ES2286133T3 - Acidos nucleicos de polipeptidos de estreptococos del grupo b y composiciones terapeuticas y vacunas de los mismos. - Google Patents
Acidos nucleicos de polipeptidos de estreptococos del grupo b y composiciones terapeuticas y vacunas de los mismos. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las mismas, en el que el análogo sustancialmente homólogo comparte por lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 2.
Description
Ácidos nucleicos de polipéptidos de
estreptococos del grupo B y composiciones terapéuticas y vacunas de
los mismos.
La investigación que condujo a la presente
invención fue apoyada, por lo menos en parte, por una beca del
NAID, beca nº A140918. Por lo tanto, el Gobierno puede ostentar
determinados derechos sobre la invención.
La presente invención se refiere a la proteína
adhesina con matriz extracelular (Ema), EmaA, a los anticuerpos
para la misma y a las vacunas, composiciones y productos
terapéuticos.
La invención se refiere también a la
identificación y prevención de infecciones por estreptococos y a los
ácidos nucleicos aislados que codifican EmaA.
Los estreptococos son cocos gram positivos
negativos a la catalasa. Pueden clasificarse por el tipo de
hemólisis presentada en agar-agar con sangre, por
la detección serológica de antígenos de carbohidrato, o por
determinadas reacciones bioquímicas. Los estreptococos clínicamente
importantes incluyen los Grupos A, B, D y S de neumonías y el grupo
de viridanos de estreptococos. Streptococcus pyogenes (Grupo
A) de tipo A de Lancefield es un patógeno humano importante, causa
de la faringitis estreptocócica, impétigo y de infecciones más
graves tales como bacteriemia y fascitis necrotizante. Las secuelas
inmunológicas de las infecciones estreptocócicas del Grupo A
constituyen asimismo importantes problemas de salud -la carditis
reumática es la causa más común de enfermedad cardíaca adquirida en
el mundo y la glomerulonefritis posestreptocócica es una causa de
hipertensión y de disfunción renal. Los estreptococos agalactiae
son la causa más común de infecciones bacterianas graves en recién
nacidos e importantes patógenos en mujeres embarazadas y adultas no
embarazadas con problemas médicos subyacentes tales como la
diabetes y la enfermedad cardiovascular. Los estreptococos del Grupo
D incluyen los enterococos (Streptococcus faecalis y
faecium) y los estreptococo del grupo D "no
enterocócicos". El Streptococcus pneumoniae
(pneumococcus) no está clasificado por grupo en el sistema
Lancefield. Los nemococos son patógenos humanos extremadamente
importantes, la causa más común de neumonía bacteriana, infecciones
del oído medio y meningitis tras el periodo neonatal. El grupo
viridans de estreptococos incluye S. milleri, S. mitis, S.
sanguis y otros. Causan bacteremia, endocarditis e infecciones
dentales. Los enterococos son causas importantes de infecciones del
tracto urinario, bacteremia e infecciones de heridas (de forma
predominante como infecciones nosocomiales en pacientes
hospitalizados), y endocarditis. Durante la última década, los
enterococos han desarrollado una resistencia a numerosos
antibióticos convencionales y existen algunas cepas resistentes a
todos los antibióticos conocidos.
Los estreptococos del Grupo B (GBS) son la causa
más común de enfermedades bacterianas graves en recién nacidos, y
constituyen importantes patógenos en mujeres embarazadas y en
adultos con enfermedades subyacentes (Baker CJ. (2000) "Group B
streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical
aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D. L. Stevens y
E. L. Kaplan), New York: Oxford University Press,
222-237). Las manifestaciones comunes de estas
infecciones incluyen bacteremia, neumonía, meningitis, endocarditis,
e infecciones osteoarticulares (Baker CJ. (2000) "Group B
streptococcal infections" en Streptococcal infections. Clinical
aspects, microbiology, and molecular pathogenesis. (D. L. Stevens y
E. L. Kaplan), New York: Oxford University Press,
222-237; Blumberg H.M. et al. (1996) J Infect
Dis 173:365-373). La incidencia de la enfermedad por
GBS invasiva es de aproximadamente 2,6 por 1.000 nacimientos y de
7,7 por 100.000 en la población mundial, con índices de mortalidad
comprendidos entre 6 y 30% (Baker CJ. (2000) "Group B
streptococcal infections" en Streptococcal
infections.
Clinical aspects, microbiology, and molecular
pathogenesis. (D. L. Stevens y E. L. Kaplan), New York: Oxford
University Press, 222-237; Blumberg H.M. et
al. (1996) J Infect Dis 173:365-373).
Aunque muchas enfermedades neonatales se pueden prevenir mediante
la administración de antibióticos profilácticos a mujeres
parturientas, los programas de profilaxis con antibióticos pueden
resultar ineficaces, resultan insatisfactorios o fallan si surge
una resistencia al antibiótico. No se ha establecido ninguna
estrategia de profilaxis efectiva para infecciones en adultos.
Durante el parto, los GBS pueden pasar de la
madre al recién nacido. Según una estimación, hasta el 30% de
mujeres embarazadas portan GBS por lo menos temporalmente en la
vagina o en el recto sin síntomas. Los bebés de estas mujeres se
colonizan con GBS durante el parto (Baker, C.J. y Edwards, M.S.
(1995) "Group B Streptococcal Infections" en Infectious
Disease of the Fetus and Newborn Infant (J.S. Remington y J.O
Klein), 980-1054). La aspiración de fluido
amniótico o secreciones vaginales infectados permiten que los GBS
accedan a los pulmones. La adhesión a y la invasión del epitelio y
endotelio respiratorio parecen ser factores críticos en la infección
neonatal de aparición temprana (Baker, C.J. y Edwards, M.S. (1995)
"Group B Streptococcal Infections" en Infectious Disease of
the Fetus and Newborn Infant (J. S. Remington y J.O Klein);
980-1054; Rubens, C.E. et al. (1991) J
Inf Dis 164:320-330). No se han clarificado las
etapas subsiguientes en la infección, tales como la invasión del
flujo sanguíneo y el establecimiento de infecciones locales
metastásicas. Tampoco se entiende bien la patogénesis de
infecciones neonatales que aparecen tras la primera semana de vida.
La colonización gastrointestinal puede resultar más importante que
un foco respiratorio en una enfermedad neonatal de aparición tardía
(Baker, C.J. y Edwards, M.S. (1995) "Group B Streptococcal
Infections" en Infectious Disease of the Fetus and Newborn
Infant (J.S. Remington y J.O. Klein), 980-1054).
Unas pruebas importantes indican que la invasión de las células
endoteliales microvasculares del cerebro por GBS resulta la etapa
inicial en la patogénesis de la meningitis. Los GBS pueden invadir
las células endoteliales microvasculares del cerebro humano y los
GBS de tipo III, que son responsables de la mayoría de meningitis,
realiza esto 2 a 6 veces más eficientemente que otros serotipos
(Nizet, V. et al (1997) Infect Immun
65:5074-5081).
Debido a que los GBS están ampliamente
distribuidos ente la población y resulta un importante patógeno en
los recién nacidos, se realizan comúnmente pruebas a las mujeres
embarazadas para determinar si presentan GBS en las semanas 35 a 37
del embarazo. Gran parte de la enfermedad neonatal por GBS puede
prevenirse mediante la administración de antibióticos profilácticos
durante el parto a mujeres que resultan positivas en el análisis o
muestran factores de riesgo conocidos. Sin embargo, los programas de
antibióticos no previenen la totalidad de la enfermedad por GBS.
Los programas resultan deficientes por una serie de razones. En
primer lugar, los programas pueden resultar ineficaces. En segundo
lugar, resulta difícil asegurar que los proveedores de servicios
sanitarios y los pacientes siguen las pruebas y el tratamiento. Y
finalmente, si aparecen nuevos serotipos o resistencia al
antibiótico, los programas de antibióticos pueden fracasar
totalmente. Las pruebas disponibles actualmente para GBS resultan
ineficaces. Estas pruebas pueden proporcionar falsos negativos.
Además, las pruebas no son específicas para las cepas virulentas de
GBS. Por lo tanto, puede proporcionarse el tratamiento con
antibióticos de manera innecesaria y añadirse al problema de la
resistencia al antibiótico. Aunque podría resultar ventajosa una
vacuna, no existe aún ninguna disponible comercialmente.
Tradicionalmente, los GBS se dividen en 9
serotipos según la reactividad inmunológica de la cápsula
polisacárida (Baker CJ. (2000) "Group B streptococcal
infections" en Streptococcal infections. Clinical aspects,
microbiology, and molecular pathogenesis. (D.L. Stevens and
E.L. Kaplan), New York: Oxford University Press,
222-223; Blumberg H.M. et al. (1996) J
Infect Dis 173:365-373; Kogan, G. et al.
(1996) J Biol Chem 271:8786-8790).Los GBS de
serotipo III resultan particularmente importantes en los neonatos
humanos, causando del 60 al 70% de la totalidad de las infecciones
y casi la totalidad de las meningitis (Baker CJ. (2000) "Group B
streptococcal infections" en Streptococcal infections.
Clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis.
(D.L. Stevens y E.L. Kaplan), New York: Oxford University Press,
222-237). Los GBS de tipo III pueden subdividirse
en tres grupos de cepas relacionadas sobre la base del análisis de
los patrones de digestión de restricción (RDP) producidos por la
digestión del ADN cromosómico con Hind III y Sse8387. (1. Y.
Nagano et al. (1991) J Med Micro
35:297-303; S. Takahashi et al. (1998) J
Inf Dis 177:1116-1119).
Por encima del 90% de las enfermedades
neonatales por GBS de tipo III invasivas en Tokio, Japón y en Salt
Lake City, Utah, están causadas por bacterias de uno de los tres
tipos de RDP, calificadas del tipo III-3 de RDP,
mientras que el tipo III-2 de RDP es
considerablemente más probable de resultar aislado de la vagina que
de la sangre o CSF. Estos resultados sugieren que este grupo
relacionado genéticamente de los GBS de tipo III-3
es más virulento que las cepas III-2 y podría ser
responsable de la mayoría de enfermedades de tipo III invasivas de
manera global.
Las vacunas preliminares para los GBS utilizaron
polisacárido purificado no conjugado. Los poli- y oligosacáridos de
GBS son muy poco inmunógenos y no producen ni memoria ni respuestas
de refuerzo significativas. Baker et al inmunizaron a 40 mujeres
embarazadas con polisacárido capsular de serotipo III (Baker, C.J.
et al. (1998) New Engl J of Med
319:1180-1185). En general, únicamente el 57% de las
mujeres con niveles bajos de anticuerpo específico respondieron a
la vacuna. La escasa inmunogenicidad del antígeno polisacárido
purificado se demostró además en un estudio en el que treinta
voluntarios adultos fueron inmunizados con una vacuna tetravalente
compuesta de polisacárido purificado de los serotipos Ia, II y III
(Kotloff, K.L. et al. (1996) Vaccine 14:446:450).
Aunque segura, esta vacuna fue únicamente moderadamente inmunógena,
respondiendo únicamente el 13% de los sujetos al tipo Ib, el 17% al
tipo II, el 33% al tipo Ia, y el 70% al polisacárido de tipo III.
La escasa inmunogenicidad de los antígenos de polisacárido provocó
esfuerzos para desarrollar las vacunas conjugadas de polisacárido,
por lo que estos poli- u oligosacáridos están conjugados a los
portadores de proteína. El noventa por ciento de las mujeres
adultas sanas inmunizadas con una vacuna conjugada de polisacárido
de tipo III y de toxoide tetánico respondió con una aumento
cuadruplicado en la concentración de anticuerpo, en comparación con
el 50% inmunizado con únicamente polisacárido (Kasper, D.L. et
al (1996) J of Clin Invest
98:2308-2314). Un tipo de vacuna conjugada de
polisacárido de tipo Ia/ib y de toxoide tetánico fue igualmente más
inmunógeno en adultos sanos que el polisacárido solo (Baker, C.J.
et al (1999) J Infect Dis
179:142-150).
La desventaja que presentan las vacunas de
conjugado de proteína y polisacárido consiste en que el
procedimiento de purificación y conjugación de los polisacáridos
resulta dificultosa, ocupa mucho tiempo y resulta cara. Un antígeno
de proteína que podría resultar más económico y de fácil producción
podría comportar una mejora.
En caso de preparar una vacuna conjugada de
polisacárido y proteína, una proteína portadora específica para GBS
puede resultar preferida para uno de los portadores comúnmente
utilizados tales como los toxoides tetánicos o diftéricos debido a
los problemas potenciales asociados a algunas de estas proteínas
portadoras, particularmente la inmunogenicidad variable y los
problemas asociados a la vacunación repetida con la misma proteína
portadora. La selección de las proteínas portadoras adecuadas
resulta importante para el desarrollo de las formulaciones de
vacuna de polisacárido y proteína. Por ejemplo, el poli- u
oligosacárido de tipo b de Haemophilus influenzae conjugado
a diferentes portadores de proteínas presenta una inmunogenicidad
variable y provoca un anticuerpo con avidez variable (Decker, M.D.
et al (1992) J Pediatrics 120:184-189;
Schlesinger, Y. (1992) JAMA 267:1489-1494).
La inmunización repetida con la misma proteína portadora puede
asimismo suprimir las respuestas inmunes por competencia para las
células B específicas (supresión epitópica) u otros mecanismos. Esto
resulta de particular interés para el desarrollo de vacunas de GBS
ya que la totalidad de las vacunas de conjugado de
poli/oligosacárido y proteína desarrolladas recientemente contra las
bacterias H. influenzae, S. Pneumoniae, y N.
Meningitis utilizan un número limitado de proteínas portadoras
(toxoide tetánico, CRM197, toxoide diftérico), aumentando el número
de exposiciones a estos portadores que es probable que reciba un
individuo. Además, utilizar el tétano como una proteína portadora no
ofrece ninguna ventaja específica más que la inmunogenicidad
mejorada de la vacuna. Una vacuna de segunda generación que contiene
una proteína portadora específica para GBS podría potenciar la
inmunogenicidad y presentar una ventaja ya que la respuesta inmune
específica para GBS podría ser generada contra la proteína portadora
y el poli/oligosacárido.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Por lo tanto, en vista de las deficiencias
mencionadas anteriormente relacionadas con las vacunas y
procedimientos de la técnica anterior, resultaría evidente que
existe todavía una necesidad en la técnica de una vacuna de GBS
inmunógena y eficaz. La disponibilidad y la utilización de un
polipéptido de GBS en una vacuna conjugada resulta deseable. Un
polipéptido de GBS que está presente o expresado en la totalidad de
los serotipos de GBS podría presentar la ventaja añadida que
consiste en proporcionar inmunidad amplia, general a lo largo de
muchos serotipos de GBS. Podría resultar particularmente relevante y
útil para proporcionar una vacuna o inmunógeno estreptocócicos que
se expresa ampliamente en varias especies estreptocócicas, por lo
que la inmunidad amplia o general contra los grupos múltiples y
únicos de estreptococos (por ejemplo, el Grupo A, el Grupo B y
S. Pneumoniae), particularmente contra distintas bacterias
estreptocócicas virulentas y clínicamente relacionadas, pudo
generarse de este modo. Manganelli y Van de Rijn, Infection and
Immunity (1999) 50-56, se refiere a la adhesina emb
estreptocócica que se une a la matriz extracelular.
Según la presente invención, se proporciona el
polipéptido EmaA estreptocócico que es particularmente útil en la
identificación y prevención de infecciones por estreptococos.
Según un primer aspecto de la presente
invención, se proporciona un polipéptido EmaA estreptocócico aislado
que comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente
homólogos, variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las
mismas, en el que el análogo sustancialmente homólogo presenta por
lo menos el 70% de identidad de secuencia con la SEC. ID. nº:
2.
Preferentemente, el polipéptido está marcado con
un marcador detectable.
En el caso en el que se utiliza un marcador
radioactivo, tal como los isótopos ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P,
^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe,
^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re, pueden utilizarse
conocidos procedimientos de recuento disponibles actualmente. En el
caso en el que el marcador sea una enzima, la detección puede
realizarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas,
espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o
gasométricas utilizadas actualmente, conocidas en la técnica.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna o una composición inmunógena que comprende
el polipéptido y un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, la vacuna o la composición
inmunógena comprende además por lo menos un antígeno seleccionado
de entre:
- a.
- polipéptido Spb1 o un fragmento inmunógeno del mismo;
- b.
- polipéptido Spb2 o un fragmento inmunógeno del mismo;
- c.
- polipéptido antígeno alfa con proteína C o un fragmento inmunógeno del mismo;
- d.
- polipéptido Rib o un fragmento inmunógeno del mismo;
- e.
- polipéptido Lmb o un fragmento inmunógeno del mismo;
- f.
- polipéptido C5a-asa o un fragmento inmunógeno del mismo;
- g.
- polisacáridos u oligosacáridos estreptocócicos del Grupo B.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición farmacéutica que comprende el
polipéptido y un portador farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, la composición farmacéutica
comprende además un ingrediente activo seleccionado de entre:
- a.
- los polipéptidos Spb1 y Spb2;
- b.
- el antígeno alfa con proteína C;
- c.
- el polipéptido Rib;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- d.
- el polipéptido Lmb;
- e.
- el polipéptido C5a-asa;
- f.
- un polisacárido u oligosacárido estreptocócico del Grupo B; y
- g.
- una vacuna antiestreptocócica.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona un anticuerpo purificado contra el
polipéptido.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un anticuerpo monoclonal contra el polipéptido.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una estirpe celular inmortal que produce el anticuerpo
monoclonal.
Preferentemente, el anticuerpo está marcado con
un marcador detectable.
Preferentemente, el marcador se selecciona de
entre una enzima, un producto químico que emite fluorescencia y un
elemento radioactivo.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más
anticuerpos contra el polipéptido, y un portador farmacéuticamente
aceptable.
Preferentemente, la composición farmacéutica
comprende además por lo menos un anticuerpo contra una proteína
seleccionada de entre Spb1, Spb2, Rib, Lmb, C5a-asa
y antígeno alfa con proteína C.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el
polipéptido.
Preferentemente, el ácido nucleico se selecciona
de entre:
- a.
- la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN.
- b.
- una secuencia de ADN que se hibrida con la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN en condiciones de hibridación a severidad moderada;
- c.
- una secuencia de ADN capaz de codificar por lo menos una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN de (a) o (b);
- d.
- una variante degenerada de la misma;
- e.
- un alelo de la misma; y
- f.
- un fragmento de la misma que se hibrida con la secuencia SEC. ID. nº: 1 de ADN en condiciones de hibridación normales.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un vector que comprende el ácido nucleico y un
activador.
Preferentemente, el activador comprende un
activador bacteriano, de levadura, de insecto o de mamífero.
Convenientemente el vector es un plásmido, un
cósmido, un cromosoma artificial de levadura (YAC), un bacteriófago
o un ADN vírico eucariótico.
En una forma de realización adicional de la
presente invención, se proporciona un sistema de vector huésped
para la producción de un polipéptido que comprende el vector en una
célula huésped adecuada.
Preferentemente, la célula huésped adecuada
comprende una célula procariótica o eucariótica.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende el ácido
nucleico.
Preferentemente, la molécula de ADN está
operativamente ligada a una secuencia de control de la
expresión.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un huésped unicelular transformado con la molécula de
ADN recombinante.
\newpage
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona una vacuna de ácido nucleico que comprende la molécula
de ADN recombinante.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona un procedimiento para detectar la presencia
del polipéptido, en el que el polipéptido se mide de la manera
siguiente:
- a.
- poniendo en contacto una muestra en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un anticuerpo contra dicho polipéptido en condiciones que permitan que se produzca la unión del polipéptido al anticuerpo; y
- b.
- detectando si se ha producido la unión entre el polipéptido procedente de la muestra y el anticuerpo;
en la que la detección de la unión
indica la presencia o actividad del polipéptido en la
muestra.
Según otro aspecto de la presente invención se
proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una
bacteria que tiene un gen que codifica el polipéptido, procedimiento
que comprende:
- a.
- poner en contacto una muestra, en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un oligonucleótido que se hibrida con el gen del polipéptido, en condiciones que permiten que se produzca la hibridación específica del oligonucleótido con el gen; y
- b.
- detectar si se ha producido la hibridación entre el oligonucleótido y el gen;
en el que la detección de la
hibridación indica la presencia o actividad de la bacteria en la
muestra.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona la utilización de la vacuna o de la
composición inmunógena para la preparación de un medicamento
destinado a la prevención de una infección con una bacteria que
expresa el polipéptido.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona la utilización de la composición
farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado al
tratamiento de una infección con una bacteria que expresa el
polipéptido.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona la utilización de la composición
farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado a la
provocación de una respuesta inmunitaria en un sujeto que ha sido
expuesto a una bacteria estreptocócica o infectado con ella.
Según un aspecto adicional de la presente
invención se proporciona la utilización de la composición
farmacéutica para la preparación de un medicamento destinado a la
prevención de una infección por una bacteria estreptocócica.
Spb1 y Spb2 se describen en el documento WO
00/78787. El antígeno alfa con proteína C se describe en Michel
et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (21),
10060-4. Rib se describe en Wästfelt et al.
(1996) J. Biol. Chem. 271 (31), 18892-18897.
Lmb se describe en Spellerberg et al. (1999) Infect.
Immun. 67 (2), 871-8. C5a-asa se
describe en Chmouryguina et al. (1996) Infect. Immun.
65 (7), 2387-90.
La Figura 1 representa las sondas específicas de
tipo III-3 del modelo de digesta de restricción
(RDP). Hibridación por transferencia de manchas de la sonda
DY1-1 con ADN genómico aislado de GBS de tipo III.
10 \mug de ADN genómico de cada una de las 62 cepas de GBS de
tipo III se transfirió a una membrana de nilón. La sonda
DY1-1 radiomarcada se hibridó con ADN de todas las
cepas III-3 (filas A-D) incluyendo
la cepa de tipo III-3 original (pocillo
E-1). La sonda no pudo hibridarse con el ADN de las
cepas III-2 (F1-F10,
G1-7) incluyendo la cepa original utilizada en la
hibridación por substracción (pocillo E 10) y las cepas
III-1 (pocillos H1-3; véase la
Figura 3). El mismo modelo de hibridación se observó utilizando la
sonda DY1-11.
La Figura 2 representa el ácido nucleico y la
secuencia de aminoácidos prevista de emaA.
La Figura 3 representa el ácido nucleico y la
secuencia de aminoácidos prevista de emaB.
La Figura 4 representa el ácido nucleico y la
secuencia de aminoácidos prevista de emaC.
La Figura 5 representa el ácido nucleico y la
secuencia de aminoácidos prevista de emaD.
Las Figuras 6 A-D representa el
ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos prevista de
emaE.
La presente invención se refiere al objeto de
las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a un
polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de un
polipéptido Ema bacteriano. Se proporcionan polipéptidos Ema
bacterianos de estreptococos, enterococos y corinebacterias. La
presente invención se refiere específicamente a un polipéptido
aislado que comprende una secuencia de aminoácidos de un
polipéptido EmaA de estreptococos. Otros polipéptidos Ema incluyen
EmaB, EmaC, EmaD y EmaE, sin embargo, la presente invención se
refiere únicamente a EmaA.
Los polipéptidos de la presente invención son
adecuados para su utilización en animales que se inmunizan
generalmente contra la infección por estreptococos. Los
polipéptidos de la presente invención son adecuados para su
utilización en animales que se inmunizan generalmente contra la
infección por estreptococos del Grupo B, del Grupo A y por S.
pneumoniae. Los polipéptidos de la presente invención son
adecuados para su utilización en animales que se inmunizan contra
estreptococos del Grupo B. Estos polipéptidos o fragmentos de
péptido de los mismos, cuando se formulan con un adyuvante
apropiado, se utilizan en vacunas para la protección contra
estreptococos, particularmente estreptococos del Grupo B, y contra
otras bacterias con proteínas con reacción cruzada.
Las proteínas de GBS con homólogos de
estreptococos fuera del Grupo B han sido identificadas anteriormente
(Lachenauer CS y Madoff LC (1997) Adv. Exp. Med. Biol.
418:615-8; Brady L. J. et al. (1991)
Infect Immun. 59(12):4425-35;
Stahlhammer-Carlemalm M. et al. (2000) J.
Infect. Dis. 182(1):142-129).
Stahlhammer-Carlemalm et al. han demostrado
protección cruzada entre estreptococos del Grupo A y Grupo B debida
a proteínas superficiales con reacción cruzada
(Stahlhammer-Carlemalm M. et al. (2000) J.
Infect. Dis. 182(1):142-129). La
proteína R28 del estreptococo del grupo A (GAS) y la proteína Rib
del estreptococo del grupo B (GBS) son moléculas de la superficie
que producen inmunidad protectora contra la infección experimental.
Estas proteínas son miembros de la misma familia y reaccionan en
cruz inmunológicamente. A pesar de la extensa identidad del resto
de aminoácidos, la reactividad cruzada entre R28 y Rib se descubrió
que era limitada, como se demuestra por análisis con proteínas muy
purificadas y antisueros específicos. No obstante, la inmunización
de ratones con R28 purificada proporcionó protección contra la
infección letal con cepas de GBS que expresan a Rib, e inmunización
con protección proporcionada por Rib contra GAS que expresa a R28.
Por lo tanto, R28 y Rib produjeron inmunidad protectora
cruzada.
La presente invención se refiere a un
polipéptido EmaA estreptocócico aislado que comprende la secuencia
de aminoácidos indicada en la SEC. ID. nº: 2, y análogos
sustancialmente homólogos, variantes alélicas y fragmentos
inmunógenos de la misma.
La identidad o posición de uno o más restos de
aminoácidos puede cambiarse o modificarse para que incluya
variantes tales como, por ejemplo, deleciones que contienen no todos
los restos especificados para la proteína, sustituciones en la que
uno o más restos especificados se sustituyen por otros restos y
adiciones en las que uno o más restos de aminoácidos se añaden a
una parte terminal o media del polipéptido. Estas moléculas
incluyen: la incorporación de codones "preferidos" para la
expresión por huéspedes no mamíferos seleccionados; el aporte de
puntos para la escisión por enzimas endonucleasa de restricción; y
el aporte de secuencias de ADN iniciales, terminales o intermedias
adicionales que facilitan la construcción de vectores expresados
fácilmente.
La presente invención contempla la utilización
de los polipéptidos de estreptococos de la presente invención para
pruebas y procedimientos de diagnóstico destinados a determinar y/o
controlar la infección por estreptococos. De este modo, la presente
invención proporciona un polipéptido EmaA de GBS aislado, marcado
con un marcador detectable.
En el caso en el que se utiliza un marcador
radioactivo, tal como los isótopos ^{3}H, ^{14}C, ^{32}P,
^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe,
^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re, pueden utilizarse
conocidos procedimientos de recuento disponibles actualmente. En el
caso en el que el marcador sea una enzima, la detección puede
realizarse por cualquiera de las técnicas colorimétricas,
espectrofotométricas, fluoroespectrofotométricas, amperométricas o
gasométricas utilizadas actualmente, conocidas en la técnica.
Tal como se define en la presente memoria,
"adherencia" significa la unión no covalente de una bacteria a
una célula o secreción humanas que es suficientemente estable para
resistir el lavado.
La expresión "adhesina de la matriz
extracelular", "Ema", "ema" puede utilizarse en la
presente memoria indistintamente, y tal como se utiliza en toda la
presente solicitud y en las reivindicaciones se refiere al material
proteico incluyendo las proteínas simples o múltiples.
Se contemplan asimismo las proteínas y
polipéptidos que presentan actividad sustancialmente equivalente o
alterada. Puede deliberarse sobre estas modificaciones, por ejemplo,
como las modificaciones obtenidas por mutagénesis dirigida al
sitio, o pueden ser accidentales, tales como las obtenidas por
mutaciones en huéspedes que son productores de uno o más
polipéptidos Ema. Asimismo, la expresión "adhesina de la matriz
extracelular (Ema)" pretende incluir dentro de su alcance las
proteínas específicamente mencionadas en la presente memoria así
como todos los análogos sustancialmente homólogos y las variaciones
alélicas.
En otra forma de realización, la presente
invención contempla fragmentos de péptido del polipéptido que
proceden de los productos de la digestión proteolítica del
polipéptido.
El derivado del polipéptido puede tener uno o
más grupos químicos unidos a él. El grupo químico puede ser un
polímero soluble en agua, un polietilenglicol, un mono-, di-, tri- o
tetrapegilado o monopegilado con terminal N.
El acoplamiento de polietilenglicol (PEG) a
compuestos es particularmente útil porque el PEG tiene una toxicidad
muy baja en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo,
un aducto de PEG de adenosina desaminasa fue aprobado en los
Estados Unidos para su utilización en seres humanos para el
tratamiento del síndrome de la inmunodeficiencia combinada grave.
Una segunda ventaja proporcionada por la conjugación de PEG es la de
reducir eficazmente la inmunogenicidad y la antigenicidad de los
compuestos heterólogos. Por ejemplo, un aducto de PEG de una
proteína humana puede ser útil para el tratamiento de la enfermedad
en otra especie de mamífero sin riesgo de desencadenar una
respuesta inmunitaria grave. El compuesto de la presente invención
puede administrarse en un dispositivo de microencapsulación a fin
de reducir o prevenir una respuesta inmunitaria del huésped contra
el compuesto o contra las células que pueden producir el compuesto.
El compuesto de la presente invención puede administrarse también
microencapsulado en una membrana, tal como en un liposoma.
Se han descrito numerosas formas activadas de
PEG adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos
de PEG útiles para la reacción con grupos amino de proteínas
incluyen los ésteres activos de ácido carboxílico o derivados de
carbonato, particularmente aquellos en los que los grupos salientes
son N-hidroxisuccinimida,
p-nitrofenol, imidazol o
1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato.
Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo
son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo
libres de proteínas. Asimismo, los reactivos PEG que contienen
grupos aminohidrazina o hidrazida son útiles para la reacción con
aldehídos generados por oxidación con peryodato de los grupos
carbohidrato en las proteínas.
Los restos de aminoácido del polipéptido
descrito en la presente memoria se prefieren al estar en la forma
isomérica "L". Los restos en forma isomérica "D" pueden
sustituirse por cualquier resto de L-aminoácido,
siempre que la propiedad funcional deseada de actividad de lectina
sea conservada por el polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo
amino libre presente en el terminal amino de un polipéptido. COOH se
refiere al grupo carboxi libre presente en el terminal carboxi de
un polipéptido. Las abreviaturas utilizadas en la presente memoria
están de acuerdo con la nomenclatura de polipéptidos habitual, J.
Biol. Chem., 243:3552-59 (1969).
Debe observarse que todas las secuencias de
restos de aminoácidos están representadas en la presente memoria
por las fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la
dirección convencional del terminal amino al terminal carboxi.
Además, debe observarse que un guión al comienzo o final de una
secuencia del resto aminoácido indica un enlace peptídico en una
secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos.
El polipéptido sintético, preparado utilizando
las técnicas bien conocidas de fase sólida, fase líquida o las
técnicas de condensación de péptidos, o cualquier combinación de las
mismas, puede incluir aminoácidos naturales y no naturales. Los
aminoácidos utilizados para la síntesis de péptidos pueden ser la
resina de aminoácido Boc habitual
(N^{\alpha}-t-butiloxicarbonil
protegida con N^{\alpha}-amino) con los protocolos
de desprotección, neutralización, acoplamiento y lavado habituales
del procedimiento original en fase sólida de Merrifield (1963,
J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154), o con los
aminoácidos 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)
protegidos con N^{\alpha}-amino con base lábil
descritos por primera vez por Carpino y Han (1972, J. Org.
Chem. 37:3403-3409). De este modo, el
polipéptido descrito en la presente memoria puede comprender
D-aminoácidos, una combinación de D- y
L-aminoácidos y varios aminoácidos
"diseñadores" (p. ej., \beta-metil
aminoácidos, C\alpha-metil aminoácidos y
N\alpha-metil aminoácidos, etc.) para transportar
propiedades especiales. Los aminoácidos sintéticos incluyen
ornitina por lisina, fluorofenilalanina por fenilalanina y
norleucina por leucina o isoleucina. Además, por asignación de
aminoácidos específicos en las etapas de acoplamiento específico,
pueden generarse hélices \alpha, espiras \beta, hojas \beta,
espiras \gamma y péptidos cíclicos.
Los péptidos pueden comprender un aminoácido
especial en el terminal C que incorpora una cadena lateral con
CO_{2}H o CONH_{2} para simular una glicina libre o un grupo
glicina-amida. Otra manera de considerar este resto
especial sería como análogo de aminoácido D o L con una cadena
lateral que está constituida por un enlazador o enlace a la perla.
El resto C-terminal seudolibre puede ser de
configuración óptica D o L; puede utilizarse una mezcla racémica de
isómeros D y L.
Puede incluirse piroglutamato como resto
N-terminal del péptido. Aunque el piroglutamato no
es adecuado para la secuencia por degradación de Edman, al limitar
la sustitución a solamente el 50% de los péptidos en una perla dada
con piroglutamato N-terminal, permanecerá suficiente
péptido sin piroglutamato en la perla para el secuenciado.
Cualquier experto debería reconocer fácilmente que esta técnica se
podría utilizar para el secuenciado de cualquier péptido que
incorpore un resto resistente a la degradación de Edman en el
terminal N. Otros procedimientos para caracterizar péptidos
aislados que demuestran actividad deseada se describen con detalle
a continuación. La actividad específica de un péptido que comprende
un grupo N-terminal bloqueado, p. ej.,
piroglutamato, cuando el grupo N-terminal específico
está presente en el 50% de los péptidos, se demostraría fácilmente
comparando la actividad de un péptido completamente bloqueado (100%)
con un péptido no bloqueado (0%).
Asimismo se describe la preparación de péptidos
que presentan propiedades estructurales mejor definidas, y la
utilización de peptidomiméticos, y enlaces peptidomiméticos, tales
como los enlaces éster, para preparar péptidos con nuevas
propiedades.
\newpage
Puede generarse un péptido que incorpore un
enlace péptido reducido, es decir,
R_{1}-CH_{2}-NH-R_{2},
en la que R_{1} y R_{2} son restos o secuencias de aminoácido.
Un enlace péptido reducido puede introducirse como subunidad
dipeptídica. Dicha molécula sería resistente a la hidrólisis del
enlace péptido, p. ej., la actividad de proteasa. Dichos péptidos
proporcionarían ligandos con función y actividad únicas, tales como
vidas medias prolongadas in vivo debido a la resistencia a la
descomposición metabólica o a la actividad de la proteasa. Además,
es bien sabido que en determinados sistemas los péptidos
dependientes presentan aumento de actividad funcional (Hruby, 1982,
Life Sciences 31:189-199; Hruby et
al., 1990, Biochem J. 268:249-262);
asimismo se describe un procedimiento para producir un péptido
dependiente que incorpora secuencias aleatorias en todas las demás
posiciones.
Un péptido forzado, cíclico o rígido puede
prepararse por síntesis, con la condición de que en por lo menos
dos posiciones en la secuencia del péptido se inserte un aminoácido
o un análogo de aminoácido que proporcione un grupo funcional
químico capaz de reticularse para forzar, ciclar o hacer rígido el
péptido después del tratamiento para formar la reticulación. La
ciclación se favorecerá cuando se incorpore un aminoácido que
produzca espiras. Ejemplos de aminoácidos capaces de reticular un
péptido son la cisteína para formar disulfuro, el ácido aspártico
para formar una lactona o una lactasa, y un quelante tal como el
ácido \gamma-carbonil-glutámico
(Gla) (Bachem) para quelar un metal de transición y formar una
reticulación. El ácido \gamma-carboxil glutámico
protegido puede prepararse modificando la síntesis descrita por
Zee-Cheng y Olson (1980, Biophys. Biochem. Res.
Commun. 94:1128-1132). Un péptido en el que la
secuencia peptídica comprende por lo menos dos aminoácidos capaces
de reticularse puede ser tratado, p. ej., por oxidación de restos de
cisteína para formar un disulfuro o por adición de un ión metálico
para formar un quelato, a fin de reticular el péptido y formar un
péptido forzado, cíclico o rígido.
Asimismo se describen estrategias para preparar
sistemáticamente reticulaciones. Por ejemplo, si se incorporan
cuatro restos de cisteína en la secuencia peptídica, pueden
utilizarse diferentes grupos protectores (Hiskey, 1981, en The
Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross y
Meienhofer, eds., Academic Press: Nueva York, págs.
137-167; Ponsanti et al., 1990,
Tetrahedron 46:8255-8266). El primer par de
cisteínas puede desprotegerse y oxidarse, a continuación el segundo
conjunto puede desprotegerse y oxidarse. De esta manera puede
formarse una serie definida de reticulaciones de disulfuro.
Alternativamente, pueden incorporarse un par de cisteínas y un par
de análogos de aminoácido de intercalación de modo que las
reticulaciones son de diferente naturaleza química.
Pueden incorporarse los siguientes aminoácidos
no clásicos en el péptido a fin de introducir motivos de
configuración específicos:
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato
(Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc.
113:2275-2283);
(2S,3S)-metil-fenilalanina,
(2S,3R)-metil-fenilalanina,
(2R,3S)-metil-fenilalanina y
(2R,3R)-metil-fenilalanina
(Kazmierski y Hruby, 1991, Tetrahedron Lett.); ácido
2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico
(Landis, 1989, Tesis doctoral, University of Arizona);
hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato
(Miyake et al., 1989, J. Takeda Res. Labs.
43:53-76); \beta-carbolina (D y L)
(Kazmierski, 1988, Tesis doctoral, University of Arizona); HIC
(ácido histidina isoquinolina carboxílico) (Zechel et al.,
1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43); y HIC (histidina urea
cíclica) (Dharanipragada).
Los análogos y peptidomiméticos de aminoácidos
siguientes pueden incorporarse en un péptido para producir o
favorecer estructuras secundarias específicas:
LL-Acp (ácido
LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico),
análogo de dipéptido que produce una espira \beta (Kemp et
al., 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838);
análogos que producen la hoja \beta (Kemp et al., 1988,
Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); análogos que
producen la espira \beta (Kemp et al., 1988,
29:5057-5060); análogos que producen la hélice
\alpha (Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett.
29:4935-4938); análogos que producen la espira
\gamma (Kemp et al., 1989, J. Org. Chem.
54:109:115); y análogos proporcionados por las referencias
siguientes: Nagai y Sato, 1985, Tetrahedron Lett.
26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem.
Soc. Perkin Trans. pág. 1687; también un análogo de la espira
Gly-Ala (Kahn et al., 1989, Tetrahedron
Lett. 30:2317); isóstero con enlace amida (Jones et al.,
1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856);
tetrazol (Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soc.
110:5875-5880); DTC (Samanen et al., 1990,
Int. J. Protein Pep. Res. 35:501:509); y análogos dados a
conocer en Olson et al., 1990, J. Am. Chem. Sci.
112:323-333 y Garvey et al., 1990, J.
Org. Chem. 56:436. Los miméticos dependientes de la
configuración de espiras beta y protuberancias beta y los péptidos
que los contienen, se describen en la patente US nº 5.440.013,
publicada el 8 de agosto de 1995 por Kahn.
Se describe además la modificación o derivación
del polipéptido o péptido. Las modificaciones de los péptidos son
bien conocidas por cualquier experto, e incluyen la fosforilación,
carboximetilación y acilación. Las modificaciones pueden efectuarse
por medios químicos o enzimáticos. En otro aspecto, pueden
prepararse derivados peptídicos glucosilados o acilados grasos. La
preparación de péptidos glucosilados o acilados grasos es bien
conocida en la técnica. También pueden prepararse derivados
peptídicos grasos de acilo. A título de ejemplo no limitativo,
puede acilarse un grupo amino libre (N-terminal o
lisil), p. ej., miristoilarse.
Un aminoácido que comprende una cadena lateral
alifática de estructura -(CH_{2})_{n}CH_{3} puede
incorporarse en el péptido. Este y otros conjugados de
péptido-ácido graso adecuados para su utilización se dan a conocer
en la patente británica
GB-8809162.4, solicitud de patente internacional
PCT/AU89/00166, y referencia 5, anteriormente.
Grupos químicos para derivación. Los
grupos químicos adecuados para la derivación pueden seleccionarse
de entre los polímeros solubles en agua. El polímero seleccionado
debería ser soluble en agua de modo que el componente al que se une
no precipite en un medio acuoso, tal como un medio fisiológico.
Preferentemente, para la utilización terapéutica de la preparación
del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable.
Un experto en la materia podrá seleccionar el polímero deseado
basándose en dichas consideraciones tales como si el conjugado
polímero/componente se utilizará terapéuticamente, y si es así, la
dosis deseada, tiempo de circulación, resistencia a la proteólisis
y otras consideraciones. Para el presente componente o componentes,
estas pueden determinarse utilizando los análisis proporcionados en
la presente memoria.
El polímero soluble en agua puede seleccionarse
de entre el grupo constituido, por ejemplo, por polietilenglicol,
copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o
copolímeros aleatorios) y dextrano o
poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol,
homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de
propileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol
polivinílico. El polietilenglicol propionaldehído puede presentar
ventajas en la preparación debido a su estabilidad en agua.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Para el
polietilenglicol, el peso molecular preferido está comprendido
entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término
"aproximadamente" indica que en las preparaciones de
polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que
el peso molecular indicado) para facilidad de manipulación y
preparación. Pueden utilizarse otros tamaños, dependiendo de las
propiedades terapéuticas deseadas (p. ej., la duración de la
liberación lenta deseada, los efectos, si existe actividad
biológica, la facilidad en la manipulación, el grado o falta de
antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol para
una proteína o análogo terapéuticos).
El número de moléculas de polímero acopladas de
esta manera pueden variar, y un experto en la materia podrá
determinar el efecto sobre la función. Se puede monoderivar, o se
puede proporcionar una o alguna combinación di-, tri-, o tetra- de
derivación, con el mismo o diferentes grupos químicos (p. ej.,
polímeros, tales como de diferentes pesos de polietilenglicoles).
La proporción de moléculas de polímero a moléculas de componente o
componentes variará, dependiendo de sus concentraciones en la mezcla
de reacción. En general, la proporción óptima (desde el punto de
vista de la eficacia de la reacción en la que no existe componente o
componentes sin reaccionar en exceso y polímero) se determinará por
los factores tales como el grado deseado de modificación (p. ej.,
mono, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado,
de si el polímero está ramificado o sin ramificar y de las
condiciones de reacción.
Las moléculas de polietilenglicol (u otros
grupos químicos) deberían estar unidos al componente o componentes
en consideración de los efectos sobre los dominios funcionales o
antigénicos de la proteína. Existen numerosos procedimientos de
acoplamiento disponibles para los expertos en la materia, p. ej., el
documento EP 0 401 384 (acoplamiento de PEG a
G-CSF), véase también Malik et al., 1992,
Exp. Hematol. 20:1028-1035 (que describe la
pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo).
Por ejemplo, el polietilenglicol puede estar unido por enlace
covalente por restos de aminoácido mediante un grupo reactivo, tal
como, un grupo amino o carboxilo libre. Grupos reactivos son
aquellos a los que puede unirse una molécula de polietilenglicol
activada. Los restos de aminoácido que tienen un grupo amino libre
incluyen los restos de lisina y los restos de aminoácido
terminales, aquellos que tienen un grupo carboxilo libre incluyen
los restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto
de aminoácido C-terminal. Asimismo pueden utilizarse
grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para acoplar la(s)
molécula(s) de polietilenglicol. Con fines terapéuticos se
prefiere el acoplamiento a un grupo amino, tal como el acoplamiento
al terminal N o al grupo lisina.
Según la presente invención pueden emplearse
técnicas de biología molecular, microbiología y de ADN recombinante
convencionales dentro de la experiencia en la técnica. Dichas
técnicas están explicadas completamente en la bibliografía. Véase,
por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual" (1989); "Current Protocols in Molecular
Biology" Volúmenes I-III [Ausubel, R. M., ed.
(1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handbook" Volúmenes
I-III [J. E. Celis, ed. (1994))]; "Current
Protocols in Immunology" Volúmenes I-III
[Coligan, J. E., ed. (1994)]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.
J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames y
S. J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.
D. Hames y S. J. Higgins eds. (1984)]; "Animal Cell Culture"
[R. I. Freshney, ed. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes"
[IRL Press, (1986)]; B. Perbal "A Practical Guide To Molecular
Cloning" (1984).
Pueden realizarse mutaciones en un ácido
nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención de
modo que se cambie un codón determinado por un codón que codifica un
aminoácido diferente. Dicha mutación se realiza generalmente
haciendo los menores cambios posibles de nucleótido. Una mutación de
sustitución de esta clase puede hacerse para cambiar un aminoácido
en la proteína resultante de manera no conservadora (es decir,
cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo de
aminoácidos con un determinado tamaño o características por un
aminoácido que pertenece a otro grupo) o de manera conservadora (es
decir, cambiando el codón de un aminoácido que pertenece a un grupo
de aminoácidos que tiene un tamaño o características determinados
por un aminoácido que pertenece al mismo grupo). Dicho cambio
conservador generalmente conduce a menos cambios en la estructura y
función de la proteína resultante. Un cambio no conservador es más
probable que altere la estructura, actividad o función de la
proteína resultante. La presente invención debería considerarse que
incluye secuencias que contienen cambios conservadores que no
alteran significativamente las características de actividad o unión
de la proteína resultante. Los sustitutos para un aminoácido en la
secuencia pueden seleccionarse de entre otros miembros de la clase
a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no
polares (hidrófobos) incluyen la alanina, leucina, isoleucina,
valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los
aminoácidos que contienen estructuras de anillo aromático son la
fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares
neutros incluyen la glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina,
asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva
(básicos) incluyen la arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos
con carga negativa (ácidos) incluyen el ácido aspártico y el ácido
glutámico. Dichas alteraciones no es de esperar que afecten al peso
molecular aparente determinado por electroforesis en gel de
poliacrilamida o al punto isoeléctrico.
Particularmente los ejemplos de sustituciones
son:
- Lys por Arg y viceversa de modo que pueda
mantenerse una carga positiva;
- Glu por Asp y viceversa de modo que pueda
mantenerse una carga negativa;
- Ser por Thr de modo que pueda mantenerse un
-OH libre; y
- Gln por Asn de modo que pueda mantenerse un
NH_{2} libre.
Las secuencias de ADN sintético permiten la
construcción conveniente de genes que expresarán análogos o
"muteínas". Un procedimiento general para la incorporación
específica para el sitio de aminoácidos no naturales en las
proteínas se describe en Noren, et al. Science,
244:182-188 (abril de 1989). Este
procedimiento puede utilizarse para crear análogos con aminoácidos
no naturales.
La presente invención proporciona un ácido
nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de un polipéptido Ema de estreptococos.
La presente invención proporciona un ácido
nucleico aislado que codifica un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de un polipéptido Ema de estreptococos del
Grupo B EmaA, que incluye variantes, alelos y fragmentos del
mismo.
El ácido nucleico es ADN, ADNc, ADN genómico o
ARN. Además, el ácido nucleico aislado puede estar ligado
operativamente a un activador de transcripción del ARN.
La presente invención se refiere también a
ácidos nucleicos aislados, tales como moléculas de ADN recombinantes
o genes clonados, o a variantes degeneradas de los mismos, alelos o
fragmentos de los mismos, que codifican el polipéptido aislado o
que inhiben competitivamente la actividad del polipéptido.
La secuencia del ADN de la molécula de ADN
recombinante o del gen clonado puede estar operativamente ligada a
una secuencia de control de expresión que puede ser introducida en
un huésped apropiado. La invención por consiguiente se extiende a
huéspedes unicelulares transformados con el gen clonado o la
molécula de ADN recombinante que comprenden una secuencia de ADN
que codifica una proteína Ema, EmaA.
Un "vector" es un replicón, tal como un
plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN
con el fin de efectuar la replicación del segmento acoplado.
Un "ADN" o "molécula de ADN" se
refiere a la forma polimérica de desoxirribonucleótidos (adenina,
guanina, timina o citosina) en su forma monocatenaria, o en una
hélice bicatenaria. Esta expresión se refiere solamente a la
estructura primaria y secundaria de la molécula, y no limita ninguna
forma terciaria concreta. Por lo tanto, esta expresión incluye el
ADN bicatenario, entre otros, en moléculas de ADN lineal (p. ej.,
fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al
tratar la estructura de determinadas moléculas de ADN bicatenario,
pueden describirse las secuencias en la presente memoria según el
convenio normal de dar solamente la secuencia en la dirección de 5'
a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la
cadena que tiene una secuencia homóloga con el ARNm).
"Origen de replicación" se refiere a las
secuencias de ADN que participan en la síntesis de ADN.
Una "secuencia de codificación" de ADN es
una secuencia de ADN bicatenario que está transcrita y se traduce
en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de
secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de
codificación están determinados por un codón de iniciación en el
terminal 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en
el terminal 3' (carboxilo). Una secuencia de codificación puede
incluir, pero no se limita, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm
eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (p. ej.,
mamífero) e incluso secuencias de ADN de síntesis. Una señal de
poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción
estará situada normalmente 3' de la secuencia de codificación en el
caso del ARNm eucariótico.
Las secuencias de control de la transcripción y
de la traducción son secuencias reguladoras de ADN tales como
activadores, potenciadores, señales de poliadenilación,
terminadores, y similares, que proporcionan la expresión de una
secuencia de codificación en una célula huésped.
Una "secuencia activadora" es una zona
reguladora de ADN capaz de unir la ARN polimerasa en una célula e
iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente
abajo (dirección 3'). Con el fin de definir la presente invención,
la secuencia activadora está unida en su terminal 3' por el punto de
iniciación de la transcripción y se prolonga corriente arriba
(dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos
necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por
encima del fondo. Dentro de la secuencia activadora se hallará un
punto de iniciación de la transcripción (convenientemente definido
por cartografía con nucleasa S1), así como dominios de unión de la
proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN
polimerasa. Los activadores eucarióticos con frecuencia, pero no
siempre, contendrán las secuencias "TATA" y las secuencias
"CAT". Los activadores procarióticos contienen secuencias de
Shine-Dalgarno además de las secuencias de consenso
10 y 35.
Una "secuencia de control de la expresión"
es una secuencia de ADN que controla y regula la transcripción y
traducción de otra secuencia de ADN. Otra secuencia de codificación
esta "bajo el control" de las secuencias de control de la
transcripción y de la traducción en una célula cuando la ARN
polimerasa transcribe la secuencia de codificación en el ARNm, que
se traduce a continuación en la proteína codificada por la secuencia
de codificación.
Una "secuencia señal" puede incluirse antes
de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido
señal, N-terminal en el polipéptido, que comunica a
la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie de la
célula o segregar el polipéptido en el medio, y este péptido señal
es sujetado por la célula huésped antes que la proteína abandone la
célula. Las secuencias señal pueden encontrarse asociadas con una
variedad de proteínas naturales a procariotas y eucariotas.
El término "oligonucleótido", tal como se
utiliza en la presente memoria para referirse a una sonda se define
como una molécula compuesta por dos o más ribonucleótidos,
preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos
factores que, a su vez, dependen de la función y utilización última
del oligonucleótido.
El término "cebador" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a un oligonucleótido, ya se produzca
de forma natural como en una digesta de restricción purificada o se
produce por síntesis, que es capaz de actuar como punto de
iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que
se produce la síntesis de un producto de extensión del cebador, que
es complementario con una cadena de ácido nucleico, es decir, en
presencia de nucleótidos y un agente de inducción tal como una ADN
polimerasa y a una temperatura y pH adecuados. El cebador puede ser
monocatenario o bicatenario y debe ser suficientemente largo para
cebar la síntesis del producto de extensión deseado en presencia
del agente inductor. La longitud exacta del cebador dependerá de
muchos factores, incluyendo la temperatura, procedencia del cebador
y utilización del procedimiento. Por ejemplo, para aplicaciones de
diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el
cebador del oligonucleótido contiene típicamente de 15 a 25 o más
nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos.
Los cebadores en la presente memoria se
seleccionan para que sean "sustancialmente" complementarios con
diferentes cadenas de una secuencia de ADN diana determinada. Esto
significa que los cebadores deben ser suficientemente
complementarios para hibridarse con sus cadenas respectivas. Por
consiguiente, la secuencia de cebador no necesita reflejar la
secuencia exacta de la plantilla. Por ejemplo, un fragmento de
nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5' del
cebador, siendo el resto de la secuencia de cebador complementario
con la cadena. Alternativamente, pueden intercalarse bases no
complementarias o secuencias más largas en el cebador, con la
condición de que la secuencia de cebador tenga suficiente
complementariedad con la secuencia de la cadena para hibridarse con
ella y de este modo formar la plantilla para la síntesis del
producto de la ampliación.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
expresiones "endonucleasas de restricción" y "enzimas de
restricción" se refieren a enzimas bacterianas, cada una de las
cuales corta el ADN bicatenario en una secuencia nucleotídica
específica o cerca de la misma.
Una célula ha sido "transformada" por ADN
exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido en la
célula. El ADN transformante puede o no estar integrado (unido por
enlace covalente) en el ADN cromosómico construyendo el genoma de
la célula. En los procariotas, levaduras y células de mamífero, por
ejemplo, el ADN transformante puede mantenerse en un elemento
episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células
eucarióticas, una célula transformada estable es aquella en la que
el ADN transformante se ha integrado en un cromosoma de modo que es
heredado por las células hijas a través de la replicación
cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la
célula eucariótica para crear estirpes celulares o clones compuestos
de una población de células hijas que contienen el ADN
transformante. Un "clon" es una población de células
procedentes de una sola célula o antecesor común por mitosis. Una
"estirpe celular" es un clon de una célula primaria que es
capaz de crecimiento estable in vitro durante muchas
generaciones.
Dos secuencias de ADN son "sustancialmente
homólogas" cuando por lo menos aproximadamente el 75%
(preferentemente por lo menos aproximadamente el 80%, y aún más
preferentemente por lo menos aproximadamente el 90 o el 95%) de los
nucleótidos son iguales en toda la longitud definida de las
secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homólogas
pueden identificarse comparando las secuencias que utilizan un
programa informático típico disponible en los bancos de datos de
secuencia, o en el experimento de hibridación de Southern en
condiciones, por ejemplo, severas definidas para este sistema
concreto. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está
dentro de la experiencia en la materia. Véase, por ejemplo, Maniatis
et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II,
supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
Una secuencia de ADN está "operativamente
ligada" a una secuencia de control de expresión cuando la
secuencia de control de expresión controla y regula la
transcripción y traducción de esta secuencia de ADN. La expresión
"operativamente ligada" incluye las que tienen una señal de
partida apropiada (p. ej., ATG) frente a la secuencia de ADN que se
ha de expresar y que mantienen el marco de lectura correcto para
permitir la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la
secuencia de control de expresión y la producción del producto
deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea
insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal
de partida apropiada, dicha señal de partida puede insertarse
enfrente del gen.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La expresión "condiciones normales de
hibridación" se refiere a las condiciones salinas y de
temperatura sustancialmente equivalentes a 5 \times SSC y 65ºC
tanto para la hibridación como para el lavado. Sin embargo, un
experto en la materia apreciará que dichas "condiciones normales
de hibridación" dependen de condiciones específicas incluyendo
la concentración de sodio y magnesio en el tampón, la longitud y
concentración de la secuencia nucleotídica, del porcentaje de
incompatibilidad, del porcentaje de formamida y similares. Es
también importante en la determinación de las "condiciones
normales de hibridación" si las dos secuencias que se hibridan
son ARN-ARN, ADN-ADN o
ARN-ADN. Tales condiciones normales de hibridación
son determinadas fácilmente por un experto en la materia según las
fórmulas bien conocidas, en las que la hibridación está comprendida
típicamente de 10 a 20ºC por debajo de la T_{m} prevista o
determinada con lavados de mayor severidad, si se desea.
"Degeneran en" significa que un codón de
tres letras diferentes se utiliza para especificar un aminoácido
concreto. Es bien sabido en la técnica que pueden utilizarse los
codones siguientes indistintamente para codificar cada aminoácido
específico:
Se entiende que los codones especificados
anteriormente son para las secuencias del ARN. Los codones
correspondientes para el ADN tienen la U sustituida por T.
Pueden realizarse mutaciones en la SEC. ID. nº:
1, de modo que un codón específico se cambie por un codón que
codifica un aminoácido diferente. Dicha mutación se realiza
generalmente haciendo los menores cambios posibles de nucleótido.
Una mutación de sustitución de esta clase puede realizarse para
cambiar un aminoácido en la proteína resultante de manera no
conservadora (es decir, cambiando el codón de un aminoácido que
pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un tamaño o
característica específicos para un aminoácido que pertenece a otro
grupo) o de manera no conservadora (es decir, cambiando el codón de
un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tiene un
tamaño o característica específicos para un aminoácido que pertenece
al mismo grupo). Dicho cambio conservador conduce generalmente a
menos cambio en la estructura y función de la proteína resultante.
Un cambio no conservador es más probable que altere la estructura,
actividad o función de la proteína resultante. La presente
invención debe considerarse que incluye secuencias que contienen
cambios conservadores que no alteran significativamente la
actividad o características de unión de la proteína resultante.
Dos secuencias de aminoácidos son
"sustancialmente homólogas" cuando por lo menos aproximadamente
el 70% de los restos de aminoácidos (preferentemente por lo menos
aproximadamente el 80%, y aún más preferentemente por lo menos
aproximadamente el 90 ó 95%) son idénticos o representan
sustituciones conservadoras.
Una zona "heteróloga" del montaje de ADN es
un segmento identificable de ADN en una molécula de ADN mayor que
no se encuentra en asociación con la molécula mayor en la
naturaleza. De este modo, cuando la zona heteróloga codifica un gen
de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por el ADN que no
flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo
original. Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga
es un montaje en el que la propia secuencia de codificación no se
encuentra en la naturaleza (p. ej., un ADNc en el que la secuencia
de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas
que tienen codones diferentes del gen natural). Las variaciones
alélicas o los episodios de mutaciones naturales no dan lugar a una
zona heteróloga de ADN como se define en la presente memoria.
Una secuencia de ADN está "operativamente
ligada" a una secuencia de control de la expresión cuando la
secuencia de control de expresión controla y regula la
transcripción y traducción de esta secuencia de ADN. La expresión
"operativamente ligada" incluye la que tiene una señal de
iniciación apropiada (p. ej., ATG) enfrente de la secuencia de ADN
que debe expresarse y que mantiene el marco de lectura correcto que
permite la expresión de la secuencia de ADN bajo el control de la
secuencia de control de la expresión y la producción del producto
deseado codificado por la secuencia de ADN. Si un gen que se desea
insertar en una molécula de ADN recombinante no contiene una señal
de iniciación apropiada, dicha señal de iniciación puede insertarse
enfrente del gen.
Además la presente invención también proporciona
un vector que comprende la molécula de ácido nucleico descrita
anteriormente. El activador puede ser, o es idéntico a un activador
bacteriano, de levadura, de insecto o de mamífero. Además, el
vector puede ser un plásmido, cósmido, cromosoma artificial de
levadura (YAC), ADN vírico de bacteriófago o eucariótico. Pueden
emplearse otros numerosos ejes centrales de vector conocidos en la
materia como útiles para expresar proteínas. Dichos vectores
incluyen, adenovirus, virus 40 de simio (SV40), citomegalovirus
(CMV), virus del tumor de mama de ratón (MMTV), virus de leucemia
murina de Moloney, sistemas de administración de ADN, es decir
liposomas, y sistemas de administración de plásmido de expresión.
Dichos vectores pueden adquirirse en el comercio o montarse a partir
de las secuencias descritas por procedimientos bien conocidos en la
técnica.
La presente invención también proporciona un
sistema vector huésped para la producción de un polipéptido que
comprende el vector de una célula huésped adecuada. Una amplia
variedad de células huésped unicelulares son también útiles para
expresar las secuencias de ADN de la presente invención. Estos
huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos
bien conocidos tales como las cepas de E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como
levaduras, y células de animal, tales como las células CHO, R1.1,
B-W y L-M, células de riñón de mono
verde africano (p. ej., COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40 y BMT10), células
de insecto (p. ej., Sf9) y células humanas y células vegetales en
cultivo tisular.
Puede emplearse una amplia variedad de
combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las
secuencias de ADN de la presente invención. Los vectores de
expresión útiles, por ejemplo, pueden estar constituidos por
segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y
sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y
plásmidos bacterianos conocidos, p. ej., plásmidos de E. coli
col E1, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tal como RP4;
los ADN de fago, p. ej., los numerosos derivados del fago \lambda,
M13 y ADN del fago monocatenario filamentoso; plásmidos de
levaduras tal como el plásmido 2 \mu o derivados del mismo;
vectores útiles en células eucarióticas tales como los vectores
útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de
combinaciones de plásmidos y los ADN del fago, tales como los
plásmidos que han sido modificados para emplear el ADN del fago u
otras secuencias de control de expresión, y similares.
Cualquiera de entre una amplia variedad de
secuencias de control de expresión (secuencias que controlan la
expresión de una secuencia de ADN operativamente unida a éste)
pueden utilizarse en estos vectores para expresar las secuencias de
ADN de la presente invención. Dichas secuencias de control de la
expresión útiles incluyen, por ejemplo, los activadores precoz o
tardío de SV40, CMV, vacunas, poliomas o adenovirus, el sistema
lac, el sistema trp, el sistema TAC, el
sistema TRC, el sistema LTR, el operador principal y
las zonas activadoras del fago \lambda, las zonas de control de
la proteína de la cubierta fd, el activador de
3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas
glucolíticas, los activadores de la fosfatasa ácida (p. ej., Pho5),
los activadores de los factores de apareamiento \alpha de la
levadura, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión
de los genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y
varias combinaciones de los mismos.
Se entiende que no todos los vectores,
secuencias de control de expresión y huéspedes funcionarán
igualmente bien para expresar las secuencias de ADN de la presente
invención. Ni todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con
el mismo sistema de expresión. Sin embargo, un experto en la materia
podrá seleccionar los vectores, secuencias de control de expresión
y huéspedes apropiados sin excesiva experimentación para llevar a
cabo la expresión deseada sin apartarse del alcance de la presente
invención. Por ejemplo, al seleccionar un vector, debe considerarse
el huésped porque el vector debe funcionar en éste. El número de
copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias
y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector,
tal como marcadores de antibióticos, también se considerarán.
Al seleccionar una secuencia de control de
expresión, se considerará normalmente una variedad de factores.
Éstos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa del sistema, su
controlabilidad y su compatibilidad con la secuencia de ADN
específica o el gen que debe expresarse, particularmente con
respecto a las estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes
unicelulares adecuados se seleccionarán por consideración de p. ej.,
su compatibilidad con el vector seleccionado, sus características
de secreción, su capacidad para plegar correctamente proteínas y
sus requisitos de fermentación, así como la toxicidad para el
huésped del producto codificado por las secuencias de ADN que deben
expresarse y la facilidad de purificación de los productos de
expresión.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se describe también un procedimiento de
producción de un polipéptido que comprende cultivar el sistema de
vector huésped descrito anteriormente en condiciones adecuadas que
permitan la producción del polipéptido y la recuperación del
polipéptido producido de este modo.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"pg" significa picogramo, "ng" significa nanogramo,
"ug" o "\mug" significan microgramo, "mg"
significa miligramo, "ul" o "\mul" significa microlitro,
"ml" significa mililitro y "l" significa litro.
Se describe además la preparación de
oligonucleótidos complementarios y ribozimas que pueden utilizarse
para interferir con la expresión de una o más proteínas Ema a nivel
de traducción. Este procedimiento utiliza ácido nucleico
complementario y ribozimas para bloquear la traducción de un ARNm
específico, ya sea enmascarando este ARNm con un ácido nucleico
complementario o escindiéndolo con una ribozima.
Los ácidos nucleicos complementarios son
moléculas de ADN o ARN que son complementarias con por lo menos una
parte de una molécula de ARNm específica. (Véase Weintraub, 1990;
Marcus-Sekura, 1988). En la célula, se hibridan al
ARNm, formando una molécula de doble cadena. La célula no traduce un
ARNm en esta forma de doble cadena. Por consiguiente, los ácidos
nucleicos complementarios interfieren con la expresión de ARNm en la
proteína. Los oligómeros de aproximadamente quince nucleótidos y
moléculas que se hibridan con el codón de iniciación AUG serán
particularmente eficaces, ya que son fáciles de sintetizar y
probablemente plantean menos problemas que las moléculas mayores
cuando las introducen en las células productoras de Ema. Se han
utilizado procedimientos complementarios para inhibir la expresión
de muchos genes in vitro (Marcus-Sekura,
1988; Hambor et al., 1988).
Las ribozimas son moléculas de ARN que poseen la
capacidad de escindir específicamente otras moléculas de ARN de una
sola cadena de manera algo análoga a las endonucleasas de
restricción del ADN. Las ribozimas se descubrieron a partir de la
observación de que determinados ARNm tienen la capacidad de escindir
sus propios intrones. Modificando la secuencia de nucleótidos de
estos ARN, los investigadores han sido capaces de modificar
moléculas que reconocen secuencias nucleotídicas específicas en una
molécula de ARN y escindirla (Cech, 1988). Debido a que son
específicos para la secuencia, solamente se inactivan los ARNm con
secuencias específicas.
Los investigadores han identificado dos tipos de
ribozimas, el tipo Tetrahymena y el tipo "cabeza de
martillo". (Hasselhoff y Gerlach, 1988). Las ribozimas de tipo
Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases, mientras
que las de tipo "cabeza de martillo" reconocen secuencias de
once a dieciocho bases. Cuanto mayor sea la secuencia de
reconocimiento más probablemente ocurrirá exclusivamente en las
especies de ARNm diana. Por consiguiente, las ribozimas de tipo
cabeza de martillo son preferibles a las ribozimas de tipo
Tetrahymena para inactivar una especie de ARNm específico, y
las secuencias de reconocimiento de dieciocho bases son preferibles
a las secuencias de reconocimiento más cortas.
La presente invención proporciona además un
anticuerpo capaz de reconocer o unir específicamente al polipéptido
Ema aislado de la presente invención. El anticuerpo puede ser un
anticuerpo monoclonal o policlonal. Además, el anticuerpo puede
estar marcado con un marcador detectable que es un marcador
radioactivo, calorimétrico, fluorescente o luminiscente. El
anticuerpo marcado puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.
En una forma de realización, el anticuerpo marcado es un anticuerpo
marcado purificado. Los procedimientos de marcado de anticuerpos
son bien conocidos en la técnica.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un anticuerpo purificado contra un polipéptido Ema
bacteriano, particularmente un polipéptido EmaA estreptocócico.
Los anticuerpos contra los polipéptidos aislados
de la presente invención incluyen anticuerpos surgidos de manera
natural y preparados de manera recombinante. Éstos pueden incluir
tanto los anticuerpos policlonales como monoclonales preparados por
técnicas genéticas conocidas, así como anticuerpos biespecíficos
(híbridos) y anticuerpos que incluyen otras funcionalidades que les
aconsejan para su utilización en diagnóstico. Dichos anticuerpos
pueden utilizarse en inmunoanálisis para diagnosticar infección con
una cepa específica o especies de bacterias. Los anticuerpos pueden
también utilizarse para la inmunización pasiva para tratar una
infección por bacterias de estreptococos del Grupo B. Estos
anticuerpos pueden también ser adecuados para modular la adherencia
y/o invasión bacterianas incluyendo la actuación como agentes
competitivos.
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal contra un polipéptido EmaA de estreptococos del Grupo
B.
Se proporciona además un anticuerpo contra un
polipéptido Ema, EmaA, marcado con un marcador detectable. El
marcador puede seleccionarse de entre el grupo constituido por un
enzima, un producto químico que emite fluorescencia y un elemento
radioactivo.
El término "anticuerpo" incluye, a título
de ejemplo, tanto los anticuerpos naturales como los no naturales.
Específicamente, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos
policlonales y monoclonales y fragmentos de los mismos. Además, el
término "anticuerpo" incluye los anticuerpos híbridos y los
anticuerpos sintéticos completos, y fragmentos de los mismos. Tales
anticuerpos incluyen los policlonales, monoclonales, híbridos, de
una sola cadena, los fragmentos Fab y un banco de expresión de
Fab.
Un "anticuerpo" es cualquier
inmunoglobulina, incluyendo los anticuerpos y fragmentos de los
mismos, que se unen a un epítopo específico. El término comprende
anticuerpos policlonales, monoclonales e híbridos, los últimos
mencionados descritos con mayor detalle en las patentes US nº
4.816.397 y nº 4.816.567.
Una "zona de combinación de anticuerpo" es
la parte estructural de una molécula de anticuerpo compuesta por
una cadena pesada y ligera variable y zonas hipervariables que se
unen específicamente al antígeno.
La frase "molécula de anticuerpo" en sus
varias formas gramaticales utilizadas en la presente memoria
contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta como una
parte inmunológicamente activa de una molécula de
inmunoglobulina.
Las moléculas de anticuerpo a título de ejemplo
son moléculas de inmunoglobulina intactas, las moléculas de
inmunoglobulina sustancialmente intactas y las fracciones de una
molécula de inmunoglobulina que contiene el parátopo, incluyendo
las fracciones conocidas en la técnica como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v), cuyas fracciones se prefieren
para su utilización en los procedimientos terapéuticos descritos en
la presente memoria.
Las fracciones Fab y F(ab')_{2} de
moléculas de anticuerpo se preparan mediante la reacción
proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de
anticuerpo sustancialmente intactas por procedimientos que son bien
conocidos. Véase, por ejemplo, la patente US nº 4.342.566 de
Theofilopoulos et al. Las fracciones Fab' de la molécula de
anticuerpo son también bien conocidas y se producen a partir de
fracciones F(ab')_{2} seguido de reducción de los enlaces
disulfuros que unen las dos fracciones de cadena pesada como con
mercaptoetanol, y seguido de alquilación del mercaptano de la
proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. En la
presente memoria se prefiere un anticuerpo que contenga moléculas de
anticuerpo intactas.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus
varias formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene
solamente una especie de zona de combinación del anticuerpo capaz
de inmunorreaccionar con un antígeno específico. Un anticuerpo
monoclonal por lo tanto presenta típicamente una sola afinidad de
unión para cualquier anticuerpo con el que inmunorreaccione. Un
anticuerpo monoclonal puede contener por lo tanto una molécula de
anticuerpo que tenga varias zonas de combinación del anticuerpo,
cada una inmunoespecífica para un antígeno diferente; p. ej., un
anticuerpo monoclonal (híbrido) biespecífico.
Varios procedimientos conocidos en la técnica
pueden utilizarse para la producción de anticuerpos policlonales
contra el polipéptido o derivados o análogos del mismo (véase, p.
ej., Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, Nueva York,
1988). Para la producción del anticuerpo, pueden inmunizarse varios
animales huéspedes por inyección con el polipéptido Ema de
estreptococos del Grupo B, un fragmento de inmunógeno del mismo, o
un derivado (p. ej., fragmento o proteína de fusión) del mismo,
incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, ovejas,
cabras, etc. El polipéptido puede estar conjugado con un portador
inmunógeno, p. ej., albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de
lapa californiana (KLH). Pueden utilizarse varios adyuvantes para
aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del
huésped.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales,
o fragmento, análogo o derivado del mismo, puede utilizarse
cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de
anticuerpo por estirpes celulares continuas en el cultivo (véase,
p. ej., Antibodies - A Laboratory Manual, Harlow y Lane,
eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor,
Nueva York, 1988). Éstas incluyen pero no se limitan a la técnica de
hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975,
Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma,
la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et
al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de
EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales
humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and
Cancer Theraphy, Alan R. Liss, Inc., págs.
77-96). Los anticuerpos monoclonales pueden
producirse en animales exentos de gérmenes que utilizan tecnología
reciente (PCT/US90/02545). Los anticuerpos humanos pueden
utilizarse y pueden obtenerse utilizando hibridomas humanos (Cote
et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:2026-2030) o transformando linfocitos B humanos
con virus EBV in vitro (Cole et al., 1985, en
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, págs.
77-96). De hecho, pueden utilizarse las técnicas
desarrolladas para la producción de "anticuerpos híbridos"
(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol.
159-870; Neuberger et al., 1984,
Nature 312:604-608; Takeda et al.,
1985, Nature 314:452-454) cortando y
empalmando los genes de una molécula de anticuerpo de ratón
específica para un polipéptido junto con los genes de una molécula
de anticuerpo humana de actividad biológica apropiada. Dichos
anticuerpos híbridos humanos o humanizados se prefieren para su
utilización en la terapia de infecciones o enfermedades humanas, ya
que los anticuerpos humanos o humanizados tienen menos
probabilidades que los anticuerpos xenogénicos para provocar una
respuesta inmunitaria, en particular una respuesta alérgica, ellos
mismos. Se utilizan las técnicas descritas para la construcción de
bancos de expresión de Fab (Huse et al., 1989 Science
246:1275-1281) para permitir la identificación
rápida y fácil de fragmentos de Fab monoclonales con la
especificidad deseada para el polipéptido, o sus derivados, o
análogos.
Los fragmentos de anticuerpo que contienen el
idiotipo de la molécula de anticuerpo pueden generarse por técnicas
conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no se
limitan a: el fragmento F(ab')_{2} que puede producirse
por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los
fragmentos Fab' que pueden generarse produciendo los puentes
disulfuro del fragmento F(ab')_{2} y los fragmentos Fab que
pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y
un agente reductor.
En la producción de anticuerpos, la
identificación del anticuerpo deseado puede realizarse por técnicas
conocidas en la materia, p. ej.,radioinmunoanálisis, ELISA (ensayo
inmunosorbente con enzima ligada), inmunoanálisis en
"sándwich", análisis inmunorradiométrico, reacciones de
precipitina con difusión en gel, análisis de inmunodifusión,
inmunoanálisis in situ (utilizando oro coloidal, enzima o
marcadores de radioisótopo, por ejemplo), transferencias Western,
reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (p. ej.,
ensayos de aglutinación en gel, ensayos de hemoaglutinación),
ensayos de fijación del complemento, ensayos de inmunofluorescencia,
ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.
La unión del anticuerpo se detecta por detección
de un marcador en el anticuerpo primario. En otro procedimiento, el
anticuerpo primario se detecta por detección de la unión de un
anticuerpo secundario o reactivo con el anticuerpo primario. En un
procedimiento adicional, se marca el anticuerpo secundario. Se
conocen muchos medios en la técnica para detectar la unión en un
inmunoanálisis.
Los anticuerpos pueden marcarse para la
detección in vitro, p. ej., con marcadores tales como
enzimas, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, colorantes, oro
coloidal, partículas de látex y agentes quimioluminiscentes.
Alternativamente, los anticuerpos pueden marcarse para la detección
in vivo, p. ej., con radioisótopos (preferentemente tecnecio
o yodo); reactivos de desplazamiento de resonancia magnética (tales
como gadolinio y manganeso); o reactivos opacos al radio.
Los marcadores empleados más frecuentemente para
estos estudios son los elementos radioactivos, enzimas, productos
químicos que emiten fluorescencia cuando se exponen a la luz
ultravioleta y otros. Se conocen numerosos materiales fluorescentes
y pueden utilizarse como marcadores. Éstos incluyen, por ejemplo,
fluoresceína, rodamina, auramina, rojo de Texas, azul AMCA y
amarillo Lucifer. Un material de detección específico es un
anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y
conjugado con fluoresceína mediante un isotiocianato. El polipéptido
puede también marcarse con un elemento radioactivo o con una
enzima. El marcador radioactivo puede ser detectado por cualquiera
de los procedimientos de recuento disponibles actualmente. El
isótopo preferido puede seleccionarse de entre ^{3}H, ^{14}C,
^{32}P, ^{35}S, ^{36}Cl, ^{51}Cr, ^{57}Co, ^{58}Co,
^{59}Fe, ^{90}Y, ^{125}I, ^{131}I y ^{186}Re.
Los marcadores enzimáticos son asimismo útiles,
y pueden detectarse por cualquiera de las técnicas calorimétrica,
espectrofotométrica, fluoroespectrofotométrica, amperométrica o
gasométrica actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la
partícula seleccionada por reacción con moléculas enlazadoras tales
como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído y similares.
Muchas enzimas que pueden utilizarse en estos procedimientos son
conocidas y pueden utilizarse. Las preferidas son peroxidasa,
\beta-glucuronidasa,
\beta-D-glucuronidasa,
\beta-D-glucosidasa,
\beta-D-galactosidasa, ureasa,
glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes
US nº 3.654.090; nº 3.850.752 y nº 4.016.043 son mencionadas a
título de ejemplo para su exposición del material y procedimientos
de marcado alternativos.
La presente invención se refiere asimismo a las
aplicaciones para diagnóstico, incluyendo los procedimientos para
la identificación de infecciones por estreptococos.
Como se describió con detalle anteriormente,
puede(n) producirse el/los anticuerpo(s) contra los
polipéptidos Ema o fragmentos de los mismos y aislarse por
procedimientos normalizados incluyendo las técnicas de hibridoma
bien conocidas. Por conveniencia, el/los anticuerpo(s) contra
los polipéptidos Ema se denominará(n) en la presente memoria
Ab_{1} y anticuerpo(s) surgidos en otras especies como
Ab_{2}.
La presencia de estreptococos en células puede
determinarse por los procedimientos inmunológicos habituales
aplicables a dichas determinaciones. Se conocen numerosos
procedimientos útiles. Los procedimientos que son especialmente
útiles utilizan los polipéptidos Ema marcados con un marcador
detectable, anticuerpo contra los polipéptidos Ema marcados con un
marcador detectable o anticuerpo secundario marcado con un marcador
detectable.
Los procedimientos y su aplicación son en su
totalidad conocidos por los expertos en la materia. El procedimiento
"competitivo", se describe en las patentes US nº 3.654.090 y
nº 3.850.752. El procedimiento en "sándwich", se describe en
las patentes US nº RE 31.006 y nº 4.016.043. Incluso se conocen
otros procedimientos tales como los procedimientos de "doble
anticuerpo" o "DASP".
En cada caso, los polipéptidos Ema forman
complejos con uno o más anticuerpo(s) o acompañantes de unión
y un elemento del complejo está marcado con un marcador detectable.
El hecho de que se haya formado un complejo y, si se desea, la
cantidad del mismo, puede determinarse por procedimientos conocidos
aplicables a la detección de marcadores.
Los kits de ensayo comerciales adecuados para su
utilización por un médico especialista pueden prepararse para
determinar la presencia o ausencia de estreptococos, particularmente
del polipéptido EmaA que expresa estreptococos.
En la misma medida que el locus ema, como
se describe en la presente memoria, se encuentra en el ADN genómico
de muchos, si no en todos, los serotipos de los estreptococos del
Grupo B, es un marcador general útil para estreptococos del Grupo
B. En la medida que los homólogos de Ema existen en otra especie de
estreptococos, incluyendoel grupo A y S. pneumoniae, es un
marcador general útil para estreptococos. Por consiguiente, pueden
producirse los kits de ensayo comerciales para determinar la
presencia o ausencia de estreptococos, y por esta razón determinar
si un individuo está infectado con estreptococos.
Asimismo se describe un sistema analítico para
la identificación de potenciales compuestos eficaces para modular
la actividad de una proteína Ema bacteriana de la presente
invención. En un caso, el compuesto de ensayo, o un extracto que
contiene el compuesto, podría administrarse a una muestra celular
que exprese la proteína Ema específica para determinar el efecto
del compuesto sobre la actividad de la proteína por comparación con
una referencia. En un caso adicional, el compuesto de ensayo, o un
extracto que contiene el compuesto, podría administrarse a una
muestra celular que exprese la proteína Ema para determinar el
efecto del compuesto sobre la actividad de la proteína, y por esta
razón sobre la adherencia de dicha muestra celular a las células
huésped, en comparación con una referencia.
Puede prepararse un sistema analítico para
identificar potenciales fármacos eficaces para modular la actividad
del polipéptido Ema. El polipéptido Ema puede introducirse en un
sistema de ensayo, y el fármaco en estudio puede introducirse
también en el cultivo celular resultante, y el cultivo ser examinado
después para observar cualquier cambio en la actividad del
polipéptido Ema de las células, debida a la adición del fármaco en
estudio solo, o debida al efecto de cantidades añadidas del
polipéptido Ema conocido.
Las posibilidades terapéuticas que surgen por la
existencia de los polipéptidos Ema de estreptococos del Grupo B
EmaA, EmaB, EmaC, EmaD y EmaE proceden del hecho de que los
polipéptidos Ema se encuentran generalmente en varios serotipos de
estreptococos del Grupo B. Además, las amplias posibilidades
terapéuticas que surgen por la existencia de polipéptidos homólogos
de Ema en varias especies de estreptococos distintas, incluyendo
S. pneumoniae y S. pyogenes. Además los polipéptidos
homólogos Ema han sido identificados en E. faecalis y C.
diptheriae. De particular relevancia a su idoneidad en la
terapia de vacunas e inmunológica es que los polipéptidos EmaA,
EmaB y EmaC poseen secuencias N-terminales
coherentes con un péptido señal, lo que indica la secreción de la
célula bacteriana y por lo menos la localización extracelular
parcial. Además, los polipéptidos EmaA, EmaB, EmaC, EmaD y EmaE
demuestran homología con distintas proteínas bacterianas
involucradas o implicadas en la adherencia e invasión bacterianas.
Por lo tanto, se prevé que los polipéptidos Ema están implicados en
la adherencia a estreptococos o requeridos por la misma y/o en la
invasión de células, crítica para la supervivencia bacteriana y la
virulencia en el huésped humano.
Por lo tanto, en los casos en los que se desee
reducir o inhibir los efectos resultantes de la proteína Ema
adhesina de la matriz extracelular de la presente invención, podría
introducirse un inhibidor apropiado de EmaA para bloquear su
actividad.
En la presente memoria se describen tamices para
un modulador de un polipéptido Ema, en particular que modula la
adherencia o invasión facilitadas por EmaA.
En dicho ejemplo, un vector de expresión que
contiene el polipéptido Ema de la presente invención, o un derivado
o análogo del mismo, se coloca en una célula en presencia de por lo
menos un agente que se supone que presenta actividad del modulador
del polipéptido Ema. La célula es preferentemente una célula
bacteriana, aun más preferentemente una célula de estreptococo o
una célula huésped bacteriana. La cantidad de actividad de
adherencia o de unión se determina y se identifica cualquiera de
dichos agentes como modulador cuando la cantidad de actividad de
adherencia o de unión en presencia de dicho agente es diferente que
en su ausencia. Los vectores pueden introducirse por cualquiera de
los procedimientos descritos anteriormente. En un ejemplo citado, el
polipéptido Ema de GBS se expresa en estreptococos y la etapa de
determinación de la cantidad de actividad de adherencia o de unión
se lleva a cabo determinando la cantidad de unión a células huésped
bacterianas in vitro.
Cuando la cantidad de actividad de adherencia o
de unión en presencia del modulador es mayor que en su ausencia, el
modulador se identifica como agonista o activador del polipéptido
Ema, mientras que cuando la cantidad de actividad de unión por
adherencia en presencia del modulador es menor que en su ausencia,
el modulador se identifica como agonista o inhibidor del
polipéptido Ema. Como reconocería cualquier experto en la materia,
determinaciones tales como éstas y las siguientes podrían requerir
alguna forma de análisis estadístico, que está comprendida dentro
de la experiencia en la materia.
Los efectores naturales descubiertos en las
células que expresan el polipéptido Ema pueden fraccionarse y
analizarse utilizando análisis de efector estándar como se
ejemplifica por ejemplo en la presente memoria. De este modo un
agente que se identifica puede ser un modulador de adherencia o de
unión natural. Alternativamente, los bancos de productos naturales
pueden cribarse utilizando los ensayos descritos en la presente
memoria para el cribado de dichos agentes.
Otro método utiliza bacteriófago recombinante
para producir grandes bancos. Utilizando el "procedimiento del
fago" [Scout y Smith, 1990, Science
249:386-390 (1990); Cwirla, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382 (1990); Devlin
et al., Science, 249:404-406 (1990)],
pueden construirse bancos muy grandes (10^{6} a 10^{8}
entidades químicas). Incluso otro procedimiento utiliza
principalmente procedimientos químicos, de los cuales el
procedimiento de Geysen [Geysen et al., Molecular
Immunology 23:709-715 (1986); Geysen et
al. J. Immunologic Method 102:259-274
(1987)] y el procedimiento de Fodor et al. [Science
251:767-773 (1991)] son ejemplos. Furka et
al. [14th Internacional Congress of Biochemistry,
volumen 5, resumen FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein
Res. 37:487-493 (1991)], Houghton [patente US
nº 4.631.211, publicada en diciembre 1986] y Rutter et al.
[patente US nº 5.010.175, publicada el 23 de abril de 1991]
describen procedimientos para producir una mezcla de péptidos que
pueden analizarse.
En otro ejemplo, bancos sintéticos [Needels
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:10700-4 (1993); Ohlmeyer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993); Lam
et al., publicación de patente internacional nº WO 92/00252;
Kocis et al., publicación de patente internacional nº WO
9428028, y similares pueden utilizarse para cribar dicho
agente.
Se describen también antagonistas o agentes de
bloqueo que incluyen fragmentos de péptidos, miméticos, una
molécula de ácido nucleico, un ribozima, un polipéptido, una
molécula pequeña, una molécula de carbohidrato, un monosacárido, un
oligosacárido o un anticuerpo. Asimismo, se describen los agentes
que bloquean o inhiben de manera competitiva la bacteria
estreptocócica. Se describe un agente que comprende un compuesto
inorgánico, una molécula de ácido nucleico, un oligonucleótido, un
compuesto orgánico, un péptido, un compuesto peptidomimético o una
proteína que inhibe el polipéptido.
En otro aspecto, la presente invención comprende
las vacunas basadas en las proteínas Ema descritas en la presente
memoria.
La inmunidad activa contra estreptococos puede
provocarse por inmunización (vacunación) con una cantidad inmunógena
del polipéptido, o derivado del péptido o fragmento del mismo, y un
adyuvante, en el que el polipéptido, o el derivado antigénico o
fragmento del mismo, es el componente antigénico de la vacuna. El
polipéptido, o derivado antigénico o fragmento del mismo, puede ser
un componente antigénico, en presencia de otros componentes
antigénicos en una vacuna. Por ejemplo, el polipéptido de la
presente invención puede combinarse con otros polipéptidos o
poli/oligosacáridos estreptocócicos, o fragmentos inmunógenos de los
mismos, incluyendo por ejemplo el polisacárido capsular de GBS,
Spb1, Spb2, antígeno alfa de la proteína C, Rib, Lmb y
C5a-asa en una vacuna multicomponente. Dicha vacuna
multicomponente puede utilizarse para potenciar la respuesta
inmunitaria, aun en los casos en los que el polipéptido de la
presente invención provoca una respuesta sobre sí mismo. El
polipéptido de la presente invención puede también combinarse con
las vacunas existentes, vacunas bacterianas completas o a base de
cápsula, solas o en combinación con otros polipéptidos de GBS,
particularmente Spb1 y/o Spb2 y/o antígeno alfa de la proteína C
y/o Rib para potenciar dichas vacunas existentes.
El término "adyuvante" se refiere a un
compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmunitaria contra un
antígeno. Un adyuvante puede servir como medicamento de liberación
retardada en el tejido que libera lentamente el antígeno y también
como activador del sistema linfoide que potencia de manera no
específica la respuesta inmunitaria (Hood et al.,
Immunology, segunda ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park,
California, pág. 384). Con frecuencia, una prueba de provocación
primaria con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, no
podrá provocar una respuesta inmunitaria humoral o celular. Los
adyuvantes incluyen, adyuvante completo de Freund, adyuvante
incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido
de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, aceite o emulsiones de
hidrocarburos, hemocianina de la lapa californiana, dinitrofenol y
adyuvante humano potencialmente útil tal como BCG (bacilo de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Se
utiliza un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Se describe asimismo una vacuna que comprende un
mutante no adherente ni virulento, incluyendo los mutantes ema
descritos en la presente memoria.
Medaglini et al. (Madaglini et al.
(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92;6868-6872) y Oggioni y Pozzi (Oggioni, M. R. y
Pozzi, G. (1996) Gene 169:85-90) han descrito
anteriormente la utilización de Streptococcus gordonii, una
bacteria comensal de la cavidad oral humana, como vehículos de
administración de vacuna activa y para la expresión génica
heteróloga. Dicho mutante ema puede utilizarse por
consiguiente como vehículo para la expresión de las proteínas
inmunógenas con el fin de provocar una respuesta inmunitaria a
tales otras proteínas en el contexto de las vacunas. Puede
provocarse inmunidad activa contra estreptococos del Grupo B, por
inmunización (vacunación) con una cantidad inmunógena del vehículo
ema que expresa una proteína inmunógena. También se describe
la utilización de dicho mutante ema en la expresión de una
proteína terapéutica en el huésped en el contexto de otras formas
de terapia.
El polipéptido de la presente invención, o
fragmentos del mismo, pueden prepararse en una mezcla con un
adyuvante para preparar una vacuna. El polipéptido o derivado del
péptido o fragmento del mismo, utilizado como componente antigénico
de la vacuna puede ser un antígeno común a todos o muchos serotipos
de bacterias GBS, o común a especies de bacterias íntimamente
relacionadas, por ejemplo Streptococcus.
Los vectores que contienen la vacuna a base de
ácido nucleico de la invención pueden introducirse en el huésped
deseado por procedimientos conocidos en la materia, p. ej.,
transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión
celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato cálcico,
lipofección (fusión de lisosomas), utilización de una pistola
génica, o un transportador del vector del ADN (véase, p. ej., Wu
et al., 1992, J. Biol. Chem.
267:963-967; Wu y Wu, 1988, J. Biol. Chem.
263:14621-14624; Harmut et al., solicitud de
patente canadiense nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de
1990).
Los modos de administración de la vacuna o
composiciones de la presente invención pueden comprender la
utilización de cualquier procedimiento adecuado y/o procedimientos
para administrar la vacuna o composición al animal huésped por lo
que son eficaces desde un punto de vista inmunoestimulante. Los
modos de administración pueden incluir, sin limitación,
procedimientos de administración parenteral tales como por vía
paracanceral, transmucosal, transdérmica, intramuscular,
intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal,
intraventricular, intracraneal e intratumoral. Ya que el resultado
deseado de la vacunación consiste en interpretar una respuesta
inmunitaria contra el antígeno, y de este modo contra el organismo
patógeno, es deseable la administración directa, o por
direccionamiento o selección de un vector vírico, indirectamente, a
los tejidos linfoides, p. ej., ganglios linfáticos o bazo. Ya que
las células inmunes se están replicando continuamente, son dianas
ideales para las vacunas de ácido nucleico a base de vector
retrovírico, ya que los retrovirus requieren células replicadoras.
Estas vacunas y composiciones pueden utilizarse para inmunizar
mamíferos, por ejemplo, por las vías intramuscular o parenteral, o
mediante la administración a las superficies de la mucosa utilizando
micropartículas, cápsulas, liposomas y moléculas de
direccionamiento, tales como toxinas y anticuerpos. Las vacunas y
composiciones inmunógenas pueden administrarse a las superficies de
la mucosa, por ejemplo, por las vías nasal u oral (intragástricas).
Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración
incluyendo los supositorios. Para los supositorios, pueden
incluirse aglutinantes y portadores, por ejemplo,
polialquilenglicoles y triglicéridos. Las formulaciones orales
pueden incluir incipientes empleados normalmente tales como
calidades farmacéuticas de sacarina, celulosa y carbonato de
magnesio.
Estas composiciones pueden tomar la forma de
soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas,
formulaciones de liberación lenta o polvos y contienen entre 1 y
95% de las composiciones inmunógenas. Las composiciones inmunógenas
se administran de manera compatible con la formulación de
dosificación, y en una cantidad tal para que sea terapéuticamente
eficaz, protectora e inmunógena. La cantidad que debe administrarse
depende del sujeto que debe inmunizarse, incluyendo, por ejemplo la
capacidad del sistema inmunitario del sujeto para sintetizar
anticuerpos, y si se desea, para producir una respuesta inmunitaria
mediada por células, humoral o por anticuerpo. Las cantidades
exactas de antígeno y de composición inmunógena que deben
administrarse dependen del criterio del médico de familia. Sin
embargo, los intervalos de dosificación adecuados son fácilmente
determinables por expertos en la materia y pueden ser del orden de
microgramos a miligramos. Los regímenes adecuados para la
administración inicial y dosis de refuerzo son también variables,
pero pueden incluir una administración inicial seguida de
administración ulterior. La dosificación de la vacuna puede también
depender de la vía de administración y variará según el tamaño del
hués-
ped.
ped.
Puede proporcionarse inmunidad pasiva a un
sujeto animal susceptible de padecer una infección por estreptococos
mediante administración de antisuero, anticuerpos policlonales o un
anticuerpo monoclonal neutralizante contra el polipéptido Ema de la
invención al paciente. Se describe una combinación de anticuerpos
dirigida contra uno o más polipéptidos Ema EmaA, en combinación con
uno o más anticuerpos contra Spb1, Spb2, Rib y antígeno alfa de la
proteína C. Aunque la inmunidad pasiva no proporciona protección a
largo plazo, puede ser una herramienta valiosa para el tratamiento
de una infección bacteriana en un sujeto que no ha sido vacunado. La
inmunidad pasiva es particularmente importante para el tratamiento
de cepas de bacterias resistentes a antibióticos, ya que ninguna
otra terapia puede estar disponible. Los anticuerpos administrados
para la terapia inmunitaria pasiva pueden ser anticuerpos
autólogos. Por ejemplo, si el paciente es un ser humano, los
anticuerpos son de origen humano o han sido "humanizados",
para minimizar la posibilidad de una respuesta inmunitaria contra
los anticuerpos. Pueden utilizarse vacunas activas o pasivas para
proteger a un paciente animal de la infección por estreptococos,
particularmente estreptococos del Grupo B.
Se han generado y probado anteriormente vacunas
contra GBS. Las vacunas preliminares utilizaron polisacárido no
conjugado purificado. Los polisacáridos y oligosacáridos de GBS son
poco inmunógenos y no pueden producir memoria ni respuestas de
refuerzo significativas. Baker et al. inmunizaron 40 mujeres
embarazadas con polisacárido capsular de serotipo III purificado
(Baker, C. J. et al. (1998) New Engl. J. of Med.
319:1180-1185). En conjunto, solamente el 57%
de las mujeres con bajas concentraciones de anticuerpo específico
respondieron a la vacuna. La escasa inmunogenicidad del antígeno
polisacárido purificado se demostró más en un estudio en el que
treinta voluntarios adultos se inmunizaron con una vacuna
tetravalente compuesta por polisacárido purificado de los serotipos
Ia, Ib, II y III (Kotloff, K. L. et al. (1996) Vaccine
14:446-450). Aunque segura, esta vacuna fue
solo modestamente inmunógena, respondiendo solamente el 13% de los
pacientes al tipo Ib, el 17% al tipo II, respondiendo el 33% al
tipo Ia y respondiendo el 70% al polisacárido de tipo III. La
escasa inmunogenicidad de los antígenos de polisacárido incitó
esfuerzos para desarrollar vacunas conjugadas de polisacárido, con
lo cual estos polisacáridos u oligosacáridos se conjugan con
portadores de proteína. El noventa por ciento de mujeres adultas
sanas inmunizadas con una vacuna conjugada de polisacárido de tipo
III-toxoide contra el tétanos respondió con un
aumento cuádruple en la concentración de anticuerpo, en comparación
con el 50% de las inmunizadas solo con polisacárido (Kasper, D. L.
et al. (1996) J. of Clin. Invest.
98:2308-2314). Una vacuna conjugada de
polisacárido de tipo Ia/Ib y toxoide contra el tétanos fue
igualmente más inmunógena en adultos sanos que solo el polisacárido
(Baker, C. J. et al. (1999) J. Infect. Dis.
179:142-150).
El procedimiento general para la conjugacion del
polisacárido se describe en Wessels et al. (Wessels, M. R.
et al. (1990) J. Clin. Investigation
86:1428-1433). Antes del acoplamiento con el
toxoide contra el tétanos, se introducen grupos aldehído en el
polisacárido por oxidación controlada con peryodato, dando como
resultado la conversión de una parte de los restos de ácido siálico
del polisacárido a restos del análogo en el carbono 8 del ácido
siálico, ácido
5-acetamido-3,5-didesoxi-D-galactosiloctulosónico.
El toxoide contra el tétanos se conjuga con el polisacárido por
aminación reductora utilizando grupos de aldehído libres presentes
en los restos de ácido siálico parcialmente oxidados. La preparación
y conjugación de oligosacáridos se describe en Paoletti et
al. (Paoletti, L. C. et al. (1990) J. Biol. Chem.
265:18278-18283). El polisacárido capsular
purificado se despolimeriza mediante digestión enzimática utilizando
endo-beta-galactosidasa producida
por Citrobacter freundii. Después de la digestión, los
oligosacáridos se fraccionan por cromatografía de filtración en
gel. El toxoide contra el tétanos se acopló por enlaces covalentes
mediante una molécula espaciadora sintética al extremo reductor del
oligosacárido por aminación reductora.
Los procedimientos y las vacunas que comprenden
vacunas de conjugado de GBS, que comprenden polisacárido capsular y
proteína se proporcionan y se describen en las patentes US nº
5.993.825, nº 5.843.461, nº 5.795.580, nº 5.302.386 y nº
4.356.263.
Estas vacunas de conjugado incluyen las vacunas
de conjugado polisacárido-toxoide contra el
tétanos.
Un polipéptido propuesto para ser utilizado en
una vacuna con GBS en el antígeno alfa de la proteína C de GBS
repetitiva, que contiene hasta nueve unidades repetidas una tras de
otra de 82 aminoácidos (Michel, J. K. et al. (1992) PNAS
USA 89: 10060-10064). El polipéptido, los
procedimientos y las vacunas del mismo, incluyendo las vacunas del
conjugado de polisacárido generadas con el mismo, se proporcionan y
se describen en las patentes US nº 5.968.521, nº 5.908.629, nº
5.858.362, nº 5.847.081, nº 5.843.461, nº 5.843.444, nº 5.820.860 y
5.648.241.
Los anticuerpos generados contra el antígeno
alfa con proteína C con un gran número de repeticiones protegen
contra la infección, pero los GBS son capaces de cambiar la
estructura de la proteína eliminando una o más de las zonas de
repetición y la detección del escape por estos anticuerpos (Madoff,
L. C. et al. (1996) PNAS USA
93:4131-4136). Este efecto pudo evitarse
teóricamente por inmunización con una proteína con un número
inferior de unidades de repetición, pero la inmunogenicidad del
antígeno alfa con la proteína C está inversamente relacionada con
el número de repeticiones, el 65% de los ratones respondieron a la
inmunización con la proteína de 9 repeticiones, pero solamente el
11% a una proteína con 1 repetición (Gravekamp, C. et al.
(1997) Infect Immunity 65:5216-5221).
Esto es un inconveniente con cualquier proteína con una estructura
repetitiva, es común para bacterias que son capaces de alterar o
reclasificar estos genes para alterar las proteínas expuestas en su
superficie.
Las dosis típicas para una vacuna compuesta de
un antígeno de proteína están comprendidas en el intervalo entre
2,5 y 50 \mug de proteína total por dosis. Las dosis típicas para
una vacuna conjugada polisacárido-proteína son de
7,5 a 25 \mug de polisacárido y de 1,25 a 250 \mug de proteína
portadora. Estos tipos de vacunas se administran casi siempre por
vía intramuscular. Los programas de dosificación de una vacuna
pueden ser determinados fácilmente por un especialista experto,
particularmente por comparación de vacunas similares, incluyendo
otras vacunas con GBS. Si se utiliza como vacuna universal, una
vacuna con GBS se integraría en el programa de inmunización de
rutina. Las vacunas más similares requieren una serie principal de
inmunizaciones (normalmente 2 ó 3 dosis a intervalos de 2 meses
empezando al mes o 2 meses de edad) y un único refuerzo a los 12 a
18 meses de edad. Un número más pequeño de dosis o una sola dosis
puede ser adecuada en niños mayores (más de un año de edad). Para
la inmunización de mujeres embarazadas, un programa de inmunización
a título de ejemplo sería una sola dosis administrada en el segundo
o al principio del tercer trimestre. Para la inmunización de
mujeres adultas no embarazadas, se utilizaría probablemente una sola
dosis. El requisito para las dosis de refuerzo ulteriores en
adultos es difícil de predecir, ésta se basaría en la
inmunogenicidad de la vacuna y del seguimiento continuo de la
eficacia de la vacuna.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición inmunógena que comprende uno o más
polipéptidos Ema bacterianos.
La invención proporciona composiciones
farmacéuticas que comprenden un polipéptido Ema de estreptococos, y
un portador farmacéuticamente aceptable.
Dicha composición farmacéutica para prevenir la
fijación de estreptococos a la superficie de la mucosa puede
incluir anticuerpos EmaA contra el polipéptido Ema, o cualquier
combinación de anticuerpos contra uno o más de dichos polipéptidos
Ema. Además, alguna de dichas composiciones puede incluir además
anticuerpo contra los polipéptidos de GBS Spb1, Spb2, antígeno alfa
con proteína C o Rib. La adherencia de bloqueo que utiliza dicho
anticuerpo bloquea la etapa inicial en la infección reduciendo de
este modo la colonización. Ésta a su vez disminuye de una persona a
otra la transmisión y evita el desarrollo de la enfermedad
sintomática.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"composición farmacéutica" significa las cantidades
terapéuticamente eficaces de productos de polipéptidos o
anticuerpos de la invención junto con diluyentes, conservantes,
disolventes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores adecuados
útiles en la terapia contra la infección bacteriana o para provocar
una respuesta inmunitaria. Una "cantidad terapéuticamente
eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a
la cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una
enfermedad y un régimen de administración dados. Dichas
composiciones son líquidas o liofilizadas o si no formulaciones
secas e incluyen diluyentes de varios contenidos de tampón (p. ej.,
Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica,
aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción
a las superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80,
Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes disolventes (p.
ej., glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (p. ej., ácido
ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p. ej., Timerosal,
alcohol bencílico, parabenos), sustancias de relleno o
modificadores de tonicidad (p. ej., lactosa, manitol), enlace
covalente de polímeros tal como polietilenglicol a la proteína,
acomplejado con iones metálicos, o incorporación del material en o
sobre preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales
como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o en
liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o
multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Dichas
composiciones influirán en el estado físico, solubilidad,
estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de
eliminación in vivo de los polipéptidos de la presente
invención. La selección de composiciones dependerá de las
propiedades físicas y químicas del polipéptido. Las composiciones
de liberación controlada o mantenida incluyen la formulación en
productos de liberación lenta lipófilos (p. ej., ácidos grasos,
ceras, aceites). También se describen composiciones en partículas
recubiertas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas) y los
polipéptidos de la presente invención acoplados a anticuerpos
dirigidos contra receptores específicos para tejidos, ligandos o
antígenos o acoplados a ligandos de receptores específicos para
tejidos. Otros ejemplos de las composiciones incorporan formas en
partículas, recubrimientos protectores, inhibidores de proteasa o
potenciadores de permeación para varias vías de administración,
incluyendo las vías parenteral, pulmonar, nasal y oral.
Además, tal como se utiliza en la presente
memoria "portador farmacéuticamente aceptable" es bien conocido
por los expertos en la materia e incluyen, tampón fosfato 0,01 a
0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8%. Además,
dichos portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser
soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas.
Ejemplos de disolventes no acuosos son el propilenglicol,
polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y
ésteres orgánicos inyectables tal como el oleato de etilo. Los
portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o
suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo la solución salina y
medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen la solución
de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico,
Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen
reponedores de fluido y de nutrientes, reponedores de electrolitos
tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Pueden
estar también presentes conservantes y otros aditivos, tales como,
por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes comparadores,
gases inertes y similares.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se
refiere a entidades moleculares y composiciones que son
fisiológicamente tolerables y no producen típicamente una reacción
alérgica o desfavorable similar, tales como molestias gástricas,
mareos y similares, cuando se administran a un ser humano.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz"
utilizada en la presente memoria significa una cantidad suficiente
para prevenir, y preferentemente reducir en por lo menos
aproximadamente el 30 por ciento, más preferentemente por lo menos
el 50 por ciento, aún más preferentemente el 90 por ciento, una
infección clínicamente significativa por bacteria estreptocócica.
Alternativamente, en el caso de una vacuna o composición inmunógena,
una cantidad terapéuticamente eficaz utilizada en la presente
memoria significa una cantidad suficiente y adecuada para provocar
una respuesta inmunitaria y una respuesta al anticuerpo en un
individuo, y particularmente para proporcionar una respuesta
suficiente para prevenir, y preferentemente reducir en por lo menos
aproximadamente el 30 por ciento, más preferentemente por lo menos
el 50 por ciento, aún más preferentemente el 90 por ciento, una
infección clínicamente significativa por bacteria
estreptocócica.
Las composiciones de liberación controlada o
mantenida incluyen la formulación en productos de liberación lenta
lipófilos (p. ej., ácidos grasos, ceras, aceites). También se
describen composiciones en partículas recubiertas con polímeros (p.
ej., poloxámeros o poloxaminas) y los compuestos acoplados a
anticuerpos dirigidos contra receptores específicos para tejidos,
ligandos o antígenos o acoplados a ligandos de receptores
específicos para tejidos. Otros ejemplos de las composiciones
incorporan formas en partículas, recubrimientos protectores,
inhibidores de proteasa o potenciadores de permeación para varias
vías de administración, incluyendo las vías parenteral, pulmonar,
nasal y oral.
Cuando se administran, los compuestos se
eliminan con frecuencia rápidamente de las superficies de las
mucosas o de la circulación y pueden por consiguiente producir
actividad farmacológica de vida relativamente corta. En
consecuencia, pueden requerirse administraciones frecuentes de dosis
relativamente grandes de compuestos bioactivos para mantener la
eficacia terapéutica. Los compuestos modificados por el enlace
covalente de los polímeros solubles en agua tales como
polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y
polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol
polivinílico, polivinilpirrolidona o poliprolina se conocen porque
presentan vidas medias sustancialmente más largas en la sangre tras
la inyección intravenosa que lo hacen los compuestos no modificados
correspondientes (Abuchowski et al., 1981; Newmark et
al., 1982; y Katre et al., 1987). Dichas modificaciones
pueden también aumentar la solubilidad de los compuestos en solución
acuosa, eliminar la agregación, aumentar la estabilidad física y
química del compuesto y reducir en gran medida la inmunogenicidad y
reactividad del compuesto. Como resultado, puede conseguirse la
actividad biológica deseada in vivo mediante la
administración de dichos aductos polímero-compuesto
con menos frecuencia o en dosis menores que con el compuesto no
modificado.
Dosis. La cantidad suficiente puede
incluir pero no se limita a la comprendida aproximadamente entre 1
\mug/kg y aproximadamente 1.000 mg/kg. La cantidad puede ser de 10
mg/kg. La forma farmacéuticamente aceptable de la composición
incluye un portador farmacéuticamente aceptable.
Los ejemplos anteriores proporcionan
composiciones terapéuticas que comprenden composiciones
farmacéuticas que comprenden vectores, vacunas, polipéptidos,
ácidos nucleicos y anticuerpos, anti-anticuerpos y
agentes, para competir con la bacteria de estreptococos del Grupo B
por las actividades patógenas, tal como la adherencia a las células
huésped.
La preparación de las composiciones terapéuticas
que contienen un componente activo está bien comprendida en la
materia. Típicamente, dichas composiciones se preparan en forma de
aerosol del polipéptido administrado a la nasofaringe o como
inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin
embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para
solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La
preparación puede estar también emulsionada. El ingrediente
terapéutico activo se mezcla con frecuencia con excipientes que son
farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente
activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución
salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de
los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener
cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes
humectantes o emulsionantes, agentes de tamponación del pH que
aumentan la eficacia del ingrediente activo.
Un componente activo puede formularse en la
composición terapéutica en formas salinas neutralizadas
farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los
grupos amino libres del polipéptido o de la molécula de anticuerpo)
y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los
ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como
acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales
formadas a partir de los grupos carboxilo libres pueden también
proceder de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de
sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas
tales como isopropilamina, trimetilamina,
2-etilamino etanol, histidina, procaína y
similares.
Una composición que comprende "A" (en la
que "A" es una sola proteína, molécula de ADN, vector, etc.)
está sustancialmente exenta de "B" (en la que "B"
comprende una o más proteínas contaminantes, moléculas de ADN,
vectores, etc.) cuando por lo menos aproximadamente el 75% en peso
de las proteínas, ADN, vectores (dependiendo de la categoría de
especies a la que pertenecen A y B) en la composición es "A".
Preferentemente, "A" comprende por lo menos aproximadamente el
90% en peso de la especie A+B en la composición, aún más
preferentemente por lo menos aproximadamente el 99% en peso.
La frase "cantidad terapéuticamente eficaz"
utilizada en la presente memoria significa una cantidad suficiente
para reducir por lo menos aproximadamente el 15 por ciento,
preferentemente por lo menos el 50 por ciento, más preferentemente
por lo menos el 90 por ciento y aún más preferentemente prevenir,
una insuficiencia clínicamente significativa de la actividad,
función y respuesta del huésped. Alternativamente, una cantidad
terapéuticamente eficaz es suficiente para producir una mejora en
una enfermedad clínicamente significativa en el huésped. Una
insuficiencia en la respuesta del huésped se pone de manifiesto
continuando o propagando la infección bacteriana. Una mejora en una
enfermedad clínicamente significativa en el huésped incluye una
disminución de la carga bacteriana, eliminación de bacterias de las
células huésped colonizadas, reducción de la fiebre o de la
inflamación asociadas con la infección, o una reducción de cualquier
síntoma asociado a la infección bacteriana.
El componente o los componentes de una
composición terapéutica puede introducirse por vía parenteral, a
través de las mucosas, p. ej., por vía oral, nasal, pulmonar, o por
vía rectal o transdérmica. Preferentemente, la administración es
parenteral, p. ej., por inyección intravenosa, e incluyendo también,
pero sin limitarse a, administración intraarteriolar,
intramuscular, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal,
intraventricular e intracraneal. La administración oral o pulmonar
puede resultar preferida para activar la inmunidad de la mucosa;
dado que los estreptococos del Grupo B generalmente colonizan las
mucosas nasofaríngea y pulmonar, particularmente la de los recién
nacidos, la inmunidad de la mucosa puede ser un tratamiento
preventivo particularmente eficaz. La expresión "dosis
unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición
terapéutica de la presente invención se refiere a las unidades
físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para seres
humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
material activo calculado para producir el efecto terapéutico
deseado junto con el diluyente requerido; es decir, el portador o
vehículo.
El compuesto activo puede administrarse en una
vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science
249:1527-1533 (1990); Treat et al., en
Liposomes in the Theraphy of Infectious Disease and Cancer,
López-Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York,
págs. 353-365 (1989);
López-Berestein, ibid, págs.
317-327; generalmente íbidem).
La composición terapéutica puede administrarse
en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, el polipéptido
puede administrarse utilizando infusión intravenosa, una bomba
osmótica implantable, un parche transdérmico, liposomas u otros
modos de administración. Puede utilizarse una bomba (véase Langer,
supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987);
Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et
al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). En otro ejemplo,
pueden utilizarse materiales poliméricos (véase Medical
Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC
Pres., Boca Ratón, Florida (1974); Controlled Drug
Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y
Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, J.
Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); véase también
Levy et al., Science 228:190 (1985); During et
al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al.,
J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Incluso en otro ejemplo, un
sistema de liberación controlada puede colocarse en la proximidad de
la diana terapéutica, es decir, el cerebro, requiriendo de este
modo solamente una fracción de la dosis general (véase, p. ej.,
Goodson, en Medical Applications of Controlled Release,
anteriormente, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Un
dispositivo de liberación controlada puede introducirse en un
paciente en la proximidad del punto de activación inmunitaria
apropiada o de un tumor. Otros sistemas de liberación controlada se
exponen en el estudio de Langer (Science
249:1527-1533 (1990)).
Un paciente en el que la administración de un
componente activo como se indicó anteriormente es un régimen
terapéutico eficaz para una infección bacteriana es preferentemente
un ser humano, pero puede ser cualquier animal. De este modo, como
puede apreciar por cualquier experto en la materia, los
procedimientos y composiciones farmacéuticas de la presente
invención son particularmente adecuados para la administración a
cualquier animal, particularmente un mamífero, e incluyendo,
animales domésticos, tales como animales felinos o caninos, animales
de granja, tales como de las especies bovina, equina, caprina,
ovina y porcina, animales salvajes (ya sea en la naturaleza o en un
zoológico), animales de investigación, tales como ratones, ratas,
conejos, cabras, ovejas, cerdos, perros, gatos, etc., es decir,
para uso médico veterinario.
En los procedimientos y composiciones
terapéuticos se proporciona una dosis terapéuticamente eficaz del
componente activo. Una dosis terapéuticamente eficaz puede ser
determinada por cualquier investigador médico experto basándose en
las características del paciente (edad, peso, sexo, enfermedad,
complicaciones, otras enfermedades, etc.), como es bien conocido en
la materia. Además, a medida que se llevan a cabo más estudios
rutinarios, aparecerá más información específica con respecto a los
niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de varias
enfermedades en varios pacientes, y cualquier investigador experto,
considerando el contexto terapéutico, la edad y la salud general
del receptor, es capaz de determinar la dosificación apropiada.
Generalmente, para la inyección o infusión intravenosa, la dosis
puede ser inferior que para la administración intraperitoneal,
intramuscular u otra vía de administración. El programa de
dosificación puede variar, dependiendo de la vida media en
circulación y de la formulación utilizada. Las composiciones se
administran de una manera compatible con la formulación de la
dosificación en la cantidad terapéuticamente eficaz. Las cantidades
exactas de ingrediente activo requeridas para ser administradas
dependen del criterio del médico de cabecera y son peculiares para
cada individuo. Sin embargo, las dosis adecuadas pueden estar
comprendidas entre aproximadamente 0,1 y 20, preferentemente entre
0,5 y aproximadamente 10, y más preferentemente uno a varios,
miligramos de ingrediente activo por kilogramo de peso corporal del
individuo al día y dependen de la vía de administración. Los
regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de
refuerzo son también variables, pero están tipificados por una
administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de
una o más horas mediante una inyección u otra administración
posteriores. Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa
continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomolar
a diez micromolar en la sangre.
Administración con otros compuestos. Para
el tratamiento de una infección bacteriana, se puede administrar el
presente componente activo junto con una o más composiciones
farmacéuticas utilizadas para tratar la infección bacteriana,
incluyendo
(1) antibióticos; (2) inhibidores de adhesina
bacteriana solubles en carbohidratos; (3) otros inhibidores de
adhesina bacteriana de molécula pequeña; (4) inhibidores del
metabolismo, transporte o transformación bacterianos; (5)
estimulantes de la lisis bacteriana, o (6) anticuerpos
antibacterianos o vacunas dirigidas a otros antígenos bacterianos.
Otros componentes activos potenciales incluyen agentes
antiinflamatorios, tales como esteroides y fármacos
antiinflamatorios no esteroideos. La administración puede ser
simultánea (por ejemplo, administración de una mezcla del presente
componente activo y un antibiótico) o pueden ser en serie.
Así pues, las composiciones terapéuticas pueden
incluir además una cantidad eficaz del componente activo y uno o
más de los ingredientes activos siguientes: un antibiótico, un
esteroide, etc.
Por lo tanto, en un caso específico en el que se
desea reducir o inhibir la infección resultante de una unión
mediada por la bacteria de la bacteria a una célula huésped, o de un
anticuerpo a ésta, o de un ligando de la misma o de un anticuerpo a
este ligando, el polipéptido se introduce para bloquear la
interacción de la bacteria con la célula huésped.
Asimismo en la presente memoria se describe la
administración pulmonar de un inhibidor del polipéptido de la
presente invención que actúa como agente inhibidor de adhesina (o
derivados del mismo). El agente inhibidor de adhesina (o el
derivado) se administra a los pulmones de un mamífero, en los que
puede interferir con bacterias, es decir, estreptococos, y
preferentemente estreptococos del Grupo B que se unen a células
huésped. Otros artículos de la preparación de proteínas para la
administración pulmonar se encuentran en la técnica [Adjei et
al. (1990) Pharmaceutical Research,
7:565-569; Adjei et al. (1990)
Internacional Journal of Pharmaceutics,
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140:3482-3488
(interferón-\gamma y factor alfa de la necrosis
tumoral); Platz et al., patente US nº 5.284.656 (factor
estimulante de colonias de granulocitos)]. Un procedimiento y una
composición para la administración pulmonar de fármacos se describe
en la patente US nº 5.451.569, publicada el 19 de septiembre de
1995 concedida a Wong et al.
Todos los dispositivos citados requieren la
utilización de formulaciones adecuadas para la administración del
agente (o derivado) inhibidor de adhesina. Típicamente, cada
formulación es específica para el tipo de dispositivo empleado y
puede conllevar la utilización de un material propulsor adecuado,
además de los diluyentes, adyuvante y/o portadores habituales
útiles en la terapia. Asimismo, la utilización de liposomas,
microcápsulas o microesferas, la inclusión de complejos, o de otros
tipos de portadores se contempla. El agente inhibidor de adhesina
químicamente modificado puede prepararse también en diferentes
formulaciones dependiendo del tipo de modificación química o del
tipo de dispositivo empleado.
Las formulaciones adecuadas para su utilización
con un nebulizador, ya sea de chorro a presión o ultrasónico,
comprenderán típicamente el agente (o derivado) inhibidor de
adhesina disuelto en agua a una concentración de entre
aproximadamente 0,1 y 25 mg del agente inhibidor de adhesina
biológicamente activo por ml de solución. La formulación puede
incluir también un tampón y un azúcar sencillo (p. ej., para la
estabilización del agente inhibidor de adhesina y regulación de la
presión osmótica). La formulación del nebulizador puede contener
también un tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación
producida por la superficie del agente inhibidor de adhesina
producida por atomización de la solución en la formación del
aerosol.
Las formulaciones para su utilización con un
dispositivo inhalador dosificador comprenderán generalmente un
polvo finamente dividido que contiene el agente (o derivado)
inhibidor de adhesina en suspensión en un propulsor con ayuda de un
tensioactivo. El propulsor puede ser cualquier material convencional
empleado para este fin, tal como un clorofluorocarbonado, un
hidroclorofluorocarbonado, un hidrofluorocarbonado o un
hidrocarburo, incluyendo triclorofluorometano,
diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y
1,1,1,2-tetrafluoroetano o combinaciones de los
mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen el trioleato de
sorbitán y la lecitina de soja. El ácido oleico puede también ser
útil como tensioactivo.
Las formulaciones líquidas de aerosol contienen
agente inhibidor de adhesina y un agente dispersante en un
diluyente fisiológicamente aceptable. Las formulaciones de aerosol
en polvo seco están constituidas por una forma sólida finamente
dividida de agente inhibidor de adhesina y agente dispersante. Ya
sea con el líquido o con la formulación de aerosol en polvo seco,
la formulación debe ser aerosolizada. Es decir, puede ser
descompuesta en partículas líquidas o sólidas a fin de asegurar que
la dosis aerosolizada alcanza realmente las membranas de la mucosa
de las fosas nasales o del pulmón. La expresión "partícula de
aerosol" se utiliza en la presente memoria para describir la
partícula líquida o sólida adecuada para la administración nasal o
pulmonar, es decir, que alcance las membranas mucosas. Otras
consideraciones, tal como la construcción del dispositivo de
administración, los componentes adicionales en la formulación y las
características de la partícula son importantes. Estos aspectos de
la administración pulmonar de un fármaco son bien conocidos en la
materia, y la manipulación de las formulaciones, los procedimientos
de aerosolización y la construcción de un dispositivo de
administración requieren como máximo la experimentación de rutina
por cualquier experto en la materia. En un ejemplo específico, el
diámetro dinámico másico medio será de 5 micrómetros o menos con el
fin de asegurar que las partículas de fármaco alcanzan los alvéolos
pulmonares [Wearley, L. L. (1991) Crit. Rev. In Ther. Drug
Carrier Systems 8:333].
Los sistemas de administración del aerosol,
tales como el inhalador dosificador presurizado y el inhalador de
polvo seco se dan a conocer en Newman, S. P., Aerosols and the
Lung, Clarke, S. W. y Davia, D. editores, págs.
197-22 y pueden utilizarse a propósito de la
presente invención.
Como se expuso con detalle anteriormente, una
formulación de aerosol puede influir otros ingredientes terapéutica
o farmacológicamente activos además del agente inhibidor de
adhesina, tales como, pero sin limitarse un antibiótico, un
esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.
Formulaciones líquidas de aerosol.
Asimismo se describen formulaciones y formas farmacéuticas de
aerosol para su utilización en el tratamiento de pacientes que
padecen enfermedades bacterianas, p. ej., por estreptococos,
particularmente por infección por estreptococos. En general dichas
formas farmacéuticas contienen agente inhibidor de adhesina en un
diluyente farmacéuticamente aceptable. Los diluyentes
farmacéuticamente aceptables incluyen pero no se limitan a agua
esterilizada, solución salina, solución salina tamponada, solución
de dextrosa y similares. Un diluyente que puede utilizarse es la
solución salina tamponada con fosfato, o una solución salina
tamponada comprendida generalmente en el intervalo de pH entre 7,0 y
8,0, o agua.
La formulación líquida de aerosol puede incluir,
como ingredientes opcionales, portadores, agentes de solubilización
o emulsión, tensioactivos y excipientes farmacéuticamente
aceptables. La formulación puede incluir un portador. El portador
es una macromolécula que es soluble en el sistema circulatorio y que
es fisiológicamente aceptable en el que aceptación fisiológica
significa que los expertos en la materia aceptarían la inyección de
dicho portador en un paciente como parte de un régimen terapéutico.
El portador preferentemente es relativamente estable en el sistema
circulatorio con una vida media en el plasma aceptable para su
eliminación. Dichas macromoléculas pueden incluir lecitina de soja,
ácido oleico y trioleato de sorbitán, siendo preferido el trioleato
de sorbitán.
Las formulaciones pueden incluir también otros
agentes útiles para el mantenimiento del pH, la estabilización de
la solución o para la regulación de la presión osmótica. Ejemplos de
los agentes pueden incluir sales, tales como cloruro sódico o
cloruro de potasio y carbohidratos, tales como glucosa, galactosa o
manosa y similares.
\newpage
También se describen formulaciones líquidas de
aerosol que comprenden el agente inhibidor de adhesina y otro
fármaco terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un
esteroide, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.
Formulaciones de aerosol en polvo seco.
La presente formulación de aerosol puede prepararse como una
formulación en polvo seco que comprende una forma en polvo
finamente dividido del agente inhibidor de adhesina y un
dispersante.
Las formulaciones para administrar desde un
dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente
dividido que contiene agente (o derivado) inhibidor de adhesina y
pueden incluir también un agente de relleno, tal como lactosa,
sorbitol, sacarosa o manitol en cantidades que facilitan la
dispersión del polvo desde el dispositivo, p. ej., 50 a 90% en peso
de la formulación. El agente (o derivado) inhibidor de adhesina
debería prepararse de la manera más ventajosa en forma de
partículas con un tamaño medio de partícula inferior a 10 mm (o
micras), lo más preferentemente entre 0,5 y 5 mm, para la
administración más eficaz al pulmón distal. En otro ejemplo, la
formulación en polvo seco puede comprender un polvo seco finamente
dividido que contiene agente inhibidor de adhesina, un agente
dispersante y un agente de relleno. Los agentes de relleno útiles
en unión con la presente formulación incluyen agentes tales como
lactosa, sorbitol, sacarosa o manitol, en cantidades que facilitan
la dispersión del polvo desde el dispositivo.
Se describen además formulaciones en polvo seco
que comprende en agente inhibidor de adhesina y otro fármaco
terapéuticamente eficaz, tal como un antibiótico, un esteroide, un
fármaco antiinflamatorio no esteroideo, etc.
Se describen también formas farmacéuticas orales
sólidas, que están descritas generalmente en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. 1990 (Mack Publishing Co.
Easton PA 18042) en el capítulo 89. Las formas farmacéuticas
sólidas incluyen comprimidos, cápsulas, píldoras, tabletas o
pastillas, sellos o bolitas. Asimismo, puede utilizarse la
encapsulación liposómica o proteinoide para formular las
composiciones (como, por ejemplo, microesferas proteinoides
descritas en la patente US nº 4.925.673). Puede utilizarse la
encapsulación liposómica y los liposomas pueden modificarse con
varios polímeros (p. ej., patente US nº 5.013.556). Una descripción
de las posibles formas farmacéuticas sólidas para utilización
terapéutica se dan en Marshall, K. en: Modern Pharmaceutics
editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes capítulo 10, 1979.
En general, la formulación incluirá el
componente o componentes (o formas químicamente modificadas del
mismo) e ingredientes inertes que permiten la protección contra el
medio estomacal, y la liberación del material biológicamente activo
en el intestino.
También se describen formas farmacéuticas orales
del componente o componentes modificados anteriormente. El
componente o componentes pueden modificarse químicamente de modo que
la administración oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la
modificación química consiste en la fijación de por lo menos un
grupo a la propia molécula del componente, en la que dicho grupo
permite (a) la inhibición de la proteólisis; y (b) la absorción en
el torrente sanguíneo procedente del estómago o del intestino.
Asimismo se desea el aumento de la estabilidad general del
componente o componentes y el aumento en el tiempo de circulación en
el cuerpo. Ejemplos de dichos grupos incluyen: polietilenglicol,
copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina.
Abuchowski y Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme
Abducts" en: Enzymes as Drugs, Hocenberg y Roberts, eds.,
Wiley-Interscience, Nueva York, NY, págs.
367-383; Newmark, et al. (1982) J. Appl.
Biochem. 4:185-189. Otros polímeros que podrían
utilizarse son poli-1,3-dioxolano y
poli-1,3,6-tioxocano. Los preferidos
para su utilización farmacéutica, como se indicó anteriormente, son
los grupos de polietilenglicol.
Para el componente (o derivado) la posición de
liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (duodeno,
yeyuno o íleon) o el intestino grueso. Un experto en la materia
tiene formulaciones disponibles que no se disolverán en el
estómago, aunque liberarán el material en el duodeno o en cualquier
parte en el intestino. Preferentemente, la liberación impedirá los
efectos perjudiciales del medio estomacal, ya sea por protección de
la proteína (o derivado) o por liberación del material
biológicamente activo más allá del medio estomacal, tal como en los
intestinos.
Para asegurar la resistencia gástrica completa
es esencial un recubrimiento impermeable hasta por lo menos pH 5,0.
Ejemplos de los ingredientes inertes más frecuentes que se utilizan
como recubrimientos entéricos son el acetato trimelitato de
celulosa (CAT), el ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP),
HPMCP 50, HPMCP 55, acetato ftalato de polivinilo (PVAP), Eudragit
L30D, Aquateric, acetato ftalato de celulosa (CAP), Eudragit L,
Eudragit S y goma laca. Estos recubrimientos pueden utilizarse como
películas mezcladas.
Puede utilizarse también un recubrimiento o
mezcla de recubrimientos en comprimidos, que no está destinado para
la protección del estómago. Éste puede incluir recubrimientos de
azúcar o recubrimientos que facilitan la ingestión del comprimido.
Las cápsulas pueden estar constituidas por una cubierta dura (tal
como gelatina) para la administración de producto terapéutico seco,
es decir en polvo; para las formas líquidas, puede utilizarse una
cubierta blanda de gelatina. El material de la cubierta de los
sellos podría ser almidón espeso u otro papel comestible. Para las
píldoras, pastillas, comprimidos moldeados o triturados de
comprimidos, pueden utilizarse técnicas de amasado en húmedo.
El péptido terapéutico puede estar incluido en
la formulación en forma de multipartículas finas en forma de
gránulos o bolitas de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm.
La formulación del material para la administración de cápsulas
podría también ser en forma de polvo, torundas ligeramente
comprimidas o incluso como comprimidos. El producto terapéutico
podría prepararse por compresión. Pueden incluirse todos los
colorantes y agentes saborizantes. Por ejemplo, la proteína (o
derivado) puede formularse (tal como mediante liposomas o
encapsulación en microesferas) y además contenido dentro de un
producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contiene
colorantes y agentes saborizantes.
Se puede diluir o aumentar el volumen del
producto terapéutico con un material inerte. Estos diluyentes
podrían incluir carbohidratos, especialmente manitol,
a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa,
dextrano modificado y almidón. Determinadas sales inorgánicas
pueden también utilizarse como cargas incluyendo el trifosfato de
calcio, carbonato de magnesio y cloruro sódico. Algunos diluyentes
comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex,
STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
Pueden incluirse disgregadores en la formulación
del producto terapéutico en forma farmacéutica sólida. Los
materiales utilizados como disgregadores incluyen pero no se limitan
a almidón, incluyendo el disgregador comercial a base de almidón,
Explotab. Pueden utilizarse almidón glucolato sódico, Amberlite,
carboximetilcelulosa sódica, ultramilopectina, alginato sódico,
gelatina, cáscara de naranja, carboximetilcelulosa ácida, esponja
natural y bentonita. Otra forma de disgregadores son las resinas de
intercambio catiónico insolubles. Pueden utilizarse gomas en polvo
como disgregadores y como aglutinantes y éstas pueden incluir gomas
en polvo tal como agar-agar, Karaya o tragacanto.
Son también útiles como disgregadores el ácido algínico y su sal
sódica. Pueden utilizarse aglutinantes para mantener el agente
terapéutico unido para formar un comprimido duro e incluir
materiales de productos naturales tales como acacia, tragacanto,
almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC), etilcelulosa
(EC) y carboximetilcelulosa (CMC). Pueden utilizarse tanto la
polivinilpirrolidona (PVP) como la hidroxipropilmetilcelulosa
(HPMC) en soluciones alcohólicas para granular el agente
terapéutico.
Puede incluirse un agente contra la fricción en
la formulación del agente terapéutico para prevenir la adherencia
durante el proceso de formulación. Pueden utilizarse lubricantes
como una capa entre el agente terapéutico y la pared del molde, y
éstos pueden incluir pero no se limitan a; ácido esteárico
incluyendo sus sales de magnesio y de calcio,
politetrafluoroetileno (PTFE), parafina líquida, aceites vegetales y
ceras. Pueden utilizarse también lubricantes solubles tales como
laurilsulfato sódico, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol
de varios pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000.
Pueden añadirse fluidificantes que pueden
mejorar las propiedades del fluido del fármaco durante la
formulación y para ayudar a la redistribución durante la
compresión. Los fluidificantes pueden incluir almidón, talco,
sílice pirógena y silicoaluminato hidratado.
Para ayudar a la disolución del agente
terapéutico en el medio acuoso puede añadirse un tensioactivo como
agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes
aniónicos tales como laurilsulfato sódico, sulfosuccinato de
dioctil sodio y sulfonato de dioctil sodio. Pueden utilizarse
detergentes catiónicos y podrían incluir cloruro de benzalconio o
cloruro de bencetomio. La lista de detergentes no iónicos
potenciales que podrían incluirse en la formulación como
tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40,
aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y 60,
monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y 80, éster de
sacarosa y ácido graso, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos
tensioactivos podían estar presentes en la formulación de la
proteína o derivado bien solos o como mezcla en diferentes
proporciones.
Los aditivos que aumentan potencialmente la
absorción del polipéptido (o derivado) son por ejemplo los ácidos
grasos, ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico.
Administración pulmonar. En la presente
memoria se describe también la administración pulmonar del presente
polipéptido (o de los derivados del mismo). El polipéptido (o
derivado) se administra a los pulmones de un mamífero mientras que
se inhala y se recubre la superficie de la mucosa de los alvéolos.
Otros artículos al respecto incluyen Adjei et al. (1990)
Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei
et al. (1990) Internacional Journal of Pharmaceutics,
63:135-144 (acetato de leuprolida); Braquet
et al. (1989), Journal of Cardiovascular
Pharmacology, 13 (supl. 5):143-146
(endotelina-1); Hubbard et al. (1989)
Annals of Internal Medicine, Vol. III, págs.
206-212 (\alpha1-antitripsina);
Smith et al. (1989) J. Clin. Invest.
84:1145-1146
(\alpha-1-proteinasa); Oswein
et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of
Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado,
marzo, (1990) (hormona de crecimiento humano recombinante); Debs
et al. (1988) J. Immunol.
140:3482-3488 (interferón-g y
factor alfa de la necrosis tumoral); Platz et al., patente
US nº 5.284.656 (factor estimulante de colonias de granulocitos)].
Un procedimiento y una composición para la administración pulmonar
de fármacos para efecto generalizado se describe en la patente US
nº 5.451.569, publicada el 19 de septiembre de 1995 concedida a
Wong et al.
Para su utilización se contempla una amplia gama
de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar
de productos terapéuticos, incluyendo pero sin limitarse a
nebulizadores, inhaladores dosificadores de dosis e inhaladores de
polvo, todos los cuales son conocidos por los expertos en la
materia.
Las formulaciones adecuadas para su utilización
con un nebulizador, ya sea de chorro a presión o ultrasónico,
comprenderán típicamente el polipéptido (o derivado) disuelto en
agua a una concentración entre aproximadamente 0,1 y 25 mg de la
proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación
puede incluir también un tampón y un azúcar sencillo (p. ej., para
la estabilización de la proteína y regulación de la presión
osmótica). La formulación del nebulizador puede contener también un
tensioactivo, para reducir o prevenir la agregación producida por
la superficie de la proteína producida por atomización de la
solución en la formación del aerosol.
Las formulaciones para su utilización con un
dispositivo inhalador dosificador comprenderán generalmente un
polvo finamente dividido que contiene el polipéptido (o derivado) en
suspensión en un propulsor con ayuda de un tensioactivo. El
propulsor puede ser cualquier material convencional empleado para
este fin, tal como un clorofluorocarburo, un
hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo,
incluyendo triclorofluorometano, diclorodifluorometano,
diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano
o combinaciones de los mismos. Los tensioactivos adecuados incluyen
el trioleato de sorbitán y la lecitina de soja. El ácido oleico
puede también ser útil como tensioactivo.
Las formulaciones para administrar desde un
dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente
dividido que contiene polipéptido (o derivado) y pueden incluir
también un agente de relleno, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa
o manitol en cantidades que facilitan la dispersión del polvo desde
el dispositivo, p. ej., 50 a 90% en peso de la formulación. La
proteína (o derivado) debería prepararse de la manera más ventajosa
en forma de partículas con un tamaño medio de partícula inferior a
10 mm (o micras), lo más preferentemente entre 0,5 y 5 mm, para la
administración más eficaz al pulmón distal.
Administración nasal. Se describe también
la administración nasal o nasofaríngea del polipéptido (o derivado).
La administración nasal permite el paso del polipéptido
directamente sobre la mucosa del aparato respiratorio superior
después de administrar el producto terapéutico a la nariz, sin
necesidad de deposición del producto en los pulmones. Las
formulaciones para administración nasal incluyen aquellas con
dextrano o ciclodextrano.
Las composiciones terapéuticas que contienen
polipéptido, análogo o fragmento activo se administran de forma
convencional por vía intravenosa, tal como por ejemplo, por
inyección de una dosis unitaria. La expresión "dosis unitaria"
cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica se
refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis
unitarias para seres humanos, conteniendo cada unidad una cantidad
predeterminada de material activo calculado para producir el efecto
terapéutico deseado junto con el diluyente requerido; es decir, el
portador o vehículo.
Las composiciones se administran de una manera
compatible con la formulación de la dosificación y en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La cantidad que debe administrarse depende
del paciente que debe tratarse, de la capacidad del sistema
inmunitario del individuo para utilizar el ingrediente activo y del
grado de inhibición o neutralización de la capacidad de fijación
deseada. Las cantidades exactas de ingrediente activo requeridas
que deben administrarse dependen del criterio del médico de cabecera
y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, las dosis
adecuadas pueden estar comprendidas entre aproximadamente 0,1 y 20,
preferentemente entre 0,5 y aproximadamente 10, y más
preferentemente uno a varios, miligramos de ingrediente activo por
kilogramo de peso corporal del individuo al día y dependen de la
vía de administración. Los regímenes adecuados para la
administración inicial y las dosis de refuerzo son también
variables, pero están tipificados por una administración inicial
seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante
una inyección u otra administración posteriores. Alternativamente,
se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para
mantener concentraciones de diez nanomolar a diez micromolar en la
sangre.
La invención puede entenderse mejor haciendo
referencia a los siguientes Ejemplos no limitativos, que se
proporcionan a título de ejemplo de la invención. Los siguientes
ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente las
formas de realización preferidas de la invención y no deberían
considerarse en modo alguno, sin embargo, como limitativos del
amplio alcance de la invención.
Comparando la composición genética y fenotípica
de los grupos relacionados genéticamente de una especie bacteriana
se facilita la identificación de factores de virulencia presentes en
la mayoría de los grupos patógenos. El GBS de tipo III puede
subdividirse en tres grupos de cepas relacionadas basadas en el
análisis de los modelos del digesto de restricción (RDP) producidos
por la digestión del ADN cromosómico con Hind III y Sse 8387 (5,
6). Más del 90% de la enfermedad por GBS de tipo III invasiva en
recién nacidos en Japón y en Salt Lake City es producida por
bacterias de uno de los tres tipos de RDP, denominados RDP de tipo
III-3, mientras que RDP de tipo
III-2 es significativamente más probable que se
aíslen de la vagina que de la sangre o de CSF (6). Estos resultados
sugieren que este grupo de GBS de tipo III-3
genéticamente relacionado son más virulentos que las cepas
III-2 y podían ser responsables de la mayoría de la
enfermedad de tipo III invasiva en conjunto. Los autores proponen
que los factores bacterianos que contribuyen al aumento de la
virulencia de las cepas III-3 pueden identificarse
caracterizando las diferencias entre la composición genética de las
cepas III-3 y III-2. Dichas
diferencias genéticas se encontrarán en los cromosomas bacterianos
ya que estas cepas no contienen plásmidos (6).
Para identificar los genes presentes en las
cepas de GBS de tipo III-3 virulentas y no en las
cepas de tipo III-2 no virulentas los autores
utilizaron una modificación de la técnica descrita por Lisitsyn
et al. (7). El ADN genómico de alto peso molecular
procedente de una cepa de GBS de tipo III-3 de RDP
invasivo (cepa 874391) y una cepa de tipo III-2 de
RDP colonizador ("no virulenta") (cepa 865043) se preparó por
lisis celular con mutanolisina y digestión con proteinasa K (5).
Para la sustracción genética, se digirió el ADN genómico de ambas
cepas con Taq I. El ADN digerido con Taq I procedente de la cepa
virulenta se mezcló con dos oligonucleótidos complementarios (TaqA
(5'-CTAGGTGGATCCTTCGGCAAT-3' (SEC.
ID. nº: 11)) y TaqB
(5'-CGATTGCCGA-3' (SEC. ID. nº:
12)), se calentó a 50ºC durante 5 minutos, a continuación se dejó
enfriar lentamente a 16ºC en tampón de T4 ligasa. Se ligaron los
oligonucleótidos al ADN de la cepa virulenta por incubación con 20
unidades de T4 ligasa a 16ºC durante 12 horas. Tras la ligadura,
500 ng de ADN de la cepa virulenta, con enlazadores ligados, y 40
\mug de ADN de la cepa no virulenta, sin enlazadores, se
mezclaron, se desnaturalizaron por calentamiento y se hibridaron a
68ºC durante 20 horas.
El diez por ciento de la mezcla de hibridación
resultante se incubó con Taq ADN polimerasa y los dNTP para
completar los extremos del ADN de la cepa virulenta hibridada. El
ADN hibridado se amplió mediante Taq ADN polimerasa durante 10
ciclos utilizando el TaqA oligonucleótido como cebador de ampliación
transcrito y complementario. Después de la ampliación, los
productos monocatenarios que permanecen tras la ampliación se
digirieron con nucleasa de la alubia mung. El veinte por ciento del
producto resultante se volvió a ampliar a continuación durante 20
ciclos. Este procedimiento de sustracción seguido de ampliación por
PCR produce un aumento de la ampliación de los segmentos de ADN de
las cepas III-3 que no se hibridan con los segmentos
de ADN procedentes de las cepas III-2.
Se realizaron un total de cuatro ciclos de
sustracción y ampliación, utilizando sucesivamente pequeñas
cantidades de productos de PCR específicos para
III-3 y alternando dos series de adaptadores (TaqA/B
(SEC. ID. nº: 11 y nº: 12, respectivamente) y TaqE/F (TaqE
(5'-AGGCAACTGTGCTAACCGAGGGAAT-3'
(SEC. ID. nº: 13)); y TaqF
(5'-CGATTCCCTCG-3') (SEC. ID. nº:
14)). Los productos de la ampliación final se ligaron en vectores
PBS KS+. Se seleccionaron al azar trece clones para análisis. Se
utilizaron estas sondas en experimentos de transferencia de huellas
y manchas para determinar si la sustracción tuvo éxito y para
identificar las sondas que se hibridan con todas las cepas
III-3. Cada una de las 6 sondas únicas se hibridó
con la cepa virulenta III-3 paterna, mientras que
ninguna de las sondas se hibridó con las cepas III-2
no virulentas. Dos de las etiquetas de la secuencia ampliada
(clones DY1-1 y DY1-11) se
hibridaron con el ADN genómico de las 62 cepas de tipo III, pero no
se hibridaron con el ADN preparado a partir de las cepas
III-2 y III-1 (Figura 1). Para
obtener información de la secuencia adicional, los autores
construyeron un banco genómico GBS III-3. Las
múltiples placas que se hibridan con cada una de las sondas
específicas para III-3 GBS se han purificado para la
caracterización adicional.
Se identificaron tres clones genómicos
solapantes que se hibridan con la sonda DY1-1. Se
subclonó y se secuenció un fragmento Sal I-Bgl II
de 6,4 kb presente en cada clon. Este ADN genómico está presente en
todas las cepas de tipo III-3 de RDP pero no en las
cepas de serotipo III-2, III-1 o de
otros serotipos de GBS.
Más del 90% de este fragmento de ADN genómico se
ha secuenciado y se ha descubierto que contiene 5 marcos de lectura
abiertos (ORF). Dos ORF parecen ser candidatos para genes
virulentos. spb 1 es un ORF de 1509 bp. La proteína prevista (502
aminoácidos y Mr 53.446) tiene las características de una proteína
unida a la membrana celular. Las secuencias de ácido nucleico y de
aminoácidos previstas de sbp I se proporcionan en las SEC.
ID. nº: 15 y nº: 16, respectivamente. El terminal N de la proteína
prevista es un tramo básico, hidrófilo de 6 aminoácidos seguido de
un núcleo rico en prolina, hidrófobo de 23 aminoácidos, consistente
en un péptido señal. La proteína madura hidrófila termina en un
dominio LPXTG (SEC. ID. nº: 17) típico que precede inmediatamente a
un núcleo hidrófobo de 20 aminoácidos y un terminal hidrófilo básico
corto. La secuencia de nucleótidos no es homóloga a las secuencias
de otros genes bacterianos conocidos. La secuencia de aminoácidos
traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos con un
número de proteínas caracterizadas, incluyendo la proteína tipo 2
de la franja de Actinomyces naeslundii (27% de identidad en
350 aminoácidos) y la proteína de tipo I de la franja de
Actinomyces viscosus (25% de homología en 420 aminoácidos)
(16), la proteína superficial T6 de S. pyogenes (23% de
identidad en 359 aminoácidos) (20), y la hsf (27% de identidad en
260 aminoácidos) y las adhesinas de HMW1 (25% de identidad en 285
aminoácidos) de Haemophilus influenzae (21, 22). La función
de la proteína T6 de S. pyogenes es desconocida. Cada uno de
los demás homólogos desempeña una función en la adherencia y/o
invasión bacteriana.
Se creó una cepa de GBS mutante con deleción
isógona spb 1^{-} por recombinación homóloga (utilizando
el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 a continuación) y se
determinó la capacidad del mutante spb 1^{-} para
adherirse a las células epiteliales respiratorias A549 e invadirlas.
En comparación con la cepa natural, el número de bacterias spb
1^{-} adherentes a las monocapas de A549 se redujo el 60,0%
(p<0,01) y el número de bacterias intracelulares invasoras se
redujo el 53,6% (p<0,01). Estos datos sugieren que spb1 puede
contribuir a la patogénesis de la neumonía por GBS y a la entrada de
bacterias en el torrente sanguíneo.
El segundo ORF, spb2, termina 37 bp
corriente arriba del spb1 y está en la misma orientación de
la transcripción. Este ORF de 1692 bp tiene una secuencia de
aminoácidos deducida de 579 restos y Mr 64.492. Las secuencias de
ácido nucleico y de aminoácidos previstas de sbp2 se
proporcionan en las SEC. ID. nº: 18 y nº: 19, respectivamente.
spb2 comparte el 50,5% de identidad de ácido nucleico y el
20,7% de la identidad de aminoácidos con spb1. La
conservación es mayor en las zonas del terminal carboxi, incluyendo
un motivo LPSTGG (SEC. ID. nº: 20) compartido. En contraste con
spb1, spb2 no presenta una secuencia con señal obvia. Su
secreción puede estar mediada por las secuencias de reconocimiento
del terminal carboxi o por péptidos accesorios (23). La secuencia
de aminoácidos deducida de Spb2 es también homóloga con las
proteínas T6 de S. pyogenes y de Actinomyces
naeslundii, y con internalina A de Listeria monocytogenes
(22% de identidad en 308 aminoácidos); de nuevo, las proteínas son
importantes en la adherencia y la invasión (24).
Se identificaron dos clones genómicos que se
hibridan con la sonda DY1-11. Se subclonó y
secuenció un fragmento Hind III de 7 kb presente en cada clon. A
diferencia de las secuencias spb específicas para el serotipo III,
este ADN genómico, que es adyacente a una zona del ADN específico
para el serotipo III-3, se descubrió que estaba
presente en todas los GBS probados hasta la fecha, incluyendo las
cepas de serotipo Ia, Ib, II y V. Esta zona del cromosoma de GBS,
de la cual los autores han diseñado el locus de adhesina de la
matriz extracelular (ema), contiene 5 ORF significativos.
El primer ORF, emaA, tiene una longitud
de 738 bp, con un producto proteico previsto de 246 aminoácidos y
Mr 26,2. La secuencia de ácido nucleico (SEC. ID. nº: 1) y la
secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 2) de emaA
se presentan en la Figura 2. La proteína EmaA es una proteína no
repetitiva. El terminal N de 27 aminoácidos de la proteína prevista
es coherente con un péptido señal. La proteína madura tiene un
dominio imperfecto que se une a la pared celular (XPXTGG (SEC. ID.
nº: 21)) seguido de un dominio que se extiende a través de la
transmembrana que abarca los restos 219 a 235 y una cola hidrófila
terminal. La secuencia nucleotídica emaA no es homóloga a
las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia de
aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología de segmentos
con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo la adhesina del
colágeno, Bbp, de Staphylococcus aureus (identidad del 37% en
103 aa) (15), una subunidad estructural de la franja de tipo 2 de
Actinomyces naeslandii (39% de homología en 112 aa) (16), y
la proteína FimP de Actinomyces viscosus (28% de homología
en 228 aa) (17). La función de la proteína T6 de S. pyogenes
es desconocida. Las franjas de tipo 1 y tipo 2 de Actinomyces
median la adherencia bacteriana a las glucoproteínas salivares y a
varias células huésped, contribuyendo a la patogénesis de la caries
dental.
El segundo ORF, emaB, empieza 94 bp 3' de
emaA y está en la misma orientación de la transcripción. La
secuencia de ácido nucleico (SEC. ID. nº: 3) y la secuencia de
aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 4) de emaB se presentan
en la Figura 3. Tiene una longitud de 924 bp; con un producto de la
proteína previsto de 308 aminoácidos y Mr de 33,9. La proteína EmaB
es una proteína no repetitiva. El terminal N de 27 aminoácidos de
la proteína prevista es consecuencia de un péptido señal. La
proteína madura tiene un dominio imperfecto que se une a la pared
celular (XPXTG) seguido de un dominio que se extiende a través de la
transmembrana que comprende los restos 279 a 294. La secuencia
nucleotídica emaB no es homóloga a las secuencias conocidas
de los genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin
embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas
caracterizadas, incluyendo la subunidad estructural de las franjas
de tipo 2 de Actinomices naeslandii (28% de homología en 222
aminoácidos), la proteína T6 de S. pyogenes (26% de homología
en 266 aminoácidos) (20) y una supuesta adhesina de la superficie
celular de S. epidermidis (24% de identidad en 197
aminoácidos). La primera de estas proteínas media en la adherencia
de S. aureus al colágeno y se supone que contribuye a la
patogénesis de la osteomielitis y la artritis infecciosa.
El tercer ORF, emaC, empieza 2 bp 3' de
EmaB y está en la misma orientación de la transcripción. Tiene una
longitud de 918 bp; con un producto de la proteína previsto de 305
aminoácidos y Mr de 34,5. La secuencia del ácido nucleico (SEC. ID.
nº: 5) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC. ID. nº: 6) de
emaC se representan en la Figura 4. La proteína EmaC es una
proteína no repetitiva. El terminal N de 30 aminoácidos de la
proteína prevista es consecuencia de un péptido señal. La proteína
madura tiene un dominio que se extiende a través de la
transmembrana que comprende los restos 265 a 281 y una cola
hidrófila terminal. La secuencia nucleotídica de emaC no es
homóloga a las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La
secuencia de aminoácidos traducida, sin embargo, comparte homología
de segmentos con numerosas proteínas caracterizadas, incluyendo las
proteínas asociadas al montaje de la subunidad estructural de la
franja de tipo 2 de Actinomyces naeslandii (38% de homología
en 234 aminoácidos) (16). Estas proteínas se necesitan para el
montaje de las franjas de tipo 2.
El cuarto ORF, emaD, tiene una longitud
de 852 bp, solapa a emaC mediante 47 bp, y está
en la misma orientación de la transcripción. El producto proteico
previsto es de 284 aminoácidos y Mr 33,1. La secuencia de ácido
nucleico (SEC. ID. nº: 7) y la secuencia de aminoácidos prevista
(SEC. ID. nº: 8) de emaD se presentan en la Figura 5. La
secuencia señal N-terminal no identificable está
presente y los potenciales segmentos transmembranarios están
presentes en las posiciones 19 a 35 y 252 a 280. La proteína madura
no es repetitiva y carece de un dominio de unión a la pared
celular. La secuencia nucleotídica de emaD no es homóloga
con las secuencias conocidas de los genes bacterianos. La secuencia
de aminoácidos traducida, comparte homología del segmento con las
mismas proteínas asociadas a las franjas de Actinomyces como
lo hace EmaC.
El quinto ORF, emaC, empieza 42 bp 3' de
EmaB y está en la misma orientación de la transcripción. Tiene una
longitud de 2.712 bp; con un producto de la proteína previsto de 904
aminoácidos y Mr de 100,9. La Figura 6 representa la secuencia del
ácido nucleico (SEC. ID. nº: 9) y la secuencia de aminoácidos
prevista (SEC. ID. nº: 10) de emaE. La proteína EmaE
prevista es una proteína no repetitiva. Un péptido señal obvio del
terminal N no es evidente pero una supuesta zona transmembranaria
está situada en los restos 24 a 40. La proteína madura tiene un
dominio de unión a la pared celular imperfecto (XPXTGG (SEC. ID. nº:
21)) seguido de un dominio que comprende transmembrana que
comprende los restos 880 a 896. La secuencia de nucleótidos
emaE no es homóloga con las secuencias conocidas de los
genes bacterianos. La secuencia de aminoácidos traducida, sin
embargo, comparte homología de segmentos con numerosas proteínas
caracterizadas, incluyendo las proteínas de unión a la fibronectina
F1 y F2 de S. pyogenes (31% de homología en 207 aminoácidos)
(18, 19). Estas proteínas median la unión por alta afinidad a la
fibronectina, y son importantes en la adherencia de S.
pyogenes a las células respiratorias.
La similitud de los productos proteicos del
locus ema a adhesinas e invasinas fisiológicamente
importantes de otras especies bacterianas sugiere que las proteínas
Ema desempeñan una función facilitando la adherencia de GBS a los
componentes de la matriz extracelular y a las superficies celulares
y la invasión posterior de células epiteliales y endoteliales, las
etapas iniciales en la patogénesis de la infección.
Varias líneas de prueba sugieren que los
miembros del locus ema y del spb pueden tener
funciones similares, pero es probable que representen distintas
clases de proteínas. Los genes del locus ema y spb son
cada uno y todos similares a las adhesiones e invasiones
fisiológicamente importantes de las especies bacterianas, sin
embargo, tanto Spb1 como Spb2 tienen dominios prototípicos de unión
a la pared celular gram positivos, mientras que los miembros del
locus ema tienen un motivo infrecuente, lo que sugiere un
mecanismo distinto del anclaje en la superficie celular. En segundo
lugar el locus spb está restringido a las cepas de serotipo
III-3 virulento de GBS, mientras que el locus
ema parece estar omnipresente en todos los serotipos de GBS.
En tercer lugar spb1 y spb2 son más homólogos entre sí
que los miembros del locus ema y los genes ema son
más estrechamente homólogos entre sí que con spb1 y
spb2.
Para identificar la actividad biológica de estos
nuevos genes de GBS, se crean cepas bacterianas mutantes isógenas
que son idénticas desde todos los puntos de vista excepto por la
presencia o ausencia de un gen específico. Los mutantes con
deleción se crean por sustitución alélica. El gen relevante, con 100
a 300 bp de secuencias de flanqueo, se subclona y modifica mediante
la deleción de un fragmento intragénico de la secuencia de
codificación y, en algunos casos, la inserción de un gen con
resistencia a la kanamicina. El gen mutante se clona en el vector
pHY304 suicida (proporcionado gentilmente por el Dr. Craig Rubens),
un plásmido huésped de amplio espectro que contiene un gen ori
sensible a la temperatura, con resistencia a la eritromicina
(erm^{TS}), y un punto de clonación múltiple pBS. El
vector pHY304 es un derivado del vector pWV01 (Framson, P. E. et
al. (1997) Applied Environ Microbiology
63:3539-3547). Los plásmidos que contienen genes
mutantes se electroporan en la cepa 874391 y se seleccionan
mutantes con entrecruzamiento único por resistencia antibiótica a
37ºC. Las colonias resistentes al antibiótico resultantes se
someten a un cambio de temperatura a 30ºC. La integración del
plásmido es inestable a esta temperatura permisiva debido a que
existen dos ori funcionales en el cromosoma. El plásmido escindido
se elimina por cultivo en un medio no selectivo para muchas
generaciones, a continuación se criba la presencia del alelo
mutante en las colonias por sensibilidad a la eritromicina. Los
mutantes con doble entrecruzamiento son estables y no requieren
mantenimiento en la selección del fármaco. El genotipo mutante se
confirma por transferencia Southern o demostrando por PCR la
deleción apropiada. Se criba la presencia de la expresión génica en
los mutantes resultantes por análisis de transferencia Northern y
Western. El fenotipo de los mutantes modificados genómico se
compara a continuación con el de la cepa 874391 natural examinando
la velocidad de crecimiento y la morfología de la colonia, y la
expresión de \beta-hemolisina y el
factor CAMP. Se evalúa la expresión de la proteína superficial por
transferencia Western, utilizando sueros policlonales de conejos
inmunizados con GBS de tipo III completo, destruido
térmicamente.
La adherencia de GBS a las células huésped es un
requisito previo para la enfermedad invasiva. Tres tipos de células
diferentes presentan el potencial para ser importantes en este
proceso: i) la adherencia a las células epiteliales respiratorias
es probable que facilite el infecciones neonatales de comienzo más
precoz, ii) la adherencia a las células epiteliales
gastrointestinales se ha supuesto que es importante en la
patogénesis de las infecciones neonatales de comienzo tardío, y
iii) la adherencia a las células endoteliales es necesaria tanto
para la endocarditis como para otras infecciones endovasculares, y
es probable que sea el episodio inicial en la meningitis por GBS.
La capacidad de las cepas naturales y mutantes para adherirse a las
células epiteliales y endoteliales se compara en los ensayos de
adherencia.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Se utilizan cuatro estirpes celulares diferentes
para investigar la función de los nuevos genes de GBS en la
adherencia. Los GBS se adhieren a las células de carcinoma epitelial
alveolar humano A549 y las invaden y las proteínas superficiales
parecen desempeñar una función importante en este proceso (8). La
unión de GBS a las células A549 se utiliza como modelo para la
colonización respiratoria in vitro. GBS también se adhiere a
C2BBeL, una estirpe celular epitelial intestinal humana, que se
utiliza como modelo para la colonización gastrointestinal, y a las
células HeLa epiteliales cervicales, un modelo para la colonización
genital y la infección maternal. Para la adherencia endotelial, se
estudian dos líneas celulares: células endoteliales de la vena
umbilical humanas (HUVE) recién aisladas; y una estirpe celular
endotelial microvascular del cerebro (BMEC) humana inmortalizada.
Los ensayos de adherencia se realizan como describe Tamura et
al. (9). Las líneas celulares se cultivan hasta confluencia en
placas de cultivo tisular de 96 pocillos en los medios recomendados.
Se lavan las monocapas con PBS y se fijan con gluteraldehído al
0,5%. Después del bloqueo con BSA al 5% en PBS, se inoculan las
células con varios inóculos de GBS, se centrifugan durante 10
minutos a 2.000 rpm y se incuban durante 1 hora a 4ºC. Las
bacterias no adherentes se eliminan lavando tres veces con leche en
polvo descremada al 5% en PBS y las bacterias unidas se eluyen a
continuación y se siembran en placas cuantitativamente.
Las GBS se adhieren al epitelio respiratorio, al
endotelio y a BMEC y los invaden (8, 10, 11). Se determina la
capacidad de las cepas de GBS naturales y mutantes isógenas para
invadir tanto las células epiteliales como las endoteliales como se
describió anteriormente (8, 10, 11). Los ensayos que distinguen la
capacidad de GBS para invadir las células eucarióticas frente a
adherirse a las células capitalizan la inestabilidad de la
penicilina y la gentamicina para introducirse en las células
huésped, lo que permite la cuantificación de las bacterias
intracelulares una vez destruidas las bacterias extracelulares. Se
cultivan GBS hasta la fase de crecimiento deseada en caldo de
cultivo TH, se lavan dos veces con PBS y se vuelven a poner en
suspensión en medio de cultivo tisular que contiene suero de
ternero fetal al 10%. Monocapas de cultivo tisular cultivadas hasta
confluencia en placas de 24 pocillos se inoculan con inóculos
variables de GBS, se centrifugan a 800 \times g y se incuban a
37ºC en CO_{2} al 5% durante 2 a 6 horas. Se eliminan las
bacterias extracelulares lavando cuatro veces con PBS. Las células
se incuban a continuación en medio reciente con 5 mg/ml de
penicilina y 100 mg/ml de gentamicina durante 2 horas. Los medios
se eliminan a continuación, se lavan las monocapas y se lisan las
células por tratamiento con Triton X-100 al 0,025%.
Los lisados celulares se tratan con ultrasonidos para destruir las
cadenas bacterianas y se colocan alícuotas en placas
cuantitativamente.
Se prueba la capacidad del anticuerpo específico
contra las nuevas proteínas de GBS para facilitar la destrucción
opsonofagocítica de GBS (12). Se inmunizan conejos con proteínas GBS
recombinantes o purificadas producidas por técnicas normalizadas.
El antisuero de conejo de diferentes diluciones (comprendidas entre
1/50 y 1/5.000) que ha sido absorbido exhaustivamente con la cepa
mutante isógena relevante a 4ºC se incubará con GBS en presencia de
complemento humano y leucocitos polimorfonucleares (3 \times
10^{6}). La destrucción opsonofagocítica se expresa como el log
del número de CFU que sobreviven después de 1 hora de incubación
sustraído del log del número de CFU en el punto de tiempo cero. La
destrucción de cepas naturales se compara con la de mutantes
isógenos que carecen de nuevas proteínas de GBS.
La rata recién nacida ha sido utilizada por
numerosos laboratorios como modelo de infección de GBS porque
simula con detalle la infección del ser humano recién nacido (13).
La contribución de nuevos genes a la patogénesis de las infecciones
por GBS se prueba comparando el tipo natural y el mutante en este
sistema. Se inoculan crías de rata por dos vías. En primer lugar,
se inoculan las crías por vía intranasal para simular la infección
respiratoria y la septicemia típica del comienzo precoz de la
infección por GBS. En segundo lugar, la inoculación intraperitoneal
o subcutánea reproduce el alto grado de bacteriemia asociada con la
septicemia por GBS y que precede a la meningitis por GBS (14).
Se inoculan crías de rata con dosis variables de
cepas de GBS y se determina la mortalidad. Se determina el nivel de
bacteriemia mediante cultivos de sangre cuantitativos. Se conservan
tejidos de pulmón, hígado, bazo y meninges para examen
histológico.
Se determina la capacidad del antisuero para las
proteínas GBS para proteger las ratas recién nacidas de la
infección por GBS (13). Las ratas recién nacidas (<18 horas de
vida) reciben una inyección intraperitoneal de 0,5 ml de antisuero
de conejo no diluido, seguido de la inoculación intraperitoneal del
equivalente de una unidad LD50 de GBS (normalmente unas 5.000
bacterias) en PBS. Se determinan a continuación la mortalidad y la
morbilidad.
Varias proteínas superficiales de GBS,
incluyendo C y Rib son inmunógenas y protectoras contra la infección
por GBS en modelos de roedor lactante (25, 26). Ninguna de estas
proteínas está presente en todas las cepas de GBS (27). Además,
cada una de estas proteínas tiene una estructura repetitiva. La
variabilidad fenotípica de estas proteínas repetitivas permite
escapar a los mutantes que expresan formas variantes para evadir los
sistemas inmunitarios del huésped y pueden limitar la eficacia de
estas vacunas (28). Es destacable que cada una de las proteínas
previstas de los locus spb y ema no tienen una estructura repetitiva
y no presentarían este inconveniente.
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Las nuevas proteínas de GBS que describen en la
presente los autores pueden ser antígenos útiles para una vacuna
contra GBS. Los datos presentados en la presente memoria indican que
estas proteínas desempeñan una función en la mediación de la
adherencia y la invasión de GBS a las células epiteliales humanas,
de este modo el anticuerpo contra estos antígenos puede prevenir
estas etapas iniciales en la infección. Es muy deseable desarrollar
una vacuna que impida la colonización de mujeres embarazadas y otros
individuos en situación de riesgo aumentada de infección invasiva
por GBS, ya que esto eliminaría la mayoría de las infecciones. Los
datos de los autores sugieren que el anticuerpo contra Spb1 es
eficaz para reducir la colonización o infección después de la
colonización con cepas muy virulentas de serotipo III, y por
consiguiente esta proteína es un antígeno de vacuna específicamente
útil. Los miembros del locus ema, a diferencia de spb1
y spb2, están omnipresentes en GBS y por consiguiente
desempeñan una función en la prevención de la infección por
serotipos múltiples de GBS. Una formulación de vacuna óptima incluye
combinaciones de estos antígenos.
Se utilizan dos estrategias para diseñar vacunas
contra GBS utilizando estas nuevas proteínas. En primer lugar, se
utilizan proteínas recombinantes purificadas o purificadas por
afinidad como antígenos de vacuna, individualmente o en combinación
(25). En segundo lugar, estas proteínas se utilizan como proteínas
portadoras para vacunas a base de polisacárido u oligosacárido
capsular. Los polisacáridos y oligosacáridos de GBS generalmente son
poco inmunógenos y no pueden provocar respuestas significativas de
recuerdo ni de refuerzo (29). La conjugación de estos polisacáridos
u oligosacáridos con portadores de proteína aumenta la
inmunogenicidad. El polisacárido GBS conjugado con toxoide contra
el tétano, por ejemplo, se ha utilizado para inmunizar mujeres
embarazadas y produce grandes concentraciones de anticuerpo contra
el polisacárido del suero materno que pueden transferirse al feto
en el tercer trimestre del embarazo (30). La selección de las
proteínas portadoras apropiadas es importante para el desarrollo de
las formulaciones de la vacuna con polisacárido y proteína. Por
ejemplo, el poli- u oligosacárido de tipo b de Haemophilus
influenzae conjugado con diferentes portadores de proteína
presenta inmunogenicidad variable y provoca anticuerpos con avidez
variable (31, 32). La inmunización repetida con la misma proteína
portadora puede también suprimir las respuestas inmunitarias por
competencia con linfocitos B específicos (supresión epitópica) u
otros mecanismos. Esto resulta particularmente interesante para el
desarrollo de las vacunas contra GBS ya que todas las vacunas del
conjugado de polisacárido y oligosacárido con conjugado de proteína
desarrolladas recientemente contra las bacterias H. influenzae,
S. pneumoniae y N. meningitidis utilizan un número
limitado de proteínas portadoras (toxoide tetánico, CRM197, toxoide
diftérico), que aumentan el número de exposiciones a estos
portadores que es probable que reciba un individuo. Una vacuna de
"diseñador", compuesta por un polisacárido u oligosacárido de
GBS acoplado a una proteína portadora específica para GBS, tal como
los nuevos polipéptidos de GBS, proporcionados en esta memoria,
particularmente incluyendo Spb1, EmaC y EmaE, pueden ser una
estrategia preferible. El gran tamaño de algunos de estos nuevos
antígenos de GBS puede presentar también una ventaja para las
proteínas con vehículo tradicional ya que el aumento de tamaño está
asociado a una mejor inmunogenicidad.
Como se expuso anteriormente, las proteínas Ema
de GBS comparten homología de segmentos con determinadas proteínas
caracterizadas de otras especies bacterianas, incluyendo las
proteínas de adherencia y de invasión bacterianas. El homólogo
segmentario se observa en el intervalo entre 24 y 39%. Además, las
proteínas Ema demuestran alguna homología entre sí. Una comparación
de los genes ema demuestra que EmaA y EmaB son 47% homólogas,
sin embargo, debido a la diferencia en sus longitudes previstas es
necesario insertar huecos en la secuencia de EmaA a fin de
alinearlas. Las dos proteínas Ema que son más similares en
estructura, EmaC y EmaD comparten el 48,7% de homología de
aminoácidos entre sí. EmaA/B, EmaC/D y EmaE son cada una \leq20%
de homólogas entre sí.
Se utilizaron secuencias de ema para
buscar los genomas microbianos no anotados (Eubacteria). Las
proteínas Ema previstas se buscaron frente a las traducciones en
los seis marcos (tblast x) de genomas microbianos no anotados
acabados e inacabados disponibles en la página web del National
Center for Biotechnology Information (NCBI). Se identificó el
homólogo del aminoácido segmentario.
EmaA tiene algún homólogo segmentario con S.
pneumoniae, E. faecalis, B. anthracis y C. diptheriae.
EmaB presenta algún homólogo segmentario con B. anthracis.
EmaE presenta homología segmentaria con S. pyogenes y
homología menor con B. anthracis.
Se identificó la homología significativa entre
EmaC y EmaD de GBS y proteínas en otra especie bacteriana. EmaC
presenta homología significativa (55% de identidad sobre 149
aminoácidos) con una zona del cromosoma de S. pneumoniae y
el cromosoma de S. pyogenes (47% de identidad sobre 150
aminoácidos). Se observó homología segmentaria menor en E.
faecalis, S. equi y C. diptheriae. EmaD presenta
homología segmentaria acusada (66% sobre 184 aminoácidos) con una
zona del cromosoma de S. pneumoniae, y menor homología
segmentaria con C. diphtheriae y S. pyogenes.
Los autores han identificado dos homólogos de
Ema en S. pneumoniae. Estos homólogos de S. pneumoniae
presentan homología con EmaC y EmaD y, como EmaC y EmaD, también
demuestran homología con la proteína asociada a franjas de
Actinomyces. El ácido nucleico codificador y la secuencia de
aminoácidos prevista del primer homólogo EmaC/D de S.
pneumoniae se proporcionan en las SEC. ID. nº: 24 y nº: 23,
respectivamente. El ácido nucleico de la zona del genoma que
incluye la secuencia que codifica el primer homólogo se proporciona
en la SEC. ID. nº: 22. El ácido nucleico y la secuencia de
aminoácidos prevista del segundo homólogo de EmaC/D de S.
pneumoniae se proporcionan en la SEC. ID. nº: 27 y nº: 26
respectivamente. El ácido nucleico de la zona genómica de este
segundo homólogo se encuentra en la SEC. ID. nº: 25. Se ha
identificado un homólogo de EmaC/D en Enterococcus faecalis
mediante reconocimiento y análisis. La secuencia de aminoácidos
prevista del homólogo de EmaC/D de E. faecalis se
proporciona en la SEC. ID. nº: 29. La secuencia de ácido nucleico
que codifica este homólogo de Ema de E. faecalis se
proporciona en la SEC. ID. nº: 30. La secuencia de ácidos nucleicos
de E. faecalis cuya zona genómica codifica el homólogo de
EmaC/D se proporciona en la SEC. ID. nº: 28.
Los autores también han identificado un homólogo
de EmaD en Corynebacterium diptheriae. La secuencia de
aminoácidos prevista del homólogo EmaD de C. diptheriae se
proporciona en la SEC. ID. nº: 32. La secuencia de ácidos nucleicos
de C. diptheriae que codifica el homólogo se encuentra en la
SEC. ID. nº: 33. La secuencia de la zona genómica correspondiente
de C. diptheriae se proporciona en la SEC. ID. nº: 31.
Un homólogo de EmaC/D previsto ha sido
identificado en S. pyogenes. La secuencia de aminoácidos
parcial prevista de este homólogo de Ema se proporciona en la SEC.
ID. nº: 37.
Una zona de aminoácidos TLLTCTPYMINS/THRLLVR/KG
(SEC. ID. nº: 34) se encuentra en EmaC de GBS, EmaD de GBS, tanto
en los homólogos EmaC/D de S. pneumoniae como en el homólogo
Ema de E. faecalis. Una secuencia similar
TLVTCTPYGINTHRLLVTA (SEC. ID. nº: 35) se encuentra también en el
homólogo Ema de C. diptheriae. El homólogo Ema previsto de
S. pyogenes también tiene una secuencia similar
TLVTCTPYGVNTKR
LLVRG (SEC. ID. nº: 36).
LLVRG (SEC. ID. nº: 36).
Lo siguiente es una lista de las referencias
citadas en este apartado del Ejemplo.
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\hskip1cm Bohnsack, John
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<120> ÁCIDOS NUCLEICOS DE POLIPÉPTIDOS DE
ESTREPTOCOCOS DEL GRUPO B Y COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS Y VACUNAS
DE LOS MISMOS
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<130>
2511-1-001
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<140> Desconocido
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<141>
2000-08-08
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<160> 37
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 737
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<212> ADN
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<400> 1
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<211> 245
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<213> Streptococcus agalactiae
\newpage
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<400> 2
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<212> ADN
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<213> Streptococcus agalactiae
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<400> 3
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<213> Streptococcus agalactiae
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<211> 21
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<213> Secuencia artificial
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artificial: oligonucleótido
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artificial: oligonucleótido
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: oligonucleótido
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<213> Streptococcus agalactiae
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: consenso
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<223> X puede ser un aminoácido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<213> Streptococcus agalactiae
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: consenso
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: consenso
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<220>
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<223> X puede ser un aminoácido.
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<211> 2714
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<212> PRT
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<210> 25
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<211> 3010
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 25
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 304
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<212> PRT
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<213> Streptococcus pneumoniae
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\newpage
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<210> 27
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<211> 915
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<212> ADN
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<213> Streptococcus pneumoniae
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<400> 27
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<210> 28
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<211> 2199
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<212> ADN
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<213> Enterococcus faecalis
\newpage
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<400> 28
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
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<211> 284
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<212> PRT
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<213> Enterococcus faecalis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 29
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<211> 855
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2687
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
diphtheriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 348
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
diphtheriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1047
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
diphtheriae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Consenso/Streptococcus pyogenes
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en posición 12 puede ser asimismo
S/T.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X en posición 18 puede ser asimismo
R/K.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Leu Thr Cys Thr Pro Tyr Met Ile Asn
Xaa His Arg Leu Leu}
\sac{Val Xaa Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Corynebacterium
diphtheriae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Val Thr Cys Thr Pro Tyr Gly Ile Asn
Thr His Arg Leu Leu}
\sac{Val Thr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Val Thr Cys Thr Pro Tys Gly Val Asn
Thr Lys Arg Leu Leu}
\sac{Val Arg Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 150
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (30)
1. Polipéptido EmaA estreptocócico aislado que
comprende la SEC. ID. nº: 2 y análogos sustancialmente homólogos,
variantes alélicas y fragmentos inmunógenos de las mismas, en el que
el análogo sustancialmente homólogo comparte por lo menos el 70% de
identidad de secuencia con la SEC. ID. nº: 2.
2. Polipéptido según la reivindicación 1,
marcado con un marcador detectable.
3. Vacuna o composición inmunógena que comprende
un polipéptido según la reivindicación 1, y un adyuvante
farmacéuticamente aceptable.
4. Vacuna o composición inmunógena según la
reivindicación 3, que comprende además por lo menos un antígeno
seleccionado de entre:
- a.
- polipéptido Spb1 o un fragmento inmunógeno del mismo;
- b.
- polipéptido Spb2 o un fragmento inmunógeno del mismo;
- c.
- polipéptido antígeno alfa de la proteína C o un fragmento inmunógeno del mismo;
- d.
- polipéptido Rib o un fragmento inmunógeno del mismo;
- e.
- polipéptido Lmb o un fragmento inmunógeno del mismo;
- f.
- polipéptido C5a-asa o un fragmento inmunógeno del mismo;
- g.
- polisacáridos u oligosacáridos estreptocócicos del Grupo B.
5. Composición farmacéutica que comprende un
polipéptido según la reivindicación 1, y un portador
farmacéuticamente aceptable.
6. Composición farmacéutica según la
reivindicación 5, que comprende además un ingrediente activo
seleccionado de entre:
- a.
- los polipéptidos Spb1 y Spb2;
- b.
- el antígeno alfa de la proteína C;
- c.
- el polipéptido Rib;
- d.
- el polipéptido Lmb;
- e.
- el polipéptido C5a-asa;
- f.
- un polisacárido u oligosacárido estreptocócico del Grupo B; y
- g.
- una vacuna antiestreptocócica.
7. Anticuerpo purificado contra un polipéptido
según la reivindicación 1.
8. Anticuerpo monoclonal contra un polipéptido
según la reivindicación 1.
9. Estirpe celular inmortal que produce un
anticuerpo monoclonal según la reivindicación 8.
10. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones 8 ó 9 marcado con un marcador detectable.
11. Anticuerpo según la reivindicación 10, en el
que el marcador se selecciona de entre una enzima, un producto
químico que emite fluorescencia y un elemento radioactivo.
12. Composición farmacéutica que comprende uno o
más anticuerpos contra un polipéptido según la reivindicación 1, y
un portador farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica según la
reivindicación 12, que comprende además un anticuerpo contra una
proteína seleccionada de entre Spb1, Spb2, Rib, Lmb,
C5a-asa y antígeno alfa con proteína C.
14. Ácido nucleico aislado que codifica un
polipéptido según la reivindicación 1.
15. Ácido nucleico según la reivindicación 14,
en el que el ácido nucleico se selecciona de entre:
- a.
- la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1.
- b.
- una secuencia de ADN que se hibrida con la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1 en condiciones de hibridación de severidad moderada;
- c.
- una secuencia de ADN capaz de codificar por lo menos una de las secuencias de aminoácidos codificada por una secuencia de ADN de (a) o (b);
- d.
- una variante degenerada de la misma;
- e.
- un alelo de la misma; y
- f.
- un fragmento de la misma que se hibrida con la secuencia de ADN de SEC. ID. nº: 1 en condiciones de hibridación normales.
16. Vector que comprende el ácido nucleico según
la reivindicación 14 y un activador.
17. Vector según la reivindicación 16, en el que
el activador comprende un activador bacteriano, de levadura, de
insecto o de mamífero.
18. Vector según la reivindicación 16 ó 17, en
el que el vector es un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial
de levadura (YAC), un bacteriófago o un ADN vírico eucariótico.
19. Sistema de vector huésped para la producción
de un polipéptido que comprende el vector según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18 en una célula huésped adecuada.
20. Sistema de vector huésped según la
reivindicación 19, en el que la célula huésped adecuada comprende
una célula procariótica o eucariótica.
21. Molécula de ADN recombinante que comprende
el ácido nucleico según la reivindicación 14.
22. Molécula de ADN recombinante según la
reivindicación 21, en la que la molécula de ADN está operativamente
ligada a una secuencia de control de expresión.
23. Huésped unicelular transformado con una
molécula de ADN recombinante según la reivindicación 21 ó 22.
24. Vacuna de ácido nucleico que comprende la
molécula de ADN recombinante según la reivindicación 21 ó
22.
22.
25. Procedimiento para detectar la presencia de
un polipéptido según la reivindicación 1, en el que el polipéptido
se mide mediante:
- a.
- puesta en contacto de una muestra en la que se supone la presencia o actividad del polipéptido, con un anticuerpo contra dicho polipéptido en condiciones que permitan que se produzca la unión del polipéptido con el anticuerpo; y
- b.
- detección de si se ha producido la unión entre el polipéptido procedente de la muestra y el anticuerpo;
en el que la detección de la unión
indica la presencia o actividad del polipéptido en la
muestra.
26. Procedimiento para detectar la presencia de
una bacteria que presenta un gen que codifica un polipéptido según
la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento:
- a.
- poner en contacto una muestra, en la que se supone la presencia o actividad de la bacteria, con un oligonucleótido que se hibrida con el gen del polipéptido, en condiciones que permiten que se produzca la hibridación específica del oligonucleótido con el gen; y
- b.
- detectar si se ha producido la hibridación entre el oligonucleótido y el gen;
en el que la detección de la
hibridación indica la presencia o actividad de la bacteria en la
muestra.
27. Utilización de la vacuna o composición
inmunógena de la reivindicación 3 ó 4, en la preparación de un
medicamento destinado a la prevención de una infección con una
bacteria que expresa un polipéptido según la reivindica-
ción 1.
ción 1.
\newpage
28. Utilización de la composición farmacéutica
según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 12 ó 13, en la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una
infección con una bacteria que expresa un polipéptido según la
reivindicación 1.
29. Utilización de la composición farmacéutica
según la reivindicación 5 ó 6, en la preparación de un medicamento
destinado a la provocación de una respuesta inmunitaria en un objeto
que ha sido expuesto o infectado con una bacteria
estreptocócica.
30. Utilización de la composición farmacéutica
según la reivindicación 12 ó 13, en la preparación de un medicamento
destinado a la prevención de una infección por una bacteria
estreptocócica.
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