BR112019013475A2 - Conjugados de polipeptídeo-antígeno com aminoácidos não naturais - Google Patents

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Abstract

são revelados métodos para a produção de composições imunogênicas contendo um aminoácido não natural. o aminoácido não natural pode ser um sítio para a fixação de antígenos, como polissacarídeos capsulares bacterianos, para produzir conjugados imunogênicos. a química de ligação bio-ortogonal incorporada aos aminoácidos não naturais permite uma apresentação de antígeno mais eficiente e potente para o sistema imune, uma purificação simplificada e estrutura mais bem definida desses imunógenos semissintéticos.

Description

CONJUGADOS DE POLIPEPTÍDEO-ANTÍGENO COM AMINOÁCIDOS NÃO NATURAIS.
[001] Este pedido reivindica o benefício dos pedidos de Patente US Provisórios n°62/441.115 (depositado em 30 de d ezembro de 2016), 62/530.803 (depositado em 10 de julho de 2017), 62/568.201 (depositado em 4 de outubro de 2017), e Pedido de Patente US Provisório 62/591.160 (depositado em 27 de novembro de 2017), cujos conteúdos estão incorporados ao presente documento em sua totalidade a título de referência.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] As vacinas à base de macromoléculas antigênicas isoladas (por exemplo, as vacinas de meningococo de primeira geração, pneumococos e polissacarídeos de Haemophilus) representaram melhorias significativas em relação às formulações de vacinas anteriores à base de vacinas de organismos vivos atenuados ou inativados.
[003] As macromoléculas purificadas são significativamente mais fáceis de fabricar, têm um perfil de segurança melhorado e podem gerar uma resposta imune específica mais produtiva (por exemplo, podem ser dirigidas contra um antígeno que é mais conservado ou é importante para a patogênese). Além disso, as mesmas oferecem um modelo simplificado para a produção de vacinas, em que uma resposta imune pode ser direcionada contra um sítio específico ou um organismo específico simplesmente fornecendo o imunógeno apropriado. No entanto, essa estratégia sofre de um fato inconveniente - nem todas as macromoléculas geram uma forte resposta imune. Muitos lipídios, polissacarídeos e certos antígenos proteicos (e a maioria das moléculas pequenas) geram respostas imunes que são inerentemente fracas, transitórias e/ou deficientes em certas populações de pacientes (os exemplos incluem crianças ou idosos). Pensa-se que essas respostas
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2/233 imunes fracas resultam de estruturas antigênicas que ativam principalmente as células B ou, de outro modo, não ativam as vias dependentes das células T que estão envolvidas na memória imunológica e na maturação dos anticorpos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [004] A presente descrição é dirigida a métodos, composições e são reveladas técnicas para a produção de composições imunogênicas contendo um aminoácido não natural. A química de ligação bio-ortogonal incorporada no aminoácido não natural permite uma apresentação mais eficiente e potente do antígeno ao sistema imune, purificação simplificada e uma estrutura mais bem definida desses imunógenos semissintéticos.
[005] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um conjugado que compreende um polipeptideo e um antígeno, em que o polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um aminoácido não natural, ou nnAA, em que o antígeno é conjugado ao nnAA. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende pelo menos um epitopo de ativação de células-T de uma proteína selecionada do grupo que consiste em toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani (também conhecida como toxina do tétano), proteína D de Haemophilus influenzae (PD, Hi D), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) e CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por uma lisina na proteína veículo nativa. Por exemplo, a proteína veículo compreende CRM197 em que pelo menos 2 (por exemplo, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6) dos 39 resíduos de
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3/233 lisina em CRM197 nativo foram substituídos por nnAAs. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por uma fenilalanina na proteína veículo nativa. Em uma outra modalidade, os pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs são substituídos por uma lisina na proteína veículo nativa. Em uma outra modalidade, os pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs são substituídos por uma fenilalanina na proteína veículo nativa. Em uma outra modalidade, os pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs são substituídos por uma lisina, uma fenilalanina ou tanto uma lisina como uma fenilalanina na proteína veículo nativa. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino3-(5-(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma proteína selecionada do grupo que consiste em toxina da difteria (DT), toxina do tétano (TT), proteína D de Haemophilus influenzae (PD) e CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um epitopo de ativação de células T é de CRM197 de acordo com SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, ou K527 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por F13, F54, F124,
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F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, os pelo menos dois nnAA são substituídos por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527,
F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ
ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por K265 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por K386 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA é substituído por K265 e K386 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido
2-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é conjugado ao nnAA via uma parte de ligação de triazol. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (em particular, tipo b, isto é, Hib), Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13,14,
15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6).
[006] Em uma modalidade relacionada, o conjugado compreende um polipeptideo e um antígeno, em que o polipeptideo é uma proteína
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5/233 veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA, em que o antígeno é conjugado ao pelo menos um nnAA e ainda em que o pelo menos um nnAA é um ácido 2,3-dissubstituído propanoico que porta um substituinte de amino na 2-posição e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetraziniIa ou um substituinte contendo etinila na 3-posição.
[007] Em uma outra modalidade relacionada, o conjugado compreende um polipeptideo e um antígeno, em que o polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, resíduos de nnAA, em que o antígeno é conjugado ao nnAA e ainda em que o resíduo de nnAA corresponde a um aminoácido que tem a estrutura de Fórmula XII:
(W%-5
O Ar (XII) [008] em que:
[009] Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo;
[010] W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-;
[011] Q1 é zero ou 1; e [012] W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetraziniIa opcionalmente C-substituído com um grupo alquila inferior, e etinila, [013] de modo que 0 resíduo de nnAA no polipeptideo tenha a estrutura de Fórmula XIII
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6/233 w6 (W6^
Ar
R3 £ (XIII) [014] em que R3 é OH ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo, e R4 é H ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo.
[015] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um polipeptídeo que compreende pelo menos um nnAA substituído por um aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo nativo de acordo com SEQ ID NO:1, em que o pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, ou K527 de SEQ ID NO:1, em que o nnAA compreende uma parte de ligação. Em uma outra modalidade, a presente descrição fornece um polipeptídeo que compreende pelo menos um nnAA substituído por um aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo nativo de acordo com SEQ ID NO:1, em que o pelo menos um nnAA é substituído por F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1, em que o nnAA compreende a parte de ligação. Em uma outra modalidade, a presente descrição fornece um polipeptídeo que compreende pelo menos dois nnAA substituído por a aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo nativo de acordo com SEQ ID NO:1, em que o pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1, em que o nnAA compreende a parte de ligação. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino3-(5-(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6
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7/233 (azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, K265 de SEQ ID NO:1 é substituído. Em uma outra modalidade, K386 de SEQ ID NO:1 é substituído. Em uma outra modalidade, K265 e K386 de SEQ ID NO:1 são substituídos. Em uma outra modalidade, o polipeptideo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5,
2-amino-3-(42-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6ácido pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4azidofenil)propanoico (pAF), ácido (azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, (azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos.
[016] Em uma modalidade relacionada, o pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA no polipeptideo é um ácido 2,3dissubstituído propanoico que porta um substituinte de amino na 2 posição e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetrazinila, ou um substituinte contendo etinila na 3-posição.
[017] Em uma outra modalidade relacionada, o pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA no polipeptideo tem a estrutura de Fórmula XII w6
O Ar Ah2 (XII) [018] em que:
[019] Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros
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8/233 contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo;
[020] W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-;
[021] Q1 é zero ou 1; e [022] W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetraziniIa opcionalmente C-substituído com um grupo alquila inferior, e etinila.
[023] Em uma modalidade, a presente descrição fornece uma composição que compreende conjugados de polipeptídeo-antígeno, em que 0 polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um nnAA, e em que 0 antígeno é conjugado ao nnAA. Em uma outra modalidade, os conjugados de polipeptídeo-antígeno são reticulados através de ligações proteína-antígeno-proteína. Em uma outra modalidade, a composição compreende múltiplos conjugados de antígeno-proteína veículo, em que cada conjugado compreende um antígeno diferente (por exemplo, polissacarídeos capsulares de diferentes sorotipos pneumocócicos). Em uma outra modalidade, os antígenos são derivados de diferentes sorotipos (por exemplo, para pneumococo) ou sorogrupos (por exemplo, para meningococo) do mesmo organismo. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (por exemplo, Hib), Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6). Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13,14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a composição
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9/233 compreende um conjugado de veículo-antígeno proteína conforme descrito no presente documento em que há pelo menos 14, 20, 21, 24 ou 25, diferentes conjugados de proteína veículo-polissacarídeo capsular, em que cada conjugado compreende um polissacarídeo capsular diferente de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10Α, 11Α, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19Α, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F. Em uma outra modalidade, a razão entre o polissacarídeo e a proteína veículo (p/p) é maior que 1. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido
2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com uma proteína selecionada de toxina de difteria (DT), toxina de tétano (TT), proteína D de Haemophilus (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) e CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, ainda em que o pelo menos um nnAA substitui um aminoácido de ocorrência natural no mesmo. Em uma outra modalidade, o pelo menos um nnAA substitui um aminoácido
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10/233 selecionado do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 ou K527 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA substitui um aminoácido selecionado do grupo que consiste em F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA substitui um aminoácido selecionado do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o antígeno é conjugado ao nnAA via uma parte de ligação. Em uma outra modalidade, o antígeno é conjugado ao nnAA via uma parte de ligação de triazol.
[024] Em uma modalidade relacionada, os conjugados de polipeptídeo-antígeno na composição compreendem, como o polipeptídeo, uma proteína veículo que compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T e pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA, em que o antígeno é conjugado ao nnAA e ainda em que o pelo menos um nnAA é um ácido 2,3-dissubstituído propanoico que porta um substituinte de amino na 2-posição e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetraziniIa, ou um substituinte contendo etinila na 3-posição.
[025] Em uma outra modalidade relacionada, os conjugados de polipeptídeo-antígeno na composição compreendem, como o polipeptídeo, uma proteína veículo que compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T e pelo menos um e, de preferência, pelo menos dois, nnAA, em que o antígeno é conjugado ao nnAA e ainda em que o pelo menos um nnAA no polipeptídeo tem a estrutura de Fórmula XII
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11/233 w6
O Ar ΗΟ-^γ^ βΗ2 (XII) [026] em que:
[027] Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo;
[028] W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-;
[029] Q1 é zero ou 1; e [030] W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetraziniIa opcionalmente C-substituído com um grupo alquila inferior, e etinila.
[031] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método para produzir um conjugado, que compreende: (a) fornecer um antígeno ativado que compreende uma pluralidade de grupos funcionais que compreendem um primeiro manejo químico com capacidade de conjugar a um segundo manejo químico de um nnAA; (b) combinar 0 antígeno ativado com um polipeptideo que compreende pelo menos um dos nnAA sob condições em que 0 primeiro e 0 segundo manejos químicos reajam para formar um conjugado antígeno-polipeptídeo, em que 0 polipeptideo compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T; e (c) recuperar uma composição que compreende 0 conjugado. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (por exemplo, Hib), Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra
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12/233 modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6). Em uma outra modalidade, o antígeno foi reagido com um primeiro reagente selecionado do grupo que consiste em CDAP, GDI, ou periodato na produção do antígeno ativado. Em uma outra modalidade, o primeiro reagente é menor que periodato 1M. Em uma outra modalidade, a pluralidade de grupos funcionais compreende grupos hidroxila. Em uma outra modalidade, a pluralidade de grupos funcionais compreende um grupo aldeído. Em uma outra modalidade, o antígeno foi reagido com um segundo reagente que compreende um grupo funcional selecionado do grupo que consiste em propargila, DIFO, DBCO e DBCO(PEG)n-NH2. Em uma outra modalidade, o antígeno foi reagido com um segundo reagente que compreende DBCO-NH2. Em uma outra modalidade, 0 primeiro manejo químico compreende um grupo alquino. Em uma outra modalidade, 0 segundo manejo químico compreende um grupo azido. Em uma outra modalidade, a razão entre 0 antígeno e 0 polipeptídeo do conjugado na composição (p/p) é maior que 1.
[032] Em uma modalidade relacionada, 0 método para produzir um conjugado compreende: (a) ativar um antígeno para incorporar pelo menos um primeiro manejo químico no mesmo, em que 0 primeiro manejo químico tem a capacidade de conjugar a um segundo manejo químico de um nnAA no polipeptídeo; (b) combinar 0 antígeno ativado com um polipeptídeo que compreende pelo menos um dos nnAA sob condições em que 0 primeiro e 0 segundo manejos químicos reajam para formar um conjugado antígeno-polipeptídeo, em que 0 polipeptídeo compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T; e (c) recuperar uma composição que compreende 0 conjugado. Em um aspecto dessa modalidade, a ativação do antígeno compreende incorporar pelo menos um grupo alquinila ao antígeno como 0 primeiro
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13/233 manejo químico.
[033] Em uma outra modalidade relacionada, é fornecido um método para produzir um conjugado polipeptídeo-antígeno, que compreende ativar um antígeno pela incorporação de pelo menos um grupo alquinila no mesmo como o primeiro manejo químico, e reagir o antígeno com um polipeptídeo que compreende pelo menos um nnAA e, de preferência, pelo menos dois nnAA, portando um grupo azido como o segundo manejo químico, permitindo assim uma reação de bioconjugação covalente não catalítica entre o polipeptídeo e o antígeno. Em uma modalidade preferencial, o grupo alquinila é restringido para aumentar a reatividade, por exemplo, em uma estrutura de anel como uma ciclooctila diaril-tensionada.
[034] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de elicitação de uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo um conjugado conforme descrito no presente documento em um excipiente adequado para administração parenteral.
[035] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de elicitação de uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma composição conforme descrita no presente documento em um excipiente adequado para administração parenteral.
[036] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método para a síntese de um polipeptídeo que compreende pelo menos 2 aminoácidos não naturais (nnAAs) em uma mistura de expressão livre de célula mantida a uma temperatura entre cerca de 10 graus Celsius e cerca de 30 graus Celsius, em que o polipeptídeo produzido compreende uma fração tanto solúvel como insolúvel, e em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 30% (p/p). Por exemplo, para 100 g de polipeptídeo total, a fração insolúvel seria 70g
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14/233 ou menos, e a fração solúvel seria 30g ou mais. Em uma outra modalidade, a temperatura é acima de cerca de 20 graus Celsius. Em uma outra modalidade, a temperatura é abaixo de cerca de 20 graus Celsius. Em uma outra modalidade, a temperatura é entre cerca de 14 graus Celsius e cerca de 18 graus Celsius. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo é codificado por um ácido nucleico que compreende um códon de supressão. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão livre de célula compreende um par de tRNA ortogonal/aminoacil-tRNA sintetase específico para o nnAA. Em uma outra modalidade, a concentração de tRNA é pelo menos 20 μΜ (isto é, a concentração do tRNA ortogonal). Em uma outra modalidade, a concentração de nnAA é menor que cerca de 2 mM e a concentração da aminoacil-tRNA sintetase é menor que cerca de 5 μΜ (isto é, a concentração da sintetase ortogonal). Em uma outra modalidade, o método compreende conjugar o polipeptídeo a uma parte ativa. Em uma outra modalidade, a parte ativa é selecionada do grupo que consiste em um hapteno, um antígeno bacteriano, um antígeno viral, uma toxina peptídica, um macrolídeo, um poliéter e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão compreende um extrato celular de E. coli, germe de trigo ou reticulócito de coelho. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão compreende pelo menos 30% de extrato celular. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado do grupo que consiste em ácido 2amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico,
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15/233 ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo produzido compreende tanto uma fração solúvel como uma fração insolúvel, e em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 60% (p/p). Em uma outra modalidade, o polipeptídeo produzido compreende tanto uma fração solúvel como uma fração insolúvel, e em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 80% (p/p). Por exemplo, para 100 g de polipeptídeo total, a fração insolúvel seria 20g ou menos, e a fração solúvel seria 80g ou mais.
[037] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método melhorado de produção de uma vacina de proteína-conjugado, em que um antígeno é conjugado a uma proteína veículo que fornece uma resposta imune dependente de células T, em que a melhora compreende empregar, como a proteína veículo, um polipeptídeo que compreende pelo menos um aminoácido não natural, em que o aminoácido não natural compreende uma parte reativa bio-ortogonal através da qual o antígeno é conjugado ao polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo bacteriano. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos dois aminoácidos não naturais que compreendem uma parte reativa bio-ortogonal através da qual o antígeno é conjugado ao polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T que não compreende um aminoácido não natural que compreende uma parte reativa bio-ortogonal através da qual o antígeno é conjugado ao polipeptídeo. Em uma outra modalidade, o epítopo de ativação de células T é de uma proteína selecionada do grupo que consiste em toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae (PD, HiD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) e CRM197. Em uma outra
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16/233 modalidade, o antígeno é um polissacarídeo bacteriano e a bactéria é selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae (por exemplo, Hib),
Streptococcus pyogenes e Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, pelo menos um dos aminoácidos não naturais é selecionado do grupo que consiste azidofenil)propanoico (pAF), em ácido 2-amino-3-(4ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido
2-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico.
[038] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método para produzir uma proteína veículo que incorpora uma pluralidade de aminoácidos não naturais em sua estrutura, que compreende: (a) fornecer um ácido nucleico que codifica uma proteína veículo, em que o ácido nucleico compreende uma pluralidade de códons de supressão; (b) criar uma mistura de reação pela combinação do ácido nucleico com um extrato bacteriano livre de célula que compreende os aminoácidos não naturais, um tRNA complementar aos códons de supressão, e uma aminoacil-tRNA sintetase; e (c) incubar a mistura de reação de (b) sob condições suficientes para seletivamente incorporar o aminoácido não natural no sítio que corresponde a cada códon de supressão na proteína veículo. Em uma outra modalidade, o aminoácido não natural é 4-azidometilfenilalanina (pAMF). Em uma outra modalidade, a etapa (c) compreende incubar a mistura de reação a menos que 20 graus Celsius. Em uma outra modalidade, o método adicionalmente compreende purificar a proteína veículo imediatamente após (c). Em uma outra modalidade, o códon de supressão é seletivamente substituído no códon 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245,
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265, 386, 523 ou 527 de SEQ ID NO:2. Em uma outra modalidade, a mistura de reação em (b) compreende adicionalmente componentes biológicos necessários para síntese de proteína. Em uma outra modalidade, o tRNA em (b) tem a capacidade de ser carregado com pAMF. Em uma outra modalidade, a aminoacil-tRNA sintetase em (b) preferencialmente aminoacila o tRNA com pAMF em comparação com os 20 aminoácidos naturais.
[039] Em uma outra modalidade, a presente descrição fornece uma composição que compreende pelo menos 14, 20, 21, 24, ou 25 conjugados de proteína veículo-antígeno distintos, em que o antigeno é um polissacarídeo capsular e (a) o polissacarídeo capsular em cada conjugado de proteína veículo-antígeno distinto é de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae; (b) a proteína veículo dos conjugados de proteína veículo-antígeno compreende um polipeptideo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos dois aminoácidos não naturais (nnAA); e (c) os polissacarídeos capsulares são conjugados ao nnAA. Em versões preferenciais dessa modalidade, o pelo menos um epitopo de ativação de células T é de CRM197 de acordo com SEQ ID NO:1; o polipeptideo tem pelo menos 80% ou 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1; e (i) o polipeptideo compreende 2-9 nnAA; (ii) o polipeptideo compreende 4-6 nnAA; e/ou (iii) pelo menos um nnAA é substituído por um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em (a) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527 de CRM197, (b) F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1, ou (c) K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, K527, F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1. Versões preferenciais das modalidades anteriores incluem composições que compreendem pelo menos 14, 20, 21, 24, ou 25 conjugados distintos de proteína veículo
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18/233 antígeno, em que cada conjugado distinto de proteína veículo-antígeno inclui um antígeno selecionado individualmente dos polissacarídeos capsulares de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em sorotipos 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F; composições de pelo menos 24 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno, em que o polissacarídeo capsular de 24 dos conjugados distintos de proteína veículo-antígeno são de sorotipos de Streptococcus pneumoniae!, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F; composições que compreendem pelo menos 25 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno, em que o polissacarídeo capsular de pelo menos um dos conjugados distintos de proteína veículo-antígeno é de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 6C, 7C, 13, 15A, 15C, 16, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 34, 35B, 33F, 35F, 37 e 38; e composições que compreendem pelo menos 25 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno, em que o polissacarídeo capsular de pelo menos um dos conjugados distintos de proteína veículo-antígeno é de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 15A e 35B, ou alternativamente do grupo que consiste em 20A, 20B e 24B.
[040] Em uma modalidade, a descrição fornece uma composição que compreende pelo menos 14, 20, 21,24, ou 25 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno em que o antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae em que (a) o polissacarídeo capsular em cada conjugado distinto de proteína veículo-antígeno é de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae; (b) a proteína veículo dos conjugados de proteína veículo-antígeno é um polipeptideo que compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T e pelo menos dois aminoácidos não naturais (nnAA) e os polissacarídeos
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19/233 capsulares são conjugados ao nnAA, (c) existe um conjugado distinto de proteína veículo-antígeno que compreende um polissacarídeo capsular para cada um dos sorotipos de Streptococcus pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F, e (d) existe pelo menos um conjugado distinto adicional de proteína veículo-antígeno que compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em sorotipos 2, 6C, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 24B, 31,33F, 34, 35B, 35F e 38. Por exemplo, a composição pode incluir (i) pelo menos 20 ou 21 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno, incluindo um conjugado para cada um dos sorotipos de Streptococcus pneumoniae 1,3,4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, ou (ii) pelo menos 24 conjugados distintos de proteína veículo-antígeno em que existe um conjugado distinto de proteína veículo-antígeno que compreende um polissacarídeo capsular para cada um dos sorotipos de Streptococcus pneumoniae 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
[041] Em uma modalidade, a descrição fornece um conjugado polipeptídeo-antígeno, em que o polipeptideo inclui 3 ou mais resíduos de nnAA e o conjugado tem um peso molecular de pelo menos 500kDa. O polipeptideo pode ser um CRM197 (por exemplo, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, conforme discutido na seção 5a abaixo) contendo 3 ou mais resíduos de nnAA (por exemplo, de 3-9 ou
3-8 ou 3-7 ou 3-6 resíduos de nnAA). O antígeno pode ser um polissacarídeo bacteriano, como um polissacarídeo capsular pneumocócico. O conjugado pode ter um peso molecular de pelo menos 600 kDa, pelo menos 800 kDa, pelo menos 900 kDa, ou pelo menos 1 MDa, por exemplo, entre 1-5 MDa. Conforme discutido adicionalmente
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20/233 no presente documento, múltiplas preparações de tais conjugados, em que cada preparação é fabricada com um polissacarídeo capsular pneumocócico de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, pode ser combinado em composições da presente invenção úteis como vacinas multivalentes. Seleções preferenciais de sorotipos de Streptococcus pneumoniae representados em tais conjugados também são discutidas adicionalmente no presente documento.
[042] Em uma modalidade, a descrição fornece um conjugado polipeptídeo-antígeno, em que o polipeptídeo inclui 4 ou mais resíduos de nnAA. O polipeptídeo pode ser um CRM197 (por exemplo, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, conforme discutido na seção 5a abaixo) contendo 4 ou mais resíduos de nnAA (por exemplo, de 4-9 ou 4-8 ou 4-7 ou 4-6 resíduos de nnAA). O antígeno pode ser um polissacarídeo bacteriano, como um polissacarídeo capsular pneumocócico. O conjugado pode ter um peso molecular de pelo menos 500 kDa, (por exemplo, pelo menos 600 kDa, pelo menos 800 kDa, pelo menos 900 kDa, ou pelo menos 1 MDa, por exemplo, entre 1-5 MDa). Conforme discutido adicionalmente no presente documento, múltiplas preparações de tais conjugados, em que cada preparação é fabricada com um polissacarídeo capsular pneumocócico de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, pode ser combinado em composições da presente invenção úteis como vacinas multivalentes. Seleções preferenciais de sorotipos de Streptococcus pneumoniae representados em tais conjugados também são discutidas adicionalmente no presente documento.
[043] Em uma modalidade, a descrição fornece uma proteína adequada para preparar um conjugado polissacarídeo imunogênicoproteína, em que a proteína (i) inclui pelo menos um nnAA e (ii) tem uma solubilidade de pelo menos 50 mg/l a 20 Ό em tampão Tris pH 7,4. O
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21/233 polipeptideo compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T (conforme discutido acima); por exemplo, pode ser um CRM197 (por exemplo, que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, conforme discutido na seção 5a abaixo) contendo 2 ou mais resíduos de nnAA, por exemplo, de 3-9 ou 4-9 ou 3-8 ou 4-8 ou 3-7 ou 4-7 ou 36 ou 4-6 resíduos de nnAA. A proteína pode ser conjugada a um polissacarídeo bacteriano, como um polissacarídeo capsular pneumocócico, para produzir um conjugado. A solubilidade pode ser pelo menos 100 mg/l, pelo menos 200 mg/l, ou ainda pelo menos 250mg/L. Conforme discutido adicionalmente no presente documento, múltiplas preparações de tais conjugados, em que cada preparação é fabricada com um polissacarídeo capsular pneumocócico de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, pode ser combinado em composições da presente invenção úteis como vacinas multivalentes. Seleções preferenciais de sorotipos de Streptococcus pneumoniae representados em tais conjugados também são discutidas adicionalmente no presente documento.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [044] Os recursos e vantagens das modalidades descritas no presente documento são adicionalmente explicados por referência à seguinte descrição detalhada e desenhos anexos que apresentam modalidades ilustrativas.
[045] A Figura 1 mostra o rendimento de uma eCRM contendo 6 nnAA produzida a 30, 25 ou 20 graus Celsius em reações CFPS opcionalmente suplementadas com quantidades crescentes de tRNA (otRNA) ou nnAA/aaRS sintetase (nnAA). Duas barras são mostradas em cada coluna, representando o rendimento total e solúvel.
[046] A Figura 2 mostra imagens de gel de coomassie (2A) e fluorescentes (2B) demonstrando o rendimento relativo de proteína
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22/233 sintetizada (2A) e a capacidade de pAMF incorporado em eCRM para reagir com DBCO-fluoresceína (2B) para eCRM de sítio único produzido em reações de síntese de proteínas de células livres (CFPS). Na Figura 2A, a escada mostra de cima para baixo 10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150 e 250 kDa. Na Figura 2B, os marcadores fluorescentes estão em 25 e 75 kDa. As faixas são as seguintes: L = escada; W = tipo selvagem; C = TAG C-terminal; então as faixas 1-12 têm TAG para substituir Lys nas posições 11, 25, 34, 38, 40, 52, 60, 77, 83, 91, 96 e 103, respectivamente.
[047] A Figura 3 mostra a atividade opsonofagocítica (OPA) (GMT) após administração de conjugados de polissacarídeo pneumocócicoeCRM monovalente em camundongos. Os sorotipos são mostrados no eixo X. Barras brancas são polissacarídeos adjuvados, enquanto barras negras são conjugados adjuvados.
[048] A Figura 4 mostra respostas de IgG ((GMT) após administração de conjugados de polissacarídeo pneumocócico-eCRM monovalente em camundongos. Os sorotipos são mostrados no eixo X. Barras brancas são polissacarídeos adjuvados, mas não conjugados; barras negras são conjugados adjuvados.
[049] A Figura 5 mostra respostas de IgG (GMT) após a administração de vacinas pneumocócicas multivalentes em coelhos. Cada sorotipo (eixo X) tem dados para uma vacina conjugada de 24 valentes da invenção (esquerda), Prevnar-13 ™ (meio) e uma vacina não conjugada de 24 valências (direita). Os dados são médias +/- 95% de intervalo de confiança.
[050] A Figura 6 é semelhante à Figura 5, mas mostra respostas de OPA (GMT).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [051] Nas vacinas conjugadas de proteínas, a resposta imune a um antígeno fraco é amplificada por ligação a um antígeno proteico
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23/233 forte conhecido. Nessas biomoléculas semissintéticas, as proteínas que produzem respostas imunes fortes, de longa duração e dependentes de células T (antígenos dependentes de células T) são tipicamente ligadas a um antígeno fraco por química de oxidação/redução não específica. Os recursos de ativação de células T nessas proteínas imunogênicas recrutam células T auxiliares para células B que reconhecem o antígeno fraco ligado, e assim permitem uma resposta imune forte, de longa duração, a uma molécula imunologicamente fraca.
[052] Os atuais métodos e blocos de construção usados para a produção de vacinas conjugadas de proteínas dificultam a aplicação mais ampla de vacinas conjugadas para o tratamento e a prevenção de doenças. Primeiro, relativamente poucos antígenos proteicos fortes são quimicamente resistentes, não tóxicos e escalonáveis o suficiente para serem usados como veículos em vacinas conjugadas. Em segundo lugar, a química de oxidação/redução geralmente utilizada para a produção de vacinas conjugadas dificulta a conservação de epítopos no veículo e no antígeno necessários para a imunogenicidade máxima. Terceiro, a eficiência relativamente baixa dessas reações de oxidação/redução complica o controle de qualidade e a purificação, especialmente em escala comercial.
[053] A produção de proteína recombinante permite a otimização da antigenicidade e da não toxicidade de proteínas veículo, mas as proteínas veículo existentes são difíceis de produzir em células recombinantes e as proteínas totalmente manipuladas são difíceis de produzir com rendimentos elevados. Reações de conjugação mais suaves minimizam a desnaturação/obstrução de epítopos de portadores e antígenos, mas a menor eficiência dessas reações resulta em menor carga do antígeno na proteína veículo e esquemas de purificação mais complicados. É importante ressaltar que o antígeno relativamente
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24/233 menor para o veículo resulta em uma maior probabilidade de interferência imune por respostas de anticorpos à própria proteína veículo, ou o fenômeno reconhecido de supressão epitópica induzida pelo veículo.
[054] Assim, identificou-se a necessidade de estratégias e reagentes que permitissem a combinação dessas tecnologias produzir vacinas conjugadas de imunogenicidade de maior imunidade e mais facilmente fabricadas. Consequentemente, são descritos no presente documento, entre outros, (1) polipeptídeos, incluindo proteínas portadoras acentuadas, que compreendem aminoácidos não naturais; (2) antígenos que são adequados para conjugar a polipeptídeos, incluindo proteínas portadoras acentuadas, que compreendem aminoácidos não naturais; (3) conjugados de polipeptídeo-antígeno de (1) e (2), incluindo antígenos conjugados a proteínas portadoras acentuadas que compreendem aminoácidos não naturais; (4) composições de vacina que compreendem os supracitados; e (5) métodos de fabricação e uso dos supracitados.
1. Definições [055] O termo códon de supressão se refere a um tripleto de nucleotídeos que é introduzido em um polinucleotideo em uma localização predeterminada e é reconhecido por um tRNA específico que pode reconhecer um códon de parada (por exemplo, um códon de parada âmbar, ocre ou opalino) e permite que a tradução leia o códon para produzir a proteína, suprimindo assim o códon de parada.
[056] Um aminoácido não natural (nnAA) se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína; outros termos que são usados como sinônimos com o termo aminoácido não natural são aminoácido não naturalmente codificado, aminoácido não natural, aminoácido não natural e várias versões hifenizadas e não hifenizadas. Aminoácidos não naturais com
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25/233 cadeias laterais químicas bio-ortogonais reativas são capazes de ser usados como manejo químico para conjugar várias cargas úteis a sítios distintos em uma proteína.
[057] O termo identidade de sequência ou identidade percentual no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se refere a duas ou mais sequências que são iguais ou possuem uma porcentagem específica de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos, quando comparado e alinhado para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, conforme medido usando um algoritmo de comparação de sequência (por exemplo, BLASTP para sequências de aminoácidos). Para propósitos deste documento, a porcentagem de identidade é determinada ao longo da sequência completa, como a sequência de referência estabelecida na SEQ ID NO: 1. O método para calcular a identidade de sequência conforme fornecido no presente documento é o programa BLASTP que tem seus padrões apresentados como comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte, por exemplo, Henikoff & Henikoff, 1989, Proc Natl Acad Sei USA 89:10915). Consulte, por exemplo, a ferramenta de alinhamento BLAST disponível em WWW em blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ou em qualquer outro lugar.
[058] O termo antígeno se refere a qualquer molécula ou fragmento molecular linear que tem a capacidade de ser reconhecido pelos receptores de antígeno altamente variáveis (receptores de células B, receptores de células T ou ambos) do sistema imune adaptativo. Exemplos não limitativos de antígenos incluem polissacarídeos ou glicanos (por exemplo, polissacarídeos capsulares bacterianos), polinucleotídeos, poliaminoácidos, lipídeos e moléculas pequenas (por exemplo, haptenos, drogas de abuso).
[059] O termo epítopo de ativação de células T se refere a uma
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26/233 unidade estrutural de estrutura molecular que tem a capacidade de induzir imunidade de célula T. A função de proteínas veículo que incluem epítopos ativadores de células T bem conhecida e documentada para conjugados. Sem querer estar limitado pela teoria, um epítopo de ativação de células T na proteína veículo permite que o antígeno ligado covalentemente seja processado por células apresentadoras de antígeno e apresentado a células T CD4+ve para induzir memória imunológica contra o antígeno.
[060] O termo epítopo de célula B se refere geralmente àqueles recursos de uma estrutura macromolecular que têm a capacidade de induzir uma resposta de célula B. Ao contrário de um epítopo de células T, um epítopo de células B não necessita compreender um peptídeo, uma vez que o processamento por células apresentadoras de antígeno e o carregamento na fenda de ligação a peptídeo de MHC não é necessário para a ativação de células B.
[061] Como usado no presente documento, proteína veículo se refere a um polipeptídeo não tóxico ou desintoxicado contendo um epítopo de ativação de células T que tem a capacidade de ser ligado a um antígeno (por exemplo, um polissacarídeo) para aumentar a resposta humoral ao antígeno conjugado em um indivíduo. O termo inclui qualquer uma das proteínas bacterianas usadas como veículos de epítopos em vacinas aprovadas pela FDA. Em algumas modalidades, a proteína veículo é toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae (PD, HiD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC), CRM197, ou proteína de superfície específica de malária ookinete Pfs25. Em uma outra modalidade, a proteína veículo é BB, derivada da proteína G de cepa G148 de Streptococcus. Uma proteína veículo nativa tem apenas aminoácidos de ocorrência natural. Uma proteína veículo acentuada
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27/233 tem pelo menos um aminoácido não natural substituído por um aminoácido de ocorrência natural na proteína veículo.
[062] Como usado no presente documento, o termo polipeptideo imunogênico se refere a um polipeptideo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T, em que o epitopo de célula T é derivado de uma proteína com capacidade de induzir memória imunológica em animais.
[063] O termo eCRM ou CRM acentuado, como uso no presente documento indistintamente, se refere a uma versão modificada da variante de códon G52E da toxina da difteria, em que pelo menos um dos resíduos naturais de aminoácidos é substituído por um aminoácido não natural e o polipeptideo retém pelo menos um epitopo de ativação de células T.
[064] Como usado no presente documento, os termos modificado, trocado, acentuado e substituído são considerados sinônimos quando usados para descrever resíduos de um polipeptideo, e em todos os casos se referem à substituição de um aminoácido não natural por um aminoácido de ocorrência natural de uma cadeia polipeptídica.
[065] Como usado no presente documento, o termo antígeno independente de T se refere a um antígeno que induz os recursos de imunidade mediada por células B, ou que não induz processos associados com imunidade mediada por células T auxiliares como comutação de isotipos ou memória imunológica.
[066] O termo polissacarídeo como usado no presente documento, é usado em seu sentido comum, incluindo, sem limitação, sacarídeos que compreendem uma pluralidade de unidades de repetição, incluindo, sem limitação, polissacarídeos com 50 ou mais unidades de repetição, e oligossacarídeos com 50 ou menos unidades de repetição. Tipicamente, os polissacarídeos têm de cerca de 50, 55,
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60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 unidades de repetição a cerca de 2.000 ou mais unidades de repetição e, opcionalmente, de cerca de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1.000 unidades de repetição a cerca de, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800 ou 1.900 unidades de repetição. Oligossacarídeos tipicamente têm de cerca de 6, 7, 8, 9 ou 10 unidades de repetição a cerca de 15, 20, 25, 30, ou 35 a cerca de 40 ou 45 unidades de repetição.
[067] Como uso no presente documento, o termo glicano se refere a qualquer polímero linear ou ramificado que consiste em resíduos de monossacáridos (por exemplo, glicose) ligados entre si por ligações glicosídicas. Exemplos de glicanos incluem glicogênio, amido, ácido hialurônico e celulose. Outros exemplos de glicanos incluem polissacarídeos capsulares bacterianos.
[068] Como usado no presente documento, o termo peso molecular de um polissacarídeo ou de um conjugado polissacarídeoproteína veículo se refere ao peso molecular calculado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) combinada com dispersão de luz laser multiangular (MALS).
[069] O termo alquila inferior, como usado no presente documento, e a menos que especificado de outro modo, se refere a um hidrocarboneto linear ou ramificado saturado tendo um a seis átomos de carbono, isto é, alquila Ci a Ce. Em certas modalidades, o grupo alquila inferior é um hidrocarboneto primário, secundário ou terciário. O termo inclui unidades substituídas e não substituídas. Consulte também o documento US2014/0066598. O termo alquileno inferior se refere a um radical alquileno de uma alquila inferior.
[070] Os compostos das várias modalidades reveladas no presente documento, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis que contêm um ou mais centros assimétricos e dão origem a enantiômeros, diastereômeros e outras formas estereoisoméricas que são definidas,
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29/233 em termos de estereoquímica absoluta, como (R) ou (S), ou como (D) ou (L) para aminoácidos. A presente descrição pretende incluir todos esses isômeros, assim como, as suas formas racêmicas e opticamente puras. Os nnAA usados aqui são geralmente α-aminoácidos com um centro quiral no carbono a, e os mesmos são preferencialmente (L) isômeros.
[071] O protocolo de nomenclatura química e os diagramas de estrutura usados no presente documento são uma forma modificada do sistema de nomenclatura I.U.P.A.C., usando o programa de software ACD/Name Versão 9.07 e/ou o programa de nomeação de software ChemDraw Ultra Versão 11.0.1 (CambridgeSoft). Exceto conforme descrito abaixo, todas as ligações são identificadas nos diagramas de estrutura química no presente documento, exceto para todas as ligações em alguns átomos de carbono, que se presume serem ligados a átomos de hidrogênio suficientes para completar a valência.
2. Métodos Gerais [072] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o significado comumente entendido. Os praticantes são particularmente direcionados para Green & Sambrook (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), e Ausubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, Nova York (2012), e Plotkin, S.A., Orenstein, W.A., & Offit, Ρ.Α., Vaccines, 6 ed, Elsevier, London (2013), que são incorporados ao presente documento a título de referência, para definições e termos. Métodos padrão também aparecem em Bindereif, Schon, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Alemanha, que descreve métodos detalhados para manipulação e análise de RNA, e é incorporado ao presente documento a título de referência. Exemplos de técnicas moleculares
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30/233 apropriadas para gerar ácidos nucleicos recombinantes e instruções de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Green & Sambrook (Id.)-, Ausubel, F. M., et al., (Id.); Berger & Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., São Diego, Calif. 1987); e PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, São Diego, Calif. 1990), que estão incorporados ao presente documento a título de referência. Exemplos de técnicas bio-orgânicas apropriadas para ativar e derivar biomoléculas com manejos químicos, e instruções para projetar tais sínteses são encontrados em Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, 2aed., Elsevier, London (2008). Para exemplos de técnicas e componentes necessários para administração parenteral de biomoléculas descritas no presente documento, os profissionais são dirigidos a Remington, Essentials of Pharmaceutics, Pharmaceutical Press, Londres (2012). Os métodos para purificação de proteínas, cromatografia, eletroforese, centrifugação e cristalização são descritos em Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley e Sons, Inc., Nova York. Métodos para síntese livre de células são descritos em Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Alemanha. Métodos para incorporação de aminoácidos não naturais em proteínas usando síntese livre de células são descritos em Shimizu et al. (2006) FEBS Journal, 273, 4.133 a 4.140 e também em Chong (2014) Curr Protoc Mol Biol. 108:16.30.1-11.
[073] Métodos de amplificação por PCR são descritos, por exemplo, em Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. São Diego, Calif., 1990 e Domingues (ed.) PCR: Methods and Protocols ISBN 1493970593 (2017). Uma reação de amplificação inclui tipicamente o DNA que deve ser amplificado, uma polimerase de DNA termoestável, dois iniciadores
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31/233 oligonucleotídicos, trifosfatos de desoxinucleotídeo (dNTPs), tampão de reaçãoe magnésio. Normalmente, um número desejável de ciclos térmicos é entre 1 e 25. Métodos para o projeto de iniciadores e otimização de condições de PCR são encontrados em textos de biologia molecular como Ausubel et al., Short Protocols In Molecular Biology, 5a Edição, Wiley, 2002, e Innis et a!., PCR Protocols, Academic Press, 1990. Os programas de computador são úteis na concepção de iniciadores com a especificidade requerida e propriedades de amplificação ideais (por exemplo, Oligo Version 5.0 (National Biosciences)). Em algumas modalidades, os iniciadores de PCR contêm adicionalmente sítios de reconhecimento para endonucleases de restrição, para facilitar a inserção do fragmento de DNA amplificado em sítios de enzimas de restrição específicas em um vetor. Se forem adicionados sítios de restrição à extremidade 5’ dos iniciadores de PCR, é preferível incluir algumas (por exemplo, duas ou três) bases 5' extras para permitir divagem mais eficiente pela enzima. Em algumas modalidades, os iniciadores de PCR também contêm um sítio promotor de RNA polimerase, como T7 ou SP6, para permitir a transcrição in vitro subsequente. Métodos para transcrição in vitro são encontrados em fontes como Van Gelder et aí., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1.663 a 1.667, 1990; Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3.010 a 3.014, 1992.
[074] O termo peso molecular de um polissacarídeo ou de um conjugado polissacarídeo-proteína veículo é medido por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) combinada com dispersão de luz laser multiangular (MALS). A configuração SEC MALS-UV-RI consiste em uma HPLC Agilent 1100 (incluindo desgaseificador, bomba quaternária, amostrador automático com controle de temperatura, compartimento de coluna de temperatura controlada e detector de diodos UV-VIS) em linha com um detector de espalhamento de luz laser multi-ângulo DAWN
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HELEOS e interferômetro refrativo diferencial Optilab T-rEX (Wyatt Technology, Santa Bárbara, CA) para a detecção de espécies eluidoras. A seguinte série de colunas é anexada a esse sistema: TSKgel Guard PWXL 6,0 mm ID x 4,0 cm de comprimento, 12 pm de partícula; TSKgel 6000 PWXL 7,8 mm ID x 30 cm de comprimento, 13 pm de partícula; e um TSKgel 3000 PWXL 7,8 mm ID x 30 cm de comprimento, 7 pm de partícula. O compartimento da coluna é ajustado para 25 O e o compartimento da amostra é ajustado para 4 G. Uma fase móvel que consiste em 0,2 pm é filtrada 1x PBS com 5% v/v de acetonitrila é usada a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. As amostras são injetadas dentro de uma faixa de concentração de 0,2 a 1,5 mg/ml de polissacarídeo e o volume injetado é ajustado para produzir uma massa total injetada de 30 a 40 pg. O software Agilent Open Lab é usado para controlar a HPLC, e o software Wyatt Astra 7 é usado para coleta e análise de dados. A técnica revela a distribuição de pesos moleculares absolutos para os conjugados em uma amostra e os resultados para uma população são expressos como um valor médio.
[075] Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares isolados de S. pneumoniae são obtidos diretamente de bactérias com o uso de procedimentos de isolamento conhecidos por um versado na técnica (consulte, por exemplo, métodos revelados nas Publicações de Pedido de Patente n°US 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340 e 2008/0102498 e WO 2008/118752). Em outras modalidades, polissacarídeos capsulares isolados de S. pneumoniae são obtidos de uma fonte comercial (por exemplo, ATCC).
3. Polipeptideos [076] São descritos no presente documento polipeptideos que compreendem pelo menos um resíduo de nnAA. Polipeptideos adequados incluem qualquer polipeptideos biologicamente ativo. Em algumas modalidades, o polipeptideo é um polipeptideo imunogênico.
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Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por resíduos nativos de um polipeptídeo específico. Em outras modalidades, o resíduo de nnAA é anexado antes, anexados depois ou inserido na sequência de um polipeptídeo específico. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 resíduos de nnAA. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9 resíduos de nnAA. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende 2-9 resíduos de nnAA e, de preferência, 4 a 6 resíduos de nnAA. Ainda em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende 2 ou mais resíduos de nnAA que são quimicamente distintos.
[077] Em uma modalidade, a descrição fornece um polipeptídeo imunogênico que compreende um resíduo de nnAA. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 resíduos de nnAA. Em uma outra modalidade, os pelo menos dois resíduos de aminoácido não natural compreendem pelo menos dois aminoácidos não naturais diferentes. Em uma outra modalidade, os pelo menos dois aminoácidos não naturais diferentes são selecionados do grupo que consiste em ácido 2-amino-3-(4azidofenil)propanoico (pAF), ácido (azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, (azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico ou ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende um epítopo de ativação de células T de uma proteína veículo. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo é uma proteína
2-amino-3-(42-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6ácido
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34/233 veículo. Em uma outra modalidade, o nnAA não está em um epitopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o nnAA é substituído por um resíduo de lisina. Em uma outra modalidade, o polipeptideo é conjugado a um antigeno. Em uma outra modalidade, o antigeno é conjugado ao nnAA. Em uma outra modalidade, o antigeno compreende um antigeno independente de célula T selecionado do grupo que consiste em um hapteno, um polissacarídeo bacteriano capsular, um lipopolissacarídeo bacteriano ou um glicano derivado de tumor. Em uma outra modalidade, o antigeno compreende um polissacarídeo não capsular bacteriano, como um exopolissacarídeo, por exemplo, o exopolissacarídeo de S. aureus.
[078] Em uma modalidade, a descrição fornece uma proteína veículo que compreende um resíduo de nnAA. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 resíduos de nnAA. Em uma outra modalidade, o aminoácido não natural é selecionado do grupo que consiste em ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico ou ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o nnAA é substituído por um resíduo de lisina. Em uma outra modalidade, o resíduo de nnAA é em uma posição que não é em um epitopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, a substituição é selecionada do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 e K527, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade,
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35/233 a substituição compreende uma combinação de K25, K213, K245, K265, K386, e K523 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende um antígeno. Em uma outra modalidade, o antígeno compreende um antígeno independente de célula-T selecionado do grupo que consiste em um hapteno, um polissacarídeo bacteriano capsular, um lipopolissacarídeo bacteriano ou um glicano derivado de tumor. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo tem a capacidade de gerar uma resposta imune dependente de célula T.
[079] Em uma modalidade, a descrição fornece uma proteína que compreende um antígeno conjugado a um resíduo de aminoácido da proteína veículo, em que nenhum antígeno é conjugado a um resíduo de aminoácido natural da proteína veículo. Em uma outra modalidade, nenhum antígeno é conjugado a um resíduo de lisina da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o aminoácido não está em um epitopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o antígeno compreende um antígeno independente de célula T selecionado do grupo que consiste em um hapteno, um polissacarídeo bacteriano capsular, um lipopolissacarídeo bacteriano ou um glicano derivado de tumor. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos.
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36/233 [080] Idealmente, a proteína veículo deveria ter uma solubilidade de pelo menos 50 mg/l (por exemplo, pelo menos 100 mg/l, pelo menos 150 mg/l, pelo menos 200 mg/l, ou pelo menos 250 mg/l) quando expressa em um sistema de síntese de proteína livre de célula.
[081] Quando um veículo inclui mais do que um resíduo de nnAA, é preferencial incluir apenas uma única espécie de nnAA (por exemplo, o único nnAA no veículo é pAMF). Isso permite que a mesma química de conjugação seja usada simultaneamente em cada nnAA. Se for desejado fixar dois antígenos diferentes a uma única molécula veículo, isso pode ser alcançado através do uso de diferentes espécies de nnAA em um único carregador e conjugando cada antígeno a um nnAA diferente, mas a conjugação a uma única espécie de nnAA em um carregador é preferencial. Ademais, quando uma composição incluir múltiplos conjugados diferentes (por exemplo, diferentes sorotipos pneumocócicos), é preferencial que cada conjugado inclua as mesmas espécies únicas de nnAA. Adicionalmente, quando uma composição incluir múltiplos conjugados diferentes (por exemplo, diferentes sorotipos pneumocócicos), é preferencial que cada conjugado inclua a mesma proteína veículo.
[082] Em uma outra modalidade, a descrição fornece um polinucleotídeo que codifica o polipeptideo descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a descrição fornece um vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptideo descrito no presente documento. Em uma outra modalidade, a descrição fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor de expressão.
4. Aminoácidos não Naturais [083] O resíduo de nnAA opcionalmente compreende qualquer um dos aminoácidos não naturais descritos neste pedido, ou outros que foram identificados como compatíveis com síntese de proteínas à base
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37/233 de células ou sem células (consulte, por exemplo, Schultz et al. Annu Rev Biochem. 2010;79: 413 a 444 particularmente páginas 418 a 420; e Chin et al. Annu Rev Biochem. 2014; 83:5.1-5.30, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência).
[084] Exemplos de aminoácidos não naturais que podem ser usados nos métodos das modalidades incluem: um análogo não natural de um aminoácido de tirosina; um análogo não natural de um aminoácido de glutamina; um análogo não natural de um aminoácido de fenilalanina; um análogo não natural de um aminoácido de serina; um análogo não natural de um aminoácido de treonina; uma alquila, arila, acila, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxila, alquenila, alquinila, éter, tiol, sulfonila, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldeído, hidroxilamina, ceto ou aminoácido substituído por amino, ou qualquer combinação dos mesmos; um aminoácido com um agente de reticulação fotoativável; um aminoácido marcado por rotação; um aminoácido fluorescente; um aminoácido com um novo grupo funcional; um aminoácido que interage de forma covalente ou não covalente com outra molécula; um aminoácido de ligação ao metal; um aminoácido contendo metal; um aminoácido radioativo; um aminoácido fotocromo e/ou fotoisomerizável; um aminoácido contendo biotina ou análogo de biotina; um aminoácido glicosilado ou modificado com hidrato de carbono; um aminoácido contendo ceto; aminoácidos compreendendo polietilenoglicol ou poliéter; um aminoácido substituído por com um átomo pesado; um aminoácido quimicamente clivável ou fotoclivável; um aminoácido com uma cadeia lateral alongada; um aminoácido contendo um grupo tóxico; um aminoácido substituído por açúcar, por exemplo, uma serina substituída por açúcar ou similar; um aminoácido contendo açúcar ligado ao carbono; um aminoácido redox-ativo; um ácido contendo α-hidróxi; um aminoácido contendo tio aminoácido; um
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38/233 aminoácido α, α dissubstituído; um β-aminoácido; um aminoácido cíclico diferente de prolina, etc.
[085] Os nnAA particularmente preferenciais para uso com a invenção são aqueles que podem ser incorporados durante a tradução (em um sistema celular ou em um sistema livre de células) e que fornecem um grupo funcional que não é encontrado em nenhum dos 20 aminoácidos de ocorrência natural. Várias técnicas para incorporar tais aminoácidos em polipeptídeos são conhecidas, por exemplo, consulte Young & Schultz (2010) J Biol Chem 285:11039-44, Maza et al. (2015) Bioconjugate Chem. 26:1884-9, e Zimmerman et al. (2014) Bioconjugate Chem. 25:351-61.
[086] Em particular, o resíduo de nnAA opcionalmente compreende um grupo químico adequado para reação química de estalo com um grupo correspondente em uma molécula de antígeno separada ou hapteno. Grupos químicos adequados para química de estalo incluem, sem limitação, grupos azida (N3), alquino (C=C), alceno (C=C) e 1,2,4,5-tetrazina ( n-n ).
[087] O conjugado compreende um polipeptideo e um antígeno, em que 0 polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um nnAA, de preferência pelo menos dois nnAA, em que 0 antígeno é conjugado ao pelo menos um nnAA. Em algumas modalidades, 0 pelo menos um nnAA é um ácido 2,3-dissubstituído propanoico que porta um substituinte de amino na 2-posição e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetrazinila, ou um substituinte contendo etinila na 3-posição.
[088] Em uma outra modalidade relacionada, 0 conjugado compreende um polipeptideo e um antígeno, em que 0 polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de
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39/233 ativação de células T e pelo menos um resíduo de nnAA, em que o antígeno é conjugado ao nnAA e ainda em que o resíduo de nnAA corresponde a um aminoácido que tem a estrutura de Fórmula XII
W6 (pôl
O Ar (XU) [089] em que:
[090] Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo;
[091] W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-;
[092] Q1 é zero ou 1; e [093] W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetraziniIa opcionalmente C-substituído com um grupo alquila inferior, e etinila, [094] de modo que 0 resíduo de nnAA no polipeptídeo tenha a estrutura de Fórmula XIII
O Ar (XIII) [095] em que R3 é OH ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo, e R4 é H ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo.
[096] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um polipeptídeo que compreende pelo menos um nnAA substituído por um aminoácido de ocorrência natural no polipeptídeo nativo de acordo com SEQ ID NO:1, em que 0 pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523, ou K527 de SEQ ID NO:1, em que 0 nnAA compreende uma parte de ligação.
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Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido (azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido
2-amino-3-(42-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, K265 de SEQ ID NO:1 é substituído. Em uma outra modalidade, K386 de SEQ ID NO:1 é substituído. Em uma outra modalidade, K265 e K386 de SEQ ID NO:1
2-amino-3-(42-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6ácido são substituídos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4azidofenil)propanoico (pAF), ácido (azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, (azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, ou qualquer combinação dos mesmos.
[097] Em uma outra modalidade, o nnAA no polipeptídeo é um ácido 2,3-dissubstituído propanoico que porta um substituinte de amino na 2-posição e um substituinte contendo azido, um substituinte contendo 1,2,4,5-tetrazinila, ou um substituinte contendo etinila na 3posição. Em uma modalidade preferencial, o substituinte na 3-posição é um substituinte contendo azido e, em uma modalidade mais preferencial, o substituinte contendo azido compreende um grupo azido terminal ligado ao átomo de carbono na 3-posição através de um grupo de ligação. Por exemplo, o grupo de ligação pode compreender uma
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41/233 parte de arileno que é opcionalmente substituída e opcionalmente contendo heteroátomo. Por exemplo, o grupo de ligação pode compreender uma parte de arileno com 5 ou 6 membros contendo 0 a 4 heteroátomos e 0 a 4 substituintes do anel não hidrogênio.
[098] Em uma modalidade mais preferencial, o nnAA tem a estrutura de Fórmula XII w6 (W^
O Ar
Figure BR112019013475A2_D0001
(XII) [099] em que:
[0100] Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo;
[0101] W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-;
[0102] Q1 é zero ou 1; e [0103] W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetraziniIa opcionalmente C-substituído com um grupo alquila inferior, e etinila.
[0104] Será reconhecido que, nesse caso, 0 resíduo de nnAA correspondente no polipeptídeo tem a estrutura de Fórmula XIII w6
O Ar
Figure BR112019013475A2_D0002
V (xiii) [0105] em que R3 é OH ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo, e R4 é H ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo.
[0106] Em algumas modalidades, Ar não contém nenhum heteroátomo, em caso que 0 ligante preferencial é um grupo fenileno não substituído (isto é, Ar é -C6H4-). Em outras modalidades, Ar contém
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42/233 um heteroátomo de nitrogênio e pelo menos um heteroátomo adicional selecionado de N, O e S. Exemplos de heterociclos de nitrogênio são descritos infra e Ar pode ser, por exemplo, uma piridina ou uma piridazina. Em uma modalidade particularmente preferencial, Q1 é 1, W5 é alquileno inferior, e W6 é azido.
Aminoácidos contendo azido:
[0107] Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA compreende um nnAA contendo azido. Em particular, modalidades, o resíduo de nnAA compreende um nnAA contendo azido de Fórmula I:
Figure BR112019013475A2_D0003
nh2 [0108] em que:
[0109] D é —Ar—W3— ou —W1— Y1— C(O)—Y2—W2—;
Figure BR112019013475A2_D0004
Figure BR112019013475A2_D0005
[0111] cada de W1, W2 e W3 é independentemente uma ligação simples ou alquileno inferior;
[0112] cada Xi é independentemente —NH—, —O—, ou —S—;
[0113] cada Y1 é independentemente uma ligação simples, —NH— , ou —O—;
[0114] cada Y2 é independentemente uma ligação simples, —NH— , —O—, ou um pirrolidinileno ligado em N ou ligado em C; e [0115] um de Zi, Z2, e Z3 é -N- e os outros de Z1, Z2, e Z3 são independentemente -CH-.
[0116] Em outras modalidades, 0 resíduo de nnAA compreende um
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43/233 aminoácido contendo azido de Fórmula II:
Figure BR112019013475A2_D0006
[0117] em que:
[0118] W4 é C1-C10 alquileno.
[0119] Em uma modalidade 0 resíduo de nnAA compreende um aminoácido contendo azido selecionado do grupo que consiste em ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico ou 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico e qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, 0 resíduo de nnAA compreende ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (pAMF). O pAMF fornece uma cinética de reação muito favorável para a produção de conjugados (por exemplo, muito mais rapidamente do que com 0 uso do pAF quando se reage com um antígeno de hidratos de carbono contendo um alquino em um método SPAAC).
[0120] A preparação de aminoácidos contendo azido de acordo com as Fórmulas I e II é encontrada, por exemplo, em Stafford etal. US20140066598A1, particularmente os parágrafos [0331] a [0333], que estão incorporados ao presente documento a título de referência. O processo envolve a substituição de grupos hidroxila por cloreto em derivados dos aminoácidos arílicos correspondentes com 0 uso de cloreto de tionila, seguido de deslocamento nucleofílico do cloreto com azida. Os aminoácidos contendo cadeia lateral de arila adequados são também adquiridos comercialmente.
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Aminoácidos contendo 1,2,4,5-tetrazinila:
[0121] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural resíduo compreende um nnAA contendo 1,2,4,5-tetrazina. Em modalidades particulares, o aminoácido não natural compreende um nnAA contendo 1,2,4,5-tetrazina de Fórmula III:
Figure BR112019013475A2_D0007
[0122] em que:
Figure BR112019013475A2_D0008
Figure BR112019013475A2_D0009
[0124] V é uma ligação simples, alquileno inferior, ou -W1-W2-;
[0125] um de W1 e W2 está ausente ou alquileno inferior, e o outro é-NH-, -O-, ou -S-;
[0126] cada um de Ζι, Z2, e Z3 é -CH- ou -N- e os outros de Z1, Z2, e Z3 são cada um independentemente -CH-; e X1 é independentemente -NH-, -O-, ou -S-;
[0127] R é alquila inferior;
Figure BR112019013475A2_D0010
[0128] e, opcionalmente, quando Ar é -4« θ V é-NH-, então um de Ζι, Z2, e Z3 é -N- desde que 0 aminoácido não natural não seja:
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Figure BR112019013475A2_D0011
[0129] A preparação aminoácidos contendo de 1,2,4,5-tetrazina de acordo com Fórmula III é encontrada, por exemplo, em Yang et al. US2016-0251336A1, particularmente os parágrafos [0341 ] a [0377], que estão incorporados ao presente documento a título de referência. O processo envolve o acoplamento de Negishi de um derivado amino/carboxila protegido do ácido (R)-2-amino-3-iodopropanoico com brometo de aminopiridila para introduzir Ar, seguido de reação com um derivado de metiltio-1,2,4,5-tetrazina para introduzir a parte de tetrazina no aminoácido.
Aminoácidos contendo alquino:
[0130] Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA compreende um nnAA contendo alquino. Em uma modalidade, esse é um grupo propargila. Uma variedade de aminoácidos contendo propargila, incluindo suas sínteses, é encontrada em Beatty et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7364-7; Beatty et al. J. Am. Chem. Soc. 2005(127): 14150-1; Nguyen et al. J Am Chem Soc. 2009(131):8720-1. Tais aminoácidos contendo propargila são adequados para incorporação como nnAAs em proteínas com o uso de sistemas à base de células. Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA compreende um nnAA contendo propargila selecionado do grupo que consiste em homopropargilglicina, etinilfenilalanina, e N6-[(2-propiniloxi)carbonil]-Llisina.
5. Proteínas veículo modificadas [0131] Em um aspecto, o polipeptídeo que compreende pelo menos um resíduo de nnAA é uma versão modificada de uma proteína veículo nativa (por exemplo, eCRM), ou um polipeptídeo que compreende um
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46/233 ou uma pluralidade de epítopos de ativação de células T de uma proteína veículo nativa. Proteínas veículo adequadas para tal modificação incluem, sem limitação, proteínas usadas em vacinas conjugadas como toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae (PD, HiD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC), ou CRM197.
[0132] As sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos de muitas proteínas portadoras nativas estão publicamente disponíveis. Como notado, no entanto, essas proteínas veículo não modificadas (ou nativas) têm limitações, incluindo conjugação de antígeno não discriminatório a qualquer aminoácido exposto à superfície. Como resultado, os epítopos de ativação de células T são frequentemente sítios onde a conjugação de antígeno ocorre. Em uma modalidade preferencial da presente descrição, o polipeptideo imunogênico é uma proteína veículo modificada pela inclusão de pelo menos um resíduo de nnAA para uso como um sítio de conjugação. Como discutido acima, o nnAA pode ser substituído por um resíduo nativo ou adicionado ao polipeptideo anexando antes, acrescentando após, ou inserindo dentro da sequência do polipeptideo. O uso de aminoácidos não naturais, conforme descrito no presente documento, permite a colocação seletiva de aminoácidos não naturais para conjugação e, como resultado, os epítopos de ativação de células T da proteína veículo acentuada podem ser evitados na conjugação de antígeno.
[0133] A Tabela 1 mostras as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos (SEQ ID NOs: 1 & 2) de uma proteína veículo nativa exemplificadora: CRM197. Os versados na técnica reconhecerão a adição de uma metionina N-terminal à sequência de aminoácidos do CRM197 convencional produzido por fermentação de C. diphteriae e a adição resultante de 1 à numeração da posição do resíduo de
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47/233 aminoácido convencional. A metionina está presente devido à inclusão de um códon de iniciação no método de síntese de proteína sem células que foi usado para produzir esses veículos no presente documento. Em alguns aspectos, a proteína veículo acentuada que compreende os resíduos de nnAA tem pelo menos 80% de identidade de sequência, pelo menos 85% de identidade de sequência, pelo menos 90% de identidade de sequência, ou pelo menos 95% de identidade de sequência com uma proteína veículo não tóxica ou nativa homóloga usada em uma vacina conjugada.
[0134] As proteínas veículo com identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 (CRM197) incluem outras proteínas mutantes da toxina da difteria, como o mutante duplo K51E/E148K não tóxico que também foi usado como uma proteína veículo em conjugados (Pecetta et al. 2016 Vaccine 34:1405-11). Em todas essas variantes da SEQ ID NO: 1, a toxicidade natural da toxina da difteria de tipo selvagem está ausente (através da mutação G52E em CRM197, ou as mutações K51E/E148K de Pecetta et al.
[0135] A Tabela 1 também mostra a sequência de aminoácidos da proteína D (SEQ ID NO: 8) de H.influenzae. A proteína veículo acentuada que compreende resíduos de nnAA pode ter pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:8. Pelo menos um resíduo de Lys na SEQ ID NO: 8 pode ser substituído por um nnAA. Existem 36 resíduos de Lys na SEQ ID NO: 8, pelo que vários podem ser substituídos por nnAA e depois usados para conjugação.
[0136] Quando a identidade da sequência é determinada em relação à toxina de difteria ou do tétano, a mesma deve ser determinada em relação à sequência da cadeia pesada processada, por exemplo, em relação aos aminoácidos 226-567 de P00588-1, ou aos aminoácidos 458-1315 de P04958-1 (sequências UniProt).
[0137] Em algumas modalidades, a proteína veículo acentuada que
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48/233 compreende os resíduos de nnAA compreende menos que a sequência nativa completa da proteína veículo e, em vez disso, compreende pelo menos um ou uma pluralidade de epítopos de ativação de células T de toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae (PD, HiD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC), CRM197, Pfs25, ou uma outra proteína veículo nativa ou não tóxica adequada. Em algumas modalidades, a toxicidade da proteína veículo acentuada é limitada por tratamento com paraformaldeído (ou por tratamento com formaldeído ou glutaraldeído) seguido por um agente de arrefecimento brusco. Em uma modalidade, a proteína veículo acentuada que compreende os resíduos de nnAA é um polipeptideo que compreende uma pluralidade de epítopos de ativação de células-T de CRM197 nativo.
Tabela 1: Sequências de aminoácidos e ácidos nucléicos CRM197 e NTHi-D nativas
Aminoácido >4AE1_B MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKP KSGTQG N YD D DW KE FYSTDN KYDAAG YSVD N EN PLSG K AGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLME QVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQ AKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR SVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESP NKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFA GANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVM GIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGF AAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYA VSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTI PGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPV YVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKT
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VDHTKVNSKLSLFFEIKS (SEQ ID NO: 1)
Acido >KU521393.1 Clone de construto sintético pUC57-CRM197 nucleic toxina gene CRM197 (CRM197), cds completo o ATGGGCGCAGACGATGTTGTGGACTCAAGTAAATCATT
TGTCATGGAAAACTTCTCCTCATATCACGGCACGAAAC
CGGGCTACGTTGATAGCATTCAGAAAGGTATCCAAAAA
CCGAAATCTGGCACGCAGGGTAACTACGATGACGATT
GGAAAGAATTCTACAGCACCGACAACAAATATGATGCG
GCCGGTTACTCAGTCGACAACGAAAATCCGCTGTCGG
GCAAAGCCGGCGGTGTGGTTAAAGTGACGTATCCGGG
CCTGACCAAAGTCCTGGCCCTGAAAGTGGATAATGCA
GAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCCTGACGG
AACCGCTGATGGAACAGGTTGGCACCGAAGAATTTATC
AAACGCTTCGGCGATGGTGCCAGTCGTGTCGTGCTGT
CCCTGCCGTTCGCAGAAGGTAGCTCTAGTGTGGAATAT
ATTAACAATTGGGAACAAGCGAAAGCCCTGTCCGTTGA
ACTGGAAATCAACTTTGAAACCCGCGGCAAACGTGGTC
AGGATGCGATGTATGAATACATGGCACAAGCTTGCGC
GGGTAATCGCGTTCGTCGCAGCGTCGGCTCCTCACTG
TCTTGTATCAACCTGGACTGGGATGTTATCCGTGATAA
AACCAAAACGAAAATCGAAAGTCTGAAAGAACATGGCC
CGATCAAAAACAAAATGAGCGAATCTCCGAATAAAACG
GTGTCCGAAGAAAAAGCTAAACAGTATCTGGAAGAATT
CCACCAAACCGCACTGGAACATCCGGAACTGTCAGAA
CTGAAAACCGTGACGGGTACCAACCCGGTTTTTGCCG
GCGCAAATTACGCAGCTTGGGCTGTGAACGTTGCGCA
AGTGATTGACTCGGAAACGGCCGATAATCTGGAAAAAA
CCACGGCGGCCCTGAGTATTCTGCCGGGCATCGGTTC
CGTTATGGGTATTGCCGACGGCGCAGTCCATCACAAC
ACCGAAGAAATTGTGGCCCAGTCTATCGCACTGTCGA
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GCCTGATGGTTGCTCAAGCGATTCCGCTGGTTGGCGA ACTGGTTGATATCGGC1 1 1GCAGCTTACAACTTCGTGG AAAGTATTATCAACCTG 1 1 1 CAGGTTGTCCACAACTCAT ATAATCGCCCGGCCTACTCGCCGGGTCACAAAACCCA ACCGTTCCTGCATGACGGCTACGCGGTTAGCTGGAAT ACGGTCGAAGATTCTATTATCCGTACCGGC1 1 1 CAGGG TGAATCTGGCCACGACATTAAAATCACGGCTGAAAACA CCCCGCTGCCGATTGCAGGTGTTCTGCTGCCGACGAT CCCGGGTAAACTGGATGTTAACAAATCAAAAACCCATA TCTCGGTCAACGGTCGCAAAATTCGTATGCGCTGCCGT GCGATCGACGGCGATGTGACCTTCTGTCGTCCGAAAA GCCCGGTCTATGTGGGCAACGGTGTCCATGCTAATCT GCACGTGGCG 1 1 1 CATCGCTCTAGTTCCGAAAAAATCC ATAGTAACGAAATCTCATCGGATTCCATTGGTGTGCTG GGCTACCAGAAAACCGTGGACCATACCAAAGTGAATA GCAAACTGAGCCTGTTCTTCGAAATCAAATCGTAA (SEQ ID NO:2)
Aminoácido >AAA24998.1 Proteína D de Haemophilus influenzae ATGGGCGCAGACGATGTTGTGGACTCAAGTAAATCATT TGTCATGGAAAACTTCTCCTCATATCACGGCACGAAAC CGGGCTACGTTGATAGCATTCAGAAAGGTATCCAAAAA CCGAAATCTGGCACGCAGGGTAACTACGATGACGATT GGAAAGAATTCTACAGCACCGACAACAAATATGATGCG GCCGGTTACTCAGTCGACAACGAAAATCCGCTGTCGG GCAAAGCCGGCGGTGTGGTTAAAGTGACGTATCCGGG CCTGACCAAAGTCCTGGCCCTGAAAGTGGATAATGCA GAAACCATCAAAAAAGAACTGGGTCTGAGCCTGACGG AACCGCTGATGGAACAGGTTGGCACCGAAGAAI I IATC AAACGCTTCGGCGATGGTGCCAGTCGTGTCGTGCTGT
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CCCTGCCGTTCGCAGAAGGTAGCTCTAGTGTGGAATAT
ATTAACAATTGGGAACAAGCGAAAGCCCTGTCCGTTGA
ACTGGAAATCAACTTTGAAACCCGCGGCAAACGTGGTC
AGGATGCGATGTATGAATACATGGCACAAGCTTGCGC
GGGTAATCGCGTTCGTCGCAGCGTCGGCTCCTCACTG
TCTTGTATCAACCTGGACTGGGATGTTATCCGTGATAA
AACCAAAACGAAAATCGAAAGTCTGAAAGAACATGGCC
CGATCAAAAACAAAATGAGCGAATCTCCGAATAAAACG
GTGTCCGAAGAAAAAGCTAAACAGTATCTGGAAGAATT
CCACCAAACCGCACTGGAACATCCGGAACTGTCAGAA
CTGAAAACCGTGACGGGTACCAACCCGGTTTTTGCCG
GCGCAAATTACGCAGCTTGGGCTGTGAACGTTGCGCA
AGTGATTGACTCGGAAACGGCCGATAATCTGGAAAAAA
CCACGGCGGCCCTGAGTATTCTGCCGGGCATCGGTTC
CGTTATGGGTATTGCCGACGGCGCAGTCCATCACAAC
ACCGAAGAAATTGTGGCCCAGTCTATCGCACTGTCGA
GCCTGATGGTTGCTCAAGCGATTCCGCTGGTTGGCGA
ACTGGTTGATATCGGCTTTGCAGCTTACAACTTCGTGG
AAAGTATTATCAACCTGTTTCAGGTTGTCCACAACTCAT
ATAATCGCCCGGCCTACTCGCCGGGTCACAAAACCCA
ACCGTTCCTGCATGACGGCTACGCGGTTAGCTGGAAT
ACGGTCGAAGATTCTATTATCCGTACCGGCTTTCAGGG
TGAATCTGGCCACGACATTAAAATCACGGCTGAAAACA
CCCCGCTGCCGATTGCAGGTGTTCTGCTGCCGACGAT
CCCGGGTAAACTGGATGTTAACAAATCAAAAACCCATA
TCTCGGTCAACGGTCGCAAAATTCGTATGCGCTGCCGT
GCGATCGACGGCGATGTGACCTTCTGTCGTCCGAAAA
GCCCGGTCTATGTGGGCAACGGTGTCCATGCTAATCT
GCACGTGGCGTTTCATCGCTCTAGTTCCGAAAAAATCC
ATAGTAACGAAATCTCATCGGATTCCATTGGTGTGCTG
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GGCTACCAGAAAACCGTGGACCATACCAAAGTGAATA GCAAACTGAGCCTGTTCTTCGAAATCAAATCGTAA (SEQ ID NO:8)
5a. CRM 197 contendo nnAA [0138] Conforme mencionado acima, a Tabela 1 mostra a sequência de aminoácidos (SEQ ID NO:1) de CRM197. CRM197 (‘material de reação cruzada 197’; também conhecido como CRM197) é um mutante não tóxico de toxina de difteria que é usado em muitas vacinas glicoconjugadas aprovadas (por exemplo, consulte Broker etal. (2011) Biologicals 39:195-204). Proteínas portadoras preferenciais para uso com a invenção compreendem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Por exemplo, a proteína veículo pode compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1, exceto pela presença de um ou mais nnAA (que podem ser inseridos em SEQ ID NO:1 ou pode ser substituídos por um ou mais resíduos de aminoácido em SEQ ID NO:1 por exemplo, substituídos por Lys e/ou Phe).
[0139] Em algumas modalidades, pelo menos um resíduo de Lys e/ou pelo menos um resíduo de Phe em SEQ ID NO:1 é substituído por um resíduo de nnAA. É preferencial substituir mais do que um resíduo na SEQ ID NO: 1 por um nnAA e, idealmente, apenas uma espécie de resíduo na SEQ ID NO: 1 é substituída por um nnAA, por exemplo, apenas os resíduos de Lys são substituídos. Quando mais do que um resíduo na SEQ ID NO: 1 é substituído por um nnAA, é preferencial que 0 mesmo nnAA seja usado em cada posição, por exemplo, pAMF em cada posição de substituição.
[0140] As proteínas veículo com 2-9 de resíduos nnAA na SEQ ID NO: 1 são preferenciais e, idealmente, com 4-9, 4-8 ou 4-6 resíduos de nnAA, por exemplo, 4, 5 ou 6 resíduos de nnAA. Isso permite uma
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53/233 ligação mais extensa de antígenos ao veículo do que o uso de um único nnAA, aumentando, assim, a proporção antígeno: veículo, evitando a ruptura excessiva da sequência e estrutura nativas, o que pode resultar em insolubilidade.
[0141] Estudos de CRM197 identificaram epítopos de célula T em resíduos P272-D291, V322-G384, e Q412-I458. Assim, é preferencial evitar a introdução de nnAA nessas regiões de SEQ ID NO:1. Essas regiões incluem F274, F356, F361, F369, K420, K441, K446, K448, e K457, então esses são os resíduos de Phe e Lys que são menos preferenciais para substituição de nnAA em CRM197. Os resíduos de Lys preferenciais para substituição por um nnAA em SEQ ID NO:1 são K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 ou K527. Outros resíduos de Lys úteis para substituição por um nnAA são K11, K38, K83, K104, K105, K126, K158, K173, K222, K237, K243, K475 e K499. Os resíduos de Phe preferenciais para substituição por um nnAA são F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 ou F532.
[0142] Estudos estruturais de CRM197 revelam duas regiões 3D gerais: a primeira região vai do N-terminal a Asn-374; e a segunda região vai de Ser-375 a C-terminal. Idealmente, um veículo usado com a invenção inclui pelo menos um nnAA na primeira região e pelo menos um nnAA na segunda região, por exemplo, pelo menos 2 nnAA em cada região, ou pelo menos 3 nnAA em cada região. Isso permite que os antígenos conjugados sejam espacialmente separados quando ligados ao veículo. Um veículo com 3 nnAA na primeira região e 3 nnAA na segunda região é útil.
[0143] A primeira região contém 27 resíduos de Lys e a segunda região contém 12 resíduos de Lys. Dessa forma, um ou mais (por exemplo, 3) resíduos de Lys nos 374 aminoácidos de N-terminal e um ou mais (por exemplo, 3) resíduos de Lys nos 162 aminoácidos de C
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54/233 terminal de SEQ ID N0:1 podem ser substituídos por um nnAA, por exemplo, em pAMF.
[0144] Modalidades preferenciais de veículos contendo nnAA à base de CRM197 têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:1 em que um ou mais de resíduos K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 e/ou K527 são substituídos por um nnAA. Tal sequência é SEQ ID NO:9, em que cada X representa um nnAA (de preferência, o mesmo nnAA, como pAMF):
[0145] MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQXGIQKP KSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKV TYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGA SRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAM YEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDXTKTKIESLKEHGPI KNKMSESPNKTVSEEKAXQYLEEFHQTALEHPELSELXTVTGTNPVF AGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAV HHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVV HNSYNRPAYSPGHXTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDI
KITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDV TFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQK TVDHTKVNSXLSLFFEIKS (SEQ ID NO: 9) [0146] Verificou-se que essa proteína veículo é muito bem expressa em um sistema de síntese proteica sem células, mantendo boa solubilidade e proporcionando boas respostas imunogênicas quando conjugada a polissacarídeos capsulares pneumocócicos.
[0147] A invenção também fornece uma composição que inclui múltiplos conjugados diferentes (por exemplo, diferentes sorotipos pneumocócicos), em que cada conjugado inclui uma proteína veículo que tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:9 (idealmente em que cada resíduo de X seja o mesmo nnAA, de preferência, pAMF).
[0148] A SEQ ID NO: 1 possui uma metionina em N-terminal (que
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55/233 será tipicamente formilada) que não está presente em CRM197 do tipo selvagem, mas é incluída para iniciar a tradução sem requerer toda a sequência líder nativa. Em algumas modalidades, a proteína veículo usada no presente documento carece de uma metionina em N-terminal, por exemplo, a metionina em N-terminal de SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:9 pode estar ausente. Em algumas modalidades, uma proteína veículo à base de CRM197 não inclui nenhum aminoácido natural (e, com mais preferência, nenhum aminoácido) a montante do N-terminal de SEQ ID NO: 1 ou a jusante do C-terminal de SEQ ID NO: 1.
[0149] Essas proteínas portadoras CRM197 contendo nnAA são particularmente úteis para conjugação a polissacarídeos capsulares pneumocócicos. Esses conjugados podem ser combinados para formar composições multivalentes conforme discutido em outro lugar no presente documento.
[0150] A invenção também fornece uma proteína para preparar um conjugado polissacarídeo imunogênico-proteína, em que a proteína tem uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1 (por exemplo, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%) e inclui pelo menos um nnAA, em que a proteína tem uma metionina em N-terminal. A invenção também fornece um conjugado polissacarídeo imunogênico-proteína preparado pela conjugação de um polissacarídeo a pelo menos um nnAA na proteína.
[0151] A invenção também fornece uma proteína para preparar um conjugado polissacarídeo imunogênico-proteína, em que a proteína compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1, exceto que pelo menos um (por exemplo, 2-9) resíduo de lisina é um nnAA. O nnAA é idealmente um nnAA contendo azido (como pAMF, que é preferencial), um nnAA contendo 1,2,4,5-tetrazinila ou um nnAA contendo alquenila. A invenção também fornece um conjugado que
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56/233 compreende tal proteína conjugada a um polissacarídeo antígeno via pelo menos um de seus nnAA.
[0152] A invenção também fornece um conjugado polissacarídeo imunogênico-proteína, em que a proteína é CRM197 que tem uma metionina em N-terminal.
[0153] Os veículos CRM197 contendo nnAA estão tipicamente presentes na forma monomérica quando utilizados para a preparação de conjugados, em vez de estarem associados a outras subunidades de CRM197 para formar multimetros de CRM197.
6. Métodos de Produção de Proteína Veículo
Métodos gerais para produção de polipeptideo:
[0154] A proteína veículo acentuada é produzida por qualquer método descrito para a produção de polipeptídeos. Os métodos adequados para a produção de polipeptídeos incluem, sem limitação, síntese de peptídeos químicos em fase sólida, expressão de proteína recombinante à base de células (em E. coliou um hospedeiro nativo), e expressão proteica livre de células e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, ligação de proteína expressa com o uso de uma combinação de componentes de peptídeo sintético e recombinante).
[0155] Em uma modalidade do método de produção de proteína veículo acentuada, a proteína veículo acentuada que porta nnAA é produzida por meio de um método que compreende reatribuição de códon. Em uma variação dessa modalidade, nnAAs que são análogos estruturais próximos dos 20 aminoácidos canônicos (por exemplo, homoallilglicina, leucina fluorada, azido-homoalanina) são usados. O nnAA é carregado em seu tRNA correspondente usando aminoaciltRNA sintetases de tipo selvagem, e o nnAA substitui completamente um dos 20 aminoácidos canônicos especificados em uma sequência de DNA modelo. Para evitar a interferência do aminoácido nativo, isto geralmente requer o uso de uma cepa de expressão bacteriana que é
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57/233 auxotrófica para o aminoácido nativo que está sendo substituído. Essa estratégia é um aminoácido em vez de um resíduo específico, uma vez que todos os resíduos AA de um certo tipo são substituídos pelo nnAA. [0156] Em uma outra modalidade do método de produção de proteína veículo acentuada, a proteína veículo acentuada que porta nnAA é produzida por uma estratégia que compreende supressão sem sentido. Nessa abordagem, o aminoácido não natural é especificado em uma sequência de DNA modelo por um códon raro ou sem sentido que normalmente não especifica um aminoácido na natureza. Uma variação da abordagem de supressão sem sentido foi iniciada por Schultz (Noren etal. Science. 1989(244):182 a 188.) e Chamberlin (Bain et al. J Am Chem Soc. 1989(111):8.013 e 8.014.), e envolve o uso do códon de parada raro TAG (o códon âmbar; UAG no código RNA) juntamente com seu tRNA e sua correspondente aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) para incorporar nnAAs em um polipeptideo de uma maneira específica ao sítio.
[0157] Em uma modalidade, a abordagem de supressão sem sentido envolve o isolamento de um par de tRNA/aaRS, modificando o tRNA no laço anti-códon para reconhecer um códon ortogonal (por exemplo, o códon âmbar TAG, o códon opala TGA ou outro códon ou sequência de bases não comumente usado para especificar aminoácidos na tradução), e modificando os aaRS para preferir o nnAA sobre o aminoácido nativa aminoacil-tRNAs. Em algumas variações dessa modalidade, o par tRNA/aminoacil-tRNA-sintetase é do mesmo organismo que a maquinaria de tradução usada para a síntese de polipeptideo. tRNA/aminoacil-rRNA-sintetase é de uma espécie. Em outras modalidades, o par de tRNA/aminoacil-rRNA-sintetase é de uma espécie diferente do mecanismo de tradução utilizado para a síntese de polipeptídeos. Foram descritos métodos para modificar o laço de anticódon de tRNA e o sítio ativo de aaRS, assim como exemplos de pares
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58/233 de tRNA/aaRS ortogonais projetados.
[0158] Em uma outra modalidade da abordagem de supressão sem sentido, a produção da proteína veículo acentuada não envolve a utilização de uma aminoacil-tRNA-sintetase manipulada. Nessa modalidade, isola-se e modifica-se apenas um tRNA ortogonal no laço anti-códon para reconhecer um códon ortogonal (por exemplo, o códon de cor âmbar TAG ou outro códon ou sequência de base não vulgarmente utilizado para especificar aminoácidos na tradução). O tRNA ortogonal manipulado é, então, acilado in vitro por um método químico adequado (por exemplo, o método de Heckler et al. Biochemistry. 1984 Mar 27;23(7): 1.468 a 1.473 que envolve o uso de T4 RNA ligase e mutante tRNAPhe), e suplementado em um extrato de síntese de proteína livre de células. Como essa modalidade utiliza rRNA quimicamente acilado, a mesma é apenas compatível com métodos de síntese de proteínas que são livres de células.
Síntese de proteína livre de células:
[0159] Uma técnica particularmente útil para produzir proteínas portadoras contendo nnAA usa síntese de proteína livre de células. São conhecidas na técnica diversas técnicas de expressão de proteína livre de células e vários nnAA podem ser incorporados dessa forma (por exemplo, consulte a Tabela 1 de Quast et al. (2015) FEBS Letters 589:1.703 a 1.712) enquanto evita possíveis efeitos citotóxicos de nnAA. Em algumas modalidades, a proteína veículo acentuada é produzida por síntese de proteína à base de extrato livre de célula. Em algumas modalidades, o extrato livre de célula compreende um extrato de reticulócitos de coelho, germe de trigo ou E. coli. Em modalidades adicionais, o extrato livre de célula é suplementado com aminoácidos, fontes de energia, sistemas de regeneração de energia, ou cofatores de cátion, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o extrato compreende tRNA mutante exogenamente suplementado ou
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59/233 aaRS mutante (aminoacil tRNA sintetase), e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o extrato compreende lisados de cepas de E. colique codificam geneticamente tRNA mutante ou aaRS mutante, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as cepas de E. coli usadas para lisados são cepas atenuadas de RF-1. Sistemas de síntese de proteínas compatíveis com células livres foram descritos para a inserção de Fórmulas I, II e III em polipeptídeos recombinantes (por exemplo, US8715958B2, US20160257946A1 e US 20160257945A1).
[0160] Em um exemplo, o documento US8715958B2 demonstra um sistema à base de E. colide regeneração livre de células em que o par de tRNATyr/Tirosina-sintetase de Methanococcus jannaschii Ç\Nang et al. (2001) Science 292(5516):498-500) é usado para introduzir o aminoácido não natural p-azido-L-fenilalanina (pAF) em cloramfenicol acetiltransferase recombinante (CAT), GM-CSF, e TetA. Usando esse sistema, o par tRNA/sintetase é suplementado no extrato, ou transformado em bactérias usadas para fazer o extrato.
[0161] Em um outro exemplo, o documento US20160257946A1 demonstra: (a) como a Tirosina-sintetase de Methanococcus jannaschii acima é adaptada usando mutagênese para que carregue preferencialmente p-azidometil-L-fenilalanina (pAMF) em um tRNA reconhecedor de âmbar, e (b) como um sistema de síntese livre de células compreendendo o par sintetase/tRNA modificado é utilizado para incorporar seletivamente o pAMF em anticorpos como o trastuzumab.
[0162] Em um exemplo adicional, o documento US20160257945A1 demonstra: (a) como a Tyrosine-sintetase acima de Methanococcus jannaschii é adaptada ao uso de mutagênese de modo que preferencialmente carregue ácido (S)-2-amino-3-(5-((6-metil-1,2,4,5tetrazin-3-ilamino)metil)piridin-2-il)propanoico (um derivado de
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60/233 aminoácido piridil tetrazina) em um tRNA reconhecedor de âmbar, e (b) como um sistema de síntese livre de célula que compreende o par de sintetase/tRNA modificado é usado para incorporar seletivamente ácido (S)-2-amino-3-(5-((6-metil-1,2,4,5-tetrazin-3-ilamino)metil)piridin-2il)propanoico em GFP recombinante.
[0163] Em uma modalidade adicional, a descrição fornece métodos de produção de polipeptídeos em um extrato livre de célula contendo 2 ou mais aminoácidos não naturais. Nessa modalidade, os polipeptídeos também têm atividade biológica comparável à proteína nativa. Em outras modalidades, os polipeptídeos têm atividade biológica melhorada ou acentuada comparável à proteína nativa.
[0164] Determina-se, opcionalmente, a atividade específica de uma proteína em uma composição, determinando o nível de atividade em um ensaio funcional, quantificando a quantidade de proteína presente em um ensaio não funcional (por exemplo, imunomanchamento, ELISA, quantificação em gel coomassie ou manchado com prata, etc.) e determinação da razão entre proteína biologicamente ativa ou proteína não agregada e proteína total. Geralmente, a atividade específica assim definida será pelo menos cerca de 5% da proteína nativa, usualmente pelo menos cerca de 10% da proteína nativa, e opcionalmente é cerca de 20%, cerca de 40%, cerca de 60% ou mais.
[0165] Em algumas modalidades, os métodos de produção dos polipeptídeos contendo nnAA envolvem a alteração das concentrações de tRNA específico de nnAA, da sintetase específica de nnAA, da própria nnAA ou da temperatura de tradução e de qualquer combinação dos mesmos. Tais condições permitem opcionalmente menos erros de tradução, melhor taxa de incorporação do nnAA, melhor atividade dos chaperones necessários para o dobramento de proteínas com incorporação do nnAA, diminuição da atividade de fatores celulares que interferem na incorporação do nnAA, ou qualquer combinação dos
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61/233 mecanismos mencionados acima.
[0166] Em algumas modalidades dos métodos de produção de polipeptideo acentuados, a concentração de tRNA específica de nnAA é aumentada para uma concentração acima de cerca de 20 μΜ, conduzindo a uma fração aumentada de polipeptideo solúvel ou ativo. Em variações adicionais dessa modalidade, a concentração de tRNA é aumentada enquanto a concentração de nnAA é mantida abaixo de cerca de 2 mM e a nnAA sintetase é mantida abaixo de cerca de 5 μΜ. [0167] Em algumas modalidades dos métodos de produção de polipeptideo acentuado, a temperatura de incubação de mistura de tradução é entre 20 graus e 30 graus Celsius, cerca de 20 graus Celsius, ou abaixo 20 graus Celsius. Em algumas variações, essas modificações de temperatura são independentemente combinadas com modificações nas concentrações de tRNA específicas de nnAA, concentrações de nnAA ou concentrações de nnAA sintetase descritas no parágrafo anterior.
7. Variantes de Sequência [0168] As proteínas veículo melhoradas da presente descrição compreendem um ou mais nnAA substituídos em qualquer posição dentro do polipeptideo, desde que a função imunogênica de um ou mais epítopos de células T do polipeptideo seja preservada. Ao basear a proteína veículo melhorada em um veículo conhecido, normalmente prefere-se substituir alguns ou todos os nnAAs por aminoácidos existentes de ocorrência natural no veículo conhecido para minimizar a possibilidade de afetar adversamente as propriedades do veículo. Entende-se, no entanto, que os nnAAs podem ser inseridos internamente ou em um terminal como adições à sequência de veículo de partida. Em algumas modalidades, o pelo menos um nnAA na proteína veículo melhorada (por exemplo, eCRM) não está presente em uma ou mais regiões da proteína que compreendem um epitopo de
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62/233 célula T. Em uma outra modalidade, nenhum nnAA no polipeptideo imunogênico acentuado está presente em uma ou mais regiões da proteína que compreendem um epítopo de célula T.
[0169] Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por um ou mais dos vinte aminoácidos naturalmente codificados, incluindo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Em algumas outras modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por um ou mais de uma classe específica de resíduo de aminoácido natural, como alifático, aromático, ácido, básico, hidroxílico, contendo enxofre ou amídico (contendo grupo amida). Em alguns casos, apenas um aminoácido específico (por exemplo, lisina) é substituído por um nnAA dentro do polipeptideo em uma ou mais posições. Em outros casos, dois ou mais aminoácidos diferentes (por exemplo, lisina, fenilalanina, etc.) são substituídos por um nnAA dentro do polipeptideo em duas ou mais posições. A lisina e a fenilalanina são preferenciais para substituição por nnAA devido ao fato de que (i) a lisina tem sido frequentemente utilizada para conjugação a proteínas veículo existentes, em que o veículo contendo nnAA pode manter os mesmos sítios de ligação e (ii) muitos nnAA úteis são baseados em fenilalanina, o veículo com nnAA pode ter uma modificação estrutural mínima em comparação com uma sequência nativa. Os polipeptídeos em que apenas uma única espécie de aminoácido é substituída por um nnAA são preferenciais, e. em que apenas os resíduos de Lys são substituídos.
[0170] Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo
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63/233 menos 14, ou pelo menos 15 resíduos de aminoácido natural de uma proteína veículo. Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, ou pelo menos 15 resíduos de aminoácido natural de uma proteína veículo. Em algumas modalidades, o resíduo de nnAA é substituído por pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, ou pelo menos 15 resíduos de aminoácido natural de SEQ ID NO:1.
[0171] Em aspectos adicionais, o nnAA é substituído por um ou mais resíduos de aminoácido em uma proteína veículo. O resíduo de aminoácido específico que é selecionado para criar variantes de nnAA simples ou múltiplas substituídas descritas no presente documento é opcionalmente determinado dividindo a proteína em subdomínios e escolhendo para substituição um único aminoácido ou conjuntos de resíduos de aminoácidos que não obstruem estereoquimicamente um ao outro (por exemplo, que existe uma distância multi-angstrom entre os locais de substituição). A divisão do CRM197 em duas regiões estruturais é discutida abaixo.
[0172] Em algumas modalidades, o nnAA é substituído por um resíduo de aminoácido carregado. Assim, um nnAA pode ser substituído por um resíduo de aminoácido aspartato, glutamato, lisina, arginina ou histidina. Em algumas modalidades, o nnAA é substituído por um resíduo de aminoácido negativamente carregado, por exemplo, por um resíduo de aspartato ou glutamato. Em algumas modalidades, o nnAA é substituído por um resíduo de aminoácido positivamente carregado, por exemplo, por um resíduo de lisina, arginina ou histidina.
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64/233 [0173] Em algumas modalidades, o nnAA é substituído por um ou mais resíduos de lisina em um polipeptídeo imunogênico. Por exemplo, uma versão acentuada de SEQ ID NO: 1 é gerada pela substituição de um nnAA por lisina da seguinte maneira: 1) um resíduo do grupo que consiste em K25, K34, K38, e K40; 2) um resíduo selecionado do grupo que consiste em K213 e K215; e 3) 2 a 4 resíduos selecionados do grupo que consiste em K228, K245, K265, K386, K523, e K527. Ainda em modalidades adicionais, o ou mais de uma classe específica de resíduo de aminoácido natural substituído é selecionado do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 e K527, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, a substituição de nnAA em SEQ ID NO:1 é selecionada de um ou mais de K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 e K527. Em uma modalidade, a substituição de nnAA compreende seis resíduos que consistem em K25, K215, K228, K265, K386 e K523 de SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a substituição de nnAA em SEQ ID NO:1 compreende K265. Em outras modalidades, a substituição de nnAA em SEQ ID NO:1 compreende K386. Em uma outra modalidade, a substituições de nnAA em SEQ ID NO:1 compreendem K265 e K386. Em uma modalidade adicional, o nnAA é substituído por uma fenilalanina. Fenilalaninas preferenciais para substituição incluem F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531, ou F532 de SEQ ID NO:1. Devido à sua proximidade, geralmente é preferencial não substituir tanto em F531 como F532.
[0174] Os epítopos de ligação para células CD4+ humanas na toxina da difteria, que são reconhecidos pela maioria dos indivíduos testados, englobam resíduos 271-290, 321 -340, 331-350, 351 -370, 411 430 ou 431-450 (consulte, Raju et al., Eur J Immunol. 1995 Dec;25(12):3207-14). Portanto, em algumas modalidades, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 271-290, 321-340,
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331-350, 351-370, 411-430, e/ou 431-450 de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 331-350 de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 321-340 de SEQ ID NO:1. Em ainda uma outra modalidade, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 431-450 de SEQ ID NO:1. [0175] Os epitopos de ligação para as células CD4 + humanas na toxina do tétano, que são reconhecidos por todos os indivíduos testados, englobam resíduos de cadeia pesada H176-195, IDKISDVSTIVPYIGPALNI [SEQ ID NO:3], e H491-510, NNFTVSFWLRVPKVSASHLE [SEQ ID NO:4] (consulte, Diethelm-Okita et al., J Infect Dis. 1997 Feb;175(2):382-91). Dessa forma, em algumas modalidades, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 176-195 e/ou 491-510 do componente de peptídeo de cadeia pesada da proteína precursora de toxina de tétano. Em uma outra modalidade, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 176-195 do componente de peptídeo de cadeia pesada da proteína precursora de toxina de tétano. Em ainda uma outra modalidade, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 491-510 do componente de peptídeo de cadeia pesada da proteína precursora de toxina de tétano.
[0176] Os epitopos de ligação para células CD4+ humanas em proteína de membrana externa de Neisseria meningitidis (OMP ou PorA) que são reconhecidos pela maioria dos indivíduos testados abrangem epitopos de células T imunodominantes, que estão localizados principalmente fora das regiões variáveis e são conservados entre diferentes cepas meningocócicas (e gonocócicas), por exemplo, que correspondem a regiões frans-membranares putativas conservadas de OMP (Wiertz et al. J Exp Med. 1992; 176(1): 79 a 88). Dessa forma, em algumas modalidades, o um ou mais nnAA substituídos não estão
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66/233 dentro dos uma região conservada de OMP.
[0177] Os epitopos de ligação para células CD4+ humanas em BB, uma proteína veículo derivada da proteína G da cepa G148 de Streptococcus, que são reconhecidos pela maioria dos indivíduos testados englobam aminoácidos 25-40 (VSDYYKNLINNAKTVE [SEQ ID NO:5]), 63-78 (DGLSDFLKSQTPAEDT [SEQ ID NO:6]), e 74-89 (AEDTVKSIELAEAKVL [SEQ ID NO:7]) na sequência de BB (Goetsch etal., Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jan;10(1 ):125 a 132). Dessa forma, em algumas modalidades, o um ou mais nnAA substituídos não estão dentro dos resíduos 25-40, 63-78, e/ou 74-89 da sequência de BB.
[0178] Em algumas modalidades, o polipeptideo imunogênico que compreende pelo menos um aminoácido não natural resíduo compreende adicionalmente pelo menos um antígeno. Em algumas modalidades, o polipeptideo imunogênico que compreende pelo menos um aminoácido não natural é uma proteína veículo acentuada e compreende adicionalmente pelo menos um antígeno. Em algumas modalidades, o polipeptideo imunogênico que compreende pelo menos um aminoácido não natural é uma proteína veículo acentuada e compreende adicionalmente pelo menos um antígeno.
8. Epitopos de Célula T [0179] Os epitopos de célula T de uma proteína veículo são, opcionalmente, determinados por qualquer um dos métodos conhecidos. Como auxiliar na concepção de proteínas veículos melhoradas da presente descrição, os epitopos de ligação de células T em proteínas são previstos com o uso de algoritmos que levam em consideração vários fatores, como perfis de anfipaticidade de proteínas, motivos de sequências, matrizes quantitativas (QM), redes neurais artificiais (ANN), máquinas de vetores de suporte (SVM), relação de atividade de estrutura quantitativa (QSAR) e simulações de docking molecular, etc. (consulte, Desai et al. Methods Mol Biol. 2014;1184:333
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67/233 a 364). Por exemplo, os epítopos de ligação de células T na toxina da difteria/CRM foram previstos usando o algoritmo DeLisi & Berzofsky (consulte, Bixler et al. WO89/06974 e PNAS 82:7848, 1985). Os epítopos de células T previstos podem ser confirmados experimentalmente. Por exemplo, os epítopos de células T de um polipeptideo imunogênico de interesse podem ser determinados experimentalmente sintetizando fragmentos peptídicos parcialmente sobrepostos correspondendo à sequência completa do polipeptideo imunogênico (ou regiões previstas) e realizando ensaios de proliferação de linhas celulares CD4+ (por exemplo, células mononucleares do sangue periférico (PBMC)) na presença de cada fragmento. Essa abordagem geral tem sido empregada para mapear os epítopos de células T na toxina da difteria (Raju et al., Eur J Immunol, dez de 1995;25(12):3207-14), toxina de tétano (Diethelm-Okita et al., J Infect Dis. fev de 1997;175(2):382-91), proteína membrânica externa de Neisseria meningitidis (OMP) (J Exp Med. jul de 1992 1; 176(1): 79 a 88), e BB, uma proteína veículo derivada da proteína G da cepa G148 de Streptococcus (Goetsch et al., Clin Diagn Lab Immunol, jan de 2003;10(1):125 a 132). Pode-se também pesquisar diretamente as proteínas veículo melhoradas da presente descrição para proliferação de células CD4+ e/ou uma resposta de citoquinas para estabelecer a presença de um epitopo de células T que não foi inativado pela presença de um ou mais nnAAs.
9. Métodos de Produção de Conjugado [0180] Em uma modalidade, a descrição fornece um método para a síntese de um polipeptideo que compreende um nnAA em uma mistura de expressão livre de célula mantida a uma temperatura entre cerca de 10 graus Celsius e cerca de 30 graus Celsius. Em uma outra modalidade, a temperatura é acima de cerca de 20 graus Celsius. Em uma outra modalidade, a temperatura é abaixo de cerca de 20 graus
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Celsius. Em uma outra modalidade, a temperatura é entre cerca de 14 graus Celsius e cerca de 18 graus Celsius. Em uma outra modalidade, o polipeptideo é codificado por um ácido nucleico que compreende um códon de supressão. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão livre de célula compreende um par de tRNA ortogonal/aminoacil-tRNA sintetase específico para o nnAA. Em uma outra modalidade, a concentração de tRNA é pelo menos 20 μΜ. Em uma outra modalidade, a concentração de nnAA é menor que cerca de 2mM e a concentração da aminoacil-tRNA sintetase é menor que cerca de 5 μΜ. Em uma outra modalidade, o método compreende conjugar o polipeptideo a uma parte ativa. Em uma outra modalidade, a parte ativa é selecionada do grupo que consiste em um hapteno, um antígeno bacteriano, um antígeno viral, um glicano derivado de tumor, uma toxina peptídica, um macrolídeo, um poliéter e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em um hormônio do crescimento, um fator de coagulação, uma proteína plasmática, uma interleucina, um domínio extracelular de receptor de célula T, um domínio extracelular de fator de crescimento, um antígeno bacteriano, um antígeno viral e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão compreende um extrato celular de E. coli, germe de trigo ou reticulócito de coelho. Em uma outra modalidade, a mistura de expressão compreende pelo menos 30% de extrato celular. Em uma outra modalidade, o polipeptideo compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 nnAAs. Em uma outra modalidade, o nnAA é selecionado do grupo que consiste em ácido 2amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6
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69/233 (azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico, ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo produzido compreende tanto uma fração solúvel como uma fração insolúvel, em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 40% (p/p). Em uma outra modalidade, o polipeptídeo produzido compreende tanto uma fração solúvel como uma fração insolúvel, em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 60% (p/p). Em uma modalidade, o polipeptídeo produzido por expressão livre de célula compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, ou pelo menos 9 nnAAs e a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos pelo menos 20% (p/p), pelo menos 30% (p/p), pelo menos 40% (p/p), pelo menos 50% (p/p), 60% (p/p), pelo menos 70% (p/p), pelo menos 80% (p/p), pelo menos 90% (p/p).
Antígenos:
[0181] São descritos no presente documento antígenos imunogênicos que são opcionalmente derivatizados adicionalmente com um manejo químico para facilitar a ligação a uma proteína veículo melhorada. Em uma modalidade, os antígenos são qualquer macromolécula purificada natural, sintética ou recombinantemente produzida ou um fragmento da mesma. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, lipídios, polissacarídeos, ácidos nucleicos, ou polipeptídeos e qualquer combinação dos mesmos (por exemplo, glicoproteinas, glicolipoproteínas, glicolipídios). Por exemplo, o glicolipídio opcionalmente é glicofosfatidilinositol. Em uma outra modalidade, o antígeno é um antígeno independente de T ou de ativação de T (usualmente um antígeno de ativação de T fraco) selecionado do grupo que consiste em um polissacarídeo bacteriano, um lipopolissacarídeo bacteriano, um glicano derivado de tumor ou um
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70/233 hapteno.
[0182] Polissacarídeos derivados de bactérias: Em algumas modalidades, um antígeno que compreende um polissacarídeo compreende um polissacarídeo derivado de bactérias, como um polissacarídeo capsular. Tais polissacarídeos capsulares são polímeros de massa molecular alta de bactérias gram-positivas ou gram-negativas que funcionam para proteger os micro-organismos contra respostas imunes e, como tal, representam alvos vacinais atraentes quando o objetivo é a produção de anticorpos neutralizantes. Tais polissacarídeos capsulares são geralmente preparados a partir de lisados de células completas ou sobrenadante da cultura da bactéria correspondente através de processos que envolvem diafiltração, remoção de proteínas, precipitação com etanol, remoção de ácidos nucleicos e liofilização. Exemplos incluem, mas não se limitam a, o protocolo Merieux (Institut Merieux (1980) Brevet Beige 80:26320) e o protocolo Yavordios (Yavordios et al. EP0071515A1 (1983)).
[0183] Polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae: Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular compreende um polissacarídeo capsular derivado de Streptococcus pneumoniae. Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva encapsulada que pode causar pneumonia, bacteremia e meningite. Existem 90 sorotipos documentados distintos de S. pneumoniae (descrito em, por exemplo, Kalin, M. Thorax 1998;53:159 a 162) que portam polissacarídeos capsulares com estruturas de unidade de repetição específicas de sorotipo. Portanto, em alguns casos, o antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae selecionado de 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 7A, 7B, 7C, 8, 9A, 9L, 9N, 9V, 10F, 10A, 10B, 10C, 11 F, 11 A, 11B, 11C, 11 D, 12F, 12A, 12B, 13, 14, 15F, 15A, 15B, 15C, 16F, 16A, 17F, 17A, 18F, 18A, 18B, 18C, 19F, 19A, 19B, 19C, 20, 21, 22F, 22A, 23F, 23A, 23B, 24F, 24A, 24B, 25F, 25A, 27, 28F, 28A, 29, 31, 32F,
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32A, 33F, 33A, 33B, 33C, 33D, 34, 35F, 35A, 35B, 35C, 36, 37, 38, 39, 40, 41F, 41 A, 42, 43, 44, 45, 46, 47F, 47A, e 48 (Henrichsen J Clin Microbiol 1995; 33:2.759 a 2.762). No entanto, apenas um subconjunto desses sorotipos é comumente responsável pela infecção bacteriana, que inclui os sorotipos 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 180, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F. Os sorotipos 60, 70, 15A, 150, 16F, 23A, 23B, 31, 34, 35B, 35F, 37 e 38 também se tornaram de interesse clínico, assim como os sorotipos 20A, 20B e 24B. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae selecionado de sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 180, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae selecionado de sorotipos 60, 70, 15A, 150, 16F, 23A, 23B, 31,34, 35B, 35F, 37 e 38. As modalidades descritas no presente documento também podem adicionalmente compreender um ou mais de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae selecionado de sorotipos 20A, 20B e 24B.
[0184] Conforme mencionado acima, composições da invenção podem incluir conjugados de polissacarídeo capsular de pelo menos 14, 15, 20, 21,24 ou 25, sorotipos pneumocócicos diferentes. Quando uma composição incluir 14 ou mais sorotipos, essas preferencialmente incluem os 13 sorotipos 1,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 180, 19A, 19F e 23F. Além desses 13 sorotipos, as composições incluem preferencialmente um ou mais dos sorotipos. 2, 8, 9N, 10A, 11 A, 12F, 15B, 17F, 20, 22F e/ou 33F. Alternativamente, além dos 13 sorotipos acima, a composição preferencialmente inclui um ou mais sorotipos 2, 60, 8, 9N, 10A, 12F, 15A, 15B, 150, 16F, 17F, 20, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 24B, 31,33F, 34, 35B, 35F e 38. Uma combinação útil de 15 ou mais (por exemplo, 16 ou mais) sorotipos inclui cada de sorotipos 1,
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3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, e também pode incluir sorotipo 8. Uma combinação útil de 20 ou mais (por exemplo, 21 ou mais) sorotipos inclui cada de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Uma combinação útil de 24 ou mais sorotipos inclui cada de sorotipos
1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F.
[0185] As estruturas de unidades de repetição de polissacarídeo capsular de sorotipo de S. pneumoniae são descritas em Jones et ai. (Jones C et al. An Acad Bras Ciênc. jun de 2005;77(2):293 a 324): [0186] Tipo 1 [0187] [—>3)-D-AAT-a-Galp-(1 -^4)-a-D-GalpA(2/3OAc)-(1 -^3)-a-DGalpA-(1^] [0188] Tipo 2 [0189] H4)-p-D-Glcp-(1 -^3)-[a-D-GlcpA-(1 -^6)-a-D-Glcp-(1 -^2)]a-L-Rhap-(1 —>3)-a-L-Rhap-(1 —>3)P-L-Rhap-(1 —>] [0190] Tipo 3 [0191] [—>3)-p-D-GlcA-(1 —>4)-p-D-Glcp-(1 —>] [0192] Tipo 4 [0193] [—>3)-p-D-ManpNAc-(1 —>3)-a-L-FucpNAc-(1 —>3)-a-DGalpNAc-(1 -^4) -a-D-Galp2,3(S)Py-(1 -^] [0194] Tipo 5 [0195] H4)-P-D-Glcp-(1 ^4)-[a-L-PnepNAc-(1 ^2)-p-D-GlcpA(1 —>3)] -a-L-FucpNAc-(1 ^3)-p-D-Sugp-(1 -^] [0196] Tipo 6B [0197] [—>2)-a-D-Galp-(1 -^3)-a-D-Glcp-(1 -^3)-a-L-Rhap-(1 -^4)-DRib-ol-(5—>P—>] [0198] Tipo 9N [0199] H4)-a-D-GlcpA-(1 ^3)-a-D-Glcp-(1 ^3)-p-D-ManpNAc(1 —>4) -P-D-Glcp-(1 -^4)-a-D-GlcpNAc-(1 -^]
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73/233 [0200] Tipo 9V [0201 ] H4)-a-D-GlcpA(2/3OAc)-(1 ^3)-a-D-Galp-(1 ^3)-β-ϋManpNAc(4/6OAc)-(1 ^4) -p-D-Glcp-(1 -^4)-a-D-Glcp-(1 -^] [0202] Tipo 12F [0203] [—>4)-[a-D-Galp-(1 —>3)]a-L-FucpNAc-(1 —>3)^-D-GlcNAc(1 —>4)-[a-D-Glc-(1 -^2) -a-D-Glc-(1 ^3)]-p-D-ManNAcA-M [0204] Tipo 14 [0205] H4)-P-D-Glcp-(1 ^6)-[p-D-Galp-(1 ^4)]-p-D-GlcpNAc(1^3)-p-D-Galp-(1^] [0206] Tipo 18C [0207] H4)-p-D-Glcp-(1^4)-[a-D-Glcp(6OAc) (1^2)][Gro(1 -^P^3)]-P-D-Galp-(1 -^4) -a-D-Glcp-(1 ^3)-p-L-Rhap-(1 -^] [0208] Tipo 19F [0209] H4)-p-D-ManpNAc-(1 -^4)-a-D-Glcp-(1 -^2)-a-L-Rhap(1-P-] [0210] Tipo 23F [0211 ] H4)-p-D-Glcp-(1 -^4)-[a-L-Rhap-(1 -^2)]-[Gro-(2^P^3)] -βD-Galp-(1 —>4)^-L-Rhap-(1 —>] [0212] Uma discussão mais completa dos polissacarídeos é encontrada em Geno et al. (2015) Clin. Microbiol. Rev. 28:871-99, em que a Tabela 1 mostra as estruturas para 97 sorotipos conhecidos. Essa Tabela também revela a proporção de resíduos de sacarídeos que são acetilados quando a acetilação não está completa.
[0213] O polissacarídeo capsular é opcionalmente O-acetilado. Em algumas modalidades, o polissacarídeo capsular do sorotipo 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F compreende um sacarídeo que tem um grau de O-acetilação de entre 10 a 100%, entre 20 a 100%, entre 30 a 100%, entre 40 a 100%, entre 50 a 100%, entre 60 a 100%, entre 70 a 100%, entre 75 a 100%, 80 a 100%, 90 a 100%, 50 a 90%, 60 a 90%,
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74/233 a 90% ou 80 a 90%. Em outras modalidades, o grau de O-acetilação é maior que 10%, maior que 20%, maior que 30%, maior que 40%, maior que 50%, maior que 60%, maior que 70%, maior que 80%, maior que 90%, ou cerca de 100%. O grau de O-acetilação do polissacarídeo é opcionalmente determinado, por exemplo, por RMN de prótons (consulte, por exemplo, Lemercinier & Jones (1996) Carbohydrate Research 296:83 a 96; Jones et al. (2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1.233 a 1.247). Em algumas modalidades, a presença de grupos O-acetila é determinada por análise de HPLC iônica. Normalmente, o polissacarídeo em um conjugado reterá os níveis de O-acetilação observados no polissacarídeo de partida purificado de uma bactéria.
[0214] Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular do sorotipo
1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F tem um peso molecular de entre 10 kDa e 4.000 kDa. Em tais outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 4.000 kDa. Em tais outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 1.400 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 3.500 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.500 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.500 kDa; 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.500 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.500 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750
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75/233 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer um dos intervalos acima é contemplado como uma modalidade da descrição.
[0215] O polissacarídeo capsular é opcionalmente modificado quimicamente em relação ao polissacarídeo capsular encontrado na natureza. Por exemplo, o polissacarídeo é opcionalmente de-Oacetilado (parcial ou totalmente), de-N-acetilado (parcial ou totalmente), N-propionado (parcial ou totalmente), etc. A de-acetilação opcionalmente ocorre antes, durante ou depois da conjugação a um manejo químico ou polipeptideo, mas tipicamente ocorre antes da conjugação.
[0216] Polissacarídeos de S. pyogenes: Em algumas modalidades, um antígeno que compreende um polissacarídeo compreende um polissacarídeo derivado de S. pyogenes. S. pyogenes é uma bactéria gram-positiva (também conhecida como estreptococo do grupo A ou 'GAS') responsável por uma ampla faixa de infecções em seres humanos, incluindo faringite, amigdalite, escarlatina, celulite, erisipela, febre reumática, glomerulonefrite pós-estreptocócica, fasceíte necrosante, mionecrose e linfangite. Em uma modalidade, o polissacarídeo é o polissacarídeo capsular de S. pyogenes. O polissacarídeo capsular de S. pyogenes é composto por ácido hialurônico, um polímero de alto peso molecular em que a unidade de repetição tem a estrutura:
[0217] H4)-p-D-GlcUAp-(143)-p-D-GlcpNAc-H] [0218] que parece ser invariante entre sorotipos de S. pyogenes. [0219] Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular de S. pyogenes tem um peso molecular de entre 10 kDa e 4.000 kDa. Em tais outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 4.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo
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76/233 tem um peso molecular de entre 50 kDa e 3.500 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.500 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.500 kDa; 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.500 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.500 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer um dos intervalos acima é contemplado como uma modalidade da descrição.
[0220] Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo não capsular de S. pyogenes. Polissacarídeos não capsulares incluem o polissacarídeo de paredes celulares de grupo-Astrep, que compreende uma estrutura principal de unidades de poli-Lrhamnopiranosila conectadas alternando ligações a-L-(1—>3) e a-L(1 —>2), as quais resíduos de N-acetil-p-D-glucosamina são ligados na 3posição da estrutura principal de rhamnose.
[0221] Em uma modalidade, os polissacarídeos de paredes celulares de grupo-A-strep de S. pyogenes tem um peso molecular de entre 10 kDa e 4.000 kDa. Em tais outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 4.000 kDa. Em outras dessas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 3.500 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.500 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500
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77/233 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.500 kDa; 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.500 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.500 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer um dos intervalos acima é contemplado como uma modalidade da descrição.
[0222] Polissacarídeos capsulares de Streptococcus agalactiae: Em algumas modalidades, o antígeno que compreende um polissacarídeo compreende um polissacarídeo capsular derivado de S. agalactiae. S. agalactiae (também chamada de Estreptococo de Grupo B ou GBS) é uma bactéria gram-positiva, geralmente comensal com os mamíferos que ocasiona septicemia, pneumonia e meningite em seres humanos imunologicamente vulneráveis e mastite bovina em vacas leiteiras. Existem pelo menos 10 sorotipos de S. agalactiae com unidades de repetição de polissacarídeo capsular distintas (la, lb, 11—IX); contudo, apenas um subconjunto dos sorotipos é comumente responsável pela doença. Os mesmos incluem sorotipos la, lb, II, III, e V, e conjugados de polissacarídeos capsulares desses sorotipos podem ser preparados. As estruturas para as unidades de repetição de polissacarídeo capsular de sorotipos comuns de S. agalactiae foram determinadas e são:
Tipo Ia
H4)-p-D-Glcp-(1 —>4)-p-D-Galp(1 -^]
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78/233 ΐ
a-D-NeupNAc(2—>3^-D-Galp(1—>3)β-ϋ-ΟΙορΝΑο
Tipo lb H4)-P-D-Glcp-(1 ^4)-p-D-Galp(1 3
T a-D-NeupNAc(2^3)p-D-Galp(1^4)p-D-GlcpNAc
Tipo II
H4)-p-D-GlcpNAc-(1 ^3)-p-D-Galp(1 ^4)-p-D-Glcp(1 ^3)-β-ϋGlcp(1^2)-P-D-Galp(1^]
TT β-D-Galp a-D-NeupNAc
Tipo III H4)-P-D-Glcp-(1 ^6)-p-D-GlcpNAc-(1 ^3)-p-D-Galp-(1
T β-D-Galp
T a-D-NeupNac
Tipo V
Η4)-β-ϋ-ΟΙορ-(1 —>4)^-D-Galp(1 -^4)-β-Ο-ΘΙορ-(1 -^]
3
T ΐ
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79/233 β-D-GlcpNAc β-D-Glcp ΐ 1 β-D-Galp ΐ 2 a-D-NeupNAc [0223] Polissacarídeos capsulares de Haemophilus influenzae: Em algumas modalidades, o antígeno que compreende um polissacarídeo compreende um polissacarídeo capsular derivado de H. influenzae. H. influenzae é uma bactéria patogênica gram-negativa, anaeróbica, responsável por uma ampla faixa de infecções localizadas e invasivas, incluindo pneumonia, bacteremia, meningite, epiglotite, celulite e artrite infecciosa. Existem pelo menos 6 sorotipos de H. influenzae com estruturas químicas distintas de polissacarídeo capsular (tipos a-f). No entanto, apenas o tipo a e o tipo b são considerados cepas de H. influenzae de alta virulência, e acredita-se que o grosso das infecções infantis seja ocasionado pelo tipo b. (Jin et al. Infect. Immun. Junho de 2007 vol. 75 n°6 2.650 a 2.654), que é, dessa form a, o tipo preferencial de polissacarídeo de H. influenzae para uso com a invenção. A estrutura da unidade de repetição do polissacarídeo capsular do tipo b foi determinada e é:
[0224] [—>3)^-D-Rib/-(1 -^1 )-D-Ribitol-(5^OPO3 ^].
[0225] Polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis: Em algumas modalidades, o antígeno que compreende um polissacarídeo compreende um polissacarídeo capsular derivado de N. meningitidis. N. meningitidis é uma bactéria Gram-negativa que é um dos principais
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80/233 agentes causadores de meningite e infecção séptica meningocócica. Existem pelo menos 13 sorogrupos de Λ/. meningitidis com estruturas químicas distintas de polissacarídeo capsular (sorogrupos A, B, C, E29, Η, I, K, L, W-135, X, Y, Z e Z’ (29E)). Considera-se, no entanto, que apenas seis sorogrupos (A, B, C, W-135, X, Y) causam doença fatal. As estruturas da unidade de repetição do polissacarídeo capsular para os cinco principais sorogrupos de interesse para a preparação do conjugado foram determinadas e são:
[0226] Tipo A [0227] H6)-a-D-ManpNAc(3/4OAc)-(1 -^OPO3^] [0228] Tipo C [0229] H9)-a-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2^] [0230] Tipo W-135 [0231 ] H6)-a-D-Galp-(1 -^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^] [0232] Tipo X [0233] H4)-a-D-GlcpNAc-(1 -^OPO3^] [0234] Tipo Y [0235] H6)-a-D-Glcp-(1 -^4)-a-D-Neup5Ac(9OAc)-a-(2^] [0236] Polissacarídeos capsulares de Porohyromonas gingivalis·.
Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6). Consulte Van Winkelhoff et al. (1993) Oral Microbiol. Immunol. 8:259 a 265; e Laine et al. (1996) J. Periodontal Res. 31: 278 a 284.
[0237] Polissacarídeos capsulares de Salmonella tvohr. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo Vi. Vi é o polissacarídeo capsular de Salmonella typhi (anteriormente classificado como a própria espécie, mas agora referido como serovar de typhi de
S.enterica). Vi também pode ser encontrado em outros serovars de Salmonella (como serovar de S. enterica paratyphi C ou serovar dublin)
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81/233 e, em outras bactérias, como Citrobacter (por exemplo, C.freundii e C.youngae). O polissacarídeo Vi é um homopolímero linear de um ácido hexossaminurônico, ácido D1,4-A/-acetilgalactos-aminourônico, que é 60 a 90% acetilado na posição C-3. A substituição de O-acetila em Vi é um fator em sua capacidade de elicitar uma resposta imune protetora. A imunogenicidade de Vi está intimamente relacionada ao seu grau de O-acetilação. A de-O-acetilação parcial pode aumentar ligeiramente a imunogenicidade; de-O-acetilação completa elimina a imunogenicidade de Vi. O polissacárido Vi usado na presente invenção pode ser quimicamente modificado em relação ao polissacarídeo capsular como encontrado na natureza. Por exemplo, o polissacarídeo Vi pode ser parcialmente de-O-acetilado, de-N-acetilado (parcial ou totalmente), N-propionado (parcial ou total mente), etc. A de-acetilação pode ocorrer antes, durante ou depois da conjugação, mas, de preferência, ocorre antes da conjugação. O efeito da de-acetilação, etc. pode ser analisados por ensaios de rotina.
[0238] Sacarídeos de Staphylococcus aureus: Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo de S.aureus. O polissacarídeo pode ser o exopolissacarídeo de S.aureus, que é uma poli-N-acetilglucosamina (PNAG), ou o polissacarídeo capsular de
S.aureus, que pode ser, por exemplo, tipo 5, tipo 8 ou tipo 336.
[0239] Polissacarídeos de superfície de Clostridium difficile: Em uma outra modalidade, o antígeno é um glicano de superfície de C.difficile, como PS-I ou PS-II.
[0240] Glucanos: Em uma outra modalidade, o antígeno é um glucano contendo β-1,3-ligações e/ou β-1,6-ligações. Esses glucanos conjugados podem ser úteis para aumentar uma resposta imune antifúngica, por exemplo, contra Candida albicans. Glucanos são polissacarídeos contendo glicose- encontrados, entre outros, em paredes celulares de fungos, β-glucanos incluem uma ou mais
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82/233 β-ligações entre subunidades de glicose. Um glucano usado de acordo com a invenção inclui β-ligações, e pode conter apenas β-ligações (ou seja, sem ligações α). O glucano pode compreender uma ou mais β-1,3ligações e/ou uma ou mais β-1,6-ligações. Pode também incluir uma ou mais β-1,2-ligações e/ou β-1,4-ligações, mas normalmente as suas únicas β-ligações serão β-1,3-ligações e/ou β-1,6-ligações. O glucano pode ser ramificado ou linear. O glucano pode ser um glucano fúngico. Um glucano fúngico será geralmente obtido a partir de um fungo, mas, quando uma estrutura específica de glucano é encontrada tanto em fungos como em não fungos (por exemplo, em bactérias, plantas inferiores ou algas), o organismo não fúngico pode ser usado como uma fonte alternativa. Dessa forma, o glucano pode ser derivado da parede celular de Candida, como C.albicans, ou de Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neo for mans, Histoplasma capsu latum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis, ou Pythiumn insidiosum. Existem várias fontes de β-glucanos fúngicos. Por exemplo, os β-glucanos puros estão comercialmente disponíveis, por exemplo, pustulan (Calbiochem) é um β - 1,6-glucano purificado de Umbilicaria papullosa. Os β-glucanos podem ser purificados das paredes celulares fúngicas de várias maneiras. Em algumas modalidades, o glucano é um β-1,3 glucano com alguma ramificação de β-1,6, como visto em, por exemplo, laminarinas. As laminarinas são encontradas em algas marrons e algas marinhas. As razões entre β(1 -3):β( 1 -6) de laminarinas variam entre diferentes fontes, por exemplo, tão baixo quanto 3:2 em laminarina de Eisenia bicyclis, mas tão alto quanto 7:1 em laminarina de Laminaria digititata. Dessa forma, o glucano usado com a invenção pode ter uma razão de β(1-
3):β(1 -6) entre 1,5:1 e 7,5:1, por exemplo, cerca de 2:1,3:1,4:1,5:1,6:1 ou 7:1. Em outras modalidades, o glucano tem exclusiva ou principalmente ligações β-1,3, como visto em curdlan. Assim, o glucano
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83/233 pode ser constituído apenas por resíduos de glucose ligados por β-1,3 (por exemplo, β-D-glucopiranose lineares com exclusivamente 1,3ligações). Opcionalmente, no entanto, o glucano pode incluir resíduos de monossacarídeos que não são resíduos de glicose ligados a β-1,3, por exemplo, pode incluir resíduos de glicose ligados a β-1,6. A razão entre resíduos de glicose ligados a β-1,3- e esses outros resíduos deveria ser pelo menos 8:1 (por exemplo, >9:1, >10:1, >11:1, >12:1, >13:1, >14:1, >15:1, >16:1, >17:1, >18:1, >19:1, >20:1, >25:1, >30:1, >35:1, >40:1, >45:1, >50:1, >75:1, >100:1, etc.).
[0241] Glicanos derivados de tumor: Em algumas modalidades, um antígeno que compreende um polissacarídeo compreende uma característica de glicano de superfície de célula inadequadamente desenvolvidas de células tumorais. Danishefsky (revisado em Zhu et at. Expert Rev Vaccines. 2009(10):1.399 a 1.413) entre outros, constatou que certos motivos de oligossacarídeo (antígenos embrionários específicos de fase, SSEAs) são originalmente expressos nas superfícies celulares durante a embriogênese e reativados em tumores adultos. Como esses são polissacarídeos curtos, os mesmos são acessados principalmente via síntese química (revisado em Zhu acima). Entre esses oligossacarídeos, os mais claramente associados à carcinogênese (por exemplo, câncer de próstata e mama) são GloboH, Ley, STn, TF e Tn.
[0242] Haptenos: Em algumas modalidades, um antígeno compreende um hapteno: uma parte sintética não polimérica de peso molecular menor que 1.000 Da. A aplicação de haptenos em conjugados de proteína terapêutica é de haptenos que mimetizam drogas de abuso, por exemplo, nicotina ou cocaína (consulte, por exemplo, Berkowitz & Spector. Science. 1972(178):1.290 a 1.292 para morfina; Kosten et al. Vaccine. 2002(20):1.196 a 1.204 para cocaína; e Hatsukami et al. Clin Pharmacol Ther. 2005(78):456 a 467). A conjugação de moléculas
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84/233 pequenas de outra forma pouco imunogênicas a polipeptideos imunogênicos permite que sejam criados anticorpos específicos de fármacos, que sequestram drogas de abuso do sistema nervoso central. [0243] Métodos de derivatização e preparação para antígenos e composições que resultam dos mesmos:
[0244] São descritos no presente documento antígenos contendo um manejo químico que tem a capacidade de reagir com um grupo correspondente introduzido em um aminoácido não natural de um polipeptideo conforme descrito anteriormente neste documento. Em algumas modalidades, o manejo químico compreende um grupo adequado para reação química de click com um grupo correspondente em um polipeptideo. Grupos químicos adequados para química de click incluem, sem limitação, grupo azido (-N3), alquino (C=C), fosfina nm (por exemplo, -P(Ph)2), alceno (C=C) e 1,2,4,5-tetrazina ( n-n ).
[0245] O manejo químico é introduzido via um processo geral compreende 3 etapas: (a) ativar 0 antígeno; (b) reagir opcionalmente 0 antígeno com um ligante ou grupo nucleofílico para introdução de reatividade não normalmente presente no antígeno; e (c) conjugar 0 antígeno ao manejo químico. Em algumas modalidades, duas ou mais das etapas (a) a (c) são simultâneas, como no caso em que um manejo químico é modificado pela adição de uma porção reativa como Nhidroxissuccinimida. Em algumas modalidades, duas ou mais das etapas (a) a (c) são discretas, com purificação opcional do antígeno entre as etapas. Em algumas modalidades, a etapa (a) adicionalmente compreende uma etapa para remover um grupo de bloqueio no antígeno, de modo que certos grupos funcionais (por exemplo, hidroxilas, aminas, tióis) sejam mais acessíveis à ativação.
[0246] O manejo químico é opcionalmente introduzido em locais variados em relação ao antígeno. Em algumas modalidades, 0 manejo
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85/233 químico é introduzido em um terminal (por exemplo, extremidades redutoras e não redutoras de um polissacarídeo, os terminais N e C de um polipeptídeo, ou a extremidade da cadeia acila de um glicerídeo). Em algumas modalidades, o manejo químico é introduzido em um local interno (por exemplo, um aminoácido interno de um polipeptídeo, ou uma hidroxila interna, amina, ou hidroxila ativada de um polissacarídeo). Em algumas modalidades, o manejo químico é introduzido em um ou mais terminais além de um local interno. O método particular de ativação usado para o antígeno afetará os locais ativados para a conjugação e, portanto, a localização final do manejo químico conjugado no antígeno. É preferencial introduzir múltiplos manejos químicos em um antígeno de modo que o mesmo possa alcançar múltiplas ligações com veículos.
[0247] Em uma modalidade preferencial, um método para conjugar um polipeptídeo a um antígeno via manejos químicos é da seguinte forma. Um antígeno é ativado para incorporar pelo menos um primeiro manejo químico no mesmo, em que o primeiro manejo químico tem a capacidade de conjugar-se a um segundo manejo químico de um nnAA no polipeptídeo. O antígeno ativado é combinado com um polipeptídeo contendo pelo menos um nnAA que porta o segundo manejo sob condições em que o primeiro e o segundo manejos químicos reajam para formar um conjugado antígeno-polipeptídeo. A reação assim possibilitada é uma reação de bioconjugação covalente não catalítica. Os sítios reativos no antígeno que servem como a primeiro manejo químico são preferencialmente grupos alquinila, onde os grupos alquinila podem ser incorporados em um contexto molecular que aumenta a reatividade. Por exemplo, os grupos alquinila podem ser incorporados em um anel, por exemplo, um anel ciclooctilila, como uma ciclooctila estirada com diarila. Os sítios reativos preferenciais no polipeptídeo, isto é, o segundo manejo químico fornecido pelos resíduos nnAA, são grupos azido. Como é conhecido na técnica, a
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86/233 reação nesse caso é uma cicloadição [3+2] referida na técnica como cicloadição de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC), discutida em mais detalhe infra.
Ativação de antígenos:
[0248] O antígeno é opcionalmente ativado usando qualquer método químico descrito para a produção de bioconjugados. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, oxidação de periodato, desmascaramento de um aldeído intrínseco (por exemplo, um terminal redutor de um polissacarídeo), ativação de tetrafluoroborato de 1-ciano4-dimetilaminopiridínio (CDAP) ou ativação de hidroxila com 1,1' carbonildiimidazol (GDI) seguido por adição nucleofílica. Estratégias químicas adicionais para a derivatização de sacarídeos são descritas em Hermanson (Hermanson, Greg. Bioconjugate Techniques (2008)). A ativação pode usar reagentes de cianilação (como p-nitrofenilcianato, CDAP ou tetrafluoroborato de N-cianotrietilamônio), ésteres ativos, carbodiimidas, hidrazidas, norborano, ácido p-nitrobenzoico, Nhidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU, etc.
[0249] A invenção fornece um antígeno (em particular, um polissacarídeo antígeno conforme revelado no presente documento, como um antígeno de polissacarídeo capsular pneumocócico) que é ativado de acordo com qualquer uma das químicas discutidas abaixo, por exemplo, o produto de reação do antígeno com um ou mais dos grupos DBCO e DIFO discutidos abaixo.
[0250] Ativação de periodato:
[0251 ] Em algumas modalidades, o antígeno é ativado por oxidação por periodato. Em algumas modalidades, a oxidação com periodato é usada para introduzir grupos aldeído em um antígeno e é útil para a adição de aldeídos a: 1) polissacarídeos; e 2) resíduos de N-terminal de polipeptídeos para produzir um antígeno ativado. O periodato diva as ligações carbono-carbono que possuem uma hidroxila ou amina
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87/233 primária ou secundária em ambas as extremidades, e assim ativa os resíduos de açúcar carboidrato contendo hidroxilas adjacentes, ou aminoácidos contendo a porção 2-aminoálcool (resíduos de treonina Nterminal ou serina). Como a parte de aldeído tem uma meia-vida longa, os antígenos ativados por esse método são opcionalmente cromatograficamente purificados e/ou liofilizados após a ativação.
[0252] Para oxidação de periodato de antígenos: (a) os antígenos são dissolvidos em uma solução; (b) uma fonte de periodato é adicionada ao antígeno a partir de uma solução estoque concentrada para formar uma mistura de oxidação; (c) a mistura de reação é incubada; e (d) (opcional) o excesso de periodato é removido.
[0253] Água desionizada ou uma solução tamponada adequada é opcionalmente usada para a reação de oxidação. Em algumas modalidades, a solução na etapa (a) é água desionizada. Em algumas modalidades, a solução na etapa (a) compreende uma quantidade eficaz de um tampão com um pKa de cerca do pH fisiológico. Em algumas modalidades, a solução na etapa (a) compreende uma quantidade eficaz de um tampão com um pKa de cerca do pH fisiológico, em que a tampão não compreende um grupo amina. Exemplos de tampões livres de amina incluem, mas não estão limitados a acetato, formato e fosfato.
[0254] A fonte de periodato na etapa (b) é opcionalmente selecionada de qualquer fonte de periodato com estabilidade apropriada em solução aquosa. Exemplos de fontes de periodato incluem, mas não estão limitados a, periodato de sódio, periodato de potássio, (meta)periodato de tetrabutilamônio, periodato de bário, periodato de hidrogênio e sódio, (para)periodato de sódio e (meta)periodato de tetraetilamônio.
[0255] Em algumas modalidades, o nível de adição de periodato e condições de reação são ajustados para converter todos os diois
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88/233 disponíveis em um polissacarídeo em aldeídos. Por exemplo, grandes excessos de periodato de sódio (excesso 1.000x em relação à concentração molar de polissacarídeo, ou uma solução 10 mM de periodato de sódio) em combinação com a incubação à temperatura ambiente favorecem a conversão total de diois em aldeídos.
[0256] Em algumas modalidades, o nível de condições de adição e reação de periodato é ajustado para introduzir uma baixa quantidade de formação de oxidação/aldeído na cadeia polissacarídica. Menos do que quantidades estequiométricas de periodato de sódio (por exemplo, <1,0 equivalentes) na reação de oxidação favorecem baixas quantidades de oxidação da cadeia polissacarídica. Por exemplo, um sacarídeo bacteriano é ativado por 0,001 a 0,7, 0,005 a 0,5, 0,01 a 0,5, 0,1 a 1,2, 0,1 a 0,5, 0,1 a 0,2, 0,5 a 0,8, 0,1 a 0,8, 0,3 a 1,0 ou 0,4 a 0,9 equivalentes molares de periodato (consulte o documento WO2011/110531). Em uma outra modalidade, 0,4 equivalente molar de periodato é adicionado a uma solução a pH 6,0 contendo um polissacarídeo capsular pneumocócico e incubado durante 17 h a 25 Ό (consulte o documento WO2011/110531).
[0257] Em uma modalidade, menos que 0.001%, 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1 %, 2%, 5%, 10%, 30% ou 50% dos diois vicinais de um sacarídeo bacteriano se tornam oxidados durante ativação de periodato (consulte o documento WO2011/110531), por exemplo, entre 5 a 10%. Baixas temperaturas de reação também favorecem menores quantidades de oxidação da cadeia polissacarídica. Em algumas modalidades, concentrações de periodato baixas (<0,1 eq) são combinadas com reações durante a noite a 4 para minimizar a oxidação da cadeia polissacarídica de polissacarídeos capsulares particulares, como 19F de S. pneumoniae.
[0258] Em algumas modalidades, o nível de adição de periodato e as condições de reação são ajustados para direcionar a divagem para
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89/233 açúcares seletivos de uma cadeia polissacarídica. Por exemplo, NalÜ4 1mM a 4 graus Celsius é usado na literatura para oxidar seletivamente resíduos de ácido siálico nos carbonos 7, 8, ou 9, enquanto NaICri 10mM à temperatura ambiente é usado para oxidar uma ampla variedade de resíduos de açúcar, incluindo resíduos de ácido siálico, galactose e mannose.
[0259] Para a oxidação de resíduos de serina ou metionina no terminal N em antígenos proteicos, são geralmente usadas condições de oxidação mais moderadas (baixas concentrações de periodato e tempos de reação), para evitar danos oxidativos nas cadeias laterais internas dos antígenos. Em uma modalidade, a etapa (b) compreende adicionar periodato de sódio a uma concentração final de 2,5 mM e a etapa (c) compreende incubar a mistura de reação a 25 graus Celsius por 3 minutos.
[0260] Como o excesso de periodato não reagido pode causar níveis de oxidação mais altos que os desejáveis, ou danos às metades imunogênicas, o antígeno em excesso, o periodato em excesso é removido opcionalmente na etapa (d). Para antígenos grandes (> 10 kDa), o excesso de periodato, em algumas modalidades, é removido por exclusão de tamanho, diálise ou diafiltração contra água ou solução tampão utilizando um meio com um limite de exclusão ou corte de peso molecular adequado. Para antígenos pequenos em que a purificação baseada no tamanho é inconveniente (peptideos curtos ou oligossacarídeos), e a remoção do periodato na etapa (d) compreende a adição de um agente de extinção. O excesso de periodato é opcionalmente extinto pela adição de glicerol (10% (v/ v)), a adição de um excesso molar de sulfito de sódio, ou a adição de um excesso molar de N-acetilmetionina.
[0261] Em algumas modalidades, um polissacarídeo ou proteína antígeno é desprotegido para aumentar a acessibilidade de grupos
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90/233 hidroxila ou amina para ativação de periodato. Em uma modalidade, os grupos O-acetila ou N-acetila em polissacarídeos são removidos para aumentar a reatividade de hidroxilas adjacentes em periodato. Para antígenos polissacarídicoso, de-O-acetilação ou de-N-acetilação opcionalmente conseguida por incubação em uma solução de ácido suave (por exemplo, com baixa concentração de HCI) ou alcalina (por exemplo, bicarbonate de sódio), seguido de aquecimento opcional e ajuste para pH fisiológico. Em algumas modalidades, o tratamento ácido suave (HCI <0,1 M ou AcOH <0,2 M), seguido de aquecimento e neutralização é utilizado para hidrolisar parcialmente (dimensionar) polissacarídeos de elevado peso molecular. Em algumas modalidades, o tratamento ácido suave (por exemplo, HCI <0,1 M ou AcOH <0,2 M), seguido de aquecimento (45 a 95 QC) e neutralização (para pH 5,5 a 6,0) é utilizado para hidrolisar parcialmente (dimensionar) polissacarídeos de alto peso molecular e desproteger o polissacarídeo. Em algumas modalidades, os sorotipos 3, 4,18C e 11A são tratados por um processo de ácido/ aquecimento /neutralização para desproteger o polissacarídeo, dimensionar o polissacarídeo ou ambos. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 3 de S. pneumoniae é tratado com ácido acético 0,18M, seguido de aquecimento por aquecimento a 85 Ό por 1 hora. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 4 de
S. pneumoniae é tratado com HCI 0,01 M seguido de aquecimento a 45QC por 1 hora. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 18C de
S. pneumoniae é tratado com ácido acético 0,18M, seguido de aquecimento por aquecimento a 95 O por 40 minutos. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 3 de S. pneumoniae é tratado com ácido acético 0,18M, seguido de aquecimento por aquecimento a 80 Ό por 1 hora.
[0262] Em uma outra modalidade, os grupos N-formila nas proteínas purificadas são removidos/os grupos amina são de-formilados
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91/233 por tratamento com uma amido-hidrolase de peptídeo de formil-Lmetionila em água desionizada ou uma solução fisiológica tamponada com pH. Em ainda outra modalidade, os grupos N-formila em proteínas purificadas são removidos por tratamento de proteína liofilizada com vapor de hidrazina anidro a -5 Ό (Miyataki et al. Eur. J. Biochem. 212, 785 a 789 (1993)).
Ativação de CDAP [0263] Em algumas modalidades, o antígeno é ativado pela formação de um aduto transiente com tetrafluoroborato de ciano-4dimetilamino piridínio (CDAP) (consulte, por exemplo, os documentos WO2011/110531 e US20120321658). Em algumas modalidades, os grupos hidroxila em um antígeno de proteína ou polissacarídeo são ativados por reação com CDAP para formar um aduto transiente de cianato (-OCN), que é, então, feito reagir com um nucleófilo adequado em um manejo químico ou ligante para formar uma ligação carbamimidato. Nessa modalidade, as ligações C-C no antígeno não são clivadas (em contraste com a ativação do periodato). Em algumas modalidades, polissacarídeos capsulares particulares são preferencialmente ativados com o uso de CDAP. Em modalidades particulares, os polissacarídeos capsulares sorotipo 3, 7F, ou 10A de S. pneumoniae são ativados com o uso de CDAP.
[0264] Para ativação de CDAP de antígenos: (a) o antígeno é dissolvido em um solvente adequado; (b) CDAP é adicionado ao antígeno a partir de uma solução estoque; (c) um agente tampão é adicionado.
[0265] A ativação de CDAP é opcionalmente realizada em qualquer solvente adequado. Em algumas modalidades, o solvente em (a) compreende água destilada. Em modalidades adicionais, o solvente em (a) adicionalmente compreende um solvente orgânico como DMSO ou acetonitrila. Em modalidades particulares, os polissacarídeos
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92/233 capsulares sorotipo 3, 7F, ou 10A de S. pneumoniae são ativados com o uso de água.
[0266] Em algumas modalidades, quantidades de CDAP supra ou subestequiométricas (em relação a polissacarídeos) são usadas para ativação. Em algumas modalidades, cerca de 0,1 a cerca de 3 eq de CDAP é usado para ativação de um polissacarídeo. Em algumas modalidades, cerca de 0,2 a 0,8 eq de CDAP é usado para ativação de um polissacarídeo. Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular sorotipo 3 de S. pneumoniae é ativado com o uso de 2,0 eq de CDAP. Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular sorotipo 10A de S. pneumoniae é ativado com o uso de 0,8 eq de CDAP.
[0267] Em algumas modalidades, a adição de um agente tampão em (c) é usada para aumentar drasticamente a eficiência da ativação de CDAP (Lees et al. Vaccine. 1996 (14):190 a 198). Em algumas modalidades, o agente tampão em (c) é trietanolamina (TEA). Em algumas modalidades, cerca de 1 a cerca de 4 eq de TEA (em relação ao polissacarídeo) é usado como um agente tampão. Em uma modalidade, cerca de 1 a cerca de 4 eq ed TEA é usado como um agente tampão para uma reação de ativação de CDAP que envolve polissacarídeo sorotipo 7F de S. pneumoniae. Em algumas modalidades, 2,5 eq de TEA é usado como agente tampão. Em uma modalidade, 2,5 eq ed TEA é usado como um agente tampão para uma reação de ativação de CDAP que envolve polissacarídeo sorotipo 7F de
S. pneumoniae. Em algumas modalidades, o agente tampão é borato de sódio, carbonato de sódio ou hidróxido de sódio, e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o agente tampão tem um pKa entre cerca de 8,0 a cerca de 11,0 ou o agente tampão é usado para ajustar o pH da solução de reação para entre cerca de 8,0 a cerca de 11,0. Em algumas modalidades, o agente tampão tem um pKa entre cerca de 9,0 a cerca de 9,5 ou o agente tampão é usado para
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93/233 ajustar o pH da solução de reação para entre cerca de 9,0 a cerca de 9,5. Em uma modalidade, o ajuste de hidróxido de sódio de pH para 9,5 é usado para uma reação de ativação de CDAP que envolve polissacarídeo sorotipo 3 de S. pneumoniae. Em uma modalidade, o ajuste de hidróxido de sódio de pH para 9,5 é usado para uma reação de ativação de CDAP que envolve polissacarídeo sorotipo 10A de S. pneumoniae.
[0268] Ativação de carbonildiimidazol (CDI)/carbonilditriazol (CDT): [0269] Em algumas modalidades, o antígeno é ativado com carbonildiimidazol (GDI) ou carbonilditriazol (CDT). GDI e CDT, like CDAP, têm a capacidade de ativar grupos hidroxila em um antígeno para formar uma parte reativa transiente; nesse aso, é um carbamato
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instável ( o para GDI e para CDT), que é, então, opcionalmente reagido com uma amina ou tiol em um manejo químico ou ligante para formar um carbamato ou ligação de carbonotioato. A ativação deve ser realizada em um solvente orgânico seco. Em algumas modalidades, a ativação de CDI/CDT é realizada em dimetilsulfóxido anidro (DMSO). Em algumas modalidades, a ativação de CDI/CDT é realizada pela adição de um excesso molar de CDI/CDT em relação ao antígeno. Em outras modalidades, a ativação de CDI/CDT é realizada pela adição de uma quantidade molar de CDI/CDT aproximadamente igual à quantidade molar do antígeno.
[0270] Nenhuma ativação química:
[0271] Em algumas modalidades, aminas endógenas ou outras partes nucleofílicas (por exemplo, uma amina primária) naturalmente presentes ou o resultado de uma etapa de desproteção (por exemplo, como discutido acima) são utilizadas para conjugar um dado polissacarídeo a um manejo químico ou proteína veículo. Tais partes
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94/233 nucleofílicas podem reagir convenientemente com uma variedade de reagentes de conjugação eletrofílica comuns, como derivados de succinato (por exemplo, ésteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) ou sulfo-NHS). Em tais modalidades, é por vezes vantajoso tratar com um protocolo de periodato como em (i) para promover a degradação de contaminantes antigênicos como o polissacarídeo C de S. pneumoniae. Nessa modalidade, o tratamento com periodato é seguido por um vasto excesso de boroidreto de sódio para extinguir qualquer grupo aldeído quimicamente introduzido. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 1 de S. pneumoniae é tratado com entre cerca de 0,05 a cerca de 0,25 eq de periodato de sódio à temperatura ambiente durante cerca de 12 a cerca de 14 horas, seguido de tratamento com cerca de 5 eq a cerca de 15 eq de boroidreto de sódio. Em uma modalidade, o polissacarídeo sorotipo 1 de S. pneumoniae é tratado com 0,15 eq de periodato de sódio à temperatura ambiente durante 18 horas, seguido de tratamento com 10 eq de boroidreto de sódio.
[0272] Conjugação a manejo químico:
[0273] Em algumas modalidades, o antígeno é conjugado ao manejo químico com o uso de qualquer método químico compatível com os métodos de ativação descritos acima (Ativação de antígenos). Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, formação de base de Schiff com aldeídos de antígeno sintético seguido por aminação redutiva, formação de hidrazona, formação de oxima, adição nucleofílica direta e formação de base de Schiff com antígeno nativo aldeídos seguido por aminação redutiva. Em algumas modalidades, a concentração absoluta de polissacarídeo em uma reação de conjugação com um manejo químico importante para minimizar a agregação ou a reatividade cruzada do polissacarídeo. Em algumas modalidades, a concentração absoluta de polissacarídeo/antígeno em uma reação de conjugação com DBCO (uma dibenzociclo-octina) ou um
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95/233 derivado de DBCO é importante para polissacarídeos ativados com periodato ou CDAP. Em algumas modalidades, a concentração de polissacarídeo em uma reação de conjugação de DBCO/derivado de DBCO é menor que 2, menor que 5, menor que 7, menor que 10, menor que 15, menor que 17,5, ou menor que 20 pmol/ml. Em algumas modalidades, a concentração de polissacarídeo em uma reação de conjugação de DBCO/derivado de DBCO é cerca de 1,5 a cerca de 17,5 pmol/ml.
[0274] Reações com antígenos ativados com periodato:
[0275] Em algumas modalidades, o manejo químico é conjugado a um antígeno de polipeptídeo ou polissacarídeo ativado como acima (Ativação de antígenos) com periodato. Nessas modalidades, um manejo químico que compreende um grupo funcional que forma um aduto estável ou semiestável com aldeídos é combinado com o antígeno ativado por periodato, seguido de redução opcional para converter adutos semiestáveis em adutos estáveis (consulte, por exemplo, o documento WO2014/111344; Wu et al. Vaccine 31(2013): 5623-2626; Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques, Segunda Edição, 2008). Em algumas variações dessas modalidades, o manejo químico é adicionado a um grande excesso molar em relação aos grupos aldeído no antígeno ativado, de modo que todos os aldeídos são consumidos na reação de conjugação de manejo químico/antígeno. Em outras variações dessas modalidades, o manejo químico é adicionado a uma razão molar mais baixa em relação aos grupos aldeídos no antígeno ativado e o excesso de aldeídos não reagidos no antígeno ativado é consumido por reação adicional com um excesso de um nucleófilo reativo a aldeído barato (por exemplo, etanolamina), ou por tratamento com um agente redutor suficientemente forte para reduzir aldeídos a grupos hidroxila (por exemplo, NaBH4).
[0276] Em uma modalidade, o manejo químico é conjugado ao
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96/233 antígeno por formação de base de Schiff com aldeídos de antígeno sintético seguido de aminação redutora. Essa modalidade resulta em um produto final que tem uma ligação de amina secundária entre o manejo químico e o antígeno: uma ligação de N-C direta entre a amina do manejo químico e um átomo de carbono no antígeno. Nessa modalidade, o manejo químico compreende uma amina. Nessa modalidade, o método de conjugação compreende: combinar o manejo contendo amina com o antígeno ativado por periodato em água Dl ou solução tamponada contendo DMSO; incubar para formar uma base de Schiff; reduzir a base de Schiff a uma amina secundária com o uso de cianoboroidreto de sódio (NaBHhCN); e opcionalmente extinção de aldeídos não reagidos com NaBHk Em algumas modalidades desse método, o manejo químico e antígeno são combinados em estequiometria em ou próximo a 1:1. Em algumas modalidades desse método, o manejo químico e antígeno são combinados com um excesso molar de manejo químico. Em algumas modalidades desse método, o manejo químico e antígeno são combinados com um excesso molar de antígeno. Em algumas modalidades, o cianoboroidreto de sódio é substituído por outro agente redutor com seletividade semelhante para reduzir ligações C = N, como triacetoxiboroidreto de sódio.
[0277] Em uma modalidade, o manejo químico é conjugado ao antígeno via formação de hidrazona. Nessa modalidade, o manejo químico compreende um grupo hidrazida (-C(=O)-NH-NH2). Essa modalidade resulta em um produto final que tem uma ligação de hidrazona (-C(=O)-NH-N=C-) ou N'-alquil hidrazida (-C(=O)-NH-NH-C-) entre o manejo químico e o carbono de antígeno. Nessa modalidade, o método de conjugação compreende: combinar um excesso molar do manejo químico contendo hidrazida com o antígeno em uma solução a pH 6,0 a 8,5 e incubar para formar uma hidrazona (-C(=O)-NH-N=C-). Em algumas outras modalidades desse método, o cianoboroidreto de
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97/233 sódio ou o triacetoxiboroidreto de sódio é incluído na mistura de reação para reduzir a ligação N = C, que produz uma N'-alquil-hidrazida. (C(=O)-NH-NH-C-).
[0278] Em uma modalidade, o manejo químico é conjugado ao antígeno por formação de oxima. Nessa modalidade, o manejo químico compreende um grupo aminooxi (-O-NH2). Essa modalidade resulta em um produto final que tem uma ligação oxima (-O-N=C-) entre 0 manejo químico e um carbono de antígeno. Nessa modalidade, 0 método de conjugação compreende: combinar um excesso molar do manejo químico contendo aminooxi com 0 antígeno em uma solução a pH 6,0 a
8,5 e incubar para formar uma ligação de oxima (-C(=O)-NH-N=C-). Em algumas outras modalidades adicionais desse método, 0 cianoboroidreto de sódio ou triacetoxiboroidreto de sódio é incluído na mistura de reação para reduzir a ligação N = C e melhorar a estabilidade; isso produz uma ligação N'-alquil hidroxilamina (-O-N-C-). [0279] Reações com antígenos ativados com CDAP:
[0280] Em algumas modalidades, 0 manejo químico é conjugado a um antígeno de polipeptídeo ou polissacarídeo ativado como descrito acima (ativação de CDAP) com CDAP. Nessas modalidades, um grupo transiente de cianato (-OCN) produzido através da ativação de CDAP ainda é reagido com um manejo químico contendo amina para produzir uma ligação de carbamimidato (-NH-C(=NH)-O-) entre 0 manejo químico e um carbono de antígeno.
[0281] Para conjugação de CDAP de manejos químicos, grupos hidroxila no antígeno são ativados conforme descrito acima (ativação de CDAP), e um manejo químico que compreende uma amina é adicionalmente adicionado à mistura de ativação. Como 0 grupo cianato é instável, 0 manejo químico é geralmente adicionado em breve (em minutos) após a ativação do antígeno. Em algumas modalidades, 0 antígeno é adicionado 2,5 minutos após CDAP ser introduzido. Em
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98/233 algumas modalidades, é adicionado um grande excesso molar do manejo químico contendo amina em relação aos grupos hidroxila ativados no antígeno. Em outras modalidades, o manejo químico é adicionado em uma concentração mais próxima da razão molar de 1:1 em relação aos grupos hidroxila ativados no antígeno, e o excesso de grupos cianato não reagidos é exaurido pela adição de um excesso de uma amina pouco dispendiosa (por exemplo, etanolamina ou hexanodiamina).
[0282] Reações com antígenos ativados com CDI/CDT:
[0283] Em algumas modalidades, o manejo químico é conjugado a um antígeno de polipeptideo ou polissacarídeo ativado conforme descrito acima (ativação de carbonildiimidazol (CDI)/carbonilditriazol (CDT)) com CDI/CDT. Nessas modalidades, um carbamato instável produzido por ativação de CDI/CDT de grupos hidroxila de antígeno (
Figure BR112019013475A2_D0013
o para GDI e para CDT) é reagido com uma amina primária para produzir uma ligação de carbamato (-NH-C(=O)-O) estável ou tiol primário para produzir uma ligação de carbonotioato estável (-SC (=0)-0-) entre o manejo químico e um carbono de antígeno. Em algumas modalidades, é adicionado um grande excesso molar do manejo químico contendo amina/tiol em relação aos grupos hidroxila ativados no antígeno. Em outras modalidades, o manejo químico é adicionado a uma concentração mais próxima a uma razão molar de 1:1 em relação aos grupos hidroxila ativados no antígeno. Ainda em outras modalidades, o CDI/CDT residual na reação é ainda inativado por tratamento com tetraborato de sódio.
[0284] Reações com antígenos não ativados:
[0285] Em algumas modalidades, o manejo químico é conjugado a uma amina endógena ou outra parte nucleofílica (por exemplo, uma
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99/233 amina primária) ou naturalmente presente ou o resultado de uma etapa de desproteção de um antígeno de polipeptideo ou polissacarídeo conforme descrito acima. Em uma modalidade disso, um grupo eletrofílico (por exemplo, um éster NHS ou sulfo-NHS) em um manejo químico é reagido com um grupo amina primária no antígeno para produzir uma ligação amida (-C(=O)-NH-) entre o manejo químico e a amina de antígeno. Em uma outra modalidade, um grupo ácido carboxílico em um manejo químico é reagido com um grupo amina primário no antígeno na presença de reagentes de acoplamento peptídicos padrão e condições para produzir uma ligação amida entre o manejo químico e a amina de antígeno.
Manejos contendo alquino [0286] Em algumas modalidades, o manejo químico compreende uma parte que permite uma reação química de click com um grupo correspondente em resíduo de nnAA de polipeptideo. Uma dessas partes é um grupo alquino, que tem a capacidade de reagir com um resíduo nnAA compreendendo um grupo azido. Na modalidade mais simples, esse é um grupo propargila, de modo que um grupo alquino em um antígeno compreenda uma estrutura de Fórmula IV:
Ui [0287] em que:
[0288] L22 é C1-C10 alquila; e [0289] U1 é pelo menos uma parte de um antígeno.
[0290] Em outras modalidades, um grupo alquino em um antígeno compreende uma estrutura de Fórmula IVa:
'Z? IJJH
U1 [0291] em que:
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100/233 [0292] l_22 é -(CH2CH20)i-io-; e [0293] Ui é pelo menos uma parte de um antígeno.
[0294] Em algumas modalidades, o grupo alquino compreende adicionalmente recursos adicionais que aceleram ou facilitam a reação do alquino com um grupo azido. Um exemplo de tal recurso é uma estrutura de anel com 8 membros (por exemplo, ciclo-octina), de modo que um grupo alquino em um antígeno compreende adicionalmente um grupo DIFO ou DBCO. Em algumas modalidades, um grupo alquino em um antígeno compreende uma estrutura de Fórmula V, VI ou Via:
Figure BR112019013475A2_D0014
Figure BR112019013475A2_D0015
[0296] Li é independentemente uma ligação, -NH-, -O-, -S-, NH(Li2)-, -O(Li2)-, ou-S(Li2)-;
[0297] l_2 é independentemente uma ligação, -C(=O)-, -S(=O)2-, C(=O)Li2-, -S(=O)2Li2;
[0298] Li2 é independentemente l_22 ou L22NH[0299] l_22 é independentemente C1-10 alquila ou -(CH2CH20)i-io-; e [0300] Ui é independentemente pelo menos uma parte de um antígeno.
[0301 ] Em algumas modalidades, estruturas de Fórmula V e Via são convenientemente formadas de um antígeno que compreende um grupo nucleofílico (por exemplo, uma amina primária) e o éster de NHS ou sulfo-NHS dos ácidos carboxílicos de DIFO ou DBCO correspondentes de estruturas V e Via. Em algumas modalidades, as estruturas de Fórmula VI são convenientemente formadas de um antígeno ativado, e um derivado de DBCO como DBCO-NH2 ou DBCO-PEGn-NH2. Em algumas modalidades, DBCO-PEGn-NH2 é DBCO-PEG4-NH2.
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101/233 [0302] [0303] [0304]
Figure BR112019013475A2_D0016
DIFO [0305] O valor de n em PEGn representa o número de unidades de repetição de oxietileno, por exemplo, na estrutura acima, ou dentro da Fórmula VII, VIlb, XI, ou parte A, ou dentro do poli (alquiloxi) de L22. O valor de n encontra-se na faixa de 1-20, por exemplo, 2-18, 3-16 ou 4-14. Dessa forma, n pode ser, por exemplo, qualquer um de 4, 5, 11, 12ou 13.
[0306] Em algumas modalidades de Fórmulas IV, V, ou VI, a parte de Ui é pelo menos um poliol de um polissacarídeo. Em algumas modalidades, a parte de U1 é pelo menos um poliol de um lipopolissacarídeo. Em algumas modalidades, a parte de U1 é pelo menos um aminoácido de um polipeptideo antigênico.
[0307] Em modalidades adicionais, um antígeno que compreende um alquino compreende uma estrutura de Fórmula VII ou Vila:
Figure BR112019013475A2_D0017
(Fórmula VII)
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102/233
Figure BR112019013475A2_D0018
(Fórmula Vila) [0308] em que:
[0309] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo; e [0310] n é pelo menos 1.
[0311] Quando um grupo (por exemplo, X, Y ou Ui) é descrito como sendo um poliol, isto pode referir-se a uma ligação química a um poliol dentro do polissacarídeo (por exemplo, a um monossacarídeo dentro do polissacarídeo, em que o monossacarídeo é um poliol). A ligação em si pode ser a qualquer grupo funcional adequado (por exemplo, a um aldeído, que pode surgir da oxidação de um diol vicinal).
[0312] Em modalidades adicionais, um antígeno que compreende um alquino compreende uma estrutura de Fórmula Vllb ou VIIc
Figure BR112019013475A2_D0019
Figure BR112019013475A2_D0020
(Fórmula Vllb) x
(Fórmula Vllc) [0313] em que:
[0314] X é independentemente uma amina de pelo menos um aminoaçúcar de um polissacarídeo; e [0315] n é pelo menos 1.
[0316] Em algumas modalidades, um antígeno que compreende um alquino compreende um polissacarídeo de acordo com (A-X)z-Y, em que:
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103/233
Figure BR112019013475A2_D0021
[0318] X é independentemente pelo menos um poliol;
[0319] Y é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo;
[0320] n é pelo menos 1; e [0321] z é maior que 1.
[0322] Em algumas modalidades, um antígeno compreende polissacarídeo que compreende adicionalmente um grupo DBCO compreende pelo menos 1,5%, pelo menos, 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, ou pelo menos 20% (p/p) de DBCO covalentemente fixado. Em algumas modalidades, o antígeno compreende mais que cerca de 1,5% (p/p) de DBCO. Em algumas modalidades, o antígeno compreende mais que 3% (p/p) de DBCO. Em algumas modalidades, o antígeno compreende no máximo 20% no máximo 19%, no máximo 18%, no máximo 17%, no máximo 16%, no máximo 15%, no máximo 14%, no máximo 13%, no máximo 12%, no máximo 11%, no máximo 10%, no máximo 9%, no máximo 8%, no máximo 7%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, no máximo 3,5%, no máximo 3,0%, no máximo 2,5%, no máximo 2,0%, ou no máximo cerca de 1,7% (p/p) de DBCO covalentemente ligado. Em algumas modalidades, o antígeno compreende menos que 20% (p/p) de DBCO covalentemente ligado. Em outras modalidades, o antígeno compreende menos que 10% (p/p) de DBCO covalentemente ligado. Em algumas modalidades, o antígeno compreende entre cerca de 1,5 e 20%, 3% e 20%, 3% e 18%, 3% e 16%, 3% e 14%, 3% e 12%, 3% e
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10%, 3% e 8%, 3% e 6%, ou 3% e 4% , ou 1,5 e 9% (p/p) de DBCO covalentemente ligado.
[0323] Em algumas modalidades, um antígeno compreende polissacarídeo que compreende adicionalmente um grupo DBCO compreende pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, ou pelo menos 20% de moléculas de DBCO por 100 unidades de repetição de polissacarídeo. Em algumas modalidades, o antígeno compreende mais que 3% de moléculas de DBCO por 100 unidades de repetição de polissacarídeo. Em algumas modalidades, o antígeno compreende no máximo 20% no máximo 19%, no máximo 18%, no máximo 17%, no máximo 16%, no máximo 15%, no máximo 14%, no máximo 13%, no máximo 12%, no máximo 11%, no máximo 10%, no máximo 9%, no máximo 8%, no máximo 7%, no máximo 6%, no máximo 5%, no máximo 4%, ou no máximo 3,5% de moléculas de DBCO covalentemente ligado por 100 unidades de repetição de polissacarídeo. Em algumas modalidades, o antígeno compreende menos que 20% de DBCO covalentemente ligado por unidade de repetição de polissacarídeo. Em outras modalidades, o antígeno compreende menos que 10% de moléculas de DBCO covalentemente ligado por 100 unidades de repetição de polissacarídeo. Em algumas modalidades, o antígeno compreende entre cerca de 3% e 20%, 3% e 18%, 3% e 16%, 3% e 14%, 3% e 12%, 3% e 10%, 3% e 8%, 3% e 6%, ou 3% e 4% moléculas de DBCO covalentemente ligado por 100 unidades de repetição de polissacarídeo.
[0324] Em uma modalidade, um antígeno que compreende um polissacarídeo é opcionalmente um oligossacarídeo. Os
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105/233 oligossacarídeos têm um baixo número de unidades de repetição (tipicamente 5 a 15 unidades de repetição) e são tipicamente derivados sinteticamente ou por hidrólise de polissacarídeos de peso molecular mais elevado.
[0325] Em uma modalidade, um antígeno que compreende um polissacarídeo tem um peso molecular de entre cerca de 10 kDa e cerca de 10.000 kDa. Em tais outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 10.000 kDa. Em tais modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 10.000 kDa; entre 50 kDa e 9.500 kDa; entre 50 kDa e 9.000 kDa; entre 50 kDa e 8.500 kDa; entre 50 kDa e 8.000 kDa; entre 50 kDa e 7.500 kDa; entre 50 kDa e 7.000 kDa; entre 50 kDa e 6.500 kDa; entre 50 kDa e 6.000 kDa; entre 50 kDa e 5.500 kDa; entre 50 kDa e 5.000 kDa; entre 50 kDa e 4.500 kDa; entre 50 kDa e 4.000 kDa; entre 50 kDa e 3.500 kDa; entre 50 kDa e 3.000 kDa; entre 50 kDa e 2.500 kDa; entre 50 kDa e 2.000 kDa; entre 50 kDa e 1.750 kDa; entre 50 kDa e 1.500 kDa; entre 50 kDa e 1.250 kDa; entre 50 kDa e 1.000 kDa; entre 50 kDa e 750 kDa; entre 50 kDa e 500 kDa; 100 kDa e 10.000 kDa; entre 100 kDa e 9.500 kDa; entre 100 kDa e 9.000 kDa; entre 100 kDa e 8.500 kDa; entre 100 kDa e 8.000 kDa; entre 100 kDa e 7.500 kDa; entre 100 kDa e 7.000 kDa; entre 100 kDa e 6.500 kDa; entre 100 kDa e 6.000 kDa; entre 100 kDa e 5.500 kDa; entre 100 kDa e 5.000 kDa; entre 100 kDa e 4.500 kDa; entre 100 kDa e 4.000 kDa; entre 100 kDa e 3.500 kDa; 100 kDa e 3.000 kDa; 100 kDa e 2.500 kDa; 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 2.000 kDa; entre 100 kDa e 1.750 kDa; entre 100 kDa e 1.500 kDa; entre 100 kDa e 1.250 kDa; entre 100 kDa e 1.000 kDa; entre 100 kDa e 750 kDa; entre 100 kDa e 500 kDa; 200 kDa e 10.000 kDa; entre 200 kDa e 9.500 kDa; entre 200 kDa e 9.000 kDa; entre 200 kDa e 8.500 kDa; entre 200 kDa e 8.000 kDa; entre 200 kDa e 7.500 kDa; entre 200 kDa e 7.000 kDa; entre 200 kDa e 6.500 kDa; entre 200 kDa e 6.000
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106/233 kDa; entre 200 kDa e 5.500 kDa; entre 200 kDa e 5.000 kDa; entre 200 kDa e 4.500 kDa; entre 200 kDa e 4.000 kDa; entre 200 kDa e 3.500 kDa; entre 200 kDa e 3.000 kDa; entre 200 kDa e 2.500 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 2.000 kDa; entre 200 kDa e 1.750 kDa; entre 200 kDa e 1.500 kDa; entre 200 kDa e 1.250 kDa; entre 200 kDa e 1.000 kDa; entre 200 kDa e 750 kDa; ou entre 200 kDa e 500 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer um dos intervalos acima é contemplado como uma modalidade da descrição.
[0326] Em uma modalidade, um antígeno que compreende um polissacarídeo tem um peso molecular de entre cerca de 50 kDa e cerca de 1.400 kDa. Em uma modalidade, um antígeno que compreende um polissacarídeo tem um peso molecular de entre cerca de 500 kDa e cerca de 3.000 kDa.
Manejos contendo azido [0327] Em algumas modalidades, o manejo químico compreende uma parte que permite uma reação química de click com um grupo correspondente em resíduo de nnAA de polipeptideo. Tal parte é um grupo azido, que tem a capacidade de reagir com um resíduo de nnAA que compreende um grupo alquino ou uma fosfina em um polipeptideo. Em algumas modalidades, um grupo azido em um antígeno compreende uma estrutura de Fórmula VIII:
y—NH J—22 Ui
N3 (VIII) [0328] L22 é uma ligação, alquila, ou poli(alquilóxi); e [0329] Ui é independentemente pelo menos uma parte de um antígeno.
Manejos contendo alceno [0330] Em algumas modalidades, 0 manejo químico compreende uma parte que permite uma reação química de click com um grupo correspondente em resíduo de nnAA de polipeptideo. Uma dessas
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107/233 partes é um grupo alceno, que tem a capacidade de reagir com um resíduo nnAA compreendendo um grupo 1,2,4,5-tetrazina. Nas modalidades mais simples, esse é um grupo vinila. Em tal modalidade, um grupo alceno em um antígeno compreende uma estrutura de Fórmula IX:
Figure BR112019013475A2_D0022
[0331] em que:
[0332] Ui é independentemente pelo menos uma parte de um antígeno.
[0333] Em outras modalidades, um grupo alceno em um antígeno compreende uma estrutura de Fórmula IXa:
[0334] em que:
[0335] L22 é C1-10 alquila ou -(CFkCFkOJi-io-; e [0336] Ui é independentemente pelo menos uma parte de um antígeno.
[0337] Em uma modalidade, a descrição fornece um método para produzir um glicoconjugado que compreende: (a) fornecer um ácido nucléico que codifica uma proteína veículo, em que 0 ácido nucléico compreende um códon de supressão; (b) criar uma mistura de reação pela combinação do ácido nucléico com um extrato bacteriano livre de célula que compreende 4-azidometilfenilalanina (pAMF), um tRNA complementar ao códon de supressão, e uma aminoacil-tRNA sintetase;
(c) incubar a mistura de reação de (b) sob condições suficientes para seletivamente incorporar pAMF em um sítio que corresponde ao códon de supressão na proteína veículo; e (d) conjugar 0 pAMF a um polissacarídeo por uma [2+3] cicloadição. Em uma outra modalidade, a [2+3] cicloadição compreende a reação entre uma azida e um grupo
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108/233 alquino. Em uma outra modalidade, a etapa (c) compreende incubar a mistura de reação a menos que 20 graus Celsius. Em uma outra modalidade, o método adicionalmente compreende purificar a proteína veículo imediatamente após (c). Em uma outra modalidade, o códon de supressão é seletivamente substituído no códon 25, 34, 38, 40, 213, 215, 228, 245, 265, 386, 523 ou 527 de SEQ ID NO:2. Em uma outra modalidade, a mistura de reação em (b) compreende adicionalmente componentes biológicos necessários para síntese de proteína. Em uma outra modalidade, o tRNA em (b) tem a capacidade de ser carregado com pAMF. Em uma outra modalidade, a aminoacil-tRNA sintetase em (b) preferencialmente aminoacila o tRNA com pAMF em comparação com os 20 aminoácidos naturais. Em uma outra modalidade, o grupo alquino compreende uma parte de DBCO conjugada ao polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6). Em uma outra modalidade, a descrição fornece um glicoconjugado preparado por um processo que compreende as etapas (a) a (d). Em uma outra modalidade, o pAMF é conjugado ao polissacarídeo para gerar um conjugado de Fórmula X, Xa, XI ou Xla. Em uma modalidade, a descrição fornece uma vacina que compreende o glicoconjugado preparado por meio das etapas (a) a (d).
[0338] Conjugados de polipeptídeo-antígeno:
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109/233 [0339] São descritos no presente documento conjugados de polipeptídeo-antígeno que podem ser formados entre um polipeptídeo imunogênico conforme descrito acima e um antígeno conforme descrito acima. Em algumas modalidades os conjugados de polipeptídeoantígeno compreendem uma proteína veículo acentuada e um antígeno, em que o antígeno é ligado a um nnAA na proteína veículo acentuada. Em uma modalidade, o antígeno não é ligado a um aminoácido natural de um polipeptídeo imunogênico. Em uma outra modalidade, o antígeno não é ligado a uma lisina em um polipeptídeo imunogênico. Por exemplo, o antígeno não é ligado a uma lisina em SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o antígeno é apenas ligado a um ou mais nnAAs de um polipeptídeo imunogênico. O um ou mais nnAA encontra-se opcionalmente localizado no terminal N, no terminal C, ou em qualquer lugar entre as extremidades dos terminais N e C de um polipeptídeo imunogênico. Em alguns casos, o antígeno é apenas ligado a um ou mais pAMFs em um polipeptídeo imunogênico. Por exemplo, o antígeno é apenas ligado a um ou mais pAMFs em SEQ ID NO:1.
[0340] Em uma outra modalidade, pelo menos um antígeno é ligado a um aminoácido situado fora de um epítopo de célula T de um polipeptídeo imunogênico. Em uma outra modalidade, no antígeno é ligado a um aminoácido situado em um epítopo de célula T de um polipeptídeo imunogênico.
[0341] Os aminoácidos selecionados para conjugação em um polipeptídeo imunogênico compreendem opcionalmente um ou mais resíduos de superfície acessível com base na estrutura cristalina (ou outra estrutura 3D, como uma estrutura de RMN) do polipeptídeo. Adicional ou alternativamente, é realizada uma substituição abrangente de aminoácidos naturais para nnAAs em um polipeptídeo imunogênico seguido de conjugação, para avaliar a utilidade de sítios específicos no polipeptídeo para conjugação.
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110/233 [0342] Em uma modalidade, o antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada indiretamente (por exemplo, primeiro combinando a proteína veículo acentuada ou antígeno com um ligante reativo e, então, combinando o aduto de proteína veículo acentuada-ligante ou aduto de antígeno-ligante com um antígeno ou proteína veículo acentuada, respectivamente). Em uma outra modalidade, o antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada diretamente (por exemplo, pela combinação de dois componentes que compreendem a proteína veículo acentuada e antígeno juntos em uma reação). Quando um conjugado incluir um ligante, pode ser usado qualquer grupo adequado. Por exemplo, um conjugado pode incluir um ligante selecionado de ácido adípico, dihidrazida de ácido adípico (ADH), β-propionamido, nitrofenil-etilamina, haletos de haloacila, ligações glicosídicas, ácido 6-aminocaproico, Nsuccinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP), partes C4 a C12, etc. Os ligantes resultantes dos grupos DBCO e DIFO discutidos acima também podem ser usados, por exemplo, incluindo 0 resíduo de uma parte de diarilciclooctila, como diarilciclocteno. O ligante será geralmente ligado a antígeno para conjugação, em vez de ser ligado a um veículo.
[0343] Como os conjugados antígeno-polipeptídeo podem formar grandes complexos reticulados, pode não ser possível, com os métodos analíticos disponíveis, medir ou determinar diretamente a localização exata de algumas ou de todas as conjugações e outros recursos físicos. Entende-se, no entanto, que tais localizações ou características físicas podem ser inferidos de forma confiável a partir do projeto de um esquema sintético, seu produto esperado e resultados analíticos consistentes com essa expectativa.
Reação de conjugação de antígeno-polipeptídeo [0344] Em algumas modalidades, 0 antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada com 0 uso de qualquer método químico adequado para conjugar os aminoácidos não naturais e manejos
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111/233 químicos descritos no presente documento. Tais métodos incluem, mas não se limitam à cicloadição de alquino-azida catalisada por cobre (I) (CuAAC), cicloadição de azida-alquino promovida por estiramento (SPAAC) e ligação alceno-tetrazina. Como reações de click, todas essas reações podem ser realizadas em solução aquosa. A ligação de Staudinger entre uma fosfina e uma azida também pode ser usada.
[0345] CuAAC: Em algumas modalidades, o antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada por cicloadição de alquino-azida catalisada por cobre(l) (CuAAC). Em uma variação dessa modalidade, a proteína veículo acentuada compreende um nnAA contendo propargila e o antígeno compreende um grupo azido. Em uma outra variação dessa modalidade, a proteína veículo acentuada compreende um nnAA contendo azido e o antígeno compreende um grupo propargila. Condições adequadas para conjugação de CuAAC de biomoléculas são encontradas, por exemplo, Presolski et at. Curr Protoc Chem Biol. 2011; 3(4): 153 a 162, em que todas envolvem a adição de Cu2+. Em algumas modalidades, a reação é acelerada pela adição de um ligante de coordenação de Cu, como ΤΗΡΑ. Em algumas modalidades, a reação é acelerada pela adição de um agente redutor para manter o estado de oxidação de Cu2+. Agentes redutores adequados incluem ascorbato de sódio, DTT ou TCEP.
[0346] SPAAC: Em algumas modalidades, o antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada por cicloadição de azida-alquino promovida por estiramento (SPAAC). Em uma outra variação dessas modalidades, a proteína veículo acentuada compreende um nnAA contendo azido e o antígeno compreende um grupo ciclooctila. Em uma outra variação dessas modalidades, a proteína veículo acentuada compreende um nnAA contendo ciclooctila e o antígeno compreende um grupo azido. Como o SPAAC não requer catalisadores ou cofatores adicionais, essa reação tem a capacidade de ser realizada em água
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112/233 destilada, solução salina a 0,9%, PBS, ou uma solução fisiologicamente tamponada. Em uma modalidade, a proteína veículo acentuada e antígeno são combinadas a uma razão de massa de 1,20: 1 (p/p).
[0347] Em algumas modalidades, o antígeno é ligado a um nnAA contendo azido na proteína veículo acentuada através de uma estrutura de Fórmula X ou Xa:
Figure BR112019013475A2_D0023
[0348] em que:
[0349] Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo acentuada;
[0350] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo acentuada;
[0351] D é —Ar—W3— ou —W1— Y1— C(O)—Y2—W2—;
Figure BR112019013475A2_D0024
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113/233 /
Figure BR112019013475A2_D0025
[0353] cada de W1, W2 e W3 é independentemente uma ligação simples ou alquileno inferior;
[0354] cada X1 é independentemente —NH—, —O—, ou —S—;
[0355] cada Y1 é independentemente uma ligação simples, —NH— , ou —O—;
[0356] cada Y2 é independentemente uma ligação simples, —NH— , —O—, ou um pirrolidinileno ligado em N ou ligado em C;
[0357] um de Z1, Z2, e Z3 é —N— e os outros de Z1, Z2, e Z3 são independentemente —CH—;
[0358] L22 é independentemente uma ligação, alquila ou poli(alquiloxi); e [0359] X é pelo menos um poliol de um polissacarídeo.
[0360] Em algumas modalidades, o antígeno é ligado a um nnAA contendo azido na proteína veículo acentuada através de uma estrutura de Fórmula XI ou Xla:
Figure BR112019013475A2_D0026
(Fórmula XI)
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114/233
Figure BR112019013475A2_D0027
(Fórmula Xia) em que:
Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um [0361] [0362] aminoácido da proteína veículo acentuada;
[0363] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo acentuada;
[0364] WéCouN;
[0365] y é pelo menos 1;
[0366] n é pelo menos 1; e [0367] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo capsular.
[0368] O valor de ‘ri é discutido acima em relação a ‘PEGri. O valor de ‘y’ encontra-se na faixa de 1-10, em linha com a Fórmula XII, e é, de preferência, um alquileno inferior, por exemplo, um C1-C4 alquileno.
[0369] Ligação de tetrazina-alquino:
[0370] Em algumas modalidades, 0 antígeno é conjugado à proteína veículo acentuada por ligação de tetrazina-alquino. Em uma variação dessas modalidades, a proteína veículo acentuada compreende um nnAA contendo 1,2,4,5-tetrazina e 0 antígeno compreende um grupo alceno. Similarmente à reação SPAAC, a ligação tetrazina-alquino prossegue sem a adição de cofatores e essa reação tem a capacidade de ser realizada em água destilada, solução salina a 0,9%, PBS, ou uma solução fisiologicamente tamponada.
Caracterização de conjugado [0371] Métodos (exclusão de tamanho, diafiltração, diálise): Após a
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115/233 reação de conjugação, os conjugados de proteína veículo de antígeno de interesse são opcionalmente purificados de acordo com métodos incluindo, sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, interação hidrofóbica e exclusão de tamanho), exclusão de tamanho molecular (diálise, diafiltração, filtração de fluxo tangencial, filtração de profundidade), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, foco isoelétrico preparativo), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), ou SDS-PAGE (consulte, por exemplo, Protein Purification, J. C. Janson & Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova York, 1989) para obter conjugados substancialmente puros.
[0372] As proteínas conjugadas de interesse são opcionalmente quantificadas de acordo com métodos incluindo, sem limitação, eletroforese microfluídica, eletroforese em gel, Western blotting, imunoensaios (por exemplo, ELISA) e outros ensaios para avaliar a atividade da proteína conjugada.
Parâmetros físicos exemplificadores [0373] Um parâmetro importante para conjugados de antígenoproteína veículo acentuada é o peso molecular do conjugado. Uma vez que os conjugados compreendem, opcionalmente, números variáveis de moléculas de antígeno conjugadas a cada molécula proteica bem como reticulação de ordem superior variável (ligação proteína-antígenoproteína, por exemplo), o peso molecular de saída de um conjugado não é necessariamente previsível dos pesos moleculares de entrada as proteínas veículo acentuadas e antígenos acentuados. Um vasto corpo de literatura (por exemplo, Howard et al. Immunology. 1971(21): 535 a 545 e Kabat & Bezer. Arch Biochem Biophys. 1958(78) 306 a 318) sugere que o tamanho de partícula antigênica tem um efeito importante na imunogenicidade. Wessels et al. (1998) Infect Immun 66:2186-92 relata que o tamanho do conjugado e a reticulação podem influenciar a
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116/233 imunogenicidade e a eficácia protetora dos conjugados do GBS tipo III. [0374] Em termos gerais, os conjugados podem ser formados através da ligação de uma proteína veículo a um antígeno que possui um ou múltiplos manejos por antígeno. Com múltiplos manejos por antígeno, um conjugado reticulado pode ser formado, envolvendo ligações proteína-antígeno-proteína. Com um único manejo por antígeno (por exemplo, um grupo terminal em um polissacarídeo), esse tipo de rede conjugada não se forma devido ao fato de que um único antígeno não se pode ligar a múltiplas moléculas de proteína veículo. Conjugados reticulados são aqui preferenciais (particularmente para pneumococos) onde são desejados pesos moleculares mais elevados, e assim são preferenciais antígenos com múltiplos manejos.
[0375] Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de cerca de 750 kDa, cerca de 1.000 kDa, cerca de 1.500 kDa, cerca de 2.000 kDa, cerca de 2.500 kDa, cerca de 3.000 kDa, cerca de 3.500 kDa, cerca de 4.000 kDa, cerca de 4.500 kDa, cerca de 5.000 kDa, cerca de 5.500 kDa, cerca de 6.000 kDa, cerca de 6.500 kDa, cerca de 7.000 kDa, cerca de 7.500 kDa ou cerca de 8.000 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de pelo menos cerca de 750 kDa, pelo menos cerca de 1.000 kDa, ou pelo menos cerca de 1.500 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 750 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 800 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 850 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 900 kDa e cerca
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117/233 de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígenoproteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 950 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado de antígeno-proteína veículo acentuada tem um peso molecular de entre cerca de 1.000 kDa e cerca de 2.800 kDa.
[0376] Um outro importante parâmetro para as vacinas conjugadas da presente descrição é a razão entre o antígeno (por exemplo, polissacarídeo) e o veículo de polipeptideo imunogênico (por exemplo, proteínas portadoras da presente descrição). Utilizando um conjugado de polissacarídeo-proteína veículo como ilustrativo do princípio geral, a razão entre polissacarídeo e proteína (PS: PC) do conjugado purificado é geralmente expressa em termos de uma relação peso-peso (p/p). Tais razões convencionalmente são expressas para incluir qualquer polissacarídeo livre que é purificado juntamente com glicoconjugados individuais. Maiores razões PS:PC de conjugados de polissacarídeoproteína veículo permitem que mais antígeno de polissacarídeo seja entregue com uma quantidade inferior de proteína veículo acentuada. Para as vacinas conjugadas pneumocócicas, a razão encontra-se tipicamente na faixa de 0,3 a 3,0, mas isso pode variar com o sorotipo e aspectos da química de conjugação (Annex 2\ Recommendations for the production and control of pneumococcal conjugate vaccines; WHO Technical Report Series, n°927, 2005). A razão da vacina comercial Prevnar-13 é 0,9 (consulte, Prevnar 13 Package Insert, M/2016 Revision, pg. 24; www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/ vaccines/approvedproducts/ucm201669.pdf), sugerindo uma faixa preferencial de 1,0 a 3,0. Ao formular uma vacina com mais de 13 sorotipos, pode ser preferencial alcançar uma proporção de 1,5 a 3,0, e particularmente preferencial empregar uma razão de cerca de 1,5 a cerca de 2,0. Essa pode ser a razão média para todos os conjugados em uma composição, que pode ser alcançada assegurando que todos
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118/233 os conjugados individuais tenham essa relação, ou assegurando que quaisquer conjugados fora dessa faixa em um lado sejam balanceados por um conjugado fora dessa faixa, por outro lado.
[0377] Em uma outra modalidade, a razão (peso por peso ) entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada é entre 0,5 e 4,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de
1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca cerca de 3,0, cerca de 3,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9, de 3,2, cerca de 3,3, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9 ou cerca de 4,0). Em uma outra modalidade, a razão de Ps:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo é entre 0,7 e 2,8. Em uma outra modalidade, a razão de Ps:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo é entre 1,0 e 2,8. Em uma outra modalidade, a razão de PS:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo é pelo menos 0,8, pelo menos 0,9, pelo menos 1,0, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4 ou pelo menos 1,5. Em uma outra modalidade, a razão entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada é maior que 0,9 (p/p). Em uma outra modalidade, a razão entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada é entre cerca de 0,9 e cerca de 3,0 (p/p). A mistura de conjugados individuais com essas razões de PS: PC pode originar uma combinação com uma razão de PS:PC geral desejada.
[0378] Presença de contaminantes (polissacarídeo livre, C-poli): Um parâmetro importante para conjugados de polissacarídeo-proteína veículo acentuada é o nível de polissacarídeo livre que não é
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119/233 covalentemente conjugado à proteína veículo acentuada, mas está, todavia, presente no conjugado composição. Por exemplo, em certos casos, o polissacarídeo livre é não covalentemente associado a (isto é, não covalentemente ligado a, adsorvido em ou aprisionado em ou com) o conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada. Em algumas modalidades, conjugados de polissacarídeo-proteína veículo acentuada descritos no presente documento compreendem menos que cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, ou 10% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo-proteínas portadoras acentuadas descritas no presente documento compreendem menos que cerca de 10% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo-proteínas portadoras acentuadas descritas no presente documento compreendem menos que cerca de 25% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo-proteínas portadoras acentuadas descritas no presente documento compreendem menos que cerca de 30% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo-proteínas portadoras acentuadas descritas no presente documento compreendem menos que cerca de 15% de polissacarídeo livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo. Polissacarídeo livre é opcionalmente medido por meio de qualquer método adequado, incluindo o método de Lei et al. (Dev Biol (Basel). 2000;103:259 a 264), que usa um método de precipitação à base de HCI/desoxicolato para distinguir os agrupamentos de polissacarídeo. Em composições preferenciais, a quantidade de polissacarídeo bacteriano não conjugado é menor que 5%, em peso, da quantidade total de polissacarídeo bacteriano na composição. Em uma composição com múltiplos conjugados pneumocócicos, é preferencial
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120/233 que a quantidade de polissacarídeo bacteriano não conjugado para cada sorotipo é menor que 5%, em peso, da quantidade total de polissacarídeo bacteriano daquele sorotipo na composição.
[0379] Um parâmetro importante para conjugados de polissacarídeo capsular pneumocócico-proteína veículo acentuada é o nível de contaminação de C-polissacarídeo presente em preparações do conjugado. O C-polissacarídeo é um componente da parede celular imunologicamente improdutivo, mas altamente imunogênico, de S. pneumoniae, que segue adiante em muitos métodos de preparação de polissacarídeo capsular pneumocócico. Como as respostas imunes ao C-polissacarídeo geralmente não produzem anticorpos neutralizantes, a contaminação com o C-polissacarídeo pode interferir com avaliações adequadas da eficácia do conjugado de antígenoproteína veículo acentuada quando administrado a animais.
[0380] O nível de C-polissacarídeo é opcionalmente mostrado por hidrólise de ácido total de uma preparação de conjugado de polissacarídeo, cromatografia do hidrolisado e detecção condutométrica de colina. Alternativamente, o polissacarídeo não hidrolisado é analisado por RMN para colina. A técnica de RMN utiliza a razão entre o sinal de colina e o sinal de ramnose metila (para polissacarídeos capsulares contendo uma ramnose; um sinal diferente para outros polissacarídeos capsulares) para calcular o teor de C-polissacarídeo. O método cromatográfico utiliza a razão entre o sinal de colina ou o teor de polissacárido determinado pelo ensaio condutométrico ou a um dos picos do componente de polissacarídeo capsular para calcular o teor de C-polissacarídeo. Em qualquer um dos métodos, os padrões de concentrações conhecidas de colina permitem o cálculo direto do nível de colina presente em uma preparação de polissacarídeo uma vez conhecida a concentração de colina, utilizando a estrutura de repetição teórica do C-polissacarídeo [Hermans, et al., Red. Trav. Chim. Pays
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Bas, 107, 600 (1988)], a concentração de C-polissacarideo em uma preparação de polissacarídeo é conhecida.
[0381] As concentrações de polissacarídeo de amostras de conjugado de proteína veículo melhorada por polissacarídeos são opcionalmente medidas por uma variedade de técnicas, por exemplo, a concentração total de polissacarídeo é opcionalmente determinada por hidrólise total do polissacarídeo e medição da concentração de um monossacarídeo específico. Comparando a concentração de Cpolissacarídeo à concentração de polissacarídeo total, o grau de contaminação de C-polissacarídeo (p/p) é determinado. Os níveis de Cpolissacarídeo abaixo 3% (p/p) de polissacarídeo total são considerados aceitáveis. Em algumas modalidades, os níveis de C-polissacarídeo são abaixo 1 %.
[0382] Em uma modalidade, a descrição fornece um conjugado que compreende uma proteína veículo e um antígeno, em que o antígeno é ligada a um nnAA na proteína veículo. Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um epitopo de célula T de toxoide de difteria (DT), toxoide de tétano (TT), proteína D de Haemophilus influenzae (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) ou CRM197. Em uma outra modalidade, o nnAA é ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido (azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido
2-amino-3-(52-amino-3-(42-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico ou ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o nnAA não está em um epitopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o nnAA é substituído por um ou mais resíduos de lisina na proteína veículo. Em uma outra modalidade, o peso molecular
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122/233 aparente do conjugado é entre cerca de 900 kDa e cerca de 5 MDa. Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de lisina substituídos são selecionados do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 e K527, e qualquer combinação dos mesmos de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o nnAA não está em um epítopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o antígeno é ligado à proteína veículo de acordo com a Fórmula XI ou Xla:
Figure BR112019013475A2_D0028
ϊ
NH
Figure BR112019013475A2_D0029
(Fórmula XI) (Fórmula Xla) [0383] em que [0384] Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
[0385] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
[0386] WéCouN;
[0387] y é pelo menos 1;
[0388] n é pelo menos 1; e [0389] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo capsular.
[0390] Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, 0 polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, 0 polissacarídeo é um
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123/233 polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6).
[0391] Em uma modalidade, a descrição fornece um método para identificar a colocação ideal de um antígeno em uma proteína veículo para aprimorar uma resposta imune de hospedeiro, que compreende: i) introduzir em uma proteína veículo uma substituição de nnAA; ii) conjugar um polissacarídeo ao nnAA para formar um glicoconjugado; e iii) medir o peso molecular aparente do glicoconjugado. Em uma outra modalidade, a substituição de nnAA não está em um epítopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um epítopo de célula T de toxoide de difteria (DT), toxoide de tétano (TT), proteína D de Haemophilus influenzae (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) ou CRM197. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo. Em uma outra modalidade, o pelo menos um ou mais polissacarídeos são conjugados à proteína veículo de acordo com a Fórmula XI ou Xla:
Figure BR112019013475A2_D0030
(Fórmula XI)
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124/233 zZ HN'X
Í' N' J
V> 0
-W p W R1'N^YR2 H o (Fórmula Xia) [0392] em que [0393] Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
[0394] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo; e [0395] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo capsular.
[0396] Em uma outra modalidade, 0 pelo menos um ou mais aminoácidos não naturais substituídos por é pAMF. Em uma outra modalidade, a descrição fornece uma proteína veículo com colocação ideal de um antígeno identificado pelo processo de i) a iii). Em uma outra modalidade, a substituição é introduzida pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 vezes. Em uma outra modalidade, 0 polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de uma bactéria. Em uma outra modalidade, a bactéria é Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, a bactéria é Streptococcus pneumoniae. Em uma outra modalidade, polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de
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125/233 um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6).
[0397] Polipeptídeos e Polissacarídeos Modificados:
[0398] Em uma modalidade, a descrição fornece um polipeptídeo modificado que compreende pelo menos um composto, ou sal do mesmo, que compreende Fórmula XI ou Xla:
Figure BR112019013475A2_D0031
[0399] em que [0400] Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um aminoácido de uma proteína veículo;
[0401] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido de uma proteína veículo; e [0402] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo.
[0403] Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um
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126/233 epítopo de célula T de toxoide de difteria (DT), toxoide de tétano (TT), proteína D de Haemophilus (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) ou CRM197. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de uma espécie bacteriana. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20,
22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, R1 e R2 não são aminoácidos que ocorrem em um epítopo de célula T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4,
K5 e/ou K6).
[0404] Em uma modalidade, a descrição fornece um polissacarídeo modificado que compreende pelo menos um composto, ou sal do mesmo, que compreende Fórmula VII ou Vila:
[0405]
Figure BR112019013475A2_D0032
Figure BR112019013475A2_D0033
em que (Fórmula VII) (Fórmula Vila) [0406] X é independentemente pelo menos um poliol do
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127/233 polissacarídeo capsular; e [0407] n é pelo menos 1.
[0408] Em uma outra modalidade, o polissacarídeo modificado de Fórmula VII é adicionalmente conjugado a uma proteína veículo que compreende pelo menos um nnAA. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo modificado é conjugado por uma [2+3] cicloadição. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é derivado de uma espécie bacteriana. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo bacteriano capsular. Em uma outra modalidade, a razão molar entre DBCO e unidade de repetição do polissacarídeo capsular é maior que 1. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular é de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae que compreende 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6).
[0409] Em uma modalidade, a descrição fornece um polissacarídeo modificado de acordo com (A-X)z-Y
Figure BR112019013475A2_D0034
Figure BR112019013475A2_D0035
[0411] X é independentemente pelo menos um poliol;
[0412] Y é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo;
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128/233 [0413] n é pelo menos 1; e [0414] z é maior que 1.
[0415] Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é derivado de uma espécie bacteriana. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae. Em uma outra modalidade, a espécie bacteriana é Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo bacteriano capsular. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular é aquele de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, o antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6). Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é adicionalmente conjugado a uma proteína veículo. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é conjugado a uma proteína veículo via uma ligação de Fórmula II. Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um epitopo de célula T de CRM197. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é conjugado por uma [2+3] cicloadição. Em uma outra modalidade, a proteína veículo compreende um ou mais aminoácidos não naturais. Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um epitopo de célula T de toxoide de difteria (DT), toxoide de tétano (TT), proteína D de Haemophilus influenzae (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) ou CRM197. Em uma outra modalidade, a proteína veículo é adicionalmente conjugada a um antígeno. Em uma outra modalidade, a proteína veículo é conjugada a um antígeno via uma ligação de Fórmula
II. Em uma outra modalidade, uma razão (p/p) entre o polissacarídeo e
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129/233 a proteína veículo (PS:PC) é entre cerca de 1,5 e cerca de 4.
[0416] Composições de conjugados de polipeptídeo-antígeno:
[0417] São descritos no presente documento composições imunogênicas que compreendem pelo menos um conjugado acentuado de proteína veículo-antígeno junto com pelo menos um excipiente, em que o antígeno é conjugado ao polipeptideo via um resíduo de nnAA na proteína veículo acentuada. Em uma modalidade, a descrição fornece uma composição de vacina que compreende um glicoconjugado descrito no presente documento. Em algumas modalidades, a composição de vacina conjugada que compreende pelo menos um conjugado acentuado de proteína veículo-antígeno conforme descrito no presente documento elicita a supressão de veículo reduzida em um indivíduo em comparação com uma composição de vacina conjugada que compreende a proteína veículo nativa. Em algumas modalidades, a composição de vacina conjugada que compreende pelo menos um conjugado acentuado de proteína veículo-antígeno conforme descrito no presente documento aprimora a resposta imunes geral e/ou aumenta a resposta dependente de célula T em um indivíduo em comparação com uma composição de vacina conjugada que compreende a proteína veículo nativa.
[0418] Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende um conjugado de proteína veículo-antígeno único (por exemplo, um único sorotipo de pneumococo). Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende múltiplos conjugados de antígeno-proteína veículo (por exemplo, múltiplos sorotipos de pneumococo). Em modalidades adicionais, os múltiplos conjugados de antígeno-proteína veículo opcionalmente compreendem: (a) múltiplos antígenos conjugados a uma proteína veículo acentuada comum; ou (b) múltiplos antígenos conjugados a diferentes proteínas portadoras acentuadas. Em modalidades adicionais, os múltiplos
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130/233 conjugados de proteína veículo acentuada-antígeno compreendem antígenos derivados de diferentes sorotipos do mesmo organismo (por exemplo, S. pneumoniae). Quando uma composição incluir múltiplos antígenos diferentes (por exemplo, polissacarídeo capsular de múltiplos sorotipos de pneumococo, ou de múltiplos sorogrupos de meningococo), é preferencial que o mesmo tipo de proteína veículo seja usado para cada antígeno, por exemplo, cada antígeno é individualmente conjugado à mesma variante de CRM197 contendo nnAA, e os conjugados individuais de antígeno-proteína são, então, combinados para render uma composição de múltiplos antígenos.
[0419] Em algumas modalidades, a razão geral (peso por peso) entre polissacarídeos de todos os sorotipos e a proteína veículo (PS:PC) em uma composição de conjugado de polissacarídeo de sorotipo multivalente encontra-se em uma certa faixa. Em uma outra modalidade, a razão (peso por peso ) entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada (ou na composição multivalente geral) é entre 0,5 e 4,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5, cerca de 2,0, cerca de 2,5, cerca de 3,0, cerca de 0,6, cerca de 1,1, cerca de 1,6, cerca de 2,1, cerca de 2,6, cerca de 3,1, cerca de 0,7, cerca de 1,2, cerca de 1,7, cerca de 2,2, cerca de 2,7, cerca de 3,2, cerca de 0,8, cerca de 1,3, cerca de 1,8, cerca de 2,3, cerca de 2,8, cerca de 3,3, cerca de 0,9, cerca de 1,4, cerca de 1,9, cerca de 2,4, cerca de 2,9, cerca de 3,4, cerca de 3,5, cerca de 3,6, cerca de 3,7, cerca de 3,8, cerca de 3,9 ou cerca de 4,0). Em uma outra modalidade, a razão de Ps:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo (ou na composição multivalente geral) é entre 0,7 e 2,8. Em uma outra modalidade, a razão de Ps:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo (ou na composição multivalente geral) é entre 1,0 e 2,8. Em uma outra modalidade, a razão de PS:PC (p/p) no conjugado de proteína veículo (ou na composição multivalente geral) é
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131/233 pelo menos 0,8, pelo menos 0,9, pelo menos 1,0, pelo menos 1,1, pelo menos 1,2, pelo menos 1,3, pelo menos 1,4 ou pelo menos 1,5 (p/p). Em uma outra modalidade, a razão entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada (ou na composição multivalente geral) é maior que 0,9 (p/p). Em uma outra modalidade, a razão entre polissacarídeo e proteína veículo acentuada no conjugado de polissacarídeo-proteína veículo acentuada (ou na composição multivalente geral) é entre cerca de 0,9 e cerca de 3,0 (p/p). Uma composição preferencial inclui conjugados de proteína-sacarídeo de polissacarídeos capsulares de múltiplos sorotipos pneumocócicos com um excesso de massa geral entre polissacarídeo e proteína, por exemplo, uma razão entre proteína:polissacarídeo entre 1:1,1 e 1:2 (p/p), por exemplo, entre 1:1,5 e 1:1,9.
[0420] Em algumas modalidades, a faixa de peso molecular geral de conjugados de polissacarídeo-proteína veículo de todos os sorotipos em uma composição de conjugado de polissacarídeo-proteína veículo de sorotipo multivalente encontra-se em uma faixa particular. Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de cerca de 750 kDa, cerca de 1.000 kDa, cerca de 1.500 kDa, cerca de 2.000 kDa, cerca de 2.500 kDa, cerca de 3.000 kDa, cerca de 3.500 kDa, cerca de 4.000 kDa, cerca de 4.500 kDa, cerca de 5.000 kDa, cerca de 5.500 kDa, cerca de 6.000 kDa, cerca de 6.500 kDa, cerca de 7.000 kDa, cerca de 7.500 kDa ou cerca de 8.000 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígenoproteína veículo acentuada têm um peso molecular de pelo menos cerca de 750 kDa, pelo menos cerca de 1.000 kDa, ou pelo menos cerca de 1.500 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígenoproteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 750 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, os
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132/233 conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 800 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 850 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 900 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 950 kDa e cerca de 2.800 kDa. Em algumas modalidades, os conjugados de antígeno-proteína veículo acentuada têm um peso molecular de entre cerca de 1.000 kDa e cerca de 2.800 kDa.
[0421] Em modalidades adicionais, a composição imunogênica compreende pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29, ou pelo menos 30 conjugados de proteína veículoantígeno acentuados distintos.
[0422] Em qualquer composição que inclua múltiplos conjugados (por exemplo, um conjugado para cada um dos múltiplos sorotipos pneumocócicos), pode ser preferencial, em alguns casos, que a proteína veículo em cada conjugado seja idêntica. Em uma modalidade alternativa de tais composições com múltiplos conjugados, pode ser preferencial usar mais do que um veículo. Embora seja possível que cada antígeno (por exemplo, polissacarídeos capsulares de diferentes sorotipos pneumocócicos) possa ser conjugado com um veículo diferente, tipicamente havería apenas 2 a 4 (por exemplo, 2 ou 3) veículos diferentes representados entre os conjugados individuais
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133/233 nessas composições. A título de ilustração e não de limitação, em uma composição de 24 conjugados diferentes, cada conjugado que compreende um polissacarídeo capsular de um sorotipo pneumocócico diferente, alguns, mas não todos os 24 conjugados compreendem uma primeira proteína veículo (por exemplo, à base de CRM197) e o equilíbrio dos 24 conjugados compreende um segundo veículo proteico (por exemplo, à base de HiD). Assim, novamente a título de exemplo e não de limitação, 12, 13, 15 ou 20 dos 24 conjugados poderíam compreender a primeira proteína veículo, e os 12, 11, 9 ou 4, respectivamente, restantes conjugados poderíam compreender a segunda proteína veículo.
[0423] Em algumas modalidades, o pelo menos um excipiente compreende componentes adequados para administração parenteral.
[0424] Em modalidades adicionais, o pelo menos um excipiente opcionalmente compreende um tampão ou agente de ajuste de pH. Em modalidades particulares, o tampão ou agente de ajuste de pH é selecionado do grupo que consiste em borato de sódio, fosfato de sódio, citrato de sódio, sulfato de amônio ou succinato e qualquer combinação dos mesmos. Outros exemplos de tampões adequados incluem ácidos, como ácidos acético, bórico, cítrico, láctico, fosfórico e clorídrico; bases como hidróxido de sódio, acetato de sódio, lactato de sódio e trishidroximetilaminometano; e tampões como citrato/dextrose, bicarbonate de sódio e cloreto de amônio. Os tampões de histidina são também úteis em composições imunogênicas.
[0425] Em modalidades adicionais, o pelo menos um excipiente opcionalmente compreende um agente de tonicidade para colocar a osmolaridade da composição em uma faixa aceitável. Em modalidades particulares, o agente de tonicidade é selecionado do grupo que consiste em cloreto de sódio, dextrose e glicerina, e qualquer combinação dos mesmos. Outros exemplos de tampões adequados
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134/233 para administração parentérica incluem sais contendo cátions de sódio, potássio ou amônio e ânions de cloreto, citrato, ascorbato, borato, fosfato, bicarbonate, sulfato, tiossulfato ou bissulfito; sais adequados incluem cloreto de potássio, tiossulfato de sódio, bissulfito de sódio e sulfato de amônio.
[0426] Em modalidades adicionais, o pelo menos um excipiente opcionalmente compreende um agente ativo de superfície (tensoativo). Em modalidades particulares, o agente ativo de superfície é monolaurato de polioxietileno sorbitano (polissorbato 20 ou Tween 20), monooleato de polioxietileno sorbitano (polisorbato 80 ou Tween 80), Brij 35, Triton X-10, Pluronic F127 ou dodecil sulfato de sódio (SDS). Em algumas modalidades, o agente ativo de superfície está presente a uma concentração entre 0,0003% e 0,3% (p/p).
[0427] Em algumas modalidades, o pelo menos um excipiente opcionalmente compreende um adjuvante, um agente que aumenta a estimulação do sistema imunológico, melhorando a apresentação antígeno (formulação de depósito, sistemas de entrega) e/ou, fornecendo sinais de coestimulação (imunomoduladores). Em algumas variações dessa modalidade, o adjuvante é à base de sal-alumínio. Em modalidades particulares, o adjuvante fosfato de alumínio e potássio, hidroxifosfato sulfato de alumínio, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio e qualquer combinação dos mesmos. Em outras variações, o adjuvante é uma emulsão de óleo em água. Em modalidades particulares, o adjuvante é AS03, MF59, ou AF03, e qualquer combinação dos mesmos. Ainda em outras variações, o adjuvante é um agonista de TLR4. Em uma modalidade particular, o adjuvante é RC529. Adjuvantes preferenciais para uso com a invenção são sais de alumínio, como um adjuvante de fosfato de alumínio (por exemplo, um adjuvante de hidroxifosfato de alumínio). Quando uma composição incluir um adjuvante de sal de alumínio, é preferencial que a concentração de Al3+
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135/233 na composição seja <1,25 mg por dose, por exemplo, <1,25 mg por 0,5 ml e, idealmente, <0,85 mg por dose. Conjugados dentro de uma composição podem ser adsorvidos ao adjuvante de sal de alumínio. Para uma composição misturada, os conjugados podem ser adsorvidos individualmente a um sal de alumínio e depois misturados, ou podem ser adicionados a um sal de alumínio para obter adsorção sequencial, formando assim a composição misturada de conjugado.
[0428] Uma composição preferencial compreende (i) um ou mais conjugados como aqui definidos, por exemplo, polissacarídeo capsular de múltiplos sorotipos pneumocócicos conjugados a proteínas veículo contendo nnAA e (ii) um adjuvante de fosfato de alumínio.
[0429] Em uma modalidade, a descrição fornece um método para aumentar a razão entre polissacarídeo e proteína veículo (p/p) (PS:PC) de uma composição imunogênica, que compreende: (a) introduzir em uma proteína veículo uma ou mais substituições de nnAA; e (b) conjugar um polissacarídeo à proteína veículo através da uma ou mais substituições de aminoácido não natural. Em uma outra modalidade, a uma ou mais substituições compreendem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8 ou pelo menos 9 substituições. Em uma outra modalidade, as substituições de nnAA não são em um epítopo de ativação de células T da proteína veículo. Em uma outra modalidade, o nnAA é pAMF. Em uma outra modalidade, a proteína veículo retém um epítopo de célula T de toxoide de difteria (DT), toxoide de tétano (TT), proteína D de Haemophilus (PD), complexo de proteína de membrana externa de meningococo do sorogrupo B (OMPC) ou CRM197. Em uma outra modalidade, as substituições de aminoácido não natural ocorrem em resíduos de lisina. Em uma outra modalidade, os resíduos de lisina são selecionados do grupo que consiste em K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K265, K386, K523 e K527, e qualquer combinação dos
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136/233 mesmos de SEQ ID NO:1. Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é conjugado à proteína veículo via uma ligação de Fórmula XI ou Xla:
Figure BR112019013475A2_D0036
[0430] em que [0431] Ri é independentemente H, formila, ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
[0432] R2 é independentemente OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo; e [0433] X é independentemente pelo menos um poliol de um polissacarídeo capsular.
[0434] Em uma outra modalidade, a razão PS:PC é entre cerca de
1,5 e cerca de 4. Em uma outra modalidade, 0 polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de Streptococcus pneumoniae selecionado do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31, e 33F, e qualquer combinação dos mesmos. Em uma outra modalidade, 0 antígeno é um polissacarídeo capsular derivado de um dos seis sorotipos de Porphyromonas gingivalis (por exemplo, K1, K2,
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K3, Κ4, Κ5 e/ou Κ6). Em uma outra modalidade, o polissacarídeo é um polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes ou Streptococcus agalactiae. Em uma outra modalidade, a descrição fornece uma glicoproteína preparada por um processo que compreende as etapas (a) a (b).
10. Respostas imunes crescentes [0435] São fornecidos no presente documento um método de elicitação de uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno em um indivíduo por meio da administração ao indivíduo de um conjugado ou composição conforme descrito no presente documento. O conjugado ou composição tipicamente será combinado com um excipiente adequado para administração parenteral.
[0436] Também são fornecidos os conjugados e composições para uso na elicitação de uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno. Também são fornecidos o uso de conjugados e composições para a fabricação de um medicamento para elicitar uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno.
[0437] A resposta de anticorpo imunoprotetor significa que o conjugado e as composições podem ser usados, por exemplo, para fornecer imunização ativa para a prevenção de doença invasiva causada por S. pneumoniae, para a prevenção de otite média causada por S. pneumoniae, para a prevenção de pneumonia causada por S. pneumoniae, para a imunização ativa de indivíduos em risco de exposição a N. meningitidis para prevenir doenças invasivas, etc.
[0438] A invenção é ilustrada nos exemplos a seguir. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não se destinam à limitação. Diversas variações, mudanças e substituições ocorrerão àqueles versados na técnica sem se afastar da invenção. Os exemplos são realizados com o uso de técnicas bem conhecidas e de rotina para
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138/233 os versados na técnica, exceto quando descrito em detalhe em contrário.
EXEMPLOS [0439] Exemplo 1: Síntese de partes de eCRM de sítio único K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG e K103TAG [0440] O eCRM foi expresso em um extrato de síntese de proteína livre de células (CFPS) fornecido por Sutro Biopharma, Inc. (Sul de São Francisco, Califórnia, EUA). Os recursos e preparação de tal extrato são descritas em outras publicações; nesse caso, o extrato foi geralmente preparado como descrito em Zawada et al., 2011, Biotechnol. Bioeng., 108(7), 1.570 a 1.578 com as seguintes modificações em relação ao documento US2016/0257946: (1) o extrato livre de células foi preparado a partir de uma cepa atenuada RF-1 sensível a OmpT manipulada para superexpressar DsbC de E. coli; (2) o extrato livre de células foi preparado a partir de uma cepa de E. coli atenuada por RF-1 semelhante manipulada para produzir um tRNA codificando CUA ortogonal para inserção de um aminoácido não natural em um códon de parada âmbar; (3) os extratos livres de células de (1) e (2) foram misturados (na razão de 85:15) e tratados com iodoacetamida 50 μΜ por 30 min à temperatura ambiente (20 °); e (4) os extratos misturados foram adicionados a uma pré-mistura contendo todos os outros componentes de um sistema de síntese de proteína livre de células, exceto para o DNA que codifica eCRM. A concentração final na reação de síntese de proteína livre de célula foi de 30% (em volume) de extrato celular, para-metilazido-L-fenilalanina 2 mM (pAMF) (RSP Amino Acids, Shirley, Mass.), tRNA sintetase específica de pAMF 5μΜ (‘RS’), GSSG 2 mM (glutationa oxidada), glutamato de magnésio 8 mM, glutamato de amônio 10 mM, glutamato de potássio 130 mM, de piruvato de sódio 35 mM, AMP 1,2 mM, GMP, UMP e CMP 0,86 mM cada, aminoácidos 2
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139/233 mM (excepto tirosina e fenilalanina 0,5 mM), oxalato de sódio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potássio 15 mM, RNAP T7 100 nM e plasmídeo eCRM 2,5μΜ codificando as variantes de nnAA. As reações de síntese livres de células foram iniciadas pela adição do DNA plasmidial que codifica eCRM.
[0441] As reações foram incubadas 14h em um agitador a 650 rpm em placas de Flower de 48 poços (m2p-labs n°MTP-48-B). Após o período de incubação, a reação foi mantida a 4 Ό até ser processada para purificação ou análise. Após a reação de síntese proteica livre de células, a mistura contendo pAMF-eCRM foi transferida para uma placa de 96 poços (DyNa Block™, 2 ml; Labnet, Edison, N.J.) e centrifugada a õ.OOOxg por 15 minutos a 40 Ό.
[0442] Primeiro, um experimento de otimização foi realizado para avaliar a melhor temperatura e aditivos para a produção CFPS de eCRM. As reações de CFPS foram realizadas a 30, 25 e 20 graus Celsius, com suplementação adicional de tRNA codificador de CUA (0,
1,2, 4, 8, 12% em v/v) e mistura de nnAA/sintetase (50, 100, 150, 200 pg/ml) em cada uma das três temperaturas. Amostras da mistura de CFPS pré e pós-centrifugação foram coletadas e analisadas por eletroforese SDS-PAGE, e as bandas foram quantificadas por densitometria para avaliar a quantidade de proteína solúvel (amostra pós-centrifugação) de proteína total (amostra de pré-centrifugação) produzida em cada condição.
[0443] A Figura 1 mostra o rendimento de nnAA-eCRM produzido em cada condição, conforme avaliado por densitometria quantitativa. Enquanto as reações de CFPS a 30 graus produziram uma fração relativamente pequena de proteína solúvel (max ~ 0,33 do total entre todas as condições), o rendimento de proteína solúvel foi aumentado (> ~ 0,40 solúvel/total entre todas as condições) a 25 graus e aumentado ainda mais ( > ~ 0,60 solúvel/total entre todas as condições) a 20 graus.
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Em ambas as condições de baixa temperatura, o rendimento de proteína solúvel é aumentado ainda mais pelo aumento da concentração de tRNA (1 -12x mostra rendimento crescente), enquanto o aumento da concentração de nnAA/sintetase teve um efeito negativo ou insignificante no rendimento solúvel.
[0444] Com base na experiência da Figura 1, temperaturas inferiores a 20 graus e concentração de tRNA de pelo menos 20 μΜ foram escolhidas para a síntese de variantes K11TAG, K25TAG, K34TAG, K38TAG, K40TAG, K52TAG, K60TAG, K77TAG, K83TAG, K91TAG, K96TAG e K103TAG.
[0445] As reações de CFPS foram realizadas conforme descrito acima. Por conveniência de purificação nessas experiências preliminares, uma etiqueta de histidina (GSGHHHHHH; SEQ ID NO: 10) foi fundida com o C-terminal da sequência de proteína veículo através do vetor de expressão e a purificação das variantes de eCRM do sobrenadante pós-centrifugação foi realizada com o uso de Phytips IMAC (Phynexus, San Jose, Califórnia) contendo 40 μΙ de resina. O leito de resina foi pré-equilibrado em tampão de equilíbrio IMAC (1x PBS e imidazol 10 mM) e o sobrenadante clarificado foi pipetado para cima e para baixo 10 vezes através de Phytips IMAC equilibrado a uma taxa de fluxo de 4,2 μΙ/min. A proteína ligada foi lavada com tampão de equilíbrio IMAC e, então, eluída com 125 μΙ_ de tampão de eluição IMAC (1 x PBS e imidazol 0,5 Μ). A etiqueta de histidina não é essencial e é omitida para purificação em larga escala.
[0446] A incorporação e reatividade de nnAA foi avaliada por SDSPAGE e análise por fluorescência após a reação com DBCOfluorescência (Figura 2). eCRM 2-12 μΜ foi incubado com DBCOfluoresceína 50 μΜ durante 16 horas, submetido a SDS-PAGE não redutor e visualizado com azul de coomassie (luz visível) e um conjunto de filtros Sypro-ruby (fluorescente, fluoresceína). A Figura 2 mostra as
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141/233 imagens correspondentes de gel de coomassie (esquerda) e fluorescente (direita) mostrando a capacidade do pAMF incorporado a eCRM para reagir com DBCO. As substituições âmbar K25, K34, K38 e K40 apresentam alta expressão e eficiência de conjugação, enquanto outras não.
Exemplo 2: Modelo de múltiplos nnAA eCRM [0447] Diversas variantes de eCRM nnAA foram selecionadas conforme descrito na descrição detalhada acima. As variantes foram sintetizadas via CFPS e testadas ao longo das linhas do Exemplo 1.
Tabela 2: Múltiplas variantes de nnAA eCRM
n° de Variante K25 K34 K38 K40 K213 K215 K228 K245 K265 K386 K52 3 K52 7
1 V V V V V V
2 V V V V V V
3 V V V V V V
4 V V V V V V
5 V V V V V V
6 V V V V V V
7 V V V V V V
8 V V V V V V
9 V V V V V V
10 V V V V V V
11 V V V V V V
12 V V V V V V
13 V V V V V V
14 V V V V V V
15 V V V V V V
16 V V V V V V
17 V V V V V V
18 V V V V V V
19 V V V V V V
20 V V V V V V
21 V V V V V V
22 V V V V V V
23 V V V V V V
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n° de Variante K25 K34 K38 K40 K213 K215 K228 K245 K265 K386 K52 3 K52 7
24 V V V V V V
25 V V V V V
26 V V V V V V
27 V V V V V V
28 V V V V V V
29 V V V V V V
30 V V V V V V
31 V V V V V V
32 V V V V V V
0448] Outras variantes incluindo diferentes números de substituições Lys —> pAMF foram preparadas. Em geral, verificou-se que números mais elevados de substituições renderam veículos que levaram a conjugados de maior MW (por exemplo, para o sorotipo 14, subindo de 998 kDa com 2 substituições para 1.238 kDa com 3 substituições, para 1.789 kDa com 4 substituições e para 2.547 kDa com 5 substituições) mas os veículos apresentaram menor solubilidade. Veículos com seis resíduos de pAMF geralmente forneceram boa solubilidade (»50 mg/ml) e imunogenicidade. A alta solubilidade foi surpreendente devido ao fato de que a substituição de resíduos de Lys carregados na sequência nativa com resíduos de pAMF hidrofóbicos aumentou a hidrofobicidade de CRM197, que é uma proteína cuja hidrofobicidade já foi relatada como afetando sua solubilidade (Orr et al. 1999 Infect Immun 67:4290-4). Assim, esses resultados mostram que é possível manter os mesmos sítios de ligação que foram utilizados em conjugados conhecidos de CRM197 (a saber, resíduos de Lys) sem ocasionar insolubilidade quando os resíduos carregados são perdidos. [0449] Estudos de CRM197 identificaram epítopos de célula T em resíduos P272-D291, V322-G384, e Q412-I458 de SEQ ID NO:1. Essas regiões de epitopo incluem os resíduos de Lys K420, K441, K446, K448 e K457, de modo que a substituição desses resíduos de lisina possa
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143/233 interromper epitopo de células T que sustentam a atividade de CRM197. Os resíduos de Lys preferenciais para substituição por um nnAA na SEQ ID NO: 1 são, dessa forma, K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 e K527, conforme mostrado na Tabela 2 acima.
[0450] É desejável que os polissacarídeos conjugados não sejam localizados com muita força em uma área da superfície de CRM197. Assim, dentro de resíduos espaçados de perto, é preferencial escolher (i) apenas um de K25, K34, K38 e K40 e (ii) K213 ou K215. Além disso, indo além de sua estrutura primária, estudos da estrutura 3D do CRM197 identificam duas regiões gerais (a primeira correndo para Asn374 e a segunda correndo de Ser-375), então também é preferencial escolher os resíduos em ambas as regiões, por exemplo, para 6 substituições, escolher 3 em cada região. Essa orientação geral permite que os polissacarídeos sejam espacialmente separados quando conectados ao veículo de CRM197.
[0451] Uma sequência que tem sido particularmente útil na criação de conjugados pneumocócicos é a variante 12 na Tabela 2, na qual K34, K213, K245, K265, K386 e K527 são substituídos por um nnAA. Essa proteína tem sequência de aminoácidos SEQ ID NO:9, em que cada X é pAMF (um nnAA preferencial). Essa proteína é usada para preparar os conjugados descritos abaixo.
[0452] Os resíduos de lisina são úteis devido ao fato de que são os aminoácidos que foram usados em conjugados conhecidos de CRM197, de modo que os nnAAs nessas posições permitem que ocorra conjugação nos mesmos sítios que já são conhecidos como sendo compatíveis com CRM197. Conforme mencionado acima, no entanto, a perda de lisina carregada pode levar a mudanças estruturais, hidrofobicidade aumentada e menor solubilidade. A modificação de resíduos de fenilalanina em nnAAs à base de fenilalanina (como paraPetição 870190060378, de 28/06/2019, pág. 186/305
144/233 azido-Phe, para-azido-metil-Phe, para-fluoro-Phe, para-acetil-Phe ou para-benzoil-Phe) reduziría o risco dessas alterações. Dessa forma, os resíduos F13, F54, F124, F128, F141, F168, F251, F390, F531 ou F532 também são selecionados para substituição, sozinhos e em combinação. A substituição de até cinco resíduos de Phe pelo pAMF foi testada e forneceu conjugados solúveis, mas com uma tendência para conjugados de menor MW do que aquele conseguido com o mesmo número de múltiplas substituições de Lys.
[0453] Em vez de substituir aminoácidos no CRM197, também é possível inserir nnAA na sequência de CRM197. Por exemplo, um códon TAG que codifica pAMF é inserido diretamente a jusante de resíduos de lisina K34, K213, K245, K265, K386 e K527, individualmente (para criar inserções de seis pontos) ou em combinação (inserindo 2, 3, 4, 5 ou 6 nnAA). Veículos com nnAA inseridos, como esses, são úteis para preparar os conjugados e composições multivalentes conforme descrito acima.
[0454] Exemplo 3: Identificação de epítopos de célula T em Pfs25 [0455] Os epítopos de ativação de células T da proteína de superfície específica Pfs25 da malária são determinados experimentalmente ao longo das linhas dos métodos descritos em, por exemplo, Diethelm-Okita et al., J Infect D is. fevde 1997 Feb;175(2):382 a 391. Resumidamente, são sintetizados fragmentos peptídicos de 20 aminoácidos e sobrepostos por 5 aminoácidos correspondendo à sequência completa expressa de Pfs25. Linfócitos de sangue periférico humano depletado em CD8+ e rico em CD4+ (PBL) são obtidos de múltiplos indivíduos. Os PBL são plaqueados em triplicado e cultivados com os peptídeos sintéticos individuais que abrangem a sequência Pfs25 e servem como estímulos experimentais. A proliferação de PBLs em resposta a cada fragmento peptídico é medida pulsando as culturas com [3H]-timidina e comparando culturas provenientes de diferentes
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145/233 indivíduos. Os fragmentos de Pfs25 que estimulam a proliferação são identificados como compreendendo um epitopo de célula T. Os fragmentos que estimulam a proliferação de PBLs de uma pluralidade ou de todos os indivíduos são classificados como compreendendo um epitopo de célula T universal ou imunodominante em Pfs25.
[0456] Exemplo 4: Protocolo geral para ativação de polissacarídeo com meta-periodato de sódio [0457] Polissacarídeos sorotipo (~ 30 pmol) foram dissolvidos em solução aquosa (HCI 10 mM). A solução foi, então, aquecida a 45 O durante 30 min e depois resfriada, quando foi adicionada solução de NaOH para ajustar o pH a 6,70. A mistura de reação foi dialisada com o uso de ultra-centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa) contra água grau de HPLC. O sobrenadante foi transferido para 50 ml de um tubo Falcon, tampão de acetato (pH 5,35) foi adicionada a 25 mM, e 0,5 eq de NalÜ4 foi adicionado. A mistura foi agitada a 25 O duran te 17 horas, após isso, a amostra oxidada foi opcional mente tratada com um excesso de boroidreto de sódio (10 eq) e purificada usando ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa) contra várias mudanças de água grau HPLC para render solução de polissacarídeo oxidado.
[0458] Exemplo 5: Procedimento geral para derivatização de polissacarídeo oxidado com periodato com DBCO [0459] Polissacarídeo oxidado (~ 30 pmol) foi combinado com DBCO-PEG4- NH2 (~ 30 pmol) ou DBCO-NH2 (~ 30 μιτιοΙ) em fosfato de sódio 72 mM pH 6,79 contendo DMSO a 16% 3 25 0. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min, depois disso, foi adicionada solução de cianoboroidreto de sódio (solução a 16 mg/ml em água; 59,54 mmol, 20 equivalentes) e mantida sob agitação de um dia para 0 outro durante 2 dias 3 25 0. A mistura de reação foi, então, lavada 3x com acetato de etila, transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa) e depois dialisada com 0 uso de 6 trocas de
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146/233 etanol a 20% em água, seguido por 3 trocas com água para render uma solução do tipo polissacarídeo. O derivado de DBCO-polissacarídeo foi, então, formulado com 10:1 (em p/p) de sacarose e liofilizado para render um pó branco para utilização na próxima reação de conjugação.
[0460] Exemplo 6. Protocolo geral para ativação de polissacarídeos com CDAP [0461] O polissacarídeo capsular (30 mg) (OS 3) foi dissolvido em solução aquosa (13,5 ml de H2O com 1,5 ml de ácido acético 2M). A mistura foi adicionada a 85 O durante 1 hora e foi adicionado um excesso de cloreto de magnésio a partir de uma solução 1M após resfriamento até à temperatura ambiente. O polissacarídeo resultante foi purificado com 0 uso de diálise centrífuga de MWCO 30 kDa Amicon usando 6 trocas de água.
[0462] O polissacarídeo preparado foi, então, dissolvido em pH 7,0 e adicionou-se água e reagente de cianilação CDAP (tetrafluoroborato de 1 -ciano-4-dimetilaminopiridínio, em acetonitrila). A solução foi, então, ajustada a pH 9,5 ou foi adicionada trimetilamina (2,5 eq). DBCO-PEG4NH2 ou DBCO-NH2 foi, então, adicionado à solução. A solução foi ajustada para DMSO a 5% e agitada de um dia para 0 outro a 25 Ό. A solução foi lavada 3x com 20 ml de acetato de etila e purificada com 0 uso de unidades de diálise MWCO 30 kDa Amicon com 0 uso de 7 trocas com DMSO a 3%, etanol a 20%, cloreto de sódio a 0,9% e 3 trocas com água. O derivado de polissacarídeo-DBCO foi, então, formulado a 10:1 (em p/p) com sacarose e liofilizado.
[0463] Exemplo 7: Procedimento Geral para Conjugação de polissacarídeo-DBCO com eCRM [0464] A amostra de polissacarídeo-DBCO liofilizada e formulada com 10:1 em p/p de sacarose (preparada pelo procedimento dos Exemplos 4 ou 5) foi dissolvida em NaCI a 0,9% e misturada com eCRM em solução para fornecer uma razão de massa de entrada de PS:eCRM
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147/233 de 1:1 (em p/p). A mistura de reação foi suavemente misturada à mão antes de se misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas. A reação click foi bruscamente arrefecida pela adição de um excesso de solução de azida sódica. A mistura de PS-eCRM conjugada foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, Cat. n°G 235060, MWCO 300K) e depois dialisada contra 5 trocas de solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas. A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render uma solução de conjugado PS-eCRM.
[0465] Exemplo 8. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do Sorotipo 1 PS a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0466] Pureza do tipo 1 PS: 80% (urônico) [0467] Peso mol.: 625 g mol’1 (por unidade de repetição)
Procedimento de reação:
[0468] O polissacarídeo nativo (19,7 mg, corrigido para 80%, 15,8 mg, 25,2 pmoles) foi dissolvido em 9,85 ml de solução aquosa (7,0 ml de água e 2,85 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,5). A essa solução foram adicionados 300 pi de solução de periodato de sódio (104 pg, 3,78 pmoles, 0,15 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, depois disso, foi adicionado um grande excesso molar de boroidreto de sódio (10 equiv. mol.). O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 30 kDa Amicon com o uso de pelo menos 6 trocas com água para render a solução PS-1 purificada.
Eq molar de NalÜ4 PS 1 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio urônico (M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,15 19,7 2,86 11040 1,4 n/d 100 N/D
[0469] 2. Derivatização de DBCO
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148/233 [0470] Procedimento de reação:
[0471] PS1-OX (15,8 mg, 25,2 pmoles) foi dissolvido em tampão de fosfato (3,6 ml, 50 mM pH 7,0) ao qual foi adicionado DBCO-PEG4-NHS éster (1,0 eq., 649,1 g mol’1 em DMSO, 0,35 ml). A mistura de reação foi agitada a 37 O durante dois dias em um banho de água termostatizado seguido por extração com acetato de etila (3 x 20 ml).O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga (MWCO 30 kDa Amicon) com 0 uso de 6 trocas com etanol 20% em água, seguido de três trocas com água (12 ml cada) para render 0 tipo do derivado 1-DBCO. A essa solução (2,20 ml, 9,59 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (96 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 3,18 mg de 1 DBCO e 32 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 1 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio urônico (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
15,8 2,20 6976 0,280 x 4 116,16 1,67 65 602
[0472] 3. Conjugação do derivado PS 1-DBCO com eCRM [0473] PS 1-DBCO: 3,18 mg (com 32 mg de sacarose) de pó liofilizado [0474] % de DBCO: 1,67% [0475] Concentração de CRM: 6,5 mg/ml de solução [0476] PS: CRM (razão de entrada): 1:1 [0477] Procedimento de reação:
[0478] Dissolveu-se 1-DBCO em solução de eCRM funcionalizado com azido (0,51 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS1 :CRM de 1:1 (em p/p). Diluição adicional com solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,22 pm filtrada) foi necessária para 1,0 mg ml·1 para
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149/233 mitigar a formação de gel. A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 18 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 1-CRM.
PS 1- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS: CRM CJD* PS livre (%) SEC- MALS MDa
3,18 3,315 7,17 0,177 40 0,099 21 1,79: 1 9,39 2,13
0479] CJD = conjugado dialisado [0480] Exemplo 9. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do Sorotipo 2 PS a um eCRM da Tabela 2
Oxidação [0481] Pureza do tipo 2 PS: 80% [0482] Peso Mol.: 960,84 g mol·1
Procedimento de reação:
[0483] O polissacarídeo nativo (25,5 mg, 26,5 pmol) foi dissolvido em 12,75 ml de solução aquosa (9,24 ml de água e 3,51 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,5). A essa solução foram adicionados 216 μΙ de solução de periodato de sódio (5,26 mg/ml, 0,20 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas com monitorização por absorção de UV a 222 nm para NalO4. O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 100 kDa Amicon com o uso de pelo menos 6 trocas com água para render solução purificada de PS-2.
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150/233
Equiv. molar de NalO4 PS 2 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,20 25,5 2,28 9041 22,8 5,4 78 N/D
[0484] 2. Derivatização de DBCO [0485] Procedimento de reação:
[0486] PS2-OX (18,1 mg, 18,8 pmoles) em 2,14 ml de água foi diluído com tampão de fosfato (1,95 ml, 200 mM pH 6,0) ao qual foi adicionado DBCO-PEG4-NH2 (9,85 mg, 1 eq., em DMSO, 0,197 ml). Após 25 minutos, adicionou-se NaCNBHs foi adicionado (2,36 mg, 2 eq. 59 μΙ de uma solução em H2O). A mistura de reação foi agitada a 25 Ό durante dois dias em um banho de água termostatizado, seguido pela adição de tampão de fosfato (0,5 ml de 200 mM, pH = 6). A isso foi adicionado NaBHU (60 μΙ de uma solução aquosa a 10 mg/ml, 1 eq.). Após agitação durante 30 min, a mistura foi extraída com acetato de etila (4 x 5 ml). O acetato de etila residual foi removido fazendo borbulhar com nitrogênio gasoso e a mistura foi transferida para filtros de centrífuga Amicon MWCO 100 kDa. O derivado de DBCO foi purificado por diálise centrífuga com 0 uso de 1 troca de água seguida de 6 trocas com etanol a 20% em água, seguido por 3 trocas com água (12 ml cada) para render 0 tipo do derivado 2-DBCO. A essa solução (2,14 ml, 14,3 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (100 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções quase iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco (4,96 mg, 4,96 mg e 4,4 mg).
PS 2 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
18,1 2,14 1956 0,848 x 4 315,5 4,03 89 375
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151/233 [0487] 3. Conjugação do derivado de PS 2-DBCO com eCRM [0488] PS 2-DBCO: 4,4 mg (com 32 mg de sacarose) de pó liofilizado [0489] % de DBCO: 4,03% [0490] Concentração de CRM: solução de 3,18 mg/ml [0491] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0492] Procedimento de reação:
[0493] Dissolveu-se PS2-DBCO em NaCI a 0,9% (3,01 ml) e adicionou-se DMSO (0,44 ml). Depois adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,95 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS2:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 18 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 100 μΙ). O conjugado CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (5 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 2-CRM.
PS 2- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS: CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
4,4 2,93 4,77 0,683 91 0,387 75 1,76: 1 LLOQ 1,37
[0494] Exemplo 10. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do
Sorotipo 3 PS a um eCRM da Tabela 2
1. Hidrólise [0495] Pureza do PS tipo 3: 86% (antrona) [0496] Peso Mol.: 360,3 g mol’1
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152/233 [0497] Procedimento de reação:
[0498] O polissacarídeo nativo 3 (30,0 mg) foi dissolvido em 15,0 ml de solução aquosa (13,5 ml de água e 1,5 ml de ácido acético, 2 Μ). A mistura foi aquecida a 85 Ό durante 1 hora, depois disso, foi adicionada uma solução de cloreto de magnésio (1,5 ml, 1 M) após resfriamento para a temperatura ambiente. O PS hidrolisado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 30 kDa Amicon com o uso de pelo menos 6 trocas com água para render uma solução purificada de PS-3 que foi depois liofilizada em duas alíquotas iguais.
PS 3 (mg) Água (ml) AcOH, 2M (ml) Ensaio de antrona (μ M) Rendimento PS (%) MALS (kDa)
30,0 13,5 1,50 10477,22 85 294
[0499] 2. Derivatização de DBCO [0500] Procedimento de reação:
[0501] PS3 hidrolisado (12,75 mg, 35,4 pmoles) foi dissolvido em água (6,4 ml) ajustado para pH 7,0 com solução de hidróxido de sódio (0,2 M, 100 μΙ). O reagente de cianilação, CDAP, foi, então, adicionado por gotejamento (0,426M em acetonitrila, 0,2 eq., 16,7 μΙ). Após 90 s, a solução foi rapidamente ajustada para pH 9,5 com solução de hidróxido de sódio (0,2 M, 300 μΙ). DBCO PEG4-NH2 (0,032 M em DMSO, 0,1 eq., 523 g mol’1, 0,110 ml) foi adicionado imediatamente, por gotejamento. DMSO adicional foi adicionado para render 5% (em v/v) de DMSO (0,320 ml). A mistura de reação foi agitada a 25 O de um dia para 0 outro em um banho de água termostatizado seguido por filtração através de um filtro de seringa PES de 0,22 μΜ. O filtrado foi extraído com acetato de etila (3 x 20 ml). O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga (MWCO 30 kDa Amicon) com 0 uso de um total de 7 trocas com DMSO a 3%, etanol a 20% em água, cloreto de sódio a 0,9% seguido de 3 trocas com água (12 ml cada) para render 0 tipo do derivado 3-DBCO. A solução aquosa foi, então, filtrada através
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153/233 de um filtro de seringa PVDF de 0,45 pm. A essa solução (3,84 ml, 8,52 mg) foi adicionado um excesso de massa de 10 vezes de sacarose (85 mg em 0,85 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções que foram liofilizadas para render três amostras de pó branco. Duas amostras continham 5,0 mg de 3-DBCO e 50 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação, com 8,5 mg na amostra restante, para um total de três.
PS3 hidrolisado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
12,8 4,04 2063,47 1,095x3 102,64 5,0 70 409
[0502] 3. Conjugação do derivado PS 3-DBCO com eCRM [0503] OS 3-DBCO: 5,0 mg (com 50 mg de sacarose) de pó liofilizado [0504] % de DBCO: 5,0% [0505] Concentração de CRM: 4,0 mg/ml de solução [0506] PS: CRM (razão de entrada): 1:1 [0507] Procedimento de reação:
[0508] O 3-DBCO foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (6,39 ml, filtrado a 0,22 pm), tampão de fosfato (pH 7,0, 0,5 M, 0,333 ml) e DMSO (0,833 ml). Adicionou-se por gotejamento solução de eCRM funcionalizado com azido (0,770 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS3:CRM de 1:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 18 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 pl). O conjugado de CRM foi transferido para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, 300 K MWCO) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48
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154/233 horas (4 trocas, 1 I cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 3-CRM.
PS 3- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS: CRM CJF* PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,0 5,0 3,63 0,402 70 0,423 74 0,95: 1 2,55 3,2
0509] CJF = conjugado dialisado e filtrado [0510] Exemplo 11: Preparação de Conjugados Pneumocócicos do Sorotipo 3 PS para um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0511] Pureza do tipo 3 PS: 86% (antrona) [0512] Peso Mol.: 360,3 g mol·1 [0513] Procedimento de reação:
[0514] O polissacarídeo nativo 3 (14,4 mg, corrigido para 86%, 12,4 mg, 34,4 pmoles) foi dissolvido em 7,2 ml de solução aquosa (5,9 ml de água e 1,3 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,5). A essa solução foram adicionados 300 μΙ de solução de periodato de sódio (1,10 mg, 5,16 pmoles, 0,15 eq.). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas. O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 30 kDa Amicon com o uso de pelo menos 6 trocas com água para render solução purificada de PS3-OX.
Equiv. molar de NalO4 PS 3 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,15 14,4 1,84 15940,33 3,9 0,8 73
[0515] 2. Derivatização de DBCO [0516] Procedimento de reação:
[0517] PS3-OX (9,05 mg, 25,1 pmoles) foi dissolvido em tampão de
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155/233 fosfato (2,11 ml, 50 mM, pH 6,7) ao qual foi adicionado DBCO-PEG4NH2 (1,0 eq., 523 g mol’1 em DMSO, 0,40 ml). A mistura de reação foi agitada a 25 Ό durante 25 minutos, antes da adição de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2 eq., 44,5 mg/ml, 35 μΙ) e agitou-se durante dois dias. Nesse instante, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml). O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga (MWCO 30 kDa Amicon) com o uso de 6 trocas com etanol a 20% em água, seguido de três trocas com água (12 ml cada) para render o tipo do derivado de 3-DBCO. A essa solução (3,20 ml, 8,60 mg) adicionou-se um excesso de massa de 10 vezes de sacarose (86 mg em 0,86 ml de água). A solução combinada foi dividida em quatro porções e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Três amostras continham 2,0 mg de 3-DBCO e 20 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação, com 2,6 mg na amostra restante, para um total de quatro.
PS 3 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
15,8 2,76 2681,28 0,683 x 3 64,47 2,3 95 304
[0518] 3. Conjugação do derivado PS 3-DBCO com eCRM [0519] PS 3-DBCO: 2,0 mg (com 20 mg de sacarose) de pó liofilizado [0520] % de DBCO: 2,3% [0521] Concentração de CRM: 4,0 mg/ml de solução [0522] PS: CRM (razão de entrada): 1:1 [0523] Procedimento de reação:
[0524] 3-DBCO foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,400 ml, 0,22 μιτι filtrado) e DMSO (0,100 ml). Adicionou-se por gotejamento solução de eCRM funcionalizado com azido (0,330 ml)
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156/233 para fornecer uma razão em massa de entrada de PS3:CRM de 1:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 48 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). O conjugado CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (4 trocas, 1 I cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 3-CRM.
PS 3- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJF relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
2.0 2.0 3,63 0,226 41 0,307 59 0,74: 1 21,0 3,42
[0525] Exemplo 12. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do Sorotipo 4 PS a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0526] Pureza do tipo 4 PS: 80% (Antrona) [0527] Peso Mol.: 825,78 [0528] Procedimento de reação:
[0529] Dissolveu-se pó de PS tipo 4 (27,5 mg, 33,30 pmoles) em
13,75 ml de solução aquosa (12,38 ml de água e 1,37 ml de HCI 0,1 M). A solução foi, então, aquecida a 45 Ό durante 30 min e, então, resfriada, em que uma solução de NaOH (0,1 M, 1,37 ml) foi adicionada para ajustar o pH a 6,70. A mistura de reação foi dialisada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) em 3 trocas com água grau de pureza para HPLC (12 ml cada). O sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon de 50 ml com 9,84 ml de água. A essa solução foi adicionado 3,43 ml de tampão de acetato 200 mM (pH 5,35)
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157/233 e 632 μΙ de solução de NalO4 (3,56 mg, 16,65 pmol, 0,5 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 17 horas e, depois diss o, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultracentrifugadora AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render solução de PS-4 oxidado.
Equiv. molar de NalO4 mg de PS 4 Vol. após purificação ml Antrona uM % de oxidação (BCA) % de oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,5 27,5 2,71 12078 10,8 2,58 101
[0530] 2. Derivatização de DBCO [0531] Procedimento de reação:
[0532] A uma solução de PS tipo 4 oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) (24,58 mg, 29,77 pmol, 2,4 ml de água) foi adicionada solução tampão (1,8 ml de 200 mM de tampão de fosfato, pH = 6,79), DMSO (0,6 ml) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (15 mg em 200 μΙ de DMSO; 28,65 pmoles, 9,6 equivalentes) tudo a 25 Ό. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e , depois disso, 224 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (5,0 mg em 300 μΙ de água; 59,54 mol, 20 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 2 dias a 25 O. A mistura de reação foi dil uída com tampão de fosfato (500 ml de solução 200 mM, pH = 6) antes de adicionar 225 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada com o uso de 6 trocas com etanol a 20% em água seguida por 3 trocas com água (12 ml cada) para render uma solução do tipo 4 derivado DBCO. A essa solução (4,75 ml, 15,25 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (153 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções e cada uma foi liofilizada para render três
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158/233 amostras de pó branco. Duas amostras continham 5,35 mg de 4 DBCO e 54 mg de sacarose e uma amostra continha 4,55 mg de 4 DBCO e 45 mg de sacarose para utilização na próxima reação de conjugação.
mg de PS 4 oxidado Vol. após purificação ml Antrona uM Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO uM % DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
24,58 5,25 3897 0,472x3 137,16 3,52 69 343
3. Conjugação do derivado PS 4-DBCO com eCRM [0533] PS 4-DBCO: 5,35 mg (com 54 mg de sacarose) de pó branco [0534] % de DBCO: 3,52% [0535] Concentração de CRM: 4 mg/ml de solução [0536] PS: CRM (razão de entrada): 1,20:1 [0537] Procedimento de reação:
[0538] A amostra do DBCO tipo 4 (5,35 mg de pó branco com 54 mg de sacarose) foi dissolvida em 0,67 ml de solução de NaCI a 0,9% e depois foi adicionada solução de eCRM funcionalizado com azido (0,74 ml). Após 10 min, foi adicionada outra porção de eCRM funcionalizado com azido (0,37 ml) fornecendo uma razão em massa de PS4:CRM de 1,20:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 2 dias. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat.G235060, 300 K MWCO) e depois dialisadas com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (5 trocas, 800 ml cada).A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render uma solução de conjugado PS-CRM Tipo 4.
PS 4- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJD relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,35 4,46 5,31 0,595 65 0,360 45 1,65: 1 23,63 4,55
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Exemplo 13. Preparação de Conjugados Pneumocócicos de Sorotipo 5 PS a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0539] Pureza do tipo 5 PS: 89% (Ácido Urônico) [0540] Peso Mol.:919,32 [0541] Procedimento de reação:
[0542] PS Tipo 5 (22,8 mg, 24,36 pmoles) em pó foi dissolvido em 8,26 ml de água e 3,14 ml de tampão de acetato 200 mM (pH 5,26) e 163 μΙ de solução de NaICri (1,3 mg, 6,1 pmoles, 0,25 eq). A mistura foi agitada a 25 O durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render solução de PS-5 oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 5 (mg) Vol. após purificação (ml) Ácido Urônico (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,25 22,8 2,44 6735,97 84,87 5,71 68
[0543] 2. Derivatização de DBCO [0544] Procedimento de reação:
[0545] A uma solução de PS Tipo 5 (6,25 mg, 6,68 pmoles, 0,992 ml de água) oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) foi adicionada solução tampão (0,063 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,74), DMSO (25 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (3,5 mg em 100 μΙ de DMSO; 6,68 pmoles, 10 equivalentes) 3 25 0. Am istura de reação foi, então, agitada a 37 O por 30 min e, depois disso, 84 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (0,84 mg em 84 μΙ de água; 13,36 pmoles, 20 equivalentes) foi adicionado e mantido em agitação durante 24 h a 37 Ό. A mistura de reação foi extraída com acetato de etila (6 x 10 ml). O extrato foi transferido para um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisado usando 8 trocas
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160/233 com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido por 3 trocas com água (12 ml cada) para render o derivado de DBCO tipo 5. A essa solução (5,35 ml, 6,0 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (60 mg em 0,6 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. Cada amostra continha 3,0 mg de 5 DBCO e 30 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 5 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ácido Urônico (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
6,25 5,38 1219,4 0,688x3 63,044 5,17 98 300
[0546] 3 Conjugação do derivado PS 5-DBCO com eCRM [0547] PS 5-DBCO: 3,0 mg (com 30 mg de sacarose) de pó branco [0548] % de DBCO: 5,17% [0549] Concentração de CRM: 3,25 mg/ml de solução [0550] PS: CRM (razão de entrada): 1:1 [0551] Procedimento de reação:
[0552] O derivado 5-DBCO (3,0 mg de pó branco com 30 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (4,48 ml) e DMSO (0,6 ml). Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (0,92 ml) fornecendo uma razão em massa de PS5:CRM de 1:1 (em p/p). A mistura de reação foi suavemente misturada antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) durante 5 horas. Adicionou-se solução de azida sódica (20 μΙ, 10 mg/ml em água). Após 30 min, a mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um dispositivo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, NQ Cat. G235060, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (5 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona 0,22 pm, 33 mm) para render solução conjugada de 5
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PS-CRM.
PS 5- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Ácido Urônico (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJD relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
3,0 3,0 5,466 0,231 46 0,239 48 0,97 LLOQ 2,74
[0553] Exemplo 14. Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 6A a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0554] PS Tipo 6A Peso Mol.: 706 [0555] Solução de NaICri em água (10 mg/ml) [0556] Procedimento de reação:
[0557] PS-6A (15 mg, 21,2 μ mol) em pó foi dissolvido em 7,5 ml de solução aquosa (solução de acetato de sódio 10 mM, PH 4,5). A essa solução foi adicionado 36,3 μΙ de solução de NaICri (0,363 mg, 1,69 μιτιοΙ, 0,08 eq). A mistura foi agitada a 4 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi transferida para um tubo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G2350 57, MWCO 20K) e, então, dialisou-se com tampão PB de 50 mm, pH 6,8 durante 24 horas (4 trocas, 600 ml cada) para render solução PS-6A oxidado. Após a diálise, adicionou-se DMSO para produzir PS-6A em DMSO a 10% com tampão PB de 50 mm, pH 6,8.
Equiv. molar de NalO4 PS 6A (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) Rendimento PS (%)
0,08 15 4 4780 9,0 90
[0558] 2. Derivatização de DBCO [0559] Concentração final de PS: 3,37 mg/ml [0560] Concentração final de tampão: DMSO a 10% em PB de 50 mM (pH 6,8) [0561] Procedimento de reação:
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162/233 [0562] A uma solução de PS tipo 6A oxidado (13,5 mg, 19,1 pmoles, 4 ml em DMSO a 10%, PB de 50 Mm, PH 6,8), uma solução de DBCOPEG4-NH2 (10,01 mg em 100,1 μΙ de DMSO; 19,1 pmoles, 10 equivalentes) foi adicionada a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O por 60 min e, depois disso, foi adi cionada solução de cianoboroidreto de sódio (1,2 mg em 120 μΙ de água; 19,1 pmoles, 10 equivalentes) e mantida sob agitação durante 24 horas a 25 O. A mistura de reação foi, então, transferida para um tubo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-a-Lyzer G2, N°Cat. G2350 57, MWCO 20K) e, em seguida, dialisada usando 4 trocas com etanol a 20% em tampão PB de 50 mM seguido de 3 trocas com tampão PB de 50 mM para render 0 derivado de DBCO tipo 6A.
PS 6A oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
13,5 8 1685 148 8,78 70 193
[0563] 3. Conjugação do derivado PS 6A-DBCO com eCRM [0564] PS 6A-DBCO: 7,1 mg (com 71 mg de sacarose) de pó branco [0565] DBCO: 9% [0566] Concentração de CRM: 2,617 mg/ml de solução [0567] PS: CRM (razão de entrada): 2:1 [0568] Concentração final de PS: 5,2 mg/ml [0569] Procedimento de reação:
[0570] Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (1,4 ml) a um derivado de DBCO 6A (7,1 mg de pó branco com 71 mg de sacarose), fornecendo uma razão em massa de PS6A:CRM de 2:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (23 Ό) durante 17 horas. A mistura foi, então, colocada em
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163/233 uma incubadora (37 Ό) durante 3 horas. Após a reação, a mistura foi diluída duas vezes por solução de cloreto de sódio a 0,9% e reduzida por boroidreto de sódio (1,9 mg em 191 μΙ de água; 50,2 pmoles, 50 equivalentes) durante 3 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-ALyzer G2, N°Cat.G235072, MWCO 300 K) e depois dial isada com PBS, PH 7 durante 24 horas (3 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render uma solução conjugada de 6A PS-CRM.
PS 6ADBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
7,1 3,6 10 0,424 60 0,170 47 2.5: 1 16.1 1,15
[0571 ] Exemplo 15. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do Sorotipo 6B PS a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0572] Pureza do tipo 6B PS: 80% (antrona) [0573] Peso Mol.: 706,18 [0574] Solução de NalÜ4 em água (5,45 mg/ml) [0575] Procedimento de reação:
[0576] PS-6B (27,28 mg corrigidos para 80%, 21,82 mg, 30,9 pmoles) em pó foi dissolvido em 14 ml de solução aquosa (9,5 ml de água e 4,5 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução foi adicionado 145 μΙ de solução de NalÜ4 (0,79 mg, 3,71 pmoles, 0,12 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de dispositivo de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render solução de PS-6B oxidado.
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Equiv. molar de NalO4 PS 6B (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,12 27,28 3,54 7783 8,1 7,33 89
[0577] 2. Derivatização de DBCO [0578] Concentração final de PS: 3,5 mg/ml [0579] Concentração final de tampão: 53 μΜ (pH 6,0) [0580] Procedimento de reação:
[0581] A uma solução de PS (18,4 mg, 27,6 pmoles, 3,35 ml de água) oxidada (presumir nível de oxidação a 10%) foi adicionada solução tampão (1,4 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,01), DMSO (700 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (14,43 mg em 295 μΙ de DMSO; 27,6 pmoles, 10 equivalentes) tudo a 25 Ό. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 Ό durante 30 min e, depois disso, foram adicionados 75 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (9,39 mg em 200 de água; 55,6 pmoles, 20 equivalentes) e mantida em agitação durante 2 dias a 25 Ό. A mistura de reação foi dil uída com tampão fosfato (500 μΙ de solução 200 mM, pH = 6) antes de adicionar 104 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada com 0 uso de 6 trocas com etanol a 20% água seguida por 3 trocas com água (12 ml cada) para render uma solução de derivado de DBCO tipo 6B. A essa solução (2,96 ml, 20,1 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (200 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 6,7 mg de 6B DBCO e 67 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
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PS 6B oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS KDa
18,4 3,11 9620 0,796x4 311,17 3,2 115 403
[0582] 3. Conjugação do derivado PS 6B-DBCO com eCRM [0583] PS 6B-DBCO: 6,7 mg (com 67 mg de sacarose) de pó branco [0584] % de DBCO: 3,2% [0585] Concentração de CRM: 2,617 mg/ml de solução [0586] PS: CRM (razão de entrada): 2:1 [0587] Concentração final de PS: 5,23 mg/ml [0588] Procedimento de reação:
[0589] Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (1,28 ml) a um derivado de 6B-DBCO (6,70 mg de pó branco com 67 mg de sacarose), fornecendo uma razão em massa de PS6B:CRM de 2:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 17 horas. A mistura foi, e m seguida, colocada em um forno (37 Ό) durante 2 horas. A mistura conj ugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab FloatA-Lyzer G2, N°Cat. G235071, MWCO 100 K) e depois d ialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 μιτι, 33 mm) para render uma solução conjugada de 6B PS-CRM.
PS 6BDBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
6,70 3,35 6,18 0,68 67 0,347 67 1,96: 1 8,72 1,30
[0590] Exemplo 16. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do
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PS Sorotipo 7F a um eCRM da Tabela 2
1. Ativação de CDAP e reticulação de DBCO [0591] Pureza PS 7F: % de n.d. (Antrona) - presumir 100% [0592] Peso mol.: 1.227 g mol-1 (unidade de repetição) [0593] Procedimento de reação:
[0594] PS7F (6,2 mg, 5,1 pmoles) foi dissolvido em água (3,1 ml) ao qual foi adicionado CDAP (2,0 eq., 100 mg/ml em acetonitrila, 24 pl). A mistura de reação foi agitada temperatura ambiente (TA) durante 30 s. Nesse momento, foi adicionada trietilamina (TEA, 2,5 eq., 0,2 M, 63 pl) e a mistura de reação foi agitada durante 120 s. DBCO PEG4-NH2 (1,0 eq., 28,7 pmoles/ml em DMSO, 180 pl) foi adicionado juntamente com tampão de borato (0,1 M, pH 8,5, 1,0 ml) e agitou-se à TA de um dia para 0 outro. O PS7F derivado de DBCO foi purificado por precipitação com etanol e por diálise centrífuga (Amicon MWC0100 kDa) usando 3 trocas com água. Após análise por espectroscopia de absorvência de UV, ensaio de antrona e SEC, essa solução (3,61 ml, 3,05 mg) foi diluída com uma solução de sacarose (10 vezes 0 teor de massa, 100 mg/ml) e liofilizada a um pó branco.
PS 7F (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
6,2 3,61 686,3 0,619 55,52 8,1 49 nd
[0595] 2. Conjugação do derivado PS 7F-DBCO com eCRM [0596] PS 7F-DBCO: 2,62 mg (com 26,2 mg de sacarose) de pó liofilizado [0597] % de DBCO: 8,1% [0598] CRM: 5,0 mg/ml em tampão PBS [0599] PS: CRM (razão de massa de entrada): 1,73:1 [0600] Procedimento de reação:
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167/233 [0601] O 7F-DBCO liofilizado foi dissolvido em salmoura (0,9% (em p/v), 0,938 ml), tampão fosfato (0,5 M, pH 7,0, 58 ml) e DMSO (144 ml) ao qual foi adicionada solução de eCRM (0,300 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS7F:CRM de 1,73:1,00 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 17 horas. O conjugado de CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisados com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi esterilizada por filtração através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 7F-CRM.
PS 7F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Razão de PS: CRM CJF PS livre (%) SEC- MALS MDa
2,62 1,5 7,17 0,450 65 0,224 2.0: 1.0 LLOQ (<21.4ug/ml) 1,95
[0602] Exemplo 17. Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 8 a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0603] Pureza do PS tipo 8 84% [0604] Peso Mol.: 684,54 g mol’1 [0605] Procedimento de reação:
[0606] O polissacarídeo nativo (42 mg, 61,3 pmoles) foi dissolvido em 21 ml de solução aquosa (14,7 ml de água e 6,3 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,5). A essa solução foi adicionada uma solução de periodato de sódio (calculada para 2,63 mg, 0,20 eq.). A mistura foi agitada a 25 O durante 18 horas com monitoramento por absorção de UV a 222 nm para NalO4. O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga de MWCO 30 kDa da Amicon com o uso de pelo
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168/233 menos 6 trocas com água para render solução purificada de PS-8.
Equiv. molar de NalO4 PS 8 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,20 42 3,26 15724 8,96 2,28 84
[0607] 2. Derivatização de DBCO [0608] Procedimento de reação:
[0609] PS8-OX (33,8 mg, 49,4 pmoles) em 3,14 ml de água foi diluído com tampão de fosfato (789 μΙ, 0,5 M pH 6,0), 1 ml de H2O e DMSO (313 μΙ) aos quais foi adicionado DBCO-PEG4-NH2 (25 mg, 1 eq., em DMSO, 250 ml). Após 10 minutos, adicionou-se NaCNBHs (6,2 mg, 2 eq adicionando 132 μΙ de 9,43 mg em 200 μΙ de H2O). A mistura de reação foi agitada a 25 O durante dois dias em um banho de água termostatizado, seguido pela adição de tampão de fosfato (0,5 ml de 200 mM, pH = 6). A isso, adicionou-se NaBHU (1 eq.). Após agitação durante 30 min, a mistura foi extraída com acetato de etila (3x5 ml). O acetato de etila residual foi removido fazendo borbulhar com nitrogênio gasoso e a mistura foi transferida para filtros de centrífuga MWCO 100 kDa Amicon. O derivado de DBCO foi purificado por diálise centrífuga com 0 uso de 6 trocas com EtOH a 20% e 3 trocas com água (12 ml cada) para render 0 tipo do derivado de 8-DBCO. A essa solução (5,63 ml, 25 mg) foi adicionada uma solução de sacarose e liofilizada.
PS 8 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
33,8 5,63 6492 0,813x3 232 3,57 74 392
[0610] 3. Conjugação do derivado PS 8-DBCO com eCRM [0611] PS 8-DBCO: 3,77 mg (com 38 mg de sacarose) de pó liofilizado
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169/233 [0612] % de DBCO: 3,57% [0613] Concentração de CRM: 5,966 mg/ml de solução [0614] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0615] Procedimento de reação:
[0616] O PS8-DBCO foi dissolvido em NaCI a 0,9% (2,28 ml), tampão de fosfato (0,126 ml, 0,5 M pH 7,0) e foi adicionado DMSO (0,314 ml). Depois, adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (0,42 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS8:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 1 hora e, em seguida, colocada em forno a 37 Ό de um dia para o outro. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 100 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para o tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (8 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona 33 mm) para render uma solução conjugada 8-CRM.
PS 8- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS: CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
3,77 2,51 7,13 0,372 70 0,237 67 1,57: 1 11,53 1,2
[0617] Exemplo 18. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do
PS Sorotipo 9N a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0618] Pureza do PS tipo 9N: 75% [0619] Peso Mol.: 928,29 g mol·1 [0620] Procedimento de reação:
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170/233 [0621 ] O polissacarídeo nativo (19,0 mg, 20,4 pmoles) foi dissolvido em 9,49 ml de solução aquosa (7,12 ml de água e 2,37 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,5). A essa solução foi adicionada uma solução de periodato de sódio (1,31 mg, 0,30 eq., 56 μΙ de 23,65 mg em 1,0 ml de solução aquosa). A mistura foi agitada a 25 Ό d urante 18 horas com monitorização por absorção de UV a 222 nm para NaICU.O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga PWCO 30 kDa Amicon com o uso de 4 trocas com água para render uma solução purificada de PS-9.
Equiv. molar de NalO4 PS 9N (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,30 19,0 1,643 9229 7,0 ND 71
[0622] 2. Derivatização de DBCO [0623] Procedimento de reação:
[0624] PS9N-OX (12,6 mg, 13,6 pmoles) em 1,643 ml de água foi diluído com tampão de fosfato (0,945 ml, 200 mM pH 6,0 contendo 94,5 mg de sacarose) e DMSO (0,33 ml) ao qual foi adicionado DBCO-PEG 4 -NH 2 ( 7,2 mg, 1 eq., em DMSO, 0,142 ml).Após 10 minutos adicionou-se NaCNBH 3 (1,71 mg, 2 eq. adicionando 47 μΙ de 7,36 mg em 200 μΙ de Η2Ο). A mistura de reação foi agitada a 25 Ό durante dois dias em um banho de água termostatizado, seguido pela adição de tampão de fosfato (0,4 ml de 200 mM, pH = 6). A isso foi adicionado NaBHU (0,51 mg, 1 eq.). Após agitação durante 30 min, a mistura foi extraída com acetato de etila (5x5 ml). O acetato de etila residual foi removido fazendo borbulhar com nitrogênio gasoso e a mistura foi transferida para filtros de centrífuga MWCO 30 kDa Amicon. O derivado de DBCO foi purificado por diálise centrífuga usando 3 trocas com água (12 ml cada) seguido de 6 trocas com etanol aquoso a 20% (12 ml cada) e finalmente 3 trocas com água (12 ml cada) para render 0 derivado de
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DBCO tipo 9N. A essa solução (2,388 ml, 9,05 mg), foi adicionada uma solução de sacarose e liofilizada.
PS 9N oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
12,6 2,388 1485 0,782 72,8 4,9 78 474
[0625] 3. Conjugação do derivado PS 9N-DBCO com eCRM [0626] PS 9N-DBCO: 4,5 mg (com 45 mg de sacarose) de pó liofilizado [0627] % de DBCO: 4,9% [0628] Concentração de CRM: 3,0 mg/ml de solução [0629] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0630] Procedimento de reação:
[0631] Dissolveu-se PS9N-DBCO em NaCI a 0,9% (1,30 ml) juntamente com pH = 7 de tampão fosfato (96 ml de 0,5 M) e adicionouse DMSO (0,24 ml). Depois, adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (0,60 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) por 18 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 100 μΙ). O conjugado CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% com 3 ml de tampão pH = 7, durante 24 horas (7 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona 33 mm) para render uma solução conjugada 9N-CRM.
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PS 9NDBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
4,5 3,0 5,28 0,77 90 0,407 72 1,89: 1 10,9 1,17
[0632] Exemplo 19. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do PS Sorotipo 9V a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0633] Pureza do PS tipo 9V: 85% (Antrona) [0634] Peso Mol.: 704 kDa (Unidade de Repetição = 971,8 g/mol) [0635] Procedimento de reação:
[0636] PS Tipo 9V (35,90 mg, 37,80 pmoles) pó foi dissolvido em 17,95 ml de solução aquosa (12,565 ml de água e 5,385 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH 5,5) em um tubo de amostra de poliestireno de 50 ml com barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionouse 852 μΙ de solução de NaICri (2,83 mg, 13,23 μιτιοίβε, 0,35 eq. molar). O tubo de reação foi envolvido em papel alumínio e colocado em banhomaria a 24 Ό. A mistura foi agitada a 24 Ό. Após 18 h, a mistura da reação foi dialisada usando três dispositivos de filtro de centrífuga Ultra15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml) por 4 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render a solução de PS-9V oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 9V (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,35 35,90 4,55 5213,14 9,06 7,30 64
[0637] 2. Derivatização de DBCO [0638] Procedimento de reação:
[0639] A uma solução de tipo oxidado 9V PS (21,64 mg, 22,78 pmoles, 4,27 ml), foram adicionadas solução tampão (0,541 ml de tampão de fosfato 0,5 M pH 6,0), DMSO (66 μΙ) e uma solução de
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DBCO-PEG4-NH2 (11,9 mg em 475 μΙ de DMSO, 22,78 μιτιοΙ, 1 equiv. molar). A mistura de reação foi agitada a 25 O dur ante 30 min e, depois disso, foram adicionados 140 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2,86 mg em 140 μΙ de água; 45,56 μιτιοΙ, 2 equiv. molar). A mistura de reação foi envolvida em folha de alumínio e mantida em agitação em um banho de água regulado para 25 O du rante 2 dias. A reação foi parada no segundo dia pela adição de 163 de uma solução de boroidreto de sódio (1,72 mg em 163 de água; 45,56 pmol, 2 equiv. molar). Depois de agitação durante 30 minutos (quando 0 borbulhamento observável cessou), extraiu-se a mistura de reação com acetato de etila (2 x 10 ml) e depois com diclorometano (2x10 ml). O extrato foi borbulhado com N2 durante 20 minutos para remover diclorometano residual, e foi, em seguida, transferido para dois dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 50 kDa; 15 ml). A diálise foi realizada através da realização de três trocas com uma solução de DMSO a 3% (15 ml cada), três trocas com uma solução de etanol a 20% (15 ml cada) e duas trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render 0 derivado de DBCO 9V. A essa solução (4,40 ml, 12,144 mg), foi adicionada uma solução de sacarose (121,44 mg 1,214 ml de água). Essa solução combinada foi dividida em três frações (2 x 5 mg e 1 x 2,14 mg) e cada uma foi liofilizada para render um pó branco fino. Todas as frações foram armazenadas a 4 O até serem necessárias para a reação de conjugação.
PS 9V Oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivação de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
21,6 4,40 949,00 0,341 28,00 3,0 56 267
[0640] 3. Conjugação de derivado de PS 9V-DBCO com eCRM [0641] PS 9V-DBCO: 5 mg (com 50 mg de sacarose) de pó branco [0642] % de DBCO: 3,0%
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174/233 [0643] Concentração de CRM: 6.009 mg/ml de solução [0644] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0645] Procedimento de reação:
[0646] O derivado de DBV 9V (5,0 mg de pó branco com 50 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,881 ml), tampão de fosfato pH 7 (0,067 ml, 0,5 M) e DMSO (0,167 ml). Uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,555 ml de solução) foi adicionada fornecendo uma razão em massa de PS9V:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas e depois durante mais 2 horas a 37 Ό. Após o tempo total de reação, um volume de azida sódica foi adicionado à mistura de conjugação (0,33 mg; 5,15 pmoles). A mistura de reação foi, então, diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% (2,83 ml) e transferida para um dispositivo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G 235060, MWCO 300 K). A amostra foi submetida à diálise em solução de cloreto de sódio a 0,9% por 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render solução de conjugado 9V PS-CRM.
PS 9V- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,0 3,33 1,67 0,86 87 0,450 68 1,9 14,2 0,94
[0647] Exemplo 20. Preparação de Conjugados Pneumocócicos do
OS Sorotipo 9V a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0648] Pureza do PS tipo 9V: 81 % (Antrona) [0649] Peso Mol.: 949,83 [0650] Solução de NaICri em água (5,41 mg/ml)
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175/233
Procedimento de reação:
[0651] PS-9V (21,15 mg corrigido para 81%, 17,13 mg, 18,04 pmoles) em pó foi dissolvido em 10,57 ml de uma solução aquosa (7,4 ml de água e 3,17 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução adicionou-se 214 μΙ de solução de NaICri (1,16 mg, 5,41 pmoles, 0,3 eq). A mistura foi agitada a 25 O durante 20 horas. A amostra oxidada foi purificada através de um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) usando 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-9V oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 9V (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,30 21,15 2,49 7352 7,4 9,6 82
[0652] 2. Derivatização de DBCO [0653] Procedimento de reação:
[0654] A uma solução de PS oxidado tipo 9V (presumir nível de oxidação a 10%) (15,36 mg, 16,17 pmoles, 2,20 ml de água) foi adicionada solução tampão (1,4 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,01), DMSO (500 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (8,46 mg em 131 μΙ de DMSO; 16,17 pmoles, 10 equivalentes) tudo a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 mi n e, depois disso, 41 ml de uma solução de cianoboroidreto de sódio (15,5 mg em 200 μΙ de água; 32,34 pmoles, 20 equivalentes) foi adicionado e mantido em agitação durante 2 dias 3 25 0. A mistura de reação foi diluída com tampão de fosfato (500 ml de solução 200 mM, pH = 6) antes da adição de 62 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml). O extrato foi transferido para um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisado usando 6 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada)
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176/233 seguido por 3 trocas com água (12 ml cada) para render o derivado de DBV tipo 9V. A essa solução (4,0 ml, 10,08 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (100 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,04 mg de 9V DBCO e 50 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 9V oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
15,36 5,42 2642 0,216x4 90,32 3,42 89 324
[0655] 3. Conjugação de derivado PS 9V-DBCO com eCRM [0656] PS 9V-DBCO: 5,04 mg (com 50 mg de sacarose) de pó branco [0657] % de DBCO: 3,42% [0658] Concentração de CRM: 3,923 mg/ml de solução [0659] PS: CRM (razão de entrada): 1,11:1 [0660] Procedimento de reação:
[0661] Uma solução de eCRM funcionalizado com azido (CRM em 0,1,156 ml de solução) foi adicionada ao derivado de DBV 9V (5,04 mg de pó branco com 50 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS9V:CRM de 1,11:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um dispositivo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G2350 60, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (5 trocas, 800 ml cada).A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 μιτι, 33 mm) para render uma solução conjugada de 9V PS-CRM.
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PS 9V- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJD relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,04 4,53 5,73 0,61 69 0,298 39 2,05: 1 14,64 1,26
[0662] Exemplo 21. Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 10A a um eCRM da Tabela 2
1. Ativação de CDAP e reticulação de DBCO [0663] Pureza PS 10A: 77% (Antrona) [0664] Peso mol.: 1.227 g mol·1 (unidade de repetição) [0665] Procedimento de reação:
[0666] PS10A (18,7 mg, 15,2 pmoles) foi dissolvido em água (7,9 ml) ao qual foi adicionado CDAP (0,8 eq., 100 mg/ml em acetonitrila, 30 μΙ). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente (TA) durante 30 s. Nesse momento, uma solução de hidróxido de sódio (0,2 M, 200 μΙ) foi adicionada para atingir pH 9,5 e a mistura de reação foi agitada por 150 s. DMSO (1,2 ml), em seguida, foi adicionado, seguido por DBCO PEG4-NH2 (0,5 eq., 32,0 μηποΙ/ml em DMSO, 238 μΙ) e agitou-se à TA de um dia para 0 outro. O PS10A derivado de DBCO foi purificado por extração com solvente e por diálise centrífuga (Amicon MWCO 30 kDa) com 0 uso de 3 trocas de 3% (em v/v) de DMSO, 2 trocas com salmoura a 0,9% (em v/v) e 3 trocas com água. Após análise por espectroscopia de absorvência de UV, ensaio de antrona e SEC, essa solução (3,18 ml, 13,5 mg) foi diluída com uma solução de sacarose (10 vezes 0 teor de massa, 100 mg/ml) e liofilizada a um pó branco.
PS 10A (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
18,7 3,18 1150,41 1,081 101,26 8,8 72 579
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178/233 [0667] 2. Conjugação do derivado PS 10A-DBCO com eCRM [0668] PS 10A-DBCO: 5,00 mg (com 50,0 mg de sacarose) de pó liofilizado [0669] % de DBCO: 8,8% [0670] CRM: 5,0 mg/ml em tampão PBS [0671] PS: CRM (razão de massa de entrada): 1,75:1 [0672] Procedimento de reação:
[0673] 10A-DBCO liofilizado foi dissolvido em salmoura (0,9% (em p/v), 3,759 ml), tampão de fosfato (0,5 M, pH 7,0, 200 ml) e DMSO (500 ml) ao qual foi adicionada solução de eCRM (0,541 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS10A:CRM de 1,75:1,00 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) por 17 horas. O conjugado de CRM foi transferido para dois tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi esterilizada por filtração através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona 33 mm) para render uma solução conjugada de 10A-CRM.
PS 10A- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Razão de PS:CRM CJF PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,00 2,86 6,86 0,678 93 0,311 2,18:1,0 5,64 1,048
[0674] Exemplo 22. Preparação de Conjugados Pneumocócicos de
PS Sorotipo 11A a um eCRM da Tabela 2
1. Hidrólise [0675] Pureza do tipo 11A PS: 69% (antrona) [0676] Peso Mol.: 908,7 g mol'1 [0677] Procedimento de reação:
[0678] O polissacarídeo nativo 11A (35,0 mg) foi dissolvido em 17,5
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179/233 ml de solução aquosa (15,75 ml de água e 1,75 ml de ácido acético, 2 M). A mistura foi aquecida a 80 Ό durante 1 hora e , depois disso, uma solução de hidróxido de sódio foi adicionada a pH 5,5 (3,2 ml, 1 M) após resfriamento até a temperatura ambiente. O PS hidrolisado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 30 kDa Amicon com o uso de pelo menos 6 trocas com água para render uma solução de PS-3 purificado que foi depois liofilizada como uma alíquota.
PS 11A (mg) Água (ml) AcOH, 2M (ml) Ensaio de antrona (μ M) Rendimento PS (%) MALS (kDa)
35,0 15,75 1,75 6294,58 85 461
[0679] 2. Oxidação [0680] Procedimento de reação:
[0681] À solução de polissacarídeo hidrolisada (5,027 ml, 28,75 mg,
31,6 pmoles) foi adicionada mais água (5,75 ml) e tampão de acetato (0,2 M, pH 5,5, 3,6 ml). A essa solução foram adicionados 135 μΙ de solução de periodato de sódio por gotejamento (1,35 mg, 6,32 pmoles, 0,20 eq.). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas. O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga MWCO 100 kDa Amicon usando pelo menos 6 trocas com água para render a solução PS-11AOX purificada.
Equiv. molar de NalO4 PS 11A (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) %de oxidação (BCA) % de oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,20 28,75 2,42 9525,39 10,2 4,82 73
[0682] 3. Derivatização de DBCO [0683] Procedimento de reação:
[0684] PS11A-OX (22,0 mg, 24,2 pmol, 2,235 ml) foi adicionado ao tampão de fosfato (1,37 ml, 200 mM, pH 6,0) ao qual foi adicionado DBCO PEG4-NH2 (1,0 eq., 523 g mol·1 em DMSO, 100 mg/ml, 127 μΙ) e uma quantidade adicional de DMSO (560 μΙ). A mistura de reação foi
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180/233 agitada a 25 Ό durante 25 minutos antes da adição de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2 eq., 44,5 mg/ml, 68 μΙ) e agitou-se durante dois dias. A mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml) e filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μιτι. O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga (MWCO 100 kDa Amicon) com o uso de 7 trocas com etanol a 20% em água seguido por três trocas com água (12 ml cada) para render o tipo do derivado 11ADBCO. A essa solução (2,535 ml, 15,00 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (150 mg em 1,5 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,00 mg de 11ADBCO e 50 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 11A hidrolisado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
22,0 3,44 1628,30 1.000x4 93,93 5,77 93 543
[0685] 4. Conjugação do derivado PS 11A-DBCO com eCRM [0686] PS 11 A-DBCO: 5,0 mg (com 50 mg de sacarose) de pó liofilizado [0687] % DBCO: 5,77% [0688] Concentração de CRM: 5,42 mg/ml de solução [0689] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0690] Procedimento de reação:
[0691] O 11 A-DBCO foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (7,656 ml, filtrado a 0,22 pm), tampão de fosfato (pH 7,0, 0,5 M, 0,385 ml) e DMSO (0,962 ml). Adicionou-se por gotejamento uma solução de eCRM funcionalizado com azido (5,42 mg/ml, 0,617 ml) para fornecer uma razão em massa de entrada de PS11 A:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser
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181/233 misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 17 horas. A reação click foi extinta pe Ia adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (4 trocas, 1 I cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 11A-CRM.
PS 11A- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJF PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,0 3,33 9,14 0,454 83 0,271 74 1,68: 1 0,92 0,987
0692] Exemplo 23: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de
PS Sorotipo 12F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0693] Pureza do tipo 12F PS: 82% (antrona) [0694] Peso mol.: 1.094 g mol’1 [0695] Procedimento de reação:
[0696] PS Tipo 12F (21,8 mg, 20 pmoles) em pó foi dissolvido em
10,9 ml de solução aquosa (8,175 ml de água e 2,725 ml de tampão de 0,2 M de acetato, pH 5,5) em um tubo de ensaio de poliestireno de 50 ml com uma barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 160 μΙ de solução de NalO4 (0,64 mg, 3 pmoles, 0,15 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em papel alumínio e colocado em banho-maria a 25 Ό. A mistura foi agitada a 25 Ό. Após 18 h, a mistura da reação foi dialisada usando dois dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml) de 6 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para tornar solução de PS 12Foxidado.
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Equiv. molar de NalO4 PS 12F (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % de oxidação (BCA) % de oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,15 21,8 3,06 4462,11 37 5,62 69
[0697] 2. Derivatização de DBCO [0698] Procedimento de reação:
[0699] PS12F-OX (13,1 mg, 12 pmoles, 2,68 ml) foi adicionado ao tampão de fosfato (1,00 ml, 200 mM, pH 6,0) ao qual foi adicionado DBCO PEG4-NH2 (1,0 eq., 523 g mol’1 em DMSO, 33 mg/ml, 199 μΙ) e uma quantidade adicional de DMSO (500 μΙ). A mistura de reação foi agitada a 25 G durante 25 minutos. Antes da adição de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2 eq., 52,5 mg/ml, 29 μΙ) e agitou-se durante dois dias. A mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml) e borbulhada sem solvente. O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga duas vezes (MWCO 30 kDa Amicon) usando 6 trocas com etanol a 20% em água seguido por 3 trocas com água de cada vez (12 ml cada) para render 0 derivado de 12F-DBCO. A essa solução (2,2 ml, 10,45 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (104,5 mg em 1,05 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,0 mg de 12F-DBCO e 50 mg de sacarose para uso na reação de conjugação.
PS 12F- OX (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
13.1 2,20 1447,92 0,302 x 3 28,2 2.0 80 544
[0700] 3. Conjugação do derivado de PS 12F-DBCO com eCRM [0701] PS 12F-DBCO: 5,0 mg (com 50 mg de sacarose) de pó liofilizado
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183/233 [0702] % de DBCO: 2,0% [0703] Concentração de CRM: 5,29 mg/ml de solução [0704] PS:CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0705] Procedimento de reação:
[0706] Ο 12F-DBCO foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (6,542 ml, 0,22 μιτι filtrada), tampão de fosfato (pH 7,0, 0,5 M, 0,334 ml) e DMSO (0,834 ml). Adicionou-se por gotejamento solução de eCRM funcionalizado com azido (5,29 mg/ml, 0,630 ml) para fornecer uma razão de entrada de PS12F:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 °C) por 17 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (4 trocas, 1 I cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução de conjugado de 12F-CRM estéril.
PS 12F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJF PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,0 3,33 8,06 0,547 88 0,200 48 2,73: 1 13,3 0,931
[0707] Exemplo 24: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de
PS Sorotipo 14 a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0708] Pureza do PS tipo 14: 91 % (Antrona) [0709] Peso Mol.: 689,25 [0710] Solução de NaICri em água (7,8 mg/ml) [0711] Procedimento de reação:
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184/233 [0712] PS-14 (28,3 mg corrigidos para 80%, 25,75 mg, 37,36 pmoles) em pó foi dissolvido em 14 ml de solução aquosa (10 ml de água e 4 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução foi adicionado 110 μΙ de solução de NalÜ4 (0,86 mg, 4,05 pmoles, 0,13 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 3 horas e, de pois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-14 oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 14 (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,13 28,3 3,042 10189 6,59 3,67 83
[0713] 2. Derivatização de DBCO [0714] Procedimento de reação:
[0715] A uma solução de tipo 14 PS (20,5 mg, 29,74 μιτιοΙ, 2,92 ml de água) oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) foi adicionada solução tampão (1,3 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,8), DMSO (550 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (11,68 mg em 150 μΙ de DMSO; 22,3 pmoles, 0,75 equivalente) tudo a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e, depois disso, foram adicionados 70 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (6,39 mg em 120 de água; 59,48 pmoles, 20 equivalentes) e mantida sob agitação durante 2 dias a 25 Ό. A mistura de reação foi dil uída com tampão fosfato (500 de 200 solução mM, pH = 6) antes da adição de 100 μΙ de solução de boroidreto de sódio (1,13 mg 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada com 0 uso de 7 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido de três trocas com água (12 ml cada) para render 0 tipo do derivado de
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DBCO. A essa solução (3,78 ml, 17,7 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (177 mg em 1,17 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,9 mg de 14 DBCO e 59 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 14 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
20,5 3,91 1694,06 0,622 x 4 238 3,51 91 463
[0716] 3. Conjugação do derivado de PS 14-DBCO com eCRM [0717] PS 6B-DBCO: 5,9 mg (com 59 mg de sacarose) de pó branco [0718] % de DBCO: 3,5% [0719] Concentração de CRM: 5,06 mg/ml de solução [0720] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0721] Procedimento de reação:
[0722] Adicionou-se uma solução de ECRM funcionalizado por azido (0,779 ml) ao derivado de 14 DBCO (5,9 mg de pó branco com 59 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS14:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) durante 18 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235071, MWCO 100 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 μιτι, 33 mm) para render uma solução conjugada de 14 PS-CRM.
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PS 14- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,9 3,94 4,27 0,648 93 0,283 61 2,29: 1 5,29 0,925
[0723] Exemplo 25: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 14 a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0724] Pureza de PS tipo 14: 91 % (Antrona) [0725] Peso Mol.:689,25 [0726] Solução de NaICri em água (10,19 mg/ml) [0727] Procedimento de reação:
[0728] PS-14 (23,5 mg corrigidos para 80%, 21,38 mg, 31,02 pmoles) em pó foi dissolvido em 11,75 ml de uma solução aquosa (8,2 ml de água e 3,55 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução adicionou-se 97 μΙ de solução de NalÜ4 (0,95 mg, 4,03 μιτιοίβε, 0,13 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render solução de PS-14 oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 14 (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,13 23,5 3,76 5994 6,60 2,28 73 N/D
[0729] 2. Derivatização de DBCO [0730] Procedimento de reação:
[0731] A uma solução de PS tipo 14 (14,3 mg, 20,75 μιτιοΙ, 3,46 ml de água) oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) foi adicionada solução tampão (1,3 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,8), DMSO (637 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (10,86 mg em 263 μΙ de DMSO; 20,75 μιτιοίβε, 10 equivalentes) tudo a 25 O. A mistura de
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187/233 reação foi, então, agitada a 25 Ό durante 30 min e, depois disso, foram adicionados 51 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (10,2 mg em 200 de água; 41,50 μηποΙ, 20 equivalentes) e mantidos sob agitação durante 2 dias a 25 Ό. A mistura de reação foi dil uída com tampão fosfato (500 de 200 solução mM, pH = 6) antes de adicionar 78 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada com o uso de 6 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido de três trocas com água (12 ml cada) para render o derivado de DBCO tipo 14. A essa solução (4,12 ml, 12,24 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (12 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em três porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 6,12 mg de 14 DBCO e 6 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 14 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%)
14,3 4,43 4307 0,621 x3 190,14 4,42 92
[0732] 3. Conjugação do derivado PS 14-DBCO com eCRM [0733] PS 6B-DBCO: 6,12 mg (com 62 mg de sacarose) de pó branco [0734] % de DBCO: 4,42% [0735] Concentração de CRM: 2,617 mg/ml de solução [0736] PS: CRM (razão de entrada): 1,8:1 [0737] Procedimento de reação:
[0738] Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (1,3 ml) a derivado de 14 DBCO (6,12 mg de pó branco com 62 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS14:CRM de 1,8:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes
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188/233 de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 17 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-ALyzer G2, N° Cat. G235071, MWCO 100 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada (1,5 ml) foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render uma solução conjugada de 14 PS-CRM.
PS 14- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa N° do lote
6,12 3.4 4,85 1,24 98 0,472 67 2,63: 1 3,48 2,5 CJD
6,12 3.4 2,31 0,24 0,094 2,55: 1 N/D 1,56 CJF
[0739] Exemplo 26: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 15B a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0740] Pureza de PS tipo 15B: 71% (Antrona) [0741] Mol. em peso: 1.185 kDa (Unidade de Repetição= 1.069,80 g/mol) [0742] Procedimento de reação:
[0743] PS Tipo 15B (14,6 mg, 13,65 pmoles) em pó foi dissolvido em 7,30 ml de uma solução aquosa (5,1 ml de água e 2,2 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH 5,5) em um tubo de ensaio de poliestireno de 50 ml com uma barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 160 pl de solução de NalÜ4 (0,59 mg, 2,75 pmoles, 0,20 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em folha de alumínio e colocado em um banho de água para agitar a 24 Ό. A pós 3,5 horas, a mistura de reação foi dialisada usando um dispositivo de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml) por 6 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para processar solução PS-15B
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189/233 oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 15B (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,20 14,6 1,521 5560,34 27.01 9,52 62
[0744] 2. Derivatização de DBCO [0745] Procedimento de reação:
[0746] A uma solução de PS tipo 15B oxidado (7,56 mg, 7,07 pmoles, 1,271 ml), foram adicionados uma solução tampão (0,640 ml de tampão de fosfato 0,5 M pH 6,0), DMSO (0,063 ml) e uma solução de DBCO-PEG4 -NH2 (17 mg em 221 μΙ de DMSO; 7,07 pmoles, 1 equiv. molar). A mistura de reação foi agitada a 25 Ό dur ante 30 min e, depois disso, adicionou-se 350 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (0,90 mg em 350 de água, 2 equiv. molar). A mistura de reação foi envolvida em folha de alumínio e mantida em agitação em um banho de água regulado para 25 Ό durante 2 dias. A reação foi parada no segundo dia pela adição de 163 μΙ de uma solução de boroidreto de sódio (0,27 mg; 7,07 μηποΙ, 2 equiv. molar). Após agitação durante 30 minutos, a mistura de reação foi extraída com diclorometano (3 x 15 ml). O extrato foi borbulhado com N2 durante 20 minutos para remover diclorometano residual e foi, então, transferido para um dispositivo de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml). A diálise foi realizada através da realização de três trocas com uma solução de DMSO a 3% (15 ml cada), três trocas com uma solução de etanol a 20% (15 ml) e três trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render 0 derivado de 15B DBCO. A essa solução (1,982 ml, 6,86 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (68,6 mg em 0,686 ml de água). Essa solução combinada foi dividida em duas frações e cada uma foi liofilizada para render um pó branco fino. Todas as frações foram armazenadas a 4 Ό após liofilização até à secura até serem
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190/233 necessárias para a reação de conjugação.
PS oxidado 15B (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivação de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
7,56 1,982 1122,13 0,732 66,71 5,9 91 n/D
[0747] 3. Conjugação do derivado PS 15B-DBCO com eCRM [0748] PS 15B-DBCO: 3,85 mg (com 38,5 mg de sacarose) de pó branco [0749] % de DBCO: 5,9% [0750] Concentração de CRM: 6.009 mg/ml de solução [0751] PS:CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0752] Procedimento de reação:
[0753] Derivado de 15B DBCO (3,85 mg de pó branco com 38,5 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (4,302 ml), tampão fosfato pH 7 (0,220 ml, 0,5 M) e DMSO (0,550 ml). Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (solução a 0,467 ml) fornecendo uma razão em massa de PS15B:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas e depois durante mais 2 horas 3 37 0. A reação de conjugação foi terminada com a adição de azida sódica (0,23 mg; 3,60 pmoles). A mistura de reação foi, então, diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% até um volume final de 7 ml e transferida para um dispositivo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, Cat. N°G2350 60, MWCO 300 K). A amostra foi submetida à diálise em solução de cloreto de sódio a 0,9% por 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 μιτι, 33 mm) para render a solução conjugada 15B PS-CRM.
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PS 15B- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
3,85 2,57 7,52 0,515 100 0,289 85 1,8: 1 7,68 2,40
[0754] Exemplo 27: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 17F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0755] Pureza do tipo 17F PS: 84% (Antrona) [0756] Mol. em peso: 1274 kDa (Unidade de Repetição = 1.203,00 g/mol) [0757] Procedimento de reação:
[0758] PS Tipo 17F (28,50 mg, 23,69 pmoles) em pó foi dissolvido em 14,25 ml de uma solução aquosa (9,925 ml de água e 4,275 ml de tampão de 0,2 M de acetato, pH 5,5) em um tubo de ensaio de poliestireno de 50 ml com uma barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 53,8 ml de solução de NaICri (0,65 mg, 3,03 pmoles, 0,128 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em folha de alumínio e colocado em um banho de água para agitar a 24 Ό. Após 1 hora, a mistura da reação foi dialisada usando dois dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml) por 5 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para processar oxidado solução de PS-17F.
Equiv. molar de NalO4 PS 17F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,128 28,50 2,63 7378,81 12,60 6,81 82
[0759] 2. Derivatização de DBCO [0760] Procedimento de reação:
[0761] A uma solução de PS tipo 17F oxidado (22,0 mg, 18,29
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192/233 pmoles, 2,48 ml), foram adicionadas uma solução tampão (1,31 ml de tampão de fosfato 0,5 M pH 6,0) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (9,58 mg em 95,8 μΙ de DMSO;18,29 pmoles, 1 equiv. molar). A mistura de reação foi agitada a 25 durante 30 min e, depois disso, adicionou-se uma solução de cianoboroidreto de sódio (2,30 mg em 200 μΙ de água; 36,60 μπΊοΙβε; 2 equiv. molar). A mistura de reação foi envolvida em folha de alumínio e mantida em agitação em um banho de água regulado para 25 Ό durante 2 dias. A reação foi pa rada no segundo dia pela adição de solução de boroidreto de sódio (0,48 mg; 18,29 μιτιοΙ, 1 equiv. molar). Após agitação durante 30 minutos, a mistura de reação foi extraída com diclorometano (3x15 ml). O extrato foi borbulhado com N2 durante 20 minutos para remover diclorometano residual e foi, então, transferida para um dispositivo de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml). A diálise foi realizada conduzindo cinco trocas com uma solução de etanol a 20% (15 ml) e três trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render 0 derivado de DBCO 17F. A essa solução (3,27 ml, 11,58 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (115,8 mg em 1,158 ml de água). Essa solução combinada foi dividida em três frações (2 x 5 mg; 1 x 1,58 mg) e cada uma foi liofilizada para render um pó branco fino. Todas as frações foram armazenadas a 4 O após liofilização até à secura até serem necessárias para a reação de conjugação.
PS 17F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivação de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
22 4,40 978,16 0,350 30,45 3,1 53 209
3. Conjugação do derivado de PS 17F-DBCO com eCRM [0762] PS 17F-DBCO: 5 mg (com 50 mg de sacarose) de pó branco [0763] % de DBCO: 3,1% [0764] Concentração de CRM: 5.996 mg/ml de solução
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193/233 [0765] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0766] Procedimento de reação:
[0767] O derivado de DBCO 17F (5 mg de pó branco com 50 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (3,742 ml), tampão fosfato pH 7 (0,200 ml, 0,5 M) e DMSO (0,500 ml). Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (solução 0,558 ml) fornecendo uma razão em massa de PS17F:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) durante 19 horas. A reação de conjugação foi terminada com a adição de azida sódica (0,27 mg; 4,16 prnol; 1 equiv. molar). A mistura de reação foi, então, diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% a um volume final de 8 ml e transferida para um dispositivo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235060, MWCO 300 K). A amostra foi submetida à diálise em solução de cloreto de sódio a 0,9% por 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 pm, 33 mm) para render a solução conjugada 17F PS-CRM.
PS 17F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
5 3,33 6,71 461,30 99 0,349 70 1,59: 1 9,41 1,072
[0768] Exemplo 28: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de
PS Sorotipo 18C a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0769] Pureza do PS tipo 18C: 72% (Antrona) [0770] Peso Mol.: 970,76 [0771] Solução de NaICri em água (5,41 mg/ml) [0772] Procedimento de reação:
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194/233 [0773] PS Tipo 18C (61 mg, 62,84 pmoles) em pó foi dissolvido em
30,5 ml de solução aquosa (27,45 ml de água e 3,05 ml de ácido acético 2 M). A solução foi, então, aquecida a 95 Ό durante 40 min e depois resfriada e, depois disso, adicionou-se uma solução de NaOH (1 N, 5,2 ml) para ajustar o pH a 6,0. A mistura de reação foi dialisada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 12 ml) em 3 trocas com água de grau HPLC (12 ml cada). O sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon de 50 ml com 12,4 ml de água. A essa solução, foi adicionado 5,15 ml de água e 5,8 ml de tampão de acetato 200 mM (pH 5,35) e 153 pl de solução de NalÜ4 (1,53 mg, 7,175 pmoles, 0,15 eq). A mistura foi agitada a 25 O durante 3 horas e, depo is disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-18C oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 18C (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,15 61 5,29 6480,2 4,84 7,1 55
2. Derivatização de DBCO [0774] Procedimento de reação:
[0775] A uma solução de PS tipo 18C oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) (10,0 mg, 10,3 pmoles, 1,55 ml de água) foi adicionada solução tampão (0,211 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,74), DMSO (141 pl) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (5,4 mg em 54 pl de DMSO; 16,17 pmoles, 10 equivalentes) tudo a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e, depois disso, 130 pl de uma solução de cianoboroidreto de sódio (1,3 mg em 130 pl de água; 20,6 pmoles, 20 equivalentes) foram adicionados e mantidos em agitação por 2 dias a 37 O. A mistura de reação fo i diluída com tampão de fosfato (500 pl de solução 200 mM, pH = 6) antes de adicionar 80 pl
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195/233 de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com diclorometano (2x10 ml) seguida por acetato de etila (10 ml). O extrato foi transferido para um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisado usando 4 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido por 3 trocas com água (12 ml cada) para render tipo o derivado 18C DBCO. A essa solução (1,31 ml, 7,0 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (70 mg em 0,7 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. Cada amostra continha 3,5 mg de 18C DBCO e 35 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 18C oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
10,0 1,52 5469,4 1,031x3 291 5,32 81 203
3. Conjugação do derivado de PS 18C-DBCO com eCRM [0776] PS 18C-DBCO: 3,5 mg (com 35 mg de sacarose) de pó branco [0777] % de DBCO: 5,32% [0778] Concentração de CRM: 2,76 mg/ml de solução [0779] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0780] Procedimento de reação:
[0781] O derivado de 18C DBCO (3,5 mg de pó branco com 35 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,661 ml), tampão de fosfato pH 7 (0,07 ml, 0,5 M) e DMSO (0,175 ml). A solução de eCRM funcionalizado com azido (0,844 ml de solução) foi adicionada fornecendo uma razão em massa de PS18C:CRM de 1,5 1 (em p/p). A mistura de reação foi suavemente misturada antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente
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196/233 (20Ό) durante 2 horas. Em seguida, a mistura de re ação foi diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,661 ml), tampão de fosfato pH 7 (0,07 ml, 0,5 M) e DMSO (0,175 ml) para tornar a concentração final de PS-18 a 1 mg/ml e deixada reagir por 18 horas. Uma solução de azida sódica (23 μΙ, 10 mg/ml em água) foi adicionada. Após 30 min, a mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um dispositivo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G2350 60, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (polietersulfona de 0,22 μιτι, 33 mm) para render solução de conjugado PS-CRM 18C.
PS 18C- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: relação de CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
3,5 2,33 4,11 0,287 34 0,168 29,6 1,7 13,7 1,97
[0782] Exemplo 29: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 18C a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0783] PS Tipo 18C Unidade de repetição Peso Mol.: 1.012 [0784] Solução de NalÜ4 em água (10 mg/ml) [0785] Procedimento de reação:
[0786] O pó de PS-18C (20 mg, 19,76 pmoles) foi dissolvido em 3 ml de solução aquosa (solução de acetato de sódio a 10 mM, pH 4,5). A essa solução foram adicionados 63,4 μΙ de solução de NalÜ4 (0,634 mg, 2,96 pmoles, 0,15 eq). A mistura foi agitada a 23 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G235057, MWCO 20K) e, então, dialisou-se com tampão PB de 50 mm, pH 6,8 durante 24 horas (4 trocas, 600 ml cada) para render uma solução de
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PS-18C oxidado. Após a diálise, adicionou-se DMSO para produzir PS18C em DMSO a 10% com tampão PB de 50 mm, PH 6,8.
Equiv. molar de NalO4 PS 18C (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) % De oxidação (BCA) Rendimento PS (%)
0,15 20 4 3705 7,05 75
[0787] 2. Derivatização de DBCO [0788] Concentração final de PS: 3,75 mg/ml [0789] Concentração final de tampão: DMSO a 10% em PB de 50 mM (pH 6,8) [0790] Procedimento de reação:
[0791] A uma solução de PS Tipo 18C oxidado (15 mg, 14,8 pmoles,
4,4 ml em DMSO a 10% PB de 50 mM, PH 6,8), uma solução de DBCOPEG4-NH2 (7,76 mg em 77,6 μΙ de DMSO; 14,8 pmoles, 10 equivalentes) foi adicionada a 25 Ό. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 60 min e, depois disso, a solução de cianoboroidreto de sódio (0,93 mg em 93 ml de água; 14,8 pmoles, 10 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 24 horas a 25 Ό. A mistura de reação foi, então, transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-a-Lyzer G2, N°Cat. G 235057, MWCO 20K) e, em seguida, dialisada usando 4 trocas com etanol a 20% em tampão de PB de 50 mM seguido por 3 trocas com tampão de PB 50 mM para render 0 derivado de DBCO tipo 18C.
PS 18C oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivação de DBCO (μΜ) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS kDa
15 5 2460,4 75,12 3,05 83 350
[0792] 3. Conjugação do derivado de PS 18C-DBCO com eCRM [0793] PS 18C-DBCO: 6 mg (com 60 mg de sacarose) de pó branco [0794] DBCO: 3% [0795] Concentração de eCRM: 6,5 mg/ml
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198/233 [0796] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0797] Concentração final de PS: 2 mg/ml [0798] Procedimento de reação:
[0799] Adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,615 ml) a um derivado de DBCO 18C (6 mg de pó branco prédissolvido em 3 ml de água, 5,9 pmoles) fornecendo uma razão em massa de PS 18C:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (23 Ό) durante 17 horas. A mistura foi, então, colocada em uma incubadora (37 Ό) durante 3 horas. Após a reação, a mistura foi diluída 2 vezes em solução de cloreto de sódio a 0,9% e reduzida em boroidreto de sódio (1,12 mg em 112 μΙ de água; 29,64 pmoles, 50 equivalentes) durante 3 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235072, MW CO 300 K) e depois dialisada com PBS, PH 7 durante 24 horas (3 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,45 μιτι e 0,22 μιτι, polietersulfona 33 mm) para render uma solução conjugada de 18C PS-CRM.
PS 18C- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC-MALS Mda (0,22 pm filtrado)
6 4 10 0,42 70 0,15 2,65:1 14,80 8,25
[0800] Exemplo 30: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de
PS Sorotipo 19A a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0801] Pureza do PS tipo 19A: 90% (Antrona) [0802] Peso Mol.: 614,44 [0803] Solução de NalÜ4 em água (5,69 mg/ml)
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199/233 [0804] Procedimento de reação:
[0805] PS-19A (22,10 mg corrigido para 90%, 19,89 mg, 32,37 pmoles) em pó foi dissolvido em 11,05 ml de uma solução aquosa (7,73 ml de água e 3,32 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução foi adicionado 304 μΙ de solução de NaICri (1,73 mg, 8,09 pmoles, 0,25 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (10 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-19- oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 19A (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,25 22,10 2,72 11148 11,5 6,1 99,39
[0806] 2. Derivatização de DBCO [0807] Procedimento de reação:
[0808] A uma solução de PS 19A oxidado (assumir nível de oxidação a 10%) (17,14 mg, 27,9 pmoles, 2,50 ml de água) foi adicionada solução tampão (1,0 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,01), DMSO (0,4 ml) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (14,61 mg em 190 μΙ de DMSO; 27,9 pmoles, 10 equivalentes) tudo 3 25 0. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e, depois disso, 70,2 ml de uma solução de cianoboroidreto de sódio (15,6 mg em 313 μΙ de água; 55,8 pmoles, 20 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 2 dias a 25 O. A mistura de re ação foi diluída com tampão de fosfato (500 ml de 200 mM solução, pH = 6) antes de adicionar 105 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (30 kDa MWCO 6 a 12 ml) e depois dialisada com 0 uso de 6 trocas com etanol a 20% em água seguida de
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200/233 trocas com água (12 ml cada) para render o derivado de DBCO 19A. A essa solução (3,12 ml, 11,4 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (114 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,70 mg de DBCO 19A e 57 mg de sacarose para utilização na próxima reação de conjugação.
PS 19A oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
17,14 4,87 5976 0,482 x 4 197,76 3,31 105 139
[0809] 3. Conjugação de derivado de PS 19A-DBCO com eCRM [0810] PS 19A-DBCO: 5,7 mg (com 57 mg de sacarose) de pó branco [0811] % de DBCO: 3,31% [0812] Concentração de CRM: 6,5 mg/ml de solução [0813] PS: CRM (razão de entrada): 1,8:1 [0814] Procedimento de reação:
[0815] Adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,49 ml) a um derivado de DBCO 19A (5,7 mg de pó branco com 57 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS19A: CRM de 1,8:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 O) durante 18 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235060, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 19A PS-CRM.
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201/233
PS 19A- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,7 3,118 5,42 0,62 70 0,40 61 1,55: 1 25,23 1
[0816] Exemplo 31: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 19A a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0817] Pureza do PS tipo 19A: 90% (Antrona) [0818] Peso Mol.: 614,44 [0819] Solução de NaICri em água (5,45 mg/ml) [0820] Procedimento de reação:
[0821] PS-19A (20,83 mg corrigidos para 90%, 18,75 mg, 30,5 pmoles) em pó foi dissolvido em 9,5 ml de solução aquosa (6,5 ml de água e 3 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução foi adicionado 305 μΙ de solução de NalÜ4 (1,63 mg, 7,62 pmoles, 0,25 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, d epois disso, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (10 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-19A oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 19A (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,25 20,83 2,95 9858 7,2 4,2 95,32 N/D
[0822] 2. Derivatização de DBCO [0823] Procedimento de reação:
[0824] A uma solução de PS tipo 19A oxidado (presumir nível de oxidação a 17%) (17,57 mg, 28,59 pmoles, 2,90 ml de água) foi adicionada solução tampão (0,87 ml de 200 mM de tampão de fosfato, pH = 6,01), DMSO (0,7 ml) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (14,97
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202/233 mg em 306 μΙ de DMSO; 28,59 pmoles, 10 equivalentes) tudo a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O dur ante 30 min, após os quais tempo 79 ml de uma solução de cianoboroidreto de sódio (9,39 mg em 200 μΙ de água; 57,2 pmoles, 20 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 2 dias a 25 Ό. A mistu ra de reação foi diluída com tampão de fosfato (500 ml de solução 200 mM, pH = 6) antes da adição de 110 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada com o uso de 6 trocas com etanol a 20% água seguida de 3 trocas com água (12 ml cada) para render origem ao derivado de DBCO 19A. A essa solução (3,56 ml, 11,9 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (120 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,95 mg de DBCO 19A e 60 mg de sacarose para utilização na próxima reação de conjugação.
PS 19A oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
17,57 3,76 5424 0,831 x3 254,1 4,68 71 111
[0825] 3. Conjugação de derivado de PS 19A-DBCO com eCRM [0826] PS 19A-DBCO: 5,95 mg (com 60 mg de sacarose) de pó branco [0827] % DBCO: 4,68% [0828] Concentração de CRM: 6,5 mg/ml de solução [0829] PS: CRM (razão de entrada): 1,8:1 [0830] Procedimento de reação:
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203/233 [0831] Adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,51 ml) a um derivado de DBCO 19 A (5,95 mg de pó branco com 60 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS19A:CRM de 1,8:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas. A mistura foi, em seguida, colocada em um forno (37 Ό) durante 2 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235071, MWCO 100 K) e depois dialisados com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 19A PS-CRM.
PS 19A- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJD relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,95 3,305 6,821 0,53 61 0,314 65 1,68: 1 9,48 0,752
[0832] Exemplo 32: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 19F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0833] Pureza do PS tipo 19F: 90,7% (Antrona) [0834] Peso Mol.: 614,44 [0835] Solução de NalÜ4 em água (5,21 mg/ml) [0836] Procedimento de reação:
[0837] PS-19F (22,0 mg, 35,8 pmoles) em pó foi dissolvido em 13,75 ml de uma solução aquosa (11 ml de água e 2,75 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5). A essa solução foi adicionado 117 μΙ de solução de NalÜ4 (0,61 mg, 2,86 pmoles, 0,08 eq). A mistura foi agitada a 4 Ό em um frigorífico durante 17 horas e, depois disso, a amostra
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204/233 oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa de 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de tampão de fosfato 10 mM pH 6,7 para render uma solução de PS-19F oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 19F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,08 22,0 2,89 8786,24 5,56 N/D 99,39
[0838] 2. Derivatização de DBCO [0839] Procedimento de reação:
[0840] A uma solução de PS Tipo 19F oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) (13,7 mg, 22,3 pmoles, 2,50 ml de água) foi adicionada solução tampão (1,0 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,0), DMSO (0,483 ml) e uma solução de DBCO-PEG-4-NH 2 (11,68 mg em 117 μΙ de DMSO; 22,3 pmoles, 10 equivalentes) tudo 3 25 0. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e , depois disso, 70,2 ml de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2,8 mg em 280 μΙ de água; 44,6 μηποΙ, 20 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação de um dia para o outro a 25 O. A mistura de reação foi diluída com tampão de fosfato (solução de 500 ml de 200 mM, pH = 6) antes da adição de 84 μΙ de solução de boroidreto de sódio (0,01 mg/μΙ, 10 equiv) em água. Após agitação durante 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (5 x 12 ml de acetato de etila) e depois transferida para uma ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada usando 5 trocas com etanol a 20% em água seguida por três trocas com tampão de fosfato 5 mM pH 7,0 (12 ml cada) para render o derivado de DBCO 19F. A essa solução (1,11 ml, 7,0 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (70 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções de 4 mg e 3 mg cada e liofilizada para render duas amostras de pó branco. Essas amostras liofilizadas de DBCO 19F foram utilizadas na próxima reação de
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205/233 conjugação.
PS 19F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
13,7 1,92 1714 0,920x4 1714 5,14 88 93
[0841] 3. Conjugação de derivado de PS 19F-DBCO com eCRM [0842] PS 19F-DBCO: 4,0 mg (com 40 mg de sacarose) de pó branco [0843] % de DBCO: 5,14% [0844] Concentração de CRM: 5,0 mg/ml de solução [0845] PS: CRM (razão de entrada): 1,6:1 [0846] Procedimento de reação:
[0847] Adicionou-se solução de eCRM funcionalizado com azido (0,5 ml) a um derivado de DBCO 19F (4,0 mg de pó branco com 40 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS19F:CRM de 1,6:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 G) durante 18 horas seguido por 37 G durante 1 hora. Adicionou-se 42 μΙ de azida sódica (0,42 mg, 1 equivalente). Após 30 min, a mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, Cat. N° G235060, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 2 dias (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 19F PS-CRM.
PS 19F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: relação de CRM PS livre (%) SEC- MALS MDa
4,0 2,5 3,75 0,84 79 0,52 77 1,63: 1 16,55 1,89
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206/233 [0848] Exemplo 33: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 19F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0849] PS Tipo 19F Peso Mol.: 613 [0850] Solução de NalCL em água (10 mg/ml) [0851] Procedimento de reação:
[0852] O pó de PS-19F (10 mg, 16,31 pmoles) foi dissolvido em 2 ml de solução aquosa (solução de acetato de sódio a 10 mM, pH 4,5). A essa solução foram adicionados 34,9 μΙ de solução de NalCL (0,349 mg, 1,63 μιτιοΙ, 0,1 eq). A mistura foi agitada a 4 Ό durante 18 horas e, depois disso, a amostra oxidada foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N°Cat. G 235057, MWCO 20K) e, então, dialisou-se com tampão de PB 50 mm, PH 6,8 durante 24 horas (4 trocas, 600 ml cada) para render solução de PS-19F oxidado. Após a diálise, adicionou-se DMSO para fazer PS-19F em DMSO a 10% com tampão PB de 50 mm, PH 6,8.
Equiv. molar de NalÜ4 PS 19F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (M) % De oxidação (BCA) Rendimento PS (%) Nota
0,1 10 2 6769 9,0 83 N/D
[0853] 2. Derivatização de DBCO [0854] Concentração final de PS: 3,32 mg/ml [0855] Concentração final de tampão: DMSO a 10% em PB de 50 mM (pH 6,8) [0856] Procedimento de reação:
[0857] A uma solução de PS Tipo 19F oxidado (8,3 mg, 13,53 pmoles, 2,5 ml em DMSO a 10%, PB de 50 mM, PH 6,8), uma solução de PEG-DBCO4-NH2 (7,08 mg, em 70,84 ml de DMSO; 13,53 pmoles, 10 equivalentes) foi adicionada a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 60 min, após 0 qual a solução de cianoboroidreto de sódio tempo (0,85 mg em 85 ml de água; 13,53
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207/233 pmoles, 10 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 24 horas a 25 Ό. A mistura de reação foi, então, transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-a-Lyzer G2, N° Cat. G235057, MWCO 20K) e, em seguida, dialisada usando 4 trocas com etanol a 20% em tampão PB de 50 mM seguido por 3 trocas com tampão PB de 50 mM para render o derivado de DBCO 19F.
PS 19F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS KDa
8,3 4 3385 235,4 7,15 78 186
[0858] 3. Conjugação de derivado de PS 19F-DBCO com eCRM [0859] PS 19F-DBCO: 6 mg (com 60 mg de sacarose) de pó branco [0860] DBCO: 7% [0861] Concentração de CRM: 2,617 mg/ml de solução [0862] PS: CRM (razão de entrada): 2:1 [0863] Concentração final de PS: 5,2 mg/ml [0864] Procedimento de reação:
[0865] Adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (1,15 ml) a um derivado de DBCO 19F (6 mg de pó branco com 60 mg de sacarose, 9,7 μιτιοΙ) fornecendo uma razão em massa de PS 19F:CRM de 2:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (23 Ό) durante 17 horas. A mistura foi, então, colocada em uma incubadora (37 Ό) durante 3 horas. Após a reação, a mistura foi diluída 2 vezes em solução de cloreto de sódio a 0,9% e reduzida em boroidreto de sódio (1,849 mg em 184,9 μΙ de água;
48,9 μηποΙ, 50 equivalentes) durante 3 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, Cat. N°G235071, MWCO 100K) e
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208/233 depois dialisada com PBS, PH 7 durante 24 horas (3 trocas, 1.000 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 19F PS-CRM.
PS 19F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS: CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS KDa
6 3 12 0,241 48 0,166 66 1.5: 1 15,12 736 (1,05 mDa- 414 KDa)
[0866] Exemplo 34: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 20 a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0867] Pureza do tipo 20 PS: 68% (antrona) [0868] Peso mol.: 1.157,9 g mol·1 [0869] Procedimento de reação:
[0870] PS Tipo 20 (30,1 mg, 26 pmoles) em pó foi dissolvido em 15,00 ml de uma solução aquosa (11,25 ml de água e 3,75 ml de tampão de 0,2 M de acetato, pH 5,5) em um tubo de ensaio de poliestireno de 50 ml com uma barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 160 μΙ de solução de NalÜ4 (1,11 mg, 5,2 pmoles, 0,20 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em papel alumínio e colocado em banho-maria a 25 Ό. A mistura foi agitada a 25 Ό. Após 18 h, a mistura de reação foi dialisada usando três dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON ® (MWCO 30 kDa; 15 ml) por 5 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para processar solução oxidada PS-20.
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209/233
Equiv. molar de NalO4 PS 20 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) %de oxidação (BCA) % de oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,20 30,1 2,6 6254,57 59,06 10,34 63 -
[0871] 2. Derivatização de DBCO [0872] Procedimento de reação:
[0873] PS20-OX (11,7 mg, 10,1 pmoles, 1,61 ml) foi adicionado a tampão de fosfato (0,600 ml, 200 mM, pH 6,0) ao qual foi adicionado DBCO-PEG4-NH2 (1,0 eq., 523 g mol’1 em DMSO, 33 mg/ml, 160 pl) e uma quantidade adicional de DMSO (207 pl). A mistura de reação foi agitada a 25 O durante 25 minutos antes da adição de uma solução de cianoboroidreto de sódio (2 eq., 52,5 mg/ml, 24 pl) e agitou-se durante um dia. Após 0 nivelamento com 1 eq. de solução de boroidreto de sódio, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml) e borbulhada livre de solvente. O derivado de DBCO foi purificado por unidades de diálise centrífuga duas vezes (Amicon MWCO 30 kDa) usando 5 trocas com etanol a 20% em água seguido por 3 trocas com água de cada vez (12 ml cada) para render 0 derivado de 20-DBCO. A essa solução (2,09 ml, 13,65 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (136,5 mg em 1,37 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 6,0 mg de 20DBCO e 60 mg de sacarose para uso na reação de conjugação.
PS 20- OX (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona ( μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS-DBCO (%) SEC- MALS KDa
11,7 2,09 1112,43 0,336 x 4 29.04 2,6 123 610
[0874] 3. Conjugação do derivado de PS 20-DBCO com eCRM [0875] PS 20-DBCO: 5,0 mg (com 50 mg de sacarose) de pó
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210/233 liofilizado [0876] % de DBCO: 2,0% [0877] Concentração de CRM: 5,29 mg/ml de solução [0878] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0879] Procedimento de reação:
[0880] 20-DBCO foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (2,684 ml, 0,22 μιτι filtrada), tampão de fosfato (pH 7,0, 0,5 M, 0,160 ml) e DMSO (0,400 ml). Adicionou-se por gotejamento solução de azido-CRM (5,29 mg/ml, 0,756 ml) para fornecer uma relação de entrada PS20:CRM de 1,5:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de ser misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) por 36 horas . A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para um tubo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (4 trocas, 1 I cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona 33 mm) para render uma solução de conjugado 20-CRM estéril.
PS 20- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJF PS livre (%) SEC- MALS MDa
6,0 4,0 7,00 0,640 75 0,366 64 1,75: 1 LLOQ 1,224
Exemplo 35: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS
Sorotipo 22F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0881] Pureza do PS tipo 22F: 89% (Antrona) [0882] Peso Mol.: 996,88 [0883] Solução de NaICri em água (5 mg/ml) [0884] Procedimento de reação:
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211/233 [0885] Ο ρό do PS tipo 22F (30,2 mg, 30,3 pmoles) foi dissolvido em 10,5 ml de água e 4,5 ml de tampão de acetato 200 mM (pH 5,26) e 132 μΙ de solução de NalCri (0,65 mg, 3,03 pmoles, 0,1 eq) .A mistura foi agitada a 25 Ό durante 18 horas e, depois diss o, a amostra oxidada foi purificada com o uso de ultra centrífuga AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-22F oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 22F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,10 30,2 3,351 7389,41 20,02 3.3 81,73
[0886] 2. Derivatização de DBCO [0887] Procedimento de reação:
[0888] A uma solução de PS tipo 22F oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) (7,0 mg, 7,02 pmoles, 0,956 ml de água) foi adicionada solução tampão (0,525 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,0), DMSO (151 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (3,67 mg em 112 μΙ de DMSO; 7,02 pmoles, 10 equivalentes) tudo 3 25 0. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e , depois disso, 17 ml de uma solução de cianoboroidreto de sódio (0,88 mg em 17 μΙ de água; 14,06 pmoles, 20 equivalentes) foi adicionada e mantida em agitação durante 2 dias a 25 O. A mistura de reação foi dil uída com tampão de fosfato (250 ml de solução 200 mM, pH = 6) antes de adicionar 9 μΙ de solução de boroidreto de sódio (31 mg/ml, 10 equiv) em água. Após 30 min, a mistura de reação foi extraída com acetato de etila (4x5 ml). O extrato foi transferido para um filtro ultra centrífugo AMICON (MWCO 100 kDa 6 a 2 ml) e depois dialisado usando 6 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido por 3 trocas com água (12 ml cada). SECHPLC mostra DBCO livre, portanto, a amostra foi redialisada usando 3 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido por 3 trocas
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212/233 com água (12 ml cada) para render o derivado de DBCO tipo 22F. A essa solução (2,35 ml, 5,2 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (52 mg em 0,520 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. A amostra continha 2,4 mg e 2,8 mg de 22F DBCO e 24 mg e 28 mg de sacarose, respectivamente, para utilização na próxima reação de conjugação.
PS 22F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
7,0 2,53 739,74 0,144x3 27,57 1,24 80 844
[0889] 3. Conjugação de derivado de PS 22F-DBCO com eCRM [0890] PS 22F-DBCO: 2,4 mg (com 24 mg de sacarose) de pó branco [0891] % de DBCO: 1,24% [0892] Concentração de CRM: 4 mg/ml de solução [0893] PS: CRM (razão de entrada): 1,4:1 [0894] Procedimento de reação:
[0895] O derivado DBCO 22F (2,4 mg de pó branco com 24 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (0,075 ml). Uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,142 ml de solução) foi adicionada fornecendo uma razão em massa de PS22F:CRM de 1,4:1 (em p/p). A mistura de reação foi suavemente misturada antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 48 horas. Uma solução de azida sódica (16 μΙ, 10 mg/ml em água) foi adicionada. Após 30 min, a mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um dispositivo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, NQ Cat. G235060, MWCO 300 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (5 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através
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213/233 de um Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render solução conjugada 22F PS-CRM.
PS 22F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
2,4 1,71 3,834 0,29 55 0,37 49 1,53 20,6 2,42
[0896] Exemplo 36: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 23F a urn eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0897] Pureza do PS tipo 23F: 85% (Antrona) [0898] Peso Mol.: 792,62 [0899] Solução de NalÜ4 em água (5,86 mg/ml) [0900] Procedimento de reação:
[0901] PS-23F (20,21 mg corrigidos para 85%, 17,18 mg, 26,7 pmoles) em pó foi dissolvido em 10 ml de solução aquosa (7,5 ml de água e 2,5 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH = 5,5).A essa solução foi adicionado 119 μΙ de solução de NalÜ4 (0,695 mg, 4,0 pmoles, 0,15 eq). A mistura foi agitada a 25 Ό durante 4 horas. A am ostra oxidada foi, então, purificada usando um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) 6 trocas (12 ml) de água de grau HPLC para render uma solução de PS-23F oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 23F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,15 20,21 2,41 7967 4,11 3,51 88 N/D
[0902] 2. Derivatização de DBCO [0903] Procedimento de reação:
[0904] A uma solução de PS tipo 23F oxidado (presumir nível de
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214/233 oxidação a 10%) (13,51 mg, 17,0 pmoles, 2,14 ml de água) foi adicionada solução tampão (0,85 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,01), DMSO (310 pl) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (8,93 mg em 170 pl de DMSO; 17,0 pmoles, 10 equivalentes) tudo a 25 O. A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e, depois disso, foram adicionados 42 de pl uma solução de cianoboroidreto de sódio (6,1 mg em 120 de água; 34,0 pmol, 20 equivalentes) e mantidos sob agitação durante 2 dias a 25 Ό. A mistura de reação foi extraída com acetato de etila (3 x 20 ml de acetato de etila) e depois transferida para um filtro de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisada usando 6 trocas com etanol a 20% (12 ml cada) em água seguido por 3 trocas com água (12 ml cada) para render 0 derivado de DBCO tipo 23F. A essa solução (7,58 ml, 13,8 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (138 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render três amostras de pó branco. Cada amostra continha 6,9 mg de 23F DBCO e 69 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 23F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
13,51 7,61 2292 0,601 x2 116,98 5,1 102 361
[0905] 3. Conjugação de derivado de PS 23F-DBCO com eCRM [0906] PS 23F-DBCO: 6,90 mg de pó branco com 69 mg de sacarose [0907] % de DBCO: 5,1% [0908] Concentração de CRM: 2,617 mg/ml de solução [0909] PS: CRM (razão de entrada): 2:1 [0910] Procedimento de reação:
[0911] Solução de eCRM funcionalizado com azido (1,32 ml de
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215/233 solução) foi adicionada ao derivado de DBCO 23F (6,90 mg de pó branco com 69 mg de sacarose) fornecendo uma razão em massa de PS23F:CRM de 2:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente com a mão antes de misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 17 horas. A mistura foi, então, colocada em um forno (37 Ό) durante 3 horas. A mistura conjugada de PS-CRM foi transferida para um filtro de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235071, MWCO 100 K) e depois dialisada com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 24 horas (3 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro Millex-HV (0,45 pm, polietersulfona 33 mm) para render uma solução conjugada de 23F PS-CRM.
PS 23F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
6,90 3,45 5,65 0,87 71 0,422 69 2,06: 1 23,62 1,4
[0912] Exemplo 37: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 33F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0913] Pureza do PS tipo 33F: 75% (Antrona) [0914] Peso Mol.: 973 [0915] Procedimento de reação:
[0916] PS Tipo 33F (34,0 mg, 35,0 pmoles) em pó foi dissolvido em 17,0 ml de solução aquosa (12,0 ml de água e 5,0 ml de tampão de 0,2 M de acetato, pH 5,5) em um tubo de ensaio de poliestireno de 50 ml com uma barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 59 μΙ de solução de NalÜ4 (1,49 mg, 7,0 pmoles, 0,20 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em papel alumínio e colocado em banho-maria 3 4 0. A mistura foi agitada a 4. Após 18 h,
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216/233 a mistura da reação foi dialisada usando três dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON ® (MWCO 100 kDa; 15 ml) por 4 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para tornar solução de PS 33Foxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 33F (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,20 34,0 2,74 4637,58 47,90 7,62 36
[0917] 2. Derivatização de DBCO [0918] Procedimento de reação:
[0919] A uma solução de PS tipo 33F oxidado (11,2 mg, 11,51 pmoles, 2,49 ml), foram adicionadas uma solução tampão (0,114 ml de tampão de fosfato 0,5 M pH 6,0) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (6,039 mg em 200 μΙ de DMSO 6,33 pmoles, 0,55 eq.). A mistura de reação foi agitada a 25 durante 30 min e, depois disso, foram adicionados 63 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (4,5 mg em 100 de água; 34,54 μηποΙ, 2,0 eq). A mistura de reação foi envolvida em folha de alumínio e mantida em agitação em um banho de água regulado para 25 Ό durante 2 dias. A reação foi pa rada no segundo dia pela adição de 44 μΙ de uma solução de boroidreto de sódio (3,12 mg em 312 de água; 11,51 μηποΙ, 1,0 eq). Após agitação durante 30 minutos, a mistura de reação foi extraída com diclorometano (3x10 ml) seguida por acetato de etila (3x10 ml). O extrato foi borbulhado com N2 durante 20 minutos para remover 0 acetato de etila residual e, então, foi transferido para dois dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 100 kDa; 15 ml). A diálise foi realizada através da realização de três trocas com uma solução de DMSO a 3% (15 ml cada), seis trocas com uma solução de etanol a 20% (15 ml cada) e três trocas com água HPLC (15 ml cada) para render 0 derivado de 33F DBCO. A
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217/233 essa solução (1,23 ml, 4,0 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (40 mg, 0,4 ml de água). Essa solução combinada foi liofilizada para render um pó branco fino. A amostra de PS33F DB foi armazenada a
4Ό até ser necessária para a reação de conjugação.
PS 33F Vol. após Antrona (μΜ) Derivatização Derivação Incorporação Rendimento SEC-
oxidado purificação de DBCO 309 de DBCO DBCO de PS-DBCO MALS
(mg) (ml) nm Abs (μΜ) (%) (%) kDa
11,2 2,44 1112,4 0,390 32,85 3,0 71 1290
[0920] 3. Conjugação de derivado de PS 33F-DBCO com eCRM [0921] PS 33F-DBCO: 4 mg (com 40 mg de sacarose) de pó branco [0922] % de DBCO: 3,0% [0923] Concentração de CRM: 6.009 mg/ml de solução [0924] PS: CRM (razão de entrada): 1,5:1 [0925] Procedimento de reação:
[0926] O derivado de DBCO 33F (4,0 mg de pó branco com 40 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (5,32 ml), tampão de fosfato pH 7 (0,267 ml, 0,5 M) e DMSO (0,667 ml). Adicionou-se uma solução de eCRM funcionalizado com azido (solução a 0,445 ml) fornecendo uma razão em massa de PS33F:CRM de 1,5:1 (em p/p). A mistura de reação foi misturada suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 19 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 50 μΙ). A mistura de reação foi, então, diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% (7,0 ml) e transferida para um dispositivo de diálise prélavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, Cat. N°G2350 60, MWCO 300 K). A amostra foi submetida à diálise em solução de cloreto de sódio a 0,9% por 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona de 33 mm) para render solução conjugada de 33F PS-CRM.
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PS 33F- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS MDa
4,0 2,67 7,82 0,545 106 0,212 62 2,57 LLOQ 1,87
[0927] Exemplo 38: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 7F a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0928] Pureza do PS tipo 7F: 86% (antrona, CRB-21-20) [0929] Peso mol.: 1.227 g mol’1 [0930] Procedimento de reação:
[0931] O polissacarídeo nativo (19,5 mg, corrigido para 86%, 16,8 mg, 13,7 mmoles) foi dissolvido em 3,9 ml de água. A essa solução foram adicionados 4,58 ml de água e 0,293 ml de tampão de acetato de sódio (1,5 M, pH 5,4). Em seguida, 30 μΙ de solução de periodato de sódio (300 pg, 1,4 μιτιοΙ, 0,1 eq) foram adicionados à solução de agitação. A reação foi agitada a 22 Ό durante 3 ho ras. O PS oxidado foi, então, concentrado duas vezes com o uso de um concentrador de rotação (MWCO 30 kDa Amicon). O concentrado de PS foi, então, trocado por tampão em água usando colunas de filtração em gel (GE Healthcare PD-10, método de rotação).
Equiv. molar de NalO4 PS 7F (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%) Nota
0,1 16,8 4,0 3260 6,2 n/d 95 N/D
[0932] 2. Derivatização de DBCO [0933] Procedimento de reação:
[0934] A 7F-OX (1,9 ml de 4,0 mg/ml; 7,6 mg; 6,2 pmoles) foi adicionado 0,15 ml de fosfato de sódio (1 M, pH 6,3). Em seguida, 0,23 ml de DBCO-PEG4-NH2 (27,1 mM em DMSO, lote 1730; 6,2 pmoles, 1,0
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219/233 eq) foi adicionado à solução em agitação. Após 5 min de agitação, 0,039 ml de NaCNBHs (20 mg/ml em água; 12,4 pmoles, 2,0 eq) foi adicionado à solução em agitação. A reação foi agitada a 22 Ό durante 40 horas. À solução foi, então, adicionado 0,024 ml de boroidreto de sódio (10 mg/ml em água; 6,3 pmoles, 1,0 eq). Após 15 min de agitação, o PS foi purificado por troca de tampão em água através de colunas de filtração em gel (Thermo Zeba Columns, MWCO 40 kDa).
PS 7F oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de antrona (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO ( μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
7,6 2,3 2282 0,14x2 111 4,8 85 175
[0935] 3. Conjugação do derivado de PS 7F-DBCO com eCRM [0936] PS 7F-DBCO: 2,8 mg (2,8 mg/ml em água) [0937] % de DBCO: 4,8% [0938] Concentração de CRM: 4,7 mg/ml de solução [0939] PS: CRM (razão de entrada): 1,6:1 [0940] Procedimento de reação:
[0941] A 7F-DBCO (1 ml de 2,8 mg/ml em água) em um tubo de centrífuga de 5 ml foi adicionado 0,128 ml de fosfato de potássio (0,5 M, pH 7,5). A essa solução foi, então, adicionado 0,372 ml de eCRM funcionalizado com azida (4,7 mg/ml em fosfato de potássio 20 mM, pH 7,1, sacarose a 7,5%), fornecendo assim uma razão em massa de entrada de 1,6:1 (em p/p). A solução foi colocada em um oscilador orbital e oscilada (de modo que a solução tenha se movido de ponta a ponta do tubo) por 16 horas a 22 Ό. O conjugado fo i, então, dialisado para cloreto de sódio a 0,9% usando uma membrana de diálise de 300 kDa (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, 1 ml) durante 48 horas com alterações no dialisado (500 ml) após 1 hora e 4 horas. A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa (Pali Acrodisc Supor,
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0,22 μιτι, 13 mm de diâmetro) para render uma solução conjugada de 7F-CRM.
[0942] Exemplo 39: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 1 a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0943] Pureza do PS tipo 1: 80% (ensaio de ácido urônico) [0944] Peso mol.: 625 g mol’1 [0945] Procedimento de reação:
[0946] O polissacarídeo nativo (20,2 mg, 32,32 pmoles) foi dissolvido em 9,5 ml de solução aquosa (7,0 ml de água e 2,5 ml de tampão de acetato, 200 mM, pH 5,24). A essa solução foram adicionados 492 μΙ de solução de periodato de sódio (3,45 mg, 16,16 pmoles, 0,5 eq). A mistura foi agitada a 25 O durante 18 horas. O PS oxidado foi purificado com o uso de diálise centrífuga de PMCO 30 kDa Amicon com o uso de 6 trocas com água para render uma solução purificada de PS-1.
Equiv. molar de NalO4 PS 1 (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio urônico (M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,50 20,2 2,61 10777,6 2,3 2,16 87
[0947] 2. Derivatização de DBCO [0948] Procedimento de reação:
[0949] A uma solução de PS tipo-1 oxidado (presumir nível de oxidação a 10%) (16 mg, 25,6 μιτιοΙ, 2,4 ml de água) adicionou-se uma solução tampão (tampão de fosfato 0,424 ml de 500 mM, pH = 6,74), DMSO (572 μΙ) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (13,4 mg em 134 μΙ de DMSO; 25,6 μιτιοίβε, 10 eq). A mistura de reação foi, então, agitada a 25 O durante 30 min e, depois disso, foram adiei onados 32 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (3,2 mg em 32 μΙ de água; 51,2 μιτιοίβε, 20 eq) e mantidos em agitação durante 3 dias a 250.
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Adicionou-se uma solução tampão (0,300 ml de tampão de fosfato 200 mM, pH = 6,0) seguido de boroidreto de sódio (0,97 mg em 100 μΙ, 25,6 pmoles, 10 eq) e agitou-se durante 30 min a 25 Ό. A mistura de reação foi extraída com diclorometano (4x5 ml). O extrato aquoso foi transferido para dois filtros de ultra centrífuga AMICON (MWCO 30 kDa 6 a 12 ml) e depois dialisado usando 5 trocas com etanol a 20% em água (12 ml cada) seguido de 3 trocas com DMSO a 3% em água (12 ml cada), 3 trocas com cloreto de sódio a 0,9% e 3 trocas com água para render o derivado DBCO tipo 1. A essa solução (1,37 ml, 10,0 mg) foi adicionada uma solução de sacarose (100 mg em 1 ml de água). A solução combinada foi dividida em duas porções iguais e cada uma foi liofilizada para render duas amostras de pó branco. Cada amostra continha 5,0 mg de 1-DBCO e 50 mg de sacarose para uso na próxima reação de conjugação.
PS 1 oxidado (mg) Vol. após purificação (ml) Ensaio de ácido urônico (μΜ) Derivatização de DBCO 309 nm Abs Derivatização de DBCO (μ M) Incorporação DBCO (%) Rendimento de PS- DBCO (%) SEC- MALS kDa
16 2.0 2909,0 0,784 x 4 290,19 2,5 91 315
[0950] 3 Conjugação do derivado de PS 1-DBCO com eCRM [0951] PS 1-DBCO: 5,0 mg (com 50 mg de sacarose) de pó liofilizado [0952] % de DBCO: 2,5% [0953] Concentração de CRM: 4,86 mg/ml de solução [0954] PS: CRM (razão de entrada): 1,7:1 [0955] Procedimento de reação:
[0956] O pó liofilizado do DBCO tipo-1 (5 mg) foi dissolvido em uma solução de cloreto de sódio a 0,9% filtrado (5,39 ml) e tampão de fosfato (250 ml, 0,5 M, pH 7,0). Uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,47 ml) foi adicionada para fornecer uma razão em massa de
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222/233 entrada de PS-1:CRM de 1,7:1 (em p/p). A solução foi muito suavemente misturada à mão antes de se misturar suavemente em um agitador orbital à temperatura ambiente (20 Ό) durante 18 horas. A reação click foi extinta pela adição de solução de azida sódica (10 mg/ml, 52 μΙ). O conjugado de CRM foi transferido para tubos de diálise pré-lavados (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, MWCO 300 K, 10 ml) e depois dialisado com solução de cloreto de sódio a 0,9% durante 48 horas (8 trocas, 800 ml cada). A solução dialisada foi filtrada através de um filtro de seringa Millex-GP (0,22 pm, polietersulfona de 33 mm) para render uma solução conjugada de 1-CRM.
PS 1- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Ácido Urônico (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) PS: CRM CJD relação PS livre (%) SEC- MALS MDa
5,0 2,94 6,47 0,56 72 0,283 62 1,98: 1 8,25 1,02
[0957] Exemplo 40: Preparação de Conjugados Pneumocócicos de PS Sorotipo 10A a um eCRM da Tabela 2
1. Oxidação [0958] PS Sorotipo 10A lote n* 63662302 (ATCC) [0959] Pureza PS 10A: 77% (Antrona) [0960] Mol. em peso: 1.013 kDa (Unidade de Repetição = 1.227 g/mol) [0961] Procedimento de reação:
[0962] O pó de PS Tipo 10A (25,99 mg, 21,18 pmoles) foi dissolvido em 12,995 ml de solução aquosa (9,746 ml de água e 3,249 ml de tampão de acetato 0,2 M, pH 5,5) em um tubo de amostra de poliestireno de 50 ml com barra de agitação. Uma vez que o PS foi solubilizado, adicionou-se 135 μΙ de solução de NalÜ4 (0,27 mg, 1,26 pmol, 0,06 equiv. molar). O tubo de reação foi envolvido em papel alumínio e colocado em uma refrigerador para agitação a 4 O. Após 45 minutos, a
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223/233 mistura da reação foi dialisada usando três dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml) de 6 trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render uma solução de PS-10A oxidado.
Equiv. molar de NalO4 PS 10A (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (μ M) % De oxidação (BCA) % De oxidação (ensaio de aldeído) Rendimento PS (%)
0,06 25,99 2,381 6757,20 16,58 3,13 76
[0963] 2. Derivatização de DBCO [0964] Procedimento de reação:
[0965] A uma solução de PS tipo 10A oxidado (18,15 mg, 14,79 pmoles, 3,371 ml), Foram adicionadas uma solução tampão (0,259 ml de tampão de fosfato 0,5 M pH 6,0), DMSO (0,145 ml) e uma solução de DBCO-PEG4-NH2 (7,7 mg em 154 μΙ de DMSO, 14,79 μιτιοΙ, 1 equiv. molar). A mistura de reação foi agitada a 4 O dura nte 30 min e, depois disso, foram adicionados 101 μΙ de uma solução de cianoboroidreto de sódio (1,9 mg em 101 de água, 2 equiv. molar). A mistura de reação foi envolvida em folha de alumínio e mantida em agitação em um refrigerador a 4 O durante 2 dias. A reação foi pa rada no segundo dia pela adição de 85 μΙ de uma solução de boroidreto de sódio (0,56 mg; 14,79 μηποΙ, 1 equiv. molar). Após agitação durante 30 minutos, a mistura de reação foi extraída com diclorometano (3x15 ml). O extrato foi borbulhado com N2 durante 15 minutos para remover diclorometano residual e foi, então, transferido para um dispositivo de filtro de centrífuga Ultra-15 AMICON® (MWCO 30 kDa; 15 ml). A diálise foi realizada através da realização de três trocas com uma solução de 3% de DMSO (15 ml cada), três trocas com solução de etanol a 20% (15 ml), duas trocas com solução de cloreto de sódio a 0,9% e duas trocas com água de grau HPLC (15 ml cada) para render 0 derivado de DBCO 10A. A essa solução (3,371 ml, 15,06 mg) foi adicionada uma solução
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224/233 de sacarose (150,6 mg em 1,506 ml de água). Essa solução combinada foi dividida em três frações iguais e cada uma foi liofilizada para render um pó branco fino. Após a liofilização, todas as frações foram armazenadas a 4 O até serem necessárias para a reação de conjugação.
PS 10A Vol. após Antrona (μΜ) Derivatização Derivação Incorporação Rendimento SEC-
oxidado purificação de DBCO 309 de DBCO DBCO de PS-DBCO MALS
(mg) (ml) nm Abs (μΜ) (%) (%) kDa
18h15 3,371 1290,30 0,333 27,21 2,1 88 540
3. Conjugação do derivado de PS 10A-DBCO com eCRM [0966] PS 10A-DBCO: 5,20 mg (com 52,0 mg de sacarose) de pó liofilizado [0967] % de DBCO: 2,1% [0968] CRM: 4,962 mg/ml em histidina 20 mM pH 7,1 (sacarose a 7,5%) [0969] PS: CRM (razão de massa de entrada): 1,25:1 [0970] Procedimento de reação:
[0971] O derivado de DBCO 10A (5,2 mg de pó branco com 52,0 mg de sacarose) foi dissolvido em solução de cloreto de sódio a 0,9% (1,502 ml), tampão de fosfato pH 7 (0,104 ml, 0,5 M) e DMSO (0,156 ml). Foi adicionada uma solução de eCRM funcionalizado com azido (0,838 ml de solução) fornecendo uma razão em massa de PS10A:CRM de 1,25:1 (em p/p). A mistura de reação, a uma concentração de 2,0 mg/ml de PS, foi suavemente misturada em um agitador orbital à temperatura ambiente (22 O) durante 2 horas. A mistura de reação foi, então, diluída para 1,0 mg/ml e deixada em agitação a 22 Ό durante mais 20 horas. A reação de conjugação foi terminada com a adição de azida sódica (7,5 mg, 115 pmol). A mistura de reação foi, então, diluída com solução de cloreto de sódio a 0,9% a um volume final de 7 ml e transferida para um dispositivo de diálise pré-lavado (SpectrumLab Float-A-Lyzer G2, N° Cat. G235060, MWCO 300 K). A amostra foi
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225/233 submetida à diálise em solução de cloreto de sódio a 0,9% por 48 horas (2 trocas, 1 I cada; troca 1,4 I). A solução dialisada foi filtrada através de um Millex-GP (0,22 μιτι, polietersulfona de 33 mm) para render a solução de conjugado PS-CRM 10A.
PS 10A- DBCO (mg) CRM (mg) Vol. após purificação (ml) Antrona (mg/ml) Recuperação de PS (%) BCA (CRM) (mg/ml) Recuperação de CRM (%) Razão de PS:CRM CJD PS livre (%) SEC- MALS (MDa)
5,20 4,16 8,21 0,553 87 0,229 45 2.4: 1 17,71 1,047
Exemplo 41: Avaliação da incorporação de DBCO-PEG 4-amina e
DBCO-amina em polissacarídeos pneumocócicos [0972] Uma variedade de polissacarídeos pneumocócicos foi oxidada como descrito acima e reagida com DBCO-PEG 4-amina (DBCO ou DB) ou DBCO-amina (DBCA ou DA) sob as mesmas condições para determinar o efeito do ligante na eficiência de incorporação. A tabela abaixo mostra que em todos menos um dos sorotipos testados, DBCO-amina incorpora a uma eficiência mais elevada, em comparação com PEG-DBCO4-amina por 100 unidades de polissacarídeos de repetição.
Amostra Oxidada PS Amostra PS DB/DA Condições de Reação DB/DA Incorporação de DBCO/DBCA % % De rendimento de DB/DA-PS Tamanho DB/DA-PS, kDa
5-OX 5-DB (15,5 mg) 5 mg/ml, 1 eq de DBCO, 10% de DMSO, Phos. Tampão 50 mM, pH 6,7, 25C,3d 4,9 89
5-DA (15,5 mg) 5 mg/ml, 1 eq de DBCA, 10% de DMSO, Phos. Tampão 50 mM, pH 6,7, 25C,3d 8,3 83
9V-OX 9V-DB (17,1 mg) 5,0 mg/ml, 2d, fosfato de fosfato 50 mM, pH 6,0, 1 eq mol. DBCO, DMSO a 15%, 25 0 3,9 56
9V-DA 5,0 mg/ml, 2d, fosfato de 6 80
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Amostra Oxidada PS Amostra PS DB/DA Condições de Reação DB/DA Incorporação de DBCO/DBCA % % De rendimento de DB/DA-PS Tamanho DB/DA-PS, kDa
(17,1 mg) fosfato 50 mM, pH 6,0, 1 eq mol. DBCA, DMSO a 15%, 25 0
14-ΟΧ 14-DB (15,65 mg) 5,0 mg/ml, tampão de fosfato 50 mM, pH 6,7, 1,0 mol. eq. DBCO, DMSO a 15%, 25 0, 48h 8 80
14-D A (15,65 mg) 5,0 mg/ml, tampão de fosfato 50 mM, pH 6,7, 1,0 mol. eq. DBCA, DMSO a 15%, 25 0, 48h 4,6 67
23F-OX 23F-DB (22,3 mg) 4 mg/ml, 48 h, 100 mM pH 6,0, 0,8 eq DBCO, DMSO a 15%, 25 0 5,5 68
23F-DA (22,3 mg) 4 mg/ml, 48 h, 100 mM pH 6,0, 0,8 eq DBCA, DMSO a 15%, 25 0 7,5 63
22F-OX 22F-DB (7,0 mg) 2 mg/ml, 1 eq de DBCO, 15% de DMSO, pH 6, 25 O 48 h. 0,8 101
22F-DA (7,0 mg) 2 mg/ml, 1 eq de DBCA, 15% de DMSO, pH 6, 25 O 48 h.Purificação Ppt. 4,3 104
22F-OX 22F-DB (7,0 mg) 4 mg/ml, 1 eq de DBCO, 15% de DMSO, pH 6, 25 O 48 h. 1,2 80 838
22F-DA (14,0 mg) 4 mg/ml, 1 eq de DBCA, 15% de DMSO, pH 6, 25 O 48 h.Purificação Ppt. 4,3 73 790
10Α-ΟΧ 10A-DB (14,60 mg) 7 mg/ml, DMSO a 10%, fosfato de fosfato a 50 mM, pH 6,0, 1 eq. DBCO, 4 0, 2d 1,5 88
10 A-D A (14,60 7 mg/ml, DMSO a 10%, fosfato de fosfato a 50 3,8 82
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Amostra Oxidada PS Amostra PS DB/DA Condições de Reação DB/DA Incorporação de DBCO/DBCA % % De rendimento de DB/DA-PS Tamanho DB/DA-PS, kDa
mg) mM, pH 6,0, 1 eq. DBCA, 4 0, 2d
7F-OX 7F-DB (12 mg) 2,9 mg/ml 1 eq DBCO (lote n°1730), fosfato 99 mM pH 6,3, 21 h a 10%, DMSO a 10% 1,9 78 160
7F-DA (12 mg) 2,9 mg/ml 1eq DBCA (lote n°1818), fosfato 99 mM pH 6,3, 21 h a 10%, DMSO a 10% 4,5 76 177
[0973] Exemplo 42: Comparação de conjugação de DBCO-PEG4amina e DBCO-amina a eCRM [0974] Os polissacarídeos pneumocócicos ligados a DBCO-PEG4amina (DB) ou DBCO-amina (DA) foram conjugados ao mesmo eCRM da Tabela 2 sob condições de reação idênticas ao longo das linhas dos Exemplos acima para avaliar 0 efeito do ligante na eficiência de conjugação. A Tabela abaixo mostra que os conjugados formados com polissacarídeo ligado a DBCO-amina geralmente resultam em menos polissacarídeo livre e maior tamanho de conjugado.
DBCO PS Escala PS (mg) PS conc. mg/ml Conc. de Prot. Mg/ml Razão de entrada Condições de Reação Conjugação % De rendimento (PS) Razão de PS:Prot PS livre Tamanho do Conjugado MDa
22F- DB 2,4 3,2 2,3 1,4 3,2 mg/ml, 10% de DMSO, 48 h, ta, diálise de 300 KDa, filtro Millex-GP 53 1,5 20,5 3,6
22F- DA 2 3,2 2,3 1,4 3,2 mg/ml, 10% de DMSO, 48 h, ta, diálise de 300 KDa, filtro 37 1,7 LLOQ <9,2% 6,2
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DBCO PS Escala PS (mg) PS conc. mg/ml Conc. de Prot. Mg/ml Razão de entrada Condições de Reação Conjugação % De rendimento (PS) Razão de PS:Prot PS livre Tamanho do Conjugado MDa
Millex-GP
7F-DB 4 2,6 1,6 1,6 2,6 mg/ml, 18h, RT, diálise de 300 kDa, filtro Millex-MP 94 2 31 1,3
7F-DA 4 2,6 1,6 1,6 2,6 mg/ml, 18h, RT, diálise de 300 kDa, filtro Millex-MP 84 2 14 1,8
[0975] Exemplo 43: Imunogenicidade de conjugados pneumocócicos de PS sorotipo-eCRM [0976] Experimentos foram conduzidos para determinar as respostas totais de anticorpo IgG e OPA funcional em camundongos ou coelhos após a administração de uma variedade de conjugados pneumocócicos de polissacarídeo-eCRM monovalentes produzidos de acordo com a presente descrição. Os ensaios de atividade de opsonofagocítica (OPA) foram utilizados para medir anticorpos funcionais em soros murinos específicos para vários sorotipos de S. pneumonia. As medições de OPA foram baseadas em Moon H. Nahm & Robert L. Burton, Protocol for opsonophagocytic killing assay for antibodies against Group B Streptococcus (UAB GBS OPA), Versão B.04, Março de 2016 (Versão Original A.01 publicada em setembro de 2011) (www.vaccine.uab.edu/uDloads/mdocs/UAB-GBS-OPA.Ddf) e Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay (UAB-MOPA) para antibodies against Streptococcus pneumoniae Versão E.02, Dezembro de 2014 (www .vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf). A Figura 3 mostra a atividade opsonofagocítica (OPA) após administração de conjugados de polissacarídeo pneumocócico-eCRM monovalente
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229/233 em camundongos. O anticorpo polissacarídeo de ligação total (IgG) específico para cada polissacarídeo pneumocócico também foi medido de acordo com os métodos descritos em Yu et al., Development of an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcus pneumoniae Clin Vaccine Immunol .2011, 18(11): 1.900 a 1.907. A Figura 4 mostra respostas de IgG após administração de conjugados de polissacarídeo pneumocócico-eCRM monovalente em camundongos.
[0977] Tal como resumido nas tabelas abaixo, cada conjugado testado provocou respostas de anticorpos IgG e funcionais em camundongos ou coelhos que eram comparáveis ou superiores aos resultados de OPA e IgG mostrados nas Figuras 3 e 4
PS Tipos Imunogenicidade Em camundongos PS Tipos Imunogenicidade em camundongos ou coelhos
IgG OPA IgG OPA
1 22 F y y
3 33 F y y
4 15B y y
5 2 y y
6A 9N y y
6B 11A y y
7F 12F y y
9V 20 y y
14 10A y y
18C 8 y y
19A 17F y y
19F
23 F
[0978] Foi preparada uma combinação de conjugados para cada um dos 24 sorotipos pneumocócicos 1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11 A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F 20, 22F, 23F e 33F com o uso do derivado de CRM197 de SEQ ID NO: 9 como o veículo em cada
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230/233 conjugado. A imunogenicidade dessa composição foi testada usando um esquema de 3 doses em grupos de 7 coelhos. Foi também comparado com a vacina 13-valente conjugada Prevnar™ e com a vacina 23-valente não conjugada Pneumovax™, à qual foi adicionado o polissacarídeo sorotipo 6A não conjugado foi adicionado para auxiliar a comparação. As três composições tinham doses equivalentes de polissacarídeo por sorotipo (exceto para 6B, onde Prevnar™ inclui uma dosagem dupla), que envolvia a diluição de Prevnar™ e de Pneumovax™. Todas as três composições incluíam 60 pg de adjuvante de fosfato de alumínio por dose, o que envolve a adição do adjuvante a Pneumovax™.
[0979] As técnicas de conjugação reveladas no presente documento levaram a uma composição com uma quantidade menor de veículo CRM197 do que na vacina Prevnar-13™ aprovada, ao mesmo tempo que incluiu polissacarídeos capsulares de 11 sorotipos adicionais. A razão entre o peso total de polissacarídeo capsular e CRM197 na composição conjugada 24-valente foi cerca de o dobro daquela observada em 13-valente Prevnar™.
[0980] As respostas após a terceira dose são mostradas na Figura 5 (respostas de IgG) e na Figura 6 (respostas de OPA). Como esperado, as respostas usando as duas vacinas conjugadas foram muito maiores do que com a vacina não conjugada. Além disso, as respostas de IgG e OPA usando a vacina 24-valente foram comparáveis àquelas obtidas com Prevnar-13™ nos sorotipos cobertos pela vacina aprovada, mas também foram superiores aos 11 sorotipos que não estão incluídos na Prevnar-13. Surpreendentemente, não houve evidência de supressão epitópica induzida por veículo.
[0981] Exemplo 44: Preparação de uma vacina conjugada para periodontite [0982] Prepara-se uma vacina contra Porphyromonas gingival is
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231/233 conjugando polissacarídeos capsulares (CPS) dos sorotipos K1, K2, K3, K4, K5 e/ou K6 de P. gingivalis a uma proteína veículo de eCRM conforme disposto a seguir.
[0983] P. gingivalis é cultivada e manipulada por qualquer método adequado. Consulte, por exemplo, Huang et al., Mol Oral Microbiol. 30: 438 a 450 (2015). CPS são purificados por qualquer método de escolha. Consulte, por exemplo, Gonzalez etal., Infect.lmmun. 71: 2.283 a 2.287 (2003); Schifferle et al, J. Immunol .143: 3.035 a 3.042 (1989); Pantosti et al., Infect.lmmun. 59: 2.075 a 2.082 (1991). Resumidamente, a P. gingivalis é coletada por centrifugação, enxaguada com solução salina, suspensa em água e submetida à extração com água-fenol quente. A fase aquosa é coletada, extraída com éter e dialisada contra água filtrada estéril. O material aquoso é ajustado a pH 5,5 e digerido de um dia para o outro com um coquetel de nuclease consistindo em DNase I e RNase A (Sigma). O pH é ajustado para neutralidade e a proteinase K (1 mg/ml; Sigma) é adicionada à amostra e incubada de um dia para o outro a 37 Ό com agitação suave. Em seguida, uma segunda digestão com proteinase K é realizada e o carboidrato resultante é concentrado usando uma membrana de corte de peso molecular 10.000. O CPS é precipitado com etanol frio, suspenso em tampão de desoxicolato e isolado com o uso de uma coluna de filtração em gel S-400 (Pharmacia, Uppsala, Suécia). As frações contendo CPS de massa molecular elevada (via SEC-MALS) são reunidas e as frações que contêm LPS são descartadas. As frações reunidas são concentradas, precipitadas, dialisadas e liofilizadas.
[0984] A uma solução de polissacarídeo tamponada adiciona-se X equivalentes molares (unidade de repetição de polissacarídeo; X determinado por varredura) de tetrafluoroborato de 1-ciano-4dimetilaminopiridínio (CDAP; de solução a 100 mg/ml em acetonitrila) com agitação vigorosa. Cinco minutos após a adição de CDAP,
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232/233 adiciona-se 0,5 equivalente molar do ligante dibenzociclo-octilamina (da solução de reserva de DMSO). Após uma hora adicional, adiciona-se glicina para extinguir quaisquer ésteres de cianato que não reagiram. Alternativamente, o CPS pode ser modificado usando periodato ou química TEMPO/NCS. O polissacarídeo derivado é, então, purificado via diálise ou UF/DF. A concentração de polissacarídeo é medida com o uso de um ensaio colorimétrico de antrona, e a concentração de dibenzociclooctila é medida com o uso de absorbância a 309 nm. Esses dois valores podem ser combinados para fornecer uma estimativa da porcentagem de polissacarídeo derivatizado com um grupo funcional dibenzilciclooctila.
[0985] O conjugado é preparado misturando o polissacarídeo derivatizado com uma proteína eCRM de escolha, como aqueles da Tabela 2. Após 18 h de incubação, é adicionado um equivalente molar de azida sódica para extinguir quaisquer grupos funcionais de dibenzociclooctilina não reagidos. O conjugado é, então, purificado via diálise ou UF/DF para remover a proteína eCRM que não reagiu. O conjugado é, então, analisado para determinar a concentração de polissacarídeo (colorimétrico), a concentração de proteína (colorimétrica) e a porcentagem de sacarídeo livre/não conjugado calculada. O peso molecular é medido usando SEC-MALS.
[0986] Polissacarídeo: os conjugados de proteína são precipitados pela adição de solução de desoxicolato a 1% (pH 6,8) e incubação em gelo por 30 minutos. Após a incubação, adiciona-se HCI 1 M e a mistura é centrifugada durante 20 minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante remanescente contém polissacarídeo não conjugado. Para determinar a concentração de polissacarídeo, a antrona dissolvida em ácido sulfúrico é adicionada às amostras e aquecida a 95 Ό durante 10 minutos. A mistura é resfriada e a absorbância em 620 nm é medida. A concentração é calculada usando uma curva padrão dos componentes
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233/233 monossacarídeos do polissacarídeo.
[0987] As modalidades descritas no presente documento são fornecidas apenas a título de exemplo, e várias alternativas às modalidades não são excluídas na prática das modalidades descritas no presente documento.

Claims (36)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo e antígeno, em que o polipeptídeo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T e pelo menos dois resíduos de aminoácido não natural (‘nnAA’), em que (i) a proteína veículo compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T de uma proteína selecionada do grupo que consiste em toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae e CRM197, e (ii) o antígeno é conjugado ao resíduos de nnAA.
  2. 2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína veículo compreende 4 a 9 resíduos de nnAA.
  3. 3. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nnAA é substituído por uma lisina na proteína veículo nativa.
  4. 4. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a proteína veículo tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1.
  5. 5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 ou K527 de SEQ ID NO:1.
  6. 6. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a proteína veículo compreende sequência de aminoácidos SEQ ID NO:9.
  7. 7. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um nnAA é um ácido 2,3-dissubstituído propanoico que porta: um
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    2/11 substituinte de amino na 2-posição; e um substituinte contendo azido, urn substituinte de 1,2,4,5-tetrazinila, ou urn substituinte contendo etinila na 3-posição.
  8. 8. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o nnAA é selecionado de ácido 2-amino-3-(4-azidofenil)propanoico (pAF), ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico (pAMF), ácido 2-amino-3-(5(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(4(azidometil)piridin-2-il)propanoico, ácido 2-amino-3-(6(azidometil)piridin-3-il)propanoico, ácido 2-amino-5-azidopentanoico e ácido 2-amino-3-(4-(azidometil)fenil)propanoico ou qualquer combinação dos mesmos.
  9. 9. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antigeno é conjugado ao nnAA via uma parte de ligação de triazol.
  10. 10. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptideo e um antigeno, em que o polipeptideo é uma proteína veículo que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos um aminoácido não natural (nnAA), em que o antigeno é conjugado ao nnAA, e ainda em que o pelo menos um resíduo de nnAA corresponde a um aminoácido que tem a estrutura de Fórmula XII w6
    O Ar (XU) em que Ar compreende um anel aromático com 5 ou 6 membros contendo opcionalmente pelo menos um heteroátomo; W5 é selecionado de C1-C10 alquileno, -NH-, -O- e -S-; Q1 é zero ou 1; e W6 é selecionado de azido, 1,2,4,5-tetrazinila opcionalmente C-substituída com um grupo alquila inferior, e etinila, de modo que 0 resíduo de nnAA
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    3/11 no polipeptídeo tenha a estrutura de Fórmula XIII w6 (pQÍ
    O Ar
    R3 £
    HN (XIII) em que R3 é OH ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo, e R4 é H ou um resíduo de aminoácido da proteína veículo.
  11. 11. Conjugado, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: W6 é azido; Ar é fenileno, ou Ar contém um heteroátomo de nitrogênio e, opcionalmente, pelo menos um heteroátomo adicional selecionado de N, O e S; Q1 é 1; e/ou W5 é alquileno inferior.
  12. 12. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antígeno é ligado à proteína veículo de acordo com a Fórmula XI ou Xla:
    Figure BR112019013475A2_C0001
    Figure BR112019013475A2_C0002
    O (Fórmula Xla) em que
    Ri é H, formila, ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
    R2 é OH ou pelo menos um aminoácido da proteína veículo;
    WéCou N;
    y é pelo menos 1;
    n é pelo menos 1; e
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    4/11
    X é pelo menos um poliol de um polissacarídeo capsular.
  13. 13. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um polissacarídeo bacteriano capsular; por exemplo, um polissacarídeo capsular de uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae e Porphyromonas gingivalis.
  14. 14. Conjugado, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um polissacarídeo capsular de um sorotipo de S.pneumoniae selecionado do grupo que consiste em
    1,2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F.
  15. 15. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a razão entre polissacarídeo e proteína veículo (em p/p) é maior que 1.
  16. 16. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo inclui 3 ou mais resíduos de nnAA e o conjugado tem um peso molecular de pelo menos 500 kDa.
  17. 17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo (a) é um CRM197 ou compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, e (b) compreende 3 a 9 resíduos de nnAA.
  18. 18. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o conjugado é caracterizado pelo fato de que é reticulado através de ligações proteína-antígeno-proteína.
  19. 19. Conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o conjugado é caracterizado pelo fato
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    5/11 de que tem um peso molecular de pelo menos 900 kDa.
  20. 20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que tem peso molecular entre 900 kDa e 5 MDa.
  21. 21. Método para produzir um conjugado caracterizado pelo fato de que compreende:
    a. Fornecer um antígeno ativado que compreende uma pluralidade de grupos funcionais que compreende um primeiro manejo químico com capacidade de conjugar-se a um segundo manejo químico de um aminoácido não natural (‘nnAA’);
    b. Combinar o antígeno ativado com um polipeptídeo que compreende pelo menos um dos nnAA sob condições em que o primeiro e o segundo manejos químicos reajam para formar um conjugado antígeno-polipeptídeo, em que o polipeptídeo compreende pelo menos um epítopo de ativação de células T; e
    c. Recuperar uma composição que compreende o conjugado.
  22. 22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro manejo químico compreende um grupo alquino e/ou o segundo manejo químico compreende um grupo azido.
  23. 23. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o antígeno foi reagido com um segundo reagente que compreende um grupo funcional selecionado do grupo que consiste em propargila, DIFO, DBCO, DBCO-NH2, e DBCO(PEG)nNH2.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que (i) 0 antígeno compreende uma estrutura de Fórmula V, VI ou Via:
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    6/11
    Figure BR112019013475A2_C0003
    em que: Li é uma ligação, -NH-, -O-, -S-, -NH(I_12)-, -O(I_12)-, ou -S(Li2)-;
    L2 é uma ligação, -C(=O)-, -S(=O)2-, -C(=O)I_12-, -S(=O)2Li2;
    L12 é L22 ou L22NHL22 é C1-10 alquila ou -(CFkCFkOji-io-; e
    Ui é pelo menos uma parte do antígeno, ou (ii) em que 0 antígeno compreende uma estrutura de Fórmula VII ou Vila:
    Figure BR112019013475A2_C0004
    (Fórmula VII)
    Figure BR112019013475A2_C0005
    (Fórmula Vila) em que: X é pelo menos um poliol de um polissacarídeo; e n é pelo menos 1, ou (iii) em que 0 antígeno compreende uma estrutura de
    Fórmula Vllb ou Vllc:
    Figure BR112019013475A2_C0006
    (Fórmula Vllb)
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    7/11
    Figure BR112019013475A2_C0007
    (Fórmula Vile) em que: X é uma amina de pelo menos um aminoaçúcar de um polissacarídeo; e n é pelo menos 1, ou (iv) em que o antígeno compreende z partes de estrutura
    A-X, em que:
    Figure BR112019013475A2_C0008
    X é pelo menos um poliol de um polissacarídeo;
    n é pelo menos 1; e z é maior que 1, ou (v) em que o antígeno compreende uma estrutura de Fórmula VIII:
    /— NH
    J—22 Ui
    N3 (VIII) em que: L22 é uma ligação, alquila ou poli(alquiloxi); e
    Ui é pelo menos uma parte de um antígeno, ou (vi) em que 0 antígeno compreende uma estrutura de Fórmula IX:
    . H
    Ui (IX) em que: Ui é pelo menos uma parte de um antígeno.
    ou (vii) em que 0 antígeno compreende uma estrutura de Fórmula IXa:
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    8/11
    Figure BR112019013475A2_C0009
    N 1
    H (IXa) em que: L22 é C1-10 alquila ou -(ChhChhOji-io-; e
    Ui é pelo menos uma parte de um antígeno.
  25. 25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que é para produzir 0 conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
  26. 26. Método melhorado de produção de uma vacina conjugada de proteína caracterizado pelo fato de que um antígeno é conjugado a uma proteína veículo que fornece uma resposta imune dependente de célula T, em que a melhora compreende empregar, como a proteína veículo, um polipeptideo que compreende pelo menos um aminoácido não natural, em que 0 aminoácido não natural compreende uma parte reativa bio-ortogonal através da qual 0 antígeno é conjugado ao polipeptideo.
  27. 27. Proteína veículo caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T e pelo menos dois resíduos de aminoácido não natural (‘nnAA’), em que (i) a proteína veículo compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T de uma proteína selecionada do grupo que consiste em toxina de Corynebacterium diphtheriae, tetanospasmina de Clostridium tetani, proteína D de Haemophilus influenzae e CRM 197.
  28. 28. Proteína veículo caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, e que compreende pelo menos um nnAA substituído por um aminoácido de ocorrência natural em SEQ ID NO:1, em que 0 pelo menos um nnAA é substituído por K25, K34, K38, K40, K213, K215, K228, K245, K265, K386, K523 ou K527 de SEQ ID NO:1, e em que 0 nnAA compreende uma parte de ligação.
  29. 29. Proteína veículo para preparar um conjugado
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    9/11 polissacarídeo imunogênico-proteína, em que a proteína é caracterizada pelo fato de que (i) compreende pelo menos um epitopo de ativação de células T (ii) inclui pelo menos um nnAA e (iii) tem uma solubilidade de pelo menos 50 mg/l a 20 Ό em tampão Tris pH 7,4.
  30. 30. Processo para produzir a proteína veículo, como definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) fornecer um ácido nucleico que codifica a proteína veículo, em que o ácido nucleico compreende uma pluralidade de códons de supressão;
    (b) criar uma mistura de reação pela combinação do ácido nucleico com um extrato celular livre de células que compreende os aminoácidos não naturais, um tRNA complementar aos códons de supressão, e uma aminoacil-tRNA sintetase; e (c) incubar a mistura de reação de (b) sob condições suficientes para seletivamente incorporar o aminoácido não natural no sítio que corresponde a cada códon de supressão na proteína veículo.
  31. 31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não natural é 4-azidometil-fenilalanina (pAMF) e o tRNA em (b) tem a capacidade de ser carregado com pAMF.
  32. 32. Método para a síntese de um polipeptídeo caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos 2 nnAAs em uma mistura de expressão livre de célula mantida a uma temperatura entre cerca de 10Ό e cerca de 30 Ό, em que o polipeptídeo produz ido compreende tanto uma fração solúvel como uma fração insolúvel, e em que a razão entre a fração solúvel e a fração insolúvel é pelo menos 30% (em p/p).
  33. 33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a temperatura está (i) acima de cerca de 20 Ό ou (ii) abaixo de cerca de 20 Ό, por exemplo, em que a tem peratura é entre cerca de 14 Ό e cerca de 18 Ό.
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    10/11
  34. 34. Composição caracterizada pelo fato de que compreende múltiplos conjugados de acordo com as reivindicações 1 a 19, em que cada um dos múltiplos conjugados compreende um antígeno diferente.
  35. 35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende:
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 2 ou mais sorotipos diferente pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 14 ou mais sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 15 ou mais sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 20 ou mais sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 21 ou mais sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 24 ou mais sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 25 ou mais
    Petição 870190060378, de 28/06/2019, pág. 286/305
    11/11 sorotipos pneumocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorotipos 1,2,3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11 A, 12F, 13, 14, 15B, 16, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24F, 31 e 33F;
    conjugados de polissacarídeos capsulares de 4 ou mais sorogrupos meningocócicos diferentes selecionados do grupo que consiste em sorogrupos A, C, W135, X e Y; ou conjugados de polissacarídeos capsulares de 2 ou mais diferente P.gingivals sorotipos selecionados do grupo que consiste em sorotipos K1, K2, K3, K4, K5, e K6.
  36. 36. Método de elicitação de uma resposta de anticorpo imunossupressor a um antígeno em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20 ou uma composição, como definida na reivindicação 34 ou 35, em um excipiente adequado para administração parenteral.
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