CN115925829B

CN115925829B - rHtaA-c蛋白在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用

Info

Publication number: CN115925829B
Application number: CN202210866337.5A
Authority: CN
Inventors: 曹永生; 张文龙; 白昀璐
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-07-22
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2024-04-23
Anticipated expiration: 2042-07-22
Also published as: CN115925829A

Abstract

本发明公开了rHtaA‑c蛋白在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用，rHtaA‑c蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。实验证明，rHtaA‑c蛋白可以抑制化脓隐秘杆菌和减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤，因此，rHtaA‑c蛋白可以用于制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗。本发明具有重要的应用价值。

Description

rHtaA-c蛋白在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及rHtaA-c蛋白在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用。

背景技术

化脓隐秘杆菌原称化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)或化脓放线菌(Actinomyces pyogenes)。2011年更名为Trueperella pyogenes(T.pyogenes)，简称为TP。

TP属于放线菌纲、放线菌科，是一种革兰氏阳性短棒状杆菌。TP感染在家畜(如猪、牛、羊)中时有发生，其他动物(马、犬、禽类)也偶见TP感染的报道。TP感染的临床表现通常为肺炎、子宫内膜炎、乳腺炎、心内膜炎、关节炎和皮下脓肿等炎症性疾病。TP与革兰氏阴性菌混合感染时，可引起化脓性或坏死性的感染。在动物机体抵抗力较强并及时釆取有效的治疗措施的情况下，TP感染会被控制在局部，并在局部形成脓肿。但当动物机体免疫力较差且治疗不及时，TP则会随着血液迁移到全身各个组织器官，造成多种器官的化脓性感染。当TP随着血液传播时，TP代谢产生的有毒物质还会对动物机体造成进一步损害，从而引起较严重多器官(包括脾脏、淋巴结、肝脏和肾脏)衰竭、从菌血症、毒血症、败血症，最后形成脓毒败血症而导致动物死亡。此外，TP不仅能够感染动物，也可感染人类。

疫苗是控制传染性疾病的重要手段之一，然而目前尚未有商品化的TP疫苗面世。因此，对TP疫苗的开发仍是亟待开展的工作。近年来关于TP疫苗的研究日益增多。已有研究制备了TP灭活疫苗，但动物试验表明这种疫苗不能有效保护动物免受TP的攻击。

发明内容

本发明的目的是预防和/或治疗化脓隐秘杆菌引起的感染。

本发明首先保护rHtaA-c蛋白，可为如下a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且具有相同功能的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:2由583个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述rHtaA-c蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述编码rHtaA-c蛋白的核酸分子可为e1)或e2)或e3)或e4)所示的DNA分子：

e1)编码区为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

e2)核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的DNA分子；

e3)与e1)或e2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于TP且编码所述rHtaA-c蛋白的DNA分子；

e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，来源于TP且编码所述rHtaA-c蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:1由1752个核苷酸组成，SEQ ID NO:1的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述rHtaA-c蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述rHtaA-c蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述rHtaA-c蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的rHtaA-c蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子的应用，可为b1)或b2)：

b1)抑制化脓隐秘杆菌；

b2)减轻脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤。

本发明还保护上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子在预防和/或治疗化脓隐秘杆菌感染中的应用。

本发明还保护上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子的应用，可为c1)或c2)：

c1)制备用于抑制化脓隐秘杆菌的药物；

c2)制备用于减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤的药物。

本发明还保护上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用。

本发明还保护上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子在制备用于治疗化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用。

上述任一所述的应用中，所述组织可为肺脏、肝脏和/或肾脏。

本发明还保护一种产品，其含有上述任一所述rHtaA-c蛋白或编码上述任一所述rHtaA-c蛋白的核酸分子；所述产品的功能可为d1)或d2)或d3)或d4)：

d1)抑制化脓隐秘杆菌；

d2)减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤；

d3)预防化脓隐秘杆菌感染；

d4)治疗化脓隐秘杆菌感染。

所述产品可为药物或疫苗。

上述任一所述的产品中，所述组织可为肺脏、肝脏和/或肾脏。

实验证明，rHtaA-c蛋白免疫后可使小鼠完全抵抗TP的致死性攻击，还可诱导小鼠产生抗HtaA的特异性抗体，细胞因子基因的表达也显著增加，同时rHtaA-c蛋白免疫可减轻TP感染引起的组织病理损伤，例如肺部病变情况显著减轻，肝细胞排列较为整齐，肾脏中有少量红细胞渗出。由此可见，rHtaA-c蛋白可以抑制化脓隐秘杆菌和减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤，用于制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为HtaA-c基因的PCR扩增结果。

图2为重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c的EcoRI和XhoI双酶切鉴定。

图3为纯化的rHtaA-c蛋白的SDS-PAGE分析。M为蛋白Marker，1为纯化的rHtaA-c蛋白。

图4为rHtaA-c蛋白攻毒保护的评价结果。

图5为抗HtaA的特异性抗体水平检测结果。

图6为血清凝集效价的测定结果。

图7为rHtaA-c蛋白免疫和TP攻击后的细胞因子检测结果。

图8为TP攻击7天后小鼠组织病理切片结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明中的化脓隐秘杆菌具体为Trueperella pyogenes(T.pyogenes strain0912)，记载于如下文献中：Liang H，Wang B，Wang J，Ma B，Zhang W.Pyolysin ofTrueperella pyogenes Induces Pyroptosis and IL-1βRelease in MurineMacrophages Through Potassium/NLRP3/Caspase-1/Gasdermin D Pathway.FrontImmunol.2022Mar 15；13：832458.Hu Y.,Zhang W.,Bao J.,Wu Y.,Yan M.,Xiao Y.,YangL.,Zhang Y.,Wang J.A chimeric protein composed of the binding domains ofClostridium perfringens phospholipase c and Trueperella pyogenes pyolysininduces partial immunoprotection in a mouse model.Res.Vet.Sci.2016；107:106-115.Yang L,Liang H,Wang B,Ma B,Wang J,Zhang W.Evaluation of the Potency ofTwo Pyolysin-Derived Recombinant Proteins as Vaccine Candidates ofTrueperella Pyogenes in a Mouse Model:Pyolysin Oligomerization and StructuralChange Affect the Efficacy of Pyolysin-Based Vaccines.Vaccines(Basel).2020Feb10；8(1):79.Trueperella pyogenes(T.pyogenes strain 0912)简称TP 0912株。

实施例

一、实验方法

1、HtaA-c基因的克隆

(1)本发明的发明人利用DNAStar软件对HtaA蛋白的二级结构、柔韧性、亲水区和疏水区以及蛋白的抗原指数进行分析，最终确定HtaA蛋白的氨基酸序列自N端起第451-1033位为抗原优势区，命名为rHtaA-c蛋白。

(2)以TP的基因组DNA为模板，采用HtaA-c1：5’-CCGGAATTCATGCCGAATCAGGTGGTGAATGG-3’(下划线为限制性内切酶EcoR I的识别位点)和HtaA-c2：5’-CCGCTCGAGTTATTCGTGAACCGTGCTGT-3’(下划线为限制性内切酶Xho I的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

(3)用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，之后回收约为1.7kb的DNA片段。

2、重组原核表达质粒的构建与鉴定

(1)将步骤1回收的DNA片段与克隆载体pMD18-T进行连接，之后转化至大肠杆菌感染态细胞DH5α中，挑取LB琼脂平板上的单菌落于5mL含50pg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于恒温摇床37℃、220r/min震荡培养10h-12h。提取质粒，并对提取的质粒进行双酶切鉴定。双酶切鉴定成功的质粒，进行基因测序，测序结果利用DNAMAN软件与HtaA参考序列进行比对，将比对成功的阳性质粒命名为pMD18-T-HtaA-c，置于-20℃保存备用。

(2)将重组质粒pMD18-T-HtaA-c进行EcoRI和XhoI双酶切处理，回收大小为1.7kb的酶切产物。将pET-30a(+)载体进行EcoRI和XhoI双酶切处理，回收载体骨架。将酶切产物和载体骨架进行连接，连接产物转化至E.coli DH5a感受态细胞中，提取质粒并进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定，双酶切鉴定正确后，进行基因测序，将测序正确的质粒命名为重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c，将此阳性质粒置-20℃保存备用。

3、重组HtaA-c(recombinant HtaA-c，rHtaA-c)蛋白的制备

(1)将重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c转化至大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3-5min，加入200μL灭菌的LB液体培养基，37℃、220r/min震荡培养1h，得到培养物。将培养物涂布于含Kan的琼脂平板上，37℃培养15h以上。挑取单菌落于含Kan的LB液体培养基中，37℃振荡培养，得到OD_600nm为0.6-0.8的菌液。向菌液中加入终浓度为1.0mmoL/L的IPTG诱导表达4h，4℃、5000r/min离心10min，收集菌体。将菌体用PBS重悬后超声破碎，之后用10％SDS-PAGE分析rHtaA-c蛋白的诱导表达情况和表达方式。

(2)将2mL步骤(1)得到的菌液接种至100mL LB液体培养基，加入300μL浓度为50μg/mL的Kan水溶液，37℃、220r/min的摇床中震荡培养。诱导表达及方法同上述小剂量诱导表达方法。rHtaA-c蛋白是包涵体形式表达，因此在变性条件下，用NI²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集洗脱后的蛋白，使用2×loading buffer上样缓冲液处理样品，水煮10min，利用10％SDS-PAGE进行结果分析。纯化后在含有5％丙三醇的PBS缓冲液中进行透析，每隔4h换液一次，待尿素完全除去后，利用10％SDS-PAGE进行结果分析，并用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓缩后的蛋白浓度，置于-70℃保存备用。

4、rHtaA-c蛋白的攻毒保护效果评价

(1)免疫原的制备与免疫接种

(1-1)将纯化的rHtaA-c蛋白用PBS缓冲液调整浓度为1mg/mL，之后在超净工作台内将其与氢氧化铝佐剂按照体积比1:1混合，颠倒混匀30min，得到免疫原，置于冰上备用。将PBS缓冲液和氢氧化铝佐剂按照体积比1:1混合，颠倒混匀30min，得到对照溶液，置于冰上备用。

(1-2)将16只18-21日龄雌性昆明鼠随机分为rHtaA-c免疫组和PBS组2组，每组8只，隔离饲养，之后进行如下操作：

rHtaA-c免疫组：每只小鼠进行三次免疫，即分别在实验第1天、第14天和第28天皮下注射0.1ml免疫原。

PBS组：每只小鼠进行三次免疫，即分别在实验第1天、第14天和第28天皮下注射0.1ml对照溶液。

(2)TP攻击

(2-1)取TP 0912株活化、培养，当TP菌液的OD_600nm为1.75左右时，TP 0912株处于对数生长期，此时TP菌液中TP的浓度为2×10⁹CFU/mL，为2×LD50。

(2-2)取TP菌液，1000r/min离心10min，得到菌体。每1ml TP菌液离心获得的菌体用100μL无菌PBS缓冲液重悬，得到TP悬液。

(2-3)完成步骤(1)第三次免疫后第14天，用腹腔方式接种TP悬液，100μL/只。每12h观察一次，连续观察35天，记录小鼠精神状态、被毛凌乱程度、进食进水情况、死亡数量及死亡时间。

分别在实验第0天(小鼠未免疫时)、第一次免疫后7天、第二次免疫后7天、第三次免疫后7天、攻菌后第7天、攻菌后第14天、攻菌后第28天和攻菌后第35天对小鼠进行尾静脉采血，分离血清于-70℃冻存备用。

(3)特异性抗体水平检测

釆用棋盘滴定法摸索rHtaA-c蛋白的抗原最佳包被量，确定检测方法。具体步骤如下：

(3-1)抗原的包被

包被液使用碳酸盐缓冲溶液(pH9.6)，抗原包被量设置为12.5ng/孔、25ng/孔、50ng/孔或100ng/孔，包被体积为100μL/孔。4℃过夜，用PBST洗涤三次。

(3-2)封闭

封闭液使用含5％脱脂乳的PBST溶液，300μL/孔，37℃封闭2h，用PBST洗涤三次。

(3-3)一抗孵育

用PBS稀释血清(每次EILSA试验分别使用小鼠未免疫时血清作为阴性血清，每次免疫后7天及攻菌后第7天、第14天、第28天及第35天血清为免疫血清)，血清稀释比例分别为1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000和1:32000。37℃孵育1h，用PBST洗涤三次。

(3-4)二抗孵育

用PBS稀释抗体，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG按1:5000稀释，用PBST洗涤三次。

(3-5)TMB显色

A液、B液、C液按比例1:1:4混合，50μL/孔，避光显色20min；

(3-6)终止

每孔加入50μL浓度为1mol/L硫酸，终止反应后使用酶标仪检测OD_450nm，当P/N>2(P为免疫血清的OD_450nm值，N为阴性血清的OD_450nm值)，阴性血清检测结果小于0.1时，可以得到最佳的抗原包被量以及血清的稀释度。

实验重复三次，选择最佳抗原包被量。并按照三种蛋白最佳包被量进行包被，检测第一次免疫后7天、第二次免疫后7天、第三次免疫后7天、攻菌7天、14天、28天及35天血清的抗体效价，并绘制折线图。

(4)血清凝集效价检测

(4-1)将OD_600nm为1.6的TP菌液接种于50mL含5％胎牛血清的马丁肉汤中，震荡培养8h。当OD_600nm值达到1.75时将菌液离心，用无菌的PBS缓冲液洗涤三次，用25mL无菌生理盐水重悬菌体，得到TP悬液。

(4-2)将第三次免疫后各组别血清分别按照1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560进行稀释，每管500μL，分别与步骤(4-1)得到的TP悬液等体积混合，震动混匀，37℃静置30min，观察各试管中的凝集现象。

(5)细胞因子基因转录水平检测

每次免疫后7天以及攻毒后7天，每组处死一只小鼠，采集脏器(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)。利用液氮冻结组织后进行研磨，在0.1g研磨物中加入1mL Trizol混匀，室温静置10min；将裂解液移入1.5mL无RNA酶的EP管中，每管加入200μL氯仿，震荡混匀，静置15min；12000r/min离心20min；重复此步骤一次；吸取上层水相至另一EP管中；加入等体积异丙醇，混匀，室温孵育10min，12000r/min离心15min，弃上清，RNA沉积于管底；离心后加入200μL 75％(v/v)乙醇水溶液，洗脱管壁，12000r/min离心2min；弃上清，干燥5-10min；用20μL DEPC水溶解沉淀，将RNA于-70℃冻存。

取15μL的RNA加入3μL OligoT，置于70℃水浴10min；冰浴2min。后放入42℃水浴1h；70℃水浴15min,将反转录完成的cDNA于-20℃冷冻保存。

用qRT-PCR方法检测小鼠肝脏、脾脏和肺脏的IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNF-α7种促炎性细胞因子基因的转录情况。

(6)组织病理学观察

攻菌后死亡小鼠立即采集脏器组织。此外，各组存活的小鼠于攻菌7天后每组随机选取一只扑杀并采集脏器组织。制作组织病理切片，显微镜观察并拍照。

二、实验结果

1、HtaA-c基因的克隆

检测结果见图1(M为Trans 2K DNA Marker，1为HtaA-c基因扩增产物)。结果表明，以TP的基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小为1.7kb的HtaA-c基因，与预期结果相符。

2、重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c的EcoRI和XhoI双酶切鉴定

检测结果见图2(M为Trans 2K Plus II DNA Marker，1为重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c的双酶切鉴定结果)。结果表明，重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c双酶切后，获得大小约为5.4kb和1.7kb两条条带，与预期结果相符。

将重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c进行结构描述如下：将pET-30a(+)载体的限制性内切酶EcoRI和XhoI识别序列间的小片段替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子，得到的重组质粒。SEQ ID NO.1所示的DNA分子即为HtaA-c基因。HtaA-c基因编码SEQ ID NO.2所示的rHtaA-c蛋白。

重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的rHtaA-c蛋白。

3、rHtaA-c蛋白的制备和纯化

将重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c转化至大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)感受态细胞，在IPTG的诱导下，目的蛋白获得成功表达，大小约70kDa。

大量诱导含有重组质粒pET-30a(+)-HtaA-c的大肠杆菌Rosetta^TM(DE3)，用NI²⁺-NTA亲和层析方法进行rHtaA-c蛋白的纯化，最终获得纯化的rHtaA-c蛋白(见图3)。

4、rHtaA-c蛋白免疫效果的评价

(1)rHtaA-c蛋白免疫后可使小鼠完全抵抗TP的致死性攻击

rHtaA-c蛋白在三次免疫后，注射部位均无明显变化，精神状态均良好。

第三次免疫14天后，对小鼠进行了TP攻击，并持续观察35天。所有小鼠在TP攻击24h内均出现被毛凌乱、厌食厌水和行动迟缓的症状。PBS组小鼠在TP攻击24h内全部死亡，死亡前除前三种症状外，还出现了腹背凹陷、走路不稳、抽搐，甚至后肢瘫痪的症状。rHtaA-c免疫组小鼠存活率为100％，且在TP攻击10-14天后基本恢复健康(见图4)。

(2)rHtaA-c蛋白免疫可诱导小鼠产生特异性抗体

采用ELISA法测定小鼠血清中抗HtaA的特异性抗体水平。rHtaA-c蛋白免疫可诱导抗HtaA特异性抗体的产生，抗体水平随免疫次数增加逐步提升。在TP攻击后第7天，抗HtaA的特异性抗体水平进一步增加(见图5)。

试管凝集试验的结果显示，第三次免疫后，rHtaA-c免疫组血清在稀释比例为1:640时能够完全凝集TP，而PBS组血清无法凝集TP(见图6)。由此可见，rHtaA-c免疫组的血清能与暴露的TP表面抗原结合，具有凝集TP的能力。

(3)rHtaA-c蛋白免疫可诱导细胞因子基因上调表达

第一次免疫后，rHtaA-c免疫组小鼠组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α和IL-10基因的转录水平都有一定程度的增加，其中肝脏中细胞因子基因转录水平上升最明显，第二和第三次免疫并没有使细胞因子基因的转录水平进一步升高，反而有所下降，表明第一次免疫对动物造成了较为明显的应激；TP攻击后，各组织中细胞因子转录水平进一步上升，表明小鼠发生了强烈的炎症反应(见图7)。由此可见，TP攻击后，细胞因子的水平变化可能是导致小鼠表现临床症状的原因之一。

(4)rHtaA-c蛋白免疫可减轻TP感染引起的组织病理损伤

组织病理学结果显示(见图8)，TP攻击后PBS组小鼠肺泡间隔明显增宽，间质性肺炎；肝脏的中央静脉红细胞淤积，肝细胞肿胀，窦状隙狭窄，肝细胞排列不规则，细胞坏死；肾脏的肾小管上皮细胞核淡染，轮廓不清晰，细胞核溶解。而rHtaA-c免疫组肺部病变情况显著减轻，肝细胞排列较为整齐，肾脏中有少量红细胞渗出。由此可见，rHtaA-c免疫对于TP感染引起的小鼠脏器损伤有明显的保护作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.rHtaA-c蛋白，为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白质；

a2）在SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1所述rHtaA-c蛋白的核酸分子。

3.权利要求1所述rHtaA-c蛋白或权利要求2所述核酸分子在抑制化脓隐秘杆菌中的非疾病诊断和治疗目的的应用。

4.权利要求1所述rHtaA-c蛋白或权利要求2所述核酸分子的应用，为c1）或c2）：

c1）制备用于抑制化脓隐秘杆菌的药物；

c2）制备用于减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤的药物。

5.权利要求1所述rHtaA-c蛋白或权利要求2所述核酸分子在制备用于预防化脓隐秘杆菌的疫苗中的应用。

6.权利要求1所述rHtaA-c蛋白或权利要求2所述核酸分子在制备用于治疗化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用。

7.一种产品，其含有权利要求1所述rHtaA-c蛋白或权利要求2所述核酸分子；所述产品的功能为d1）或d2）或d3）或d4）：

d1）抑制化脓隐秘杆菌；

d2）减轻化脓隐秘杆菌感染引起的组织病理损伤；

d3）预防化脓隐秘杆菌感染；

d4）治疗化脓隐秘杆菌感染。

8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述产品为药物。

9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于：所述产品为疫苗。

10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述组织为肺脏、肝脏和/或肾脏。