JPH11501809A

JPH11501809A - マイコプラズマに対する抗原組成物

Info

Publication number: JPH11501809A
Application number: JP8527121A
Authority: JP
Inventors: ウオーカー，ジヨン; リー，ローガン; ダウテイ，スチーブン・ウイリアム
Original assignee: ザ・ユニバーシテイ・オブ・メルボルン
Priority date: 1995-03-16
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 1999-02-16
Also published as: WO1996028472A1; MX9707002A; EP0815142A1; US7074894B2; CN1181761A; EP0815142A4; BR9607354A; US20030092897A1; AUPN178995A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料、；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プローブ（その抗体プローブは：免疫動物を、感染部位もしくは病変領域または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されたマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物で攻撃誘発させた後、短時間の内に採取された生物学的試料を提供し；その生物学的試料から細胞を単離し；細胞を適切な培養培地中でインビトロで培養し；そして前記細胞から産生される抗体を回収することを含む方法により産生される）を提供し；そのマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料を抗体プローブで探索して少なくとも一つの抗原を検出し；そして検出された抗原を単離することを含む方法により調製される、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する仮想的防護抗原に関し、そして更には診断用抗原、その調製法、およびワクチン組成物、特にマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対するワクチン組成物の製剤の際のそれらの使用をも含む。

Description

【発明の詳細な説明】マイコプラズマに対する抗原組成物本発明は、予防用かつ診断用抗原、それらの調製法、およびワクチン組成物、特にマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染に対するワクチン組成物の製剤におけるそれらの使用に関する。マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、ブタにおけるマイコプラズマ肺炎（ブタ流行性肺炎）の原因である偏在的なブタ呼吸器病原体である。ブタ流行性肺炎は世界のブタ産生国における最も広域にわたりかつ経済的に重要な疾患であるかもしれない。ブタ流行性肺炎（ＳＥＰ）によりもたらされる経済効果は多様であり、疾患に起因する出費は高額となる。オーストラリアではこの疾患は１９８８年には年間約２０，０００，０００ドルにものぼると推定された。死亡率の上昇、成長に伴う体重増加率の減少、食用肉への変換効率の低下、二次性細菌感染の疑い、管理費用の上昇、および抗生物質使用量の増大がＳＰＥの経済効果の主な理由である。幾つかの実験的ワクチンが産生されているものの、これらは至適結果を生じるには及ばず、かつ例えばテトラサイクリン、リンカマイシン、およびチアムリンのような様々な種類の抗生物質の使用が依然として最も広汎な管理処置法となっている。しかしながら、このような抗生物質には治療効果の限界が存在し、なぜならそれらの抗生物質によっては感染の樹立は回避されず、そして治療終了後に肺病変が生じることがあるためである。ＭＬＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｅｎｔｕｒｅｓＬ．Ｐ．に与えられた欧州特許出願公開第３５９，９１９号には、３６ｋＤ、４１ｋＤ、７４．５ｋＤ、および９６ｋＤのサイズの一連の抗原が記載されており、かつワクチンにおけるこれらの抗原の使用が提案されている。提示される結果により、攻撃誘発に対するブタの防御法の幾つかが達成されたことが示唆されている。しかしながら依然として、Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）での攻撃誘発後の集団感染および臨床疾患に対する防御を付与し、かつ更には二次感染からの罹患率および死亡率を有意に減少させるであろう、Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する効果的なワクチンのための技術が必要とされている。従って、従来の技術における一つもしくは複数の問題点および欠点を克服するかもしくは少なくとも緩和させることが本発明の目的である。従って本発明の最初の態様では、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する仮想的防御抗原が提供され、その抗原はマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プローブ（その抗体プローブは：免疫動物を、感染部位もしくは病変領域または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されたマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物で攻撃誘発させた後、短時間の内に採取された生物学的試料を提供し；その生物学的試料から細胞を単離し；細胞を適切な培養培地中でインビトロで培養し；そして前記細胞から産生された抗体を回収することを含む方法により産生される）を提供し；そのマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料を抗体プローブで探索して少なくとも一つの抗原を検出し；そして検出された抗原を単離することを含む方法により調製される。防御抗原は更には以下に論議されるように診断抗原としても機能することがあってよい。従って本発明の好ましい態様では、本明細書中これ以降に記載される１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８キロダルトン（ｋＤ）のおおよその分子量を有する抗原群より選択される、マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原、その突然変異体、誘導体、および断片が提供される。この仮想的防御抗原は表面蛋白質であってよい。この仮想的防御抗原は表面リポ蛋白質もしくは膜蛋白質であってよい。この防御抗原は１１０〜１１４、９０〜９４、７４、６２、５２、および４８ｋＤのおおよその分子量を有する抗原群から選択される。７２〜７５ｋＤの抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：および、場合によっては以下の内部アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を含むことが好ましい。６０〜６４ｋＤの抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：を含むことが好ましい。５２〜５４ｋＤの抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：および場合によっては以下の内部アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を含むことが好ましい。４６〜４８ｋＤの抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：および好ましくは以下の内部アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を含むことが好ましい。４６〜４８ｋＤの抗原は核酸断片：によりコードされてよい。従って本発明の更に別の態様では、マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原をコードする単離された核酸断片が提供され、前記核酸断片は：である。例えばＭ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）およびＭ．シノビアエ（Ｍ．ｓｙｎｏｖｉａｅ）のような様々なマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）間の交差防御が報告されているため、類似抗原が他のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種中に検出されることがあってもよい（図１）。更にまた別の態様では本発明は、動物のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）感染を予防するための方法を提供する。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）疾患が例えばブタ流行性肺炎（ＳＰＥ）のようなマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）疾患であることが好ましい。この方法は、先に記載されるマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの防御抗原の有効量を動物に投与することを含む。本発明は更に、本明細書中に記載されるマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの仮想的防御抗原の予防的有効量を含むワクチン組成物を提供する。この獣医学的組成物が、本明細書に記載される二つもしくはそれを上回る数の仮想的防御抗原を含むことが好ましい。従って好ましい態様では本発明は、１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８キロダルトンのおおよその分子量を有する抗原より選択される二つもしくはそれを上回る数の仮想的防御抗原を含むワクチン組成物を提供する。このワクチン組成物は、１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８ｋＤのおおよその分子量を有する抗原より選択される二つもしくはそれを上回る数の仮想的防御抗原のいずれかの組み合わせ物を含んでよい。二つもしくはそれを上回る数の抗原は特定されたおおよその分子量の内の一つの範囲に含まれる抗原、および／または別の特定されたおおよその分子量からの抗原より選択されることがあってよい。この組成物は、約１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８ｋＤの分子量を有する防御抗原から選択される３、４、５、もしくは６の抗原を含んでよい。本発明に従うワクチン組成物は経口投与されてよいか、または非経口投与されてよい（例えば、筋肉内注射、皮下注射、皮内注射、もしくは静脈内注射）。必要とされる量は活性成分の抗原性と共に変化するであろうし、そして現存のワクチンの典型的な免疫応答を誘導するに十分な量のみを必要とするに過ぎないであろう。反応性実験により必要量が容易に確認されるであろう。ワクチンもしくは獣医学的組成物の典型的初回用量はおおよそ０．００１〜１ｍｇ（活性成分）／ｋｇ（体重）であってよい。この用量率は増加することがあってよく、そして必要に応じ、所望されるレベルの防御を提供するのに必要とされる複数回用量が用いられてよい。本発明に従うワクチン組成物は更には、そのワクチン組成物のための獣医学的に許容される担体、稀釈剤、もしくは賦形剤を含んでよい。活性成分は担体中に懸濁されるかもしくは溶解されてよい。担体は、動物に対して無毒性であり、かつ活性成分に適合するいずれかの固体もしくは溶媒であってよい。適切な担体には、例えば通常の食塩水および生理学的濃度もしくはその濃度に近い他の無毒性塩のような液体担体、ならびに例えばタルクもしくはスクロースのような固形担体が含まれる。ワクチンが例えばフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）のアジュバント(完全もしくは不完全)のようなアジュバントを含むことが好ましく、または所望される場合にはその抗原の抗原性を亢進させる目的で例えばサイトカインのような免疫調節物質が添加されることがあってよい。そのアジュバントが、抗体力価および遅延型過敏症（ＤｅｌａｙｅｄＴｙｐｅＨｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）応答を誘導するという点で終始一貫して優れていることが見いだされている鉱油タイプのものであることが一層好ましい。特に好ましいアジュバントは商品名ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５０として市場に出回っておりかつＳｅｐｐｉｃ社、Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ、から入手することができるものである。気管支を通して投与するのに用いる場合には、ワクチンはエアロゾルの形態で存在するのが適切である。本発明の更に別の態様では、先に記載される要領で同定および精製される、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する診断用抗原を含む診断用キットが提供される。本発明に従う仮想的防御抗原はオーストラリア特許第４９０３５／９０号（この全開示は引用により本明細に取り込まれる）に記載される一般的方法を利用して単離および同定されることがあってよい。従って更に別の態様では、本発明はマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を産生するための方法を提供する。この方法は、免疫動物を、感染部位もしくは病変領域または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されたマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物で攻撃誘発させた後、短時間の内に採取した生物学的試料を提供すること；その生物学的試料から細胞を単離すること；細胞を適切な培養培地内でインビトロで培養すること；および前記細胞から産生される抗体を回収すること、を含む。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）はマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であってよい。動物はヒトを始めとする哺乳類であってよい。この哺乳類は例えばブタ、ヒツジ、もしくはウシのような家畜であってよい。生物学的動物試料はいずれかの適切な種類のものであってよい。この生物学的試料は動物の組織、臓器、リンパ、もしくはリンパ節から採取されてよい。この生物学的試料は感染部位、その動物の肺、もしくは形成されることがある病変領域、または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されてよく、その例は肺から排出されるリンパ節である。しかしながら血清／血漿試料は、本発明のこの態様に従う生物学的試料としては用いられない。血清／血漿試料内に見いだされる抗体の過半数はマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の防御もしくはその特異的診断には適さないか、またはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に無関係であることが見いだされている。それに加え、他の血清／血漿構成成分は、病原体構成成分とそれらに対する抗体との間の特異反応を妨害することがあってよい。それとは対照的に、本発明に記載されるプローブは防御免疫にとって特に重要なマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）特異抗体中で高度に濃縮される。生物学的試料が、その疾患の進行の際の予め決定された時期に動物から採取されることが好ましい。一般的にはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）感染については、生物学的試料は、病原体から取得される産物での攻撃誘発もしくはその投与、または病原体自体での攻撃誘発の後約２〜７日目に採取すべきであることが見いだされている。生物学的試料から採取される細胞はＢ細胞を含んでよい。従って、細胞がインビボ刺激化の後の短時間の内、好ましくはその約２〜５日の内に採取されることが好ましく、そうすればインビトロでのインキュベーションの後に培養培地中に特異抗体を分泌するであろう抗体形成細胞のインビボ誘導がもたらされる。短時間前に活性化されたＢ細胞による培養培地中への抗体のインビトロ分泌は、その培養物へのヘルパー因子の添加により促進することができる。ヘルパー因子は、インターロイキン１、２、３、４、５、６、７、および８、コロニー刺激化因子、インターフェロンを初めとする単独もしくは組合わされて用いられるサイトカイン、ならびに特異的Ｂ細胞分泌の亢進効果を有することが示されることがある他の因子であってよい。抗体を産生する方法は、抗体を増殖、および分泌および／または放出させる目的で単離させた細胞を活性化させる別の段階を含んでよい。この細胞活性化段階は、培養培地に細胞活性化剤を添加することを含んでよい。細胞活性化剤はマイトジェンおよび白血球により産生されるヘルパー因子、またはそれらの合成等価物もしくは組み合わせ物から選択することができる。マイトジェンは、ポークウィド（アメリカヤマゴボウ）（フィトラッカアメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａａｍｅｒｉｃａｎａ））から取得される産物（ポークウィドマイトジェン（ＰＷＭ）としても知られている）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリ（Ａ−Ｕ））、精製ツベルクリン（ＰＰＤ）、ポリイノシン酸− ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ−Ｃ））、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ブドウ球菌生物体もしくはその産物、バクトストレプトリシン（Ｂａｃｔｏｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ）Ｏ試薬（ＳＬＯ）、スタフィロコッカル（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ファージ溶菌物（ＳＰＬ）、エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ＥＢＶ）、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）水溶性マイトジェン（ＮＷＥＭ）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ）Ａ（ＣｏｎＡ）、およびデキストラン−硫酸、ならびにそれらの混合物を含む群から選択されてよい。細胞増殖剤は、Ｂ細胞増殖および／または抗体分泌を間接的にかもしくは直接もたらすいずれかの試薬であってよく、その例は固相抗−免疫グロブリンである。ヘルパー因子は、インターロイキン１、２、３、４、５、６、７、および８、コロニー刺激化因子、インターフェロンを初めとするサイトカイン、ならびに単独もしくは他の因子および試薬と組み合わせて添加される場合には、特異的Ｂ細胞増殖および／または抗体分泌の促進効果を有することが知られることがあってよいいずれかの他のヘルパー因子を含む群から選択されてよい。これはいずれにしても、マイトジェン、およびヘルパー因子を初めとする細胞活性化因子の余すところのないリストを意味するのではない。細胞のインビトロ培養は、細胞の亜集団を分離させるための前段階を伴ってか、もしくは伴わずに実施されてよい。抗体の回収は、培養培地からの上清の回収により実施されてよい。この上清は、インビトロでの培養中にこれらの細胞から分泌されるか、もしくは例えばＢ細胞の溶解によってＢ細胞から人工的に放出される抗体を含む。抗体含有性上清を、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の抗原を検出するために直接用いてよいことが見いだされている。本発明の好ましい態様では、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関連する抗原を同定するための方法が提供される。この方法は、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料；およびマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プローブ；を提供し；抗体プローブでマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料を探索して少なくとも一つの抗原を検出し；そして検出された抗原を単離することを含む。マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料は標準的緩衝溶液と混合され、そしてそこに含まれる蛋白質を分離させる目的で例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのような標準的支持体にかけることができる（図２）。別法では、それらの蛋白質は非イオン性洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（ＴＸ −１１４）を用いて選択されることがある。不溶性物質が遠心分離により除去されることがある。ＴＸ−１１４相中に可溶性となる蛋白質はその後には沈降析出することができる（図２）。分離蛋白質はその後にはニトロセルロース、ナイロン、もしくは他のシートに転移することができる。適切な抗体での探索は更には、このようにして産生された産物を検出アッセイに供することを含んでよい。検出アッセイはウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット技術を含んでよい。この検出アッセイは、免疫沈降アッセイ、放射免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイ、もしくは免疫蛍光アッセイであってよい（図３、４、および５）。先に記載される要領で産生される抗体は、単に培養培地から回収される上清の形態で利用することができる。別法では抗体が分離および精製することができる。本発明の更に別の好ましい態様では培養培地中に含まれる抗体が、抗体の親和性精製、好ましくは免疫親和性精製用に用いられることができる。従って好ましい態様では、抗原を精製するための方法が提供される。この方法は、粗精製抗原混合物；および適切な支持体上に固定化された、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する抗体を提供し；その粗精製抗原混合物を、固定化させた抗体を用いる親和性クロマトグラフィーに供し；そしてそのようにして形成された精製抗原を単離すること、を含む。抗体は通常の方法により培養物上清プローブから取得することができる。例えば、血清もしくは血漿から免疫グロブリンを精製するのに用いられる方法（一例では、硫酸アンンモニウムでの沈殿、カプリル酸での分画、イオン交換クロマトグラフィー、または固定化させたプロテインＧもしくはプロテインＡへの結合およびそこからの溶出による方法）が用いられてよい。そのようにして取得された抗体を、その後には適切な支持体（例えば、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、Ａｆｆｉ−ｇｅｌ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ社）、もしくは蛋白質に結合することができる他の親和性クロマトグラフィー用支持体）に結合させることができる。固定化させた抗体をその後には、親和性クロマトグラフィーによる複合体マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物からの特異抗原の分画化および精製にかけることができる。固定化させた抗体に抗原を結合させた後には、非結合の巨大分子種をその固体支持体から、例えば１．５ＭＮａＣｌを含む緩衝液で洗い落とすことができる。その後には、その抗原を親和性カラムから、例えば０．５〜３．０Ｍチオシアン酸ナトリウムのようなカオトロピックイオンを含む、例えば低ｐＨもしくは高ｐＨの緩衝液（一種類もしくは複数の種類）で溶離させることができる。抗体プローブを親和性クロマトグラフィーに適用させることにより、生化学的特徴決定、アミノ酸配列決定、および限定防御の研究のための動物のワクチン接種のために、複合体粗精製抽出物混合物からの充分量の特異抗原の迅速単離が可能となる。抗原（一つもしくは複数）を取得するための親和性クロマトグラフィーの適用により、データがほとんど知られていないかもしくは全く知られていない抗原の精製に通常の生化学的技術を適用する際に遭遇することがよくある問題が回避される。更に、「分析用」親和性クロマトグラフィーの目的のためにポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体を作製する必要性も未然に回避される。しかしながら大容量の調製にはポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の調製が必要であるかも知れない。抗原（一つもしくは複数）が同定されたら、分子生物学、化学的技術（例えば、クローニング技術）を用いて無制限の量でこの抗原を産生することがあってよく、もしくは別法では同定された抗原の様々な分画に相当する合成ペプチドがワクチンを産生するための手段として用いることができる。従って本発明の好ましい態様では、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する合成抗原性ポリペプチドを調製するための方法が提供され、この方法は、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料から取得されるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー；および先に記載される抗体プローブ；を提供し；そのｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーから合成ポリペプチドを作製し；その合成ポリペプチドを抗体プローブで検索し；そしてそれによって検出された合成抗原性ポリペプチドを単離することを含む。ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーのいずれかが用いられてよい。ｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーが、原核生物宿主（例えば細菌）もしくは真核生物宿主（例えば哺乳類細胞）のいずれかの中のクローンｃＤＮＡの転写および後続の発現を可能とするであろう適切な発現ベクター内に組み込まれることがあってよい。プローブは好ましくは、（ｉ）先に記載される要領で同定および精製される抗原のアミノ酸配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ；（ｉｉ）先に記載される要領で産生される培養培地から取得される抗体；（ｉｉｉ）先に記載される要領で同定および精製される抗原に対して産生されるモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体；（ｉｖ）例えばＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ，２４１，ページ５４４−５４６（１９８９）に記載される、抗原に対して特異性を示す組換えもしくは合成のモノクローナル抗体もしくはポリペプチド；から選択してもよい。本発明に従って産生される合成抗原性ポリペプチドは合成抗原性ペプチドおよび他の蛋白質を含む融合蛋白質であってよい。本発明の更に別の態様では、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原をコードするＤＮＡ断片が提供され、前記ＤＮＡ断片は図６ａおよび図６ｂに従う核酸配列、もしくはその相同配列および機能的活性断片を有する。本発明の更に別の好ましい態様では、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原をコードするＤＮＡ断片を含むクローンが提供され、前記ＤＮＡ断片は図６ａおよび図６ｂに従う核酸配列、もしくはその相同配列および機能的活性断片を有する。そのクローンがｐＣ１−２であることが好ましい。本発明はここで、付随する実施例および図面を参照すると一層完全に記載されるであろう。しかしながら今後の記述は単に説明を目的とするものであって、いかなる場合においても先に記載される本発明の一般性における制限として見なされるべきでないことは理解されるべきである。図面の説明：図１：各種のマイコプラズマのＳＤＳ抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）（クーマシーＲ２５０染色させたもの）の解説。レーン１予備染色させた分子量標準（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＳｔａｎｄａｒｄｓ）。レーン２Ｍ．ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）。レーン３Ｍ．シノビアエ（Ｍ．ｓｙｎｏｂｉａｅ）。レーン４Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。レーン５Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）。レーン６Ｍ．フロックラレ（Ｍ．ｆｌｏｃｃｕｌａｒｅ）。図２：Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の株の抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）（クーマシーＲ２５０染色させたゲル）の解説。レーン１予備染色させた分子量標準（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＳｔａｎｄａｒｄｓ）。レーン２Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株ＢｅａｕｆｏｒｔのＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物。レーン３レーン２と同一レーン４Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株ＢｅａｕｆｏｒｔのＳＤＳ抽出物。レーン５Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株１０１１０のＳＤＳ抽出物。図３：Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株ＢｅａｕｆｏｒｔからＴｒｉｔｏｎＸ−１１４で抽出し、血清および上清抗体プローブで探査した抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。レーン１抗体対照なし。レーン２ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）ブタ血清対照（１／２００）。レーン３ブタ（Ｐｉｇ）１０５上清。レーン４ブタ（Ｐｉｇ）１上清。レーン５ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）ブタ上清。図４：Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株ＢｅａｕｆｏｒｔからＳＤＳで抽出し、血清および上清抗体プローブを共に用いて探索した抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。レーン１ａ）ブタ（Ｐｉｇ）４５３上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）４５３血清（１／１００）。レーン２ａ）ブタ（Ｐｉｇ）１０５上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）１０５血清（１／１００）。レーン３ａ）ブタ（Ｐｉｇ）１上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）１血清（１／１００）。レーン４ａ）ブタ（Ｐｉｇ）上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）血清（１／１００）。レーン５ａ）ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）上清。ｂ）ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）血清（１／１００）。レーン６抗体対照なし。図５：Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）−株ＢｅａｕｆｏｒｔからＳＤＳで抽出し、血清および上清抗体プローブを共に用いて探索した抗原のウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１０．０％）上での抗原の分画化。レーン１ａ）ブタ（Ｐｉｇ）４５３上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）４５３血清（１／１００）。レーン２ａ）ブタ（Ｐｉｇ）１０５上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）１０５血清（１／１００）。レーン３ａ）ブタ（Ｐｉｇ）１上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）１血清（１／１００）。レーン４ａ）ブタ（Ｐｉｇ）１５上清。ｂ）ブタ（Ｐｉｇ）１５血清（１／１００）。レーン５ａ）ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）上清。ｂ）ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）血清（１／１００）。レーン６抗体対照なし。図６：４８ｋの全遺伝子配列。図７：４８ｋの遺伝子配列のｔＨＥ４８ｋＤａの蛋白質配列。実施例１マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）用培地フリス（Ｆｒｉｓｓ）培地 Hovind-Hougen，K.，Friss，N.F.，Research in Veterinary Science， 1991 ，51，pp 155-163，“Morphological & Ultrastructural Studies of M floccul are and M hyopneumoniae in vitro"。２５０ｍｌハンクス（Ｈａｎｋｓ）ＢＳＳ１４０ｍｌ水１．５グラム脳−心臓滲出液（ブレイン−ハート−インフュージョン（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ））１．６グラムＰＰＬＯブイヨンｗ／ｏＣＶ１２０℃、２０分間のオートクレーブ処理１８ｍｌイーストエキストラクト（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ）（７５０ｍｌ中の１００ｇＹＳＣ−２Ｓｉｇｍａ社）３．７ｍｌ０．２％ＤＮＡ（０．１％Ｎａ₂ＣＯ₃中）５．１４ｍｌ１％−ＮＡＤ０．６ｍｌ１％フェノールレッド（Ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ）ｐＨ７．３〜７．４に調節せよ０．４５μｍ、０．２μｍの膜を通過させて濾過し、４℃下に保存せよ。２０％になるまで滅菌したウマ（Ｈｏｒｓｅ）もしくはブタ（Ｐｉｇ）血清を添加し、そして使用前に抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）を添加せよ。エーテリッジ（Ｅｔｈｅｒｉｄｇｅ）培地 Etheridge，J.R.，Cottew，G.S.，Lloyd.，L.C.，Australian Veterinary Jou rnal，1979，August 55，pp 356-359，“lsolation of Mycoplasma hyopneumoni ae from lesions in experimentally infected pigs"。物質６００ｍｌに対する量ハンクス（Ｈａｎｋｓ）ＢＳＳ１８．９ｍｌハートレィズ−ディゲスト（ＨａｒｔｌｅｙｓＤｉｇｅｓｔ）ブイヨン１．２８グラム心臓滲出液（ＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）ブイヨン１．６５グラムラクトアルブミン加水分解産物２．２１グラムグルコース４．４１グラムイーストエキストラクト（ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ）自己溶解物８．８２ｍｌブタ（Ｐｉｇ）血清（濾過したもの）１６３ｍｌ１％ＮＡＤ６．１７ｍｌ１％フェノールレッド（Ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ）１．３２ｍｌ０．２％ＤＮＡ（０．１％Ｎａ₂ＣＯ₃中）４．４１ｍｌＭＱ水（約３５０〜４００ｍｌ）で６００ｍｌにメスアップせよ。ｐＨを７．４に調節し、そして：３．０μｍ、０．８μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍを通して濾過せよ。４℃に保存せよ。免疫メスブタの開発メスブタおよびナイーブな（抗原接触未経験の）若いメスブタ（ドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）と表示されるつがわせていないメスブタ）を選定せよ。様々な時期に、培養物として育成されたＭ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と肺ホモジネートとで攻撃誘発せよ。投与は鼻内および気管内で実施せよ。攻撃誘発期間−１９９１年９月〜１９９２年１月２１日。チアムリン抗生物質を１９９２年１月３１日〜１９９２年２月４日まで投与した。約８週間休止期間を置いた。感染性攻撃誘発Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株Ｂｅａｕｆｏｒｔの１２０ｍｌの凍結培養物を遠心分離により沈降させ（１２，０００×ｇ、２０分）そして５０ｍｌの完全培地中に再懸濁させ、そして３７℃で一晩培養させた。一晩培養させたこの培養物を遠心分離（１２，０００×ｇ）２０分）にかけ、そしてマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）細胞を１０ｍｌの無血清マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）培養培地中に再懸濁させた。濃縮させたマイコプラズマ１０ｍｌを、接種物が気管内に確実に挿入されるようにカテーテルを通じて、麻酔を施した免疫メスブタに投与した。攻撃誘発後３〜４日目にメスブタを屠殺し、そして肺に排出されるリンパ節を採取した（これらのリンパ節には、左右の気管気管支リンパ節および気管分岐部に位置するリンパ節が含まれる）。抗体プローブをブタリンパ節から調製し、そしてこれを利用して、先に引用されるオーストラリア特許第４９０３５／９０号に記載される仮想的防御抗原を検出した。分離細胞培養物は個々のリンパ節から取得した。培養物上清は培養後５日目に回収した。抗原の調製マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株Ｂｅａｕｆｏｒｔをエーテリッジ（Ｅｔｈｅｒｉｄｇｅ）培地内で、ｐＨが６．８と７．０との間に減少するまで培養した。Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細胞を、１２，０００×ｇで２０分間の遠心分離により培養物から回収し、滅菌したＰＢＳもしくは０．２５ＭＮａＣｌのいずれかで４回洗浄し、そしてその後にペレット化させた細胞を以下の方法の内の一つで抽出した。（ｉ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）細胞ペレットを０．２％ＳＤＳ中に再懸濁させ、そして３７℃で２時間抽出した。不溶性物質を１２，０００×ｇで１０分間、その抽出物からペレット化させ、そして可溶性抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）上で泳動させた。（ｉｉ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４Ｂｏｒｄｉｅｒ（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２５６：１６０４−１６０６）の方法を用いて、非イオン性洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を用い、膜蛋白質を選択的に抽出した。細胞ペレットを冷却ＰＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ（蛋白質）になるまで再懸濁させ、そして予備濃縮させたＴｒｉｔｏｎＸ−１１４の冷却溶液を添加して１％（ｖ／ｖ）最終濃度のＴＸ−１１４とした。抽出は、緩和な撹拌を伴う４℃での一晩のインキュベーションにより達成された。不溶性物質は１２，０００×ｇでの２０分間の遠心分離により除去した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４可溶性膜蛋白質をその後に、３７℃での相分離を達成することにより取得した。ＴＸ−１１４相に可溶な蛋白質を、担体であるデキストラン（８０，０００分子量）の存在下、−７０℃で８０％エタノールを用いて一晩沈降させた。蛋白質を１２，０００×ｇでの３０分間の遠心分離により回収し、そして４Ｍ尿素中５００μｇ／ｍｌになるまで溶解させた。抗原の同定６つの抗原が既述の技術を用いて同定された。同定された抗原は、免疫培養物およびドーキー（Ｄｏｏｋｉｅ）という若メスブタから抗体プローブにより同定されたものと一致すると同定された。この結果が表１にまとめられている。ＣＮＢＲ−臭化シアン断片Ｘは決定されなかったアミノ酸を表す。（Ａ／Ｂ）−ＡもしくはＢであってよい残基。４８ｋＤａの遺伝子のＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）（ＰＣＲ）用オリゴヌクレオチドプライマーを、Ｎ−末端および臭化シアン（ＣＮＢｒ）由来の内部ペプチドから取得されたアミノ酸配列から設計した。重複度の高い位置ではイノシン（Ｉ）での置換を施した。以下のプライマーが、ＢａｒｔｅｌｔＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅＲｏｂｏｔｉｃサーマルサイクラー装置内で実施される標準的ＰＣＲアッセイで用いられた。得られるＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲル上で可視化させ、切り出し、そしてＰｒｅｐ−ａ−Ｇｅｎｅ（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて精製した。これらを標準技術によりジデオキシ末端を有するＴ−ベクター（ＨｏｌｔｏｎａｎｄＧｒａｈａｍ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９：１１５６，１９９１）内にクローン化させ、そして核酸配列を決定した。先に示されるプライマーＦ１およびＦ２を用いる反応から取得されたＰＣＲ産物は約８１０塩基対のものであり、そして配列決定により、精製された天然の４６〜４８ｋＤａの蛋白質につき既に決定されていたアミノ酸配列をコードすることが示された。４８ｋの遺伝子のゲノムクローンの単離４８ｋの遺伝子および４８ｋＤａの蛋白質の全体（図６および７）を単離および配列決定した。この遺伝子は、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＣＬＡＩで消化させ、そしてその断片をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に連結させることにより作製されたＭ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のゲノムライブラリーから取得された。連結させた産物を、その後には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内に電気穿孔により挿入させ、そして細胞を１００ｐｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を含むルリア（Ｌｕｒｉａ）ブイヨンアガープレート（ＬＢ−Ａｍｐ）上でプレート培養した。このライブラリーを４８ｋＤａの蛋白質に特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物とのＤＮＡハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。陽性クローンをＬＢ−Ａｍｐ内で増殖させ、その細胞を回収し、そしてＤＮＡを単離し、そして確認のために部分配列決定を実施した。陽性クローンｐＣ１−２の完全な配列決定を実施し、そして蛋白質配列を演繹した。この配列を４８ｋＤａの蛋白質のＮ−末端および臭化シアン断片から取得される蛋白質配列と比較したところ、この遺伝子は所望される蛋白質をコードすることが見いだされた。アジュバントの選択５〜７週令の若ブタを、同定された抗原（一つもしくは複数）で免疫した。この抗原はＴｒｉｔｏｎＸ−１１４抽出物、ならびに４６〜４８、５２〜５３、６０〜６４、７０〜７５、９０〜９４、および１１０〜１１４ｋＤの同定された蛋白質を、単独もしくは組み合わせてのいずれかで含む。５〜１００μｇの間の蛋白質を含む抗原の免疫化用用量がアジュバントと組合わされて筋肉内注射により投与された。アジュバントは、（ｉ）ＳｅｐｐｉｃＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５０（ｉｉ）ＱｕｉｌｌＡおよび他のサポニン誘導体（ｉｉｉ）例えばＢａｙｏｌＦ／ＡｒｌａｃｅｌＡのような鉱油を利用する水中油型エマルジョン（ｖｉ）乳化剤としてのレシチンと共に例えばトウモロコシ油、ベニバナ油、もしくは他のもののような植物油を利用する水中油型のエマルジョン、（ｖ）水酸化アルミニウムゲル、および（ｖｉ）例えばＢＡＳＦ社（Ｕ．Ｓ．Ａ．）により産生されるＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７のような非イオン性ブロック重合体、から選択される。免疫化用用量は２〜４週間の間隔で投与され、用量回数はアジュバントおよび抗原量に依存するが、ただし２〜３回の用量が投与されることが好ましい。アジュバントは、ＥＬＩＳＡにより測定される際の、抗体力価を誘導する能力に基づき、かつ遅延型過敏症（Ｄｅｌａｙｅｄ−ＴｙｐｅＨｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（ＤＴＨ）反応により検査される誘導性の細胞媒介性免疫の評価により検査した。この結果により、抗体力価およびＤＴＨ応答を誘導するという点では鉱油タイプのアジュバントが終始一貫して優れていることが明白に示された（表２）。特に、商品名ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ−５０として市場に出回り、かつＳｅｐｐｉｃ社、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、から入手することが可能なアジュバントが適切であることが見いだされた。表２：ブタにおける抗体レベルおよびＤＴＨ応答は、Ｍ．ヒオプネウモニアエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの抗原の第３回目の注射の後２週間目に測定した。（− ＝応答なし；± ＝微かな発赤；＋＝微かな発赤および浮腫；＋＋＝発赤；＋＋＋＝発赤を伴うもしくは伴わない浮腫）。豚舎防御試験６週令の９頭の若ブタの群れを、以下の表３に示されるように精製された抗原および半精製された抗原で免疫化させた。これらの抗原は、アセトニトリル濃度勾配液を用いるギ酸溶媒系を用いる逆相ＨＰＬＣ上で精製した。抗原は、鉱油アジュバント中に取り込ませる前に４モル尿素中に可溶化させた。免疫化スケジュールは表２に示されるとうりである。抗原の用量部分精製したもの第１回目および第２回目のワクチン接種時。５０μｇ複合抗原／用量６２ｋＤ第３回目のワクチン接種時。２２０μｇ部分精製抗原／用量（精製された）７４＋５２ｋＤ第１回目のワクチン接種時。２０μｇの合計蛋白質量／用量第２回目のワクチン接種時。１３μｇの合計蛋白質量／用量第３回目のワクチン接種時。１７μｇの合計蛋白質量／用量（精製された）４８ｋＤ第１回目のワクチン接種時。２０μｇ／用量第２回目のワクチン接種時。１８μｇ／用量第３回目のワクチン接種時。２７μｇ／用量全ての蛋白質評価は「ＢＣＡ」蛋白質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ社、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ）により実施した。マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）での感染からの防御は、最終免疫化の後２週間目の感染性攻撃誘発により評価した。感染性攻撃誘発は、感染させた肺から調製された１０％（ｗ／ｖ）肺ホモジネート１０ｍｌの鼻内投与により、そして予め感染させてある若ブタと一緒に検査用の若ブタを居住させることにより達成した。感染性攻撃誘発後４週間目に動物を屠殺し、そして肺病変の広さおよび程度を評価した（表４）。引用文献 Warren H.S. and Chedid, L.A., Future Prospects for Vaccine Adjuvants C RC Critical Reviews in lmmunology 8:83-108, 1988。最後に、様々な他の変法および／または変更が本明細書にその概略が記載される本発明の真髄を逸脱することなく作製されることがあってよいことが理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 15/01 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＺＧ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 33/543 ５９７ 33/543 ５９７ 33/569 Ｆ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｅ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:35） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダウテイ，スチーブン・ウイリアムオーストラリア・ビクトリア3130ブラツクバーン・ダイアナドライブ１エイ【要約の続き】ｅ）感染に対するワクチン組成物の製剤の際のそれらの使用をも含む。

Claims

【特許請求の範囲】１．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する仮想的防御抗原であって、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プローブ（その抗体は：免疫動物を、感染部位もしくは病変領域または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されたマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物で攻撃誘発させた後、短時間の内に採取された生物学的試料を提供し；その生物学的試料から細胞を単離し；細胞を適切な培養培地中でインビトロで培養し；そして前記細胞から産生された抗体を回収することを含む方法により産生される）を提供し；そのマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料を抗体プローブで探索して少なくとも一つの抗原を検出し；そして検出された抗原を単離することを含む方法により調製される上記仮想防御抗原。２．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）がマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）である、請求の範囲１に記載の仮想的防御抗原。３．本明細書中に記載される１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８キロダルトン（ｋＤ）のおおよその分子量を有する抗原群より選択されるマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原、その突然変異体、誘導体、および断片。４．表面蛋白質である、請求の範囲３に記載の仮想的防御抗原。５．表面リポ蛋白質もしくは膜蛋白質である、請求の範囲３もしくは４に記載の仮想的防御抗原。６．１１０〜１１４、９０〜９４、７４、６２、５２、および４８ｋＤのおおよその分子量を有する請求の範囲３〜５の内のいずれか一つに記載の仮想的防御抗原。７．７２〜７５ｋＤ領域内の抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：を含む、請求の範囲３に記載の仮想的防御抗原。８．以下のＮ−末端アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を更に含む、請求の範囲７に記載の仮想的防御抗原。９．６０〜６４ｋＤ領域内の抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：を含む、請求の範囲３に記載の仮想的防御抗原。１０．５２〜５４ｋＤ領域内の抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：を含む、請求の範囲３に記載の仮想的防御抗原。１１．以下のＮ−末端アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を更に含む、請求の範囲１０に記載の仮想的防御抗原。１２．４６〜４８ｋＤ領域の抗原が以下のＮ−末端アミノ酸配列：を含む、請求の範囲３に記載の仮想的防御抗原。１３．以下の内部アミノ酸配列：の内の一つもしくは複数を更に含む、請求の範囲１２に記載の仮想的防御抗原。１４．マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原をコードする、以下の配列、その突然変異体、誘導体、組換え体、および断片：を含む単離された核酸断片。１５．抗原が以下の核酸配列、その突然変異体、誘導体、組換え体、および断片：を含む４６〜４８ｋＤ領域である、仮想的防御抗原をコードする、請求の範囲１４に記載の単離された核酸断片。１６．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する抗体を産生するための、免疫動物を、感染部位もしくは病変領域または感染部位もしくは病変に近接する領域から採取されたマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくはマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）抽出物で攻撃誘発させた後、短時間の内に採取した生物学的試料を提供すること；その生物学的試料から細胞を単離すること；細胞を適切な培養培地内でインビトロで培養すること；および前記細胞から産生される抗体を回収することを含む方法。１７．生物学的試料が、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）で攻撃誘発させた後の予め決められた時期、好ましくは攻撃誘発後２〜７日目に採取される、請求の範囲１６に記載の方法。１８．細胞のインビトロでの培養が更に、その培養物へのヘルパー因子の添加を含み、前記ヘルパー因子は単独もしくは組合わされて用いられるインターロイキン１、２、３、４、５、６、７、および８、コロニー刺激化因子、インターフェロンを初めとするサイトカイン、ならびに特異的Ｂ細胞分泌の亢進効果を有することが示されることがある他の因子から選択される、請求の範囲１６に記載の方法。１９．抗体を増殖、および分泌および／または放出させる目的で単離された細胞を活性化させることを含む細胞活性化段階を更に含み、前記細胞活性化段階は、培養培地に細胞活性化剤を添加することを含み、前記細胞活性化剤は本明細書に記載されるようにマイトジェンおよび白血球により産生されるヘルパー因子、またはそれらの合成等価物もしくは組み合わせ物を含む群から選択される、請求の範囲１６〜１８の内のいずれか一つに記載の方法。２０．抗体が、培養培地から回収された上清の形態をとる、請求の範囲１６〜１９の内のいずれか一つに記載の方法。２１．請求の範囲１６〜２０の内のいずれか一つの方法に従って調製されるマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する抗体。２２．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関連する仮想的防御抗原を同定する、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料；およびマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの抗体を含む抗体プローブ；を提供し；抗体プローブでマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料を探索して少なくとも一つの抗原を検出する；そして検出された抗原を単離することを含む方法。２３．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に関連する仮想的防御抗原を精製する、粗精製抗原混合物；および適切な支持体上に固定化された、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する抗体を提供し；その粗精製抗原混合物を、固定化させた抗体を用いる親和性クロマトグラフィーに供し；そしてそのようにして形成された精製抗原を単離することを含む方法。２４．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）好ましくはマイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する合成抗原性ポリペプチドを調製するための、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試料から取得されるｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリー；および請求の範囲１６に従って調製される抗体を含む抗体プローブ；を提供し；そのｃＤＮＡライブラリーもしくはゲノムライブラリーから合成ポリペプチドを作製し；その合成ポリペプチドを抗体プローブで検索し；そしてそれによって検出された合成抗原性ポリペプチドを単離することを含む方法。２５．抗体プローブが、マイコプラズマヒオプネウモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）もしくは関連感染に対する、本明細書に記載される１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８キロダルトン（ｋＤ）のおおよその分子量を有する抗原、その突然変異体、誘導体、および断片の群から選択される抗原に対して作製される抗体を含む、請求の範囲２４に記載の方法。２６．Ｎ−末端アミノ酸配列：を有する請求の範囲２４もしくは２５に記載の方法により産生される７２〜７５ｋＤ領域の合成仮想的防御抗原。２７．更に内部アミノ酸配列：を含む、請求の範囲２６に記載の合成仮想的防御抗原。２８．Ｎ−末端アミノ酸配列：を有する請求の範囲２４もしくは２５に記載の方法により産生される６０〜６４ｋＤ領域の合成仮想的防御抗原。２９．Ｎ−末端アミノ酸配列：を有する請求の範囲２４もしくは２５に記載の方法により産生される５２〜５４ｋＤ領域の合成仮想的防御抗原。３０．更に内部アミノ酸配列：を含む、請求の範囲２９に記載の合成仮想的防御抗原。３１．Ｎ−末端アミノ酸配列：を有する請求の範囲２４もしくは２５に記載の方法により産生される４６〜４８ｋＤ領域の合成仮想的防御抗原。３２．更に内部アミノ酸配列：を含む、請求の範囲３１に記載の合成仮想的防御抗原。３３．請求の範囲１〜３１の内のいずれか一つに記載のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する少なくとも一つの仮想的防御抗原の予防的有効量を含むワクチンもしくは獣医学的組成物。３４．１１０〜１１４、９０〜９４、７２〜７５、６０〜６４、５２〜５４、および４６〜４８キロダルトンのおおよその分子量を有する抗原から選択される複数の仮想的防御抗原を含む、請求の範囲３３に記載のワクチンもしくは獣医学的組成物。３５．請求の範囲２１に記載のマイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する抗体を含むワクチンもしくは獣医学的組成物。３６．請求の範囲１〜１３および２６〜３２の内のいずれか一つに記載される診断用抗原もしくはその断片を含む診断用キット。３７．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）感染を予防もしくは治療するための、請求の範囲１〜１３の内のいずれか一つに記載の少なくとも一つの仮想的防御抗原の予防的もしくは治療的有効量を動物に投与することを含む方法。３８．マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）もしくは関連感染に対する仮想的防御抗原をコードし、図６に記載の核酸配列もしくは相同配列、およびその機能的活性断片、突然変異体、変異体、もしくは組換え体を有する単離されたＤＮＡ断片。３９．請求の範囲３８に記載のＤＮＡ断片を含むクローン。４０．本明細書中これ以前に記載のクローンｐＣ１−２である、請求の範囲３９に記載のクローン。４１．請求の範囲３８に記載のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列もしくはその機能的等価物。４２．図７のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列もしくはその機能的等価物。４３．実施例を参考にして本明細書中これ以前に実質的に記載される仮想的防御抗原もしくは抗体。