KR20140005892A - 면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 완화시키는 신규한 제제 - Google Patents

면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 완화시키는 신규한 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 완화시키는, 특히 폴리사카리드-단백질 접합체를 갖는 신규한 제제를 제공한다. 구체적으로, 신규한 제제는 폴리소르베이트 80을 포함하는 이전에 사용된 계면활성제보다 유의한 이점을 제공하는 1100 내지 17,400의 분자량 범위 내의 폴록사머를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 15개의 뚜렷한 폴리사카리드-단백질 접합체 및 폴록사머를 갖는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 각각 접합체는 담체 단백질, 바람직하게는 CRM197에 접합된 여러 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae) (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 또는 33F)로부터 제조된 피막 폴리사카리드로 이루어진다.
<대표도>
도 1b

Description

면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 완화시키는 신규한 제제 {NOVEL FORMULATIONS WHICH MITIGATE AGITATION-INDUCED AGGREGATION OF IMMUNOGENIC COMPOSITIONS}
발명의 분야
본 발명은 폴리사카리드-단백질 접합체를 갖는 면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 완화시키는 신규한 제제를 제공한다. 구체적으로, 신규한 제제는 폴리소르베이트 80을 포함하는 이전에 사용된 계면활성제에 비해 유의한 이점을 제공하는 1100 내지 17,400의 분자량 범위 내의 폴록사머 계면활성제를 포함한다.
발명의 배경
백신 제제는 일반적으로 안정되어야 하며, 긴 저장 수명 및 다중 투여량 용기의 용도에 대한 필요성에 부응하기 위해 균일한 일관성을 가져야 한다. 폴리사카리드-단백질 접합체를 포함하는 단백질을 기반으로 하는 백신은 침전된 단백질 생성물의 비이용성으로 인한 백신의 효과적인 더 낮은 총 농도를 야기할 수 있는 단백질 응집 및 침전에 적용된다. 폴리사카리드-단백질 접합체 백신은 특히, 담체 단백질 단독보다 응집에 대한 더 강한 성향을 갖는 것으로 나타난다. 문헌 [Berti et al., 2004, Biophys J 86:3-9]를 참조한다.
폴리사카리드-단백질 접합체 백신을 위한 제제의 선택은 단백질 응집에 큰 영향을 줄 수 있다. 문헌 [Ho et al., 2001, Vaccine 19:716-725]를 참조한다. 예를 들면, 소르비톨은 수분-유도된 응집을 감소시키는 것으로 발견되었으며 (문헌 [Schwendeman et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:11234-11238]을 참조함), 폴리소르베이트 80 및 알루미늄 포스페이트 둘 다는 폴리사카리드-단백질 접합체의 침전을 억제하는 것으로 나타났다 (미국 특허 출원 공개 번호 2007/0253984 A1을 참조함).
당업계에 안정성을 증대시키고, 폴리사카리드-단백질 접합체를 갖는 면역원성 조성물의 응집/침전을 억제하는 추가의 백신 제제에 대한 계속되는 필요성이 있다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 폴리사카리드-단백질 접합체를 갖는 면역원성 조성물의 진탕-유도된 응집을 억제하는 신규한 제제에 관한 것이다. 본 발명의 제제는 인자, 예를 들면 규소 오일 상호작용, 전단력, 해운 진탕, 열 안정성 등에 대해 면역원성 조성물을 안정화시킨다.
따라서, 본 발명은 (i) 5.0 내지 8.0의 pH 범위를 갖는 pH 완충 염 용액, (ii) 1100 내지 17,400의 범위의 분자량을 갖는 폴록사머 및 (iii) 하나 이상의 폴리사카리드-단백질 접합체를 포함하는 제제에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 폴록사머는 7,500 내지 15,000 또는 7,500 내지 10,000의 범위의 분자량을 갖는다. 특정 실시양태에서, 제제의 폴록사머는 폴록사머 124, 폴록사머 188, 폴록사머 237, 폴록사머 338 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 특정 실시양태에서, 폴록사머는 폴록사머 188 또는 폴록사머 237이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.001% 내지 5% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.025% 내지 4%, 0.025% 내지 1%, 0.025% 내지 0.5%, 또는 0.025% 내지 0.15% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.05% 내지 4%, 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 0.5%, 또는 0.05% 내지 0.15% 중량/부피이다. 다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1.0% 또는 5.0% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머 188의 최종 농도는 제제의 0.05% 내지 1.0% 중량/부피 또는 제제에서의 폴록사머 237의 최종 농도는 제제의 0.1% 내지 1.0% 중량/부피이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제제의 pH 완충 염 용액은 5.2 내지 8.0, 5.2 내지 7.5, 또는 5.8 내지 7.0의 pH를 갖는 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘, 아세테이트, 시트레이트, MES, MOPS, TRIS 또는 HEPES이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 1 mM 내지 50 mM의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 완충제는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도에서의 히스티딘이다. 하나의 특정 실시양태에서, 히스티딘 완충제의 최종 농도는 20 mM이다.
특정 실시양태에서, pH 완충 염 용액에서의 염은 마그네슘 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 염화나트륨 또는 그의 조합을 포함한다. 하나의 특정 실시양태에서, pH 완충 염 용액에서의 염은 염화나트륨이다. 하나의 실시양태에서, 염은 20 mM 내지 170 mM의 농도로 존재한다.
특정 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제의 단백질은 CRM197, 파상풍 톡소이드, 콜레라 톡소이드, 백일해 톡소이드, 이. 콜라이(E. Coli) 열 민감 톡소이드 (LT), 폐렴구균용혈소 톡소이드, 폐렴구균성 표면 단백질 A (PspA), 폐렴구균성 아드헤진 단백질 A (PsaA), 스트렙토코커스(Streptococcus)로부터의 C5a 펩티다제, 헤모필루스 인플루엔자(헤모필러스 인플루엔자) 단백질 D, 난알부민, 키호울 림페트 헤모시아닌(keyhole limpet haemocyanin) (KLH), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) (BSA) 및 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 제제의 폴리사카리드-단백질 접합체는 하나 이상의 폐렴구균성 폴리사카리드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 폐렴구균성 폴리사카리드는 에스. 뉴모니에(S. pneumoniae) 혈청형 1 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 2 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 8 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 9N 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 10A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 11A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 12F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 15B 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 17F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 20 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 22F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, 및 에스. 뉴모니에 혈청형 33F 폴리사카리드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 1 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 22F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, 및 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 33F 폴리사카리드를 포함하는 15가 폐렴구균성 접합체 (15vPnC) 제제이다.
특정 실시양태에서, 제제는 아쥬반트를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에서, 아쥬반트는 알루미늄-기반 아쥬반트, 예를 들면 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 술페이트이다. 하나의 특정 실시양태에서, 알루미늄 아쥬반트는 알루미늄 포스페이트이다. 특정 실시양태에서, 제제는 0.001 mg 내지 0.250 mg 원소 알루미늄을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 0.001 mg 내지 0.250 mg 원소 알루미늄, 바람직하게는 0.112 mg 내지 0.130 mg 원소 알루미늄, 140 내지 160 mM 염화나트륨 및 18 내지 22 mM L-히스티딘 완충제를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 제제는 3.6 내지 4.4 μg에서의 6B를 제외한 1.8 내지 2.2 μg의 각각의 사카리드; 약 32 μg CRM197 담체 단백질; 0.125 mg의 원소 알루미늄 (0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 아쥬반트; 150 mM 염화나트륨 및 20 mM L-히스티딘 완충제를 함유하도록 제제화된 단일 0.5 mL 투여량인 제제이다.
특정 실시양태에서, 제제는 m-크레솔, 페놀, 2-페녹시에탄올, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 또는 티메로살인 보존제를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 바이알, 바이알 마개, 바이알 봉합(closure), 유리 봉합, 고무 봉합, 플라스틱 봉합, 예비-충전된 주사기를 포함하는 주사기, 주사기 마개, 주사기 플렁거(plunger), 플라스크, 비이커, 눈금 실린더, 발효기, 생물반응기, 고무관, 파이프, 봉투(bag), 병, 앰플, 카트리지 및 일회용 펜으로 이루어진 군으로부터 선택된 용기 수단 내에 함유된다. 특정 실시양태에서, 용기 수단은 규소화되고, 바람직하게는 베이크드-온(baked-on)된다.
도면의 간단한 설명
도 1a-c: 4℃ (A) 및 37℃ (B)에서 진탕을 한 pH 5.8 제제 및 진탕을하지 않은 pH 5.8 제제에 대한 크기 분포.
도 2a-b: 4℃ (A) 및 37℃ (B)에서 진탕을 한 0.1% (w/v) 폴록사머 188 제제 및 진탕을하지 않은 0.1% (w/v) 폴록사머 188 제제로의 pH 5.8에 대한 크기 분포이다.
도 3a-b: 4℃ (A) 및 (B)에서 진탕을 한 0.1% (w/v) 폴록사머 188 제제 및 진탕을 하지 않은 0.1% (w/v) 폴록사머 188 제제로의 pH 7.0에 대한 크기 분포이다.
도 4a-b: 4℃ (A) 및 37℃ (B)에서 진탕을 한 0.1% (w/v) 폴록사머 188, 6% (w/v) 수크로스 및 50mM NaCl 제제 및 진탕을 하지 않은 0.1% (w/v) 폴록사머 188, 6% (w/v) 수크로스 및 50mM NaCl 제제로의 pH 7.0에 대한 크기 분포이다.
도 5a-d: pH 5.8 제제로부터의 ISTA 표준 해운 연구(Standard Shipping Study) (A) 수행 1, (B) pH 5.8 제제로부터의 수행 2, (C) 0.1% 폴록사머 188로의 pH 5.8 제제로부터의 수행 1, (D) 0.1% 폴록사머 188로부터의 수행 2 후의 0.1% 폴록사머 188의 존해하의 pH 5.8 제제에 대한 크기 분포 및 0.1% 폴록사머 188의 부재하의 pH 5.8 제제에 대한 크기 분포.
도 6a-c: 하기 조건하에 진탕을 한 pH 5.8, 37℃에서의 크기 분포 및 진탕을 하지 않은 pH 5.8, 37℃에서의 크기 분포: 0.1% (w/v) 폴록사머 188 (A)의 부재하의 m-크레솔, 0.1% (w/v) 폴록사머 188의 부재하의 m-크레솔, 및 0.1% (w/v) 폴록사머 188 (C)의 존재하의 페놀.
도 7: 37℃에서 진탕을 한 0.1% (w/v) 폴록사머 237 제제 및 진탕을하지 않은 0.1% (w/v) 폴록사머 237 제제로의 pH 5.8에 대한 크기 분포.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로, 폴리사카리드-단백질 접합체를 함유하는 제제에서의 계면활성제로서의 폴록사머의 사용은 진탕 유도된 응집을 완화시키고, 다른 계면활성제 예를 들면, 폴리소르베이트보다 예상외로 우수한 특성을 제공한다는 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 당업계에 면역원성 조성물 예를 들면, 폴리사카리드-단백질 접합체의 미립자 형성 (예를 들면, 응집, 침전)의 안정성을 개선시키고 억제하는 계속되는 필요성을 논한다.
실시예에 기재된 바와 같이, 초기 연구는 0.1% (w/v)의 농도에서의 폴록사머 188의 백신 제제에의 첨가는 열, 기계적 부하, 등 후 입단의 형성을 완화시킬 수 있는지에 대해 조사하였다. 다중 진탕 연구 및 시뮬레이션된 해운 연구 (ISTA 표준 시험(Standard Testing))는 현재의 ISTA 표준 방법을 사용한 회전 교반 및 시뮬레이션된 해운 연구 후 응집을 완화시키는 폴록사머 188의 능력을 나타냈다.
따라서, 본 발명은 pH 완충 염 용액을 포함하는 폴리사카리드-단백질 접합체를 갖는 제제를 안정화시키는 제제, 1100 내지 17,400의 분자량을 갖는 폴록사머 및 하나 이상의 폴리사카리드-단백질 접합체에 관한 것이며, 여기서 완충제는 5.0 내지 8.0의 pH를 가진다. 특정 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 용기 수단 내에 포함된다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "CpG-함유 뉴클레오티드," "CpG-함유 올리고뉴클레오티드," "CpG 올리고뉴클레오티드," 및 유사 용어는 비메틸화된 CpG 모이어티를 함유하는 6-50개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 예를 들면, 문헌 [Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297]을 참조한다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "폴리사카리드"는 "사카리드", "올리고사카리드", "폴리사카리드", "리포사카리드", "리포-올리고사카리드 (LOS)", "리포폴리사카리드 (LPS)", "글리코실레이트", "글리코접합체" 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 면역학적 및 세균성 백신 업계에서 흔히 사용되는 임의의 항원성 사카리드 요소 (또는 항원성 단위)를 포함할 것을 의도한다.
본원에 정의된 바와 같이, "폴리사카리드-단백질 접합체", "폐렴구균성 접합체", "7가 폐렴구균성 접합체 (7vPnC)", "13가 폐렴구균성 접합체 (13vPnC)", 및 "15가 폐렴구균성 접합체 (15vPnC)"는 액체 제제, 냉동 액체 제제 및 고체 (예를 들면, 냉동-건조되거나 또는 동결건조된) 제제를 포함한다. 용어 "PCV15"는 또한 15가 폐렴구균성 접합체를 지칭하며, 용어 15vPnC와 구별없이 사용된다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "침전", "침전되다" "미립자 형성", "클라우딩(clouding)" 및 "응집"은 구별없이 사용될 수 있으며, 폴리사카리드-단백질 접합체의 "응집"을 야기하는 임의의 물리적 상호작용 또는 화학적 반응을 지칭함을 의도한다. 응집 (예를 들면, 단백질 응집)의 절차는 종종 열, 압력, pH, 진탕, 전단력, 동결-융해, 탈수, 중금속, 페놀성 화합물, 규소 오일, 변성제 등을 포함하는 많은 물리화학적 부하에 의해 영향받는다.
본원에 정의된 바와 같이, 본 발명의 "계면활성제"는 면역원성 조성물 제제의 표면 장력을 낮추는 임의의 분자 또는 화합물이다.
폴록사머는 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개의 친수성 쇄의 측면에 있는 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중심 소수성 쇄로 이루어진 비이온성 삼중블록 공중합체이다. 폴록사머는 또한 상표명 플루로닉(Pluronic)(등록상표)으로 알려져 있다. 중합체 블록의 길이가 주문 제작될 수 있기 때문에, 약간 상이한 특성을 갖는 많은 상이한 폴록사머가 존재한다. 포괄적인 용어 "폴록사머"에 대해, 이들 공중합체는 흔히 글자 "P" (폴록사머를 의미함), 이어서 3개의 숫자로 명명되며, 초기 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 핵의 대략적인 분자 질량을 제공하며, 마지막 숫자 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량 (예를 들면, P407 = 4,000 g/몰의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 70% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 폴록사머)을 제공한다. 플루로닉 상표명에 대해, 이들 공중합체의 코딩(coding)은 실온에서의 그의 물리적 형태를 정의하기 위한 글자 (L = 액체, P = 페이스트(paste), F = 박편(flake) (고체))로 개시되며, 이어서 2개 또는 3개의 숫자가 따른다. 수적 지정 내의 처음 숫자 (3-자리 수 내의 2개의 숫자)를 300으로 곱한 것은 소수물질의 대략적인 분자량을 나타내며; 마지막 숫자 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량을 제공한다 (예를 들면, L61 = 1,800 g/몰의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 10% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 플루로닉(등록상표)). 미국 특허 번호 3740421을 참조한다.
폴록사머의 예는 하기 일반 화학식을 갖는다:
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH,
상기 식에서, a 및 b 블록은 하기 값을 갖는다:
Figure pct00001
본원에 사용된 바와 같이, 분자량 단위는 달톤 (Da) 또는 g/몰이다.
특정 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.001% 내지 5% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.025% 내지 4%, 0.025% 내지 1%, 0.025% 내지 0.5%, 또는 0.025% 내지 0.15% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.05% 내지 4%, 0.05% 내지 1%, 0.05% 내지 0.5%, 또는 0.05% 내지 0.15% 중량/부피이다. 다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머의 최종 농도는 제제의 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1.0% 또는 5.0% 중량/부피이다. 또다른 실시양태에서, 제제에서의 폴록사머 188의 최종 농도는 제제의 0.05% 내지 1.0% 중량/부피이거나 또는 제제에서의 폴록사머 237의 최종 농도는 제제의 0.1% 내지 1.0% 중량/부피이다.
계면활성제는 바람직하게는 담체 단백질에 접합되지 않는다.
제제는 또한 pH-완충 염 용액을 함유한다. 완충제는 예를 들면, TRIS, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글라이시네이트, 히스티딘, 글라이신, 숙시네이트, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 및 트리에탄올아민 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 완충제는 용액을 4 내지 10, 5.2 내지 7.5, 또는 5.8 내지 7.0의 범위의 pH로 완충시킬 수 있다. 완충제는 추가로, 예를 들면, 특히, 제약 제제가 비경구적 사용을 위한 것인 경우 비경구적 사용을 위한 USP 호환성 완충제로부터 선택될 수 있다. 완충제의 농도는 1 mM 내지 50 mM 또는 5 mM 내지 50 mM의 범위일 것이다.
염 용액 (즉, NaCl을 함유하는 용액)이 바람직한 반면, 제제에 대해 적합한 다른 염은 CaCl2, KCl 및 MgCl2를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 비-이온성 등장성 제제는 염 대신 사용될 수 있다. 적합한 염 범위는 25 mM 내지 500 mM 또는 40mM 내지 170mM을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
바람직한 실시양태에서, 백신 조성물은 염화나트륨과 함께 L-히스티딘 완충제 중에 제제화된다.
본 발명의 제제는 또한 추가의 계면활성제를 함유할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (트윈(Tween)으로 흔히 지칭됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 다우팩스(DOWFAXTM)(상표명) 하에 판매되는 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체, 예를 들면 선형 EO/PO 블럭 공중합체; 반복되는 에톡시 (옥소-1,2-에탄디일) 기의 수가 다를 수 있는 옥토크시놀, 특히 옥토크시놀-9 (트리톤(Triton) X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)가 관심의 계면활성제임; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예를 들면 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예를 들면 테르지톨(Tergitol)(상표명) NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알코올 (비알아이제이(Brij) 계면활성제로 알려짐)로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르, 예를 들면 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (비알아이제이 30); 및 소르비탄 에스테르 (스팬으로 흔히 알려짐), 예를 들면 소르비탄 트리올레에이트 (스팬(Span) 85), 및 소르비탄 모노라우레이트를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 제제는 아쥬반트로 추가로 제제화된다. 아쥬반트는 면역원 또는 항원과 함께 투여된 경우 면역 반응을 증대시키는 물질이다. 면역 아쥬반트는 단독으로 투여된 경우 약한 면역원성인 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있으며, 예를 들면 항체 역가 또는 세포-매개된 면역 반응을 유도하지 않거나 또는 약한 항체 역가 또는 세포-매개된 면역 반응을 유도하고, 항원에 대한 항체 역가를 증가시키고/시키거나 개체에서 면역 반응을 달성하기 위해 효과적인 항원의 투여량을 낮춘다. 따라서, 아쥬반트는 종종 면역 반응을 증가시키기 위해 투여되며, 당업자에게 공지되어 있다. 조성물의 효과를 증대시키기 위한 적합한 아쥬반트는 하기를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다:
(1) 알루미늄 염 (알룸(alum)), 예를 들면 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 술페이트 등;
(2) 수중-오일 에멀젼 제제 (다른 특이적 면역자극성 제제, 예를 들면 뮤라밀 펩티드 (N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않음) 또는 세균성 세포벽 성분을 갖거나 또는 갖지 않음), 예를 들면 (a) 미세유동화기, 예를 들면 모델(Model) 110Y 미세유동화기 (Microfluidics, Newton, MA)를 사용한 서브마이크론 입자로 제제화된 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80, 및 0.5% 스팬 85를 함유하는 MF59 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 90/14837) (임의로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함), (b) 서브마이크론 에멀젼으로 미세유동화되거나 또는 더 큰 입도 에멀젼을 발생시키기 위해 볼텍싱된 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121, 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, (c) 미국 특허 번호 4,912,094에 기재된 3-O-디에이레이티드(deaylated) 모노포스포릴리피드 A (MPL(상표명)), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), 및 세포벽 골격 (CWS), 바람직하게는 MPL+CWS (Detox(상표명))로 이루어진 군으로부터 선택된 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 하나 이상의 세균성 세포벽 성분을 함유하는 리비(Ribi)(상표명) 아쥬반트 시스템 (RAS), (Corixa, Hamilton, MT); 및 (d) 몬타니드(Montanide) ISA;
(3) 사포닌 아쥬반트, 예를 들면 퀼(Quil) A 또는 스티뮬론(STIMULON)(상표명) QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (예를 들면, 미국 특허 번호 5,057,540을 참조함)이 사용될 수 있거나 또는 그로부터 생성된 입자, 예를 들면 콜레스테롤, 사포닌, 인지질, 및 양친매성 단백질의 조합에 의해 형성된 미국 특허 번호 5,254,339에 기재된 ISCOM (면역자극성 복합체) 및 이스코매트릭스(Iscomatrix)(등록상표) (ISCOM으로서 본질적으로 동일 구조를 갖지만 단백질은 없음 (CSL Limited, Parkville, Australia));
(4) 코릭사(Corixa) (Hamilton, Mont.)로부터 구할 수 있으며, 미국 특허 번호 6,113,918에 기재된 세균성 리포폴리사카리드, 합성 지질 A 동족체, 예를 들면 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 동족체; 하나의 상기 AGP는 수성 형태 또는 안정된 에멀젼으로서 제제화되며 또한 529로도 알려진 (이전에 RC529로 알려짐) 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥소-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드임,
(5) 임의의 합성 뉴클레오시드 간(internucleside) 연결기, 변경된 염기 및/또는 변경된 슈가를 사용한 변경된 올리고뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 CpG 모티프(들)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 번호 6,207,646) (예를 들면, 문헌 [Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93]; [Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58]; 및 [Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110]을 참조함);
(6) 사이토카인 및 림포카인, 예를 들면 인터루킨 (예를 들면, 그의 돌연변이체 형태를 포함하는 IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 등; 미국 특허 번호 5,723,127), 인터페론 (예를 들면, α, β 및 γ 인터페론), 과립구 집락 자극 인자 (GCSF), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 집락 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 동시자극적 분자 B7-1 및 B7-2 등, 및 케모카인, 예를 들면 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, 및 RANTES; 및
(7) 상보체, 예를 들면 상보체 성분 C3d의 삼량체.
다른 아쥬반트는 유럽 특허 번호 1,296,713 및 1,326,634에 기재된 암피젠, 아브리딘, L121/스쿠알렌, D-락티드-폴리락티드/글리코시드, 플루로닉 폴리올, 뮤라밀 디펩티드, 사멸된 보르데텔라(Bordetella), 결핵균, IC-31 (Intercell AG, Vienna, Austria), 백일해 독소 (PT), 또는 이. 콜라이 열-민감 독소 (LT), 특히 LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129를 포함한다; 예를 들면, 국제 특허 공개 번호 WO 93/13302 및 WO 92/19265를 참조한다.
또다른 실시양태에서, 아쥬반트는 2, 3, 또는 그 이상의 상기 아쥬반트, 예를 들면,. SBAS2의 혼합물 (또한 3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A 및 QS21 함유 수중-오일 에멀젼)이다.
특정 실시양태에서, 아쥬반트는 알루미늄 염이다. 알루미늄 염 아쥬반트는 알룸-침전된 백신 또는 알룸-흡착된 백신일 수 있다. 알루미늄-염 아쥬반트는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 문헌 [Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)] 및 문헌 [Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)]에 기재되어 있다. 알루미늄 염은 수화 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 삼수화물 (ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 삼수화물, 알히드로겔, 수퍼포스, 암포겔, 알루미늄 (III) 히드록시드, 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트 (알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)), 무정형 알루미나, 삼수화 알루미나, 또는 트리히드록시알루미늄을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 알루미늄 클로라이드 및 나트륨 포스페이트를 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시키기 위해 1:1 부피 비율로 혼합함으로써 제조된다. 혼합 절차 후, 물질은 2-8 μm의 범위의 표적 총 입도를 달성하기 위해 높은-전단 혼합기로 크기-감소된다. 생성물은 이어서 생리학적 염에 대해 철저여과되며, 스팀 멸균된다.
특정 실시양태에서, 시판되는 Al(OH)3 (예를 들면, 웨스트베리, 뉴욕(Westbury, NY)에 소재한 덴마크/아큐레이트 케미칼 앤드 사이언티픽 코.(Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.)의 알히드로겔 또는 수퍼포스)이 단백질을 50 - 200 g 단백질/mg 알루늄 히드록시드의 비율로 흡착하도록 사용된다. 단백질의 흡착은 또다른 실시양태에서, 단백질의 pI (등전 pH) 및 배지의 pH에 의존한다. 더 낮은 pI를 갖는 단백질은 더 높은 pI를 갖는 단백질보다 더 강하게 양전하로 하전된 알루미늄 이온에 흡착된다. 알루미늄 염은 2-3주의 기간 동안 천천히 방출되는 Ag의 데포(depot)를 확립할 수 있고, 대식세포 및 상보체 활성화의 비특이적 활성화에 관여할 수 있고/있거나 선천 면역 기전을 자극할 수 있다 (아마 요산의 자극을 통함). 예를 들면, 문헌 [Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23]을 참조한다.
본 발명의 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 임의의 공지된 폴리사카리드 및 담체 단백질을 포함할 수 있다. 폴리사카리드의 예는 폐렴구균성 폴리사카리드, 나이세리아 폴리사카리드, 및 스트렙토코커스(strepotococcus) 폴리사카리드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 폐렴구균성 폴리사카리드는 에스. 뉴모니에 혈청형 1 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 2 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 8 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 9N 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 10A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 11A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 12F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 15B 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 17F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 20 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 22F 폴리사카리드, 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, 및 에스. 뉴모니에 혈청형 33F 폴리사카리드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 특히 에스. 뉴모니에의 다중 혈청형으로부터 수득된 폴리사카리드를 함유하는 다가 폐렴구균성 폴리사카리드-단백질 접합체 백신을 위해 적합하다. 7가 폐렴구균성 접합체 백신, 프레브나르(Prevnar)(등록상표)는 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F로부터의 폴리사카리드를 함유한다. 미국 특허 출원 공개 번호 미국 2006/0228380 A1은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함하는 13가 폐렴구균성 접합체 백신을 기재한다. 중국 특허 출원 공개 번호 CN 101590224 A는 혈청형 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함하는 14가 폐렴구균성 접합체 백신을 기재한다. 미국 가 특허 출원 번호 61/302726은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 포함하는 15가 폐렴구균성 접합체 백신을 기재한다.
특정 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드 및 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드를 포함하는 7가 폐렴구균성 접합체 (7vPnC) 제제이다.
특정 다른 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 1 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드 및 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드를 포함하는 13가 폐렴구균성 접합체 (13vPnC) 제제이다.
하나의 실시양태에서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제는 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 1 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 22F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, 및 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 33F 폴리사카리드를 포함하는 15가 폐렴구균성 접합체 (15vPnC) 제제이다.
스트렙토코커스 뉴모니에(Steptococcus pneumoniae)로부터의 피막 폴리사카리드는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 폴리사카리드는 박테리아로부터 단리될 수 있으며, 공지된 방법 및 바람직하게는 미세유동화에 의해 어느 정도 사이징(size)될 수 있다 (예를 들면, 유럽 특허 번호 EP497524 및 EP497525를 참조함). 폴리사카리드는 폴리사카리드 샘플에서의 점도를 감소시키기 위해 및/또는 접합된 생성물에 대한 여과성을 개선시키기 위해 사이징될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 각각 폐렴구균성 폴리사카리드 혈청형은 콩-기반 배지에서 성장된다. 개체 폴리사카리드는 이어서 원심분리, 침전, 및 초미세-여과를 포함하는 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들면, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 및 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다.
담체 단백질은 바람직하게는 비-독성 및 비-반응원성이고, 충분한 양 및 순도로 수득 가능한 단백질이다. 담체 단백질은 폴리사카리드의 면역원성을 증대시키기 위해 에스. 뉴모니에 폴리사카리드와 접합되거나 또는 연결될 수 있다. 담체 단백질은 표준 접합 절차로 처리될 수 있어야 한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, CRM197은 담체 단백질로서 사용된다. 하나의 실시양태에서, 각각 피막 폴리사카리드는 동일한 담체 단백질에 접합된다 (각각 피막 폴리사카리드 분자는 단일 담체 단백질에 접합됨). 또다른 실시양태에서, 피막 폴리사카리드는 2개 이상의 담체 단백질에 접합된다 (각각 피막 폴리사카리드 분자는 단일 담체 단백질에 접합됨). 이러한 실시양태에서, 동일 혈청형의 각각 피막 폴리사카리드는 전형적으로 동일 담체 단백질에 접합된다.
CRM197은 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다. 하나의 실시양태에서, 이는 카스아미노산 및 효모 추출물-기반 배지 중에 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. 또다른 실시양태에서, CRM197은 미국 특허 번호 5,614,382에 기재된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. 전형적으로, CRM197은 초미세-여과, 암모늄 술페이트 침전, 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM197은 페넥스 익스프레션 테크놀로지(Pfenex Expression Technology)(상표명) (Pfenex Inc., San Diego, CA)를 사용하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 중에서 제조된다.
다른 적합한 담체 단백질은 추가의 비활성화된 세균성 독소, 예를 들면 DT (디프테리아 톡소이드), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들면, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 세균성 외막 단백질, 예를 들면 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균성 표면 단백질 A (PspA; 국제 출원 특허 공개 번호 WO 02/091998을 참조함), 폐렴구균성 아드헤진 단백질 (PsaA), A군 또는 B군 스트렙토코커스로부터의 C5a 펩티다제 (예를 들면, 효소적으로 비활성화 스트렙토코커스의 C5a 펩티다제 (SCP), 예를 들면 미국 특허 번호 6,951,653, 미국 특허 번호 6,355,255 및 미국 특허 번호 6,270,775에 기재된 SCP 변이체 중 하나 이상), 또는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 D, 일부 방법으로 해독된 플라이(ply), 예를 들면 dPLY-GMBS (국제 특허 출원 공개 번호 WO 04/081515를 참조함) 또는 dPLY-로프몰을 포함하는 폐렴구균성 폐렴구균용혈소 (문헌 [Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13]), PhtA, PhtB, PhtD, PhtE를 포함하는 PhtX 및 Pht 단백질의 융합, 예를 들면 PhtDE 융합, PhtBE 융합 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/98334 및 WO 03/54007을 참조함)이 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예를 들면 난알부민, 키호울 림페트 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린 (PPD)의 정제된 단백질 유도체, PorB (엔. 메닌자이티디스(N. meningitidis)로부터의 단백질), PD (헤모필러스 인플루엔자 단백질 D; 예를 들면, 유럽 특허 번호 EP 0 594 610 B를 참조함), 또는 그의 면역학적으로 관능성 등가물, 합성 펩티드 (유럽 특허 번호 EP0378881 및 EP0427347을 참조함), 열 충격 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/17712 및 WO 94/03208을 참조함), 백일해 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/58668 및 유럽 특허 번호 EP0471177을 참조함), 사이토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 91/01146을 참조함), 다양한 병원체 유도된 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌 [Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824]를 참조함), 예를 들면 N19 단백질 (문헌 [Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7]을 참조함), 철 흡수 단백질 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 01/72337을 참조함), 씨. 디피사일(C. difficile)의 독소 A 또는 B (국제 특허 공개 번호 WO 00/61761을 참조함), 및 플라젤린 (문헌 [Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9]를 참조함)은 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
다른 DT 돌연변이체, 예를 들면 CRM176, CRM228, CRM 45 (문헌 [Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844]); 니콜스(Nicholls) 및 율(Youle)에 의한 문헌 [Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 및 CRM107 및 다른 돌연변이가 사용될 수 있다; 결실 또는 Glu-148의 Asp, Gln 또는 Ser으로 및/또는 Ala 158의 Gly으로의 돌연변이 및 미국 특허 번호 4,709,017 또는 미국 특허 번호 4,950,740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 하나 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 특허 번호 5,917,017 또는 미국 특허 번호 6,455,673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 미국 특허 번호 5,843,711에 개시된 단편.
정제된 폴리사카리드는 이어서 사카리드가 담체 단백질과 반응할 수 있도록 만들기 위해 화학적으로 활성화된다 (예를 들면, 환원성 아민화를 통함). 활성화된 후, 각각 피막 폴리사카리드는 담체 단백질 (예를 들면, CRM197)에 대한 공지된 커플링 기술에 의해 별도로 접합되어 글리코접합체 (또는 별법으로, 동일 담체 단백질에 접합된 각각의 피막 폴리사카리드)를 형성하며, 단일 투여량 제제로 제제화된다.
하나의 실시양태에서, 폴리사카리드의 화학적 활성화 및 담체 단백질에 대한 후속적인 접합은 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506에 기재된 수단에 의해 달성된다. 간단히, 상기 화학은 말단 히드록실기를 알데히드로 산화시키는 임의의 산화제, 예를 들면 페리오데이트 (나트륨 페리오데이트, 칼륨 페리오데이트, 또는 과요오드산을 포함함)와의 반응에 의해 폐렴구균성 폴리사카리드의 활성화를 수반한다. 반응은 반응성 알데히드기의 형성으로 탄수화물의 인접한 히드록실기의 무작위 산화성 절단으로 이어진다.
하나의 실시양태에서, 단백질 담체 (예를 들면, CRM197)에의 커플링은 단백질의 리실기에의 직접 아민화를 통한 환원성 아민화에 의한 것일 수 있다. 예를 들면, 접합은 활성화된 폴리사카리드 및 담체 단백질의 혼합물을 환원제, 예를 들면 나트륨 시아노보로히드라이드와 반응시킴으로써 수행된다. 반응하지 않은 알데히드는 이어서 강한 환원제, 예를 들면 나트륨 보로히드라이드의 첨가로 캡트(capped)된다.
또다른 실시양태에서, 접합 방법은 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)로의 사카리드의 활성화에 의존하여 시아네이트 에스테르를 형성할 수 있다. 활성화된 사카리드는 따라서 직접 또는 스페이서 (링커(링커))기를 통해 담체 단백질 상의 아미노기에 커플링될 수 있다. 예를 들면, 스페이서는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들면, GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화 담체 단백질 (예를 들면, 요오도아세트이미드 [예를 들면, 에틸 요오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙시니미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후 수득된 티오에테르 연결기를 통해 담체에 커플링될 수 있는 시스타민 또는 시스테아민이 되어 티올화 폴리사카리드를 수득할 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스테르 (임의로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 아디프산 디하이드라자이드 (ADH)와 커플링되며, 아미노-유도체화된 사카리드는 화학 단백질 담체 상의 카르복실기를 통한 카르보디이미드 (예를 들면, EDAC 또는 EDC)를 사용하여 담체 단백질에 접합된다. 이러한 접합체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094; 및 문헌 [Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기재되어 있다.
다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙시니미드, S--NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 다수는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/42721에 기재되어 있다. 접합은 사카리드의 유리 히드록실기와 CDI의 반응 (문헌 [Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18]을 참조함), 이어서 단백질과 반응하여 카르바메이트 연결기의 형성에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커에 관여될 수 있다. 이는 아노머릭(anomeric) 말단의 1차 히드록실기로의 환원, 1차 히드록실기의 임의의 보호/탈보호, CDI 카르바메이트 중간체를 형성하기 위한 CDI와 1차 히드록실기의 반응 및 CDI 카르바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노기의 커플링에 관여할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제제화 전에, 각각 폐렴구균성 피막 폴리사카리드 항원은 반응성 알데히드를 형성하기 위해 활성화된 에스. 뉴모니에로부터 개별적으로 정제되며, 이어서 환원성 아민화를 사용하여 담체 단백질 CRM197에 공유결합으로 접합된다.
피막 폴리사카리드의 담체 단백질에의 접합 후, 폴리사카리드-단백질 접합체는 (폴리사카리드-단백질 접합체의 양에 대해 강화됨) 하나 이상의 다양한 기술에 의해 정제된다. 이들 기술의 예는 당업자에게 공지되어 있으며, 농도/정용여과 작동, 초미세여과, 침전/용출, 칼럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 번호 6,146,902를 참조한다.
개별 글리코접합체가 정제된 후, 이들은 본 발명의 면역원성 조성물을 제제화하기 위해 혼합된다. 이들 폐렴구균성 접합체는 별도의 절차에 의해 제조되며, 단일 투여량 제제로 벌크(bulk) 제제화된다. 본 발명의 폴리사카리드-단백질 접합체의 제제는 당업계-인정된 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들면, 15 개체 폐렴구균성 접합체는 조성물을 제조하기 위해 생리학상 허용가능한 비히클로 제제화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 완충 염, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.
각각 백신 투여량에서의 접합체의 양은 유의한, 부작용 없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 폐렴구균성 혈청형에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 각각 투여량은 각각 폴리사카리드의 0.1 내지 100 μg, 특히 0.1 내지 10 μg, 및 더욱 특히 1 내지 5 μg을 포함할 수 있다. 예를 들면, 각각 투여량은 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 또는 750 ng 또는 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 μg을 포함할 수 있다.
하나의 실시양태에서, 알루미늄 염의 투여량은 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500, 또는 700 μg, 또는 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg 또는 그 이상이다. 또다른 실시양태에서, 상기 기재된 알룸 염의 투여량은 재조합 단백질의 μg 당이다.
특정 백신에 대한 성분의 최적 양은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰과 관련된 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 또다른 실시양태에서, 인간 예방접종을 위한 투여량은 동물 연구로부터 인간 데이터로의 외삽법에 의해 정의된다. 또다른 실시양태에서, 투여량은 경험적으로 정의된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, PCV-15 백신은 개별적으로 CRM197에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F의 폐렴구균성 피막 폴리사카리드의 멸균 액체 제제이다. 각각 0.5 mL 투여량은 4 μg에서의 6B를 제외한 2 μg의 각각의 사카리드; 약 32 μg CRM197 담체 단백질 (예를 들면, 32 μg ± 5 μg, ± 3 μg, ± 2 μg, 또는 ± 1 μg); 0.125 mg의 원소 알루미늄 (0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 아쥬반트; 및 염화나트륨 및 L-히스티딘 완충제를 함유하도록 제제화된다. 염화나트륨 농도는 약 150 mM (예를 들면, 150 mM ± 25 mM, ± 20 mM, ± 15 mM, ± 10 mM, 또는 ± 5 mM) 및 약 20 mM (예를 들면, 20 mM ± 5 mM, ± 2.5 mM, ± 2 mM, ± 1 mM, 또는 ± 0.5 mM) L-히스티딘 완충제이다.
폴리사카리드-단백질 접합체는 전형적으로 pH-완충 염에서의 다중 혈청형의 혼합물 내로 합해지며, 이어서 아쥬반트 (염 내에 존재할 수 있음)와 합해진다. 폴록사머는 절차에서의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 절차는 히스티딘, 염, 및 폴록사머에서의 15 혈청형의 혼합물을 합하고, 이어서 이 혼합된 물질을 APA 및 염과 합하는 것으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 제제는 250ug/mL의 APA(알루미늄 포스페이트 아쥬반트)와 5.8의 pH에서의 히스티딘 (20 mM), 염 (150 mM) 및 폴록사머 188 (0.1% w/v)로 이루어진다. 현재의 노력은 5.8 - 7.0의 pH 범위를 조사하였으며, 나열된 제제는 진탕-유도된 응집을 완화시킨다는 것을 나타냈다. 폴록사머 188에 대한 범위 결과는 현재 진행 중이며 0.025 내지 0.15%의 범위를 조사하고 있다.
본 발명의 조성물은 또한 에스. 뉴모니에로부터의 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 봉입을 위해 적합한 에스. 뉴모니에 단백질의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083855 및 WO 02/053761에 나타낸 단백질을 포함한다.
상기 기재된 제제는 또한 하나 이상의 추가의 제약상 허용가능한 희석제, 부형제 또는 제약상 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "제약상 허용가능한 담체"는 인간 또는 다른 척추동물 숙주에의 투여와 호환성인 임의의 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅, 항세균성 및 항진균성 제제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함하도록 의도된다. 적절한 담체는 당업자에게 자명하며, 대체로 투여 경로에 의존할 것이다.
액체 제제에 대한 제약상 허용가능한 담체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 오일이다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 (물에 추가로) 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 오일의 예는 동물, 식물, 또는 합성 기원, 예를 들면, 땅콩 오일, 대두 오일, 올리브 오일, 해바라기 오일, 어류-간 오일, 또다른 해양 오일, 또는 우유 또는 달걀로부터의 지질의 오일이다.
면역원성 조성물 제제 내에 존재할 수 있는 부형제는 보존제, 화학적 안정화제 및 현탁제 또는 분산제를 포함하나 이들로 한정되지는 않는다. 전형적으로, 안정화제, 보존제 등은 표적된 수취인 (예를 들면, 인간 대상체)에서의 효능에 대한 가장 좋은 제제를 정의하는데 최적화되었다. 보존제의 예는 m-크레솔, 2-페녹시에탄올, 벤질 알코올, 티메로살, 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 황 디옥시드, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 및 파라클로로페놀을 포함한다. 안정화 성분의 예는 카스아미노산, 수크로스, 젤라틴, 페놀 레드, N-Z 아민, 모노칼륨 디포스페이트, 락토스, 락트알부민 히드로리세이트, 및 건조 우유를 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 제제는 예를 들면, 액체, 분말, 에어로졸, 정제, 캡슐, 장용성 정제 또는 캡슐, 또는 좌제의 형태로 인간 대상체에의 투여를 위해 제조된다. 따라서, 면역원성 조성물 제제는 또한 오일성 또는 수성 비히클, 페이스트 중의 현탁액, 용액, 에멀젼, 및 이식가능한 서방형 또는 생물분해성 제제를 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지는 않는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 제제는 경구 투여되며, 따라서 즉, 고체 또는 액체 제제로서 경구 투여를 위해 적합한 형태로 제제화된다. 고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 알약, 과립, 펠렛 등을 포함한다. 액체 경구 제제는 용액, 현탁액, 분산제, 에멀젼, 오일 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제제는 단일 투여량 바이알, 다중-투여량 바이알 또는 예비-충전된 주사기이다.
본 발명의 면역원성 조성물은 상기 기재된 유형의 제약 제제에 유용한 통상적인, 생리학상 허용가능한 담체, 희석제 및 부형제, 예를 들면 용매, 완충제, 아쥬반트, 또는 다른 성분의 선택에 의해 제한되지 않는다. 상기-기재된 성분으로부터의 적절한 pH, 등장도, 안정성 및 다른 통상적인 특징을 갖는 이들 제약상 허용가능한 조성물의 제조는 당업자의 능력 내에 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 용기 수단 중에 포함된 면역원성 조성물의 제제에 관한 것이다. 본원에 정의된 바와 같이, 본 발명의 "용기 수단"은 면역원성 조성물의 연구, 공정, 개발, 제제화, 제조, 저장 및/또는 투여 중 "함유", "수용", "혼합(mix)", "혼합(blend)", "조제", "주사", "전달", "분무" 등에 사용되는 물질의 임의의 조성물을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 용기 수단은 일반 실험실 유리제품, 플라스크, 비이커, 눈금 실린더, 발효기, 생물반응기, 고무관, 파이프, 봉투, 병, 바이알, 바이알 봉합 (예를 들면, 고무 마개, 스크류 온 캡(screw on cap)), 앰플, 주사기, 주사기 마개, 주사기 플렁거, 고무 봉합, 플라스틱 봉합, 유리 봉합 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 용기 수단은 제조의 물질에 의해 제한되지 않으며, 물질, 예를 들면 유리, 금속 (예를 들면, 강, 스테인리스 강, 알루미늄 등) 및 중합체 (예를 들면, 열가소성, 탄성중합체, 열가소성-탄성중합체)를 포함한다.
당업자는 상기 제시된 용기 수단은 결코 총망라한 목록은 아니며, 면역원성 조성물의 연구, 공정, 개발, 제제화, 제조, 저장 및/또는 투여 중 면역원 또는 면역원성 조성물의 함유, 수용, 혼합(mix), 혼합(blend), 조제, 주사, 전달, 분무 등에 사용되는 다양한 용기 수단에 대해 당업자에게 가이던스(guidance)로서의 역할을 할 뿐이라는 것을 이해할 것이다. 본 발명에서의 사용이 고려된 추가의 용기 수단은 실험실 장비 판매 회사 및 제조 회사, 예를 들면 유나이티드 스테이트스 플라스틱 코르프.(United States Plastic Corp.) (Lima, Ohio), VWR (West Chester, Pa.), 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences) (Franklin Lakes, N.J.), 피셔 사이언티픽 인터내셔널 인크.(Fisher Scientific International Inc.) (Hampton, N.H.) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) (St. Louis, Mo.)로부터 발행된 카탈로그에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 제제는 조성물의 연구, 공정, 개발, 제제화, 제조, 저장 및/또는 투여의 다양한 단계 전반에 걸쳐 용기 수단 내에 포함된 면역원성 제제의 침전을 안정화시키고, 억제한다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 신규한 제제는 물리적/열 부하 (예를 들면, 온도, 습도, 전단력 등)에 대해 면역원성 조성물을 안정화시킬 뿐 아니라, 이들은 또한 안정성을 증대시키고, 음성 인자에 대해 면역원성 조성물의 침전을 억제하거나 또는 예를 들면, 용기/봉합 시스템 (예를 들면, 규소화 용기 수단)과의 면역원성 조성물의 비호환성에 영향을 준다.
본 발명의 면역원성 조성물의 안정성은 당업자에게 공지되어 있고, 통상적인 표준 기술을 사용하여 쉽게 정의된다. 예를 들면, 면역원성 조성물은 빛 산란, 광학 밀도, 침강 속도 원심분리, 침강 평형 원심분리, 원이색법(CD), 로우리(Lowry) 검정, 비신코니닉산(bicinchoninic acid) (BCA) 검정, 항체 결합 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 방법에 의해 안정성, 응집, 면역원성, 미립자 형성, 단백질 (농도) 손실 등에 대해 검정된다.
수반되는 설명 및 도면에 대한 본 발명의 다양한 실시양태를 기재하였으며, 본 발명은 이들 정확한 실시양태에 제한되지 않으며, 다양한 변화 및 변형은 본 발명의 범주 또는 참뜻으로부터 벗어나지 않고 당업자에 의해 영향받을 것이 이해되어야 한다.
다음 예는 본 발명을 설명하나 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1: 에스. 뉴모니에 캡슐 폴리사카리드의 제조
폐렴구균을 배양하는 방법은 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]를 참조한다. 폐렴구균성 캡슐 폴리사카리드를 제조하는 방법은 또한 업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 유럽 특허 제EP0497524호를 참조한다. 폐렴구균성 서브타입의 단리물은 ATCC로부터 이용가능하다.
이 박테리아는 혈액한천에서 알파-용혈성(alpha-hemolytic)인, 피포성이고, 비-운동성이고, 그램-양성이고, 랜싯-형(lancet-shaped)인 쌍구균(diplococci)인 것으로 식별된다. 서브타입은 특정 항혈청을 사용하여 팽화(Quelling) 반응에 근거하여 구별된다. 예를 들면, 미국 특허 제5,847,112호를 참조한다.
세포 은행
PCV-15 내에 존재하는 에스. 뉴모니에 혈청형의 각각을 대표하는 세포 은행을 머크 균주 수집 (Merck Culture Collection) (Rahway, NJ)으로부터 냉동 바이알 내에 얻었다.
접종
해동한 시드 균주를 적절한 예비-멸균된 성장 배지를 함유하는 시드 발효조로 이동시켰다.
시드 발효
균주를 온도 및 pH를 제어하면서 시드 발효조에서 성장시켰다. 시드 발효조의 전체 부피를 예비-멸균된 성장 배지를 함유하는 성장 발효조로 이동시켰다.
성장 발효
성장 발효는 공정의 최종 세포 성장 단계였다. 온도, pH 및 진탕 속도를 제어하였다.
비활성화
비활성화제의 첨가를 통해 발효 공정을 종결하였다. 비활성화시킨 후, 배치를 제어 온도 및 진탕으로 유지되는 비활성화 탱크로 이동시켰다.
정제
세포 파괴물을 원심분리 및 여과를 조합 사용하여 제거하였다. 배치를 초미세여과 및 정용여과하였다. 그 후 배치를 용매-기반 분별법으로 처리하여 불순물을 제거하고 폴리사카리드를 회수하였다.
실시예 2: 폐렴구균성 폴리사카리드-CRM197 접합체의 제조
활성화 공정
상이한 혈청형 사카리드를 일반적인 공정 흐름을 사용하여 정제된 CRM197 담체 단백질에 개별적으로 접합시킨다. 본 공정에서 사카리드를 용해시키고, 표적 분자량으로 사이징하고, 화학적으로 활성화시키고, 초미세여과로 완충제-교환시킨다. 정제된 CRM197을 그 후 활성화된 사카리드와 접합시키고, 생성된 접합체를 초미세여과 후 최종 0.2 μm 막 여과로 정제한다. 각각의 단계에서 다수의 공정 변수, 예컨대 pH, 온도, 농도, 및 시간은 본 실시예에 기재된 바와 같이 혈청형-특이적이다.
단계 1: 용해
정제된 폴리사카리드를 2 - 3 mg/mL의 농도로 물 중에 용해시켰다. 용해된 폴리사카리드를 사전 설정 압력 0 내지 1000 bar로 기계적 균질기에 통과시켰다. 입도 감소 후, 사카리드를 농축시켜 10 kDa MWCO 초미세여과기 상에서 멸균수로 정용여과시켰다. 여과물을 폐기하고, 잔류물을 나트륨 아세테이트 완충제를 사용하여 pH 4.1인, 50 mM 최종 농도로 조정하였다. 혈청형 4 및 5에 대해, pH 5.0의 100 mM 나트륨 아세테이트를 사용하였다. 혈청형 4에 대해, 용액을 50℃± 2℃에서 배양하였다. 20 - 24℃로 냉각함으로써 가수분해를 중단시켰다.
단계 2: 페리오데이트 반응
폐렴구균성 사카리드 활성화를 위해 요구되는 나트륨 페리오데이트 몰 당량을 총 사카리드 함량을 사용하여 결정하였다. 철저한 혼합으로, 온도 2 - 6℃를 적용하는 5, 7F, 및 19F를 제외한 모든 혈청형에 대해 20 - 24℃에서 3 - 20시간 동안 산화가 진행되도록 하였다.
단계 3: 초미세여과
산화된 사카리드를 농축시키고, pH 6.4인 10 mM 칼륨 포스페이트로 (혈청형 5에 대해서는 pH 4.3인 10 mM 나트륨 아세테이트로), 10 kDa MWCO 초미세여과기상에서 정용여과하였다. 여과물을 폐기하고, 잔류물을 3 M 칼륨 포스페이트 완충제를 첨가하여 pH 6.3 - 8.4로 조정하였다.
접합 공정
단계 1: 접합 반응
농축된 사카리드를 0.2 - 2 대 1의 충전비율로 CRM197 담체 단백질과 혼합하였다. 블렌딩된 사카리드-CRM197 혼합물을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.
접합 반응을 나트륨 시아노보로히드리드 용액을 첨가함으로써 개시하여 사카리드 1몰당 1.8 - 2.0 몰의 나트륨 시아노보로히드리드를 얻었다. 반응 혼합물을 20 - 24℃ (혈청형 3, 5, 6A, 7F, 19A, 및 19F에 대해 8 - 12℃)에서 48 - 120시간 동안 배양하였다.
단계 2: 보로히드리드 반응
접합 배양의 말기에 반응 혼합물을 4 - 8℃로, 및 1.2 M 중탄산나트륨 완충제 또는 3 M 칼륨 포스페이트 완충제 (혈청형 5 제외)로 pH 8 - 10으로 조정하였다. 접합 반응을 나트륨 보로히드리드 용액을 첨가함으로써 중단시켜 사카리드 1 몰당 0.6 - 1.0 몰의 나트륨 보로히드를 얻었다 (혈청형 5에 대해 0 몰의 보로히드리드를 첨가함). 반응 혼합물을 45 - 60 분 동안 배양하였다.
단계 3: 초미세여과 단계
반응 혼합물을 100 kDa MWCO 초미세여과기상에서 pH 8.4 완충제인 100 mM 칼륨 포스페이트 최소 20 부피로 정용여과시켰다. 100 kDa 초미세여과기로부터의 잔류물을 300 kDa MWCO 초미세여과기상에서 150 mM 염화나트륨 최소 20 투석여과부피로 20 - 24℃에서 정용여과시켰다. 여과물을 폐기하였다.
단계 4: 멸균 여과
300 kDa MWCO 정용여과로부터의 잔류물을 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 보로실리케이트 유리 용기에 방출 시험, 공정중 제어, 및 제제 (혈청형 19F 제외)에 적절한 부피로 충전시켰다. 혈청형 19F 접합체를 0.2 μm 필터를 통해 저장탱크로 통과시키고, 20 - 24℃에서 배양시켰다. 배양 후에, 접합체를 300 kDa MWCO 초미세여과기상에서 150 mM 염화나트륨 최소 20 투석여과부피로 20 - 24℃에서 정용여과시켰다. 여과물을 폐기하고, 잔류물을 0.2 μm 필터를 통해 여과시키고 보로실리케이트 유리 용기에 방출 시험, 공정중 제어, 및 제제에 적절한 부피로 충전하였다. 최종 벌크 잔류물을 2 - 8℃에 거치하였다.
실시예 3: 15가 폐렴구균성 접합체 백신의 제제
벌크 농축물의 필요 부피를 배치 부피 및 벌크 사카리드 농도에 근거하여 계산하였다. 결합된 15 접합체를 염화나트륨, 완충제를 함유하는 pH 5.8인 L-히스티딘을 포함하는 부형제 (예를 들면, 폴록사머)를 첨가함으로써 표적 흡수 농도로 추가로 희석하였다. 충분히 혼합한 후에, 블렌드를 0.2 μm 막을 통해 멸균여과하였다. 멸균된 형성 벌크를 벌크 알루미늄 포스페이트와 블렌딩하는 동안 및 그 후에 서서히 혼합하였다. 형성된 백신 2 - 8℃에서 거치하였다.
실시예 4: 진탕-유도된 응집에 있어서 부형제의 효과
15가 폐렴구균성 접합체 백신-15 (PCV-15)의 안정성을 회전 진탕 연구 후에 다양한 부형제 및 pH 조건으로 연구하였다. PCV-15를 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)와 함께 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 중에 제조하였다. CRM197 단백질 64 μg/mL를 폐렴구균성 폴리사카리드 (PnP) 타입 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F과 4μg/mL으로 및 타입 6B과 8μg/mL으로, 총 폴리사카리드 농도 64μg/mL에 대해 접합시켰다.
회전 진탕 연구를 위해, PCV-15 제제 골격을 계면활성제 및 삼투조절물질, 및 삼투조절물질과 조합한 계면활성제를, pH 5.8, 6.2 및 7.0에서 첨가하여 제조하였다. 염화나트륨 농도를 150 mM 내지, 삼투조절물질의 농도에 의존하여 100 mM 또는 50 mM으로 조정하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 수직 및 측면 회전 진탕을 사용하도록 고안하였다. 응집을 육안으로 및 정적 광 산란을 사용하여 관찰하였다.
제제 물질:
PCV-15 제제 물질을 실시예 1-3에 기재한 바와 같이 제조하였다. 형성된 물질을 모든 진탕 연구가 완료될 때까지 2-8℃에서 거치하였다. 하기 제제를 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA) 및 64μg/mL 폴리사카리드:CRM 접합체와 함께 20 mM 히스티딘 중에 제조하였다.
Figure pct00002
진탕 연구 절차:
진탕 연구의 목적은 바이알을 진탕 조건에 처리한 후, 그 조건이 집합제 형성에 미치는 효과를 결정하는 것이다. 본 연구는 친수성 표면 (비-마쇄)과의 상호작용 및 제제를 최종 용기 성분 및 공기 계면으로 노출시키는 것을 통해 PCV-15 제제를 직접 진탕시키는 것을 기술한다. PCV-15 제제를 비-술페이트-처리된 2 mL 바이알내에 13 mm 스탑퍼를 사용하여 0.75 mL의 부피로 충전하였다.
회전, 진동, 및 순환(end-over-end) 진탕 방법에 대해, 바이알을 24시간 동안 4℃ 및 25℃에서 수직으로 및 측면으로 진탕하였다. 바이알이 7 x 7 냉동고 박스에 먼저 거치되는 것인 수직 회전 진탕의 경우를 제외하고, 바이알을 진탕 기구에 직접적으로 부착하였다. 회전 진탕에 대해 실험실규모 다목적 회전로를 최대 속도로 사용한 반면, 진동 진탕에 대해서는 1,500 rpm의 디지털 와조를 사용하였다. 순환 진탕에 대해 로타-진탕 지니(rota-shake genie)를 최대 속도로 사용하였다. 회전 진탕 방법에 대해 8시간째까지, 및 진동 및 순환 진탕 방법에 대해 9시간째까지 1시간 간격으로 관찰하였고, 모든 3종 진탕 방법에 대해 24시간째에 최종 관찰을 기록하였다. 제제 물질의 제한된 이용가능성으로 인해, 바이알을 회전 방법에 대해 2회 및 진동 및 순환 방법에 대해 1회 진탕하였다. 모든 바이알을 대조군인 비-진탕 바이알과 비교하였다.
추가로, 회전 진탕 방법을 위해, 3% 술페이트-처리된 2 mL 바이알을 0.75 mL 제제로 충전하였다. 바이알을 24시간 동안 최대 속도로 수직 및 측면 진탕하고, 동일한 조건하에서 진탕된 비-술페이트-처리된 바이알과 비교하기 위해 4℃에서 10-비 제품 상자 없이 및 함께 포장하였다. 10-비 제품 상자는 바이알을 10개까지 담을 수 있고 하나의 원형 제품을 함유할 수 있는 최종 시장 제품의 한가지 유형이다.
결과
PCV-15 제제 1을 pH 5.8, 6.0, 6.2, 6.6, 6.8, 및 7.0에서 진탕한 후, pH에서의 변화가 특히 측면 진탕 후의, 응집체의 형성을 방지하기에 유의하게 충분하지 않았다는 것을 알아냈다. 계면활성제 PS-80을 개별적으로 및 삼투조절물질(osmolyte) 수크로스와 조합하여 첨가하는 것은 일부 진탕 연구에서 수직 및 측면 진탕-유도된 응집을 방지하였지만, 모든 진탕 연구에서 그렇진 않았다. 계면활성제 PS-20을 개별적으로 V114 제제에 첨가하는 것은 또한 일부 진탕 연구에서 수직 및 측면 진탕-유도된 응집을 방지하지 않았지만, 모든 진탕 연구에서 그렇진 않았다. 그러나, PS-20이 pH 5.8에서 삼투조절물질 수크로스 또는 트레할로스와 함께 첨가되는 경우, 수직 및 측면 진탕-유도된 응집을 방지하였다. 결국, 계면활성제 폴록사머 188은 개별적으로 및 pH 5.8, 6.2, 및 7.0에서 삼투조절물질 수크로스와 조합하여 진탕 유도된 응집을 방지하였다.
결론
다양한 계면활성제, 삼투조절물질, 및 pH 조건을 사용한 진탕 연구를 완료한 후, 계면활성제 PS-20은 pH 5.8에서 삼투조절물질 수크로스 및 트레할로스와 조합하여 진탕-유도된 응집을 방지할 수 있었다. 그러나, 계면활성제 폴록사머 188은 pH와 무관하게 개별적으로 및 삼투조절물질 수크로스와 조합하여 진탕-유도된 응집을 방지할 수 있었다.
실시예 5: 진탕-유도된 응집에서 온도, pH, 염 농도 및 수크로스의 효과
열 응력을 거친 다수의 제제를 이용하여 PCV-15에 가해진 회전 진탕의 영향을 연구하였다. 회전 진탕 연구를 위해, PCV-15를 pH, 염 농도를 달리하고 수크로스를 첨가함으로써 다수의 제제로서 제조하였다 (표 1). 그 다음 이러한 제제를 세 그룹: 4℃; 1주 동안 37℃ 응력; 및 45일 동안 25℃ 응력으로 나누었다. 4℃ 그룹은 즉시 진탕 처리한 반면, 다른 두 그룹은 상기 조건에 따라 배양한 후, 그 뒤 진탕 처리하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 회전 측면 진탕을 사용하도록 고안하였다. 모든 샘플에 대해 육안 관찰을 사용하여 미립자를 검출하였고, 4℃ 및 37℃ 샘플은 정적 광 산란을 시험하여 샘플에서의 입도 분포를 관찰하였다.
<표 1>
진탕 연구를 위해 제조된 제제
Figure pct00003
방법:
제제의 제조:
상기한 바와 같이 10 mM 히스티딘 pH 7.0 및 염에 거치한 후 표 1에 정의된 바와 같이 제제화된 폴리사카리드-단백질 접합체로부터 제제를 클래스 II 생물안전 작업대(Biosafety cabinet)에서 무균상 제조하였다.
회전 진탕:
본 연구는 친수성 표면 (비-마쇄)과의 상호작용 및 제제를 최종 용기 성분 및 공기/액체 계면으로 노출시키는 것을 통해 PCV-15 제제를 직접 진탕시키는 것을 기술한다. PCV-15 제제를 비-술페이트-처리된 2 mL 바이알내에 13 mm 스탑퍼를 사용하여 0.75 mL의 충전부피로 충전하였다. 바이알을 필요시 열 응력 조건으로 처리한 후, 24시간 동안 4℃에서 측면상 진탕시켰다. 회전 진탕에 대해 실험실규모의 다목적 회전로를 최대 속도로 사용하였다. 측면 진탕을 위해 바이알을 회전로에 직접적으로 부착하였다. 24시간째에 관찰을 진행하였다.
결과:
바이알내에서 4℃에서 24시간 동안 회전 진탕을 거친 PCV-15 제제 (표 1)는 응력 조건과 무관하게, 폴록사머 188의 부재하에 침전물을 형성하였다. 폴록사머 188를 첨가하는 것은 관찰되는 미립자를 생성하지 않았다 (표 2). 15개의 바이알을 각각의 조건에 대해 검사하였다.
대조군 실험을 APA의 존재 또는 부재 하에 4℃에서 20 mM 히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl과 함께 수행하였다. 결과는 APA의 존재가 진탕-유도된 응집을 억제하는데 기여하지 않았다는 것을 보여주는 것으로, 비슷했다.
<표 2>
바이알내에서의 진탕 유도된 응집 형성에서 계면활성제의 영향
Figure pct00004
또한 정적 광 산란을 4℃ 및 37℃ 샘플에서 수행하여 입도 분포를 관찰하였다. 폴록사머 188이 없는 제제에서 더 큰 미립자 군집을 관찰하였다. 폴록사머 188만을 함유하는 제제는 비-진탕 샘플에서 관찰되는 군집과 비슷한 하나의 입자 군집을 가졌다 (도 1a-4b).
결론:
최종 농도 0.1%에서 폴록사머 188은 진탕에 앞서 제제에 열 응력을 가하는 경우에서 조차도, 바이알 내에서 진탕-유도된 응집을 완화시킬 수 있었다.
실시예 6: ISTA 표준 시험 동안 진탕-유도된 응집의 방지에 있어서 계면활성제의 영향
도입:
ISTA 표준 3A 연구의 목적은 바이알 제제를 통상 수송에서 관찰되는 진동 응력 및 전위차 응력에 노출시키는 것이다. 연구를 위해, PCV15를 다수의 제제로 제조한 후 ISTA 3A 절차로 처리하였다. 국제 수송 안전 협회 (International Safe Transit Association) 절차 3A (East Lansing, MI)를 참조한다. ISTA 표준 공정를 이용한 결과는 선진국으로 수송하는 경우 물체가 겪을 기대 조건과 더 비슷할 것이다. 샘플을 그 후 2-8℃에서 거치하였다. 2-8℃에서 거치한 후, 샘플을 미립자 검출을 위해 육안으로 검사하였고, 그 후 추가적으로 정적 광 산란 (SLS)으로 입도 분포를 분석하였다.
방법:
제제의 제조:
상기한 바와 같이 10 mM 히스티딘 pH 7.0 및 염 중에 정치한 후 표 3에 정의된 바와 같이 제제화된 폴리사카리드-단백질 접합체로부터 제제를 클래스 II 생물안전 작업대에서 무균상 제조하였다.
<표 3>
진탕 연구를 위해 제조된 제제
Figure pct00005
ISTA 표준 진탕 연구:
바이알을 ISTA 3A 절차로 처리하였다.
사용된 물체는 ISTA 절차 3A에 특화된 것이었고, 젤 적재용기(shipper) 기재 (발포 폴리스티렌 (EPS) 보온성 적재용기에 대한 기재); 폴라팩 젤(PolarPack gel), 28 온스 (제품 온도를 유지하기 위해 사용되는 냉각제); 0℃ 미만 온도 및 25℃ 이상 온도에서 알람하는 PCS 50913 템테일 (TempTale) 모니터; 슬롯이 있는 PCS 50900 골판 패드; 테이프 - 제품 상자 및 젤 적재용기 덮개(shut)를 각각 고정하는데 사용하기 위한 스카치 테이프 및 포장 테이프; 10x 제품 상자 (마개를 하고 크림핑한(crimped) 바이알 10개를 5 x 2 패턴으로 담을 수 있도록, 5개씩 2개 열을 분리하는 원형 제품와 함께 고안된 상자); 및 PCS 50837 젤 적재용기 덮개 (EPS로 만든 덮개)를 포함한다.
하기 상자 제조를 수행하였다:
10x 제품 상자 1개를 1 측면 덥개를 스카치 테이프로 테이핑하여 조립함.
흑색 영구 표지로 10x 제품 상자의 모든 측면에 칠함.
PCV15 제제의 바이알 10개를 얻음.
V114 DP 제제의 바이알 10개 모두를 프로쿼드(ProQuad) 10x 제품 상자내에 거치함.
10x 제품 상자 덮개의 열린 끝을 테이핑함.
포장된 10x 제품 상자를 젤 적재용기 내에, 4개의 냉장한 28 온스 폴라팩, 바닥의 2개 젤 및 상부의 2개 젤 사이에 거치함.
상자 제조가 완료된 직후, 거치/제어 예비테스트를 위해 물체를 테그란트 코퍼레이션 (Tegrant Corporation) (Montgomeryville, PA)으로 수송하였다. 시험이 수행될 때까지 모든 물체를 하기 온도 조건에 거치하였다: 폴라팩 젤 냉각제, 5℃ ± 3 ℃로 냉장, PCV15 제제의 바이알 5 ℃ ± 3 ℃로 냉장; 폴라팩 젤 냉각제, -20 ℃ ± 5 ℃로 냉동, 모든 다른 구성요소는 실온. 모든 물체는 이러한 온도 저장조건에서 24시간 초과하여 있었다.
하기 포장을 테그란트 코퍼레이션에서 수행하였다:
젤 적재용기 기재를 얻음.
젤 적재용기 기재 바닥에 평평한 28온스 냉장한 폴라팩 젤 1개를 놓음.
템테일 1개를 젤 적재용기 내부 벽의 모서리가 닿도록 폴라팩 젤의 상부에 놓고, 작동시킴.
골판 패드 1개를 놓고, 냉장한 폴라팩 젤 및 템테일의 상부에 넣음.
골판 패드 상부에 제품 상자를 채우는 PCV15 제제를 놓음.
제품 상자를 채우는 PCV15 제제의 최상층에 템테일 1개를 놓음.
골판 패드 1개를 제품 상자를 채우는 PCV15 제제의 상부에 슬롯팅하여 놓음.
템테일 1개를 바닥부인, 젤 적재용기 벽의 반대 모서리가 닿도록 골판 패드 내에 놓고, 작동시킴.
골판 패드 및 템테일 상부에 28온스 냉장한 폴라팩 젤 1개를 평평하게 놓음.
냉장한 폴라팩 젤 상부에 28온스 냉동된 폴라팩 젤 2개를 평평하게 놓음.
젤 적재용기 기재상에 젤 적재용기 뚜껑을 놓음.
젤 적재용기 덮개을 포장 테이프로 테이핑함.
포장된 젤 적재용기를 ISTA 3A 시험 절차에 따른 분포 시험을 위해 미드-애틀랜틱 패키징 (Mid-Atlantic Packaging) (Montgomeryville, PA)으로 수송하였다.
ISTA 시험에 추가하여, 바이알의 서브셋(subset)을 또한 이전에 기재된 회전 진탕 조건에 노출시켰다. 회전 진탕에 대해 실험실규모의 다목적 회전로를 최대 속도로 사용하였다. 측면진탕을 위해 바이알을 회전로에 직접적으로 부착시켰다. 24시간째에 관찰하였다.
결과:
회전 진탕 결과:
바이알내에서 4℃에서 24시간 동안 회전 진탕한 후의 PCV15 제제는 폴록사머 188의 부재하에 침전물을 형성시켰다. 계면활성제, 폴록사머 188의 첨가는 관찰되는 미립자를 형성시키지 않았다 (표 4).
<표 4>
바이알내 진탕 유도된 응집 형성에서 계면활성제의 영향
Figure pct00006
ISTA 표준 시험 결과:
ISTA 표준 3A 절차를 거친 V114 제제 (표 3)를 응집체에 대해 육안으로 검사하였다. 폴록사머 188 또는 폴리소르베이트 (PS)를 함유하는 제제는 응집체의 출현을 경감시키지 않았다 (표 5).
<표 5>
ISTA 3A 절차에 노출시킨 바이알내 진탕 유도된 응집 형성에서 계면활성제의 영향
Figure pct00007
육안 검사에 추가적으로, 정적 광 산란을 또한 샘플의 서브셋에서 수행하여 입도 분포를 조사하였다. 계면활성제를 갖지 않는 대조군 제제는 ISTA 시험을 거친 후에 입도가 증가할 뿐만 아니라, 더 광범위한 입도 분포를 생성하였다 (도 5a-b). 그러나, 폴록사머 188을 함유하는 제제는 ISTA 시험에 노출시킨 후 더 균질한 생성물을 보였다 (도 5c-d).
결론:
다양한 제제를 회전 및 진동 응력 모두에 노출시키고 입도 분포에 대해 육안으로 및 정적 광 산란을 이용하여 관찰하였다. 결과는 계면활성제 (폴리소르베이트 또는 폴록사머 188)의 첨가가 진동 응력에 의해 유발된 진탕-유도된 응집을 경감시킬 수 있다는 것을 나타낸다 (ISTA 표준 3A 결과). 그러나, 오직 폴록사머 188만이 V114 제제와 연관된 진동 및 회전 응력 모두를 경감시킬 수 있다.
실시예 7: 폴록사머 범위 탐색
PCV-15를 실시예 1 내지 3에 기재한 바와 같이 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)와 함께 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 중의 바이알 상으로서 제조하였다. 회전 진탕 연구를 위해, PCV-15를 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)에 계면활성제를 첨가하여 제조하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 회전 측면 진탕을 사용하도록 고안하였다. 바이알을 통과하는 광선 경로 (틴들 효과)가 미립자를 검출하도록 하였다.
방법:
제제의 제조:
실시예 1 내지 3에서 기재한 바와 같이 제제를 클래스 II 생물안전 작업대에서 무균상 제조하였다. 제제를 진탕 연구가 개시될 때까지 4℃에서 거치하였다.
<표 6>
본 연구에서 평가된 제제
Figure pct00008
회전 진탕:
진탕 연구의 목적은 바이알을 진탕 조건에 처리한 후 상기 조건이 응집체 형성에 미치는 효과를 결정하는 것이다. PCV-15 제제를 비-술페이트-처리된 2 mL 바이알내에 13 mm 스탑퍼를 사용하여 0.75 mL의 충전부피로 충전하였다. 바이알을 24시간 동안 4℃에서 측면 진탕시켰다. 실험실규모 다목적 회전로를 최대속도에서 회전 진탕에 사용하였다. 바이알을 측면 진탕시키기 위해 회전로에 직접적으로 부착시켰다.
24시간째에 관찰하였다.
결과:
바이알내에서 4℃에서 24시간 동안 회전 진탕시킨 PCV15 제제는 폴록사머 188의 부재하에 또는 PS80의 존재하에서 침전물을 형성시켰다. 계면활성제 폴록사머 188을 0.025% 내지 0.15% 농도로 첨가하는 것은 관찰되는 미립자를 생성시키지 않았다. 그러나, 더 높은 농도인, 0.1% 및 0.15%에서, 경미한 흐림도 (패닝(fanning))의 출현을 공기/액체 계면이 존재하는 바이알 구역에서 관찰하였다 (표 7).
<표 7>
바이알내 PCV15와 알루미늄의 진탕 유도된 응집 형성에서 계면활성제의 영향
Figure pct00009
결론:
계면활성제 폴록사머 188은 0.025 내지 0.15% 중량/부피의 농도에서 바이알내 진탕-유도된 응집을 방지할 수 있었다.
실시예 8: 진탕-유도된 응집에서 보존제의 효과
회전 진탕 연구 후에, 15가 폐렴구균성 접합체 백신-15 (PCV-15)의 안정성을 다양한 보존제를 단독으로 또는 계면활성제와 조합 사용하여 연구하였다. PCV-15를 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)와 함께 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 중에 제조하였다. CRM197 단백질 64 μg/mL를 폐렴구균성 폴리사카리드 (PnP) 타입 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F과 4μg/mL으로 및 타입 6B과 8μg/mL으로, 64μg/mL의 총 폴리사카리드 농도에 대해 접합하였다.
회전 진탕 연구를 실시예 4에 기재한 바와 같이 수행하였다. PCV-15 제제 골격을 페놀, 2-페녹시에탄올, m-크레솔, 벤질 알코올, 또는 클로로부탄올을 특정 농도에서 단독으로 또는 폴록사머 188과 조합 첨가하여 제조하였다. 일부 보존제를 특정 용매에 용해하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 회전 측면 진탕을 사용하도록 고안하였다. 응집을 육안으로 관찰하였고, 일부 경우에서 정적 광 산란을 사용하였다.
결과:
바이알내에서 24시간 동안 4℃에서 회전 진탕한 후의 PCV15 제제는 일반적으로 폴록사머 188의 부재하에서 침전물을 형성하지 않았다. 계면활성제 0.1% 폴록사머 188을 첨가하는 것은 어떠한 시험 보존제로도 관찰되는 미립자를 생성하지 않았다.
<표 8>
바이알내 PCV15와 알루미늄의 진탕 유도된 응집 형성에서 보존제의 영향
Figure pct00010
또한, 정적 광 산란을 대표 샘플에서 수행하여 입도 분포를 관찰하였다. 폴록사머 188을 갖지 않는 제제에서, 더 큰 미립자 군집을 관찰하였다. m-크레솔 또는 페놀을 갖고 폴록사머 188을 함유하는 제제는 비-진탕 샘플에서 관찰되는 군집과 비슷한 하나의 입자 군집을 가졌다 (도 6a-c).
결론:
시험된 다양한 보존제는 폴록사머 188의 진탕-유도된 응집을 억제하는 능력에 악영향을 미치지 않았다.
실시예 9: 진탕-유도된 응집에서 pH 및 완충제의 효과
15가 폐렴구균성 접합체 백신-15 (PCV-15)의 안정성을 회전 진탕 연구 후에 다양한 완충제 및 pH 조건을 사용하여 연구하였다. PCV-15를 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)와 함께 20 mM 특정 완충제 및 150 mM 염화나트륨 중에 제조하였다. CRM197 단백질 64 μg/mL를 폐렴구균성 폴리사카리드 (PnP) 타입 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F에 4μg/mL로, 및 타입 6B에 8μg/mL로, 총 폴리사카리드 농도 64μg/mL에 대해 접합하였다.
회전 진탕 연구를 위해, PCV-15 제제 골격을 계면활성제 및 삼투조절물질, 및 삼투조절물질과 조합한 계면활성제를, pH 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.2, 6.6, 6.8, 7.0 및 8.0에서 첨가하여 제조하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 회전 측면 진탕을 사용하도록 고안하였다. 응집을 육안으로 관찰하였다.
결과:
바이알내에서 4℃에서 24시간 동안 회전 진탕시킨 PCV15 제제는 시험한 완충제 및 pH 조건에 대해 폴록사머 188의 부재하에서 침전물을 형성시켰다. 계면활성제 0.1% 폴록사머 188을 첨가하는 것은 어떠한 시험 완충제 및 pH 조건에서도 관찰되는 미립자를 생성시키지 않았다.
<표 8>
바이알내 PCV15와 알루미늄의 진탕 유도된 응집 형성에서 완충제 및 pH 조건의 영향
Figure pct00011
결론:
시험된 다양한 완충제 및 pH 조건은 폴록사머 188의 진탕-유도된 응집을 억제하는 능력에 악영향을 미치지 않았다.
실시예 10: 진탕-유도된 응집에 대한 다양한 분자량 범위의 폴록사머의 효과
15가 폐렴구균성 접합체 백신-15 (PCV-15)의 안정성을 회전 진탕 연구 후에 다양한 상업상 이용가능한 폴록사머를 이용하여 연구하였다. PCV-15를 0.25 mg/mL 알루미늄 포스페이트 아쥬반트 (APA)와 함께 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 중에 제조하였다. CRM197 단백질 64 μg/mL를 폐렴구균성 폴리사카리드 (PnP) 타입 1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F, 및 33F에 4μg/mL로, 및 타입 6B에 8μg/mL로, 총 폴리사카리드 농도 64μg/mL에 대해 접합하였다.
회전 진탕 연구를 위해, PCV-15 제제 골격을 폴록사머 237, 폴록사머 338, 또는 폴록사머 407를 특정 농도로 첨가하여 제조하였다. 진탕 연구를 4℃에서 24시간 동안 회전 측면 진탕을 사용하도록 고안하였다. 응집을 육안으로 관찰하였다.
결과:
0.1% 폴록사머 237과 바이알내에서 24시간 동안 4℃에서 회전 진탕한 후의 PCV15 제제는 관찰되는 미립자를 생성하지 않았다. 시험한 다른 조건은 매우 작은 미립자를 생성하였지만, 폴록사머를 갖지 않는 대조군 제제에 대해 유의한 개선을 보이지 않았다.
<표 9>
바이알내 PCV15와 알루미늄의 진탕 유도된 응집 형성에서 다양한 분자량 범위의 폴록사머의 영향
Figure pct00012
또한, 정적 광 산란을 폴록사머 237을 0.1%로 갖는 샘플에서 수행하여 입도 분포를 관찰하였다. 이 제제는 비-진탕 샘플에서 관찰되는 군집과 비슷하였다 (도 7).
결론:
다양한 분자량 범위의 폴록사머는 진탕-유도된 응집을 억제하는 능력에서 차이가 있었다. 조건의 최적화는 완전한 억제를 가능하도록 해야한다.

Claims (21)

  1. (i) 5.0 내지 8.0의 pH 범위를 갖는 pH 완충 염 용액, (ii) 1100 내지 17,400의 범위의 분자량을 갖는 폴록사머 및 (iii) 하나 이상의 폴리사카리드-단백질 접합체를 포함하는 제제.
  2. 제1항에 있어서, 7,500 내지 15,000의 범위의 분자량을 갖는 폴록사머.
  3. 제1항에 있어서, 7,500 내지 10,000의 범위의 분자량을 갖는 폴록사머.
  4. 제1항에 있어서, 폴록사머는 폴록사가 188 또는 폴록사머 237인 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 내의 폴록사머의 최종 농도가 제제의 0.001% 내지 5% 중량/부피인 제제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 내의 폴록사머의 최종 농도가 제제의 0.025% 내지 1% 중량/부피인 제제.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 내의 폴록사머 188의 최종 농도가 제제의 0.05% 내지 1.0% 중량/부피이거나 또는 제제 내의 폴록사머 237의 최종 농도가 제제의 0.1% 내지 1.0% 중량/부피인 제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, pH 완충 염 용액이 5.2 내지 8.0의 pH 범위를 갖는 것인 제제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 트리스, 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 또는 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제제.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도에서의 히스티딘이거나, 또는 1 mM 내지 20 mM의 최종 농도에서의 숙시네이트인 제제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 염이 20 nM 내지 170 nM의 농도에서 존재하는 것인 제제.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 담체 단백질 CRM197인제제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카리드-단백질 접합체가 하나 이상의 폐렴구균성 폴리사카리드를 포함하는 것인 제제.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리사카리드-단백질 접합체 제제가 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에(S. pneumoniae) 혈청형 1 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 3 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 4 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 5 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 6B 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 7F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 9V 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 14 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 18C 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19A 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 19F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 22F 폴리사카리드, CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 23F 폴리사카리드, 및 CRM197 폴리펩티드에 접합된 에스. 뉴모니에 혈청형 33F 폴리사카리드를 포함하는 15가 폐렴구균성 접합체 (15vPnC) 제제인 제제.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는 것인 제제.
  16. 제15항에 있어서, 아쥬반트가 알루미늄-기반 아쥬반트인 면역원성 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 아쥬반트가 알루미늄 포스페이트인 제제.
  18. 제17항에 있어서, 0.112 내지 0.130 mg 원소 알루미늄, 140 내지 160 mM 염화나트륨 및 18 내지 22 mM L-히스티딘 완충제를 포함하는 제제.
  19. 제18항에 있어서, 3.6 내지 4.4 μg에서의 6B를 제외한 1.8 내지 2.2 μg의 각각의 사카리드; 약 32 μg CRM197 담체 단백질; 0.125 mg의 원소 알루미늄 (0.5 mg 알루미늄 포스페이트) 아쥬반트; 약 150 mM 염화나트륨 및 약 20 mM L-히스티딘 완충제를 함유하도록 제제화된 단일 0.5 mL 투여량인 제제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, m-크레솔, 페놀, 2-페녹시에탄올, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 또는 티메로살인 보존제를 추가로 포함하는 것인 제제.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 제제를 포함하는 바이알 또는 예비-충전된 주사기.
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