JP2001504335A

JP2001504335A - ストレプトコッカス・ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質

Info

Publication number: JP2001504335A
Application number: JP52199298A
Authority: JP
Inventors: ジアン，ミン; エー．ポッター，アンドリュー; ロナルドマクラクラン，フィリップ
Original assignee: ユニバーシティオブサスカッチェワン
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2001-04-03
Also published as: EP0948528A2; AU5044198A; BR9713355A; CA2270404A1; IL129566A0; WO1998021231A2; WO1998021231A3; KR20000068980A

Abstract

(57)【要約】ストレプトコッカス・ユベリス（Ｓ．ユベリス）のウシラクトフェリン（ｂＬＦ）結合タンパク質、並びにｂＬＦをコードする遺伝子（ｌｂｐ）を記載する。ＬＦ結合タンパク質は、Ｓ．ユベリス感染、特に乳腺症の予防および治療のためのワクチン組成物において、並びにＳ．ユベリス感染の存否を決定する診断方法において用いることができる。ｍｇａと呼ばれるｌｂｐに隣接した調節領域も開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ストレプトコッカス・ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質技術分野本発明は一般に細菌抗原に関する。より詳しくは、本発明はストレプトコッカス・ユベリス（Streprococcus uberis；S．uberis）由来のウシラクトフェリン結合タンパク質の特徴づけおよび組換え生産並びにそれの利用に関する。本発明はまた、ラクトフェリン結合タンパク質遺伝子の上流に置かれた調節領域ｍｇａの特徴づけにも関する。背景乳腺の感染症である乳腺炎は、毎年酪農業に大きな経済損失を引き起こしている。ストレプトコッカス・ユベリス（Streprococcus uheris；S．uheris）は乳牛の乳腺炎の症例の高比率の原因である環境的病原体であり、そして非泌乳期の乳腺から単離される主な生物である〔Bramley，A.J．(1984)Br．Vet．J．140:32 8-335:Bramley & Dodd（1984）J．Dairy Res．51:481-512;Oliver，S.P．（1988 ）Am．J．Vet．Res．49:1789-1793〕。Ｓ．ユベリスの感染から起こる乳腺炎は通常無症状であり、白血球の流入によって体細胞数が増加した見かけ上正常な乳汁により特徴付けられる。血液から乳汁へと塩化ナトリウムと炭酸水素ナトリウムが移動して分泌を抑制し、よりアルカリ性の方へとｐＨのシフトを引き起こすため、乳汁の化学組成が変化する。Ｓ．ユベリス乳腺炎は、乳汁の変色や凝固および乳腺の腫大や硬化といった明らかな病気の徴候を伴う、急性臨床的症状の形態をとることもある。臨床的疾患の症例には深刻なものもあり、発熱も起こりうる。Ｓ．ユベリス乳腺炎の臨床的症状発現の概要については、Bramley（1991）Mastitis:physiologyor pathology． p.3-9;C．Burvenich，G．Vandeputte-van Messom & A.W．Hill編，New insights into the pathogenesis of mastitis．Rijksuniversiteit Gent，Gelgium；およびSchalm他（1971）The mastitis complex-A brief summary．p.1-3，Bovine Mastitis．Lea & Febiger，Philadelphiaを参照のこと。Ｓ．ユベリス感染の病因はあまり解明されていない。更に、宿主防御機構や乳腺生理学に対するＳ．ユベリス毒性因子の影響は十分限定されていない。Ｓ．ユベリスに関連する既知の毒性因子としては、ヒアルロン酸莢膜、ヒアルロニダーゼ、Ｒ様タンパク質、プラスミノーゲン活性化因子およびＣＡＭＰ因子が挙げられる。しかしながら、病原性におけるそれら毒性因子の役割についてはほとんど知られていない。ラクトフェリン（Ｌｆ）は多形核白血球（ＰＭＮ）および種々の外分泌腺により分泌される哺乳類鉄結合性糖タンパク質である〔Baggiolini他（1990）J．Exp ．Med．131:559-570;Masson他（1966）Clin．Chim．Acta 14:735-739〕。このタンパク質は乳汁中と粘膜表面に高濃度で見つかる〔Masson他，前掲；Reiter & O ram（1967）Nature 216:328-330〕。例えば、乳び管分泌液中のウシラクトフェリン（ｂＬｆ）濃度は、感染の発症度によって、急性ウシ乳腺炎の期間中30倍にまで増加し得る〔Harmon他（1976）Infect．Immun．13:533-542〕。内皮表面へのＰＭＮの付着、顆粒球−単球コロニー刺激因子のフィードバック阻害および抗体産生の制御をはじめとする様々な生理学的経路におけるＬｆの制御機能が提唱されている。上記経路において或る種の哺乳類細胞とＬｆとの特異的相互作用が関係すると思われ、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、ＰＭＮ、活性Ｔリンパ球および肝細胞上にＬｆに特異的なレセプターが同定されている〔Bennet & Dav is（1981）J．Immunol．127:1211-1216;Dehanne他（1985）Am．J．Physiol．248 :463-469;Maneva他（1983）Int．J．Biochem．15:981-984;Rochard他（1989）FE BS Lett．255:201-204;およびvan Snick & Masson（1976）J．Exp．Med．144:15 68-1580〕。Ｌｆは試験管内でＥ．コリや他の幾つかの微生物の増殖を抑制する〔Bullen他（1972）Br．Med．J．1:69-75〕。このＬｆ媒介抗菌作用は、主として細菌の鉄剥奪能力によるとされている〔Arnold他（1977）Science 197:263-265;Law & Re iter（1977）J．Dairy Res．44:595-599;Oram & Reiter（1968）Biochim．Bioph ys．Acta 170:351-365〕。この点において、幾つかの例外を除いて、微生物増殖には鉄が不可欠であることは周知である〔Weinberg，E.D．（1978）Microbiol． Rev．42:45-66〕。哺乳類組織内には鉄が豊富であるが、哺乳類の体内にある鉄は事実上全てフェリチンとしてまたはヘム化合物として細胞内に保持され、侵入微生物は通常そのプールに接近できない。その上、細胞外間隙中に存在する少量の鉄は、高親和力鉄結合性宿主糖タンパク質（例えば血清やリンパ中に存在するトランスフェリン（Ｔｆ）、および分泌液や乳汁中に存在するＬｆ）により効率的にキレート化される〔Otto他（1992）Crit．Rev．Microbiol．18:217-233〕。この欠乏を解消するために、細菌病原体は特異的鉄取込み機構を発達させた。多くの細菌種ではそれらの機構が第二鉄イオン（FeIII）に対して高親和性を示すシデロフォア（シデロクロム）と呼ばれる小化合物の合成と分泌を含む。シデロフォアは、ＴＦまたはＬｆに結合した鉄を遊離させてフェリシデロフォア錯体を形成することができ、次いでその錯体が特異的な鉄抑制性膜レセプターにより認識され、そして細菌の中に取り込まれ、そこで鉄が放出される〔Crosa，J.H．(1989)Microbiol．Rev．53:517-530〕。この鉄取込み機構は多数のグラム陰性菌種について記載されている。グラム陰性菌の中には鉄欠乏環境の中で増殖させると検出可能なシデロフォアを分泌しないものがあるが、しかしＴｆまたはＬｆに直接に且つ特異的に結合することによって細菌細胞への鉄輸送を可能にする外膜タンパク質を生産する。Ｔｆ結合は、細菌の外膜に存在する２つのタンパク質、すなわちトランスフェリン結合タンパク質１と２（Ｔｂｐ１とＴｂｐ２）の活性によって媒介されるようである〔Gonzalez他（1990）Mol．Microbiol．4:1173-1179;Ogunnariwo & Sch ryvers（1990）Infrect．Immun．58:2091-2097;Schryvers，A.B．(1989)J．Med ．Microbiol．29:121-130;Schryvers & Lee（1989）Can．J．Microbiol．35:409 -415;Schryvers & Morris（1988）Mol．Microbiol．2:467-472〕。トランスフェリン結合タンパク質はそれらの天然宿主のトランスフェリンに高度に特異的である性質を有する。しかしながら、Ｌｆからの鉄取込み機構は十分に特徴づけられていない。推定 105kDa（キロダルトン）のＬｆレセプターＬｂｐ１がアフィニティー単離により淋菌において同定されている〔Schryvers & Lee前掲；Cornelissen他（1992）J ．Bacteriol．174:5788-5797;Lee & Bryan（1989）J．Med．Microbiol．28:199- 204〕。Ｌｂｐ１の構造遺伝子（ｌｂｐＡと呼ばれる）も単離されている〔Biswa s & Sparling（1995）Infect．Immun．63:2958-2967〕。髄膜炎菌ラクトフェリンレセプター遺伝子も特徴づけられている〔Petterson他（1993）Infect．Immun ．61:4724-4733;Petterson他（1994）J．Bacteriol．176:1764-1766;Petterson 他（1994）Microb．Pathog．17:395-408〕。淋菌と髄膜炎菌のｌｂｐＡのＤＮＡ配列およびＬｂｐ１の推定アミノ酸配列は高度に保存されている（94％同一）。Ｌｂｐ１は同じ淋菌株のＴｂｐ１と46％同一であるが〔Cornelissen他（1992 ）J．Bacteriol．174:5788-5797〕、Ｔｂｐ２とはわずか18％のみ同一である〔A nderson他（1994）J．Bacteriol．176:3162-3170〕と示されている。淋菌と髄膜炎菌の両者が比較的良く保存されたFurボックスを含み、タンパク質はTonB依存性レセプターファミリーに相同であり、それはＴｂｐ１には当てはまる（Cornel issen他、前掲）がＴｂｐ２には当てはまらない（Anderson他、前掲）。Ｌｆレセプタータンパク質であるＬｂｐ１とＴｆレセプタータンパク質であるＴｂｐ１との間の著しい類似性は、細菌細胞へのＬｆの結合がＴｆ結合と類似しているかもしれないことを示唆する。この仮説と一致するのは、ｌｂｐＡの上流の転写解読枠ｌｂｐＢによりコードされる推定タンパク質がＴｂｐ２と広範囲の相同性を示す〔Petterson他（1994）Microb．Pathog．17:395-408〕という事実である。この事実は、Ｌｆからの鉄獲得が、Ｔｆからのと同様に、外膜中の２つの特定タンパク質を必要とすることを示唆する。グラム陰性菌の鉄取込み機構の知見とは対照的に、グラム陽性病原体は細胞外体液中での増殖中に鉄を獲得する機構に関する情報は比較的少ない。Ｓ．アウレウス（S．aureus）とコアギュラーゼ陰性ブドウ球菌の両者がシデロフォアを産生すると報告されている〔Konetschny-Rapp他（1991）Eur．J．Biochem．191:65 -74;Meiwes他（1990）FEMS Microbiol．Lett．67:201-206〕。Ｓ．アウレウスはヒトおよびウシＬｆとヒトＴｆの両方を結合できるようだ〔Naidu他（1991）J． Med．Microbiol．34:323-328;Naidu他（1991）J．Dairy Sci．74:1218-1226;Nai du他（1992）J．Med．Microbiol．36:177-183;Modun他（1994）Infect．Immun． 62:3850 -3858〕。ＬｆとウシＳ．アガラクティエ（S．agalactiae）株との相互作用も報告されている〔Rainard，P．(1992)FEMS Microbiol．Lett．98:235-240〕。しかしながら、それらのＴｆまたはＬｆ結合タンパク質の鉄獲得機能は研究されていない。Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質は、ヒト食細胞による攻撃を妨げる能力があるためにこの生物の主な毒性因子の１つであると考えられる〔Lancefield，R.C．(1962 )J．Immunol．89:307-313〕。Ｍ分子に対して抗体が産生されるまで、細菌は感染組織に居座る。Ｍタンパク質に対する型特異的抗体は該分子の抗食作用を逆転させそして侵入生物を効率的にクリアランスすることができる。例えば、Ｍタンパク質は、食作用に対する耐性を媒介するのにそれらが関係していること〔Keho e，M.A．(1991)Vaccine 9:797-806〕と、それらが超抗原性によって潜在的に有害な宿主免疫応答を誘導する能力があり且つ宿主交差反応性抗体応答を誘導する能力があること〔Bisno，A．Ｌ．(1991)New Engl．J．Med．325:783-793;Froude 他（1989）Curr．Top．Microbiol．Immunol．145:5-26;Stollerman，G.H．（199 1）Clin．Immunol．Immunopathol．61:131-142〕から、Ｓ．ピオゲネス（S．pyo genes）の重要なビルレンス因子の１つである。Ａ群連鎖球菌（ＧＡＳ）では、Ｍタンパク質遺伝子（emm）およびペプチダーゼ遺伝子（scpA）並びに存在する場合、Ｍタンパク質関連IgGおよびIgA結合タンパク質をコードする遺伝子（それぞれfcrAおよびenn）が染色体上でクラスターを形成している〔Haanes他（1992）J．Bacteriol．174:4967-4976;Hollingshead 他(1993)Mol．Microbiol．8:707-717;Podbielski，A．(1993)Mol．Gen．Genet．237 :287-300〕。それらの毒性関連表面タンパク質の発現は、正式にはＭｒｙまたはＶｉｒＲと呼ばれる、タンパク質Ｍｇａ（これはＡ群連鎖球菌属の多遺伝子調節因子を意味する）によって転写レベルで同時制御されている〔Caparon & Scott（1987）Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 84:8677-8681;Chen他（1993）Mol．Gen．Genet．241:685-693;Haanes & C leary（1989）J．Bacteriol．171:6397-6408;Mclver他（1995）J．Bacteriol．1 77 :I.:6619-6624;Perez-Casal他（1991）J．Bacteriol．173:2617-2624；Podbie lski他（1995）Infect．Immun．63:9-20;Podbielski，A．(1992)Med．Microbiol ．Immunol．181:227-240：Robbins他（1987）J．Bacteriol．169:5633-5640〕。ＭｇａはＧＡＳ中の極めて重要な調節系の一部、恐らく２成分調節系の第二成分として機能するものであると思われる。予防接種は、新たな感染に対する乳腺の抵抗力を増加させ且つ病気の臨床的発症度を減らすための１つのアプローチである。従来の研究は、Ｓ．ユベリスによる一次感染が同一株による二回目のチャレンジ後の感染率をかなり減少できることを示した〔Hill，A.W．（1988）Res．Vet．Sci．44:386-387〕。Ｓ．ユベリス死菌による局所予防接種は相同株による乳房内チャレンジに対してウシ乳腺を保護する〔Finch他（1994）Infect．Immun．62:3599-3603〕。同様に、生存Ｓ．ユベリスによる皮下予防接種も同一株による乳腺炎の発病の大幅な改善を引き起こすことが示された〔Hill他（1994）FEMS Immunol．Med．Microbiol．8:109-118 〕。こうして予防接種した動物はその乳汁中に少数の細菌しか発生せず且つ多くの四肢動物が感染しないままである。しかしながら、生存菌または弱毒化菌を使った予防接種は受容体に対して危険を及ぼす恐れがある。従って、Ｓ．ユベリスに対して使用するためのサブユニットワクチン組成物を提供することが望ましい。今まで、Ｓ．ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質は特徴づけられておらず、そしてワクチン組成物にそれを使用することは記載されていない。発明の開示本発明は、Ｓ．ユベリスからのウシラクトフェリン（ｂＬｆ）結合タンパク質（ｂＬｂｐ）の発見およびそれの特徴づけに基づく。ｂＬｆ結合タンパク質をコードする遺伝子ｌｂｐ、並びに前記遺伝子の上流調節因子ｍｇａもクローニングした。ｂＬｆ結合タンパク質、それの免疫原性断片および類似体、並びに／またはそれを含むキメラタンパク質は、単独でまたは別の抗原と組み合わせて、哺乳動物宿主において細菌感染からの保護を提供する新規サブユニットワクチンにおいて使用することができる。従って一態様では、本発明は、単離された免疫原性Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質、並びに免疫原性Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質のコード配列を含んで成る核酸分子に向けられる。追加の態様では、本発明は前記核酸分子を含有する組換えベクター、それらのベクターにより形質転換された宿主細胞、およびＳ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質を組換え生産させる方法に向けられる。別の態様では、本発明は医薬上許容される賦形剤と免疫原性Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質とを含んで成るワクチン組成物に向けられる。更に別の態様では、本発明は哺乳動物被検体においてＳ．ユベリス感染、例えば乳腺炎を治療または予防する方法に向けられる。この方法は前記被検体に上記ワクチン組成物の治療有効量を投与することを含んで成る。追加の態様では、本発明は(a)免疫原性Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質を提供し；そして(b)該タンパク質を医薬上許容される賦形剤と混合することを含んで成る、ワクチン組成物の製造方法に関する。更なる態様では、本発明はＳ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質に対する抗体に向けられる。追加の態様では、本発明は生物学的試料中のＳ．ユベリス抗体を検出する方法であって、 (a)生物学的試料を用意し； (b)生物学的試料中に存在する時、Ｓ．ユベリス抗体がＳ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質に結合して抗原／抗体複合体を形成するような条件下で、前記生物学的試料をＳ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質と反応させ；そして (c)前記複合体の存否を検出し、それによって前記試料中のＳ．ユベリス抗体の存否を検出することを含んで成る方法に向けられる。更に別の態様では、本発明はＳ．ユベリス感染を検出するための免疫診断試験キットに向けられる。この試験キットは、Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質と免疫診断試験を実施するための使用説明書を含んで成る。他の態様では、本発明は単離されたＳ．ユベリスＭｇａタンパク質、並びにそれのコード配列を含んで成る核酸分子に向けられる。本発明の上記および他の態様は、本明細書中の開示を考慮すれば当業者が容易に考えつくであろう。図面の簡単な説明図１はｌｂｐの制限酵素地図であり、ｂＬｆの進行性欠失と結合データの要約を示す。白抜きの箱（ｐ領域）はプロモーターとリボソーム結合部位を含む５’ 配列を表し、陰影を付けた箱（ｓ領域）はシグナルペプチドをコードするｌｂｐ配列を表し、そして斜線を引いた箱は成熟または先端が切り取られたタンパク質をコードするｌｂｐ配列を表す。Ｒ１とＲ201（Ｒは残基を意味する）はそれぞれ、pLBP5中の成熟タンパク質の最初のコドンとpTP51中の先端が切り取られたタンパク質の最初のコドンを示す。その他の数字は各タンパク質の最終コドンを示す。ｌｐｂの上に制限部位が与えられている。各クローンのｂＬｆ結合能が右側に示される。図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）は、Ｓ．ユベリスウシＬｂｐのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。ヌクレオチドとアミノ酸は配列の右側に番号付けられている。推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。232位と262位にある２つの可能なＡＴＧ開始コドン、および1915位にあるＴＡＡ終始コドンはボールド体で示される。２つの推定−35および−10プロモーター配列並びにシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ）が指摘されている。推定ロー（ρ）因子非依存性転写ターミネーター（Ｔ）には下線が引かれている。二重の下線はＯＲＦのＮ末端にある推定シグナルペプチドの存在を示す。Ｃ末端の疎水性膜貫通領域はイタリック体で示され、近くの表面固定モチーフはイタリック体と二重下線により示される。中央部の反復アミノ酸配列はＡ，ＢおよびＣの文字により示される。図３は、Ｌｂｐの二次構造、荷電残基および疎水性のプロフィールを示す。Ｌｂｐの推定アミノ酸配列をNovotny-Auffray演算法により解析した。Turn、Beta およびAlphaと印したプロットは、それぞれβターン−ランダムコイル、βシートおよびαヘリックス形成の可能性を示す。＋／−プロットは、正電荷（上）および負電荷（下）を有する分子の領域を示す。疎水性(Hydro)プロットはタンパク質の疎水性領域を示す。アミノ酸位置が横軸に示される。図４は、pLBP5iとpMGA14からのpMGA14Fの作製を示す。プラスミドpMGA14Fは、 pMGA14のSphI部位とNheI部位の間にpLBP5iの1.5kbSphI−NheI断片を挿入することにより作製した。線はＳ．ユベリスＤＮＡを示し、箱はベクタ-pTZ18Rの多重クローニング部位を示す。サザンブロットまたはノーザンブロット実験に使用するプローブ断片は、斜線を引いた棒により示される。矢印はｌｂｐ，ｍｇａ’およびｍｇａの転写解読枠の位置を示す。図５Ａ〜５Ｄ（配列番号３〜12）は、ｍｇａのヌクレオチド配列とＭｇａの推定アミノ酸配列、並びにｍｇａの下流のＯＲＦを示す。ヌクレオチドとアミノ酸の番号は配列の右側に示される。推定アミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字記号として示される。可能なＡＴＧ開始コドンはボールド体で示され、そして終止コドンは“^*”により示される。推定−35および−10プロモーター配列並びにシャイン−ダルガルノ配列（ＳＤ）も示される。図６は、ハイブリダイゼーション分析に使うプローブと、ＤＮＡ配列分析から構成したＬｂｐの構造（最上部）に示す。シグナルペプチド、高プロリン領域および膜貫通領域がそれぞれＳ，ProおよびＴＭで示される。Ａ，ＢおよびＣ反復領域も示される。ハイブリダイゼーションで使用するプローブは斜線を引いた棒により地図の下に示される。図７はＳ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合の経時変化を示す。10⁹個の細菌を 0.2mlのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中6.9nMの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆと共にインキュベートした。指示した時間間隔で細菌をペレットにし、そして細菌細胞に結合した¹²⁵Ｉ− ｂＬｆの量を測定した。図８は、放射性標識リガンドおよび競合相手としてｂＬｆ（33％鉄飽和のもの）を使った競合結合アッセイの結果を示す。％結合値は、未標識ｂＬｆの非存在下でのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に懸濁した細菌への¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合に対する、増加する量の未標識ｂＬｆの存在下での¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合の比率として計算した。挿入図：Ｓ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆの結合のスキャッチャードプロットおよび親和性（Ｋｄ）。直線は線形回析により分析した時の最大近似を表す。 270nMの未標識ｂＬｆの濃度が¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合の50％置換を引き起こした（点線で示す）。図９は、Ｓ．ユベリスによるラクトフェリン結合の発現に対する鉄キレート化剤の影響を示す。EDDA、ジピリジルまたはデスフェリオキサミンメシレートの有無のもとTHB-YE中で増殖させた細胞を、0.2mlのＰＢＳ−１％ＢＳＡ中6.9nMの¹² ⁵ Ｉ−ｂＬｆと共に室温で２時間インキュベートした。３回洗浄した後、細胞に結合した放射能を測定した。図10は、実施例３においてＬｂｐの発現に使用する組換えプラスミドの物理的地図である。プラスミドpLBP5は、ベクターpTZ18R中に3.7kbのＳ．ユベリス由来のkDNAを含む。pLBP5からのSphI−RsaI断片をベクターpGH433中にサブクローニングすることによりプラスミドpGHLBPを作製した。Ｐ_tacはtacプロモーターの位置を示す。Ｌｂｐ遺伝子はｌｐｂと標示した矢印により示される。図11は、Ｓ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−標識ｂＬｆ結合に対する組換えｂＬｆ結合タンパク質の阻害を示す。増加する量のＥ．コリpLBP5（●）またはＥ．コリpTZ 18R（○）の上清（sup.）と全細胞溶解物の混合物（同容量での）を、10⁹個のＳ．ユベリス細胞と混合し、そして0.2ml容量中の0.69nM ¹²⁵Ｉ−ｂＬｆと共にインキュベートした。Ｅ．コリ試料を全く含まないＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に懸濁したＳ．ユベリスに対するｂＬｆ結合の相対比率として阻害値を算出した。具体的記載本発明のプラクチスは、特に断らない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の常用技術を使用する。そのような技術は文献中に詳しく説明されている。例えばSambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第Ｉ，IIおよびIII巻，第二版(1989);DNA Cloning,第ＩおよびII巻(D.N ．Glover編，1985)；Oligonucleo-tide Synthesis(M.J．Gait編，1984);Nucleic Acid Hybridiza-tion(B.D．Hames＆S.J．Higgins編，1984)；Animal CellCultu re(R.K．Freshney編，1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press，1986) ；Perbal，B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；双書のMethod s in Enzymology(S．Colowick & N．Kaplan編，Academic Press，Inc.）；およびHandbook of Experimantal Immunology,第Ｉ〜IV巻(D.M．Weir & C.C．Blackw ell編，1986，Blackwell Scientific Publications)を参照のこと。Ａ．定義本発明を説明する上で、次の用語を使用するが、それは下記に記載のように定義される。本明細書および請求の範囲で使用する時、単数形として示すものは、その内容を具体的に規定しない限り、複数のものも包含することに注意すべきである。例えば、単に「Ｌｂｐ」として言及されるものは、２以上のＬｂｐの混合物を包含する。「ラクトフェリン結合タンパク質」、「Ｌｇ結合タンパク質」および「Ｌｂｐ」（これらは相互に交換可能に使われる）またはそれをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、Ｓ．ユベリスｌｂｐ遺伝子より誘導される、タンパク質またはヌクレオチド配列を意味する。代表的なＳ．ユベリスｌｂｐ遺伝子のヌクレオチド配列およびこの遺伝子によりコードされるＬｆ結合タンパク質の対応アミノ酸配列は、図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）に表される。しかしながら、Ｓ．ユベリスには数種類のサブタイプが知られており、Ｓ．ユベリスの株間でＬｆ結合タンパク質の変異が起こるだろうから、ここに定義されるＬｆ結合タンパク質は図面に記載の配列に限定されない。更に、誘導されるタンパク質またはヌクレオチド配列は、上述した遺伝子から物理的に誘導される必要はなく、例えば、本明細書中に提供される情報に基づいた、化学合成、単離（例えばＳ．ユベリスから）または組換え生産によるものをはじめとする、任意の方法で生成することができる。更に、そのような用語は、免疫活性および／またはラクトフェリン結合活性を示す、前記遺伝子によりコードされる連続アミノ酸配列に対して「実質的に相同である」（この用語は下記に定義される）アミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。かくして、前記用語はタンパク質の全長配列だけでなく、免疫原性配列、先端が切り取られた配列および部分配列、並びに活性類似体および前駆体形を意味する。また、この用語には、遺伝子の少なくとも約８個の連続塩基対、より好ましくは少なくとも10〜20個の連続塩基対、最も好ましくは少なくとも約25〜50個以上の連続塩基対を含む、遺伝子のヌクレオチド断片が包含される。そのような断片は下記に詳しく記載するようにプローブとしておよび診断方法において有用である。前記用語は、プロセシング形、欠失形、シグナル配列およびそれをコードする核酸配列も包含する。その上、この用語は膜固定領域を欠くＬｆ結合タンパク質、およびそのような欠失をコードする核酸配列も意味する。そのような欠失は、タンパク質の分泌を行うものではない系において望ましいだろう。更に、ほぼＮ末端の200コドンの中に見つかるＬｆ結合領域は存在してもしなくてもよい。例えば、Ｌｆ結合タンパク質をＬｆの精製に使うならば、Ｌｆ結合領域は保持されるだろう。該タンパク質をワクチン組成物に使うつもりならば、Ｌｆ結合領域を含むかまたは含まない免疫原性エピトープが存在するだろう。前記用語は、調製方法によって、天然形のタンパク質または塩基性塩もしくは酸付加塩の形のタンパク質も包含する。そのような酸付加塩は遊離アミノ基を含み、そして塩基性塩は遊離カルボキシルとで形成される。医薬上許容される塩基性塩および酸付加塩は下記に記載する。更に、該タンパク質は、脂質（該分子と一緒に天然に存在する脂質と免疫活性を破壊しない別の脂質の両方）や糖質などの別の生物学的物質との結合により、または側鎖の修飾（例えばアミノ基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖のリン酸化、スルフヒドリル基の酸化、アミノ酸残基のグリコシル化）により、あるいはコードされる一次配列の別の修飾により修飾されてもよい。従って、前記用語は、ポリペプチドが本明細書に定義されるような免疫応答を生じる機能を果たす限り、配列に欠失、付加および置換を含むものを意味する。この点で特に好ましい置換は、本質的に保存的な置換、例えばアミノ酸のファミリー内で行われる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般に次の４つのファミリーに分けられる：(1)酸性…アスパラギン酸およびグルタミン酸；(2)塩基性…リジン、アルギニン、ヒスチジン；(3)無極性…アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および(4)無荷電で極性…グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時々芳香属アミノ酸として分類されることがある。例えば、ロイシンからイソロイシンもしくはバリンへの個々の置換、またはその逆；アスパラギン酸からグルタミン酸への置換、またはその逆；スレオニンからセリンへの置換、またはその逆；あるいは１つのアミノ酸から構造的に類似した別のアミノ酸への保存的置換は、生物活性に重要な影響を及ぼさないだろうと合理的に推測できる。タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさないようなわずかなアミノ酸置換を有すること以外は、標準分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、標準ポリペプチドの定義の中に含まれる。「乳腺炎」とは、Ｓ．ユベリスの存在によって引き起こされる、雌牛、雌羊、ヤギ、雌豚、雌馬などをはじめとする哺乳動物の乳腺の炎症を意味する。この感染は乳腺への食細胞の浸潤によりその症状を発現する。一般に、乳腺炎には次の４つの臨床的類型が知られている：(1)乳腺の腫大、熱、痛みおよび異常分泌に関係し、そして発熱や顕著な抑うつ、速くて弱い脈、くぼみ目、虚弱および完全な食欲不振といった他の全身的傷害の徴候を伴う、超急性乳腺炎；(2)上記と同様な乳腺の変化を有するが、発熱、食欲不振および抑うつが軽度から中度である、急性乳腺炎；(3)全身的変化はないが、乳腺の変化とその分泌の変化をわずかに示す、実質性乳腺炎；および(4)乳腺炎の標準試験によってのみ炎症反応が検出可能である、潜在性乳腺炎。乳腺炎の検出のための標準試験としては、非限定的な例として、カリフォルニア州乳腺炎試験、ウィスコンシン州乳腺炎試験、ナガセ試験、乳汁中の持続性の高白血球数を検出するのに使われる電気的細胞計数法および体細胞計数法が挙げられる。一般に、乳汁中の体細胞数が約300,000〜約500,000個／ml以上である場合、感染の存在を示すだろう。よって、例えば乳汁中の体細胞数が約500,000個／ml以下に維持されるならば、ワクチンが乳腺炎の治療および／または予防に有効であると考えられる。乳腺炎およびその診断の考察については、例えばThe Me rck Veterinary Manual．A Handbook of Diagnosis，Therapy，and Disease Prevention and Control for the Veteri narian，Merck and Co.，Rahway，New Jersey，1991を参照のこと。「単離された」核酸分子は、その分子が天然に見つかる完全生物体から分離された核酸分子；または本来はそれに付随する配列の全部もしくは一部を除去した核酸分子；または天然に存在するが、それに関連した非相同配列（下記に定義する）を有する配列である。「サブユニットワクチン組成物」とは、着目の病原体からの抗原に由来するかまたはそれと相同である、必ずしも抗原全部ではない、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドを含む組成物を意味する。そのような組成物は完全な病原体細胞もしくは粒子、またはそのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含有しない。「サブユニット抗原組成物」は、少なくとも部分的に精製した（好ましくは実質的に精製した）、病原体からの免疫原性ポリペプチド、またはそれの組換え類似体から調製される。サブユニット抗原組成物は、病原体からのその他の抗原またはポリペプチドを実質的に含まない、１もしくは複数の着目のサブユニット抗原を含むことができる。「エピトープ」とは、特定のＢ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位を言う。この用語はまた「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互いに交換可能に使われる。同一エピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗体の結合を阻止する１抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイにおいて同定することができる。組成物またはワクチンに対する「免疫応答」は、着目の組成物またはワクチンに対する宿主の細胞性および／または抗体依存性免疫応答の発生である。通常、「免疫応答」としては、非限定的例として、次の作用の１つまたは複数が挙げられる：着目の組成物またはワクチンに含まれる１もしくは複数の抗原に対して特異的に向けられた、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγδＴ細胞の産生。好ましくは、宿主は新たな感染に対する乳腺の抵抗力が増強されそして／または病気の臨床的発症度が減少されるような治療的または防御的免疫応答を示すだろう。そのような防御は、感染宿主において通常表れる症状の減少もしくは消失、回復時間の短縮および／または感染した四肢動物からの乳中の体細胞数の減少により証明されるだろう。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドという用語は、上述した免疫応答を惹起するアミノ酸配列を言う。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書中で使用する時、シグナル配列、膜固定領域および／またはＬｆ結合領域を有するかまたは有しない、Ｌｆ結合タンパク質の全長配列；それの類似体；またはそれの免疫原性断片を包含する。「免疫原性」断片とは、１もしくは複数のエピトープを含み、そのため上述した免疫応答を惹起するＬｆ結合タンパク質の断片を意味する。そのような断片は当該技術分野で周知である多数のエピトープマッピング技術を使って同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66巻（Glenn，E．Morris編，19 96）Humana Press，Totowa，New Jerseyを参照のこと。例えば、直鎖状エピトープは固体支持体上で多数のペプチド（これらのペプチドはタンパク質分子の一部に相当する）を同時に合成し、そしてペプチドがまだ支持体上に固定されている状態でペプチドを抗体と反応させることにより、決定することができる。そのような技術は当該技術分野で知られており、例えば米国特許第4,708,871号明細書；Geysen他（1984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:3998-4002;Geysen他（1986）Molec．Immunol．23:709-715に記載されている。同様に、例えばＸ線結晶学や二次元核磁気共鳴法によってアミノ酸のコンフォメーションを決定することにより、コンホメーションエピトープも容易に同定される。例えばEpitope Ma pping Protocols（前掲）を参照のこと。本発明の目的上の免疫原性断片は、Ｌｂｐ分子の通常少なくとも約３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約10 〜15個のアミノ酸、最も好ましくは25個以上のアミノ酸を含むだろう。該断片の長さに関しての臨界的上限はなく、タンパク質配列のほぼ全長を含んでなることができ、またはＬｂｐのエピトープを２つ以上含んで成る融合タンパク質でもあることができる。「生来の」タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質が天然に存在する源より単離されたタンパク質またはポリペプチドを言う。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造されたポリペプチド、即ち所望のポリペプチドをコードする外因性ＤＮＡ構成物により形質転換された細胞から生産されたポリペプチドを言う。「合成」ポリペプチドは化学合成により調製されたものである。「ベクター」はレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドであり、結合したセグメントの複製をもたらすように、それに別のＤＮＡセグメントが結合されてもよい。ＤＮＡ「コード配列」または特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節因子の調節下に置いた時に試験管内もしくは生体内で転写されそしてポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５ ’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、非限定的に、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および更に合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。転写終結配列は通常コード配列の３’側に置かれるだろう。ＤＮＡ「調節要素」は、プロモーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節領域、エンハンサーなどを集合的に言い、これは、集合的に宿主細胞中でのコード配列の転写および翻訳に備える配列である。所望の遺伝子が転写され翻訳され得る限り、それらの調節配列の全てが必ずしも組換えベクター中に存在しなくてもよい。「作用可能に連結された」とは、そのように記載される成分が通常の機能を果たすように配置されている要素の配置のことを言う。よって、コード配列に作用可能に連結された調節要素は、コード配列の発現を行うことができる。調節要素は、それらがコード配列の発現を指令する働きをする限り、コード配列と連続している必要はない。よって、例えば、プロモーターとコード配列の間に、転写されるが翻訳されない介在配列が存在してもよく、そのような場合でもまだプロモーターがコード配列に「作用可能に連結した」と見なすことができる。プロモーターのような「調節要素」は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合しそしてコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれが該コード配列によりコードされるポリペプチドへと翻訳される時、細胞内でコード配列の「転写を指令する」。「宿主」細胞は、外因性核酸分子により形質転換されているか、または形質転換することができる細胞である。外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された時、細胞はそのような外因性ＤＮＡによって「形質転換」されている。外因性ＤＮＡは細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれてもよく（共有結合で連結される）、組み込まれなくてもよい。原核生物や酵母では、例えば外因性ＤＮＡはエピソーム要素、例えばプラスミド上に維持され得る。真核細胞に関しては、安定して形質転換された細胞は、外因性ＤＮＡが染色体の複製を通して娘細胞に遺伝するように、外因性ＤＮＡが染色体中に組み込まれた状態になった細胞である。この安定性は、真核細胞が外因性ＤＮＡを含む娘細胞の集団から成る細胞系またはクローンを確立できることにより証明される。「相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド成分間の同一性の比率を言う。ある成分から別の配列への配列間の一致は、当該技術分野で既知の方法によって決定することができる。例えば、配列情報を整列しそして容易に利用可能なコンピュータープログラム、例えばALIGN 〔Dayhoff，M.O．(197 8)Atlas of Protein Sequence and Structure ５：増補３，National Biomedica l Research Foundation，Washington，DC〕を使うことにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により、相同性を決定することができる。あるいは、相同領域間で安定な二本鎖を形成する条件下で、ポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、次いで一本鎖特異的ヌクレアーゼで消化し、そして消化断片をサイズ測定することにより、相同性を決定することができる。２つのＤＮＡ配列、または２つのポリペプチド配列は、上述した方法を使って調べた時にそれらの２つの配列が分子の限定した長さに渡って少なくとも約80％〜85％、好ましくは少なくとも約90％、最も好ましくは少なくとも約95％〜98％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用する時、実質的に相同とは、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列に対しても言う。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について限定されているように、緊縮条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を限定することは当業者の技術の範囲内である。例えば、Sambrook他（前掲）；DNA Cloning（前掲）；Nucleic Acid Hybridization（前掲）を参照のこと。「機能的に等価」という用語は、標準のＬｆ結合タンパク質と同一であるＬｆ結合タンパク質により惹起される応答に比較して、あるＬｆ結合タンパク質のアミノ酸配列が実質的に同等のまたは増強された上記の免疫応答を惹起するもの、またはそれの免疫原性部分であることを意味する。ＤＮＡ構成物の「非相同」領域は、本来は別のＤＮＡ分子と関連して見つからないような別のＤＮＡ分子に連結されたまたはその中に含まれる同定可能なＤＮＡセグメントである。よって、非相同領域が細菌遺伝子をコードする時、該遺伝子は通常、起源の細菌のゲノム中では該細菌遺伝子に隣接していないＤＮＡによって隣接されるだろう。非相同コード配列の別の例は、コード配列それ自体が天然に見つからない構成物である（例えば、生来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変異または自然の突然変異現象は、本明細書中で使用されるＤＮＡの非相同領域をもたらさない。本明細書中で使用する「処置」という語は、(i)感染もしくは再感染の防止（予防）、または(ii)着目の病気の症状の軽減もしくは除去（治療）のいずれかを指す。本明細書中で使用する時、「生物学的試料」とは、非限定的例として血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚、呼吸器管、腸管および生殖器管の外分泌液、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、器官、生検材料をはじめとする、被検体から単離された組織または体液の試料、並びに非限定的例として培地中での細胞および組織（例えば組換え細胞および細胞成分）の増殖から得られた順化培地をはじめとする試験管内細胞培養成分の試料のことを言う。本明細書中で使用する時、「標識」および「検出可能な標識」という語は、非限定的例として、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えばビオチンまたはハプテン）等をはじめとする、検出可能な分子を指して言う。「蛍光物質」とは、検出可能な領域で蛍光を発することができる物質またはその部分を言う。本発明において使用することができる標識の具体例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、NADPHおよびαまたはβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。Ｂ．一般法本発明の中心は、Ｓ．ユベリスのウシＬｆ結合タンパク質の発見である。Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質の遺伝子（“ｌｂｐ”）を単離し、特徴づけ、そしてそれによりコードされるタンパク質を配列決定した。Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質の完全ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）に示される。特に、実施例において記載するように、561アミノ酸残基をコードする図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）の残基232〜1914に示される1683bp の単一ＯＲＦが、それぞれ76kDaおよび165kDaの分子量を有する、ウシラクトフェリンを結合できる２つのタンパク質種を与える。尿素処理の結果単一バンドを生じ、そしてＳ．ユベリスにおいてだけでなく、Ｌｆ結合タンパク質をコードする構成物により形質転換された組換えＥ．コリにおいても、ノーザンブロット分析が単一の主要転写物を示すことから、165kDaタンパク質は多分76kDaタンパク質の二量体であろう。Ｓ．ユベリスのウシＬＦ結合タンパク質は、約50アミノ酸の推定Ｎ末端シグナルペプチドを含む（翻訳開始が図２Ａの最初のＡＴＧコドンで始まるとすると）。シグナルペプチドを含む全長ウシＬｆ結合タンパク質は、図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のアミノ酸位置１〜561（ヌクレオチド位置232〜19141によりコードされる）に見つかる。シグナルペプチドを含まない成熟タンパク質は、図２Ａ〜２Ｃのアミノ酸位置52〜561（ヌクレオチド位置445〜1914)に見つかる。図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）に示されるように、Ｃ末端に膜固定モチーフも存在する。ウシＬｆ結合領域は、分子中の200コドンＮ末端領域に存在する。このタンパク質はジスルフィド結合を含まないようである。実施例に示される通り、Ｓ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆの結合は時間依存性であり、そして未標識のｂＬＦにより置換可能であった。アポｂＬｆは、鉄飽和ｂＬｆと同じくらい効率的に¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合を阻害する。ウシトランシフェリン、ヒトラクトフェリンおよびヒトトランスフェリンはｂＬｆ結合を妨害しない。スキャッチャードプロットは直線状であり、そして約7800の結合部位が1.0 ×10^-7Ｍの親和力で各細菌細胞により発現される。鉄利用能の減少はｂＬｆによるＳ．ユベリスの飽和を有意に変更しない。ヒトＬｆがウシＬｆの結合を有意に阻害しないようであることから、本明細書中に記載のｂＬｆ結合タンパク質はラクトフェリン種特異的である。Ｓ．ユベリスのＬｆ結合タンパク質は、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２と呼ばれる２種類の別個のトランスフェリン結合タンパク質から成りそして株によって分子量が68〜105kDaと異なるヘモフィルス（Haemophilus）やナイセリア（Neisseria）種のトランスフェリンレセプターとは異なる。同様に、Ｓ．アウレウス（S．aureus）のウシＬｆレセプターは、92kDaと67kDaの推定分子量を有する２種類のｂＬｆ結合タンパク質から成り〔Naidu他（1991）J． Dairy Sci．74:1218-1226〕、従って本明細書中に記載のレセプターとは異なると思われる。また、本明細書中に記載の連鎖球菌Ｌｆ結合タンパク質は、還元SD S-PAGEゲル条件下で67kDaと62kDaの２成分に分かれる約450kDaタンパク質であるＳ．アウレウスヒトＬｆ結合タンパク質とも異なるようである。Ｓ．ユベリスｂＬｆ結合タンパク質の一次および二次構造の分析は、それがＭ様タンパク質であることを示唆する。特に、ＭおよびＭ様タンパク質の正の調節因子であるＡ群連鎖球菌ｍｇａと相同の遺伝子が、ｌｂｐの上流の隣接領域に見つかった。サザンブロット分析はｌｂｐを含む試験した全てのＳ．ユベリス株においてｍｇａが存在することを示す。Ｓ．ユベリスｍｇａの配列およびそれからのタンパク質生成物は図５Ａ〜５Ｄ（配列番号３〜12）に与えられる。ヌクレオチド361〜363のＡＴＧ開始コドンから始まりそしてヌクレオチド1858〜1860のＴＡＡコドンで終わる推定遺伝子産物Ｍｇａは、58,454Daの計算分子量を有する499アミノ酸残基から成る。ＭｇａのＮ末端はシグナルペプチドの特徴を持たず、それが細胞質タンパク質であることを示唆する。ｍｇａの開始コドンより上流に推定リボソーム結合部位AGGAGAがある。図５Ａ〜５Ｄ（配列番号３〜12）に示されるように、−35および−10プロモーターモチーフに似た配列も同定された。Ｓ．ユベリスＬｆ結合タンパク質、それの免疫原性断片またはそれを含むキメラタンパク質は、哺乳類、例えばウシ、ウマ、ヒツジおよびヤギ種において、Ｓ．ユベリスにより引き起こされる細菌感染（乳腺炎を含む）を治療または予防するためのサブユニットワクチンとして提供することができる。ワクチン組成物における使用に加えて、そのようなタンパク質およびそれの断片、それに対する抗体、並びにそれをコードする遺伝子は、哺乳類被検体において感染の存在を検出するための診断薬として使用することができる。同様に、該タンパク質をコードする遺伝子はクローニングすることができ、そして別の細菌株において相同遺伝子を検出および単離するためのプローブをデザインするのに使用することができる。例えば、少なくとも約15〜20ヌクレオチド、より好ましくは約 20〜50ヌクレオチド、最も好ましくは約60〜100以上のヌクレオチドを含んで成る断片をそれらの態様において利用することができるだろう。Ｓ．ユベリスＬｆ結合タンパク質は、それを発現する連鎖球菌種および組換え宿主細胞からウシＬｆを精製するのにも利用できる。Ｓ．ユベリスＬｆ結合タンパク質は単独でまたは別の細菌、真菌、ウイルスもしくは原核生物の抗原と組み合わせてワクチン組成物に使用することができる。それらの抗原は、別々にまたは１もしくは複数のそれらの抗原に融合されたＬｆ結合タンパク質の１もしくは複数のエピトープを含んで成る融合タンパク質として提供することができる。例えば、Ｓ．ユベリスからの別の免疫原性タンパク質、例えばCAMP因子、ヒアルロン酸莢膜、ヒアルロニダーゼ、Ｒ様タンパク質および活性化因子を、Ｌｆ結合タンパク質と一緒に投与することができる。更に、乳腺炎に関係する別の生物からの免疫原性タンパク質、例えば、スタフィロコッカス属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、ノカルジア属、クロストリジウム属、マイミコバクテリア属、マイコプラズマ属、パスツレラ属、プロトセカ属、別の連鎖球菌属、大腸菌、並びに酵母菌からの免疫原性タンパク質を、本明細中に記載のｂＬｆ結合タンパク質と一緒に投与することができる。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・アガラクテイエ（Streprococcus agalactiae）、ストレプトコッカス・ディスガラクテイエ（Streprococcus dysgalactiae）、ストレプトコッカス・ズウエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）、コリネバクテリウム・ピオゲネス（C orynebacterium pyogenes）、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aer uginosa）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、エンテロバクター・エロゲネス（Fnterohacter aerog enes）およびクレブシエラ（Klehsiella）種からの免疫原性タンパク質を、本発明のｂＬｆ結合タンパク質と一緒に投与することができる。ＬＦ結合タンパク質の製造上述したＬＦ結合タンパク質並びにそれから誘導される活性断片、類似体およびキメラタンパク質は様々な方法により製造することができる。具体的には、ＬＦ結合タンパク質はそれを発現する細菌から直接単離することができる。これはまず細胞成分と数種類の外来のタンパク質を含まない粗抽出物を調製することにより達成される。次いで所望のタンパク質を、例えばカラムクロマトグラフィー、HPLC、免疫吸着技術または当該技術分野において周知である他の常法により、更に精製することができる。あるいは、本明細書中に記載されるようにして該タンパク質を組換え生産することができる。上記に説明したように、それらの組換え生産物は、部分タンパク質配列、全長配列、シグナルペプチドを含む前駆体形、シグナルペプチドを含まない成熟形、または融合タンパク質（例えば、組換え宿主のための適当なリーダー配列との融合タンパク質、あるいはストレプトコッカスまたは別の病原体のための別のサブユニット抗原配列との融合タンパク質）の形をとることができる。本発明のｌｂｐ遺伝子は、ＬＦを結合するタンパク質生成物の能力に基づいて、後述するようなＬＦ結合アッセイを使って単離することができる。こうして、遺伝子ライブラリーを作製し、得られたクローンを用いて適当な宿主細胞を形質転換せしめることができる。コロニーをプールし、ＬＦ結合活性を有するクローンについてスクリーニングすることができる。また、ＬＦ結合タンパク質に対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を使って、コロニーをスクリーニングすることもできる。あるいは、アミノ酸配列が決定されれば、その決定されたアミノ酸配列の一部に対するコドンを含むオリゴヌクレオチドプローブを調製し、そのプローブを用いて目的のタンパク質をコードする遺伝子についてゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブおよびｃＤＮＡライブラリーの調製の基本方法、並びに核酸ハイブリダイゼーションによるそれらのスクリーニングは、当業者に周知である。例えばDNA Cloning:第Ｉ巻（前掲）；Nucleic Acid Hybridization（前掲）；Oligonucleot ide Synthesys（前掲）；Samblook他（前掲）を参照のこと。スクリーニングしたライブラリーから陽性ハイブリダイゼーションによって１つのクローンが同定されれば、制限酵素分析およびＤＮＡ配列分析により、特定のライブラリー挿入断片がＬＦ結合タンパク質遺伝子またはそれの相同物を含むことを確認することができる。次いで標準技術を使って、そして所望であれば全長配列の一部を削除するためにＰＣＲ法または制限酵素を使って、該遺伝子を単離することができる。同様に、既知技術、例えばフェノール抽出を使って、細菌から遺伝子を直接単離し、そして配列を更に操作して任意の所望の変更を行うことができる。ＤＮＡを獲得しそして単離するのに使われる技術の説明については、例えば、Sambrook 他（前掲）を参照のこと。あるいは、着目のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をクローニングするのではなくて合成により調製することができる。特定のアミノ酸配列をコードする適当なコドンを用いてＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般に、その配列を発現に使うつもりであれば、意図する宿主に好ましいコドンが選択されるだろう。標準法により調製した重複するオリゴヌクレオチドから完全な配列を集成して完全なコード配列を構築することができる。例えば、Edge（1981）Nature 292 :756;Nambair他（1984）Science 223:1299;Jay他（1984）J．Biol．Chem．259:6 311を参照のこと。所望のタンパク質のコード配列が調製または単離されたら、それらを適当なベクターまたはレプリコン中でクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターの選択は好みの問題である。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらにより形質転換することができる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（Ｅ．コリ）、pBR322（Ｅ．コリ）、pACYC177（Ｅ．コリ）、pKT230（グラム陰性菌）、pG Y1106（グラム陰性菌）、pLAFR1（グラム陰性菌）、pME290（Ｅ．コリ以外のグラム陰性菌）、pHV14（Ｅ．コリおよびバシラス・サチリス）、pBD9（バシラス）、pIJ61（ストレプトマイセス）、pUC6（ストレプトマイセス）、YIp5（サッカロミセス）、YCp19（サッカロミセス）およびウシ乳頭腫ウイルス（哺乳動物細胞）が挙げられる。Sambrook他（前掲）；DNA Cloning（前掲）：B．Perbal（前掲）を参照のこと。所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、この発現構成物を含むベクターにより形質転換された宿主細胞中でＲＮＡに転写されるように、遺伝子をプロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）および場合によりオペレーター（本明細書中では総称的に「調節」要素と呼ばれる）の調節下に置くことができる。コード配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでも含まなくてもよい。シグナル配列が含まれるならば、それは生来の配列、相同配列、または非相同配列であることができる。例えば、Ｓ．ユベリスＬＦ結合タンパク質のシグナル配列（図２Ａに示される）はそれの分泌に用いることができ、当該技術分野で周知である多数の他のシグナル配列も同様に用いることができる。リーダー配列は翻訳後プロセシングにおいて宿主により除去され得る。例えば、米国特許第4,43 1,739号；同第4,425,437号；同第4,338,397号明細書を参照のこと。宿主細胞の増殖に関係するタンパク質配列の発現の調節に備える別の調節配列も望ましいことがある。調節配列は当業者に知られており、その例としては化学的または物理的剌激物質（例えば調節化合物の存在）に応答して遺伝子の発現を開始または停止させるものが挙げられる。調節配列および別の制御配列は、ベクター（例えば上述のクローニングベクター）中に挿入される前にコード配列に連結されてもよい。あるいは、既に調節配列と適当な制限部位を含む発現ベクター中にコード配列を直接クローニングせしめることができる。コード配列が適当な方向で調節配列に結合されるように、すなわち正しい読み枠を維持するように、コード配列を修飾することが必要なことがある。ＬＦ結合タンパク質の変異体または類似体を産生せしめることが望ましいこともある。変異体または類似体は、タンパク質をコードする配列の一部の除去、或る配列の挿入および／または該配列中の１もしくは複数のヌクレオチドの置換により調製することができる。ヌクレオチド配列を修飾する技術、例えば部位特異的突然変異誘発は、例えばSambrook他（前掲）；DN A Cloning（前掲）；Nucleic Acid Hybridization（前掲）を参照のこと。次いで発現ベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換せしめる。多数の哺乳動物細胞系が当該技術分野において知られており、そのような細胞系としてはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）から入手可能な不死化細胞系、例えば非限定的例として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、Hera 細胞、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞（例えばHep G2）、マディン−ダービィ（Madin-Darhy）ウシ腎臓（MDBK）細胞などが挙げられる。同様に、細菌宿主、例えばＥ．コリ（E．coli)、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）およびストレプトコッカス（Streptococcus）種も本発明の発現構成物と共に使用されるだろう。本発明において有用な酵母宿主としては特に、サッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・マルトーサ（Candida Ealtosa）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ピキア・ギレリモンディ（Pichia guillerimondi i）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe）およびヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipo lytica）が挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞としては、特に、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa cali fornica）、カイコガ（Bombyx mori）、キイロショウジョウバエ（Drosophila m elanogaster）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）およびトリコプルシア・ニイ（Trichoplusia ni)が挙げられる。選択される発現系と宿主に依存して、本発明のタンパク質は、上述した発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を着目のタンパク質か発現される条件下で培養することにより調製される。次いで宿主細胞からタンパク質を単離しそして精製する。発現系がタンパク質を増殖培地中に分泌するのであれば、該タンパク質を培地から直接精製することができる。タンパク質が分泌されないのであれば、それは細胞溶解物から単離される。適当な増殖条件および回収方法の選択は当業者の技術の範囲内である。本発明のタンパク質は、着目の遺伝子のＤＮＡ配列から誘導されるアミノ酸配列または既知のアミノ酸配列を使って、固相ペプチド合成のような化学合成により製造してもよい。そのような方法は当業者に周知である。例えば、固相ペプチド合成技術については、J．M．Stewart & J.D．Young，Solid Phase Peptide Sy nthesis，第２版，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984)とG．Barany & R ．B．Merrifield，The Peptides:Analysis，Synthesis，Biology，E.Gross & J ．Meienhofer編，第２巻，Academic Press，New York（1980）3-254頁を；典型的な液相合成については、M．Bondansky，Principles of Peptide Synthesis，S pringer-Verlag，Berlin(1984)とE．Gross & J．Meienhofer編，The Peptides:A nalysis，Synthesis，Biology，前掲，第１巻を参照のこと。問題の抗原の小断片が着目の被検体において免疫応答を惹起することができる場合には、ペプチドの化学合成が好ましいかもしれない。本発明のＬＦ結合タンパク質またはそれらの断片を使って、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を生産せしめることができる。ポリクローナル抗体を所望するならば、特定の哺乳類（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を本発明の抗原、それの断片または変異抗原で免疫処置する。既知の方法に従って、免疫処置動物から血清を収集しそして処理する。例えば、Jurgens他（1985 ）J．Chrom．348:363-370を参照のこと。ポリクローナル抗体を含む血清を使用するならば、既知の方法を使って免疫アフィニティークロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製することができる。ＬＦ結合タンパク質およびその断片に対するモノクローナ抗体も、当業者により容易に調製することができる。ハイブリドーマ技術を使ったモノクローナル抗体の調製の一般的方法論は周知である。細胞融合により、あるいは腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン−バー（Epstein-Barr ）ウイルスによるトランスフェクションといった他の技術により、不死化された抗体産生細胞系を作製することができる。例えば、M．Schreier他，Hybridoma T echniques(1980)；Hammerling他，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridom as(1981)；Hennett他，Monoclonal Antibodies(1980)；更には米国特許第4,341, 761号、同第4,399,121号、同第4,427,783号、同第4,444,887号、同第4,452,570 号、同第4,466,917号、同第4,472,500号、同第4,491,632号および同第4,493,890 号明細書を参照のこと。ＬＦ結合タンパク質またはそれの断片に対して産生されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な性質、即ちイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、免疫アフィニティー技術を使って、それらの抗体が向けられる個々の抗原を精製するのに有用である。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体は共に受動免疫処置にも使うことができ、または免疫応答を増強するためにサブユニットワクチン製剤と組み合わせることができる。ポリクロナール抗体とモノクローナル抗体は両者とも診断目的に有用である。ワクチン製剤および投与本発明のＬＦ結合タンパク質は、単独でまたは別の抗原と組み合わせて、後述のように被検体を免疫処置するために使われるワクチン組成物に製剤化することができる。そのような製剤の調製方法は、例えばRemington's Pharmaceutical S ciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania,第18版，1990に記載されている。典型的には、本発明のワクチンは、液体溶液または懸濁液の注射剤として調製される。注射前に液体賦形剤中に溶解または懸濁するのに適当な固体形を調製してもよい。該製剤は乳化されてもよくまたはリポソーム賦形剤中に活性成分が封入されてもよい。一般に免疫原性活性成分は、適合性の医薬賦形剤、例えば水、塩類溶液、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの混合物と混合される。所望であれば、更に、賦形剤は少量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤およびpH緩衝剤を含んでもよい。ワクチンの効能を高めるアジュバントをワクチン製剤に添加してもよい。アジュバントとしては、例えば、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(DDA)、油、水中油型乳濁液、サポニン、サイトカイン、および当業界で既知である他の物質が挙げられる。ＬＦ結合タンパク質はその免疫原性を増強するために担体（キャリヤー）に連結することができる。適当な担体としては、血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミンおよび当業者に周知の他のタンパク質をはじめとするタンパク質；多糖類、例えばセファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなど；アミノ酸ポリマー、例えばポリグルタミン酸、ポリリジンなど；アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子、のようなゆっくり代謝される巨大分子が挙げられる。ＬＦ結合タンパク質は生来の形で使用されてもよく、あるいはそれらに含まれる官能基成分が例えばリジン残基のスクシニル化により、またはCys−チオラクトンとの反応により、修飾されてもよい。例えばアミノ機能と２−イミノチオランまたは３−（４−ジチオピリジル）プロピオネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応により、担体（または抗原）中にスルフヒドリル基が組み込まれてもよい。ペプチドの付着のために適当な担体を修飾してスペーサーアーム（例えばヘキサメチレンジアミンまたは同様な大きさの他の二価性分子）を組み込んでもよい。本発明のＬＦ結合タンパク質に適当な他の担体としては、米国特許第5,071,65 1号明細書に開示されたようなロタウイルスのＶＰ６ポリペプチドまたはそれの機能性断片が挙げられる。米国特許第4,722,840号明細書に開示された方法により調製されたウイルスタンパク質と目的の免疫原との融合生成物も有用である。更に別の適当な担体としては、細胞の形での提示が被検体の生来の提示形態を模倣し、免疫状態をもたらすので、細胞、例えばリンパ球が挙げられる。あるいは、本発明のタンパク質は赤血球、好ましくは被検体自身の赤血球に結合させることができる。ペプチドをタンパク質または細胞に結合させる方法は当業者に周知である。更に、ＬＦ結合タンパク質（またはそれの複合体）は、中性の形でまたは塩の形でワクチン組成物に製剤化することができる。医薬上許容される塩としては、活性ポリペプチドの遊離アミノ基とで形成される酸付加塩、および無機酸（例えば塩酸もしくはリン酸）とまたは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とで形成される酸付加塩が挙げられる。遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導されてもよい。ワクチン製剤は、活性成分の「治療有効量」、即ち組成物を投与した被検体に免疫応答を惹起せしめることができる量を含むだろう。乳腺炎の治療および予防においては、例えば「治療有効量」は、好ましくは新たな感染に対する乳腺の抵抗力を高めそして／または該病気の臨床的発症度を減少させる量であろう。そのような保護は感染宿主に通常表れる症状の減少もしくは消失、回復時間の短縮および／または感染宿主からの乳汁中の体細胞数の低下のいずれかにより証明されるだろう。例えば、乳汁中の体細胞数（ＳＣＣ）を、国際酪農連盟（Internatio nal Daiyr Federation）により設定された閾値（限界値）である約500,000細胞／mlより低く（これ以上では動物が臨床上乳腺炎を有すると見なされる）保持または誘導する組成物の能力が、治療効果の指標であろう。正確な量は、標準試験を使って当業者により容易に決定される。ＬＦ結合タンパク質濃度は、典型的には組成物の約１％〜約95％（w/w）の範囲内であるが、適当ならばそれより高くても低くてもよい。本発明のワクチン製剤では、動物あたり１〜３mlの量を投与する時、注射液１mlあたり20〜500μgの活性成分が免疫応答を生じさせるのに適当であろう。被検体を免疫処置するために、ワクチンは通常非経口的に、普通は筋肉内注射により投与される。しかしながら、皮下、腹腔内および静脈内注射のような別の投与方法も受け入れられる。投与すべき量は、処置する予定の動物、抗体を合成する動物の免疫系の容量、および所望される保護の程度に依存する。有効量は、用量応答曲線を作成する日常的試験を通して当業者が容易に決定することができる。少なくとも１用量で、好ましくは２用量でワクチンを投与することにより被検体を免疫処置する。更に、感染に対する免疫の状態を維持するために要求されるのと同じくらいの用量を動物に投与してもよい。別の投与方法に適当な追加のワクチン製剤としては、坐剤、ある場合にはエーロゾル剤、経鼻製剤、経口製剤および徐放性製剤が挙げられる。坐剤の場合には、ワクチン組成物は典型的な結合剤と担体、例えばポリアルカリングリコールまたはトリグリセリドを含むだろう。そのような坐剤は、約0.5％〜約10％(w/w)、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から調製することができる。経口賦形剤としては、例えば、医薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウム等のような常用の佐剤が挙げられる。それらの経ロワクチン組成物は液剤、懸濁液剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤の剤形をとることができ、そして約10％〜約95％、好ましくは約25％〜約70％の活性成分を含むことができる。経鼻製剤は通常、鼻粘膜に刺激を引き起こさず且つ繊毛機能を有意に妨害しない賦形剤を含むだろう。水、食塩水または他の既知の物質のような希釈剤を本発明において使用することができる。経鼻製剤は保存剤、例えば非限定的例としてクロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムを含んでもよい。鼻粘膜による目的タンパク質の吸収を増加させるために界面活性剤が存在してもよい。徐放性または持続性製剤は、リポソーム、非再吸収性不透性ポリコポリマー）、膨潤性ポリマー（例えばヒドロゲル）または再吸収性ポリマー（例えばコラーゲンおよび或る種の多酸もしくはポリエステル、例えば再吸収性縫合を行うのに使われるもの）のような担体または賦形剤中にタンパク質を導入することにより製造される。ＬＦ結合タンパク質は、当業界で周知の埋没型ミニポンプを使って提供することもできる。本発明のＬＦ結合タンパク質は、それを発現するキャリヤーウイルスを介して投与することもできる。本発明において使用されるであろうキャリヤーウイルスとしては、非限定的例として、ワクシニアウイルスおよび他のポックスウイルス、アデノウイルス、並びにヘルペスウイルスが挙げられる。一例として、新規タンパク質を発現するワクシニア組換えウイルスは次のようにして作製することができる。まず、特定のタンパク質をコードするＤＮＡを、それがワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列〔例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列〕に隣接するように、適当なベクター中に挿入する。次いで、このベクターを用いて細胞をトランスフェクトせしめると同時に細胞をワクシニアに感染させる。相同組換えが、ワクシニアプロモーターと着目のタンパク質をコードする遺伝子をウイルスゲノム中に挿入する働きをする。細胞を５−ブロモデオキシウリジンの存在下で培養しそしてそれに耐性であるウイルスプラークを摘み取ることにより、生成したＴＫ^-組換え体を選択することができる。別の投与経路は、遺伝子治療または核酸免疫処置を含む。目的のＬＦ結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（および付随の調節要素）を、それの生体内翻訳のために被検体に直接投与することができる。あるいは、被検体の細胞または組織を生体外でトランスフェクトし、そして宿主中に形質転換物質を再導入することにより、遺伝子伝達を行うことができる。ＤＮＡは例えば注射により、宿主生物に直接導入することができる〔国際出願公開No．WO 90／1 1092；およびWolff他（1990）Science 247:1465-1468を参照のこと〕。リポソーム媒介遺伝子伝達も既知の方法を使って行うことができる。例えば、Hazinski他（1991）Am．J．Respir．Cell Mol．Biol．4:206-209;Brigham他（1989）Am．J ．Med．Sci．298:278-28１;Canonico他(1991)Clin．Res．39:219A；およびNabel 他(1990)Scicence 249:1285-1288を参照のこと。標的指向物質、例えば特定の細胞型の表面上に発現された表面抗原に対して向けられた抗体をリポソーム表面に共有結合せしめて、感染に対し感受性である特異的組織および細胞に核酸を伝達することができる。診断アッセイ上述した通り、本発明のＬＦ結合タンパク質は、Ｓ．ユベリス感染の存否を調べるために生物学的試料中のＳ．ユベリスの反応性抗体の存在を検出する診断薬としても利用することができる。例えば、ＬＦ結合タンパク質と反応性である抗体の存在は、標準的電気泳動技術および免疫診断技術、例えばイムノアッセイ、例えば競合アッセイ、直接反応アッセイまたはサンドイッチ型アッセイを使って検出することができる。そのようなアッセイとしては、非限定的例として、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識および酵素媒介イムノアッセイ、例えばEL ISA；ビオチン／アビジン型アッセイ；放射免疫アッセイ；免疫電気泳動法；免疫沈澱法などが挙げられる。反応は一般的に標識、例えば蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、酵素標識または色素分子の検出、あるいは抗原およびそれと反応する１または複数の抗体の間の複合体の形成を検出する別の方法を含む。上述したアッセイは、通常、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から液相中の未結合抗体を分離することを必要とする。本発明の実施に使用することができる固体支持体としては、ニトロセルロース（例えば膜またはマイクロタイターウエルの形の）；ポリ塩化ビニル（例えばシートまたはマイクロタイターウエルの形の）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズまたはマイクロタイタープレートの形の）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ紙；ナイロン膜；活性ビーズ；磁気性ビーズなどが挙げられる。典型的には、まず固体支持体を、固相成分が該支持体に十分に固定化されるような適当な結合条件下で、固相成分（例えば１または複数のＬＦ結合タンパク質）と反応させる。はじめに抗原を良好な結合性を有するタンパク質に結合させることにより、支持体への抗原の固定化を増強することができる場合がある。適当な結合用タンパク質としては、非限定的に、巨大分子、例えば血清アルブミン〔ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む〕、アオガイヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、および当業者に周知である他のタンパク質が挙げられる。抗原を支持体に結合するために利用することができる他の分子としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。そのような分子とそれらの分子を抗原にカップリングさせる方法は当業者に周知である。例えば、Brinkley，M．A.，Bioconj ugate Chem．(1992)3:2-13;Hashida他，J．Appl．Biochem（1984）6:56-63;およびAnjaneyulu & Staros，Interna-tional J．of Peptide and Protein Res．(19 87)30:117-124を参照のこと。固相支持体を固相成分と反応させた後、固定化されない固相成分を洗浄によって支持体から除去し、次いで支持体に結合した成分を、適当な結合条件下で、リガンド成分（例えば固定化抗原に対する抗体）を含むと思われる生物学的試料と接触させる。結合しなかったリガンドを除去するために洗浄した後、結合したリガンドに選択的に第二の結合剤が結合することができるような適当な結合条件下で、第二の結合剤成分を添加する。次いで、当該技術分野で周知の技術を使って、第二の結合剤の存在を検出することができる。より詳しくは、マイクロタイタープレートのウエルをＬＦ結合タンパク質でコーティングしたELISA法を利用することができる。抗ＬＦ結合タンパク質免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと思われる生物学的試料を、コーティングしたウエルに添加する。抗体を固定化抗原に結合させるのに十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して未結合成分を除去し、そして検出可能に標識された第二の結合分子を添加する。第二の結合分子を捕捉された任意の試料抗体と反応させた後、プレートを洗浄し、そして当該技術分野で周知の方法を使って第二の結合分子の存在を検出する。特定の一態様では、生物学的試料からの結合した抗ＬＦ結合抗原リガンドの存在は、抗体リガンドに対して向けられた抗体を含んで成る第二の結合剤を使って、容易に検出することができる。多数の抗ウシ免疫グロブリン（Ｉｇ）分子が当該技術分野で知られており、当業者に周知の方法を使って、それを検出可能な酵素標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼに容易に接合することができる。適当な酵素基質を用いて検出可能なシグナルを生成せしめる。別の関連の態様では、当業者に既知の方法を使って競合型ELISA技術を実施することができる。アッセイは、ＬＦ結合タンパク質とそのタンパク質に特異的な抗体とが沈澱条件下で複合体を形成するように、溶液中で実施することもできる。特定の一態様では、当業者に既知のカップリング技術を使って、例えば直接化学カップリングまたは間接カップリングにより、ＬＦ結合タンパク質を固相粒子（例えばアガロースビーズなど）に付着させることができる。次いで、抗原をコーティングした粒子を、適当な結合条件下で、ＬＦ結合タンパク質に対する抗体を含むと思われる生物学的試料と接触させる。結合抗体同士での架橋結合が粒子−抗原−抗体複合体凝集物の形成を引き起こし、その凝集物を沈澱させそして洗浄および／または遠心分離を用いて試料から分離することができる。多数の標準法のいずれかを使って、例えば上述した免疫診断法を使って、反応混合物を分析して抗体−抗原複合体の存否を決定することができる。更に別の態様では、抗ＬＦ結合分子を含むと思われる生物学的試料からの抗体のポリクローナル集団が支持体に固定化される、免疫アフィニティー母材を提供することができる。この場合には、固定化抗原を使って試料の初期アフィニティー精製を実施することができる。得られた試料調製物は抗Ｓ．ユベリス成分のみを含み、アフィニティー支持体の潜在的非特異的結合性を回避するだろう。高収率で且つ抗原結合活性の良好な保持率で免疫グロブリン（完全な断片または特定断片）を固定化する方法が当該技術分野で多数知られている。特定の方法により限定されることなく、固定化プロテインＡまたはプロテインＧを使って免疫グロブリンを固定化することができる。従って、免疫グロブリン分子が固定化されて免疫アフィニティー母材が提供されたら、適当な結合条件下で、標識ＬＦ結合タンパク質が結合抗体と接触せしめられる。非特異的に結合した抗原を免疫アフィニティー支持体から洗い流した後、当該技術分野で既知の方法を使って標識についてアッセイすることにより、結合した抗原の存在を測定することができる。ＬＦ結合タンパク質またはそれに対する抗体をはじめとする上述したアッセイ試薬は、適当な使用説明書や上述のイムノアッセイをおこなうために必要な他の試薬と一緒に、キットの形で提供することができる。このキットは更に、使用する特定のイムノアッセイに応じて、適当な標識、並びに包装した他の試薬および材料（即ち洗浄緩衝液など）も含むことができる。これらのキットを使って、上述したような標準イムノアッセイを実施することができる。下記に本発明を実施するための具体的態様の例を示す。この実施例は例示目的にのみ与えられるのであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。Ｃ．実験実施例１Ｓ．ユベリス中のウシラクトフェリン結合タンパク質の同定材料と方法菌株と培養条件アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC 9927）からのＳ．ユベリス株（su-1）を実験に使用した。細菌をベース＃２ヒツジ血液寒天プレート（PML Microbiologicals）上で37℃にて18時間増殖させた。鉄制限条件は、800 μM EDDA、800μMジピリジルまたは100μMデスフェリオキサミンメシレートの添加により、0.3％酵母エキスが捕捉されたTodd-Hewittブロス（THB-YE）中で達成された。鉄キレート化剤はいずれもSigmaから入手した。細菌細胞壁の調製Ｓ．ユベリスの細胞壁成分をBaker他（1976）J．Exp．Med．143: 258-270により記載された通りに抽出した。20枚のベース#2血液寒天プレートにＳ．ユベリスを接種し、そして37℃で18時間インキュベートした。細菌細胞を収集し、200mlの0.85％食塩水で１回洗浄し、そして50mlの抽出緩衝液（0.05M Na₂ HPO₄，0.15M NaCl，0.01M EDTA，pH7.4）中に再懸濁した。ガラスビーズ（直径４mm）と共に37℃で20時間振盪することにより細胞壁を抽出した。48,300ｇで20 分間遠心した後、上清（細胞壁抽出物）を収集し、濾過し（0.22μm Nalgeneフィルター）、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、そして１mlの蒸留水中に再懸濁した。鉄結合タンパク質の調製ｂＬｆ（牛乳から）、ウシトランスフェリン（ｂＴｆ）、ヒトラクトフェリン（ｈＬｆ）およびヒトトランスフェリン（ｈＴｆ）を包含する全ての鉄結合タンパク質は、大部分が鉄遊離形でSigmaから購入した。鉄飽和タンパク質およびアポタンパク質は、以前に記載された方法〔Mazurier & Spik（1980）Biochem．Bi ophys．Acta629:399-408〕により調製した。 ¹²⁵ Ｉ−標識ｂＬｆの調製 Thorell & Johanson（1971）Biochim．Biophys．Acta 251:363-368のラクトペルオキシダーゼ法により、ウシＬｆをヨウ素化した。約70μgのｂＬｆ（33％鉄飽和）をヨウ素化に使用した。セファデックスG-25カラム上でのクロマトグラフィーにより、¹²⁵Ｉ−標識タンパク質を遊離のNa¹²⁵Iから分離した。標識タンパク質をアリコートに分け、使用直前まで−70℃で保存した。ラクトペルオキシダーゼはBoehringer-Mannheimから購入し、Na¹²⁵IはAmershamから購入した。ラクトフェリン結合アッセイ結合アッセイは以下文献に記載の通り実施した〔Naidu他（1990） J．Clin．Microbiol．28:2312-2319;Naidu他（1991）J．Med．Microbiol．34:32 3-328;Naidu他（1991）J．Dairy Sci．74:1218-1226;Naidu他（1992）J．Med．M icrobiol．36:177-183〕。培地から細菌細胞を収穫し、0.1Mリン酸塩緩衝化食塩溶液（ＰＢＳ）pH7.2中で１回洗浄し、そして１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ）中に再懸濁して10¹⁰個の細菌／ml（ｃ．ＯＤ₆₀₀＝1.5 ）の濃度とした。飽和時間を測定するために、10⁹個の細菌（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ0.1ml中）を0.1mlの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ溶液（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中6.9nM）と混合し、そして5，10，15，20，25，30，60，90，120，150分間室温でインキュベートした。細菌をペレット化し、そして0.1％ Tween 20を含む氷冷ＰＢＳ１mlで３回洗浄した。細菌ペレットに結合した放射能をγカウンター中で測定した。競合結合実験では、10⁹個の細菌を系列希釈した未標識ｂＬＦの存在下で２×10⁵cpm の¹²⁵Ｉ−ｂＬＦと混合し、そして室温で２時間インキュベートした。総投入量、細胞に結合したタンパク質量および遊離タンパク質量を計算し、そしてスキャッチャード分析〔Scatchard，G．(1949)Ann．N.Y．Acad．Sci．51:660-672〕にかけた。¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合に対するｂＬｆ、アポｂＬｆ、ｂＴｆ、ｈＬｆおよびｈＴｆの阻害作用を評価する時、未標識タンパク質を5.5nMの濃度で使用した。全ての試料を三重反復試験し、そして各実験を少なくとも２回繰り返した。与えられるデータは２つの別々の実験の平均値である（特に断らない限り）。Ｓ．ユベリスのタンパク質分解および熱処理細菌（10¹⁰細胞を含む1ml)をプロテアーゼで37℃にて２時間処理した。トリプシン(Sigma)加水分解は100mM Tris-HCl（pH8.0）中で、2,500U/mlの最終酵素濃度で行い、そしてフェニルメチルスルホニルフルオリド（500μg/ml）の添加により反応を停止させた。ペプシン(Sigma)消化は100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）中で、1,000U/mlの酵素濃度で行い、そして反応混合物のpHを7.4まで上昇させて加水分解を停止させた。プロテインキナーゼＫ（Boehringer Mannheim）処理は40mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）中で行い、そしてフェニルメチルスルホニルフルオリド（500 μg/ml）の添加により消化を阻害した。熱処理には、細菌懸濁液（10¹⁰細胞／ml ）を湯浴中で次の各温度で１時間インキュベートした：50℃、80℃および100℃ 。酵素処理した細胞と熱処理した細胞の両方をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで結合実験を行う前にＰＢＳ−１％ＢＳＡ中に再懸濁した。PAGE およびウエスタンブロット分析タンパク質のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE）はLaemmliにより記載された方法〔Laemmli，U.K．(1970)Nature 227:680-685〕を使って行った。試料を２−メルカプトエタノールの不在下で37℃で30分間試料緩衝液中に可溶化させるか（非還元条件）、または１％２−メルカプトエタノールの存在下で100 ℃で５分間試料緩衝液中に可溶化させた（還元条件）。供給業者(Bio-Rad)により推奨される通りにタンパク質を電気泳動によりニトロセルロース膜に移行し、そしてＴＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。推定ｂＬｆ結合タンパク質を同定するために、次のようにウエスタンブロットを¹²⁵Ｉ−ｂＬＦで探査した。¹²⁵Ｉ−ｂＬＦをＴＢＳ−１％ＢＳＡ中80ng/mlの最終濃度になるように膜に添加し、そして室温で２時間インキュベートした。0. 05％ Tween 20を含むＴＢＳで３回洗浄した後、膜を室温で24時間Ｘ線フィルムにさらした。¹²⁵Ｉ−ｂＬＦ結合と競合させるためには、¹²⁵Ｉ−ｂＬＦとインキュベートする前に、移行した膜を35μg/mlの未標識ｂＬＦと共に２時間インキュベートした。結果Ｓ．ユベリスへのｂＬｆの時間依存性結合Ｓ．ユベリス株su-1を¹²⁵Ｉ−標識タンパク質結合アッセイにおいてｂＬｆ結合について試験した。Ｓ．ユベリスと¹²⁵Ｉ−ｂＬｆとの結合の反応速度論を研究するために、結合を様々な時間間隔で測定した（図７）。経時変化は、¹²⁵Ｉ −ｂＬｆが時間依存形式でＳ．ユベリスに結合でき、100％飽和には約90分を必要とすることを示した。この結合飽和時間は、後の結合実験におけるインキュベーション時間を決定するための基準であった。ｂＬｆレセプター飽和度、親和性およびコピー数放射性リガンドと競合物質の両方としてｂＬｆ（33％鉄飽和）を使って競合結合実験を行い、そしてＳ．ユベリスによるｂＬｆ結合の特異性を証明した（図８）。未標識ｂＬｆは、用量依存形式でＳ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆの結合を効率的に置換した。約270nMの未標識ｂＬｆの濃度が、¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ取込みの50 ％阻害を引き起こした（点線により示される）。スチャッチャードプロット分析は直線性を示し、すなわち１つのｂＬｆ結合成分の証明が期待される。スキャッチャードプロットから計算したＳ．ユベリスの細胞１個あたり結合したｂＬｆ分子の数は約7800であり、親和性（Ｋｄ）は1.0×10^-7Ｍであった。ｂＬｆ鉄飽和がレセプター結合に影響を及ぼし得るかどうかを調べるために、¹²⁵ Ｉ−ｂＬｆ結合アッセイにおいて競合物質としてアポｂＬｆを使った。結果は、アポｂＬｆが¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合を鉄飽和ｂＬｆト同じくらい効率的に阻害できることを示し（表１）、このことはアポｂＬｆと鉄飽和ｂＬｆが共にＳ．ユベリス細胞上に同じ結合レセプターを有することを示唆する。結合の特異性を更に調べるために、Ｓ．ユベリス細胞への¹²⁵Ｉ −ｂＬｆの結合を阻害するｂＴＦ、ｈＬｆおよびｈＴＦの能力も評価した（表１）。それらのタンパク質のいずれもＳ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆの結合を妨害しなかった。前記結果は、この結合がｂＬｆ特異的であることを示唆している。ｂＬｆ結合に対する鉄制限条件の影響Ｓ．ユベリスのｂＬｆ結合性が鉄調節細菌成分により媒介されるのかどうかを調べる試みにおいて、EDDA、ジピリジルまたはデスフェリオキサミンメシレートをＴＨＢ−ＹＥブロス中に含め、鉄の利用性を低下させた。それらの鉄制限条件からの細胞は、正常な培養条件からのものよりも高い¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合を示さなかった（図９）。このことは、鉄制限条件がｂＬｆによるＳ．ユベリスの飽和を大きくは変えないことを示す。表１．Ｓ．ユベリスへの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合に対する未標識タンパク質および細菌の酵素処理または熱処理の阻害作用 ¹阻害値は阻害剤の非存在下でＰＢＳ中に懸濁した細菌へのｂＬｆ結合の相対比率として計算した。² 結合の減少は、何も処理してない細菌へのｂＬｆ結合の相対比率として計算した。プロテアーゼ加水分解と熱処理に対するｂＬｆ結合成分の感受性Ｓ．ユベリス細胞のペプシン、トリプシンおよびプロテイナーゼＫは、ｂＬｆ結合を阻止することができ（表１）、それは表面上に暴露された細胞壁タンパク質が結合に関与していることを示唆する。細菌の熱処理が或る程度結合を減少させたことから（表１）、このタンパク様成分は温度に感受性であった。細胞壁ｂＬｆ結合タンパク質の同定Ｓ．ユベリスの細胞壁調製物中に機能的に活性なｂＬｆ結合タンパク質（bＬｆ-binding protein；Ｌｂｐ）が存在することが、¹²⁵Ｉ−ｂＬｆを用いて探査したウエスタンブロットにより検出された。非還元条件下では、それぞれ165kDa と76kDaの見かけ分子量を有する２成分がＳ．ユベリスのｂＬｆ結合タンパク質として同定された。還元条件下では両タンパク質がｂＬｆ結合活性を大幅に失った。未標識ｂＬｆの存在がこの結合を有効に阻害したことから、これらのタンパク質バンドは¹²⁵Ｉ−ｂＬｆへの特異的結合から生じたものであると証明された。考察Ｓ．ユベリスがｂＬｆに特異的なレセプターを発現できるかどうかを証明するために、本発明者らは生物学的レセプターの主な前提条件、即ち、リガンド特異性と濃度依存性飽和度を満たすことができるかどうかについて調べようと努めた。Ｓ．ユベリスへのウシＬｆ結合は時間と濃度に依存し（未標識リガンドが結合を目当てに¹²⁵Ｉ−ｂＬｆと競争できることにより証明される）、このことは細胞表面上の結合レセプターが限定数存在することを示唆する。スキャッチャードプロット分析により、細胞あたり7800個のｂＬｆ結合部位があると推定された。ｂＬｆに対する連鎖球菌レセプターの親和性（1.0×10^-7Ｍ）は、Naidu他（1991 ）J．Dairy Sci．74: 1218-1226によりＳ．アウレウスのｂＬｆレセプターについて記載されたもの（7 .1×10^-8Ｍ）よりわずかに低い。競合結合アッセイにおいてウシアポｂＬｆと鉄飽和Ｌｆの両形態とも¹²⁵Ｉ− ｂＬｆ結合を阻害する効率が同じくらいであったので、Ｓ．ユベリスはそれらの両形態を区別しなかった。この観察結果は、Ｎ．メニンジティディス（N．menin gitidis）Ｌｆレセプターについて記載されたもの〔Schryvers & Morris（1988 ）Infect．Immun．56:44-1149〕と同様であるが、Ｔｆレセプターについてのものとは対照的である。グラム陰性菌のトランスフェリン結合タンパク質の研究から思いついた共通の特徴は、それらの天然宿主のトランスフェリンに対する顕著な特異性である。競合結合アッセイでは、本明細書中に記載の連鎖球菌レセプターは、ヒトＬｆがウシＬｆの結合を有効に阻害できないという点で、或るラクトフェリン種特異性も証明した。Ｓ．アウレウスＬｆレセプターがヒトとウシの両起源からのラクトフェリンを結合すると示されていることが興味深い〔Naidu他（1990）J．Clin．Mi crobiol．28:2312-2319;Naidu他（1991）J．Med．Microbiol．34:323-328;Naidu 他（1991）J．Dairy Sci．74:1218-1226;Naidu他（1992）J．Med．Microbiol．3 6 :177-183〕。このような状況においては、Ｓ．ユベリスが排他的にウシ病原体であり、Ｓ．アウレウスがヒトとウシの両方において感染を引き起こすとすれば、ラクトフェリンに対する特異性はそれらの細菌の宿主特異性にも貢献し得る。その上、ウシトランスフェリンとヒトトランスフェリンのどちらも、Ｓ．ユベリスのラクトフェリンレセプターへの¹²⁵Ｉ標識ウシラクトフェリンの結合を阻害することができなかった。この観察結果は、Ｓ．アウレウスのラクトフェリンレセプターへのヒトまたはウシラクトフェリン結合をヒトまたはウシトランスフェリンによって阻害できなかったという、Naidu他（1991）J．Dairy Sci．74. :1218-1226;Naidu他（1992）J．Med．Microbiol．36:177-183により報告された結果と類似している。Ｎ．メニンジティディス（N，meningitidis）やＨ．インフルエンザ（H．infl uenza）のようなグラム陰性菌のトランスフェリンおよびラクトフェリンレセプターの大部分の発現は鉄により調節されるけれども、Ｓ．ユベリスレセプター活性は増殖培地の鉄利用性により調節されなかった。この結果は、ＴｆへのＳ．アウレウスの結合およびＬｆへのＳ．アガラクティエの結合が鉄により調節されないことを示したModun他（1994）Infect．Immun．62:3850-3858およびRainard，P ．(1992)FEMS Microbiol．Lett．98:235-240の所見と一致する。Ｓ．ユベリス上のウシラクトフェリンレセプターの存在が証明されたので、本発明者らはそれに関係する細菌細胞壁成分を同定しようと努めた。Ｓ．ユベリス細胞の熱処理およびタンパク質分解酵素処理は、ラクトフェリン結合を阻止した。このことは、細胞表面上の１または複数のタンパク質が関与している可能性を示唆した。S.ユベリスの細胞壁抽出物を調製し、そして非還元条件下でSDS-PAGE 試料緩衝液中に可溶化した。SDS-PAGEとニトロセルロースへの移行後の¹²⁵Ｉ− ｂＬｆ結合の結果、165kDaと76kDaの分子量を有する２つのラクトフェリン結合タンパク質が同定された。Ｓ．ユベリスがただ１つのｂＬｆ結合成分を有することをスキャッチャードプロット分析が示したので、165kDaタンパク質は76kDaの二量体形であるようだ。Ｓ．ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質は、種によって68〜105kDaの分子量で異なるＴｂｐ１およびＴｂｐ２と称する２種類のトランスフェリン結合タンパク質から成るヘモフィラス種やナイセリア種のトランスフェリンレセプターとは異なっている。Ｓ．ユベリスＬｂｐは上記２つの菌種のラクトフェリンレセプターとも異なっている。今日まで、 98〜105kDaの分子量を有するラクトフェリン結合タンパク質はただ１つだけ上記の菌種から同定されており、そして淋菌のラクトフェリンタンパク質（Ｌｂｐ１）が機能的に関連した淋菌Ｔｂｐ１と特徴を共有することが示されている（Bisw as & Sparling，1995）。Ｓ．アウレウスのウシラクトフェリンレセプターは92k Daと67kDaの推定分子量を有する２つの異なるｂＬｆ結合タンパク質から成り〔N aidu他（1991）J．Daury Sci．74:1218-1226〕、従って本明細書に記載のレセプーとは異なると思われる。また、本明細書に記載の連鎖球菌Ｌｂｐは、還元SDS- PAGEゲル条件下で67kDaと62kDaの２成分に分かれる１つの約450kDaタンパク質として同定されたＳ．アウレウスのヒトラクトフェリン結合タンパク質とも異なるようである。実施例２Ｓ．ユベリスＬｂｐ遺伝子およびその上流のＭｇａののクローニングおよび特徴づけ材料と方法菌株、プラスミドおよび培地使用するＳ．ユベリス株を下記の表２に列挙する。細菌はベース#2ヒツジ血液寒天プレート（PML Microbiologicals）上で37℃にて18時間、または0.3％酵母エキスが捕捉されたTodd-Hewittブロス（THB-YE）中で37℃にて一晩増殖させた。Ｅ．コリ細胞はLuriaブロス中またはLuriaブロス−寒天プレート上で増殖させた。組換えプラスミドを含むＥ．コリ株の増殖には50μg/mlの濃度でアンピリシンを使った。使用するクローニングベクターはpTZ18Rであった〔Mead他（1986） Protein Eng．1:67-74〕。細菌細胞壁、細胞膜、周縁細胞質、全細胞溶解物および培養上清の調製Ｓ．ユベリスの細胞壁成分は実施例１に記載の通り抽出した。外膜および内膜は、ショ糖密度勾配遠心分離によりＥ．コリ細胞から単離した。Ｅ．コリ周縁細胞質タンパク質は、冷却浸透圧ショック法により調製した。Ｅ．コリ形質転換体の全細胞溶解物を調製するために、細菌を一晩増殖させ、収集し、0.1Ｍリン酸塩緩衝化食塩溶液（ＰＢＳ）pH7.2中で１回洗浄し、水に再懸濁し、１回の凍結−解凍サイクルにかけ、そして２分間音波処理した。6000× gで20分間遠心分離した後、上清（全細胞溶解物）を収集し、凍結乾燥し、そして1/100培養容量の水に再懸濁した。組換えＥ．コリの100倍濃縮培養上清は、10％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を使った沈澱により得た。鉄飽和ｂＬｆおよび¹²⁵Ｉ−標識ｂＬｆの調製実施例１に記載の通りに33％鉄飽和ウシラクトフェリンを調製し、そしてヨウ素化した。ラクトフェリン結合アッセイ細菌細胞を培地から回収し、0.1M ＰＢＳ（pH7.2）中で１回洗浄し、そして１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ）中に10¹⁰個の細菌／ ml（c．ＯＤ₆₀₀＝1.5）の密度になるように再懸濁した。組換えタンパク質のｂＬｆ結合能を評価するために、増加する量のＥ．コリ細胞溶解物＋上清を約10⁹ 個のＳ．ユベリスと混合し、そして200μｌの総容量で1.0×10⁴cpmの¹²⁵Ｉ−ｂＬｆと共にインキュベートした。室温で２時間インキュベートした後、細菌細胞をペレット化し、0.1％ Tween 20を含む氷冷ＰＢＳ１mlで３回洗浄した。細菌ペレット中に存在する放射能をγ−カウンター中で測定した。全試料を三重反復試験し、全実験を２回繰り返した。与えるデータは、２つの別々の実験の平均値±標準偏差である。抗血清の調製Ｓ．ユベリスの組換えＬｂｐに対する血清は、完全フロイントアジュバント中の組換えＥ．コリのＴＣＡ沈澱済細胞上清0.5mlをウサギに皮下注射することにより惹起せしめた。不完全フロイントアジュバント中の試料を同量で２回、各動物の皮下にブースター注射した。PAGE およびウエスタンブロッティングタンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）はLaemml iにより記載された通りに行った〔Laemmli，U.K．（1970）Nature 227:680-685 〕。還元および非還元条件下の試料は実施例１に記載の通り調製した。３Ｍ尿素を含む試料緩衝液中に溶かした試料をゲルに負荷する前に30分間煮沸した。¹²⁵ Ｉ−ｂＬｆで探査するウエスタンブロットは、実施例１に記載した通りに実施した。組換えＬｂｐに対するウサギ抗血清を使ってプローブする免疫ブロッティングは下記の通りに行った。まず、タンパク質を製造業者（Bio-Rad）により推奨されるようにニトロセルロース膜上に電気ブロッティングした。ＴＢＳ（10mM T ris-HCl，pH7.5，140mM NaCl）−１％ウシ血清アルブニン（ＢＳＡ）中でのインキュベーションにより、非特異的結合をブロックした。ブロットをＴＢＳ−１％ＢＳＡ中に１：200希釈した抗体と共に室温で１時間インキュベートした。0.05 ％Tween 20を含有するＴＢＳ中で３回洗浄した後、ＴＢＳ−１％ＢＳＡ中１：50 00のアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウス（またはウサギ)IgG（Kirkegaard & Perry Laboratories，Inc.）を使って血清反応性タンパク質を検出した。アルカリホスファターゼ活性は、製造業者（Promega）により記載されたニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートトルイジニウム系を使って検出した。組換えＤＮＡ技術プラスミドＤＮＡはSambrook他（前掲）により記載された通りに精製した。必要な時、Gene Cleanキット（Bio/can Scientific）を使ってアガロースゲルからＤＮＡ断片を単離した。Ｓ．ユベリスの遺伝子ライブラリーを作製するために、以前に記載された通りに〔Caparon & Scott（1987）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:8677-8681〕染色体ＤＮＡを調製し、そしてSau3AIで部分消化した。ショ糖密度勾配遠心分離（Sa mbrook他，前掲）の後、2,000〜5,000bpの断片を回収した。それらの断片の末端をdGTPとdATPを使って部分的にフィルインし、SalIで切断されdTTPとdCTPを使って部分的にフィルインされたたpTZ18Rに連結せしめた。Ｅ．コリ DH αコンピテント細胞の形質転換は、製造業者（GIBCO BRL，Gaithersburg，MD）により推奨される通りに行った。Ｌｆ結合クローンを同定するために、形質転換体をニトロセルロースディスク（Schleicher & Schuell，Keene，NH）上でレプリカ複製し、そしてクロロホルム蒸気中で溶解させた。ＴＢＳ−１％ＢＳＡとのインキュベーションにより非特異的結合をブロックした。実施例１に記載の通りに膜を更に¹²⁵ Ｉ−ｂＬｆと共にインキュベートした。制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片およびウシ腸アルカリホスファターゼは、製造業者（Pharmacia Canada Ltd.，Quebec，Canada）の指示に従って使用した。ＤＮＡ配列は、Sanger他（1977）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74:5463-5467 のジデオキシチェーンターミネーション法により、T7 配列決定キット（Pharmacia Canada Ltd．）を使って、二本鎖プラスミド鋳型上で決定した。ＲＮＡ分析Ｅ．コリ株からのＲＮＡは、追加のＲＮアーゼ不含有ＤＮアーゼＩ消化を使って以前に記載された通りに単離した〔Lloubes他（1986）Nucleic Acid Res．14: 2621-263〕。Ｓ．ユベリスからのＲＮＡは次の通りに調製した。まず、10mlの培養物（ＯＤ₆₀₀ ＝0.6）からの細胞ペレットを、500Uのムタノリシン(Sigma)を含むＴＥ緩衝液（pH8.0）250μｌ中に再懸濁し、そして37℃で30分間インキュベートした。溶解緩衝液（250μｌ）（60mM Tris-HCl，pH7.4，200mM NaCl，10mM EDTA，2% SDS ）と100μg/ml（最終濃度）のプロテイナーゼＫを加え、インキュベーションを１時間続けた。試料を65℃のフェノール（水で飽和したもの、pH4.0）で１回抽出し、室温のフェノールで２回抽出した。エタノール沈澱によりＲＮＡを回収し、そしてＤＮアーゼＩ（Pharmacia Canada Ltd．）で処理した。ノーザンブロット分析はSambrook他（前掲）により記載された通りに実施した。結果ｌｂｐ遺伝子のクローニングと発現Ｓ．ユベリス（su-1）からの染色体ＤＮＡを使ってpTZ18R中に遺伝子ライブラリーを作成した。¹²⁵Ｉ−ｂＬｆを用いたコロニーブロッティングにより、ｂＬｆ結合タンパク質（Ｌｂｐ）の発現について5000個の形質転換体をスクリーニングした。最強のシグナルを有する１つのコロニーと弱いシグナルを有する６つのコロニーを選択し、それを使って全細胞溶解物を調製し、それを更に非還元条件下で¹²⁵Ｉ−ｂＬｆを結合する能力について試験した。最強のシグナルを有するクローン、Ｅ．コリ pLBP5が３本の主要バンドを生成した。そのうちの２本が、Ｓ．ユベリスのものとサイズが非常に近似している165kDaと76kDa の分子量を有した。未開裂のシグナルペプチドを有する前駆体形である可能性がある、165kDaよりわずかに大きい１本のバンドも観察された。宿主株対照Ｅ．コリpTZ18Rの全細胞溶解物からは対応するバンドが全く観察されなかった。Ｅ．コリpLBP5の周縁細胞質と上清からも組換えＬｂｐが検出されたが、外膜または内膜からは検出されなかった。このことは、Ｅ．コリ DH5αにおいて発現されたＬｂｐが膜に局在化されておらず、代わりに細胞から分泌される可能性があることを示した。競合阻害アッセイを行うことにより、Ｅ．コリ pLBP5の細胞溶解物と上清中に遊離のおよび機能的に活性な組換えＬｂｐの存在も検出された。Ｅ．コリ pLBP5 細胞溶解物と上清の混合物は、用量依存形式でＳ．ユベリス細胞への¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合を効率的に阻害したが、Ｅ．コリpTZ18Rからの試料は¹²⁵Ｉ−ｂＬｆ結合を阻害しなかった（図11）。 165kDaの分子量を有するタンパク質が76kDa分子の二量体であるかどうかを証明するために、２−メルカプトエタノールまたは尿素で処理した試料を、Ｅ．コリ pLBP5の上清に対するウサギ抗血清を使ったウエスタンブロティングにより分析した。メルカプトエタノール処理はＳ．ユベリスまたは組換えＥ．コリのいずれのＬｂｐの電気泳動移動度に対して何も影響がなかったが、一方で尿素処理は 165kDaと75kDaのバンドの消失と105kDaの見かけ分子量を有する新たなバンドの出現をもたらした。このデータは、165kDaタンパク質が76kDaサブユニットの二量体らしいことを示唆する。二量体は尿素によって単量体に解離され、それが更に変性されほぐされて、76kDaから105kDaへの見かけ分子量増加をもたらしたようだ。別の研究者らによってナイセリア・メニンジティディス（Neisseria mening itidis）において尿素処理後のＴｂｐ２の見かけ分子量の有意な増加が観察されている〔Vonderharr他（1994）J．Bacteriol．176:6207-6213〕。上記データもまた、オリゴマーの形成にジスルフィド結合が必須ではないことを示している。ヌクレオチド配列決定および分析Ｌｂｐ遺伝子の配列を決定するために、pLBP5のHincII，HindIII，SacI，SphI およびXbaI断片（図１）の各々を個別にpTZ18Rの対応部位中にクローニングした。万能プライマーと逆プライマーを使って、各断片を両方向で配列決定した。それにより得られた配列情報に基づいてその後のプライマーを合成した。 pLBP5から２つの転写解読枠（ＯＲＦ）が見つかった（図１）。１つはＬｂｐをコードする遺伝子ｌｂｐであり、サクブローンpLBP5L中のそれの存在はｂＬｆ結合表現型をもたらした。相補的ＤＮＡ鎖上のもう１つのＯＲＦは不完全であった。GenBankデータベース検索は、推測上のＯＲＦ遺伝子産物がＡ群連鎖球菌におけるＶｉｒＲおよびＭｒｙ正の調節因子に対して有意な相同性を有することを示した。よって、このＯＲＦをｍｇａ’と命名した（図１）。完全ｍｇａ遺伝子のクローニングと配列決定は後述する。ｌｂｐ配列はＤＮＡ配列の232位と262位に２つの潜在的な翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含んだ。両方とも推定ＳＤ配列に関連している（図２Ａ〜２Ｃ）。それらの開始点はそれぞれ62.857および61.454の推定サイズを有するタンパク質を与えるだろう。これらの推定サイズは76kDa分子量タンパク質に匹敵する。このタンパク質の実測分子量と計算分子量の間の不一致の理由は明らかでない。翻訳後修飾、例えば脂質修飾が起こり、SDS-PAGE測定による見かけ分子量を増加させたのかもしれない。グラム陰性菌において観察される同様な差はタンパク質脂質修飾により生じると証明されている〔Theisen他（1 992）Infect．Immun．60:826-831;Theisen他（1993）Infect．Immun．61:1793-1 798〕。ＤＮＡ配列は、２つの推定−10および−35プロモーター領域が最初のＡＴＧから−88位と−102位に存在することを示す。ｌｂｐの下流には潜在的ρ−非依存性転写ターミネーターがある（図２Ａ〜２Ｃ）。Ｌｂｐの推定配列のＮ末端の分析は、シグナル配列に特徴的なアミノ酸〔Simo nen & Palva（1993）Microbiol．Rev．57:109-137〕を示した（図２Ａ〜２Ｃ）。該配列の特徴は、ＫおよびＲ残基に富む正電荷を有するＮ末端に続いて、アミノ酸25〜48の疎水性領域（図３）および49〜50位のシグナルペプチダーゼ開裂部位ＶＫＡ（Ａ残基の後ろで開裂が起こる）である。この推定シグナル配列の存在は、ＬｂｐがＳ．ユベリスの細胞質膜の外側に輸送されることを示唆する。 GenBankデータベース検索は、ＬｂｐのＣ末端が連鎖球菌Ｍタンパク質、プラスミノーゲン結合タンパク質、フィブリノーゲンおよびIgG結合タンパク質のＣ末端に高度に相同であることを明らかにした。それは、グラム陽性菌の表面タンパク質について十分に確立された一般的特徴の全てを示す〔Fischetti他（1991 ）Common characteristics of the surface proteins from Gram-positive cocc i，p.290-294．G.M．Dunny，P.P．Cleary & L.L．McKay編，Genetics and molec ular biology of stereptococci，lactococci，and enterococci．American Soc iety for Microbiology，Washington，D.C.〕。それらの特徴は、Ｃ末端の４つの荷電アミノ酸から成る小さなクラスターに続いて21アミノ酸から成る疎水性領域の存在を含む（図２Ａ〜２Ｃおよび図３）。隣接する疎水性領域は共通膜固定モチーフLPSTGDである。次の50アミノ酸領域は、プロリンとグリシンの高比率（12％）により特徴づけられる細胞壁関連領域である。GenBankデータベース検索もＬｂｐが哺乳類ミオシン重鎖およびキネシン重鎖に相同であることを示した。それはそれらの２つの原繊維タンパク質とそれぞれ48％および46％の全配列相同性を有した。膜固定モチーフおよび高プロリン／グリシン領域の後ろの領域は、内在的相同性を有することがわかった３つのアミノ酸ブロックを有する（図２Ａ〜２Ｃ）。Ａ１ブロックはＡ２ブロックに相同である52アミノ酸を含み、Ｂ１ブロックはＢ２ブロックに相同である13アミノ酸を含み、そして59アミノ酸のＣ１ブロックはＣ２ブロックに相同である。翻訳されたタンパク質の二次構造の分析は、高プロリン／グリシン領域からシグナル配列の開裂部位の近くのβ−シートおよびターン領域まで広がる広範囲の α−ヘリックス領域を示した（図３）。ＬｂｐのＬｆ結合領域の局在化ＬｂｐのＬｆ結合領域を局在化するために、遺伝子欠失体を作製した（図１）。pLBP5Lの制限酵素部位HincII，StuI，XbaIおよびXmnIにおいて３’欠失体pTP3 1，pTP32，pTP33およびpTP34を作製した。pLBP5Lの643bp HindIII-XbaI断片を除去することにより、５’欠失体pTP51を作製した。これらの欠失体は全てｌｂｐプロモーターを含んだ。先端が切り取られたＬｂｐをＥ．コリ中で生産させ、そしてSDS-PAGE、ニトロセルロースへの移行および特異的ウサギ抗血清または¹²⁵ Ｉ−ｂＬｆとの反応の後に可視化した。前記実験では非還元条件下で全ての試料を試験した。ｂＬｆ結合結果を図１に要約する。全長Ｌｂｐと同様に、Ｅ．コリ pTP31，pTP32およびpTP33からの先端が切り取られたタンパク質は単量体形と二量体形の両方のｂＬｆを結合することができた。それらのクローンからの幾つかの分解生成物も結合活性を有した。Ｅ．コリ pTP34またはpTP51からは１つもバンドが検出されなかった。これらのデータは、ｂＬｆの結合に関係するＬｂｐの最初の領域が22kDaのＮ末端断片にあることを示す。完全ｍｇａ遺伝子のクローニングおよび配列決定上述したように、プラスミドpLBP5はｌｂｐに加えて不完全なｍｇａ’遺伝子を含んだ。便宜上、pLBP5分子を反転させてpLBP5i（図４）にして記載した。完全ｍｇａ遺伝子を得るために、ｍｇａ’からの991bpのStyI断片（図４中のＶＰ１）をプローブとして放射性標識（³²Ｐ）し、そしてＳ．ユベリス遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに使った。陽性のＥ．コリ DH5αクローンを得、プラスミドpMGA14の制限酵素地図を図４に示す。pMGA14のヌクレオチド配列を決定するために、pMGA14のBamHI，HincII，HindIIIおよびKpnI制限断片（図４）を個別にpTZ18Rの対応部位中にクローニングし、そして万能プライマーと逆プライマーを使って両方向で配列決定した。それから得られた配列情報に基づいてその後のプライマーを合成した。プラスミドpMGA14はＭｇａの完全ＯＲＦを含んだ。しかしながら、関連するプロモーター領域は存在しなかった。pLBP5iの1.5k b SphI-NheI断片はｍｇａ’の５’領域の大部分と完全なプロモーター領域を含んだので、それをpMGA14のSphI部位とNheI部位の間に挿入して、プロモーターを有する完全なｍｇａ遺伝子を含むpMGA14Fを作製した（図４）。 pMGA14Fの3558bp ＤＮＡ断片の配列を図５Ａ〜５Ｄに与える。ヌクレオチド36 1〜363位のＡＴＧコドンで始まりそしてヌクレオチド1858〜1860位のＴＡＡコドンで終わる推定遺伝子産物Ｍｇａは、 58,454Daの計算分子量を有する499アミノ酸残基から成る。ＭｇａのＮ末端は記載されたような〔Simonen & Palva（1993）Microbiol．Rev．57:109-137〕シグナルペプチドの特徴を欠いており、これはＭｇａが細胞質タンパク質であることを示唆する。ｍｇａの開始コドンの前には推定リボソーム結合部位ＡＧＧＡＧＡがある。−35および−10プロモーターモチーフに似た配列も同定された。 GenBankデータベースの検索から、ｍｇａの推定タンパク質がＶｉｒＲおよびＭｒｙタンパク質〔Chen他（1993）Mol．Gen．Genet．241:685-693；Perez-Casa l他（1991）J．Bacteriol．173:2617-2624〕に対して34％の全配列同一性を有することがわかった。Ａ群連鎖球菌Ｍタンパク質のそれらの正の調節因子がヘリックス−ターン−ヘリックスＤＮＡ結合領域を含むことが示され、それらの領域を介して、調節因子が特異的ＤＮＡ配列と直接相互作用して転写活性に影響を及ぼし得ると考えられる（Chen他、前掲；Perez-Casal他、前掲）。PCGENEソフトウエアを使った外観検査および分析による類似のＤＮＡ結合領域を同定する試みは、Ｓ．ユベリスのＭｇａ中にそのようなモチーフを検出することができなかった。しかしながら、アミノ酸残基106〜125の領域（図５Ａ〜５Ｄ）は、ＶｉｒＲ49 〔Podbielski他（1995）Infect．Immun．63:9-20〕のＤＮＡ結合領域の配列と90 ％の一致を示した。ｍｇａの後に、それぞれ181，85，78および128アミノ酸残基を有する更に４つのＯＲＦが存在する（図５Ａ〜５Ｄ）。GenBankから有意な配列整列は見つからない。ｌｂｐおよびｍｇａ転写物のノーザンブロット分析ｌｂｐおよびｍｇａ転写物を分析するために、Ｓ．ユベリス（su-1）、Ｅ．コリ DH5α(pLBP5)、Ｅ．コリ DH5α(pLBP5L)、Ｅ．コリ DH5α(pMGA14F)およびＥ．コリ DH5α(pTZ18R)からＲＮＡを調製し、そして２つのノーザンブロットに使用した。１つのブロットはｌｂｐの1. 5kb HindIII-HpaI中間部断片（図６中のＬＰ１）を使って探査した。Ｓ．ユベリス（su-1）、Ｅ．コリ DH5α(pLBP5)およびＥ．コリ DH5α(pLBP5L)からのＲＮＡを含むレーンには2.0kbバンドが検出されたが、Ｅ．コリ DH5α(pTZ18R)からのＲＮＡを含む試料には欠けていた。このデータは、組換えＥ．コリ並びに生来のＳ．ユベリスにおいてはｌｂｐにより唯一の主要転写物だけが生産されることを示す。第二のブロットは、ｍｇａの1.0kb NcoI-NheI中間部断片（図４中のＮＰ２）を使って探査した。Ｅ．コリDH5α(pLBP5)およびＥ．コリ DH5α(pMGA14F )からのＲＮＡを含む試料においてそれぞれ1.8kbバンドが検出された。Ｓ．ユベリスおよびＥ．コリ DH5α(pTZ18R)のＲＮＡ試料からは全くバンドが検出されなかった。組換えＥ．コリにおいてｍｇａおよびｍｇａ’遺伝子が転写され、そしてｍｇａ’遺伝子の転写の間にベクターの終止コドンが使用されたのに違いない。しかしながら、Ｓ．ユベリス試料に可視ハイブリダイゼーションバンドが欠けているのが遺伝子転写物の量が少なかったためかまたはｍｇａ遺伝子が不活性であったためかは不明である。Ｓ．ユベリス株におけるｌｂｐおよびｍｇａ分布のサザンブロット分析５つのATCC株と42の野外分離株を含むＳ．ユベリスの集団（表２）をサザンハイブリダイゼーション実験に使った。染色体ＤＮＡを調製し、制限エンドヌクレアーゼHindIIIで消化し、そしてアガロースゲル上で分離した。ｌｂｐ遺伝子分布を分析するために、Ｌｂｐをコードする領域からの大部分のＤＮＡ配列を含む 1.5kb HindIII-HpaI断片（図６中のＬＰ１）をプローブとして使った。このプローブは47分の42(42/47)の株からのＤＮＡとハイブリダイズした（表２）。この結果は、ｌｂｐがＳ．ユベリス株の大部分と相同性領域を共有すること、またはそれらの株の中にｌｂｐプローブに相同である様々なｌｂｐ遺伝子の領域があることのいずれかを意味する。相同領域をより詳細に局在化するために、このｌｂｐプローブを更に小さい断片に細分割した（図６）。ｌｂｐ遺伝子のコード領域のＮ末端部分と中央部分をそれぞれ包含する643bp HindIII−Xba I断片（ＬＰ２）および437bp XbaI−StuI断片（ＬＰ３）の２つのプローブは、ｌｂｐ遺伝子を最初にクローニングした株であるsu-1とのみハイブリダイズした。一方で、Ｃ末端領域からの409bp StuI−HpaI断片（ＬＰ４）は、プローブＬＰ１とハイブリダイズした株の全部とハイブリダイズした。Ｃ反復配列の一部、提唱される細胞壁結合領域および膜固定領域のコード配列を含むｌｂｐ遺伝子の領域が、Ｓ．ユベリス株間で保存され、一方Ｎ末端部分をコードする領域は大きく異なることは明らかなようだ。ｌｂｐプローブとハイブリダイズした様々な株からの染色体制限断片のサイズの多様性は、それらの株間に或る程度の制限部位不均質性（HindIII部位が異なる位置にある）があることを示す。表２．Ｓ．ユベリス株並びにＬＰプローブおよびＶＰプローブとのＤＮＡハイブリダイゼーション表２（続き） ^a５つのATCC（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）株を除く全ての株が現場分離株である。^b ハイブリダイズする断片のサイズ（キロ塩基）。^c ハイブリダイゼーションせず。別のＳ．ユベリス株中にｍｇａ関連遺伝子が存在するかどうかを調べるために、前に作製したブロットをストリップし、そしてｍｇａ遺伝子の５’領域を含む 572bp HindIII断片（図４中のＶＰ３）を使って再探査した。ｌｂｐ遺伝子との相同性を示した全てのＳ．ユベリス株においてハイブリダイゼーションが検出可能であった（表２）。各株においてｍｇａプローブと反応した特異的バンドを表２に列挙する。考察 ¹²⁵Ｉ−ｂＬｆを使ったコロニーブロッティングにより遺伝子ライブラリーをスクリーニングした後、Ｓ．ユベリスのＬｂｐ遺伝子をＥ．コリ中にクローニングした。Ｅ．コリ形質転換体は、Ｓ．ユベリスにより生産される生来のタンパク質と同様な、76kDaと165kDaの分子量を有する機能的に活性なｂＬｆ結合タンパク質を生産した。Ｓ．ユベリスとｂＬｆとの一親和性結合現象を考えると、165k Daタンパク質が76kDa分子の二量体だろうかと考えた。還元剤β−メルカプトエタノールでの処理は、それらのタンパク質の移動度に全く影響を及ぼさなかった。このことは、タンパク質構造中にジスルフィド結合が無いことを示す。配列決定データが入手できた後でこれを確認した。すると、このタンパク質中には適当なシステイン残基は１つもなかった。３Ｍ尿素の存在下で30分間煮沸した後、タンパク質を完全に変性した。この処理は、二量体の解離から生じるのであろう、 165kDaタンパク質の分子量の有意な減少を引き起こし、そしてタンパク質の変性から生じる76kDaタンパク質の分子量の増加を引き起こした。低濃度の尿素処理または短い煮沸時間では165kDaバンドの移動度を変えることができなかったので、二量体構造は非常に安定であると思われる。Ｓ．ユベリス細胞壁調製物中に単量体と二量体のＬｂｐが両方存在することは、細菌表面上に両方の形態が存在することを暗示するのかもしれない。しかしながら、細菌細胞上に二量体形のみが存在し、ガラスビーズ処理によって引き起こされる部分的細胞溶解のために細胞質から単量体が出てくることもあり得る。試料調製の間の二量体から単量体への解離は、二量体の安定性のためにあまり起こりそうにないように見える。Ｓ．ユベリスＬｂｐの複雑な性質をヌクレオチド配列分析から更に確認した。予想通り、２つのＬｂｐは1,683bpの単−ＯＲＦによりコードされていた。２コピーの翻訳産物が互いに相互作用して同種二量体を形成することも十分可能である。サブユニット間の相互作用は広範囲であり、且つ高いα−ヘリックス含量の存在のため分子の長さ全体に渡ることができる。Ｍタンパク質〔Fuschetti，V.A ．（1989）Clin．Microbiol．Rev．2:285-314〕と同様に、Ｌｂｐは多数のα− ヘリックスコイル構造を含む哺乳類原繊維タンパク質、例えばヒトミオシン重鎖およびキネシン重鎖とかなりの配列相同性を共有する。Ｌｂｐの推定アミノ酸配列は、細菌細胞の外側に現れるタンパク質に予想されるように、Ｎ末端に50アミノ酸のシグナルペプチド（最初のＡＴＣ開始コドンで翻訳が始まるとすると）の存在を示した。このシグナルペプチドの構造は、以前に記載されたグラム陽性菌からのタンパク質中のシグナルペプチドの共通構造と等価である〔Simonen & Palva（1993）Microbiol．Rev．57:109-137;Goward他（ 1993）Trends Biochem．Sci．18:136-140;Perlman & Halvorson(1983)J．Mol．B iol．167:391-409;von-Heijne，G．（1983）Eur.J．Biochem．133:17-21;von-He ijne，G．(1986)Nucleic．Acids Res．14;4683-4690〕。ＬｂｐのＣ末端分析は、グラム陽性菌からの多数の他のタンパク質において見つかる膜固定モチーフ〔Fischetti他（1991）Common characterist ics of the surface proteins from Gram-positive cocci，p.290-294．G.M．Du nny，P.P．Cleary & L.L．McKay編、Genetics and molecular biology of strep tococci，lactococci and enterococci．American Society for Microbiology， Washington，D.C.〕に典型的なアミノ酸の存在を明らかにした。そのような領域はタンパク質を細胞壁に固定する役割を果たす〔Pancholi & Fischetti（1988） J．Bacteriol．170:2618-2624;Schneewind他（1992）Cell 70:267-281;Schneewi nd他（1993）Embo．J．12:4803-4811〕。Ｌｂｐが膜表面に固定化されるようになるのは恐らくＣ末端アミノ酸によってであろう。周縁細胞質に卓越的に見つかる連鎖球菌Ｍ6.1タンパク質（Fischetti他、1994）と同様に、Ｅ．コリ中で発現されたＬｂｐは大部分分泌されたので、本明細書に記載の膜固定モチーフはＥ．コリ中では何も機能を持たない。ｌｂｐ遺伝子への５’および前進的３’欠失により、ｂＬｆを結合できるＮ末端の大領域（約200コドン）の限定が可能になった。この領域をナイセリアからのＴｂｐ２のトランスフェリン結合領域〔vonder Haar他（1994）J．Bacteriol ．176:6207-6213〕と比較すると全く有意な相同性を示さなかった。また、本明細書中で報告されるｂＬｆ結合領域はアクチノバシラス・プリュロニューモニエ（Actinobacillus Pleuroneumoniae）のトランスフェリン結合タンパク質（ＴｆｂＡ）中に見つかるトランスフェリン結合活性を有する領域〔Strutzberg他（19 95）Infect．Immun．63:3846-3850〕のいずれも含まなかった。実施例１に示すように、ウシまたはヒトトランスフェリンはＳ．ユベリスへのウシラクトフェリンの結合を阻害できなかったことから、これは驚くべきことではない。これは、ｂＬｆ結合領域とＴｆ結合領域との相違を示す。第二のＯＲＦのｍｇａがｌｂｐ遺伝子領域に隣接して見つかった。この遺伝子の推定産物（499 アミノ酸残基を含む）は、Ａ群連鎖球菌のＭタンパク質の正の調節因子であるＶｉｒＲ12（499残基）およびＭｒｙ（530残基）〔Chen他（1991）Mol．Gen．Gene t．241:685-693；Perez-Casal他（1991）J．Bacteriol．173:2617-2624〕と同等の分子の大きさおよび配列を有する。しかしながら、ＭｒｙとＶｉｒＲ12はそれらに対して98％の相同性を有した（Chen他、前掲）のに対して、Ｍｇａはわずか 34％の相同性しか示さなかった。これは種の違いに起因するのかもしれない。同様に、ＯＦ⁺ＧＡＳのＶｉｒＲ49は、ＯＦ^-ＧＡＳのＶｉｒＲやＭｒｙとは低い相同性（76％）を示した〔Podbielski他（1995）Infect．Immun．63:9-20〕。Ｍｇａが細胞質に位置することは推定タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドが無いことにより示唆された。潜在的−10および−35プロモーターが見つかった。ｍｒｙが自己超調節されそしてＣＯ₂のレベルに応答して環境的に調節されることが研究により示されている〔Okada他（1993）Mol．Microbiol．7:893-903〕。ＣＯ₂濃度を増加させることによりｍｒｙの発現が刺激された。我々の実験では、ＣＯ₂の追加の補足を行わない条件下でＳ．ユベリス細胞を培養した。刺激環境の不在は、非常に低レベルのｍｇａ発現を引き起こした。これは、ノーザンブロット分析がＳ．ユベリスからｍｇａ転写物を検出しなかった理由であろう。組換えＥ．コリ中では、感受性タンパク質のような別の調節成分がないために、ｍｇａは環境シグナルによって調節されないだろうと予想される。ｍｇａがｌｂｐの発現を調節するかどうかを知ることが興味深い。ＭおよびＭ様タンパク質遺伝子のプロモーター中に存在する潜在的ＶｉｒＲ結合ボックス〔 Podbielski他（1992）Mol．Microbiol．6: 2253-2265;Podbielski他（1995）Infect．Immun.63:9-20〕は、相同性比較によりｌｂｐの−35領域のすぐ上流部分に全く見つからなかった。この連鎖球菌属におけるｍｇａの分布およびｌｂｐとの関連を調べるために、47のＳ．ユベリス株をｍｇａおよびｌｂｐ特異的プローブを使ってブロットした。結果は、ｌｂｐ陽性である全ての菌株がｍｇａを含むことを示した。サブゲノムプローブを使ったＳ．ユベリス株中のｌｂｐのサザンブロット分析は、Ｃ末端配列が株間で保存されており、一方でＮ末端領域は大きな変動を示すことを明らかにした。この現象は、Ａ群連鎖球菌のＭタンパク質について記載されたものと類似している。Ｍ６タンパク質構造遺伝子からのプローブを使ったＤＮＡハイブリダイゼーションにより、Scott他（1986）Infect．Immun．52:609-6 12は、Ｃ末端領域が異なるＭ血清型の株間で高度に保存されておりそしてＮ末端領域が高度に可変的であることを示した。これと一致して、詳細なアミノ酸比較と抗体反応性は、保存されたＣ末端領域内の限定的相違と、Ｎ末端の大きな可変性を明らかにした〔Bessen & Fischetti（1990）J．Exp．Med．172:1757-1764;B essen他（1989）J．Exp．Med．169:269-283；Kehoe（1991）Vaccine 9:797-806 〕。しかしながら、Ｓ．ユベリスのＬｆ結合タンパク質の場合、限定された配列と血清学的データしか比較に利用できない。Ｍタンパク質では、Ｎ末端領域が連鎖球菌細胞表面から遠位であり、よって免疫学的選択圧に大部分暴露される分子の領域であると予想されるだろう。従って、異なる血清型のＭタンパク質間でＮ末端領域の配列が異なることは驚くべきことではない。対照的に、分子のＣ末端領域の配列は、連鎖球菌の表面への結合を確実にするために進化論的に保存されているべきである。ＬｂｐはＭタンパク質のものに類似した構造を有するので、そのＣ末端配列が株間で保存され、一方でＮ末端領域が可変性を示すという発見は驚くべきことではない。ＬｂｐのＮ末端部分がＳ．ユベリス株間で可変的であるので、分子のこの部分がＬｆ結合を担うという我々の発見は驚くべきことでる。同様な観察結果はアクチノバシラス・プリュロニューモニエ（Actinobacillus pleuropneumoniae）においても報告されている。異なるＡ．プリュロニューモニエ血清型からのトランスフェリン結合タンパク質（Ｔｂｐ２）の２つのイソ型タンパク質は、可変的Ｎ末端半分と保存的Ｃ末端半分を含んでおり〔Bunka他（1995）Cloning and seque ncing of the transferrin-binding protein genes of Actinobacillus pleurop neumoniae，biotype 1-serotype 5 and biotype 2-serotype 2．未公開；GenBan k受入れ番号Z46774;Gerlach他（1992）Infect．Immun．60:3253-3261;Gerlach他（1992）Infect．Immun．60:892-898〕そして該分子のＮ末端半分がトランスフェリン結合を担っている〔Strutzberg他（1995）Infect．Immun．63:3846-3850 〕。実施例３Ｓ．ユベリスによるチャレンジに対する組換えラクトフェリン結合タンパク質の防御能の評価材料と方法菌株、ベクターおよび培地Ｓ．ユベリス株su-1(ATCC 9927)はウシ乳腺炎の臨床症例から入手した。細菌細胞はトリプシン処理大豆ブロス中で増殖させ、アリコートに分け、そして必要となるまで血液ビーズ上で−70℃で保存した。Ｅ．コリ株 DH5αは全ての形質転換実験に使用した。Ｅ．コリ細胞をLuria培地中で培養し、そして形質転換体の増殖培地に50μg/mlのアンピシリンを補足した。プラスミドpGH433〔Anderson他（1991）Infect．Immun．59:4110-4116〕はIPTG(イソプロピルβ-Ｄ−チオガラクトピラノシド)誘導性プロモーターの調節下で組換えタンパク質を発現させるのに使った。PAGE およびウエスタンブロッティングＬｂｐ封入体を４Ｍ尿素の存在下で試料緩衝液に溶かし、そして４Ｍ尿素を含むSDS-PAGEゲル上で泳動した。su-1に感染したウシからの回復期血清清の１：75 希釈液とアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ウシIgGの１：5000希釈液を使って、ウエスタンブロッティングを行った。タンパク質精製Ｅ．コリ形質転換体の培養物（１ｌ）を660nmでの吸光度が0.5となるまで増殖させ、そして２mM IPTGを使って誘導した。37℃で２時間連続して激しく振盪した後、細胞を収集し、Gerlach他（1992）Infect．Immun．60:892-898により記載された通りにタンパク質封入体を調製した。30℃で増殖した中間対数期ブロス培養物（１ｌ）を、タンパク質誘導のため激しく振盪しながら42℃で２時間培養した。遠心分離により細胞を収穫し、５mlの25％ショ糖＋50mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中に再懸濁し、そして−70℃で凍結した。250mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)中に溶かした1mgのリゾチームの添加、氷上での10分間のインキュベーション、25m lの界面活性剤混合物（20mM Tris-HCl緩衝液，pH7.4，300mM NaCl，２％デオキシコール酸，2% Nonidet P-40を５部と100mM Tris-HCl緩衝液，pH8.0，50mM EDT A，2% Triton X-100を４部）の添加、および音波処理により、細胞を溶解した。封入体を15,000×gで30分間の遠心分離により収穫し、そして5〜10mg／mlの濃度になるように水に再懸濁した。ELISA用の抗原は、SDS-PAGEゲルまたは４Ｍ尿素／SDS-PAGEゲルから溶出することにより精製した。タンパク質純度および濃度の測定タンパク質純度は、SDS-PAGEとその後のクーマシーブルー染色により評価した。タンパク質濃度は、供給業者により記載されたようなBio-Rad DCタンパク質アッセイを使って測定した。ウシ血清アルブミン（Pierce Chemical Co.，Rockfor d，IL）を標準物質として使用した。クーマシーブルー染色したSDS-PAGEをBio-R ad 620デンシトメーターでスキャンした後、標的タンパク質の量対全タンパク質の量を測定した。ワクチン調製および予防接種ワクチンは、0.1M PBS，pH7.2で希釈したアジュバントVSA3中に乳化したタンパク質から成った。ワクチンの各２ml用量は、VSA(0.67ml)，PBS(1.33ml)，および４Ｍ塩酸グアニジン5〜10μｌ中に溶かしたタンパク質抗原50μgを含んだ。ペンシルベニア州立大学乳腺炎リサーチ集団（Pennsylvania State Universitty M astitis Research Herd）からの15頭の健康な乳牛を、乾乳した時と再び28日後に筋肉内に予防接種した。５頭の牛から成るグループにＬｂｐまたはアジュバントのみを投与した。チャレンジ細菌チャレンジ培養物は、５％全血を含むエスクリン血液寒天プレート上でストックビーズ培養物を回転することにより調製した。37℃で24時間インキュベートした後、単一コロニーを100mlの超高温滅菌処理(UHT)乳に接種し、そして37℃ で12時間インキュベートした。24時間培養物をよく混合し、100μｌアリコートを取り出して第二の100mlのUHT乳に接種した。第二の37℃での９時間のインキュベーションの後、培養物を無菌食塩水を使って10倍増分で系列希釈した。各希釈液１mlあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を分光光度計上での吸光度により測定し、そして血液寒天プレート上に塗布することにより確認した。１mlの食塩水中200ＣＦＵのＳ．ユベリスを泌乳４日目に４分の１の乳房内に注入することにより、動物をチャレンジした。サンプリング表３に記載の時期に乳汁および血液試料を採取した。表３．免疫処置、チャレンジおよびサンプリングスケジュール抗体価Ｌｂｐ抗原の全Ｉｇ力価を間接ELISAにより測定した。炭酸塩緩衝液中の抗原でNunc Immulon-2プレートをコーティングした。使用前に、プレートをＴＢＳＴ（100mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，0.05% Tween-20）と３％ＢＳＡで１時間ブロックした。ブロックした後、プレートを蒸留水で洗浄した。血清と乳汁試料を１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴで３倍ずつ系列希釈した。Ｌｂｐ抗原に対するウサギ抗血清も希釈し、それを陽性対照として使用した。陰性対照試料は１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴであった。コーティングしたプレートに希釈試料と対照を移し、そして室温で１時間インキュベートした。プレートを蒸留水で徹底的に洗浄し、全てのウエルを１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中に１：2000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼーヤギ抗Ig接合体と共にインキュベートした。室温で１時間インキュベートした後、プレートを蒸留水で洗浄した。次いで試料中に存在する抗体の量を、ＡＢＴＳ基質を使って視覚化した。各試料の抗体価は495nmの参照波長と405nmでの吸光度の読みに基づいた。試料の陽性の読みとは、吸光度がブランク（陰性対照）の吸光度の２倍であるものであった。抗体価は、陽性の読みを与える最後の希釈率の逆数をとることにより測定した。アッセイプレート間の一致性は、陽性対照の吸光度の読みによりモニタリングした。乳汁組成分析 Fossomatic Cell and Milk Analyzer（A/S Foss Electric，Hillerod，Denmar k）を使って、乳汁ｐＨ値、総体細胞数、脂肪、タンパク質および乳糖を測定した。ＤＮＡ操作全ての分子技術は、供給業者（Pharmacia Canada Ltd.）により推奨される通りまたはSambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版（1989）に記載の通りであった。必要な場合、Gene Cleanキット（Bio/can Scientific）を使ってアガロースゲルからプラスミドＤＮＡ断片を単離した。結果 tac プロモーターの調節下でのＬｂｐの発現 pLBP5からの1.8kb SphI-RsaI断片をpGH433（図10）のBamHI部位に挿入して、1 2アミノ酸リーダーペプチドとIPTG誘導性tacプロモーターを提供することにより、プラスミドpGH-LBPを作製した。連結前に、挿入断片をマングビーンヌクレアーゼで処理して、SphIにより生じた末端から３’突出末端を除去し、そしてBamH Iで切断したベクターをクレノウ断片でフィルインして平滑末端にした。pGH-LBPは、pGH 433により提供された12アミノ酸リーダーペプチドとtacプロモーターの下流に、Ｌｂｐ遺伝子（ｌｂｐ）の96％カルボキシ末端を含んだ。融合部位のヌクレオチド配列の分析は、図１に与えられるｌｂｐの配列との一致を示した。組換えタンパク質の精製 pGH-LBPを使ってＥ．コリ DH5α中でＳ．ユベリスのＬｂｐを発現させた。この系では、組換えタンパク質の発現は正常の増殖条件下では抑制された。IPTG誘導により、組換えタンパク質が凝集形で生産された。82kDaと90kDaのＬｂｐが全タンパク質の36％を占めた。単離したタンパク質凝集物を４Ｍ塩酸グアニジン中に溶かし、そしてワクチン製剤に使った。Ｌｂｐを４Ｍ尿素−SDS-PAGEゲルから精製し、それをELISA用の抗原として使った。凝集形Ｌｂｐと精製済Ｌｂｐの両方が、Ｓ．ユベリスに感染したウシからの回復期血清を使ったウエスタンブロッティングにより、抗原として活性であると証明された。実験的細菌チャレンジ後の乳汁中の体細胞数非予防接種対照動物のチャレンジ後の四半分からの乳汁中の平均体細胞数は、チャレンジ後３日目に3,000,000細胞／mlまで増加した。Ｌｂｐで予防接種した動物のチャレンジ後の四半分からのものは、対照グループのものに近似する平均ＳＣＣの迅速な増加を示した。Ｌｂｐ特異的抗体価の予防接種の効果対照動物の血清および乳汁中のＬｂｐ特異的抗体の平均レベルは、実験的チャレンジの前には低かった。１回の試行では、Ｌｂｐで予防接種した動物の血清および乳汁中のＬｂｐ特異的抗体レベルは、予防接種前レベルまたは対照動物のレベルと比較して有意に増加しなかった。その次の試行では、抗体応答が認められた。チャレンジ後の乳汁のｐＨ値および主成分の変化プラシーボ（偽薬）およびＬｂｐで予防接種した動物からの乳汁の平均ｐＨ値は、チャレンジ後に同様なパターンで変化した。免疫処置したまたは免疫処置してない動物からの乳汁中の脂肪、乳糖およびタンパク質の百分率も、チャレンジ後に同様なパターンで変化した。それらの値の明白な減少は起こらなかった。考察Ｓ．ユベリスＬｂｐの表面暴露は、乳汁中のオプソニン抗体レベルを上昇させそして乳腺中へのＰＭＮ漸増の速度を加速させることにより、Ｌｂｐを潜在的ワクチン候補にする。更に、上記実施例は、ＬｂｐがＳ．ユベリス感染から回収された動物からのウシ血清により認識されることを証明した。このことは、該タンパク質が生体内で発現されそしてウシがそれに免疫応答したことを示す。それらの考えに基づいて、Ｓ．ユベリスによるチャレンジに対する組換えＬｂｐの感染防御能を乳牛において試験した。Ｌｂｐは使用する発現系において、大量の純粋な組換えタンパク質の精製を容易にする封入体として生産された。一研究では、Ｌｂｐは免疫処置したウシにおいて高レベルの特異抗体を誘導しなかったが、これは多分製剤パラメーターのせいと思われる。それらの動物では、細菌チャレンジが乳腺炎の徴候である高い体細胞数を引き起こした。従って、Ｌｂｐでの予防接種は乳腺炎の発生を防がなかった。しかしながら、予防接種に対する血清学的応答が貧弱であり、従ってこの研究からＬｂｐの防御能に関する何らかの結論を引き出すことはできない。次の研究では、免疫処置したウシにおいてＬｂｐが抗体応答を惹起した。保護研究は現在進行中であり、予備結果はＬｂｐが乳腺炎から被検体を保護するのに有効であることを示している。乳房内または皮下経路でのＳ．ユベリス死菌による予防接種後のＳ．ユベリス乳腺炎に対する保護に乳腺リンパ球が関係している可能性がどこかに示唆されている〔Finch他（1994）Infect．Immun．62:3599-3603〕。最近の所見は、Ｓ．ユベリスにより引き起こされた乳腺炎に対する保護が特異抗体のレベルに関係しないようであることを指摘している。乾乳期でのＳ．ユベリスの乳房内または皮下投与は、次の泌乳期の間の同一株でのチャレンジ後に乳汁から回収される細菌の数および臨床的乳腺炎の発生率を大きく減少させることが証明されている〔Finc h他（1994）前掲；Hill他（1994）FEMS Immunol．Med．Microbiol．1:109-118〕。予防接種後にＳ．ユベリス特異的免疫グロブリンのレベルに有意な増加があったが、血清および乳汁中のオプソニン活性にはまったく増加が見られなかった。更に、Ｓ．ユベリスが細菌表面に結合したＩｇの存在にかかわらず、好中球の殺菌活性に抵抗できることが証明されている〔Leigh & Field（1994）Infect．Imm unn．62:1854-1859〕。従って、Ｓ．ユベリス乳腺炎に対する予防接種方法を評価する時、抗体応答の評価と同等に細胞性免疫応答の評価が重要であるだろう。我々のワクチン試験の間、免疫処置または非免疫処置動物においてチャレンジ後に明らかな乳腺炎の臨床的徴候は全く観察されなかった。従って、乳汁のｐＨ値および主成分に影響されなかったことは驚くべきことではない。Ｓ．ユベリスラクトフェリン結合タンパク質、それの調製方法および使用方法が開示される。本発明の好ましい態様を幾分詳細に記載してきたけれども、請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく明らかな変更を行い得ることは理解されよう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年３月１７日（１９９８．３．１７）【補正内容】請求の範囲 1. 単離された免疫原性ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uher is）ウシラクトフェリン結合タンパク質。 2. 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のアミノ酸位置１〜561に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１のラクトフェリン結合タンパク質、または少なくとも約10アミノ酸を含んで成るそれの免疫原性断片。 3. 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のアミノ酸位置52〜561に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１のラクトフェリン結合タンパク質、または少なくとも約10アミノ酸を含んで成るそれの免疫原性断片。 4. 免疫原性ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uberis）ウシラクトフェリン結合タンパク質のコード配列を含んで成る、単離された核酸分子。 5. 前記分子が図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のヌクレオチド位置232〜191 4に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る請求項４の核酸分子、または少なくとも約15ヌクレオチドを含んで成るそれの断片。 6. 前記分子が図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のヌクレオチド位置445〜191 4に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る請求項４の核酸分子、または少なくとも約15ヌクレオチドを含んで成るそれの断片。 7. 組換えベクターであって、 (a) 請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子；および (b) 前記コード配列を宿主細胞中で転写しそして翻訳することができる前記核酸分子に作用可能に連結された調節要素であって、前記調節要素の少なくとも１つが前記コード配列に対して非相同である調節要素を含んで成る組換ベクター。 8. 請求項７の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。 9. 組換えウシラクトフェリン結合タンパク質の生産方法であって、 (a) 請求項８に記載の宿主細胞の集団を用意し；そして (b) 前記細胞集団を、前記組換えベクター中に存在するコード配列によりコードされるウシラクトフェリン結合タンパク質が発現されるような条件下で培養することを含んで成る方法。 10．請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性ウシラクトフェリン結合タンパク質と医薬上許容される賦形剤を含んで成るワクチン組成物。 11．アジュバントを更に含んで成る、請求項10のワクチン組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マクラクラン，フィリップロナルドカナダ国，サスカッチェワンエス７エイチ５エル８，サスカトゥーン，テイトプレイス 309シー―207

Claims

【特許請求の範囲】 1. 単離された免疫原性ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uher is）ウシラクトフェリン結合タンパク質。 2. 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のアミノ酸位置１〜561に示されるアミノ酸配列と少なくとも約80％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１のラクトフェリン結合タンパク質、または少なくとも約10アミノ酸を含んで成るそれの免疫原性断片。 3. 図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のアミノ酸位置52〜561に示されるアミノ酸配列と少なくとも約80％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る請求項１のラクトフェリン結合タンパク質、または少なくとも約10アミノ酸を含んで成るそれの免疫原性断片。 4. 免疫原性ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uheris）ウシラクトフェリン結合タンパク質のコード配列を含んで成る、単離された核酸分子。 5. 前記分子が図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のヌクレオチド位置232〜191 4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る請求項４の核酸分子、または少なくとも約15ヌクレオチドを含んで成るそれの断片。 6. 前記分子が図２Ａ〜２Ｃ（配列番号１〜２）のヌクレオチド位置445〜191 4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも約80％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成る請求項４の核酸分子、または少なくとも約15ヌクレオチドを含んで成るそれの断片。 7. 組換えベクターであって、 (a) 請求項４〜６のいずれか一項に記載の核酸分子；および (b)前記コード配列を宿主細胞中で転写しそして翻訳することができる前記核酸分子に作用可能に連結された調節要素であって、前記調節要素の少なくとも１つが前記コード配列に対して非相同である調節要素を含んで成る組換えベクター。 8. 請求項７の組換えベクターにより形質転換された宿主細胞。 9. 組換えウシラクトフェリン結合タンパク質の生産方法であって、 (a) 請求項８に記載の宿主細胞の集団を用意し；そして (b) 前記細胞集団を、前記組換えベクター中に存在するコード配列によりコードされるウシラクトフェリン結合タンパク質が発現されるような条件下で培養することを含んで成る方法。 10．請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性ウシラクトフェリン結合タンパク質と医薬上許容される賦形剤を含んで成るワクチン組成物。 11．アジュバントを更に含んで成る、請求項10のワクチン組成物。 12．ワクチン組成物の調製方法であって、 (a) 請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性Ｓ．ユベリスウシラクトフェリン結合タンパク質を用意し；そして (b) 前記ラクトフェリン結合タンパク質を医薬上許容される賦形剤と混合することを含んで成る方法。 13．哺乳類被検体において乳腺炎を治療または予防するのに有用な組成物の製造のための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のウシラクトフェリン結合タンパク質の使用。 14．請求項１〜３のいずれか一項に記載のストレプトコッカス・ユベリスウシラクトフェリン結合タンパク質に対して向けられた抗体。 15．前記抗体がポリクローナルである、請求項14の抗体。 16．前記抗体がモノクローナルである、請求項14の抗体。 17．生物学的試料中のストレプトコッカス・ユベリス抗体を検出する方法であって、 (a) 生物学的試料を用意し； (b) 前記生物学的試料中にＳ．ユベリス抗体が存在する時、Ｓ．ユベリス抗体が請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳ．ユベリスウシラクトフェリン結合タンパク質に結合して抗体／抗原複合体を形成するような条件下で、前記生物学的試料を前記Ｓ．ユベリスウシラクトフェリン結合タンパク質と反応させ；そして (c) 前記複合体の存否を検出し、それにより前記試料通のＳ．ユベリス抗体の存否を検出することを含んで成る方法。 18．ストレプトコッカス・ユベリス感染を検出するための免疫診断試験キットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＳ．ユベリスウシラクトフェリン結合タンパク質、および前記免疫診断試験を実施するための使用説明書を含んで成る試験キット。 19．単離されたストレプトコッカス・ユベリスウシＭｇａタンパク質。 20．ストレプトコッカス・ユベリスウシＭｇａタンパク質のコード配列を含んで成る、単離された核酸分子。