CN110642927B - 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物制品领域，公布了化脓隐秘杆菌的一种抗原蛋白及其制备、疫苗应用、抗体检测方法。本发明将高度保守的化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP的基因，克隆至pGEX‑4T‑1质粒，构建BL21（DE3）重组菌株，使用IPTG诱导表达重组蛋白SBP(GST‑SBP)，实现了目的蛋白的可溶性表达，采用Gluthathione‑Sepharose 4B层析法亲和纯化重组蛋白。本发明提供的重组SBP(GST‑SBP)蛋白具有良好的反应原性和免疫原性，能够与化脓隐秘杆菌免疫或感染的动物（小鼠、山羊）的血清反应，能够刺激动物（小鼠、羊）产生高水平特异抗体，小鼠免疫保护率为90%。本发明为制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物提供了新的抗原蛋白。

Description

一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品，具体涉及一种制备预防化脓隐秘杆菌感染的抗原蛋白。

背景技术

山羊产业近年来在三峡库区迅速发展，已成为助推农民脱贫致富和农村健康发展的重要产业之一。然而，疫病对地区养羊业的影响日益显现，其中危害较为严重的是化脓性肺炎，因其潜伏感染期长，临床症状不明显，化脓性病变导致肺脏组织不可逆损伤，严重影响羔羊存活率。化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)是山羊化脓性肺炎的重要病原之一(张素辉等，2015；付利芝等，2018；冯峰，2010.)。化脓隐秘杆菌是革兰氏阳性菌，主要寄生在动物上呼吸道、消化道、生殖道等黏膜，属于一种共生性条件致病菌，通常导致牛、羊、猪等多种动物的肺脏脓肿、肝脓肿、脑脓肿、乳腺炎、子宫内膜炎、流产和死胎等疾病(Rissetiet al，2017；Cohenetal，2018；Piersanti et al，2019)。

已鉴定的化脓隐秘杆菌毒力因子有溶血素(Pyolysin，PLO)和黏附蛋白胶原结合蛋白(collage-binding protein，CbpA)、神经氨酸酶(neuraminidases，Nan)NanH和NanP等，PLO是其主要的保护性抗原，至今没有新保护性抗原的发现。

铁是病原菌抵御宿主杀菌作用、维持生存和毒力的必需微量元素，致病菌需要利用自身表达的ABC(ATP binding cassette，ABC)转运体等系统从宿主体内摄取铁(Casabona et al，2017；2017；Peng et al，2018)。ABC转运体是膜相关蛋白或表面蛋白，负责细胞内外物质的跨膜运输，由ABC型膜透酶(permease)、ATP结合蛋白质(或称ATP酶，ATPase)和底物结合蛋白(substrate-binding protein，SBP)组成，SBP决定ABC转运体的特异性。SBP是一个保守的细菌黏附蛋白家族，同时也是毒力决定因子，在细菌致病性和体内生存中发挥重要作用。

山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株基因组编码有铁ABC转运体等细菌铁摄取相关ABC转运体(张素辉等，2016)。这些蛋白与已公布基因组的其他化脓隐秘杆菌菌株的铁摄取ABC转运体等蛋白高度保守，它们在宿主体内不同铁环境条件下会出现差异表达，以适应宿主体内不同组织的铁源。

通过免疫印迹和质谱分析课题组发现，与化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清发生抗原抗体反应的化脓隐秘杆菌菌体蛋白可能是铁ABC转运体组分SBP。免疫印迹显示，重组SBP(GST-SBP融合蛋白)可被化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清识别，出现出现特异条带。进一步地，被重组SBP免疫的小鼠可获得抗化脓隐秘杆菌感染的能力，免疫保护率不低于90％。

发明内容

本发明的目的是提供一种化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP，并将该重组蛋白与佐剂联合免疫动物，检测抗原免疫动物的血清抗体水平及保护率，免疫小鼠产生了较高水平的特异性抗体，保护率为90％；可诱导羊只产生高水平特异性抗体。所述蛋白可用于制备预防化脓隐秘杆菌致死性感染的药物。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种蛋白，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

上述蛋白应用于制备预防化脓隐秘杆菌致死性感染的药物。采用所述蛋白制备的药物对被免疫动物的保护率为90％以上。

一种DNA分子，序列为SEQ ID NO.1，用于编码上述蛋白。

本发明的另一目的在于提供上述蛋白的制备方法。

上述蛋白的制备方法，包括以下步骤：从化脓隐秘杆菌中PCR扩增获得铁ABC转运体SBP目的基因，2)克隆至pGEX-4T-1质粒，转化获得大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株，3)收集细菌培养物，超声裂解菌液，4)使用Gluthathione-Sepharose 4B层析法纯化上清中的可溶性重组蛋白，5)SDS-PAGE检验纯化的重组蛋白。

上述PCR扩增中所采用的引物为：上游引物序列为GGATCCTCCTCTAAGCCT，下游引物序列为GGATCCTTACTTCAGGCCGGC，分别含有为BamH I和Xho I限制性内切酶的识别位点。

具体的，上述制备方法包括以下步骤：以PCR获得方法从专利申请号为CN201410072433.8(生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，(GenBank NO：CP012649)中的化脓隐秘杆菌扩增铁ABC转运体SBP目的基因。上游引物序列为GGATCCTCCTCTAAGCCT，下游引物序列为GGATCCTTACTTCAGGCCGGC。斜体部分分别为BamH I和Xho I限制性内切酶的识别位点。表达的sbp基因，序列如SEQ ID NO.1所示，将目的基因克隆至pGEX-4T-1质粒，构建大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株，诱导表达重组蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。采用免疫印迹分析上清中重组蛋白的表达情况，随后采用Gluthathione-Sepharose 4B层析法纯化上清中的可溶性重组蛋白。

本发明另一目的在于提供上述蛋白在疫苗中的应用。

一种疫苗，包括上述蛋白。

上述疫苗，配方为纯化的重组蛋白与弗氏佐剂体积比1∶1混合乳化，或纯化蛋白与铝胶佐剂按体积比5∶1混合。

采用免疫印迹分析重组蛋白与化脓隐秘杆菌抗血清(1∶5 00)的反应情况，证实该蛋白可与化脓隐秘杆菌抗血清发生特异性反应。

检测重组蛋白SBP的免疫原性：将纯化的重组SBP(GST-SBP)、GST分别与铝胶佐剂混合均匀，制备抗原。腿部肌肉注射，抗原注射剂量为10μg/只小鼠，重组SBP(GST-SBP)免疫小鼠产生了较高水平的特异性抗体，保护率为90％。将纯化的重组蛋白与铝胶佐剂混合制备的抗原免疫3月龄山羊，免疫羊SBP抗体水平显著提高。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了可用于化脓隐秘杆菌疫苗研发的新保护性抗原：化脓隐秘杆菌铁ABC转运体底物结合蛋白SBP。该蛋白可有效保护被免疫动物免于化脓隐秘杆菌致死性感染，保护率为90％；可诱导羊只产生高水平特异性抗体。所述蛋白可用于制备预防化脓隐秘杆菌致死性感染的药物。

附图说明

图1为提取的化脓隐秘杆菌膜蛋白电泳图。(M：蛋白质Marker；1：膜蛋白)

图2为免疫印迹分析提取的化脓隐秘杆菌膜蛋白与化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清的反应。(M：蛋白质Marker；1：未免疫小鼠血清；2：免疫小鼠血清)

图3为采用PCR方法从化脓隐秘杆菌基因组中扩增铁ABC转运体sbp基因的结果。(M：Marker DL2000；1：PCR产物；2：阴性对照)

图4为采用BamH I和Xho I限制性内切酶对克隆有基因sbpp的重组质粒pGEX-4T-1进行双酶切鉴定结果。(M：Marker DL2000；1：双酶切克隆有基因sbp的重组质粒pGEX-4T-1；2：未酶切克隆有基因sbp的重组质粒pGEX-4T-1)

图5为转化含sbp基因的pGEX-4T-1的重组BL21(DE3)重组菌株经IPTG诱导后其细菌培养物超声裂解上清产生可被GST抗体识别的表达产物(免疫印迹)。(M：蛋白质Marker；1：未诱导培养物裂解液上清；2：诱导培养物裂解液上清)

图6为纯化的重组蛋白SBP(GST-SBP)。(M：蛋白质Marker；1：GST-SBP)

图7为重组SBP(GST-SBP)与化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清发生的抗原抗体反应(免疫印迹)。(M：蛋白质Marker；1：诱导培养物裂解液上清；2：未诱导培养物裂解液上清)

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例

一、分析具有免疫反应性的膜蛋白

1.化脓隐秘杆菌抗血清制备

菌株为专利申请号为CN201410072433.8(生物保藏号为CCTCC NO：M2014037，(GenBankNO：CP012649)中的山羊化脓隐秘杆菌重庆分离株。

挑取化脓隐秘杆菌单菌落接种TSB培养基，37℃培养48h。向培养物中加入0.2％甲醛溶液，置37℃灭活24h，期间震荡5次。将灭活培养物与弗氏佐剂混合乳化，制备灭活抗原。腿部肌肉注射，0.2mL/只小鼠，每间隔2周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫15天后，摘除眼球采集小鼠血液，血液凝固后离心收集获得化脓隐秘杆菌抗血清。

2.膜蛋白分离提取与质谱分析

使用细菌膜蛋白提取试剂盒分离提取新鲜培养的化脓隐秘杆菌膜蛋白，采用SDS-PAGE检测提取的膜蛋白(图1)，采用免疫印迹技术分析证实化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清能与分离的化脓隐秘杆菌膜蛋白发生抗原抗体反应，共出现2条特异条带(图2)。将对应的SDS-PAGE凝胶上的2条蛋白质条带切下，采用LC-MS/MS方法进行质谱分析，获得2条多肽序列VLVTGHDAFNYLGR和IADTELFADTLGTEAPVDTYVGAFK，将获得的多肽序列在NCBI上进行BLAST搜索以获得其编码基因，发现这2条多肽与化脓隐秘杆菌的铁ABC转运体的sbp有高同源性，其编码蛋白与化脓隐秘杆菌其他分离株相应分子的同源性高于99％，表明其高度保守。

二、获得重组SBP蛋白

1.sbp基因克隆

使用细菌DNA试剂盒提取化脓隐秘杆菌重庆分离株2012CQ-ZSH基因组(GenBank登录号CP012649)DNA，以PCR方法从中扩增目的基因。上游引物序列为GGATCCTCCTCTAAGCCT，下游引物序列为GGATCCTTACTTCAGGCCGGC。斜体部分分别为BamH I和Xho I限制性内切酶的识别位点。PCR反应体系：10×PCRBuffer(含15mM Mg²⁺)2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，5U/μLrTaq 0.10μL，10μM上、下游引物各0.5μL，DNA0.5μL，用去离子水补足25μL。PCR反应参数：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸45s，共进行30循环；72℃延伸5min。获得约800bp的PCR产物(图3)，目的片段经DNA凝胶回收试剂盒回收后插入经BamH I和Xho I双酶切的pGEX-4T-1质粒，构建大肠杆菌BL21(DE3)重组菌株。提取阳性菌落培养物中的重组质粒，BamH I和Xho I双酶切可获得与目的基因大小一致的特异性片段(图4)，序列测定及分析结果显示克隆基因无突变(序列同SEQ ID NO.1)，表明成功构建含有sbp基因序列的质粒。

2.重组蛋白的诱导表达

37℃下振摇培养至菌体浓度达OD₆₀₀约为1时，加入终浓度0.1mmol/L IPTG，37℃下诱导表达3h。培养物4℃下5 000r/min离心30min，沉淀用PBS洗涤3次。每100mL培养液加20mL PBS以悬浮菌体沉淀，冰水浴中超声裂解菌悬液(超声功率为300W，工作4s间歇5s，超声裂解15min)。裂解物12 000r/min离心10min，样本经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与GST单克隆抗体(1∶5 000)孵育，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育，最后置BCTP/NBT中显色。转化了携带sbp基因的pGEX-4T-1质粒的BL21(DE3)重组菌株经IPTG诱导后其细菌培养物超声裂解上清产生可被GST抗体识别的表达产物，且条带清晰(图5)，表明融合蛋白GST-SBP在大肠杆菌BL21(DE3)中实现高效可溶性表达。

3.重组蛋白质纯化

向裂解物中加入终浓度1％TritionX-100，4℃振摇孵育30min，5 000r/min离心30min，收集上清。上清使用0.22μm滤膜过滤。每20mL上清使用500μLGluthathione-Sepharose 4B纯化蛋白。向层析柱加Gluthathione-Sepharose 4B，使用5倍体积PBS洗层析柱。将处理好的代纯化样品上柱，用2倍样品体积的PBST洗层析柱。用3倍柱体积的10mmol/L的还原型谷胱甘肽洗脱。整个纯化过程在2～8℃中进行。采用SDS-PAGE分析纯化效果(图6)，扫描条带以根据条带灰度计算目的蛋白含量，使用bradford法测定蛋白质含量以计算目的蛋白产率。经检验，我们成功利用Gluthathione-Sepharose 4B从工程菌诱导培养物裂解液上清中纯化到重组蛋白SBP，经测试纯度高于95％，每100mL培养物可获得纯化的重组SBP(GST-SBP)10mg。

4.重组蛋白与抗血清的免疫印迹分析

将纯化的重组蛋白SDS-PAGE后，转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与化脓隐秘杆菌抗血清(1∶5 00)孵育，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)孵育，最后置BCTP/NBT中显色，免疫印迹出现特异性条带，大小与预期相同(图7)。表明重组蛋白SBP(GST-SBP)与化脓隐秘杆菌免疫的小鼠血清发生特异性反应。

5.弗氏佐剂抗原的免疫保护作用

将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂按体积比1∶1混合乳化，制备抗原。实验小鼠为昆明小鼠，6-8周龄，雌性，腿部肌肉注射，0.2mL/只小鼠，蛋白剂量为10μg/只，每间隔2周免疫1次，共免疫3次，共免疫45只小鼠。第3次免疫15天后，采用新鲜培养的化脓隐秘杆菌进行攻毒，腹腔注射1×10⁹CFU/只。未免疫小鼠按同剂量腹腔注射化脓隐秘杆菌。5天后，未免疫小鼠全部死亡，重组SBP(GST-SBP)免疫3次的昆明小鼠在致死剂量的化脓隐秘杆菌攻击下死亡3只，存活42只，保护率为93.3％。

6.铝胶佐剂抗原的免疫保护作用

将纯化的重组蛋白与铝胶佐剂按体积比5∶1混合，制备抗原。腿部肌肉注射，抗原注射剂量为10μg/只小鼠，每间隔2周免疫1次，共免疫3次。重组SBP(GST-SBP)共免疫15只小鼠，GST共免疫15只小鼠。对照组小鼠采用相同方法注射PBS，共15只。第3次免疫15天后，采集眶前静脉血液，每组采集5只，分离血清。剩下的10只小鼠用于攻毒与测试保护率。采用新鲜培养的化脓隐秘杆菌进行攻毒，腹腔注射1×10⁹CFU/只，观察15天。

采用间接ELISA方法测试特异性抗体水平。间接ELISA操作如下，将重组蛋白SBP(GST-SBP)溶于碳酸盐(pH9.6)缓冲液包被酶标板，蛋白质包被量为280ng/孔，100μL/孔，4℃放置过夜；PBST洗涤后用2％明胶封闭2h；PBST洗涤后加入1∶100倍稀释的血清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤后加入1∶10 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG，37℃孵育1h；PBST洗涤后加入底物显色10min，测试450nm的吸收值。

实验结果显示，用重组SBP(GST-SBP)包被的酶标板测试重组SBP(GST-SBP)、GST和对照组产生的SBP抗体水平，相对于免疫前、对照PBS组，重组SBP(GST-SBP)免疫小鼠产生了较高水平的特异性抗体(表1)；攻毒结果导致未免疫的10只小鼠全部死亡，GST免疫组10小鼠死亡9只，重组SBP(GST-SBP)免疫小鼠死亡1只，存活9只，保护率为90％。

表1免疫小鼠抗体水平

7.免疫羊只抗体水平测试

将重组蛋白与铝胶佐剂混合制备的抗原免疫3月龄山羊。肌肉注射，100μg/只，1mL/只，每间隔2周免疫1次，共免疫3次。重组SBP(GST-SBP)免疫5只，GST免疫5只。对照组5只，采用相同方法注射PBS。第3次免疫2周后采集羊血液，分离血清，测试特异性抗体水平。结果显示，相较于免疫前、对照组，免疫羊SBP抗体水平显著提高(表2)。

表2免疫羊只抗体水平

8.验证重组SBP包被的酶标板能特异性检测化脓隐秘杆菌感染的山羊血清抗体的特异性

将重组SBP(GST-SBP)溶于碳酸盐(pH9.6)缓冲液包被酶标板，蛋白质包被量为280ng/孔，100μL/孔，4℃放置过夜；PBST洗涤后用2％明胶封闭2h；PBST洗涤后加入1∶100倍稀释的血清，100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗涤后加入1∶20 000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG，37℃孵育1h；PBST洗涤后加入底物显色10min，测试450nm的吸收值。按上述步骤检测已知背景山羊血清，血清包括确诊为化脓隐秘杆菌感染的山羊血清15份、化脓隐秘杆菌阴性血清、大肠杆菌免疫的山羊血清、伪结核棒状杆菌免疫的山羊血清、金黄色葡萄球菌免疫的山羊血清。每个血清做2个平行重复，同类血清求平均值。根据P/N值判定血清是否呈山羊化脓隐秘杆菌抗体阳性。

检测结果见表3，确诊化脓隐秘杆菌感染的阳性血清的P/N大于6，大肠杆菌、伪结核棒状杆菌和金黄色葡萄球菌免疫血清的P/N值均小于2，表明SBP与上述血清无交叉反应，具有较好的特异性。

表3山羊血清抗体检测

备注：“”表示阴性，“+”表示阳性。

序列表

<110> 重庆市畜牧科学院

<120> 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用

<160> 4

<210> 1

<211> 876

<212> DNA

<213> Artificial(人工序列)

<400> 1

tcctctaagc ctgccgaatc cacgactacg gctactggga aagacaagct cgtcgtcgtc 60

gctaccacgg gatatctcgg cgatgccgtg gctaacattg ctccgcaagc cgaactcacc 120

gttctcgtcg gccctggcgg agatccgcat actcaagagt tgaccacctc cgataccgaa 180

   aagatcggca aagctgatct cgtggtttgg acgagccacg acatggagca caagatgatg 240

   gatcagctcg ataagctggg cgatcgccag ctcgccgcag gcgaggcaat ccccgaatca 300

   caactgctgc cgtgggaaga ggatggcaag atcgaaggcc acgatccgca cgtgtggaac 360

   gatccggttg cctggcagct cgtcgtcact gcgactgccg agaagctcgc caagattgac 420

   ccggccaatg ccgacaccta caaggcaaac gcgaagaaat acaacgaaaa gatccaggct 480

gttcacgtca aggccaagga agagttcgcg aagatcccta aagaaaggcg cgttctcgtc 540

   accggtcacg atgccttcaa ctacctcggc cgcacctacg accttgaaat ccatgccacc 600

   gacttcgtct cctcagagtc cgagatgtcg cctgtgcaga tcaacgaact tgcccagctg 660

   gtagccaaaa agaaggtgcc agtgatcttt gctgacaacc tgaagaatcc tgaggtcatt 720

aagcacctgc gtgaggctgt ggcggcagct ggctggaatg tcaagatcgc agacacggag 780

   ctctttgctg acacgctcgg caccgaggct ccggtcgaca cctacgttgg tgccttcaag 840

   cacaacgtcg aagcgatcgt tgccggcctg aagtaa 876

<210> 2

<211> 291

<212>Protein

<213>人工序列

<400> 2

SSKPAESTTT ATGKDKLVVV ATTGYLGDAV ANIAPQAELT VLVGPGGDPH TQELTTSDTE 60KIGKADLVVW TSHDMEHKMM DQLDKLGDRQ LAAGEAIPES QLLPWEEDGK IEGHDPHVWN 120DPVAWQLVVT ATAEKLAKID PANADTYKAN AKKYNEKIQA VHVKAKEEFA KIPKERRVLV 180TGHDAFNYLG RTYDLEIHAT DFVSSESEMS PVQINELAQL VAKKKVPVIF ADNLKNPEVI 240KHLREAVAAA GWNVKIADTE LFADTLGTEA PVDTYVGAFK HNVEAIVAGL K 291

<210> 3

<211> 18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>用于扩增sbp基因的 PCR反应的上游引物

<400> 3

1 GGATCCTCCTCTAAGCCT18

<210> 4

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>用于扩增sbp基因的 PCR反应的下游引物

<400> 4

1 GGATCCTTACTTCAGGCCGGC 21

Claims (7)

1.一种蛋白在制备用于预防化脓隐秘杆菌致死性感染药物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

2.如权利要求1所述应用，所述蛋白的编码DNA序列为SEQ ID NO.1。

3.如权利要求1所述应用，所述蛋白制备方法包括以下步骤：

1）从化脓隐秘杆菌中PCR扩增获得铁ABC转运体SBP目的基因，

2）克隆至pGEX-4T-1质粒，转化获得大肠杆菌BL21（DE3）重组菌株，

3）收集细菌培养物，超声裂解菌液，

4）Gluthathione-Sepharose 4B层析法纯化上清中的可溶性重组蛋白，5）SDS-PAGE检验纯化的重组蛋白。

4.如权利要求3所述应用，所述PCR扩增中所采用的引物为：上游引物序

列为GGATCCTCCTCTAAGCCT，下游引物序列为

GGATCCTTACTTCAGGCCGGC，分别含有为BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切

酶的识别位点。

5.一种疫苗，包括权利要求1所述蛋白。

6.如权利要求5所述疫苗，包括纯化的权利要求1所述蛋白与铝胶佐剂，并按体积比5:1混合。

7.一种ELISA板，用于检测权利要求5或6所述疫苗诱导产生的特异性抗体，其中包被抗原包括权利要求1所述蛋白。

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