CN102443053A - 猪链球菌2型hp0245基因编码蛋白作为保护性抗原的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽医微生物学和动物传染病技术领域。具体涉及猪链球菌2型的一个具有免疫原性蛋白基因的分离、克隆表达它所编码蛋白中的胞外肽段以及重组蛋白在疫苗和诊断中的应用。本发明从猪链球菌2型强毒株SC-19菌株中分离得到一个新的具有免疫原性的蛋白基因hp0245；其中编码胞外肽段的DNA(hp0245_EC)具有如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，编码261个氨基酸。重组蛋白HP0245_EC保留了原始蛋白免疫原性的特点；对小鼠感染猪链球菌2型SC-19菌株能提供有效的免疫保护力，具有潜在的疫苗应用价值。本发明还包括猪链球菌2型HP0245-ELISA诊断试剂盒的构成和制备方法，以及克隆hp0245_EC大肠杆菌DH5α/SS2 hp0245_EC的制备，该重组大肠杆菌已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2010258。

Description

猪链球菌2型hp0245基因编码蛋白作为保护性抗原的应用

技术领域

本发明属于兽医微生物学和动物传染病技术领域。具体涉及一个猪链球菌2型的保护性抗原基因分离、克隆以及它编码的蛋白在疫苗和ELISA诊断试剂盒中的应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis)是引起猪链球菌病的病原菌，能够导致猪脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎、关节炎，甚至死亡，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。在已知的33个血清型(1-31，33，1/2)中，猪链球菌2型是流行范围最广，致病性最强的血清型，并且可以导致特定人群的感染。至1968年丹麦学者首次报道人感染猪链球菌2型以来，全世界已有550多份人感染猪链球菌2型的病例。其中，1998、2005年在我国江苏省和四川省爆发了较大规模的人感染猪链球菌2型的疫情，分别导致14和38人死亡。流行病学调查结果显示，猪链球菌2型是造成我国2003-2007年猪链球菌病的优势血清型，分离率达到了43.2％。该血清型菌株造成宿主系统性感染，导致多器官病变坏死，并且猪链球菌2型常与猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒一起引起混合感染(Wei Z，Li R，Zhang A，He H，Hua Y，Xia J，Cai X，Chen H and Jin M.Characterization of Streptococcus suis isolates from the diseased pigs in China between 2003 and 2007.VetMicrobiol，2009，137：196-201)。鉴于猪链球菌2型的流行范围之广、危害性之强，因此，我们亟需有效的预防和治疗手段来控制猪链球菌病的发生和流行。

目前，国际上报道的关于猪链球菌的疫苗种类有：灭活苗、弱毒苗、基因缺失疫苗以及亚单位疫苗。然而，由于灭活疫苗、弱毒苗和基因缺失疫苗存在毒力返强的生物安全隐患，基于保守蛋白质所设计的亚单位疫苗被认为是猪链球菌疫苗研究领域的一个热点。猪链球菌是细胞外病原菌，其细胞表面结构蛋白和分泌蛋白在刺激机体产生免疫反应过程中发挥了重要作用，因此，这类蛋白成为了猪链球菌亚单位疫苗研究的候选蛋白。以猪链球菌毒力因子MRP，EF以及溶血素为目标的亚单位疫苗由于一些菌株不含这些毒力因子而逐渐被淘汰应用(Jacobs A A，Loeffen P L，van den Berg A J and Storm P K.Identification，purification，and characterization of a thiol-activated hemolysin(suilysin)of Streptococcus suis.Infect Immun，1996，62：1742-1748；Wisselink H J，Vecht U，Stockhofe-Zurwieden N and Smith H E.Protection of pigs against challengewith virulent Streptococcus suis serotype 2 strains by a muramidase-released protein and extracellular factorvaccine.Vet Rec，2001，148：473-477)。随后，一些具有较好免疫保护力的猪链球菌细胞表面蛋白被先后报道出来，包括：38KDa蛋白(Okwumabua O and Chinnapapakkagari S.Identification of the gene encoding a38-kilodalton immunogenic and protective antigen of Streptococcus suis.Clin Diagn Lab Immunol，2005，12：484-490)，Sao(Li Y，Gottschalk M，Esgleas M，Lacouture S，Dubreuil J D，Wilson P and Harel J.Immunizationwith recombinant Sao protein confers protection against Streptococcus suis infection.Clin Vaccine Immunol，2007，14：937-943)，SsuiDRAFT 0103(Aranda J，Garrido M E，Cortes P，Llagostera M and Barbe J.Analysis ofthe protective capacity of three Streptococcus suis proteins induced under divalent-cation-limited conditions.Infect Immun，2008，76：1590-1598)以及6PGD(Tan C，Liu M，Liu J，Yuan F，Fu S，Liu Y，Jin M，Bei W andChen H.Vaccination with Streptococcus suis serotype 2 recombinant 6PGD protein provides protection against S.suis infection in swine.FEMS Microbiol Lett，2009，296：78-83)。其中，Sao蛋白还具有较好的猪链球菌病诊断应用前景。近年来，随着基因组测序以及蛋白质组学技术在猪链球菌研究中的运用，越来越多的保护性抗原被鉴定出来。张安定等发现了3个细菌细胞表面蛋白免疫小鼠或猪后能够使其对抗猪链球菌2型强毒的感染，这3个蛋白分别是Enolase(Zhang A，Chen B，Mu X，Li R，Zheng P，Zhao Y，Chen H and Jin M.Identification and characterization of a novel protective antigen，Enolase of Streptococcus suis serotype 2.Vaccine，2009，27：1348-1353)，HP0197(Zhang A，Chen B，Li R，Mu X，Han L，Zhou H，Chen H and Jin M.Identifi cation ofa surface protective antigen，HP0197 of Streptococcus suis serotype 2.Vaccine，2009，27：5209-5213)和HP0272(Chen B，Zhang A，Li R，Mu X，He H，Chen H and Jin M.Evaluation of the protective efficacy of a newlyidentified immunogenic protein，HP0272，of Streptococcus suis.FEMS Microbiol Lett，2010，307：12-18)。

申请人在之前所进行的关于筛选猪链球菌2型在宿主体内上调表达基因的研究(Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the naturalhost.Int J Med Microb，2010，300：482-488)中报道了一系列预测为猪链球菌2型细胞表面蛋白基因，其中包括hp0245。该基因名称是根据已测序菌株S.suis 05ZYH33的基因组序列注释(GenBank accession no.NC009442)。hp0245编码的膜蛋白含有一较长的胞外段，该肽段作为潜在的抗原表位可以刺激机体产生免疫反应。因而，hp0245有可能作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选蛋白基因。

发明内容

本发明的目的在于克隆猪链球菌2型的一个免疫原性蛋白基因的部分片段，将该片段转化到大肠杆菌中进行表达，纯化后的重组蛋白应用于制备猪链球菌2型亚单位疫苗和ELISA试剂盒。

本发明是这样实现的：

申请人从猪链球菌2型地方分离株SC-19(菌株来源参见实施例1)中克隆到hp0245中编码细胞外肽段的DNA，将其连入表达载体pET-28a(+)获得重组质粒pET-28a/SS2 hp0245_EC，随后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行原核表达。经过测序发现本发明的重组蛋白HP0245_EC由783个碱基编码，261个氨基酸组成，具有序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和氨基酸序列。通过室内生物测定证实本发明的重组表达蛋白HP0245_EC能够对猪链球菌2型感染有保护作用，并且蛋白质免疫印迹实验表明该蛋白可以与感染猪链球菌2型的猪血清发生反应，这就预示着该蛋白具有作为猪链球菌2型亚单位疫苗以及相应的诊断试剂的应用前景。更详细的技术方案参考实施例部分的描述。

本发明的有益效果在于：重组表达的猪链球菌2型蛋白HP0245_EC具有较强的免疫原性，能够为免疫动物提供良好的免疫保护，同时由于生产安全，制备工艺简单，因此可被制备成猪链球菌2型的亚单位疫苗用来预防猪链球菌病的发生与流行。另外，根据HP0245_EC抗原性强这一特点，该蛋白还可以被开发作为猪链球菌2型的新的诊断试剂或诊断试剂盒，为监控猪链球菌病提供一有力可靠的工具。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的猪链球菌2型免疫原性蛋白基因hp0245中编码胞外肽段HP0245_EC的核苷酸序列及对应的氨基酸序列。

图1：本发明实施例中猪链球菌2型免疫原性蛋白基因hp0245中编码胞外肽段HP0245_EC的DNA所在的原核表达载体pET-28a/SS2 hp0245_EC的构建图和物理图谱。

图2：本发明实施例中重组质粒pET-28a/SS2 hp0245_EC的酶切鉴定图。图中：M为DNA分子量大小标准；1为质粒pET-28a(+)；2为重组质粒pET-28a/SS2 hp0245_EC；3为EcoR I和Sal I双酶切pET-28a/SS2 hp0245_EC结果。

图3：本发明实施例中猪链球菌2型重组蛋白HP0245_EC在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达纯化的SDS-PAGE电泳分析。图中：M为蛋白质分子量标准。

图4：本发明实施例中重组蛋白HP0245_EC与感染猪链球菌2型的猪血清Western Blot反应结果。

图5：本发明实施例中重组蛋白HP0245_EC和猪链球菌2型灭活苗免疫小鼠后的抗体滴度。

图6：本发明实施例中免疫小鼠低剂量攻毒3天后的病理切片图。图中：a，b为佐剂对照组小鼠的脑组织切片：c为灭活苗免疫小鼠的脑组织切片；d为重组蛋白HP0245_EC免疫小鼠的脑组织切片。

具体实施方案

以下叙述是本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA和蛋白质的标准操作方法和所使用的药品均参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见萨姆布鲁克和拉塞尔，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2001)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

实施例1重组蛋白HP0245_EC的克隆与表达

本发明以SS2地方分离株SC-19作为hp0245中编码细胞外肽段DNA克隆的来源菌株，该菌株分离自2005年四川省猪链球菌病中的一头病猪，为强毒株，具有MRP⁺EF⁺SLY⁺表型(参见文献Li W，Liu L，Qiu D，ChenH and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the natural host.IntJ Med Microb，2010，300：482-488)。

1.hp0245中编码细胞外肽段DNA的克隆

利用猪链球菌2型SC-19的基因组为模板，申请人依据NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的S.suis 05ZYH33基因组序列中的hp0245基因序列设计上游引物P1：5’-GCGAATTCGGTGCTAGTCGAACGTTG-3’，其中下划线部分为EcoR I酶切位点；下游引物P2：5’-CCGTCGACGGTCATAAGAATTTCAAGTTG-3’，其中下划线部分为SalI酶切位点，进行PCR扩增以获得长度为783bp的目标DNA片段。PCR反应的体系和程序如下：

50μL反应体系包含：5μL 10×PCR反应缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，5μL dNTP(各2.5mM)，5μL特异性上游引物P1(2μM)，5μL特异性下游引物P2(2μM)，4μL模板(猪链球菌SC-19基因组)，0.5μL PrimeSTAR HS DNA聚合酶(购自宝生物工程大连有限公司)，加灭菌去离子水至50μL。PCR反应参数和程序为：94℃，5min，1个循环；94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min，30个循环；72℃，10min，1个循环。

扩增到的目标片段通过DNA回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)纯化后酶切，再经纯化后连接到pET-28a(+)(购自德国Merck公司)得到含有hp0245胞外肽段DNA序列的重组质粒pET-28a/SS2hp0245_EC(图1)。之后将该重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α(购自宝生物工程大连有限公司)，并涂布卡那霉素抗性平板(使终浓度为50μg/mL)。将抗性平板置于37℃培养箱中培养12-16h，待转化子长到一定大小以后，筛选转化子。将筛选到的转化子用5mL的液体LB培养基活化培养，然后抽提质粒进行酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致(图2)。最后将筛选到的阳性转化子用5mL的液体LB培养基活化培养，取1mL的过夜培养物送样测序(测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成)。测序结果显示本发明克隆的该DNA片段具有如序列表SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列(包括其对应的氨基酸序列)，申请人将基因片段命名为hp0245_EC(在本发明中，被命名的基因以斜体小写表示，下同)。通过软件分析预测该基因片段可编码一个如序列表SEQ ID NO：1中所示的由161个氨基酸组成的多肽，预测其分子量为30KDa，申请人将其命名为HP0245_EC(在本发明中，被命名的蛋白以正体大写表示，下同)。

将上述转化了的重组质粒pET-28a/SS2 hp0245_EC的重组大肠杆菌命名为大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/SS2 hp0245_EC，于2010年9月30日将该重组大肠杆菌送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：M2010258。

2.重组蛋白HP0245_EC的表达与纯化

为了大量表达重组蛋白HP0245_EC，申请人将上述携带有其编码序列的重组表达质粒pET-28a/SS2hp0245_EC转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)(购自德国Merck公司)中，得到了大肠杆菌(Escherichia coli)BL21 pET-28a/SS2 hp0245_EC。将该重组大肠杆菌菌株接种于5mL LB液体培养基中(使终浓度为50μg/mL卡那霉素)，过夜活化。以菌液∶培养基的体积比为1∶100的比例将重组大肠杆菌培养液转接至50mL新鲜LB液体培养基中，置于37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.5-0.8左右，加入1.0mmol/L的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(即IPTG，购自sigma公司)于37℃诱导培养3h。将上述培养物12000rpm/min离心1min收集菌体，根据《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克和拉塞尔，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2001)上所介绍的包涵体提取方法对重组蛋白HP0245_EC进行提取并纯化。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3所示，提纯的蛋白与蛋白分子量标准比对，估算分子量为35KDa，与预计的蛋白分子量大小基本吻合，证明本发明的猪链球菌2型HP0245蛋白胞外片段在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了成功的表达。

实施例2重组蛋白HP0245_EC免疫原性的检测

为了证明重组蛋白HP0245_EC具有猪链球菌2型天然蛋白HP0245免疫原性的特点，并且可以作为抗原用于猪链球菌2型感染的诊断检测试剂盒的应用中，申请人通过蛋白质免疫印迹方法(参见萨姆布鲁克和拉塞尔，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京，2001)将纯化后的重组蛋白HP0245_EC经SDS-PAGE跑胶后转移到PVDF膜上，并用感染猪链球菌2型的猪血清与之杂交，具体步骤如下：5μg重组蛋白HP0245_EC经SDS-PAGE电泳完毕后，通过转膜仪(购自美国Bio-Rad公司)将其电转至PVDF膜上(购自美国Invitrogen公司)，PVDF膜在封闭液(5％脱脂牛奶)中封闭2小时之后与感染猪链球菌2型的猪血清(以体积比1∶200的比例稀释)于37℃作用1小时，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗IgG(购自美国SouthernBiotech公司)，继续孵育30分钟，每两步之间都要用洗涤液(TBST：0.05％吐温-20，20mM Tris-HCl，150mM氯化钠)对PVDF膜进行充分洗涤。最后加入底物液3，3′-二氨基联苯胺(DAB，购自美国Sigma公司)进行显色反应。实验结果如图4所示为阳性，证明该重组蛋白HP0245_EC可与感染猪链球菌2型的猪血清反应，具有被用于猪链球菌2型诊断应用的潜力。

实施例3重组蛋白HP0245_EC对猪链球菌2型感染保护力的检测

1.对重组蛋白HP0245_EC进行免疫后小鼠抗体水平评价

为了对重组蛋白HP0245_EC进行免疫后抗体水平评价，申请人将重组蛋白HP0245_EC，灭活苗及佐剂对照进行免疫后小鼠抗体水平评价。方法是：将4周龄雌性Balb/c小鼠分成3组，每组20只。第1组每只腹腔注射50μgHP0245_EC。第2组注射自制的含有1×10⁹CFU的猪链球菌2型灭活苗，灭活苗的制备过程如下：用胰大豆培养基(TSB，购自美国BD公司)培养猪链球菌2型过夜，然后向其中加入0.5％的多聚甲醛溶液静置培养24小时，取少量灭活后的菌液涂布在胰大豆培养基平板(TSA，购自美国BD公司)上，如果没有猪链球菌2型菌生长，则说明细菌已经彻底被灭活，可作为灭活苗使用。第3组为对照组，注射磷酸缓冲液(PBS：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，高压灭菌，室温保存)，所有注射物在注射前均与等体积氢氧化铝佐剂(购自武汉中博生物股份有限公司)混合。2周后加强免疫一次，所用剂量同上。二免后第7天断尾采血，用包被有HP0245_EC(250ng/孔)和SS2灭活苗(5μg/孔)的ELISA板进行抗体效价的检测(包被方法见下文)。小鼠血清首先经过体积比为1∶100倍稀释，然后再进行倍比稀释测效价。结果显示，经重组蛋白HP0245_EC和灭活苗二免后，小鼠的特异性抗体滴度达到较高的水平(图5)。

2.重组蛋白HP0245_EC对猪链球菌2型感染保护力的检测

申请人在二免后第10天对重组蛋白HP0245_EC，灭活苗及佐剂对照免疫小鼠进行猪链球菌2型感染试验。采用腹腔注射的方法，向每组中的10只小鼠注射3×10⁹CFU(2×LD₅₀)的处于对数生长中期的猪链球菌2型SC-19菌株，向另外10只小鼠注射7.5×10⁹CFU(5×LD₅₀)SC-19菌株。攻毒后连续观察7天。免疫保护力率如表1所示，在低剂量攻毒试验中HP0245_EC和灭活苗均能提供100％的免疫保护，在高剂量攻毒试验中，HP0245_EC和灭活苗提供的保护率分别为80％和50％，而对照组的免疫保护效果在两组攻毒试验中皆为0％(对照组小鼠在低剂量攻毒第3天还有2只存活，但是都表现出较严重的临床症状，例如毛被粗糙，嗜睡，眼肿，颤栗，行动迟缓)。取低剂量攻毒3天后的小鼠进行病理解剖观察(每组2只)，发现对照组小鼠的脑膜明显增厚，有大量炎性细胞的浸润，并且出现脑组织液化的病变特征(图6a，6b)，SS2的灭活苗免疫小鼠的脑膜有少量炎性细胞的浸润(图6c)，而HP0245_EC免疫小鼠的脑膜正常(图6d)。

表1免疫小鼠攻毒保护结果

实施例4猪链球菌2型HP0245在ELISA诊断试剂盒中的应用

1.HP0245-ELISA试剂盒构成：

表2HP0245-ELISA试剂盒组装

2.HP0245-ELISA试剂盒相关试剂配方：

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，双蒸水加至1000mL(pH9.6)。

20倍浓缩洗涤液：NaCl 160g，KCl 4g，Na₂HPO₄·12H₂O 58g，KH₂PO₄ 4g，Tween-20 10mL加双蒸水定容至1000mL。0.22μm滤膜过滤除菌，无菌分装，30mL/瓶。

封闭液：5g脱脂乳溶于100mL洗涤液。

底物液：底物液A：浓度为0.006％双氧水缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1M磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加联苯二胺(TMB)10mg。使用时将底物液A和底物液B等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

终止液(0.025％HF)：浓度40％氢氟酸(HF)625μL，加双蒸水定容至100mL。

3.HP0245-ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度采取方阵滴定的方法来确定(表3)。试验结果

表明抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL，血清最佳稀释度为1∶40。

表3HP0245-ELISA方正滴定结果

4.抗原酶标板的制备：将上述实施例1制备的猪链球菌2型重组蛋白HP0245_EC用包被液稀释至2.5μg/mL，按100μL/孔加入到酶标板中，置37℃1小时后放入4℃冰箱过夜；弃包被液，加入所说的封闭液(150μL/孔)于37℃封闭1小时；弃封闭液，加保护剂(150μL/孔)，37℃1小时，4℃8小时，弃保护剂，自然风干；将酶标板放入专用锡泊袋，加一小袋干燥剂，抽真空，热压封口。

5.血清稀释液的制备：将空白对照菌大肠杆菌BL21/pET-28a(+)作同步诱导，离心收集菌体，用pH7.4的TE溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)洗涤1次，加入原培养物体积1/10的PBS溶液(pH7.4)重悬，-40℃速冻1小时，超声波破碎至透明(2-3min)，取该溶液20mL，加入封闭液80mL，即为血清稀释液。

6.猪链球菌2型HP0245-ELISA检测步骤及判断标准

1)从4℃冰箱中取出试剂盒，平衡各组分至室温。

2)取预包被的微孔条板(根据标本多少，可拆开分次使用)，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。除空白对照孔外，每孔加入以样品稀释液1∶40稀释的待检样品，每孔加100μL，同样体积比为1∶40稀释对照血清，设阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白孔不加，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。

3)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

4)每孔加酶标二抗100μL，置37℃温育30分钟。

5)洗涤3次，200μL/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

6)每孔加底物液A、B各1滴(50μL)，室温避光显色15分钟。

7)每孔加终止液1滴(50μL)，15分钟内测定结果，读取波长630nm的光密度值(OD)。

HP0245-ELISA结果判定标准的确定：选择10份用猪链球菌2型荚膜多糖(CPS)ELISA抗体检测试剂盒(购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)检测全部为阴性的血清进行实验。经纯化的HP0245蛋白包被的ELISA板检测均为阴性，计算10份血清的平均值(X)和标准偏差(SD)，阴阳界限计算公式X+2SD。计算得平均值为0.1817，标准偏差为0.0205，求得阴阳性界定值为0.22。

结果判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD₆₃₀值，OD₆₃₀≥0.22判为阳性，疑为猪链球菌2型感染；OD₆₃₀＜0.22判为阴性。

Claims (6)

1.猪链球菌2型保护性抗原蛋白的应用，其特征在于，该抗原为hp0245基因编码蛋白的胞外肽段HP0245_EC，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一株表达猪链球菌2型HP0245胞外肽段HP0245_EC的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/SS2 hp0245_EC，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2010258，其含有权利要求1所述的抗原蛋白基因。

3.权利要求1的应用，其中包括在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的应用。

4.权利要求1的应用，其中包括在制备猪链球菌2型ELISA诊断试剂盒中的应用。

5.权利要求2所述的大肠杆菌在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的应用。

6.权利要求2所述的大肠杆菌在制备猪链球菌2型ELISA诊断试剂盒中的应用。

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