JP2023022188A - 非天然アミノ酸とのポリペプチド抗原接合体 - Google Patents

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Abstract

【課題】非天然アミノ酸を含有する免疫原性組成物の生成のための、ポリペプチドおよび抗原を含む接合体、ならびにその生成方法を提供する。【解決手段】ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であり、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)前記抗原が、前記nnAA残基と接合している、接合体を提供する。【選択図】図3

Description

関連出願の相互参照
この出願は、2016年12月30日に出願された米国仮特許出願第62/441,115号、2017年7月10日に出願された米国仮特許出願第62/530,803号、2017年10月4日に出願された米国仮特許出願第62/568,201号、および2017年11月27日に出願された米国仮特許出願第62/591,160号の利益を主張し、それらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる。
単離された抗原性高分子ベースのワクチン(例えば、第1世代髄膜炎菌、肺炎球菌、およびへモフィルス多糖類ワクチン)は、生の弱毒化または不活性化微生物ワクチンを中心としたより以前のワクチン製剤を越える著しい改善を示した。
精製された高分子は、製造が著しく容易であり、改善された安全特性を有し、より生産的な特異的免疫反応を発生させ得る(例えば、それらは、より保存されるか、または発病原因について重要である抗原を対象とし得る)。さらに、それらは、免疫反応が単に適切な免疫原を提供することによって特定の部位または特定の微生物を対象とすることができる、ワクチン生成に対する単純化された鋳型を提供する。しかしながら、この方策は、あらゆる高分子が強い免疫反応を発生させるわけではないという不都合な事実を抱えている。多くの脂質、多糖類、および特定のタンパク質抗原(および大部分の小分子)は、特定の患者集団(例としては、幼児または高齢者を含む)において本質的に弱く、一時的であり、かつ/または正常に機能しない免疫反応を発生させる。こうした弱い免疫反応は、主にB細胞を活性化するか、または別様に、免疫記憶および抗体成熟に関わるT細胞依存経路を活性化しない抗原構造から生じると考えられる。
本開示は、非天然アミノ酸を含有する免疫原性組成物の生成のための方法、組成物、および技術を対象とする。非天然アミノ酸に組み込まれるバイオ直交性付着化学により、免疫系に対するより効率的で強力な抗原の提示、単純化された精製、およびこれらの半合成免疫原のより明確に定義された構造が可能になる。
一実施形態では、本開示は、ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つの非天然アミノ酸、すなわち「nnAA」を含む担体タンパク質であり、抗原がnnAAと接合している、接合体を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン(破傷風毒素としても知られる)、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、天然担体タンパク質中のリジンと交換される。例えば、担体タンパク質は、天然CRM197中の39個のうちの少なくとも2(例えば、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも6)つのリジン残基がnnAAによって交換されている、CRM197を含む。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、天然担体タンパク質中のフェニルアラニンと交換される。別の実施形態では、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAは、天然担体タンパク質中のリジンと交換される。別の実施形態では、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAは、天然担体タンパク質中のフェニルアラニンと交換される。別の実施形態では、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAは、天然担体タンパク質中のリジン、フェニルアラニン、またはリジンおよびフェニルアラニンの両方と交換される。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素(DT)、破傷風毒素(TT)、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD)、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質と少なくとも80%の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する。別の実施形態では、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープは、配列番号1によるCRM197由来のものである。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と交換される。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のF13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532と交換される。別の実施形態では、少なくとも2つのnnAAは、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532と交換される。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のK265と交換される。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のK386と交換される。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のK265およびK386と交換される。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、抗原は、トリアゾール連結部分を介してnnAAと接合している。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌(具体的には、b型、すなわちHib)、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。
関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAを含む担体タンパク質であり、抗原は、少なくとも1つのnnAAと接合し、さらに、少なくとも1つのnnAAは、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、2,3-二置換プロパン酸である。
別の関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAA残基を含む担体タンパク質であり、抗原は、nnAAと接合し、さらに、nnAA残基は、式XIIの構造を有するアミノ酸に対応し、
Figure 2023022188000002
式中、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
は、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のnnAA残基は、式XIIIの構造を有し、
Figure 2023022188000003
式中、Rは、OHまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Rは、Hまたは担体タンパク質のアミノ酸残基である。
一実施形態では、本開示は、配列番号1による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも1つのnnAAを含むポリペプチドであって、少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と交換され、nnAAが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号1による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも1つのnnAAを含むポリペプチドであって、少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のF13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532と交換され、nnAAが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、配列番号1による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも2つのnnAAを含むポリペプチドであって、少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532と交換され、nnAAが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、配列番号1のK265が交換される。別の実施形態では、配列番号1のK386が交換される。別の実施形態では、配列番号1のK265およびK386が交換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
関連する実施形態では、ポリペプチド中の少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAは、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、2,3-二置換プロパン酸である。
別の関連する実施形態では、ポリペプチド中の少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAは、式XIIの構造を有し、
Figure 2023022188000004
式中、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
は、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体を含む組成物であって、ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つのnnAAを含む担体タンパク質であり、抗原がnnAAと接合している、組成物を提供する。別の実施形態では、ポリペプチド抗原接合体は、タンパク質-抗原-タンパク質連結を通して架橋される。別の実施形態では、組成物は、複数の担体-タンパク質抗原接合体を含み、各接合体は、異なる抗原(例えば、異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖)を含む。別の実施形態では、抗原は、同じ微生物の異なる血清型(例えば、肺炎球菌について)または血清群(例えば、髄膜炎菌について)由来のものである。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌(例えばHib)、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、組成物は、少なくとも14、20、21、24、または25個の異なる担体タンパク質-莢膜多糖接合体があり、各接合体が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の異なる莢膜多糖を含む、本明細書に記載されるようなタンパク質担体-抗原接合体を含む。別の実施形態では、多糖類と担体タンパク質との比率(w/w)は、1を上回る。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリア毒素(DT)、破傷風毒素(TT)、へモフィルスタンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、およびCRM197から選択されるタンパク質と少なくとも80%の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、CRM197と少なくとも80%の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する。別の実施形態では、担体タンパク質は、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有し、さらに、少なくとも1つのnnAAは、内部に天然に生じるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAは、配列番号1のF13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAは、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532からなる群から選択されるアミノ酸を交換する。別の実施形態では、抗原は、連結部分を介してnnAAに接合される。別の実施形態では、抗原は、トリアゾール連結部分を介してnnAAに接合される。
関連する実施形態では、組成物中のポリペプチド抗原接合体は、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAを含む担体タンパク質をポリペプチドとして含み、抗原はnnAAと接合し、さらに、少なくとも1つのnnAAは、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ、2,3-二置換プロパン酸である。
別の関連する実施形態では、組成物中のポリペプチド抗原接合体は、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープ、ならびに少なくとも1つ、および好ましくは少なくとも2つのnnAAを含む担体タンパク質をポリペプチドとして含み、抗原はnnAAと接合し、さらに、ポリペプチド中の少なくとも1つのnnAAは、式XIIの構造を有し、
Figure 2023022188000005
式中、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
は、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
一実施形態では、本開示は、接合体を生成するための方法であって、(a)nnAAの第2の化学ハンドルに接合することができる第1の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、(b)第1および第2の化学ハンドルが反応して抗原-ポリペプチド接合体を形成する条件下で、nnAAのうちの少なくとも1つを含むポリペプチドと活性化抗原を組み合わせることであって、ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、(c)接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、抗原は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌(例えばHib)、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原を、活性化抗原の生成において、CDAP、CDI、または過ヨウ素酸塩からなる群から選択される第1の試薬と反応させた。別の実施形態では、第1の試薬は、1M未満の過ヨウ素酸塩である。別の実施形態では、複数の官能基は、水酸基を含む。別の実施形態では、複数の官能基は、アルデヒド基を含む。別の実施形態では、抗原を、プロパルギル、DIFO、DBCO、およびDBCO(PEG)n-NHからなる群から選択される官能基を含む第2の試薬と反応させた。別の実施形態では、抗原を、DBCO-NHを含む第2の試薬と反応させた。別の実施形態では、第1の化学ハンドルは、アルキン基を含む。別の実施形態では、第2の化学ハンドルは、アジド基を含む。別の実施形態では、組成物(w/w)中の接合体の抗原とポリペプチドとの比率は、1を上回る。
関連する実施形態では、接合体を生成するための方法は、(a)抗原を活性化して、少なくとも1つの第1の化学ハンドルを内部に組み込むことであって、第1の化学ハンドルが、ポリペプチド中のnnAAの第2の化学ハンドルに接合することができる、組み込むことと、(b)第1および第2の化学ハンドルが反応して抗原-ポリペプチド接合体を形成する条件下でnnAAのうちの少なくとも1つを含むポリペプチドと活性化抗原を組み合わせることであって、ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、(c)接合体を含む組成物を回収することと、を含む。この実施形態の一態様では、抗原の活性化は、少なくとも1つのアルキニル基を第1の化学ハンドルとして抗原に組み込むことを含む。
別の関連する実施形態では、ポリペプチド抗原接合体を生成するための方法であって、少なくとも1つのアルキニル基を第1の化学ハンドルとして内部に組み込み、第2の化学ハンドルとしてアジド基を持つ、少なくとも1つのnnAA、および好ましくは少なくとも2つのnnAAを含むポリペプチドと抗原を反応させることによって抗原を活性化し、それによってポリペプチドと抗原との間の非触媒共有結合生体接合反応を可能にすることを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、アルキニル基を拘束して、例えば、ジアリール歪みシクロオクチンなどの環構造において、反応性を増加させる。
一実施形態では、本開示は、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、本明細書に記載されるような接合体を対象に投与することを含む、方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、本明細書に記載されるような組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、セ氏約10度~セ氏約約30度の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも2つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成されたポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率が、少なくとも30%(w/w)である、方法を提供する。例えば、100gの総ポリペプチドについて、不溶性画分は、70g以下であり、可溶性画分は、30g以上であろう。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を上回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を下回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約14度~セ氏約18度である。別の実施形態では、ポリペプチドは、抑制コドンを含む核酸によってコードされる。別の実施形態では、無細胞発現混合物は、nnAAに対して特異的な直交性tRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素対を含む。別の実施形態では、tRNAの濃度は、少なくとも20μM(すなわち、直交性tRNAの濃度)である。別の実施形態では、nnAAの濃度は、約2mM未満であり、アミノアシル-tRNA合成酵素の濃度は、約5μM未満である(すなわち、直交性合成酵素の濃度)。別の実施形態では、本方法は、ポリペプチドを活性部分に接合させることを含む。別の実施形態では、活性部分は、ハプテン、細菌抗原、ウィルス抗原、ペプチド毒素、マクロライド、ポリエーテル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、発現混合物は、大腸菌、小麦胚芽、またはウサギの網状赤血球の細胞抽出物を含む。別の実施形態では、発現混合物は、少なくとも30%細胞抽出物を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも60%(w/w)である。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも80%(w/w)である。例えば、100gの総ポリペプチドについて、不溶性画分は、20g以下であり、可溶性画分は、80g以上であろう。
一実施形態では、本開示は、タンパク質-接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、抗原が、T細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合し、改善が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを担体タンパク質として用いることを含み、非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、方法を提供する。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類である。別の実施形態では、ポリペプチドは、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、少なくとも2つの非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて抗原がポリペプチドに接合される、非天然アミノ酸を含まない少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、T細胞活性化エピトープは、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来のものである。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類であり、細菌は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌(例えばHib)、化膿連鎖球菌、およびストレプトコッカス・アガラクチアからなる群から選択される。別の実施形態では、非天然アミノ酸のうちの少なくとも1つは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸からなる群から選択される。
一実施形態では、本開示は、複数の非天然アミノ酸をその構造中に組み込む担体タンパク質を生成するための方法であって、(a)担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、(b)非天然アミノ酸、抑制コドンに相補的であるtRNA、およびアミノアシル-tRNA合成酵素を含む無細胞細菌抽出物と核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、(c)担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位で非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、(b)の反応混合物を培養することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、4-アジドメチルフェニルアラニン(pAMF)である。別の実施形態では、工程(c)は、セ氏20度未満で反応混合物を培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、追加的に、(c)の直後に担体タンパク質を精製することを含む。別の実施形態では、抑制コドンは、配列番号2のコドン25、34、38、40、213、215、228、245、265、386、523、または527と選択的に置換される。別の実施形態では、(b)の反応混合物は、タンパク質合成に必要な生体成分をさらに含む。別の実施形態では、(b)のtRNAを、pAMFで荷電することができる。別の実施形態では、(b)のアミノアシル-tRNA合成酵素は、20個の天然アミノ酸と比較して、pAMFでtRNAを優先的にアミノアシル化する。
別の実施形態では、本開示は、少なくとも14、20、21、24、または25個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物であって、抗原が、莢膜多糖であり、(a)各別個の担体タンパク質-抗原接合体中の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり、(b)担体タンパク質-抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むポリペプチドを含み、(c)莢膜多糖がnnAAと接合している、組成物を提供する。この実施形態の好ましい型では、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープは、配列番号1によるCRM197由来のものであり、ポリペプチドは、配列番号1と少なくとも80%または95%の配列同一性を有し、(i)ポリペプチドは、2~9つのnnAAを含み、(ii)ポリペプチドは、4~6つのnnAAを含み、かつ/または(iii)少なくとも1つのnnAAは、(a)CRM197のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、(b)配列番号1のF13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、もしくはF532、または(c)配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、K527、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、もしくはF532からなる群から選択されるアミノ酸産基と置換される。先の実施形態の好ましい型は、少なくとも14、20、21、24、または25個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物を含み、各別個の担体タンパク質-抗原接合体は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖から個別に選択される抗原、別個の担体タンパク質-抗原接合体のうちの24個の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33F由来のものである少なくとも24個の別個の担体タンパク質-抗原接合体の組成物、別個の担体タンパク質-抗原接合体のうちの少なくとも1つの莢膜多糖が、6C、7C、13、15A、15C、16、16F、23A、23B、24F、31、34、35B、33F、35F、37、および38からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも25個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物、ならびに別個の担体タンパク質-抗原接合体のうちの少なくとも1つの莢膜多糖が、15Aおよび35B、または代替的に、20A、20B、および24Bからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも25個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物を含む。
一実施形態では、本開示は、少なくとも14、20、21、24、または25個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含む組成物であって、抗原が、肺炎連鎖球菌の莢膜多糖であり、(a)各別個の担体タンパク質-抗原接合体中の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり、(b)担体タンパク質-抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(nnAA)を含むポリペプチドであり、莢膜多糖がnnAAと接合し、(c)肺炎連鎖球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fの各々に対する莢膜多糖を含む別個の担体タンパク質-抗原接合体があり、(d)血清型2、6C、8、9N、10A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、20、20A、20B、22F、23A、23B、24F、24B、31、33F、34、35B、35F、および38からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の莢膜多糖を含む少なくとも1つの追加の別個の担体タンパク質-抗原接合体がある、組成物を提供する。例えば、組成物は、(i)肺炎連鎖球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fの各々に対する接合体を含む、少なくとも20もしくは21個の別個の担体タンパク質-抗原接合体、または(ii)肺炎連鎖球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fの各々に対する莢膜多糖を含む別個の担体タンパク質-抗原接合体がある、少なくとも24個の別個の担体タンパク質-抗原接合体を含み得る。
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体であって、ポリペプチドが、3つ以上のnnAA残基を含み、接合体が、少なくとも500kDaの分子量を有する、ポリペプチド抗原接合体を提供する。ポリペプチドは、3つ以上のnnAA残基(例えば、3~9つ、または3~8つ、または3~7つ、または3~6つのnnAA残基)を含有する、CRM197(例えば、以下の5a節で考察されるように、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む)であり得る。抗原は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類であり得る。接合体は、少なくとも600kDa、少なくとも800kDa、少なくとも900kDa、または少なくとも1MDa、例えば、1~5MDaの分子量を有し得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
一実施形態では、本開示は、ポリペプチド抗原接合体であって、ポリペプチドが4つ以上のnnAA残基を含む、ポリペプチド抗原接合体を提供する。ポリペプチドは、4つ以上のnnAA残基(例えば、4~9つ、または4~8つ、または4~7つ、または4~6つのnnAA残基)を含有するCRM197(例えば、以下の5a節で考察されるように、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む)であり得る。抗原は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類であり得る。接合体は、少なくとも500kDa(例えば、少なくとも600kDa、少なくとも800kDa、少なくとも900kDa、または少なくとも1MDa、例えば、1~5MDa)の分子量を有し得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
一実施形態では、本開示は、免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するのに好適なタンパク質であって、タンパク質が、(i)少なくとも1つのnnAAを含み、(ii)pH7.4のトリス緩衝液中、20℃で少なくとも50mg/Lの溶解度を有する、タンパク質を提供する。ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープ(上記に考察されるような)を含み、例えば、それは、2つ以上のnnAA残基、例えば、3~9つ、または4~9つ、または3~8つ、または4~8つ、または3~7つ、または4~7つ、または3~6つ、または4~6つのnnAA残基を含有するCRM197(例えば、以下の5a節で考察されるように、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む)であり得る。タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖などの細菌多糖類と接合して、接合体を作製し得る。溶解度は、少なくとも100mg/L、少なくとも200mg/L、またはさらには少なくとも250mg/Lであり得る。本明細書でさらに考察されるように、各調製が異なる肺炎連鎖球菌血清型由来の肺炎球菌莢膜多糖で作製される、そのような接合体の複数の調製を、多価ワクチンとして有用である本発明の組成物に組み込むことができる。そのような接合体で表される肺炎連鎖球菌血清型の好ましい選択も、本明細書でさらに考察する。
本明細書に記載される実施形態の特徴および利点を、例示的な実施形態を説明する、以下の詳細な記載および添付の図面を参照することによってさらに説明する。
任意選択的に、tRNA(otRNA)またはnnAA/aaRS合成酵素(nnAA)の増加量を補足された、CFPS反応におけるセ氏30、25、または20度で生成された6つのnnAA含有eCRMの収率を示す。各列に、総収率および可溶性収率の両方を表す、2つの棒を示す。 合成タンパク質(2A)の相対収率、および無細胞タンパク質合成(CFPS)反応において生成された一部位eCRMについてDBCO-フルオレセイン(2B)と反応するためのeCRMに組み込まれたpAMFの能力を実証する、クマシー(2A)および蛍光(2B)ゲル画像を示す。図2Aでは、はしごは、上から下に、10、15、20、25、37、50、75、100、150、および250kDaを示す。図2Bでは、蛍光マーカーは、25および75kDaである。レーンは以下のとおりである。L=はしご、W=野生型、C=C末端TAG、次に、レーン1~12は、それぞれ、11、25、34、38、40、52、60、77、83、91、96、および103位でLysを交換するためのTAGを有する。 マウス中の一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のオプソニン食作用(OPA)活性(GMT)を示す。血清型がX軸上に示される。白い棒は、アジュバント化多糖類であり、黒い棒は、アジュバント化接合体である。 マウス中の一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のIgG応答(GMT)を示す。血清型がX軸上に示される。白い棒は、アジュバント化されているが、接合されていない多糖類であり、黒い棒は、アジュバント化接合体である。 ウサギ中の多価肺炎球菌ワクチンの投与後のIgG応答(GMT)を示す。各血清型(X軸)は、本発明の24価の接合体ワクチン(左)、Prevnar-13(商標)(中間)、および24価の非接合体ワクチン(右)についてのデータを有する。データは、平均+/-95%の信頼区間である。 図5と類似しているが、OPA応答(GMT)を示す。
タンパク質-接合体ワクチンでは、「弱い」抗原に対する免疫反応は、既知の「強い」タンパク質抗原への付着によって増幅される。これらの半合成生体分子では、強く長寿命のT細胞依存性免疫反応(「T細胞依存性抗原」)を精製するタンパク質は、典型的には、非特異的酸化/還元化学によって「弱い」抗原に付着される。これらの免疫原性タンパク質に対するT細胞活性化特徴は、ヘルパーT細胞を、付着された弱い抗原を認識するB細胞に補充し、そのため、別様に弱免疫原性分子に対する強く長寿命の免疫反応を可能にする。
タンパク質-接合体ワクチン生成のために使用される現在の方法および構成単位は、疾患の治療および予防のための接合体ワクチンのより広範の適用を妨げる。第1に、比較的少ない強いタンパク質抗原は、化学的に耐性があり、非毒性であり、かつ接合体ワクチンにおいて担体として使用されるのに十分拡張可能である。第2に、接合体ワクチン生成のために一般に使用される酸化/還元化学が、最大免疫原性のために必要とされる担体および抗原に対するエピトープを保存することを困難にしている。第3に、これらの酸化/還元反応の比較的低い効率が、特に商業規模での品質制御および精製を複雑にしている。
組み換えタンパク質の生成は、担体タンパク質の抗原性および非毒性の最適化を可能にするが、既存の担体タンパク質は、組み換え細胞中に生成することが困難であり、完全に操作されたタンパク質は、高収率で生成することが困難である。より緩やかな接合反応は、担体および抗原エピトープの変性/閉塞を最小限に抑えるが、これらの反応のより低い効率が、担体タンパク質に対する抗原のより低い荷重およびより複雑な精製スキームをもたらす。重要なことに、担体に対する比較的低い抗原が、担体タンパク質自体に対する抗体反応、または担体誘発性エピトープ抑制の認識された現象による免疫「干渉」のより高い可能性をもたらす。
したがって、より高い免疫原性のより容易に製造される接合体ワクチンを生成するためのこれらの技術の組み合わせを可能にする方策および試薬に対する必要性が特定されている。したがって、とりわけ、(1)非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質を含むポリペプチド、(2)非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質を含むポリペプチドに接合するのに好適な抗原、(3)非天然アミノ酸を含む増強された担体タンパク質と接合している抗原を含む、(1)および(2)のポリペプチド抗原接合体、(4)前述のものを含むワクチン組成物、ならびに(5)前述のものを作製および使用する方法を本明細書に記載する。
1.定義
「抑制コドン」という用語は、所定の場所でポリヌクレオチド内に導入されるヌクレオチドトリプレットを指し、終止コドン(例えば、アンバー、オークル、またはオパール終止コドン)を認識することができる特異的tRNAによって認識され、翻訳がコドンを読み取ってタンパク質を生成し、それによって終止コドンを抑制することを可能にする。
「非天然アミノ酸」(nnAA)とは、20個の一般的なアミノ酸またはピロリジンもしくはセレノシステインのうちの1つではないアミノ酸を指し、「非天然アミノ酸」という用語と同義的に使用される他の用語は、「非天然にコードされたアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、およびそれらの様々にハイフンでつながれた型およびハイフンでつながれない型である。バイオ直交性反応性化学的側鎖を有する非天然アミノ酸は、タンパク質中の不連続な部位に様々なペイロードを接合するための化学「ハンドル」として使用することができる。
2つ以上の核酸もしくはポリペプチド配列の文脈における、「配列同一性」もしくは「パーセント同一性」という用語は、配列比較アルゴリズム(例えば、アミノ酸配列についてのBLASTP)を使用して測定されるように、比較ウィンドウにわたる最大対応について比較および整列されたとき、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定された百分率を有する、2つ以上の配列を指す。この文書の目的のために、パーセント同一性は、配列番号1に説明される基準配列などの全長配列にわたって判定される。本明細書に提供されるような配列同一性を計算するための方法は、3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62採点マトリクスで設定されたその初期値を有するBLASTPプログラムである(例えば、Henikoff&Henikoff,1989,Proc Natl Acad Sci USA 89:10915を参照されたい)。例えば、WWW at blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiまたはその他で入手可能なBLAST整列ツールを参照されたい。
「抗原」という用語は、適応免疫系の高度に可変的な抗原受容体(B細胞受容体、T細胞受容体、または両方)によって認識されることができる、任意の分子または線状分子断片を指す。抗原の非制限例には、多糖類またはグリカン(例えば、細菌莢膜多糖)、ポリヌクレオチド、ポリアミノ酸、脂質、および小分子(例えば、ハプテン、乱用薬物)が含まれる。
「T細胞活性化エピトープ」という用語は、T細胞免疫を誘発することができる分子構造の構造単位を指す。T細胞活性化エピトープを含む担体タンパク質の機能は、接合体についてよく知られており、かつ文書化されている。理論に縛られることは望まないが、担体タンパク質中のT細胞活性化エピトープは、共有結合された抗原が、抗原提示細胞によって処理され、かつ抗原に対する免疫記憶を誘発するためにCD4+veT細胞に提示されることを可能にする。
「B細胞エピトープ」という用語は、概して、B細胞応答を誘発することができる高分子構造のこうした特徴を指す。T細胞エピトープとは対照的に、B細胞エピトープは、抗原提示細胞による処理およびMHCのペプチド結合クレフトへの荷重が、B細胞活性化について必要とされないため、ペプチドを含む必要がない。
本明細書で使用される場合、「担体タンパク質」とは、対象において接合された抗原に対する液性応答反応を増強するために、抗原(例えば、多糖類)に付着されることができるT細胞活性化エピトープを含有する非毒性または無毒化ポリペプチドを指す。本用語は、FDAに承認されたワクチンにおけるエピトープ担体として使用される細菌タンパク質のうちのいずれかを含む。いくつかの実施形態では、担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、CRM197、またはマラリアオーキネート特異的表面タンパク質Pfs25である。別の実施形態では、担体タンパク質は、連鎖球菌株G148のGタンパク質由来のBBである。「天然担体タンパク質」は、天然にのみ生じるアミノ酸を有する。「増強された担体タンパク質」は、担体タンパク質中に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも1つの非天然アミノ酸を有する。
本明細書で使用される場合、「免疫原性ポリペプチド」という用語は、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含むポリペプチドを指し、ここで、T細胞エピトープは、動物における免疫記憶を誘発することができるタンパク質由来のものである。
本明細書で相互変換可能に使用されるような「eCRM」または「増強されたCRM」という用語は、ジフテリア毒素のG52Eコドン変異形の改変型を指し、ここで、天然アミノ酸残基の少なくとも1つは、非天然アミノ酸と置換され、ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを保持する。
本明細書で使用される場合、「改変される」、「交換される」、「増強される」、および「置換される」という用語は、ポリペプチドの残基を記載するために使用される場合に同義とみなされ、すべての場合において、ポリペプチド鎖内の天然に生じるアミノ酸との非天然アミノ酸の交換を指す。
本明細書で使用される場合、「T非依存性抗原」という用語は、B細胞媒介性免疫の特徴を誘発するか、またはアイソタイプ・スィッチングもしくは免疫記憶などのヘルパーT細胞媒介性免疫と関連するプロセスを誘発しない、抗原を指す。
本明細書で使用される場合、「多糖類」という用語は、制限されないが、50個以上の繰り返し単位を有する多糖類、および50個以下の繰り返し単位を有するオリゴ糖を含むが限定されない、複数の繰り返し単位を含む糖類を含む、その通常の意味で使用される。典型的には、多糖類は、約50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95個の繰り返し単位~約2,000個以上の繰り返し単位、および任意選択的に、約100、150、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、または1000個の繰り返し単位~約1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、または1900個の繰り返し単位を有する。オリゴ糖は、典型的には、約6、7、8、9、または10個の繰り返し単位~約15、20、25、30、または35~約40または45個の繰り返し単位を有する。
本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、グリコシド連結によって互いと接合している単糖類(例えば、グルコース)残基からなる任意の線状または分岐ポリマーを指す。グリカンの例としては、グリコーゲン、デンプン、ヒアルロン酸、およびセルロースが挙げられる。「グリカン」の他の例には、細菌莢膜多糖が含まれる。
本明細書で使用される場合、多糖類または担体タンパク質-多糖類接合体の「分子量」という用語は、多角的レーザー光散乱(MALS)と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって計算される分子量を指す。
本明細書で使用される場合、別段の定めがない限り、「低級アルキル」という用語は、1~6つの炭素原子、すなわち、C~Cアルキルを有する直鎖飽和型または分岐炭化水素を指す。特定の実施形態では、低級アルキル基は、第1級、第2級、または第3級炭化水素である。本用語は、置換部分および非置換部分の両方を含む。US2014/0066598も参照されたい。「低級アルキレン」という用語は、低級アルキルのアルキレン基を指す。
1つ以上の不斉中心を含み、絶対立体化学に関して、アミノ酸に対する(R)もしくは(S)として、または(D)もしくは(L)として定義される、鏡像異性体、ジアステレオマー、および他の異性立体形態を生じる、本明細書に開示される様々な実施形態の化合物、またはそれらの薬学的に許容可能な塩。本開示は、すべてのそのような異性体、ならびにそれらのラセミ形態および任意選択的に純粋な形態を含むことが意図される。本明細書で使用されるnnAAは、概して、一般的に、α-炭素にキラル中心を有するα-アミノ酸であり、それらは、好ましくは(L)異性体である。
本明細書で使用される化学的名前付けプロトコルおよび構造図は、ACD/Name型9.07ソフトウェアプログラムおよび/またはChemDraw Ultra型11.0.1ソフトウェア名前付けプログラム(CambridgeSoft)を使用した、I.U.P.A.C.命名法の改変形態である。以下に記載されるものを除いて、原子価を完成させるのに十分な水素原子と接合していると想定される、いくつかの炭素原子上のすべての結合を除く、すべての結合が、本明細書の化学構造図で同定される。
2.一般的な方法
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術的かつ科学的用語は、一般に理解される意味を有する。開業医には、定義および用語について参照により本明細書に組み込まれる、Green&Sambrook(eds.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2012)、およびAusubel,F.M.,et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 99),John Wiley & Sons,New York(2012)、ならびにPlotkin,S.A.,Orenstein,W.A.,& Offit,P.A.,Vaccines,6 ed,Elsevier,London(2013)が特に案内される。標準的な方法はまた、RNA操作および分析について詳細な方法を記載し、参照により本明細書に組み込まれる、Bindereif,Schon,&Westhof(2005)Handbook of RNA Biochemistry,Wiley-VCH,Weinheim,Germanyにも記載されている。組み換え核酸を発生させるための適切な分子技術、および多くのクローニング運動の指示の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Green&Sambrook(Id.)、Ausubel,F.M.,et al.(Id.)、Berger&Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology(Volume 152 Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.1987)、およびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Academic Press,San Diego,Calif.1990)に見出される。化学ハンドルにより生体分子を活性化および誘導体化するための適切な生物有機技術、およびそのような剛性を設計するための指示の例は、Hermanson,G.T,Bioconjugate Techniques,2nd ed.,Elsevier,London(2008)に見出される。本明細書に記載される生体分子の非経口投与に必要な技術および成分の例について、開業医には、Remington,Essentials of Pharmaceutics,Pharmaceutical Press,London(2012)が案内される。タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化のための方法は、Coligan et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New Yorkに記載されている。無細胞合成のための方法は、Spirin&Swartz(2008)Cell-free Protein Synthesis,Wiley-VCH,Weinheim,Germanyに記載されている。無細胞合成を使用した非天然アミノ酸のタンパク質への組み込みのための方法は、Shimizu et al.(2006)FEBS Journal,273,4133-4140、およびChong(2014)Curr Protoc Mol Biol.108:16.30.1-11にも記載されている。
PCR増幅方法は、例えば、Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press Inc.San Diego,Calif.,1990 and Domingues(ed.)PCR:Methods and Protocols ISBN 1493970593(2017)に記載されている。増幅反応は、典型的には、増幅されるべきDNA、熱安定性DNAポリメラーゼ、2つのオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)、反応緩衝液、およびマグネシウムを含む。典型的には、熱サイクルの望ましい数は、1~25である。PCR条件のプライマーの設計および最適化のための方法は、Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,5th Edition,Wiley,2002、およびInnis et al.,PCR Protocols,Academic Press,1990に見出される。コンピュータプログラムは、必要とされる特異性および最適な増幅特性(例えば、Oligo型5.0(National Biosciences))を有するプライマーの設計において有用である。いくつかの実施形態では、PCRプライマーは、追加的に、増幅DNA断片のベクター中の特異的制限酵素部位への挿入を容易にするための、制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を含有する。制限部位がPCRプライマーの5’末端に加えられるべき場合、酵素によるより効率的な開裂を可能にするために、いくつかの(例えば、2つまたは3つの)余分の5′塩基を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、PCRプライマーはまた、その後のインビトロ転写を可能にするために、T7またはSP6などのRNAポリメラーゼプロモーター部位を含有する。インビトロ転写のための方法は、Van Gelder et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1663-1667,1990、Eberwine et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:3010-3014,1992などの供給源に見出される。
多糖類または担体タンパク質-多糖類接合体の分子量は、多角的レーザー光散乱(MALS)と組み合わされたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって測定される。SEC MALS-UV-RI設定は、溶出種の検出のための、DAWN-HELEOS多角度レーザー光散乱検出器およびOptilab T-rEX示差屈折干渉計(米国カリフォルニア州サンタバーバラ、Wyatt Technology)に従った、Agilent HPLC 1100(脱気剤、第4級ポンプ、温度制御オートサンプラー、温度制御カラム区画、およびUV-VISダイオードアレイ検出器を含む)からなる。以下の一連のカラムは、このシステムに取り付けられる。TSKgel Guard PWXL 6.0mm ID×4.0cm長、12μm粒子、TSKgel 6000 PWXL 7.8mm ID×30cm長、13μm粒子、およびTSKgel 3000 PWXL 7.8mm ID×30cm長、7μm粒子。カラム区画は、25℃に設定され、試料区画は、4℃に設定される。5%v/vアセトニトリルで0.2μm濾過された1×PBSからなる移動相が、0.5mL/分の流量で使用される。試料は、0.2~1.5mg/mLの濃度範囲の多糖類内に注入され、注入される容量は、30~40μgの相注入質量を生じるように調節される。Agilent Open Labソフトウェアを使用は、HPLCを制御するために使用され、Wyatt Astra 7ソフトウェアは、データの回収および分析のために使用される。本技術は、試料中の接合体についての絶対分子量の分布を明らかにし、および個体数についての結果は、平均値として表現される。
いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌が単離された莢膜多糖は、当業者に知られている単離手順を使用して細菌から直接得られる(例えば、米国特許出願公開第2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、および2008/0102498、ならびにWO2008/118752に開示される方法を参照されたい)。他の実施形態では、肺炎連鎖球菌が単離された莢膜多糖は、商業的供給源(例えば、ATCC)から得られる。
3.ポリペプチド
少なくとも1つのnnAA残基を含むポリペプチドを本明細書に開示する。好適なポリペプチドは、任意の生物学的活性ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、免疫原性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、特異的ポリペプチドの天然残基と置換される。他の実施形態では、nnAA残基は、特異的ポリペプチドの配列前に添加され、その後に添加されるか、またはその内部に挿入される。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、または9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、2~9つのnnAA残基を含み、および好ましくは4~6つのnnAA残基を含む。またさらなる実施形態では、ポリペプチドは、化学的に異なる2つ以上のnnAA残基を含む。
一実施形態では、本開示は、nnAA残基を含む免疫原性ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、少なくとも2つの非天然アミノ酸残基は、少なくとも2つの異なる非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、少なくとも2つの異なる非天然アミノ酸は、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、または2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリペプチドは、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープを含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、担体タンパク質である。別の実施形態では、nnAAは、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、nnAAは、リジン残基と置換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、抗原と接合している。別の実施形態では、抗原は、nnAAと接合している。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるT細胞非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、エキソ多糖類、例えば、黄色ブドウ球菌のエキソ多糖類などの細菌非莢膜多糖を含む。
一実施形態では、本開示は、nnAA残基を含む担体タンパク質を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAA残基を含む。別の実施形態では、非天然アミノ酸は、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、または2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、nnAAは、リジン残基と置換される。別の実施形態では、nnAA残基は、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープ中にではない位置にある。別の実施形態では、置換は、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523、およびK527、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、置換は、配列番号1のK25、K213、K245、K265、K386、およびK523の組み合わせを含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるT非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、ポリペプチドは、T細胞依存性免疫反応を発生させることができる。
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質のアミノ酸残基と接合している抗原を含むタンパク質であって、抗原が担体タンパク質の天然アミノ酸残基と接合しない、タンパク質を提供する。別の実施形態では、抗原は、担体タンパク質のリジン残基と接合しない。別の実施形態では、アミノ酸は、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープ中にない。別の実施形態では、抗原は、ハプテン、細菌莢膜多糖、細菌リポ多糖類、または腫瘍由来のグリカンからなる群から選択されるT非依存性抗原を含む。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。
理想的には、担体タンパク質は、無細胞タンパク質合成システムにおいて発現されたときに、少なくとも50mg/L(例えば少なくとも100mg/L、少なくとも150mg/L、少なくとも200mg/L、または少なくとも250mg/L)の溶解度を有するべきである。
担体が1つ超のnnAA残基を含む場合、単一種のみのnnAAを含む(例えば、担体中のnnAAのみが、pAMFである)ことが好ましい。これにより、同じ接合化学を各nnAAで同時に使用することが可能になる。2つの異なる抗原を単一の担体分子に付着させることが望まれる場合、これは、単一の担体内の異なるnnAA種を使用し、かつ各抗原を異なるnnAAに接合することによって達成され得るが、担体中の単一種のnnAAに対する接合が好ましい。さらに、組成物が複数の異なる接合体(例えば、異なる肺炎球菌血清型)を含む場合、各接合体が同じ単一種のnnAAを含むことが好ましい。さらに、組成物が複数の異なる接合体(例えば、異なる肺炎球菌血清型)を含む場合、各接合体が同じ担体タンパク質を含むことが好ましい。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。別の実施形態では、本開示は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
4.非天然アミノ酸
nnAA残基は、任意選択的に、この出願、または細胞ベースの、または無細胞タンパク質合成と互換性があるものとして同定されている他の出願に記載されている非天然アミノ酸のうちのいずれかを含む(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Schultz et al.Annu Rev Biochem.2010;79:413-44 particularly pp.418-420、およびChin et al.Annu Rev Biochem.2014;83:5.1-5.30を参照されたい)。
本実施形態の方法において使用され得る非天然アミノ酸の例としては、チロシンアミノ酸の非天然アナログ;グルタミンアミノ酸の非天然アナログ;フェニルアラニンアミノ酸の非天然アナログ;セリンアミノ酸の非天然アナログ;トレオニンアミノ酸の非天然アナログ;アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロー、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ホウ酸、ボロン酸、リン酸、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせ;光励起性架橋剤を含むアミノ酸;スピン標識アミノ酸;蛍光アミノ酸;新規官能基を含むアミノ酸;別の分子と共有結合的に、もしくは非共有結合的に相互作用するアミノ酸;金属結合アミノ酸;金属含有アミノ酸;放射性アミノ酸;光ケージおよび/もしくは光異性化アミノ酸;アミノ酸を含有するビオチンもしくはビオチン-アナログ;グリコシル化もしくは炭水化物改変アミノ酸;アミノ酸を含有するケト;ポリエチレングリコールもしくはポリエーテルを含むアミノ酸;重原子置換アミノ酸;化学的に開裂可能な、もしくは光分解性アミノ酸;細長い側鎖を有するアミノ酸;毒性基を含有するアミノ酸;糖置換アミノ酸、例えば、糖置換セリンなど;炭素連結糖含有アミノ酸;レドックス活性アミノ酸;α-ヒドロキシ含有酸;アミノチオ酸含有アミノ酸;α,α二置換アミノ酸;β-アミノ酸;プロリン以外の環状アミノ酸などが挙げられる。
本発明で使用するのに特に好ましいnnAAは、翻訳中に(細胞または無細胞系に)組み込まれ得、かつ20個の天然に生じるアミノ酸のうちのいずれにも見出されない官能基を提供するものである。そのようなアミノ酸をポリペプチドに組み込むための様々な技術が知られており、例えば、Young&Schultz(2010)J Biol Chem 285:11039-44,Maza et al.(2015)BioconjugateChem.26:1884-9、およびZimmerman et al.(2014)BioconjugateChem.25:351-61を参照されたい。
具体的には、nnAA残基は、任意選択的に、別個の抗原分子またはハプテンの対応する基との「クリック」化学反応に好適な化学基を含む。「クリック」化学に好適な化学基には、アジド(N)基、アルキン(C≡C)基、アルケン(C=C)基、および1,2,4,5-テトラジン(
Figure 2023022188000006
)基を含むがこれらに限定されない。
接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つのnnAA、好ましくは少なくとも2つのnnAAを含む担体タンパク質であり、抗原は、少なくとも1つのnnAAと接合している。いくつかの実施形態では、少なくとも1つのnnAAは、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ2,3-二置換プロパン酸である。
別の関連する実施形態では、接合体は、ポリペプチドおよび抗原を含み、ポリペプチドは、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つのnnAA残基を含む担体タンパク質であり、抗原は、nnAAと接合しており、さらに、nnAA残基は、式XIIの構造を有するアミノ酸に対応し、
Figure 2023022188000007
式中、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
は、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、
その結果、ポリペプチド中のnnAA残基は、式XIIIの構造を有し、
Figure 2023022188000008
式中、Rは、OHまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Rは、Hまたは担体タンパク質のアミノ酸残基である。
一実施形態では、本開示は、配列番号1による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と交換される少なくとも1つのnnAAを含むポリペプチドであって、少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と交換され、nnAAが連結部分を含む、ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。別の実施形態では、配列番号1のK265が交換される。別の実施形態では、配列番号1のK386が交換される。別の実施形態では、配列番号1のK265およびK386が交換される。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
別の実施形態では、ポリペプチド中のnnAAは、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル含有置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ2,3-二置換プロパン酸である。好ましい実施形態では、3位の置換基は、アジド含有置換基であり、より好ましい実施形態では、アジド含有置換基は、連結基を通じて3位の炭素原子に結合される末端アジド基を含む。例えば、連結基は、任意選択的に置換され、任意選択的にヘテロ原子含有である、アリーレン部分を含み得る。例えば、連結基は、0~4つのヘテロ原子および0~4つの非水素環置換基を含有する、5員または6員アリーレン部分を含み得る。
より好ましい実施形態では、nnAAは、式XIIの構造を有し、
Figure 2023022188000009
式中、
Arは、任意選択的に、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、
は、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、
Q1は、ゼロまたは1であり、
は、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択される。
この場合、ポリペプチド中の対応するnnAA残基は、式XIIIの構造を有し、
Figure 2023022188000010
式中、Rは、OHまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Rは、Hまたは担体タンパク質のアミノ酸残基であることが理解されるであろう。
いくつかの実施形態では、Arは、任意のヘテロ原子を含有せず、この場合、好ましいリンカーは、非置換フェニレン基である(すなわち、Arは、-C-である)。他の実施形態では、Arは、窒素ヘテロ原子と、N、O、およびSから選択される少なくとも1つの追加のヘテロ原子とを含有する。例示的な窒素複素環は、以下に記載されており、Arは、例えば、ピリジンまたはピリダジンであり得る。特に好ましい実施形態では、Q1は1であり、Wは低級アルキレンであり、Wはアジドである。
アジド含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、アジド含有nnAAを含む。特定の実施形態では、nnAA残基は、式Iのアジド含有nnAAを含み、
Figure 2023022188000011
式中、
Dは、-Ar-W3-または-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-であり、
Arは、
Figure 2023022188000012
であり、
W1、W2、およびW3の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各Xは、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
各Y1は、独立して、単一の結合、-NH-、または-O-であり、
各Y2は、独立して、単一の結合、-NH-、-O-、またはN連結もしくはC連結ピロリジンイレンであり、
、Z、およびZのうちの1つは、-N-であり、Z、Z、およびZのうちの他のものは、独立して、-CH-である。
他の実施形態では、nnAA残基は、式IIのアジド含有アミノ酸を含み、
Figure 2023022188000013
式中、
は、C~C10アルキレンである。
一実施形態では、nnAA残基は、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、または2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアジド含有アミノ酸を含む。さらなる実施形態では、nnAA残基は、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)を含む。pAMFは、接合体を生成するための非常に好ましい反応速度論を提供する(例えば、SPAAC法でアルキン含有炭水化物抗原と反応するときに、pAFを使用するよりもはるかに迅速である)。
式IおよびIIによるアジド含有アミノ酸の調製は、例えば、参照により組み込まれる、Stafford et al.US2014-0066598A1、特に段落[0331]~[0333]に見出される。本プロセスは、塩化チオニルを使用した対応するアリールアミノ酸の誘導体の塩化物との水酸基の置換、続いて塩化物のアジドとの求核置換を伴う。好適なアミノ酸を含有するアリール側鎖がまた、市販で入手される。
1,2,4,5-テトラジニル含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸残基は、nnAAを含有する1,2,4,5-テトラジンを含む。特定の実施形態では、非天然アミノ酸は、式IIIのnnAAを含有する1,2,4,5-テトラジンを含み、
Figure 2023022188000014
式中、
Arは、
Figure 2023022188000015
であり、
Vは、単一の結合、低級アルキレン、または-W1-W2-であり、
W1およびW2の一方は、不存在であるか、または低級アルキレンであり、他方は、-NH-、-O-、または-S-であり、
、Z、およびZのうちの各1つは、-CH-または-N-であり、Z、Z、およびZのうちの他のものは、各々独立して、-CH-であり、Xは、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
Rは低級アルキルであり、
任意選択的に、Arが
Figure 2023022188000016
であり、Vが-NH-である場合、Z、Z、およびZのうちの1つは、非天然アミノ酸が
Figure 2023022188000017
でないという条件で、-N-である。
式IIIによる1,2,4,5-テトラジン含有アミノ酸の調製は、例えば、参照により組み込まれる、Yang et al.US2016-0251336A1、特に段落[0341]~[0377]に見出される。本プロセスは、Arを導入するためのアミノピリジル臭化物との(R)-2-アミノ-3-ヨードプロパン酸のアミノ/カルボキシル保護誘導体の根岸カップリング、続いてテトラジン部分をアミノ酸に導入するためのメチルチオ-1,2,4,5-テトラジン誘導体との反応を伴う。
アルキン含有アミノ酸
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、アルキン含有nnAAを含む。一実施形態では、これは、プロパルギル基である。様々なプロパルギル含有アミノ酸であって、その合成を含む、プロパルギル含有アミノ酸は、Beatty et al.Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,7364-7;Beatty et al.J.Am.Chem.Soc.2005(127):14150-1;Nguyen et al.J Am Chem Soc.2009(131):8720-1に見出される。そのようなプロパルギル含有アミノ酸は、細胞ベースのシステムを使用した、nnAAとしてのタンパク質への組み込みに好適である。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、ホモプロパルギルグリシン、エチニルフェニルアラニン、およびN6-[(2-プロピニルオキシ)カルボニル]-L-リジンからなる群から選択されるプロパルギル含有nnAAを含む。
5.改変担体タンパク質
一態様では、少なくとも1つのnnAA残基を含むポリペプチドは、天然担体タンパク質(例えば、eCRM)、または天然担体タンパク質の1つもしくは複数のT細胞活性化エピトープを含むポリペプチドの改変型である。そのような改変に好適な担体タンパク質は、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197などの接合体ワクチンにおいて使用されるタンパク質を含むがこれらに限定されない。
多くの天然担体タンパク質のアミノ酸および核酸配列は、公的に入手可能である。しかしながら、上記のように、そのような非改変(または天然)担体タンパク質は、任意の表面露出アミノ酸に対する非識別的抗原接合を含む、限界を有する。結果として、T細胞活性化エピトープは、抗原接合が生じる部位であることが多い。本開示の好ましい実施形態では、免疫原性ポリペプチドは、接合の部位として使用するための少なくとも1つのnnAA残基の包含によって改変された担体タンパク質である。上記に考察されるように、nnAAは、天然残基と置換され得るか、またはポリペプチドの配列前に添加し、その後に添加するか、またはその内部に挿入することによってポリペプチドに加えられ得る。本明細書に記載されるように、非天然アミノ酸の使用は、接合のための非天然アミノ酸の選択的配置を可能にし、結果として、抗原接合における増強された担体タンパク質のT細胞活性化エピトープが回避され得る。
表1は、例示的な天然担体タンパク質:CRM197のアミノ酸および核酸配列(配列番号1および2)を示す。当業者であれば、コリネバクテリウム・ジフテリア菌の発酵によって生成される従来のCRM197のアミノ酸配列に対するN末端メチオニンの追加、および結果として生じる、従来のアミノ酸残基の位置番号付けに対する1の追加を認識するであろう。メチオニンは、これらの担体を生成するのに使用されている無細胞タンパク質の合成方法における開始コドンが本明細書に含まれるので、存在する。いくつかの態様では、nnAA残基を含む増強された担体タンパク質は、接合体ワクチンにおいて使用される同種の天然もしくは非毒性担体タンパク質と少なくとも80%の配列同一性、少なくとも85%の配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または少なくとも95%の配列同一性を有する。
配列番号1(CRM197)と配列同一性を有する担体タンパク質は、接合体中に担体タンパク質として使用されてもいる、非毒性K51E/E148K二重変異体などの他の変異体ジフテリア毒素タンパク質を含む(Pecetta et al.2016 Vaccine 34:1405-11)。配列番号1のこれらの変異形のうちのすべてにおいて、野生型ジフテリア毒素の天然毒性は不存在である(CRM197中のG52E変異、またはPecetta et al.のK51E/E148K変異を介して
表1はまた、へモフィルス・インフルエンザ菌由来のタンパク質D(配列番号8)のアミノ酸配列を示す。nnAA残基を含む増強された担体タンパク質は、配列番号8と少なくとも80%の配列同一性を有し得る。配列番号8の少なくとも1つのLys残基は、nnAAによって交換され得る。配列番号8内に36個のLys残基があるので、いくつかは、nnAAによって交換され得、次に接合のために使用され得る。
ジフテリアもしくは破傷風毒素に関する配列同一性が判定される場合、それは、処理済みの重鎖配列に関して、例えば、P00588-1のアミノ酸226-567、またはP04958-1のアミノ酸458-1315(UniProt配列)に関して、判定されるべきである。
いくつかの実施形態では、nnAA残基を含む増強された担体タンパク質は、担体タンパク質の完全未満の天然配列を含むか、代わりに、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD、HiD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、CRM197、Pfs25、または別の好適な天然もしくは非毒性担体タンパク質湯体の少なくとも1つもしくは複数のT細胞活性化エピトープを含む。いくつかの実施形態では、増強された担体タンパク質の毒性は、パラホルムアルデヒドでの処理に(またはホルムアルデヒドもしくはグルタルアルデヒドでの処理に)、続いて焼入冷却剤での処理に限定される。一実施形態では、nnAA残基を含む増強された担体タンパク質は、天然CRM197の複数のT細胞活性化エピトープを含むポリペプチドである。
Figure 2023022188000018

5a.nnAA含有CRM197
前述のように、表1は、CRM197のアミノ酸配列(配列番号1)を示す。CRM197(「交差反応物質197」、CRM197としても知られている)は、多くの承認された複合糖質ワクチンにおいて使用されるジフテリア毒素の非毒性変異体である(例えば、Broker et al.(2011)Biologicals 39:195-204を参照されたい)。本明細書で使用するのに好ましい担体タンパク質は、配列番号1と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、担体タンパク質は、1つ以上のnnAA(配列番号1内に挿入され得るか、または配列番号1内の1つ以上のアミノ酸残基と置換され得る、例えば、Lysおよび/もしくはPheと置換され得る)の存在を除いて、配列番号1のアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、配列番号1の少なくとも1つのLysおよび/または少なくとも1つのPhe残基は、nnAA残基によって置換される。nnAAを有する配列番号1の1つ超の残基を置換することが好ましく、理想的には、配列番号1の残基の1つのみの種が、nnAAによって置換され、例えば、Lys残基のみが置換される。配列番号1の1つ超の残基がnnAAと置換される場合、同じnnAAが、各位置で、例えば、各置換位置のpAMFで使用されることが好ましい。
配列番号1内に2~9つのnnAA残基を有する担体タンパク質が好ましく、理想的には、4~9つ、4~8つ、もしくは4~6つのnnAA残基、例えば4、5、もしくは6つのnnAA残基を有する。これにより、単一のnnAAを使用するよりも抗体への抗原のより広範囲の付着が可能になり、それによって不溶性をもたらし得る天然の配列および構造の過度の破砕を回避しながら、抗原:担体比率を増す。
CRM197の研究は、残基P272-D291、V322-G384、およびQ412-I458内のT細胞エピトープを同定した。したがって、配列番号1のこれらの領域内へのnnAAの導入を回避することが好ましい。これらの領域は、F274、F356、F361、F369、K420、K441、K446、K448、およびK457を含むため、これらは、CRM197中のnnAA置換により好ましくない、Phe残基およびLys残基である。配列番号1のnnAAによる置換に好ましいLys残基は、K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527である。nnAAによる置換に有用な他のLys残基は、K11、K38、K83、K104、K105、K126、K158、K173、K222、K237、K243、K475、およびK499である。nnAAによる置換に好ましいPhe残基は、F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532である。
CRM197の構造の研究は、2つの一般的な3D領域を明らかにしている:第1の領域は、N末端~Asn-374に及び、第2の領域は、Ser-375~C末端に及ぶ。理想的には、本発明で使用される担体は、第1の領域の少なくとも1つのnnAAおよび第2の領域の少なくとも1つのnnAA、例えば、各領域の少なくとも2つのnnAA、または各領域の少なくとも3つのnnAAを含む。これにより、担体に付着されたときに接合された抗原を空間的に離間させることが可能になる。第1の領域に3つのnnAAを有し、第2の領域に3つのnnAAを有する担体が有用である。
第1の領域は、27個のLys残基を含有し、第2の領域は、12個のLys残基を含有する。したがって、配列番号1のN末端の374個のアミノ酸内の1つ以上の(例えば3つの)Lys残基、およびC末端の162個のアミノ酸内の1つ以上の(例えば3つの)Lys残基が、nnAAにより、例えば、pAMF内で置換され得る。
CRM197に基づくnnAA含有担体の好ましい実施形態は、配列番号1のアミノ酸配列を有し、残基K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、および/またはK527のうちの1つ以上が、nnAAであり/によって交換される。1つのそのような配列は、配列番号9であり、各Xは、nnAA(好ましくは、pAMFなどの同じnnAA)を表す。
Figure 2023022188000019
この担体タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖に接合されたときに、良好な溶解度を維持し、かつ良好な免疫原性応答を提供しながら、無細胞タンパク質合成システムにおいて非常に良好に発現されることが見出された。
本発明はまた、複数の異なる接合体(例えば、異なる肺炎球菌血清型)であって、各接合体が、配列番号9のアミノ酸配列を有する担体タンパク質を含む(理想的には、各X残基は、同じnnAA、好ましくはpAMFである)複数の異なる接合体を含む組成物を提供する。
配列番号1は、野生型CRM197中には存在しないが、天然リーダー配列全体を必要とせずに、翻訳を開始するために含まれる、N末端メチオニン(典型的には、ホルミル化されるであろう)を有する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される担体タンパク質は、N末端メチオニンが欠落しており、例えば、配列番号1または配列番号9のN末端メチオニンが不存在であり得る。いくつかの実施形態では、CRM197に基づく担体タンパク質は、配列番号1のN末端の上流または配列番号1のC末端の下流に天然アミノ酸を含まない(およびより好ましくは、アミノ酸を含まない)。
これらのnnAA含有CRM197担体タンパク質は、肺炎球菌莢膜多糖に接合するのに特に有用である。これらの接合体を組み合わせて、本明細書のどこかで考察されるような多価組成物を形成することができる。
本発明はまた、免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するためのタンパク質であって、タンパク質が、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性(例えば少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%)を有するアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも1つのnnAAを含み、タンパク質がN末端メチオニンを有する、タンパク質を提供する。本発明はまた、タンパク質中の少なくとも1つのnnAAに多糖類を接合させることによって調製される免疫原性多糖類-タンパク質接合体を提供する。
本発明はまた、免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するためのタンパク質であって、タンパク質が、少なくとも1つの(例えば2~9つの)リジン残基がnnAAであることを除いて、配列番号1のアミノ酸配列を含む、タンパク質を提供する。nnAAは、理想的には、アジド含有nnAA(好ましいpAMFなど)、1,2,4,5-テトラジニル含有nnAA、またはアルケニル含有nnAAである。本発明はまた、接合体であって、そのnnAAのうちの少なくとも1つを介して多糖類抗原に接合されるタンパク質を含む、接合体を提供する。
本発明はまた、免疫原性多糖類-タンパク質接合体であって、タンパク質が、N末端メチオニンを有するCRM197である、免疫原性多糖類-タンパク質接合体を提供する。
nnAA含有CRM197担体は、典型的には、CRM197多量体を形成するために、他のCRM197サブユニットと関連しているのではなく、接合体を調製するために使用されたときに、単量体形態で存在する。
6.担体タンパク質の生成方法
ポリペプチド生成のための一般的な方法
増強された担体タンパク質は、ポリペプチドの生成について記載される任意の方法によって生成される。ポリペプチドの生成に好適な方法は、固相化学ペプチド合成、細胞ベースの組み換えタンパク質発現(大腸菌または天然宿主中の)、および無細胞タンパク質発現、ならびにそれらの任意の組み合わせ(例えば、合成成分と組み換えペプチド成分との組み合わせを使用した発現タンパク質結紮)を含むがこれらに限定されない。
増強された担体タンパク質生成方法の一実施形態では、nnAAを持つ増強された担体タンパク質は、「コドン再割り当て」を含む方法によって生成される。この実施形態の1つの変形例では、20個の標準的なアミノ酸(例えばホモアリルグリシン、フッ素化ロイシン、アジドホモアラニン)の近い構造的アナログである、nnAAを使用する。nnAAは、野生型アミノアシル-tRNA合成酵素を使用して、その対応するtRNAに荷重され、nnAAは、鋳型DNA配列において特定された20個の標準的なアミノ酸のうちの1つを完全に交換する。天然アミノ酸による干渉を防止するために、これは、一般的に、交換される天然アミノ酸について栄養要求性である細菌発現株の使用を必要とする。この方策は、特定の型のすべてのAA残基がnnAAにより交換されるため、残基特異的ではないアミノ酸である。
増強された担体タンパク質生成方法の別の実施形態では、nnAAを持つ増強された担体タンパク質は、「ナンセンス抑制」を含む方策によって生成される。このアプローチでは、非天然アミノ酸は、通常、天然ではアミノ酸を同定しない、まれなまたは「ナンセンス」コドンによって、鋳型DNA配列中に同定される。ナンセンス抑制アプローチの1つの変形例は、Schultz(Noren et al.Science.1989(244):182-188.)およびChamberlin(Bain et al.J Am Chem Soc.1989(111):8013-8014.)によって先駆的に実施されており、部位特異的な方法でnnAAをポリペプチドに組み込むために、そのtRNAおよびその対応するアミノアシル-tRNA合成酵素(aaRS)と共に、まれな終止コドンTAG(「アンバー」コドン、RNAコードにおけるUAG)の使用を伴う。
一実施形態では、「ナンセンス抑制」アプローチは、tRNA/aaRS対の単離、直交性コドン(例えば、アンバーコドンTAG、オパールコドンTGA、または翻訳においてアミノ酸を同定するために一般的に使用されない別のコドンもしくは塩基配列)を認識するための抗コドンループでのtRNAの改変、およびアミノアシル-tRNA天然アミノ酸よりもnnAAを優先するためのaaRSの改変を伴う。この実施形態のいくつかの変形例では、tRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素対は、ポリペプチドの合成のために使用される翻訳機構と同じ微生物由来のモノである。他の実施形態では、tRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素対は、ポリペプチドの合成のために使用される翻訳機構とは異なる種由来のモノである。tRNA抗コドンループおよびaaRS活性部位を改変するための方法は、操作された直交性tRNA/aaRS対の例であるように記載されている。
「ナンセンス抑制」アプローチの別の実施形態では、増強された担体タンパク質の生成は、操作されたアミノアシル-tRNA合成酵素の使用を伴わない。この実施形態では、直交性tRNAのみが、直交性コドン(例えば、アンバーコドンTAG、または翻訳においてアミノ酸を同定するために一般的に使用されない別のコドンもしくは塩基配列)を認識するために、抗コドンで単離および改変される。次に、直交性操作tRNAは、好適な化学方法(例えば、T4 RNAリガーゼおよび変異体tRNAPheの使用を伴う、Heckler et al.Biochemistry.1984 Mar 27;23(7):1468-73の方法)によってインビトロでアシル化され、かつ無細胞タンパク質合成抽出物中に補足される。この実施形態は、化学的にアシル化されたtRNAを使用するため、無細胞のタンパク質合成方法とのみ互換性がある。
無細胞タンパク質合成
nnAA含有担体タンパク質を生成するのに特に有用な技術は、無細胞タンパク質合成を使用する。いくつかの無細胞タンパク質発現技術は、当該技術分野で知られており、様々なnnAAを、nnAAの潜在的な細胞傷害効果を回避しながら、この方法で組み込むことができる(例えば、Quast et al.(2015)FEBS Letters 589:1703-12の表1を参照されたい)。いくつかの実施形態では、増強された担体タンパク質は、無細胞抽出物ベースのタンパク質合成によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、または大腸菌の抽出物を含む。さらなる実施形態では、無細胞抽出物に、アミノ酸、エネルギー源、エネルギー再発生システム、または陽イオン補助因子、およびそれらの任意の組み合わせを補足する。いくつかの実施形態では、抽出物は、外因的に補足された変異体tRNAまたは変異体aaRS(アミノアシルtRNA合成酵素)、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、抽出物は、変異体tRNAまたは変異体aaRSを遺伝子的にコードする大腸菌株由来の溶解物、およびそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、溶解物のために使用される大腸菌株は、RF-1弱毒化株である。互換性がある無細胞タンパク質合成システムは、式I、II、およびIIIの組み換えポリペプチドへの挿入について記載されている(例えば、US8715958B2、US2016/0257946A1、およびUS2016/0257945A1)。
一例では、US8715958B2は、メタノコッカス・ヤナシイ(Wang et al.(2001)Science 292(5516):498-500)由来のtRNATyr/チロシン-合成酵素対を使用して、非天然アミノ酸p-アジド-L-フェニルアラニン(pAF)を、組み換えクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、GM-CSF、およびTetAに導入する、再発生無細胞大腸菌ベースのシステムを実証している。このシステムを使用して、tRNA/合成酵素対は、抽出物内に補足されるか、または抽出物を作製するために使用される細菌へと形質変換されるかのいずれかである。
別の例では、US2016/0257946A1は、(a)p-アジドメチル-L-フェニルアラニン(pAMF)をアンバー認識tRNAに優先的に荷重するように、変異原性を使用して上記のメタノコッカス・ヤナシイチロシン-合成酵素を適応させる方法、および(b)改変された合成酵素/tRNA対を含む無細胞合成システムを使用して、pAMFをトラスツズマブなどの抗体に選択的に組み込む方法を実証している。
さらなる例では、US2016/0257945A1は、(a)(S)-2-アミノ-3-(5-((6-メチル-1,2,4,5-テトラジン-3-イルアミノ)メチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸(ピリジルテトラジンアミノ酸誘導体)をアンバー認識tRNAに優先的に荷重するように、変異原性を使用して上記のメタノコッカス・ヤナシイチロシン-合成酵素を適応させる方法、および(b)改変された合成酵素/tRNA対を含む無細胞合成システムを使用して、(S)-2-アミノ-3-(5-((6-メチル-1,2,4,5-テトラジン-3-イルアミノ)メチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸を組み換えGFPに選択的に組み込む方法を実証している。
さらなる実施形態では、本開示は、2つ以上の非天然アミノ酸を含有する無細胞抽出物中にポリペプチドを生成する方法を提供する。この実施形態では、ポリペプチドはまた、天然タンパク質に匹敵する生物活性を有する。他の実施形態では、ポリペプチドは、天然タンパク質に匹敵する改善または増強された生物活性を有する。
任意選択的に、機能的アッセイにおいて活性のレベルを判定し、非機能的アッセイにおいて存在するタンパク質の量を定量化し(例えば、免疫染色、ELISA、クマシーまたは銀染色ゲルでの定量化など)、かつ生物学的活性タンパク質または非凝集タンパク質と総タンパク質との比率を判定することによって、組成物中のタンパク質の比活性度を判定する。一般的に、そのように定義されるような比活性度は、天然タンパク質の少なくとも約5%の比活性度であり、通常、天然タンパク質の少なくとも約10%の比活性度であり、任意選択的に、約20%、約40%、約60%以上である。
いくつかの実施形態では、nnAA含有ポリペプチドを生成する方法は、nnAA特異的tRNA、nnAA特異的合成酵素、nnAA自体の濃度、または翻訳温度、およびそれらの任意の組み合わせの変更を伴う。そのような条件は、任意選択的に、翻訳エラーの減少、nnAAの組み込みの改善された割合、nnAAの組み込むによるタンパク質折り畳みのために必要なシャペロンの活性の改善、nnAA組み込みに干渉する細胞因子の活性の低下、または前述の機構の任意の組み合わせを可能にする。
増強されたポリペプチド生成方法のいくつかの実施形態では、nnAA特異的tRNA濃度は、約20μMを超える濃度まで増加され、可溶性または活性ポリペプチドの画分の増加をもたらす。この実施形態のさらなる変形例では、tRNA濃度は増加され、nnAA濃度は、約2mM未満に保たれ、nnAA合成酵素は、約5μM未満に維持される。
増強されたポリペプチド生成方法のいくつかの実施形態では、翻訳混合物の培養温度は、セ氏20フ度~30度、セ氏約20度、またはセ氏20度未満である。いくつかの変形例では、これらの温度の改変は、独立して、先行する段落に記載されている、nnAA特異的tRNA濃度、nnAA濃度、またはnnAA合成酵素濃度と組み合わされる。
7.配列変異体
本開示の改善された担体タンパク質は、ポリペプチドの1つ以上のT細胞エピトープの免疫原性機構が保存される限り、ポリペプチド内の任意の位置で置換される1つ以上のnnAAを含む。改善された担体タンパク質を既知の担体に基づかせる場合、通常、担体の特性に悪影響を与える機会を最小限に抑えるために、nnAAのうちのいくつかまたはすべてを既知の担体における既存の天然に生じるアミノ酸と置換することが好ましい。しかしながら、nnAAは、開始担体配列への追加として内部に、または終端に挿入され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、改善された担体タンパク質(例えば、eCRM)中の少なくとも1つのnnAAは、T細胞エピトープを含むタンパク質の1つ以上の領域内に存在しない。別の実施形態では、増強された免疫原性ポリペプチド中のnnAAは、T細胞エピトープを含むタンパク質の1つ以上の領域内に存在しない。
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含む、20個の天然にコードされるアミノ酸のうちの1つ以上と置換される。いくつかの他の実施形態では、nnAA残基は、脂肪族、芳香族、酸性、塩基、ヒドロキシル、硫黄含有、またはアミド(アミド基を含有する)などの、特定の種類の天然アミノ酸残基のうちの1つ以上と置換される。いくつかの場合では、1つのみの特異的アミノ酸(例えば、リジン)が、1つ以上の位置でポリペプチド内のnnAAと置換される。他の場合では、2つ以上の異なるアミノ酸(例えば、リジン、フェニルアラニンなど)は、2つ以上の位置でポリペプチド内のnnAAと置換される。リジンおよびフェニルアラニンは、(i)既存の担体タンパク質への接合のためにリジンが使用されることが多く、そのためnnAA含有担体が同じ付着部位に維持され得、かつ(ii)多くの有用なnnAAがフェニルアラニンベースであり、そのためnnAAを有する担体が、天然配列と比較して最小限の構造的改変を有し得るという理由で、nnAAによる置換について好ましい。単一種のみのアミノ酸がnnAAと置換される、例えば、残基のみが置換される、ポリペプチドが好ましい。
いくつかの実施形態では、nnAA残基は、担体タンパク質の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15個の天然アミノ酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、担体タンパク質の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15個の天然アミノ酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、nnAA残基は、配列番号1の少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、または少なくとも15個の天然アミノ酸残基と置換される。
さらなる態様では、nnAAは、担体タンパク質内の1つ以上のアミノ酸残基と置換される。本明細書に記載される単一または複数置換nnAA変異形を作出するために選択される特異的アミノ酸残基は、任意選択的に、タンパク質をサブドメインに分割し、かつ互いを立体的に遮らない(例えば、置換部位間にマルチオングストローム距離があるように)単一のアミノ酸またはアミノ酸残基のセットを置換のために選択することによって判定される。CRM197の2つの構造的領域への分割を以下に考察する。
いくつかの実施形態では、nnAAは、荷電したアミノ酸残基と置換される。したがって、nnAAは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、またはヒスチジンアミノ酸残基と置換され得る。いくつかの実施形態では、nnAAは、負に荷電したアミノ酸残基、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基と置換される。いくつかの実施形態では、nnAAは、正に荷電したアミノ酸残基、例えば、リジン、アルギニン、またはヒスチジン残基と置換される。
いくつかの実施形態では、nnAAは、免疫原性ポリペプチド内の1つ以上のリジン残基と置換される。例えば、配列番号1の増強された型は、以下の方法、1)K25、K34、K38、およびK40からなる群由来の1つの残基、2)K213およびK215からなる群から選択される1つの残基、ならびに3)K228、K245、K265、K386、K523、およびK527からなる群から選択される2~4つの残基で、nnAAをリジンと置換することによって発生される。またさらなる実施形態では、置換された特定の種類の天然アミノ酸残基のうちの1つ以上は、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523、およびK527、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、配列番号1のnnAA置換は、K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、およびK527のうちの1つ以上から選択される。一実施形態では、nnAA置換は、配列番号1のK25、K215、K228、K265、K386、およびK523からなる6つの残基を含む。いくつかの実施形態では、配列番号1のnnAA置換は、K265を含む。他の実施形態では、配列番号1のnnAA置換は、K386を含む。別の実施形態では、配列番号1のnnAA置換は、K265およびK386を含む。さらなる実施形態では、nnAAは、フェニルアラニンと置換される。置換に好ましいフェニルアラニンは、配列番号1のF13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532を含む。それらの近接性のために、一般的に、F531およびF532の両方で置換しないことが好ましい。
試験された大多数の対象によって認識されたジフテリア毒素へのヒトCD4+細胞に対する結合エピトープは、残基271-290、321-340、331-350、351-370、411-430、または431-450を包含する(Raju et al.,Eur J Immunol.1995 Dec;25(12):3207-14を参照されたい)。したがって、いくつかの実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、配列番号1の残基271-290、321-340、331-350、351-370、411-430、および/または431-450内にない。一実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、配列番号1の残基331-350内にない。別の実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、配列番号1の残基321-340内にない。また別の実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、配列番号1の残基431-450内にない。
試験されたすべての対象によって認識された破傷風毒素へのヒトCD4+細胞に対する結合エピトープは、重鎖残基H176-195、IDKISDVSTIVPYIGPALNI[配列番号3]、およびH491-510、NNFTVSFWLRVPKVSASHLE[配列番号4]を包含する(Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis.1997 Feb;175(2):382-91を参照されたい)。したがって、いくつかの実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基176-195および/または491-510内にない。別の実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基176-195内にない。また別の実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、破傷風毒素の前駆体タンパク質の重鎖ペプチド成分の残基491-510内にない。
試験された大多数の対象によって認識された髄膜炎菌外膜タンパク質(OMPまたはPorA)へのヒトCD4+細胞に対する結合エピトープは、大部分が可変領域の外側に位置し、異なる髄膜球菌(および淋菌)株の中に保存される、例えば、OMPの保存される推定トランス膜領域に対応する、免疫優性T細胞エピトープを包含する(Wiertz et al.J Exp Med.1992;176(1):79-88)。したがって、いくつかの実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、OMPの保存された領域内ににない。
試験された大多数の対象によって認識された連鎖球菌株G148のGタンパク質由来の担体タンパク質であるBBへのヒトCD4+細胞に対する結合エピトープは、BB配列における、アミノ酸25-40(VSDYYKNLINNAKTVE[配列番号5])、63-78(DGLSDFLKSQTPAEDT[配列番号6])、および74-89(AEDTVKSIELAEAKVL[配列番号7])を包含する(Goetsch et al.,Clin Diagn Lab Immunol.2003 Jan;10(1):125-32)。したがって、いくつかの実施形態では、置換された1つ以上のnnAAは、BB配列の残基25-40、63-78、および/または74-89内にない。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの非天然アミノ酸残基を含む免疫原性ポリペプチドは、少なくとも1つの抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む免疫原性ポリペプチドは、増強された担体タンパク質であり、かつ少なくとも1つの抗原をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含む免疫原性ポリペプチドは、増強された担体タンパク質であり、かつ少なくとも1つの抗原をさらに含む。
8.T細胞エピトープ
担体タンパク質のT細胞エピトープは、任意選択的に、既知の方法のうちのいずれかによって判定される。本開示の改善された担体タンパク質の設計における支援として、タンパク質中のT細胞結合エピトープは、タンパク質の両親媒性プロファイル、配列モチーフ、定量化マトリクス(QM)、人工神経ネットワーク(ANN)、サポートベクターマシン(SVM)、定量化構造活性関係(QSAR)、および分子ドッキングシミュレーションなどの様々な要因を考慮するアルゴリズムを使用して予測される(Desai et al.Methods Mol Biol.2014;1184:333-64を参照されたい)。例えば、ジフテリア毒素/CRMにおけるT細胞結合エピトープは、DeLisi&Berzofskyアルゴリズムを使用して予測されている(Bixler et al.WO89/06974 and PNAS 82:7848,1985を参照されたい)。予測されたT細胞エピトープを、実験的に確認することができる。例えば、対象となる免疫原性ポリペプチドのT細胞エピトープは、免疫原性ポリペプチド(または予測された領域)の完全な配列に対応する部分的に重複するペプチド断片を合成し、かつ各断片の存在下でのCD4+細胞株(例えば、末梢血単核細胞(PBMC))の増殖アッセイを実行することによって、実験的に判定され得る。この一般的なアプローチは、ジフテリア毒素(Raju et al.,Eur J Immunol.1995 Dec;25(12):3207-14)、破傷風毒素(Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis.1997 Feb;175(2):382-91)、髄膜炎菌の外膜タンパク質(OMP)(J Exp Med.1992 Jul 1;176(1):79-88)、および連鎖球菌株G148のGタンパク質由来の担体タンパク質であるBB(Goetsch et al.,Clin Diagn Lab Immunol.2003 Jan;10(1):125-32)におけるT細胞エピトープをマップ化するために用いられている。1つ以上のnnAAの存在によって不活性化されていないT細胞エピトープの存在を構築するために、CD4+細胞増殖および/またはサイトカイン応答に対して本開示の改善された担体タンパク質を直接スクリーニングすることができる。
9.接合体の生成方法
一実施形態では、本開示は、セ氏約10度~セ氏約30度の温度で維持された無細胞発現混合物中にnnAAを含むポリペプチドの合成のための方法を提供する。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を上回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約20度を下回る。別の実施形態では、温度は、セ氏約14度~セ氏約18度である。別の実施形態では、ポリペプチドは、抑制コドンを含む核酸によってコードされる。別の実施形態では、無細胞発現混合物は、nnAAに対して特異的な直交性tRNA/アミノアシル-tRNA合成酵素対を含む。別の実施形態では、tRNAの濃度は、少なくとも20μMである。別の実施形態では、nnAAの濃度は、約2mM未満であり、アミノアシル-tRNA合成酵素の濃度は、約5μM未満である。別の実施形態では、本方法は、ポリペプチドを活性部分に接合させることを含む。別の実施形態では、活性部分は、ハプテン、細菌抗原、ウィルス抗原、腫瘍由来のグリカン、ペプチド毒素、マクロライド、ポリエーテル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、ポリペプチドは、成長ホルモン、凝固因子、プラズマタンパク質、インターロイキン、T細胞受容体の細胞外ドメイン、成長因子の細胞外ドメイン、細菌抗原、ウィルス抗原、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、発現混合物は、大腸菌、小麦胚芽、またはウサギの網状赤血球の細胞抽出物を含む。別の実施形態では、発現混合物は、少なくとも30%細胞抽出物を含む。別の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含む。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも40%(w/w)である。別の実施形態では、生成されたポリペプチドは、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも60%(w/w)である。一実施形態では、無細胞発現によって生成されたポリペプチドは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つのnnAAを含み、可溶性画分と不溶性画分との比率は、少なくとも少なくとも20%(w/w)、少なくとも30%(w/w)、少なくとも40%(w/w)、少なくとも50%(w/w)、60%(w/w)、少なくとも70%(w/w)、少なくとも80%(w/w)、少なくとも90%(w/w)である。
抗原
任意選択的に、増強された担体タンパク質への付着を促進するために、化学ハンドルでさらに誘導体化された免疫原性抗原を本明細書に記載する。一実施形態では、抗原は、任意の精製された天然、合成、もしくは組み換え生成された高分子またはその断片である。例としては、脂質、多糖類、核酸、またはポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせ(例えば、糖タンパク質、グライコリポタンパク質、糖脂質)を含むがこれらに限定されない。例えば、糖脂質は、任意選択的に、グリコシルホスファチジルイノシトールである。別の実施形態では、抗原は、細菌多糖類、細菌リポ多糖類、腫瘍由来のグリカン、もしくはハプテンからなる群から選択されるT非依存性もしくはT活性化抗原(通常、弱いT活性化抗原)である。
細菌由来の多糖類いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、莢膜多糖などの細菌由来の多糖類を含む。そのような莢膜多糖は、免疫反応に対して微生物を保護する機能を果たす、グラム陽性またはグラム陰性細菌の高分子質量のポリマーであり、そのように、目標が中和抗体の生成である場合に、魅力的なワクチン標的を表す。そのような莢膜多糖は、一般的に、透析濾過、タンパク質除去、エタノール沈殿、核酸除去、および凍結乾燥を伴うプロセスを介して、対応する細菌の全体的な細胞溶解物または培養上清から調製される。例としては、Merieuxプロトコル(Institut Merieux(1980)Brevet Belge 80:26320)およびYavordiosプロトコル(Yavordios et al.EP0071515A1(1983))を含むがこれらに限定されない。
肺炎連鎖球菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、莢膜多糖は、肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖を含む。肺炎連鎖球菌は、肺炎、細菌感染症、および髄膜炎を引き起こし得る、被包されたグラム陽性細菌である。血清型特異的繰り返し単位構造を有する莢膜多糖を持つ、肺炎連鎖球菌の90個の別個の文書化された(例えば、Kalin,M.Thorax 1998;53:159-162に概説された)血清型がある。したがって、いくつかの場合、抗原は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、7A、7B、7C、8、9A、9L、9N、9V、10F、10A、10B、10C、11F、11A、11B、11C、11D、12F、12A、12B、13、14、15F、15A、15B、15C、16F、16A、17F、17A、18F、18A、18B、18C、19F、19A、19B、19C、20、21、22F、22A、23F、23A、23B、24F、24A、24B、25F、25A、27、28F、28A、29、31、32F、32A、33F、33A、33B、33C、33D、34、35F、35A、35B、35C、36、37、38、39、40、41F、41A、42、43、44、45、46、47F、47A、および48(Henrichsen J Clin Microbiol 1995;33:2759-2762)から選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。しかしながら、これらの血清型のサブセットのみが、一般に、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fを含む、細菌感染の原因となる。血清型6C、7C、15A、15C、16F、23A、23B、31、34、35B、35F、37、および38も、血清型20A、20B、および24Bを有するように、臨床的に懸念になっている。別の実施形態では、抗原は、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fから選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、血清型6C、7C、15A、15C、16F、23A、23B、31、34、35B、35F、37、および38から選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖である。本明細書に記載される実施形態はまた、追加的に、血清型20A、20B、および24Bから選択される肺炎連鎖球菌の莢膜多糖のうちの1つ以上を含み得る。
前述のように、本発明の組成物は、少なくとも14、15、20、21、24、または25個の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体を含み得る。組成物が14個以上の血清型を含む場合、これらは、好ましくは、13個の血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、および23Fを含む。これらの13個の血清型に加えて、組成物は、好ましくは、血清型2、8、9N、10A、11A、12F、15B、17F、20、22F、および/または33Fのうちの1つ以上を含む。代替的に、上記13個の血清型に加えて、組成物は、好ましくは、1つ以上の血清型2、6C、8、9N、10A、12F、15A、15B、15C、16F、17F、20、20A、20B、22F、23A、23B、24F、24B、31、33F、34、35B、35F、および38を含む。15個以上の(例えば、16個以上の)血清型の有用な組み合わせは、血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fの各々を含み、かつ血清型8も含み得る。20個以上の(例えば21個以上の)血清型の有用な組み合わせは、血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、および33Fの各々を含む。24個以上の血清型の有用な組み合わせは、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fの各々を含む。
一般的な肺炎連鎖球菌の血清型莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、Jones et al.(Jones C et al.An Acad Bras Cienc.2005 Jun;77(2):293-324)に記載されている。
1型
[→3)-D-AAT-α-Galp-(1→4)-α-D-GalpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-GalpA-(1→]
2型
[→4)-β-D-Glcp-(1→3)-[α-D-GlcpA-(1→6)-α-D-Glcp-(1→2)]-α-L-Rhap-(1→3)-α-L-Rhap-(1→3)β-L-Rhap-(1→]
3型
[→3)-β-D-GlcA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]
4型
[→3)-β-D-ManpNAc-(1→3)-α-L-FucpNAc-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→4)-α-D-Galp2,3(S)Py-(1→]
5型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-PnepNAc-(1→2)-β-D-GlcpA-(1→3)]-α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-Sugp-(1→]
6B型
[→2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)-D-Rib-ol-(5→P→]
9N型
[→4)-α-D-GlcpA-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-β-D-ManpNAc-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-GlcpNAc-(1→]
9V型
[→4)-α-D-GlcpA(2/3OAc)-(1→3)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-ManpNAc(4/6OAc)-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→]
12F型
[→4)-[α-D-Galp-(1→3)]α-L-FucpNAc-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→4)-[α-D-Glc-(1→2)-α-D-Glc-(1→3)]-β-D-ManNAcA-(→]
14型
[→4)-β-D-Glcp-(1→6)-[β-D-Galp-(1→4)]-β-D-GlcpNAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→]
18C型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-D-Glcp(6OAc)(1→2)][Gro-(1→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→3)-β-L-Rhap-(1→]
19F型
[→4)-β-D-ManpNAc-(1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1→P→]
23F型
[→4)-β-D-Glcp-(1→4)-[α-L-Rhap-(1→2)]-[Gro-(2→P→3)]-β-D-Galp-(1→4)-β-L-Rhap-(1→]
多糖類のより広範囲の考察は、Geno et al.(2015)Clin.Microbiol.Rev.28:871-99に見出され、ここで表1は、97個の既知の血清型についての構造を示す。この表はまた、アセチル化が完全でないときにアセチル化される単糖類の残基の比率を開示する。
莢膜多糖は、任意選択的に、O-アセチル化される。いくつかの実施形態では、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F由来の莢膜多糖は、10~100%、20~100%、30~100%、40~100%、50~100%、60~100%、70~100%、75~100%、80~100%、90~100%、50~90%、60~90%、70~90%、または80~90%のO-アセチル化の程度を有する単糖類を含む。他の実施形態では、O-アセチル化の程度は、10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、または約100%である。多糖類のO-アセチル化の程度は、任意選択的に、例えば、プロトンNMRによって判定される(例えば、Lemercinier&Jones(1996)Carbohydrate Research 296:83-96;Jones et al.(2002)J.Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247を参照されたい)。いくつかの実施形態では、O-アセチル基の存在は、イオン-HPLC分析によって判定される。通常、接合体中の多糖類は、細菌から精製された開始多糖類中に見られるO-アセチル化レベルを保持するだろう。
実施形態では、血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F由来の莢膜多糖は、10kDa~4,000kDaの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~4,000kDaの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~1,400kDaの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~3,500kDa、50kDa~3,000kDa、50kDa~2,500kDa、50kDa~2,000kDa、50kDa~1,750kDa、50kDa~1,500kDa、50kDa~1,250kDa、50kDa~1,000kDa、50kDa~750kDa、50kDa~500kDa、100kDa~4,000kDa、100kDa~3,500kDa、100kDa~3,000kDa、100kDa~2,500kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~1,750kDa、100kDa~1,500kDa、100kDa~1,250kDa、100kDa~1,000kDa、100kDa~750kDa、100kDa~500kDa、200kDa~4,000kDa、200kDa~3,500kDa、200kDa~3,000kDa、200kDa~2,500kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~1,750kDa、200kDa~1,500kDa、200kDa~1,250kDa、200kDa~1,000kDa、200kDa~750kDa、または200kDa~500kDaの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
莢膜多糖は、任意選択的に、天然に見られる莢膜多糖に対して化学的に改変される。例えば、多糖類は、任意選択的に、脱O-アセチル化(部分的にまたは完全に)、脱N-アセチル化(部分的にまたは完全に)、N-プロピオン化(部分的にまたは完全に)などされている。脱アセチル化は、任意選択的に、化学ハンドルもしくはポリペプチドへの接合前、中、または後に生じるが、典型的には、接合前に生じる。
化膿連鎖球菌の多糖類いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、化膿連鎖球菌由来の多糖類を含む。化膿連鎖球菌は、咽頭炎、扁桃腺炎、猩紅熱、蜂窩織炎、丹毒、リウマチ熱、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、壊疽性筋膜炎、筋壊死、およびリンパ管炎を含む、ヒトにおける多様な感染の原因となるグラム陽性細菌(A群連鎖球菌、すなわち「GAS」としても知られる)である。実施形態では、多糖類は、化膿連鎖球菌の莢膜多糖である。化膿連鎖球菌の莢膜多糖は、繰り返し単位が、以下の構造を有する高分子ポリマーである、ヒアルロン酸から構成され:
[→4)-β-D-GlcUAp-(143)-β-D-GlcpNAc-(→]
これは、化膿連鎖球菌の血清型間で不変であるように思われる。
実施形態では、化膿連鎖球菌由来の莢膜多糖は、10kDa~4,000kDaの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~4,000kDaの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~3,500kDa、50kDa~3,000kDa、50kDa~2,500kDa、50kDa~2,000kDa、50kDa~1,750kDa、50kDa~1,500kDa、50kDa~1,250kDa、50kDa~1,000kDa、50kDa~750kDa、50kDa~500kDa、100kDa~4,000kDa、100kDa~3,500kDa、100kDa~3,000kDa、100kDa~2,500kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~1,750kDa、100kDa~1,500kDa、100kDa~1,250kDa、100kDa~1,000kDa、100kDa~750kDa、100kDa~500kDa、200kDa~4,000kDa、200kDa~3,500kDa、200kDa~3,000kDa、200kDa~2,500kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~1,750kDa、200kDa~1,500kDa、200kDa~1,250kDa、200kDa~1,000kDa、200kDa~750kDa、または200kDa~500kDaの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
別の実施形態では、多糖類は、化膿連鎖球菌由来の非莢膜多糖である。非莢膜多糖は、α-L-(1→3)およびα-L-(1→2)連結を交互にすることによって接続されたポリ-L-ラムノピラノシル単位の骨格を含み、N-アセチル-β-D-グルコースアミン残基が、ラムノース骨格の3位に付着される、A群連鎖球菌の細胞壁多糖類を含む。
実施形態では、化膿連鎖球菌由来のA群連鎖球菌の細胞壁多糖類は、10kDa~4,000kDaの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~4,000kDaの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~3,500kDa、50kDa~3,000kDa、50kDa~2,500kDa、50kDa~2,000kDa、50kDa~1,750kDa、50kDa~1,500kDa、50kDa~1,250kDa、50kDa~1,000kDa、50kDa~750kDa、50kDa~500kDa、100kDa~4,000kDa、100kDa~3,500kDa、100kDa~3,000kDa、100kDa~2,500kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~1,750kDa、100kDa~1,500kDa、100kDa~1,250kDa、100kDa~1,000kDa、100kDa~750kDa、100kDa~500kDa、200kDa~4,000kDa、200kDa~3,500kDa、200kDa~3,000kDa、200kDa~2,500kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~1,750kDa、200kDa~1,500kDa、200kDa~1,250kDa、200kDa~1,000kDa、200kDa~750kDa、または200kDa~500kDaの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
ストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、ストレプトコッカス・アガラクチア由来の莢膜多糖を含む。ストレプトコッカス・アガラクチア(B群連鎖球菌、すなわちGBSとも呼ばれる)は、免疫学的に脆弱なヒトにおける敗血症、肺炎、および髄膜炎、ならびに乳牛におけるウシの乳房炎を引き起こす、哺乳動物と一般的に片利共生的なグラム陽性細菌である。別個の莢膜多糖の繰り返し単位(Ia、Ib、II-IX)を有する少なくとも10個のストレプトコッカス・アガラクチアの血清型があるが、血清型のサブセットのみが、一般に、疾患の原因となっている。これらは、血清型Ia、Ib、II、III、およびVを含み、これらの血清型由来の莢膜多糖の接合体を調製することができる。一般的なストレプトコッカス・アガラクチアの血清型の莢膜多糖の繰り返し単位についての構造は、決定されており、以下のとおりである。
Ia型
Figure 2023022188000020
Ib型
Figure 2023022188000021
II型
Figure 2023022188000022
V型
Figure 2023022188000023
ヘモフィルス・インフルエンザ菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、へモフィルス・インフルエンザ菌由来の莢膜多糖を含む。へモフィルス・インフルエンザ菌は、肺炎、細菌感染症、髄膜炎、喉頭蓋炎、蜂窩織炎、および感染性関節炎を含む、広範囲の局所的かつ浸潤性感染の原因となる、グラム陰性の嫌気性病原菌である。別個の莢膜多糖の化学構造(a~f型)を有するヘモフィルス・インフルエンザ菌の少なくとも6つの血清型がある。しかしながら、a型およびb型のみが、へモフィルス・インフルエンザ菌の「高病原性」株と考えられ、小児期感染症の大部分が、b型によって引き起こされると考えられ(Jin et al.Infect.Immun.June 2007 vol.75 no.6 2650-2654)、これはしたがって、本発明で使用するためのへモフィルス・インフルエンザ菌の多糖類の好ましい型である。b型の莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、決定されており、以下のとおりである。
[→3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-Ribitol-(5→OPO →]
髄膜炎菌の莢膜多糖いくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、髄膜球菌由来の莢膜多糖を含む。髄膜球菌は、髄膜炎および髄膜炎菌敗血症性感染の主要な原因病原体であるグラム陰性細菌である。別個の莢膜多糖の化学構造(血清群A、B、C、E-29、H、I、K、L、W-135、X、Y、Z、およびZ’(29E))を有する髄膜球菌の少なくとも13個の血清群がある。しかしながら、6つのみの血清群(A、B、C、W-135、X、Y)が、生命を脅かす疾患を引き起こすと考えられる。接合体の調製について対象となる5つの主な生命を脅かす血清群についての莢膜多糖の繰り返し単位の構造は、決定されており、以下のとおりである。
A型
[→6)-α-D-ManpNAc(3/4OAc)-(1→OPO3→]
C型
[→9)-α-D-Neup5Ac(7/8OAc)-(2→]
W-135型
[→6)-α-D-Galp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
X型
[→4)-α-D-GlcpNAc-(1→OPO→]
Y型
[→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Neup5Ac(9OAc)-α-(2→]
ポルフィロモナス・ジンジバリスの莢膜多糖別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。Van Winkelhoff et al.(1993)Oral Microbiol.Immunol.8:259-265、およびLaine et al.(1996)J.Periodontal Res.31:278-84を参照されたい。
サルモネラ・チフス菌の莢膜多糖別の実施形態では、抗原は、Vi多糖類である。Viは、サルモネラ・チフス菌の莢膜多糖(以前は種自体として分類されていたが、現在ではサルモネラ属のチフス血清型とも呼ばれている)である。Viはまた、サルモネラ菌の他の血清型(サルモネラ属血清型パラチフスCまたは血清型ダブリンなど)および他の細菌では、シトロバクター属(例えばC.freundiiおよびC.youngae)などにも見られ得る。Vi多糖類は、C-3位で60~90%アセチル化されたα1,4-N-アセチルガラクトース-アミノウロン酸である、ヘキソサミンウロン酸の線状ホモポリマーである。Viに対するO-アセチル置換は、防御的免疫反応を誘発するその能力における因子である。Viの免疫原性は、O-アセチル化のその程度に密接に関連している。部分的な脱O-アセチル化は、免疫原性をわずかに増加させ得、完全な脱O-アセチル化は、Viの免疫原性を取り除く。本発明で使用されるVi多糖類は、天然に見られるような莢膜多糖に対して化学的に改変され得る。例えば、Vi多糖類は、部分的に脱O-アセチル化、脱N-アセチル化(部分的にまたは完全に)、N-プロピオン化(部分的にまたは完全に)などされ得る。脱アセチル化は、接合の前、中、または後に生じ得るが、好ましくは、接合の前に生じる。脱アセチル化などの効果は、定常アッセイによって評価され得る。
黄色ブドウ球菌の糖類別の実施形態では、抗原は、黄色ブドウ球菌由来の多糖類である。多糖類は、ポリ-N-アセチルグルコースアミン(PNAG)である黄色ブドウ球菌のエキソ多糖類、または例えば、5型、8型、もしくは336型である黄色ブドウ球菌の莢膜多糖であり得る。
クロストリジウム・ディフィシルの表面多糖類別の実施形態では、抗原は、PS-IまたはPS-IIなどのクロストリジウム・ディフィシル由来の表面グリカンである。
グルカン別の実施形態では、抗原は、β-1,3-連結および/またはβ-1,6-連結を含むグルカンである。これらの接合されたグルカンは、例えばカンジダアルビカンスに対して抗真菌性免疫反応を高めるのに有用であり得る。グルカンは、とりわけ真菌細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。β-グルカンは、グルコースサブユニット間の1つ以上のβ-連結を含む。本発明により使用されるグルカンは、β-連結を含み、かつβ-連結のみを含み得る(すなわち、α連結がない)。グルカンは、1つ以上のβ-1,3-連結および/または1つ以上のβ-1,6-連結を含み得る。それは、1つ以上のβ-1,2-連結および/またはβ-1,4-連結も含み得るが、通常、そのβ連結のみが、β-1,3-連結および/またはβ-1,6-連結であろう。グルカンは、分岐状または直鎖であり得る。グルカンは、真菌性グルカンであり得る。「真菌性グルカン」は、一般的に、真菌から得られるが、特定のグルカン構造は、真菌および非真菌の両方(例えば、細菌中では、下等植物または藻類)に見られ、次に、非真菌性微生物は、代替源として使用され得る。したがって、グルカンは、カンジダアルビカンスなどのカンジダ菌の細胞壁由来のものであり得、またはコクシジオイデス・イミチス、トリコフィトン・ベルコースム、ブラストマイセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォーマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、サッカロマイセス・セレビシエ、パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス、またはピシウム菌由来のものであり得る。真菌性β-グルカンの様々な供給源がある。例えば、純粋なβ-グルカンは、市販されており、例えば、プスチュラン(Calbiochem)は、Umbilicaria papullosaから精製されたβ-1,6-グルカンである。β-グルカンは、真菌細胞壁から様々な方法で精製され得る。いくつかの実施形態では、グルカンは、例えば、ラミナリン中に見られるような、何らかのβ-1,6分岐を有するβ-1,3グルカンである。ラミナリンは、褐藻類および海藻中に見られる。ラミナリンのβ(1-3):β(1-6)比率は、異なる供給源間で変化し、例えば、アラメのラミナリン中では3:2ほどの低さであるが、コンブのラミナリン中では7:1の高さである。したがって、本明細書で使用されるグルカンは、1.5:1~7.5:1、例えば、約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、または7:1のβ(1-3):β(1-6)比率を有し得る。他の実施形態では、グルカンは、独占的にまたは主に、カードラン中に見られるような、β-1,3連結を有する。したがって、グルカンは、β-1,3-連結グルコース残基(例えば、独占的に1,3連結を有する線状β-D-グルコピラノース)のみから作製され得る。しかしながら、任意選択的に、グルカンは、β-1,3-連結グルコース残基ではない単糖類残基を含み得、例えば、β-1,6-連結グルコース残基を含み得る。β-1,3-連結グルコース残基とこれらの他の残基との比率は、少なくとも8:1(例えば、≧9:1、≧10:1、≧11:1、≧12:1、≧13:1、≧14:1、≧15:1、≧16:1、≧17:1、≧18:1、≧19:1、≧20:1、≧25:1、≧30:1、≧35:1、≧40:1、≧45:1、≧50:1、≧75:1、≧100:1など)であるべきである。
腫瘍由来のグリカンいくつかの実施形態では、多糖類を含む抗原は、腫瘍細胞の発生的に不適切な細胞表面グリカン特性を含む。他の中でも特に、ダニシェフスキージェン(Zhu et al.Expert Rev Vaccines.2009(10):1399-1413に概説される)は、特定のオリゴ糖モチーフ(時期特異的胚抗原、SSEA)が、胚形成中の細胞表面に元々発現され、大人の腫瘍中に「再活性化」されることを発見した。これらは短い多糖類であるので、それらは主に、化学合成(上記のZhuに概説される)を介してアクセスされる。これらのオリゴ糖の中で、発癌(例えば、前立腺癌および乳癌)と最も明確に関連するのは、グロボ-H、Le、STn、TF、およびTnである。
ハプテンいくつかの実施形態では、抗原は、ハプテン:1,000Da未満の分子量の非ポリマー合成部分を含む。治療的タンパク質接合体でのハプテンの用途は、乱用薬物、例えば、ニコチンまたはコカインを模倣するハプテンである(例えば、Berkowitz&Spector.Science.1972(178):1290-1292 for morphine、Kosten et al.Vaccine.2002(20):1196-1204 for cocaine、およびHatsukami et al.Clin Pharmacol Ther.2005(78):456-467を参照されたい)。別様に、免疫原性ポリペプチドに対して十分に免疫原性でない小分子の接合は、薬物特異的抗体を高めることを可能にし、これにより乱用薬物を中枢神経系から隔離する。
結果として生じる、抗原および組成物についての誘導体化および調製の方法
本明細書の先に記載されるようなポリペプチドの非天然アミノ酸に導入された対応する基と反応することができる化学ハンドルを含有する抗原を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドへの対応する基との「クリック」化学反応に好適な基を含む。「クリック」化学に好適な化学基は、アジド(-N)基、アルキン(C≡C)基、ホスフィン(例えば、-P(Ph))基、アルケン(C=C)基、および1,2,4,5-テトラジン(
Figure 2023022188000024
)基を含むがこれらに限定されない。
化学ハンドルは、3つの工程:(a)抗原の活性化、(b)任意選択的に、通常、抗原中に存在しない反応性を導入するためのリンカーまたは求核性基との抗原の反応、および(c)抗原の化学ハンドルへの接合を含む、一般的なプロセスを介して導入される。いくつかの実施形態では、工程(a)~(c)のうちの2つ以上は、化学ハンドルがN-ヒドロキシスクシンイミドなどの反応性部分の追加によって改変された場合などに、同時に起こる。いくつかの実施形態では、工程(a)~(c)のうちの2つ以上は、工程間の抗原の任意選択的な精製により、分離的である。いくつかの実施形態では、工程(a)は、追加的に、特定の官能基(例えばヒドロキシル、アミン、チオール)が活性化によりアクセス可能であるように、抗原の保護基を除去するための工程を含む。
化学ハンドルは、任意選択的に、抗原に対する様々な場所に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、終端(例えば、多糖類の還元末端および非還元末端、ポリペプチドのN末端およびC末端、またはグリセリドのアシル鎖の末端)に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、内部場所(例えば、ポリペプチドの内部アミノ酸、または内部ヒドロキシル、アミン、または多糖類の活性化ヒドロキシル)に導入される。いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、内部場所に加えて1つ以上の末端に導入される。抗原のために使用される活性化の特定の方法は、接合のために活性化された場所、したがって抗原の接合された化学ハンドルの最終的な場所に影響を与えるだろう。担体との複数の連結を達成し得るように、抗原に複数の化学ハンドルを導入することが好ましい。
好ましい実施形態では、化学ハンドルを介してポリペプチドを抗原に接合するための方法は、以下のとおりである。抗原は、少なくとも1つの第1の化学ハンドルを内部に組み込むように活性化され、ここで第1の化学ハンドルは、ポリペプチド中のnnAAの第2の化学ハンドルに接合することができる。活性化抗原は、第1および第2の化学ハンドルが抗原-ポリペプチド接合体を形成するように反応する条件下で、第2のハンドルを持つ少なくとも1つのnnAAを含有するポリペプチドと組み合わされる。そのように可能にされる反応は、非触媒共有結合生体接合反応である。「第1の化学ハンドル」として機能する抗原の反応性部位は、好ましくはアルキニル基であり、アルキニル基は、反応性を増加させる分子環境に組み込まれ得る。例えば、アルキニル基は、環、例えば、ジアリール歪みシクロオクチンなどのシクロオクチニル環に組み込まれ得る。nnAA残基によって提供されるポリペプチド中の好ましい反応性部位、すなわち、「第2の化学ハンドル」は、アジド基である。当該技術分野で知られているように、この場合の反応は、以下でさらに詳細に考察される、「歪み促進アジド-アルキン負荷環化」(SPAAC)として当該技術分野で参照される[3+2]負荷環化である。
抗原の活性化
抗原は、任意選択的に、生体接合体の生成について記載される任意の化学方法を使用して活性化される。そのような方法は、過ヨウ素酸塩酸化、固有のアルデヒド(例えば、多糖類の還元末端)の脱マスキング、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDAP)の活性化、または1,1’-カルボニルジイミダゾール(CDI)とのヒドロキシルの活性化、その後の求核付加を含むがこれらに限定されない。単糖類誘導体化のさらなる化学方策は、Hermanson(Hermanson,Greg.Bioconjugate Techniques(2008))に記載されている。活性化には、シアン化試薬(p-ニトロフェニルシアネート、CDAP、またはN-シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロホウ酸など)、活性エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ノルボルネン、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUなどを使用することができる。
本発明は、以下に考察される化学のうちのいずれかにより活性化される抗原(具体的には、肺炎球菌莢膜多糖抗原などの本明細書に開示されるような多糖類抗原)、例えば、抗原と以下に考察される1つ以上のDBCO基およびDIFO基との反応の生成物を提供する。
過ヨウ素酸塩の活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、過ヨウ素酸塩酸化により活性化される。いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩酸化は、アルデヒド基を抗原に導入するために使用され、かつ1)多糖類、および2)活性化抗原を生成するためのポリペプチドのN末端残基へのアルデヒドの付加に有用である。過ヨウ素酸塩は、第1級もしくは第2級ヒドロキシルまたはアミンをいずれかの末端に保持する炭素-炭素結合を開裂し、そのため、隣接するヒドロキシルを持つ炭水化物糖残基、または2-アミノアルコール部分を含有するアミノ酸(N-末端トレオニンまたはセリン残基)を活性化する。アルデヒド部分は長半減期を有するため、この方法によって活性化された抗原は、任意選択的に、活性化後にクロマトグラフィーにより精製および/または凍結乾燥される。
抗原の過ヨウ素酸塩酸化について、(a)抗原を溶液中に溶解し、(b)過ヨウ素酸塩の供給源を濃縮された原液から抗原に加えて、酸化混合物を形成し、(c)反応混合物を培養し、かつ(d)(任意選択的な)過度の過ヨウ素酸塩を除去する。
脱イオン水または好適な緩衝液は、任意選択的に、酸化反応のために使用される。いくつかの実施形態では、工程(a)の溶液は脱イオン水である。いくつかの実施形態では、工程(a)の溶液は、略生理的pHのpKaを有する緩衝液の有効量を含む。いくつかの実施形態では、工程(a)の溶液は、略生理的pHのpKaを有する緩衝液の有効量を含み、緩衝液は、アミン基を含まない。非アミン系緩衝液の例は、酢酸、ギ酸、およびリン酸を含むがこれらに限定されない。
工程(b)の過ヨウ素酸塩源は、任意選択的に、水溶液中で適切な安定性を有する任意の過ヨウ素酸塩源から選択される。過ヨウ素酸塩源の例は、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、テトラブチルアンモニウム(メタ)過ヨウ素酸塩、過ヨウ素酸バリウム、過ヨウ素酸水素ナトリウム、(パラ)過ヨウ素酸ナトリウム、および(メタ)過ヨウ素酸テトラエチルアンモニウムを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、多糖類のすべての入手可能なジオールをアルデヒドに変換するように調節される。例えば、室温での培養と組み合わせた、過ヨウ素酸ナトリウムの大幅な超過(多糖類のモル濃度に関して、>1000xの超過、または10mM溶液の過ヨウ素酸ナトリウム)は、アルデヒドよりもジオールの総変換が好ましい。
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、低量の酸化/アルデヒド形成を多糖類鎖に導入するように調節される。化学反応における化学量論量未満の過ヨウ素酸ナトリウム(例えば、<1.0当量)は、低量の多糖類鎖酸化が好ましい。例えば、細菌単糖類は、0.001~0.7、0.005~0.5、0.01~0.5、0.1~1.2、0.1~0.5、0.1~0.2、0.5~0.8、0.1~0.8、0.3~1.0、または0.4~0.9モル当量の過ヨウ素酸塩によって活性化される(WO2011/110531を参照されたい)。別の実施形態では、0.4モル当量の過ヨウ素酸塩が、肺炎球菌莢膜多糖を含有するpH6.0溶液に加えられ、かつ25℃で17時間の間培養される(WO2011/110531を参照されたい)。
一実施形態では、細菌単糖類のビシナルジオールの0.001%、0.01%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%、10%、30%、50%未満、例えば、5~10%が、過ヨウ素酸塩の活性化中に酸化される(WO2011/110531を参照されたい)。低い反応温度はまた、より低量の多糖類鎖酸化が好ましい。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌19Fなどの特定の莢膜多糖の多糖類鎖酸化を最小限に抑えるために、低い過ヨウ素酸塩濃度(<0.1当量)を、4℃での一晩の反応と組み合わせる。
いくつかの実施形態では、過ヨウ素酸塩の付加および反応条件のレベルは、選択的な糖類および多糖類鎖に開裂を方向付けるように調節される。例えば、セ氏4度での1mMのNaIOは、文献中、炭素7、8、または9のシアル酸残基を選択的に酸化するために使用され、室温での10mMのNaIOは、シアル酸、ガラクトース、およびマンノース残基を含む、多種多様な糖残基を酸化するために使用されている。
タンパク質抗原中のN-末端セリンまたはメチオニン残基の酸化について、より温和な酸化条件(低い過ヨウ素酸塩濃度および反応時間)が、一般に、抗原の内部側鎖に対する酸化的損傷を回避するために使用される。実施形態では、工程(b)は、2.5mMの最終濃度まで過ヨウ素酸ナトリウムを加えることを含み、工程(c)は、反応混合物をセ氏25度で3分間培養することを含む。
過度の未反応過ヨウ素酸塩は、抗原中に免疫原性部分に対する望ましいものよりも高い酸化レベルまたは損傷を引き起こし得るため、過度の過ヨウ素酸塩は、任意選択的に、工程(d)で除去される。大きい抗原(>10kDa)について、過度の過ヨウ素酸塩は、いくつかの実施形態では、好適な分子量の分画もしくは排除限界を有する培地を使用する水もしくは緩衝溶液に対してサイズ排除、透析、または透析濾過によって除去される。小さい抗原については、サイズベースの精製は、不都合であり(短鎖ペプチドまたはオリゴ糖)、工程(d)の過ヨウ素酸塩の除去は、焼入冷却剤を加えることを含む。過度の過ヨウ素酸塩は、任意選択的に、グリセロールの付加(10%(v/v))、モル過剰の亜硫酸ナトリウムの付加、またはモル過剰のN-アセチルメチオニンの付加によってクエンチされる。
いくつかの実施形態では、多糖類もしくはタンパク質抗原は、過ヨウ素酸塩の活性化のためのヒドロキシルもしくはアミン基の近接性を増すように脱保護される。一実施形態では、多糖類のO-アセチルまたはN-アセチル基は、隣接するヒドロキシルの過ヨウ素酸塩に対する反応性を増すために除去される。多糖類の抗原について、脱O-アセチル化もしくは脱N-アセチル化は、任意選択的に、弱酸性(例えば、低濃度のHCl)もしくはアルカリ性(例えば、重炭酸ナトリウム)溶液中での培養、続いて任意選択的な加熱、および生理的pHに戻す調節によって達成される。いくつかの実施形態では、弱酸性処理(<0.1MのHClまたは<0.2MのAcOH)、続いて加熱および中和を使用して、高分子量の多糖類を部分的に加水分解(「サイズ決め」)する。いくつかの実施形態では、弱酸性処理(例えば<0.1MのHClまたは<0.2MのAcOH)、続いて加熱(45~95℃)および中和(pH5.5~6.0まで)を使用して、同時に、高分子量の多糖類を部分的に加水分解(「サイズ決め」)し、かつ多糖類を脱保護する。いくつかの実施形態では、血清型3、4、18C、および11Aは、多糖類を脱保護し、多糖類をサイズ決めし、またはそれらの両方を行うために、そのような酸/加熱/中和プロセスによって処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の血清型3多糖類は、0.18Mの酢酸、続いて85℃で1時間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の血清型4多糖類は、0.01MのHCl、続いて45℃で1時間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌の18C多糖類は、0.18Mの酢酸、続いて95℃で40分間の加熱により処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型11A多糖類は、0.18Mの酢酸、続いて80℃で1時間の加熱によって処理される。
別の実施形態では、脱イオン水または生理的pH緩衝液中のホルミル-L-メチオニルペプチドアミドヒドロラーゼによる処理によって、精製されたタンパク質のN-ホルミル基は除去され/アミン基は脱ホルミル化される。また別の実施形態では、精製されたタンパク質のN-ホルミル基は、-5℃での無水ヒドラジン蒸気による凍結乾燥タンパク質の処理によって除去される(Miyataki et al.Eur.J.Biochem.212,785-789(1993))。
CDAPの活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDAP)による一時的な付加物を形成することによって活性化される(例えば、WO2011/110531およびUS2012/0321658を参照されたい)。いくつかの実施形態では、タンパク質もしくは多糖類抗原の水酸基が、CDAPとの反応によって活性化され、一時的なシアナト(-OCN)付加物を形成し、次に、化学ハンドルもしくはリンカーの好適な求核試薬と反応されて、カルバミミデート連結を形成する。この実施形態では、抗原のC-C結合は、開裂されない(過ヨウ素酸塩の活性化とは対照的に)。いくつかの実施形態では、特定の莢膜多糖が、CDAPを使用して優先的に活性化される。特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型3、7F、または10Aの莢膜多糖が、CDAPを使用して活性化される。
抗原のCDAP活性化について、(a)抗原が好適な溶媒中に溶解され、(b)CDAPが原液から抗原に加えられ、(c)緩衝剤が加えられる。
CDAP活性化は、任意選択的に、任意の好適な溶媒中で行われる。いくつかの実施形態では、(a)の溶媒は、蒸留水を含む。さらなる実施形態では、(a)の溶媒は、追加的に、DMSOまたはアセトニトリルなどの有機溶媒を含む。特定の実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型3、7F、または10Aの莢膜多糖が、水中で活性化される。
いくつかの実施形態では、超または亜化学量論的(多糖類に関して)量のCDAPが、活性化のために使用される。いくつかの実施形態では、約0.1~約3当量のCDAPが、多糖類の活性化のために使用される。いくつかの実施形態では、約0.2~0.8当量のCDAPが、多糖類の活性化のために使用される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型3の莢膜多糖が、2.0当量のCDAPを使用して活性化される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型10Aの莢膜多糖が、0.8当量のCDAPを使用して活性化される。
いくつかの実施形態では、(c)の緩衝剤の付加を使用して、CDAP活性化の効率が劇的に増加される(Lees et al.Vaccine.1996(14):190-198)。いくつかの実施形態では、(c)の緩衝剤は、トリエタノールアミン(TEA)である。いくつかの実施形態では、約1~約4当量のTEA(多糖類に関して)が、緩衝剤として使用される。一実施形態では、約1~約4当量のTEAが、肺炎連鎖球菌血清型7Fの多糖類を伴う、CDAP活性化反応に対する緩衝剤として使用される。いくつかの実施形態では、2.5当量のTEAが、緩衝剤として使用される。一実施形態では、2.5当量のTEAが、肺炎連鎖球菌血清型7Fの多糖類を伴う、CDAP活性化反応に対する緩衝剤として使用される。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、ホウ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウム、およびそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約8.0~約11.0のpKaを有するか、または緩衝剤を使用して、約8.0~約11.0に対する反応溶液のpHを調節する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約9.0~約9.5のpKaを有するか、または緩衝剤を使用して、約9.0~約9.5の反応溶液のpHを調節する。一実施形態では、pHの9.5への水酸化ナトリウムの調節が、肺炎連鎖球菌血清型3の多糖類を伴うCDAP活性化反応のために使用される。一実施形態では、pHの9.5への水酸化ナトリウムの調節が、肺炎連鎖球菌血清型10Aの多糖類を伴うCDAP活性化反応のために使用される。
カルボニルジイミダゾール(CDI)/カルボニルジトリアゾール(CDT)の活性化
いくつかの実施形態では、抗原は、カルボニルジイミダゾール(CDI)またはカルボニルジトリアゾール(CDT)により活性化される。CDAPのようなCDIおよびCDTは、抗原の水酸基を活性化して、一時的な反応性部分を形成することができ、この場合、それは、不安定なカルバメート(CDIについて
Figure 2023022188000025
およびCDTについて
Figure 2023022188000026
)であり、これが次に、任意選択的に、化学ハンドルもしくはリンカーのアミンもしくはチオールと反応されて、カルバメートもしくはカルボノチオエート連結を形成する。活性化は、乾燥有機溶媒中で行われるべきである。いくつかの実施形態では、CDI/CDT活性化は、ジメチルスルホキシド(DMSO)中で行われる。いくつかの実施形態では、CDI/CDT活性化は、抗原に関してCDI/CDTのモル過剰を加えることによって行われる。他の実施形態では、CDI/CDT活性化は、抗原のモル量に略等しいCDI/CDTのモル量を加えることによって行われる。
化学活性化なし
いくつかの実施形態では、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの(例えば上記に考察されるように)内在性アミンもしくは他の求核性部分(例えば、第1級アミン)を使用して、化学ハンドルもしくは担体タンパク質に所与の多糖類を接合させる。そのような求核性部分は、好都合なことに、コハク酸誘導体のような様々な一般的な求電子接合試薬(例えば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)またはスルホ-NHSエステル)と反応され得る。そのような実施形態では、肺炎連鎖球菌のC-多糖類のような抗原汚染部室の分解を促進するための(i)におけるような過ヨウ素酸塩プロトコルにより処理することが有益な場合がある。この実施形態では、過ヨウ素酸塩の処理に続いて、任意の化学的に導入されたアルデヒド基をクエンチするために、膨大に過剰な水素化ホウ素ナトリウムにより処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型1の多糖類は、室温で約12~約14時間、約0.05~約0.25当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて約5当量~約15当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。一実施形態では、肺炎連鎖球菌血清型1の多糖類は、室温で18時間、0.15当量の過ヨウ素酸ナトリウムで処理され、続いて10当量の水素化ホウ素ナトリウムで処理される。
化学ハンドルに対する接合
いくつかの実施形態では、抗原は、上記に記載される活性化方法(「抗原の活性化」)と互換性がある任意の化学方法を使用して化学ハンドルに接合される。そのような方法は、合成抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化、ヒドラゾン形成、オキシム形成、直接求核付加、および天然抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、化学ハンドルとの接合反応における絶対多糖類濃度は、多糖類の凝集または交差反応性を最小限に抑えるために重要である。いくつかの実施形態では、DBCO(ジベンゾシクロ-オクチン)もしくはDBCO誘導体との接合反応における絶対多糖類/抗原濃度は、過ヨウ素酸塩もしくはCDAPによる多糖類の活性化にとって重要である。いくつかの実施形態では、DBCO/DBCO-誘導体の接合反応における多糖類濃度は、2未満、5未満、7未満、10未満、15未満、17.5未満、または20μモル/mL未満である。いくつかの実施形態では、DBCO/DBCO-誘導体の接合反応における多糖類濃度は、約1.5~約17.5μモル/mLである。
過ヨウ素酸塩活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記のように過ヨウ素酸塩により活性化された(「抗原の活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、アルデヒドとの安定的または準安定的付加物を形成する官能基を含む化学ハンドルが、過ヨウ素酸塩活性化抗原と組み合わされ、続いて任意選択的な還元と組み合わされて、準安定的付加物を安定的付加物に変換する(例えば、WO2014/111344;Wu et al.Vaccine 31(2013):5623-2626;Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Second Edition,2008を参照されたい)。これらの実施形態のいくつかの変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関する大きいモル過剰で加えられ、その結果、すべてのアルデヒドが、化学ハンドル/抗原接合反応において消費される。これらの実施形態の他の変形例では、化学ハンドルは、活性化抗原のアルデヒド基に関してより低いモル比率で加えられ、活性化抗原の過度の未反応アルデヒドは、過度の安価なアルデヒド-反応性求核試薬(例えば、エタノールアミン)によるさらなる反応によって、またはアルデヒドを水酸基に還元するのに十分強い還元剤(例えば、NaBH4)による処理によって消費される。
一実施形態では、化学ハンドルは、合成抗原アルデヒドによるシッフ塩基形成、続いて還元的アミノ化によって抗原に接合される。この実施形態は、化学ハンドルと抗原との間の第2級アミン連結:化学ハンドルのアミンと抗原の炭素原子との間の直接のN-C結合を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、化学ハンドルはアミンを含む。この実施形態では、接合方法は、DMSOを含有するDI水または緩衝液中の過ヨウ素酸塩活性化抗原とアミン含有ハンドルを組み合わせることと、培養してシッフ塩基を形成することと、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム(NaBHCN)を使用して、シッフ塩基を第2級アミンに還元することと、任意選択的に、未反応アルデヒドをNaBH4によりクエンチすることと、を含む。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、1:1のまたはその近くの化学量論で組み合わされる。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、モル過剰の化学ハンドルと組み合わされる。この方法のいくつかの実施形態では、化学ハンドルおよび抗原は、モル過剰の抗原と組み合わされる。いくつかの実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムは、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムなどのC=N結合を還元するための同様の選択により別の還元剤と置換される。
一実施形態では、化学ハンドルは、ヒドラゾン形成を介して抗原に接合される。この実施形態では、化学ハンドルは、ヒドラジド(-C(=O)-NH-NH)基を含む。この実施形態は、化学ハンドルと抗原炭素との間にヒドラゾン(-C(=O)-NH-N=C-)またはN’-アルキルヒドラジド(-C(=O)-NH-NH-C-)連結を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、接合方法は、pH6.0~8.5の溶液中でモル過剰のヒドラジド含有化学ハンドルを抗原と組み合わせることと、培養してヒドラゾン(-C(=O)-NH-N=C-)を形成することと、を含む。この方法のいくつかのさらなる実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物中に含めてN=C結合を還元し、これにより、N’-アルキルヒドラジド(-C(=O)-NH-NH-C-)が生成される。
一実施形態では、化学ハンドルは、オキシム形成によって抗原に接合される。この実施形態では、化学ハンドルは、アミノオキシ(-O-NH)基を含む。この実施形態は、化学ハンドルと抗原炭素との間にオキシム(-O-N=C-)連結を有する最終生成物をもたらす。この実施形態では、接合方法は、pH6.0~8.5の溶液中でモル過剰のアミノオキシ含有化学ハンドルを抗原と組み合わせることと、オキシム連結(-O-N=C-)を形成することと、を含む。この方法のいくつかのさらなる実施形態では、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムまたはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物中に含めて、N=C結合を還元し、安定性を改善し、これにより、N’-アルキルヒドロキシルアミン連結(-O-N-C-)が生成される。
CDAP活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにCDAPにより活性化された(「CDAP活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、CDAP活性化を介して生成された一時的なシアナト(-OCN)基が、アミン含有化学ハンドルとさらに反応されて、化学ハンドルと抗原炭素との間にカルバミミデート連結(-NH-C(=NH)-O-)を生成する。
化学ハンドルのCDAP接合について、抗原の水酸基は、上記に記載されるように活性化され(「CDAP活性化」)、アミンを含む化学ハンドルは、追加的に、活性化混合物に加えられる。シアナト基が不安定であるため、化学ハンドルは、一般的に、抗原の活性化のすぐ後(数分以内)に加えられる。いくつかの実施形態では、抗原は、CDAPが導入された2.5分後に加えられる。いくつかの実施形態では、抗原の活性化水産基に関して大きくモル過剰のアミン含有化学ハンドルが加えられる。他の実施形態では、化学ハンドルは、抗原の活性化水酸基に関して1:1のモル比率により近い濃度で加えられ、過度の未反応シアナト基は、過度の安価なアミン(例えば、エタノールアミンまたはヘキサンジアミン)の付加によって低減される。
CDI/CDT活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようにCDI/CDTにより活性化された(「カルボニルジイミダゾール(CDI)/カルボニルジトリアゾール(CDT)活性化」)ポリペプチドまたは多糖類の抗原に接合される。これらの実施形態では、抗原水酸基のCDI/CDT活性化(CDIについて
Figure 2023022188000027
およびCDTについて
Figure 2023022188000028
)によって生成された不安定なカルバメートは、第1級アミンとさらに反応して、安定的カルバメート(-NH-C(=O)-O-)連結を生成するか、または第1級チオールとさらに反応して、化学ハンドルと抗原炭素との間に安定的カルボノチオエート(-S-C(=O)-O-)連結を生成する。いくつかの実施形態では、抗原の活性化水酸基に関して大きくモル過剰のアミン/チオール含有化学ハンドルが加えられる。他の実施形態では、化学ハンドルは、抗原の活性化水酸基に関して1:1のモル比率に近い濃度で加えられる。またさらなる実施形態では、反応における残留CDI/CDTは、四ホウ酸ナトリウムによる処理によってさらに不活性化される。
非活性化抗原との反応
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、上記に記載されるようなポリペプチドもしくは多糖類の抗原由来の、天然に存在するか、もしくは脱保護工程の結果であるかのいずれかの、内在性アミンもしくは他の求核性部分(例えば、第1級アミン)に接合される。この一実施形態では、化学ハンドルの求電子基(例えば、NHSまたはスルホ-NHSエステル)は、抗原の第1級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミド連結(-C(=O)-NH-)を生成する。別の実施形態では、化学ハンドルのカルボン酸基は、標準的なペプチドカップリング試薬および条件の存在下で、第1級アミン基と反応されて、化学ハンドルと抗原アミンとの間にアミドを生成する。
アルキン含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、アジド基を含むnnAA基と反応することができるアルキン基である。最も単純な実施形態では、これはプロパルギル基であり、そのため、抗原のアルキン基は、式IVの構造を含み、
Figure 2023022188000029
式中、
22は、C~C10アルキルであり、
は、抗原の少なくとも1つの部分である。
他の実施形態では、抗原のアルキン基は、式IVaの構造を含み、
Figure 2023022188000030
式中、
22は、-(CHCHO)1-10-であり、
は、抗原の少なくとも1つの部分である。
いくつかの実施形態では、アルキン基は、アルキンのアジド基との反応を促進または容易にする追加の特徴をさらに含む。1つのそのような特徴の例は、8員環構造(例えば、シクロ-オクチン)であり、そのため、抗原のアルキン基は、DIFO基またはDBCO基をさらに含む。いくつかの実施形態では、抗原のアルキン基は、式V、式VI、またはVIaの構造を含み、
Figure 2023022188000031
式中、
は、独立して、結合、-NH-、-O-、-S-、-NH(L12)-、-O(L12)-、または-S(L12)-であり、
は、独立して、結合、-C(=O)-、-S(=O)-、-C(=O)L12-、-S(=O)12であり、
12は、独立して、L22またはL22NH-であり、
22は、独立して、C1-10アルキルまたは-(CHCHO)1-10-であり、
は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
いくつかの実施形態では、式VおよびVIaの構造は、好都合なことに、求核性基(例えば、第1級アミン)ならびに構造VおよびVIaの対応するDIFOもしくはDBCOカルボン酸のNHSもしくはスルホ-NHSエステルを含む抗原から形成される。いくつかの実施形態では、式VIの構造は、好都合なことに、活性化抗原、およびDBCO-NHまたはDBCO-PEGn-NHなどのDBCO誘導体から形成される。いくつかの実施形態では、DBCO-PEGn-NHは、DBCO-PEG-NHである。
Figure 2023022188000032
「PEGn」における「n」の値は、例えば、上記に示される構造中の、または式VII、式VIIb、式XI、もしくは部分「A」内の、またはL22のポリ(アルキルオキシ)内のオキシエチレンの繰り返し単位の数を表す。nの値は、1~20の範囲内、例えば、2~18、3~16、または4~14内である。したがって、nは、例えば、4、5、11、12、または13のうちのいずれかであり得る。
式IV、V、またはVIのいくつかの実施形態では、Uの部分は、多糖類の少なくとも1つのポリオールである。いくつかの実施形態では、Uの部分は、リポ多糖類の少なくとも1つのポリオールである。いくつかの実施形態では、Uの部分は、抗原ポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸である。
さらなる実施形態では、アルキンを含む抗原は、式VIIまたはVIIaの構造を含み、
Figure 2023022188000033
式中、
Xは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1である。
基(例えば、X、Y、またはU)がポリオールであるものと記載されている場合、これは、多糖類内のポリオールへの(例えば、単糖類がポリオールである多糖類内の単糖類への)化学付着を指し得る。付着自体は、任意の好適な官能基への(例えば、ビシナルジオールの酸化から生じ得るアルデヒドへの)付着であり得る。
さらなる実施形態では、アルキンを含む抗原は、式VIIbまたはVIIcの構造を含み、
Figure 2023022188000034
式中、
Xは、独立して、多糖類の少なくとも1つのアミノ糖のアミンであり、
nは、少なくとも1である。
いくつかの実施形態では、アルキンを含む抗原は、(A-X)-Yによる多糖類を含み、式中、
Aは、
Figure 2023022188000035
であり、
Xは、独立して、少なくとも1つのポリオールであり、
Yは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1であり、
zは、1を上回る。
いくつかの実施形態では、抗原は、少なくとも1.5%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、または少なくとも20%(w/w)の共有結合的に付着されたDBCOを含む多糖類を含む、DBCO基をさらに含む多糖類を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、約1.5%(w/w)を上回るDBCOを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、3%(w/w)を上回るDBCOを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、最大でも20%最大でも19%、最大でも18%、最大でも17%、最大でも16%、最大でも15%、最大でも14%、最大でも13%、最大でも12%、最大でも11%、最大でも10%、最大でも9%、最大でも8%、最大でも7%、最大でも6%、最大でも5%、最大でも4%、最大でも3.5%、最大でも3.0%、最大でも2.5%、最大でも2.0%、または最大でも約1.7%(w/w)の共有結合的に付着されたDBCOを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、20%(w/w)未満の共有結合的に付着されたDBCOを含む。他の実施形態では、抗原は、10%(w/w)未満の共有結合的に付着されたDBCOを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、約1.5~20%、3%~20%、3%~18%、3%~16%、3%~14%、3%~12%、3%~10%、3%~8%、3%~6%、または3%~4%、または1.5~9%(w/w)の共有結合的に付着されたDBCOを含む。
いくつかの実施形態では、抗原は、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、または少なくとも20%のDBCO分子を含む、DBCO基をさらに含む多糖類を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、3%を上回るDBCO分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、最大でも20%最大でも19%、最大でも18%、最大でも17%、最大でも16%、最大でも15%、最大でも14%、最大でも13%、最大でも12%、最大でも11%、最大でも10%、最大でも9%、最大でも8%、最大でも7%、最大でも6%、最大でも5%、最大でも4%、または最大でも3.5%の共有結合的に付着されたDBCO分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、多糖類の繰り返し単位当たり、20%未満の共有結合的に付着されたDBCOを含む。他の実施形態では、抗原は、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、10%未満の共有結合的に付着されたDBCO分子を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、約3%~20%、3%~18%、3%~16%、3%~14%、3%~12%、3%~10%、3%~8%、3%~6%、または3%~4%の共有結合的に付着されたDBCO分子を含む。
実施形態では、多糖類を含む抗原は、任意選択的に、オリゴ糖である。オリゴ糖は、少数の繰り返し単位(典型的には、5~15個の繰り返し単位)を有し、典型的には、合成的に、またはより高い分子量の多糖類の加水分解によって得られる。
実施形態では、多糖類を含む抗原は、約10kDa~約10,000kDaの分子量を有する。他のそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~10,000kDaの分子量を有する。さらなるそのような実施形態では、多糖類は、50kDa~10,000kDa、50kDa~9,500kDa、50kDa~9,000kDa、50kDa~8,500kDa、50kDa~8,000kDa、50kDa~7,500kDa、50kDa~7,000kDa、50kDa~6,500kDa、50kDa~6,000kDa、50kDa~5,500kDa、50kDa~5,000kDa、50kDa~4,500kDa、50kDa~4,000kDa、50kDa~3,500kDa、50kDa~3,000kDa、50kDa~2,500kDa、50kDa~2,000kDa、50kDa~1,750kDa、50kDa~1,500kDa、50kDa~1,250kDa、50kDa~1,000kDa、50kDa~750kDa、50kDa~500kDa、100kDa~10,000kDa、100kDa~9,500kDa、100kDa~9,000kDa、100kDa~8,500kDa、100kDa~8,000kDa、100kDa~7,500kDa、100kDa~7,000kDa、100kDa~6,500kDa、100kDa~6,000kDa、100kDa~5,500kDa、100kDa~5,000kDa、100kDa~4,500kDa、100kDa~4,000kDa、100kDa~3,500kDa、100kDa~3,000kDa、100kDa~2,500kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~2,000kDa、100kDa~1,750kDa、100kDa~1,500kDa、100kDa~1,250kDa、100kDa~1,000kDa、100kDa~750kDa、100kDa~500kDa、200kDa~10,000kDa、200kDa~9,500kDa、200kDa~9,000kDa、200kDa~8,500kDa、200kDa~8,000kDa、200kDa~7,500kDa、200kDa~7,000kDa、200kDa~6,500kDa、200kDa~6,000kDa、200kDa~5,500kDa、200kDa~5,000kDa、200kDa~4,500kDa、200kDa~4,000kDa、200kDa~3,500kDa、200kDa~3,000kDa、200kDa~2,500kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~2,000kDa、200kDa~1,750kDa、200kDa~1,500kDa、200kDa~1,250kDa、200kDa~1,000kDa、200kDa~750kDa、または200kDa~500kDaの分子量を有する。上記範囲のうちのいずれか内の任意の整数は、本開示の実施形態と考えられる。
実施形態では、多糖類を含む抗原は、約50kDa~約1,400kDaの分子量を有する。実施形態では、多糖類を含む抗原は、約500kDa~約3,000kDaの分子量を有する。
アジド含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、ポリペプチドのアルキン基またはホスフィンを含むnnAA残基と反応することができるアジド基である。いくつかの実施形態では、抗原のアジド基は、式VIIIの構造を含み、
Figure 2023022188000036
22は、結合、アルキル、またはポリ(アルキルオキシ)であり、
は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
アルケン含有ハンドル
いくつかの実施形態では、化学ハンドルは、ポリペプチドのnnAA残基の対応する基との「クリック」化学反応を可能にする部分を含む。1つのそのような部分は、1,2,4,5-テトラジン基を含むnnAA残基と反応することができるアルケン基である。最も単純な実施形態では、これはビニル基である。1つのそのような実施形態では、抗原のアルケン基は、式IXの構造を含み、
Figure 2023022188000037
式中、
は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
他の実施形態では、抗原のアルケン基は、式IXaの構造を含み、
Figure 2023022188000038
式中、
22は、C1-10アルキルまたは-(CHCHO)1-10-であり、
は、独立して、抗原の少なくとも1つの部分である。
一実施形態では、本開示は、複合糖質を生成するための方法であって、(a)担体タンパク質をコードする核酸であって、抑制コドンを含む、核酸を提供することと、(b)4-アジドメチルフェニルアラニン(pAMF)、抑制コドンと相補的であるtRNA、およびアミノアシル-tRNA合成酵素を含む無細胞細菌抽出物と核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、(c)担体タンパク質中の抑制コドンに対応する部位にpAMFを選択的に組み込むのに十分な条件下で(b)の反応混合物を培養することと、(d)[2+3]負荷環化によってpAMFを多糖類に接合することと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、[2+3]負荷環化は、アジドとアルキン基との間の反応を含む。別の実施形態では、工程(c)は、セ氏20度未満で反応混合物を培養することを含む。別の実施形態では、本方法は、追加的に、(c)の直後に担体タンパク質を精製することを含む。別の実施形態では、抑制コドンは、配列番号2のコドン25、34、38、40、213、215、228、245、265、386、523、または527と選択的に置換される。別の実施形態では、(b)の反応混合物は、タンパク質合成に必要な生体成分をさらに含む。別の実施形態では、(b)のtRNAを、pAMFで荷電することができる。別の実施形態では、(b)のアミノアシル-tRNA合成酵素は、20個の天然アミノ酸と比較して、pAMFでtRNAを優先的にアミノアシル化する。別の実施形態では、アルキン基は、多糖類に接合されたDBCO部分を含む。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、本開示は、工程(a)~(d)を含むプロセスによって調製された複合糖質を提供する。別の実施形態では、pAMFは、式X、Xa、XI、またはXIaの接合体を発生させるために多糖類に接合される。一実施形態では、本開示は、工程(a)~(d)によって調製された複合糖質を含むワクチンを提供する。
ポリペプチド抗原接合体
上記に記載されるような免疫原性ポリペプチドと上記に記載されるような抗原との間に形成され得るポリペプチド抗原接合体を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド抗原接合体は、増強された担体タンパク質および抗原を含み、ここで抗原は、増強された担体タンパク質中のnnAAに連結される。一実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの天然アミノ酸に連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチド内のリジンに連結されない。例えば、抗原は、配列番号1のリジンに連結されない。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドの1つ以上のnnAAにのみ連結される。1つ以上のnnAAは、任意選択的に、N末端、C末端、または免疫原性ポリペプチドのN末端とC末端との間のどこかに位置する。いくつかの場合では、抗原は、免疫原性ポリペプチド中の1つ以上のpAMFにのみ連結される。例えば、抗原は、配列番号1の1つ以上のpAMFにのみ連結される。
別の実施形態では、少なくとも1つの抗原は、免疫原性ポリペプチのT細胞エピトープの外側に位置するアミノ酸に連結される。別の実施形態では、抗原は、免疫原性ポリペプチドのT細胞エピトープ内に位置するアミノ酸に連結されない。
免疫原性ポリペプチド内で接合するために選択されるアミノ酸は、任意選択的に、ポリペプチドの結晶構造(またはNMR構造などの他の3D構造)に基づく1つ以上の表面アクセス可能な残基を含む。追加的または代替的に、接合についてのポリペプチドの特異的部位の効能を評価するために、nnAAとの天然アミノ酸の包括的な交換が、免疫原性ポリペプチドで行われ、続いて接合が行われる。
一実施形態では、抗原は、(例えば、最初に、増強された担体タンパク質もしくは抗原を反応性リンカーと組み合わせ、次に、増強された担体タンパク質-リンカーもしくは抗原-リンカー付加物を、それぞれ抗原もしくは増強された担体タンパク質と組み合わせることによって)間接的に増強された担体タンパク質に接合される。別の実施形態では、抗原は、(例えば、増強された担体タンパク質および抗原を含む2つの成分を1つの反応で一緒に組み合わせることによって)直接増強された担体タンパク質に接合される。接合体がリンカーを含む場合、任意の好適な基を使用することができる。例えば、接合体は、アジピン酸、アジピン酸ジヒドラジド(ADH)、β-プロピオンアミド、ニトロフェニル-エチルアミン、ハローアシルハロゲン化物、グリコシド連結、6-アミノカプロン酸、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン酸(SPDP)、C4~C12部分などから選択されるリンカーを含み得る。例えば、ジアリールシクロオクテンなどのジアリールシクロオクチン部分の残基を含む、上記で考察されるDBCO基およびDIFO基から生じるリンカーはまた、使用され得る。リンカーは、一般的に、担体に付着されるのではなく、接合のために抗原に付着されるであろう。
抗原-ポリペプチド接合体は大きい架橋複合体から形成され得るため、いくつかまたはすべての接合の正確な場所および他の物理的特徴を直接測定または判定するための利用可能な分析方法によってはできない場合がある。しかしながら、そのような場所または物理的特徴は、その期待値と一致する合成スキーム、その期待される生成物、および分析結果の設計から信頼可能に推論され得ることが理解される。
抗原-ポリペプチド接合反応
いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載される非天然アミノ酸および化学ハンドルを接合するのに好適な任意の化学方法を使用して増強された担体タンパク質に接合される。そのような方法は、銅(I)触媒アルキン-アジド負荷環化(CuAAC)、歪み促進アジド-アルキン負荷環化(SPAAC)、およびテトラジン-アルケン結紮を含むがこれらに限定されない。「クリック」反応として、これらの反応のうちのすべてを、水溶液中で行うことができる。ホスフィンとアジドとの間のシュタウディンガー結紮も使用することができる。
CuAAC:いくつかの実施形態では、抗原は、銅(I)触媒アルキン-アジド負荷環化(CuAAC)によって増強された担体タンパク質に接合される。この実施形態の1つの変形例では、増強された担体タンパク質はプロパルギル含有nnAAを含み、抗原はアジド基を含む。この実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有nnAAを含み、抗原はプロパルギル基を含む。生体分子のCuAAC接合に好適な条件は、例えば、Presolski et al.Curr Protoc Chem Biol.2011;3(4):153-162に見出され、それらのすべてが、Cu2+の付加を伴う。いくつかの実施形態では、反応は、THPAなどのCu配位リガンドの付加によって加速される。いくつかの実施形態では、反応は、Cu2+の酸化状態を維持するために還元剤の付加によって加速される。好適な還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、DTT、またはTCEPを含む。
SPAAC:いくつかの実施形態では、抗原は、歪み促進アジド-アルキン負荷環化(SPAAC)によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の1つの変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有nnAAを含み、抗原はシクロオクチン基を含む。これらの実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はシクロオクチン含有nnAAを含み、抗原はアジド基を含む。SPAACは追加の触媒または補助因子を必要としないため、この反応は、蒸留水、0.9%生理食塩水、PBS、または生理的緩衝液中で行うことができる。一実施形態では、増強された担体タンパク質および抗原は、1.20:1(w/w)の質量比率で組み合わされる。
いくつかの実施形態では、抗原は、式XまたはXaの構造を介して増強された担体タンパク質中のアジド含有nnAAに連結され、
Figure 2023022188000039
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OHまたは増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Dは、-Ar-W3-または-W1-Y1-C(O)-Y2-W2-であり、
Arは、
Figure 2023022188000040
であり、
W1、W2、およびW3の各々は、独立して、単一の結合または低級アルキレンであり、
各X1は、独立して、-NH-、-O-、または-S-であり、
各Y1は、独立して、単一の結合、-NH-、または-O-であり、
各Y2は、独立して、単一の結合、-NH-、-O-、またはN連結もしくはC連結ピロリジンイレンであり、
Z1、Z2、およびZ3のうちの1つは-N-であり、Z1、Z2、およびZ3のうちの他のものは、独立して-CH-であり、
L22は、独立して、結合、アルキル、またはポリ(アルキルオキシ)であり、
Xは、多糖類の少なくとも1つのポリオールである。
いくつかの実施形態では、抗原は、式XIまたはXIaの構造を介して増強された担体タンパク質中のアジド含有nnAAに連結され、
Figure 2023022188000041
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OHまたは増強された担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wは、CまたはNであり、
yは、少なくとも1であり、
nは、少なくとも1であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
「n」の値は、「PEGn」に関連して上記に考察される。「y」の値は、式XIIに従って1~10の範囲にあり、好ましくは、低級アルキレン、例えば、C1~C4アルキレンである。
テトラジン-アルキン結紮
いくつかの実施形態では、抗原は、テトラジン-アルキン結紮によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の1つの変形例では、増強された担体タンパク質は、1,2,4,5-テトラジン含有nnAAを含み、抗原はアルケン基を含む。SPAAC反応と同様に、テトラジン-アルキン結紮は、補助因子の付加なしで進み、これおよびこの反応は、蒸留水、0.9%生理食塩水、PBS、または生理的緩衝液中で行うことができる。
接合体の特性評価
方法(サイズ排除、透析濾過、透析)接合反応に続いて、対象となる抗原が増強された担体タンパク質接合体は、任意選択的に、略純粋な接合体を得るための、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、およびサイズ排除)、分子サイズ排除(透析、透析濾過、接線流濾過、深層濾過)電気泳動手順(例えば、分取等電点電気泳動)、示差的溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、またはSDS-PAGE(例えば、Protein Purification,J.C.Janson&Lars Ryden,editors,VCH Publishers,New York,1989を参照されたい)を含むがこれらに限定されない方法によって精製される。
対象となる接合タンパク質は、任意選択的に、マイクロ流体電気泳動、ゲル電気泳動、ウエスタンブロット法、免疫測定法(例えば、ELISA)、および接合タンパク質の活性を評価するための他のアッセイを含むがこれらに限定されない方法により定量化される。
例示的な物理的パラメータ
抗原が増強された担体タンパク質接合体についての1つの重要なパラメータは、接合体の分子量である。接合体は、任意選択的に、各タンパク質分子に接合された可変数の抗原分子、ならびに可変のより高次の架橋(例えば、タンパク質-抗原-タンパク質連結)を含むため、接合体の出力分子量は、増強された担体タンパク質および抗原の投入分子量から必ずしも予測可能ではない膨大な文献(例えば、Howard et al.Immunology.1971(21):535-545およびKabat&Bezer.Arch Biochem Biophys.1958(78)306-18)は、抗原粒子径が免疫原性に対する重要な効果を有することを示唆している。Wessels et al.(1998)Infect Immun 66:2186-92は、接合体のサイズおよび架橋が、GBSのIII型接合体の免疫原性および防御的有効性に影響を与え得ることを報告している。
一般的な用語において、接合体は、抗原当たり、1つまたは複数のいずれかのハンドルを有する抗原に担体タンパク質を連結することによって形成され得る。抗原当たり、複数のハンドルを有する、タンパク質-抗原-タンパク質連結を伴う、架橋接合体が形成され得る。抗原当たり、単一のハンドルを有する(例えば、多糖類中の末端基)、この種の接合体格子は、単一の抗原が複数の担体タンパク質分子に結合することができないため、形成されない。より高い分子量が所望され、したがって複数のハンドルを有する抗原が好ましい、架橋接合体が本明細書では好ましい(特に肺炎球菌について)
いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約750kDa、約1,000kDa、約1,500kDa、約2,000kDa、約2,500kDa、約3,000kDa、約3,500kDa、約4,000kDa、約4,500kDa、約5,000kDa、約5,500kDa、約6,000kDa、約6,500kDa、約7,000kDa、約7,500kDa、または約8,000kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、少なくとも約750kDa、少なくとも約1,000kDa、または少なくとも約1,500kDaの分子量を有し、いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約750kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約800kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約850kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約900kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約950kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約1,000kDa~約2,800kDaの分子量を有する。
本開示の接合体ワクチンについての別の重要なパラメータは、抗原(例えば、多糖類)と免疫原性ポリペプチド担体(例えば、本開示の担体タンパク質)との比率である。多糖類-担体タンパク質接合体を一般的な原則の例示として使用すると、精製された接合体の多糖類とタンパク質との(PS:PC)比率は、一般的に、重量-重量(w/w)比率に関して表現される。そのような比率は、慣習的に、個々の複合糖質と共に精製された任意の遊離多糖類を含むものと表現される。多糖類-担体タンパク質接合体のより高いPS:PC比率により、より多くの多糖類抗原をより低量の増強された担体タンパク質と共に送達することが可能になる。肺炎球菌接合体ワクチンについて、この比率は、典型的には、0.3~3.0の範囲内にあるが、これは、血清型および接合化学の態様により変化し得る(添付書類2:Recommendations for the production and control of pneumococcal conjugate vaccines;WHO Technical Report Series,No.927,2005)。市販のワクチンであるPrevnar-13の比率は、0.9であり(Prevnar 13 Package Insert,M/2016 Revision,pg.24;www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/vaccines/approvedproducts/ucm201669.pdfを参照されたい)、1.0~3.0の好ましい範囲を示唆している。13個を上回る血清型によりワクチンを処方するとき、1.5~3.0の比率を達成することが好ましい場合があり、約1.5~約2.0の比率を用いることが特に好ましい場合がある。これは、すべての個々の接合体がこの比率を有することを確実にすることによって、または片側のこの範囲外の任意の接合体が反対側のこの範囲外の接合体によって均衡が保たれることを確実にすることによって達成され得る、組成物中のすべての接合体についての平均比率であり得る。
別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率(重量単位)は、0.5~4.0(例えば、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、または約4.0)である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(w/w)PS:PC比率は、0.7~2.8である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(w/w)PS:PC比率は、1.0~2.8である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(w/w)PS:PC比率は、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、または少なくとも1.5である。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、0.9(w/w)を上回る。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、約0.9~約3.0(w/w)である。そのようなPS:PC比率による個々の混合体の混合は、所望の全体的なPS:PC比率を有する組み合わせを生じ得る。
汚染物質(遊離多糖類、C-ポリ)の存在多糖類が増強された担体タンパク質接合体についての重要なパラメータは、増強された担体タンパク質に共有結合的に接合されないが、それにもかかわらず接合体組成物中に存在する遊離多糖類のレベルである。例えば、特定の例では、遊離多糖類は、多糖類が増強された担体タンパク質接合体に非共有結合的に関連付けられる(すなわち、非共有結合的に結合され、これに吸着されるか、またはこれ内もしくはこれと共に取り込まれる)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質接合体は、多糖類の総量と比較して、約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、または10%未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約10%未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約25%未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約30%未満の遊離多糖類を含む。別の実施形態では、本明細書に記載される多糖類が増強された担体タンパク質は、多糖類の総量と比較して、約15%未満の遊離多糖類を含む。遊離多糖類は、任意選択的に、多糖類のプールを区別するためのHCl/デオキシコール酸ベースの沈殿方法を使用する、Lei et al.(Dev Biol(Basel).2000:103:259-64)の方法を含む任意の好適な方法によって測定される。好ましい組成物では、非接合細菌多糖類の量は、組成物中の細菌多糖類の総量の5重量%未満である。複数の肺炎球菌接合体を含む組成物では、各血清型に対する非接合細菌多糖類の量は、組成物中のその血清型の細菌多糖類の総量の5重量%未満であることが好ましい。
肺炎球菌莢膜多糖-増強された担体タンパク質接合体についての重要なパラメータは、接合体の調製において存在するC-多糖類の汚染物質のレベルである。C-多糖類は、免疫学的に非生産的であるが、多くの肺炎球菌莢膜多糖の調製方法において「沿って動く」肺炎連鎖球菌の高度に免疫原性の細胞壁成分である。C-多糖類の免疫反応は、一般的に、中和抗体を生成しないため、C-多糖類による汚染は、動物に投与されたときの抗原が増強された担体タンパク質接合体の有効性の適切な評価に干渉し得る。
C-多糖類のレベルは、任意選択的に、多糖類接合体調製の総酸加水分解、加水分解物のクロマトグラフィー、およびコリンの電気伝導率検出によって示される。代替的に、非加水分解多糖類は、コリンのためのNMRによって分析される。NMR技術は、C-多糖類の含有量を計算するためのコリン信号とラムノースメチル信号との比率(ラムノースを含有する莢膜多糖について;他の莢膜多糖についての異なる信号)を使用する。クロマトグラフィー方法は、C-多糖類含有量を計算するための電気伝導度アッセイによって判定された多糖類含有量、または莢膜多糖の成分ピークのうちの1つのいずれかとコリン信号との比率を使用する。いずれかの方法では、コリンの既知の濃度の基準により、C-多糖類の理論的繰り返し構造[Hermans,et al.,Recl.Trav.Chim.Pays-Bas,107,600(1988)]を使用して、いったんコリン濃度が分かり、多糖類の調製におけるC-多糖類の濃度が分かると、多糖類の調製において存在するコリンのレベルの直接の計算が可能になる。
多糖類が増強された担体タンパク質接合体試料の多糖類の濃度は、任意選択的に、様々な技術によって測定され、例えば、総多糖類の濃度は、任意選択的に、多糖類の総加水分解および特定の単糖類の濃度の素測定によって判定される。C-多糖類の濃度を総多糖類の濃度と比較することによって、C-多糖類の汚染の程度(w/w)を判定する。総多糖類の3%(w/w)未満のC-多糖類のレベルは、許容可能であるとみなされる。いくつかの実施形態では、C-多糖類のレベルは、1%未満である。
一実施形態では、本開示は、担体タンパク質および抗原を含む接合体であって、抗原が担体タンパク質中のnnAAに連結される、接合体を提供する。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、nnAAは、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、または2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、およびそれらの任意の組み合わせである。別の実施形態では、nnAAは、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、nnAAは、担体タンパク質中の1つ以上のリジン残基と置換される。別の実施形態では、接合体のみかけ分子量は、約900kDa~約5MDaである。別の実施形態では、置換される1つ以上のリジン残基は、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523、およびK527、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、nnAAは、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープではない。別の実施形態では、抗原は、式XIまたはXIaによる担体タンパク質に連結され、
Figure 2023022188000042
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wは、CまたはNであり、
yは、少なくとも1であり、
nは、少なくとも1であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。
一実施形態では、本開示は、i)担体タンパク質中にnnAA置換を導入することと、ii)多糖類をnnAAに接合させて、複合糖質を形成することと、iii)複合糖質のみかけ分子量を測定することと、を含む、宿主の免疫反応を改善するために担体タンパク質の抗原の最適な配置を同定するための方法を提供する。別の実施形態では、nnAA置換は、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープ中にはない。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、抗原は、多糖類である。別の実施形態では、少なくとも1つ以上の多糖類は、式XIまたはXIaによる担体タンパク質に接合され、
Figure 2023022188000043
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
別の実施形態では、置換される少なくとも1つ以上の非天然アミノ酸は、pAMFである。別の実施形態では、本開示は、i)~iii)のプロセスによって同定される抗原の最適な配置を有する担体タンパク質を提供する。別の実施形態では、置換は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9回、導入される。別の実施形態では、多糖類は、細菌の莢膜多糖である。別の実施形態では、細菌は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、細菌は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。
改変ポリペプチドおよび多糖類
一実施形態では、本開示は、式XIまたはXIaを含む、少なくとも1つの化合物、またはその塩を含む、改変ポリペプチドであって、
Figure 2023022188000044
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールである、改変ポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、へモフィルスタンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、多糖類は、細菌種の莢膜多糖である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、R1およびR2は、担体タンパク質のT細胞エピトープ中に生じるアミノ酸ではない。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。
一実施形態では、本開示は、式VIIまたはVIIaを含む、少なくとも1つの化合物、またはその塩を含む、改変多糖類であって、
Figure 2023022188000045
式中、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1である、改変多糖類を提供する。
別の実施形態では、式VIIの改変多糖類は、少なくとも1つのnnAAを含む担体タンパク質にさらに接合される。別の実施形態では、改変多糖類は、[2+3]負荷環化によって接合される。別の実施形態では、多糖類は、細菌種由来のものである。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、細菌莢膜多糖である。別の実施形態では、DBCOと莢膜多糖の繰り返し単位とのモル比率は、1を上回る。別の実施形態では、莢膜多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせを含む肺炎連鎖球菌血清型のものである。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。
一実施形態では、本開示は、(A-X)-Yによる改変多糖類を提供し、
式中、
Aは、
Figure 2023022188000046
であり、
Xは、独立して、少なくとも1つのポリオールであり、
Yは、独立して、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nは、少なくとも1であり、
zは、1を上回る。
別の実施形態では、多糖類は、細菌種由来のものである。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌である。別の実施形態では、細菌種は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアである。別の実施形態では、多糖類は、細菌莢膜多糖である。別の実施形態では、莢膜多糖は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、担体タンパク質にさらに接合される。別の実施形態では、多糖類は、式IIの連結を介して担体タンパク質に接合される。別の実施形態では、担体タンパク質は、CRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、多糖類は、[2+3]負荷環化によって接合される。別の実施形態では、担体タンパク質は、1つ以上の非天然アミノ酸を含む。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、担体タンパク質は、抗原にさらに接合される。別の実施形態では、担体タンパク質、式IIの連結を介して抗原に接合される。別の実施形態では、多糖類と担体タンパク質(PS:PC)との比率(w/w)は、約1.5~約4である。
ポリペプチド抗原接合体の組成物
少なくとも1つの賦形剤と一緒に少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む免疫原性組成物であって、抗原が増強された担体タンパク質中のnnAA残基を介してポリペプチドに接合される、免疫原性組成物を本明細書に記載する。一実施形態では、本開示は、本明細書に記載される複合糖質を含むワクチン組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中の担体抑制の低減を誘発する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような少なくとも1つの増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む接合体ワクチン組成物は、全体的な免疫反応を改善し、かつ/または天然担体タンパク質を含む接合体ワクチン組成物と比較して、対象中のT細胞依存性応答を増加させる。
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、単一の担体-タンパク質-抗原接合体(例えば、肺炎球菌の単一の血清型)を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、複数の担体-タンパク質抗原接合体(例えば、肺炎球菌の複数の血清型)を含む。さらなる実施形態では、複数の担体-タンパク質抗原接合体は、任意選択的に、(a)般的な増強された担体タンパク質に接合された複数の抗原、または(b)異なる増強された担体タンパク質に接合された複数の抗原を含む。さらなる実施形態では、複数の増強された担体タンパク質抗原接合体は、同じ微生物(例えば、肺炎連鎖球菌)の異なる血清型由来の抗原を含む。組成物が複数の異なる抗原(例えば、肺炎球菌の複数の血清型由来の莢膜多糖、または髄膜炎菌の複数の血清群由来の莢膜多糖)を含む場合、各抗原について同じ型の担体タンパク質が使用されることが好ましく、例えば、各抗原が、同じnnAA含有CRM197変異形に個別に接合され、次に、個々の抗原-タンパク質接合体が、多抗原組成物を与えるために組み合わされることが好ましい。
いくつかの実施形態では、多価血清型多糖類接合体組成物中のすべての血清型多糖類と担体タンパク質(PS:PC)との全体的な(重量単位)比率は、特定の範囲内にある。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)多糖類と増強された担体タンパク質との比率(重量単位)は、0.5~4.0(例えば、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、または約4.0)である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)(w/w)PS:PC比率は、0.7~2.8である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)(w/w)PS:PC比率は、1.0~2.8である。別の実施形態では、担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)(w/w)PS:PC比率は、少なくとも0.8、少なくとも0.9、少なくとも1.0、少なくとも1.1、少なくとも1.2、少なくとも1.3、少なくとも1.4、または少なくとも1.5(w/w)である。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、0.9(w/w)を上回る。別の実施形態では、多糖類が増強された担体タンパク質接合体中の(または全体的な多価組成物中の)多糖類と増強された担体タンパク質との比率は、約0.9~約3.0(w/w)である。好ましい組成物は、タンパク質に対して全体的に質量過度の多糖類、例えば、1:1.1~1:2(w/w)、例えば、1:1.5~1:1.9のタンパク質:多糖類比率を有する、複数の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖のタンパク質-単糖類接合体を含む。
いくつかの実施形態では、多価血清型多糖類-担体タンパク質接合体組成物中のすべての血清型多糖類-担体タンパク質接合体の全体的な分子量範囲は、特定の範囲内にある。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約750kDa、約1,000kDa、約1,500kDa、約2,000kDa、約2,500kDa、約3,000kDa、約3,500kDa、約4,000kDa、約4,500kDa、約5,000kDa、約5,500kDa、約6,000kDa、約6,500kDa、約7,000kDa、約7,500kDa、または約8,000kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、少なくとも約750kDa、少なくとも約1,000kDa、または少なくとも約1,500kDaの分子量を有し、いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約750kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約800kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約850kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約900kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約950kDa~約2,800kDaの分子量を有する。いくつかの実施形態では、抗原が増強された担体タンパク質接合体は、約1,000kDa~約2,800kDaの分子量を有する。
さらなる実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、または少なくとも30個の別個の増強された担体タンパク質-抗原接合体を含む。
複数の接合体(例えば、複数の肺炎球菌血清型の各々に対する接合体)を含む任意の組成物において、いくつかの例では、各接合体中の担体タンパク質が同一であることが好ましい可能性があるだろう。複数の接合体を有するそのような組成物の代替的な実施形態では、1つ超の担体を使用することが好ましい場合がある。各抗原(例えば、異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖)が異なる担体に接合され得ることが可能であるが、典型的には、そのような組成物中の個々の接合体の中で代表される2~4(例えば、2または3)個のみの異なる担体があるであろう。例示の方法により、限定の方法ではなく、各接合体が異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖を含む、24個の異なる接合体の組成物中、24個の接合体のうちのいくつかであるがすべてではない接合体が、第1の担体タンパク質(例えば、CRM197に基づく)を含み、24個の接合体のうちの残りが、第2のタンパク質担体(例えば、HiDに基づく)を含む。したがって、再び例示の方法により、限定の方法ではなく、24個の接合体のうちの12、13、15、または20個の接合体は、第1の担体タンパク質を含む可能性があり、それぞれ、12、11、9、または4個の残りの接合体は、第2の担体タンパク質を含む可能性があるであろう。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの賦形剤は、非経口投与に好適な成分を含む。
さらなる実施形態では、少なくとも1つの賦形剤は、任意選択的に、緩衝液またはpH調節剤を含む。特定の実施形態では、緩衝液またはpH調節剤は、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、またはコハク酸エステル、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。好適な緩衝液の他の例には、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、塩酸などの酸;水酸化ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス-ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基;ならびにクエン酸/ブドウ糖、重炭酸ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液が含まれる。ヒスチジン緩衝液はまた、免疫原性組成物において有用である。
さらなる実施形態では、少なくとも1つの賦形剤は、任意選択的に、組成物のオスモル濃度を許容可能な範囲にもたらすための等張化剤を含む。特定の実施形態では、等張化剤は、塩化ナトリウム、ブドウ糖、およびグリセリン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。非経口投与に好適な緩衝液の他の例としては、ナトリウム、カリウム、もしくはアンモニウムの陽イオンおよび塩化物を有する塩、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、重炭酸、硫酸、チオ硫酸、もしくは亜硫酸水素の陰イオンが挙げられ、好適な塩としては、カリウム塩化物、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、および硫酸アンモニウムが挙げられる。
さらなる実施形態では、少なくとも1つの賦形剤は、任意選択的に、表面活性剤(界面活性剤)を含む。特定の実施形態では、表面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(ポリソルベート20または「Tween20」)、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(ポリソルベート80または「Tween80」)、Brij35、Triton X-10、Pluronic F127、またはドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。いくつかの実施形態では、表面活性剤は、0.0003%~0.3%(w/w)の濃度で存在する。
いくつかの実施形態では、少なくとも1つの賦形剤は、任意選択的に、抗原提示(デポ製剤、送達システム)を増強することによって、かつ/または共刺激信号(免疫刺激剤)を提供することによって、免疫系の刺激を増加させる薬剤である、アジュバントを含む。この実施形態のいくつかの変形例では、アジュバントは、アルミニウム塩ベースのものである。特定の実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウムカリウム、硫酸アルミニウムヒドロキシリン酸、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウム、およびそれらの任意の組み合わせである。他の変形例では、アジュバントは、水中油型乳剤である。特定の実施形態では、アジュバントは、AS03、MF59、またはAF03、およびそれらの任意の組み合わせである。また他の変形例では、アジュバントは、TLR4-アゴニストである。特定の実施形態では、アジュバントは、RC529である。本発明で使用するのに好ましいアジュバントは、リン酸アルミニウムアジュバント(例えば、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバント)などのアルミニウム塩である。組成物がアルミニウム塩アジュバントを含む場合、組成物中のAl3+の濃度が、用量当たり、≦1.25mg、例えば0.5ml当たり、≦1.25mg、および理想的には用量当たり、≦0.85mgであることが好ましい。組成物内の接合体は、アルミニウム塩アジュバントに吸着され得る。混合された組成物について、接合体は、個別にアルミニウム塩に吸着され得、次に混合され得るか、または逐次吸着を達成するためにアルミニウム塩中に加えられ得、それによって混合された接合体組成物を形成し得る。
好ましい組成物は、(i)本明細書で定義されるような1つ以上の接合体、例えば、nnAA含有担体タンパク質に接合された複数の肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖、および(ii)リン酸アルミニウムアジュバントを含む。
一実施形態では、本開示は、免疫原性組成物の多糖類とタンパク質担体との比率(w/w)(PS:PC)を増加させるための方法であって、(a)1つ以上のnnAA置換を担体タンパク質に導入することと、(b)1つ以上の非天然アミノ酸置換を介して多糖類を担体タンパク質に接合させることと、を含む、方法を提供する。別の実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、または少なくとも9つの置換を含む。別の実施形態では、nnAA置換は、担体タンパク質のT細胞活性化エピトープ中にない。別の実施形態では、nnAAは、pAMFである。別の実施形態では、担体タンパク質は、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、へモフィルスタンパク質D(PD)、血清群B髄膜炎菌(OMPC)の外膜タンパク質複合体、またはCRM197のT細胞結合エピトープを保持する。別の実施形態では、非天然アミノ酸置換は、リジン残基で発生する。別の実施形態では、リジン残基は、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K265、K386、K523、およびK527、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、多糖類は、式XIまたはXIaの連結を介して担体タンパク質に接合され、
Figure 2023022188000047
式中、
は、独立して、H、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
は、独立して、OH、または担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Xは、独立して、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである。
別の実施形態では、PS:PC比率は、約1.5~約4である。別の実施形態では、多糖類は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33F、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である。別の実施形態では、抗原は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの6つの血清型(例えば、K1、K2、K3、K4、K5および/またはK6)のうちの1つに由来する莢膜多糖である。別の実施形態では、多糖類は、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、またはストレプトコッカス・アガラクチアの莢膜多糖である。別の実施形態では、本開示は、工程(a)~(b)を含むプロセスによって調製される糖たんぱく質を提供する。
10.免疫反応の上昇
本明細書に記載されるような接合体または組成物を対象に投与することによって、対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法を本明細書に提供する。接合体または組成物は、典型的には、非経口投与に好適な賦形剤と組み合わされるであろう。
抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する際に使用するための接合体および組成物も提供する。抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発するための薬剤の製造のための接合体および組成物の使用も提供する。
免疫防御性抗体反応は、接合体および組成物を使用して、例えば、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる浸潤性疾患の予防のため、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる中耳炎の予防のため、肺炎連鎖球菌によって引き起こされる肺炎の予防のための能動免疫化、浸潤性疾患を予防するために髄膜球菌に曝露される危険のある対象の能動免疫化などを提供することができることを意味している。
本発明を以下の実施例に例示する。材料、方法、および例は、例示のみであり、限定することを意図していない。多数の変形、変更、および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者であれば生じるであろう。実施例は、別様に詳細に記載された場合を除いて、当業者によく知られており、かつ定常の技術を使用して実行される。
実施例1:一部位eCRM部分である、K11TAG、K25TAG、K34TAG、K38TAG、K40TAG、K52TAG、K60TAG、K77TAG、K83TAG、K91TAG、K96TAG、およびK103TAGの合成
eCRMは、Sutro Biopharma,Inc.(米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)によって提供される無細胞タンパク質合成(CFPS)抽出物中に発現された。そのような抽出物の特徴および調製は、他の公報に記載されており、この場合、抽出物は、一般に、US2016/0257946からの以下の改変を有する、Zawada et al.,2011,Biotechnol.Bioeng.,108(7),1570-1578に記載されるように調製された。(1)大腸菌DsbCを過剰発現させるように操作されたOmpT感受性RF-1弱毒化株から、無細胞抽出物を調製し、(2)アンバー終止コドンで非天然アミノ酸を挿入するための直交性CUAコード化tRNAを生成するように操作された同様のRF-1弱毒化大腸菌株から、無細胞抽出物を調製し、(3)(1)および(2)由来の無細胞抽出物を、混成し(85:15の比率で)、室温(20℃)で30分間50μMのヨードアセトアミドで処理し、(4)混成された抽出物を、eCRMをコードするDNAを除く、無細胞タンパク質合成システムのすべての他の成分を含有する予混合物に加えた。無細胞タンパク質合成反応の最終濃度は、30%(容量当たり)の細胞抽出物、2mMのパラ-メチルアジド-L-フェニルアラニン(pAMF)(マサチューセッツ州シャーリーRSP Amino Acids)、5μMのpAMF特異的tRNA合成酵素(「RS」)、2mMのGSSG(酸化型グルタチオン)、8mMのグルタミン酸マグネシウム、10mMのグルタミン酸アンモニウム、130mMのグルタミン酸カリウム、35mMのピルビン酸ナトリウム、1.2mMのAMP、GMP、UMP、およびCMPの各々0.86mM、2mMのアミノ酸(チロシンおよびフェニルアラニンについての0.5mMを除く)、4mMのシュウ酸ナトリウム、1mMのプトレシン、1.5mMのスペルミジン、15mMのリン酸カリウム、100nMのT7 RNAP、およびnnAA変異形をコードする2.5μMのeCRMプラズミドであった。無細胞合成反応は、eCRMをコードするプラズミドDNAの付加によって開始された。
48ウェルの花皿(m2p-labs#MTP-48-B)中に650rpmの撹拌器で14時間、反応物を培養した。培養期間後、精製または分析のために処理されるまで、反応物を4℃に保持した。無細胞タンパク質合成反応に続いて、pAMF-eCRMを含有する混合物を、96ウェルの皿(DyNa Block(商標)、2mL;Labnet,Edison,N.J.)に移し、40℃で15分間、5000×gで遠心分離した。
最初に、eCRMのCFPS生成のための最良の温度および添加剤を評価するために、最適化実験を行った。3つの温度の各々でのCUAコード化tRNAの追加の補足(0、1、2、4、8、12%v/v)およびnnAA/合成酵素混合物(50、100、150、200μg/ml)を含む、CFPS反応をセ氏30、25、および20度で行った。遠心分離前および後のCFPS混合物の試料を回収し、SDS-PAGE電気泳動によって分析し、濃度測定によって塊を定量化して、各条件で生成された総タンパク質(遠心分離前の試料)の可溶性タンパク質(遠心分離後の試料)の量を評価した。
図1は、定量化濃度測定によって評価されるような各条件で生成されたnnAA-eCRMの収率を示す。30度でのCFPS反応は、比較的小さい画分の可溶性タンパク質(全条件の中で、合計の最大約0.33)を生成したが、可溶性タンパク質の収率は、25度で増強され(全条件の中で、>約0.40の可溶性/合計)、20度でさらに増強された(全条件の中で、>約0.60の可溶性/合計)。「低い」温度条件の両方で、可溶性タンパク質の収率は、tRNA濃度の増加によってさらに増強され(1~12xは、収率の増加を示す)、nnAA/合成酵素濃度の増加は、可溶性収率に対して有害な影響から影響なしであった。
図1の実験に基づいて、20度未満の温度および少なくとも20μMのtRNA濃度を、K11TAG、K25TAG、K34TAG、K38TAG、K40TAG、K52TAG、K60TAG、K77TAG、K83TAG、K91TAG、K96TAG、およびK103TAG変異形の合成のために選択した。
CFPS反応を上記のように行った。これらの予備実験における精製の利便性のために、ヒスチジン標識(GSGHHHHHH、配列番号10)を、発現ベクターを介して担体タンパク質配列のC末端に融合させ、遠心分離後の上清からのeCRM変異形の精製を、40μLの樹脂を含有するIMAC Phytips(米国カリフォルニア州サンノゼ、Phynexus)を使用することによって実行した。樹脂床を、IMAC平衡緩衝液(1×PBSおよび10mMのイミダゾール)中で予め平衡化し、清澄化された上清を、4.2μL/分の流量で平衡化されたIMAC Phytipsを通して10回ピペットで移した。結合タンパク質を、IMAC平衡緩衝液で洗浄し、次に、125μLのIMAC溶出緩衝液(1×PBSおよび0.5Mのイミダゾール)で溶出させた。ヒスチジン標識は必須ではなく、大規模な精製のために省略される。
nnAAの組み込みおよび反応性を、DBCO-フルオレセインとの反応後に、SDS-PAGEおよび蛍光分析によって評価した(図2)。2~12μMのeCRMを、50μMのDBCO-フルオレセインで16時間培養し、非還元SDS-PAGEに供し、クマシーブルー(可視光)およびSypro-rubyフィルタセット(蛍光、フルオレセイン)で可視化した。図2は、eCRMに組み込まれてDBCOと反応するpAMFの能力を示す、対応するクマシー(左)および蛍光(右)ゲル画像を示す。K25、K34、K38、およびK40のアンバー置換は、高い発現および接合効率を示し、他のものは、それらを示さない。
実施例2:複数のnnAA eCRMの設計
複数のnnAA eCRM変異形を、上記の詳細な記載において記載されるように選択した。変異体を、CFPSを介して合成し、実施例1に沿って試験した。
Figure 2023022188000048
異なる数のLys→pAMF置換を含むさらなる変形例を調製した。一般的には、より高い数の置換は、より高いMW接合体に導く担体を与える(例えば、血清型14について、2つの置換による998kDaから、3つの置換による1238kDaまで、4つの置換による1789kDaまで、かつ5つの置換による2547kDaまで上昇する)が、担体はより低い溶解度を有することが見出された。6つのpAMF残基を有する担体は、一般に、良好な溶解度(>>50mg/mL)および免疫原性の両方を提供した。高い溶解度は、疎水性pAMF残基を有する天然配列中の荷電したLys残基の交換が、タンパク質であって、その疎水性がその溶解度に影響を与えることがすでに報告されている(Orr et al.1999 Infect Immun 67:4290-4)タンパク質である、CRM197の疎水性を増加させたため、驚くべきことであった。したがって、これらの結果は、荷電した残基が失われたときに不溶性を生じることなく、既知のCRM197接合体(すなわち、Lys残基)において使用された同じ付着部位を維持することが可能であることを示す。
CRM197の研究により、配列番号1の残基P272-D291、V322-G384、およびQ412-I458内のT細胞エピトープが同定された。これらのエピトープ領域は、Lys残基K420、K441、K446、K448、およびK457を含み、そのため、これらのリジン残基の置換は、CRM197の活性を支持するT細胞エピトープを破砕し得るであろう。配列番号1のnnAAによる置換に好ましいLys残基は、したがって、上記の表2に示されるように、K25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、およびK527である。
接合された多糖類が、CRM197表面の1つの領域に過度に強固に局所化されないことが望ましい。したがって、密集した残基内で、(i)K25、K34、K38、およびK40のうちの1つのみ、および(ii)K213またはK215のいずれかを採取することが好ましい。さらに、その第1級構造を越えて、CRM197の3D構造の研究により、2つの一般的な領域(Asn-374への第1の走行およびSer-375からの第2の走行)が同定され、そのため、これらの領域の両方において残基を採取する、例えば、6つの置換について、各領域において3つを採取することも好ましい。この一般的な誘導により、CRM197担体に付着されたときに、多糖類を空間的に離間させることが可能になる。
肺炎球菌接合体の作出に特に有用である1つの配列は、K34、K213、K245、K265、K386、およびK527がnnAAによって交換される、表2の変異形12である。このタンパク質は、各XがpAMF(好ましいnnAA)である配列番号9のアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、以下に記載される接合体を調製するために使用される。
リジン残基は、既知のCRM197接合体において使用されているアミノ酸であるため有用であり、そのため、これらの位置でのnnAAは、CRM197と互換性があるとすでに知られているものと同じ部位に接合が生じすることを可能にする。しかしながら、前述のように、荷電したリジンの損失が、構造的変化、疎水性の増加、およびより低い溶解度を生じ得る。フェニルアラニン残基のフェニルアラニンベースのnnAAへの改変(パラ-アジド-Phe、パラ-アジド-メチル-Phe、パラ-フルオロ-Phe、パラ-アセチル-Phe、またはパラ-ベンゾイル-Pheなど)は、これらの変化の危険性を低減するであろう。したがって、残基F13、F54、F124、F128、F141、F168、F251、F390、F531、またはF532がまた、単独でかつ組み合わせて、置換のために選択される。最大5つのPhe残基のpAMFによる置換が試験され、可溶性接合体を提供するが、同じ数の複数のLys置換により達成されるよりも低いMW接合体に対する傾向で提供される。
CRM197内でアミノ酸を置換するのではなく、CRM197配列内にnnAAを挿入することも可能である。例えば、pAMFをコードするTAGコドンは、個別に(6つの点挿入を作出するために)または組み合わせて(2、3、4、5、または6個のnnAAを挿入する)のいずれかで、リジン残基K34、K213、K245、K265、K386、およびK527の下流に直接挿入される。これらのように挿入されたnnAAを有する担体は、上記に記載されるような接合体および多価組成物を作製するのに有用である。
実施例3:Pfs25におけるT細胞エピトープの同定
マラリアオーキネート特異的表面タンパク質Pfs25のT細胞活性化エピトープは、例えば、Diethelm-Okita et al.,J Infect Dis.1997 Feb;175(2):382-91に記載された方法に沿って実験的に判定される。簡潔に言うと、20個のアミノ酸のペプチド断片および5個のアミノ酸による重複は、Pfs25の完全に発現された配列に対応する合成である。CD8+が減損され、かつCD4+が豊富なヒト末梢血リンパ球(PBL)は、複数の対象から得られる。PBLは、3重にめっきされ、実験的刺激として機能するPfs25配列にわたる個々の合成ペプチドで培養される。各ペプチド断片に応答するPBLの増殖が、培養物を[H]-チミジンで脈動させることによって測定され、これが異なる個体から発生する培養物にわたって比較される。増殖を刺激するPfs25断片は、T細胞エピトープを含むように同定される。複数またはすべての対象からのPBLの増殖を刺激する断片は、Pfs25中に汎用または免疫優性T細胞エピトープを含むものとして分類される。
実施例4:メタ過ヨウ素酸ナトリウムによる多糖類の活性化についての一般的なプロトコル
血清型多糖類(約30μモル)を、水溶液(10mMのHCl)中に溶解した。次に、溶液を45℃で30分間加熱し、次に冷却し、そのときpHを6.70に調節するために、NaOH溶液を加えた。HPLC等級水に対してAMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)を使用して、反応混合物を透析した。上清を50mLのファルコンチューブに移し、酢酸緩衝液(pH5.35)を25mMまで加え、かつ0.5当量のNaIOを加えた。混合物を、25℃で17時間攪拌し、その後、酸化試料を、任意選択的に、過度の水素化ホウ素ナトリウム(10当量)で処理し、HPLC等級水のいくつかの変化に対してAMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)を使用して精製して、酸化多糖類溶液を得た。
実施例5:DBCOによる過ヨウ素酸塩-酸化多糖類の誘導体化のための一般的な手順
酸化多糖類(約30μモル)を、16%DMSOを含有する、pH6.79の72mMリン酸ナトリウム中のDBCO-PEG-NH(約30μモル)またはDBCO-NH(約30μモル)と25℃で合わせた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(水中に16mg/mlの溶液、59.54μモル、20当量)を加え、25℃で2晩の間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、エチル酢酸で3x洗浄し、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCO)に移し、次に、水中での20%エタノールの6回の交換、続いて水との3回の交換を使用して透析し、多糖類-DBCO誘導体型の溶液を得た。次に、多糖類-DBCO誘導体を、10:1(w/w)のショ糖で調合し、凍結乾燥して、次の接合反応で使用するための白色粉末を得た。
実施例6:CDAPによる多糖類の活性化のための一般的なプロトコル
莢膜多糖(30mg)(PS 3)を、水溶液(1.5mLの2Mの酢酸を含む13.5mLのHO)中に溶解した。混合物を、85℃で1時間加熱し、周囲温度まで冷却した後、過度のマグネシウム塩化物を、1Mの溶液から加えた。結果として得られた多糖類を、水の6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCOの透析を使用して精製した。
次に、調製された多糖類を、pH7.0の水中に溶解し、シアン化試薬CDAP(アセトニトリル中の1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸)を加えた。次に、溶液をpH9.5に調節するか、またはトリメチルアミン(2.5当量)を加えた。次に、DBCO-PEG-NHまたはDBCO-NHを溶液に加えた。溶液を5%DMSOに調節し、25℃で一晩攪拌した。溶液を、20mLのエチル酢酸で3x洗浄し、3%DMSO、20%エタノール、0.9%塩化ナトリウムとの7回の交換および水との3回の交換を使用したAmicon 30kDa MWCO透析ユニットを使用して精製した。次に、多糖類-DBCO誘導体を、ショ糖と10:1(w/w)で調合し、凍結乾燥した。
実施例7:eCRMとの多糖類-DBCOの接合のための一般的な手順
凍結乾燥され、10:1w/wのショ糖で調合された(実施例4または5の手順によって調製された)多糖類-DBCO試料を、0.9%NaCl中に溶解し、溶液中でeCRMと混合して、1:1(w/w)のPS:eCRM投入質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、過度のアジ化ナトリウム溶液の付加によりクエンチした。接合されたPS-eCRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、24時間にわたる0.9%塩化ナトリウム溶液の5回の交換に対して透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、PS-eCRM接合体溶液を得た。
実施例8:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型1接合体の調製
1.酸化
1型PSの純度:80%(ウロン)
分子量:625gモル-1(繰り返し単位当たり)
反応手順
天然多糖類(19.7mg、80%に修正、15.8mg、25.2μモル)を、9.85mLの水溶液(7.0mLの水および2.85mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、300μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(104μg、3.78μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、大きくモル過剰の水素化ホウ素ナトリウム(10モル当量)を加えた。酸化PSを、水による少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-1溶液を得た。
Figure 2023022188000049

2.DBCO誘導体化
反応手順
PS1-OX(15.8mg、25.2μモル)を、リン酸緩衝液(3.6mL、50mM、pH7.0)中に溶解し、これに、DBCO-PEG-NHSエステル(1.0当量、DMSO中に649.1gモル-1、0.35mL)を加えた。反応混合物を、37℃で2日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、水中での20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、1-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.20mL、9.59mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に96mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するために、3.18mgの1 DBCOおよび32mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000050

3.eCRMとのPS 1-DBCO誘導体の接合
PS 1-DBCO3.18mg(32mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO(%):1.67%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
1-DBCOを、アジド官能化eCRM溶液(0.51mL)中に溶解して、1:1(w/w)のPS1:CRM投入質量比率を得た。ゲル形成を軽減するために、1.0mg mL-1への0.9%塩化ナトリウム溶液によるさらなる希釈(0.22μmに濾過)が必要であった。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間透析した(3回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、1-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000051


*CJD=透析された接合体
実施例9:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型2接合体の調製
1.酸化
2型PSの純度:80%
分子量:960.84gモル-1
反応手順
天然多糖類(25.5mg、26.5μモル)を、12.75mLの水溶液(9.24mLの水および3.51mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、216μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(5.26mg/ml、0.20当量)を加えた。混合物を、NaIOに対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心100kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-2溶液を得た。
Figure 2023022188000052

2.DBCO誘導体化
反応手順
2.14mLの水中のPS2-OX(18.1mg、18.8μモル)を、リン酸緩衝液(1.95mL、200mM、pH6.0)で希釈し、これに、DBCO-PEG-NH(9.85mg、1当量、DMSO中、0.197mL)を加えた。25分後、NaCNBH(2.36mg、2当量HO中の溶液から59μL)を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で2日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.5mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH4(60μLの10mg/mL水溶液、1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(4×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、100kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、水の1回の交換、続いて水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して、遠心透析によって精製し、2-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.14mL、14.3mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの略等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料(4.96mg、4.96mg、および4.4mg)を得た。
Figure 2023022188000053

3.eCRMとのPS 2-DBCO誘導体の接合
PS 2-DBCO:4.4mg(32mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
%DBCO:4.03%
CRM濃度:3.18mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS2-DBCOを、0.9%NaCl(3.01mL)中に溶解し、DMSO(0.44mL)を加えた。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.95mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS2:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%の塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、2-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000054

実施例10:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型3接合体の調製
1.加水分解
3型PSの純度:86%(アントロン)
分子量:360.3gモル-1
反応手順
天然多糖類3(30.0mg)を、15.0mLの水溶液(13.5mLの水および1.5mLの酢酸、2M)中に溶解した。混合物を、85℃で1時間加熱し、その後、周囲温度に対して冷却した後、塩化マグネシウム溶液(1.5mL、1M)を加えた。加水分解されたPSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-3溶液を得、次にこれを、2つの等しい分割量で凍結乾燥した。
Figure 2023022188000055

2.DBCO誘導体化
反応手順
加水分解されたPS3(12.75mg、35.4μモル)を、水(6.4mL)中に溶解し、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、100μL)でpH7.0に調節した。次に、シアン化試薬CDAPを、滴下(アセトニトリル中に0.426M、0.2当量、16.7μL)で加えた。90秒後、溶液を、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、300μL)でpH9.5に迅速に調節した。DBCO-PEG-NH(DMSO中に0.032M、0.1当量、523gモル-1、0.110mL)を、すぐに滴下で加えた。追加のDMSOを加えて、5%(v/v)のDMSO(0.320mL)を得た。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で一晩攪拌し、続いて、0.22μmのPES注射器フィルタを通して濾過した。濾液をエチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、3%DMSO、水中の20%エタノール、0.9%塩化ナトリウムとの合計7回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、3-DBCO誘導体型を得た。次に、水溶液を、0.45μmのPVDF注射器フィルタを通して濾過した。この溶液(3.84mL、8.52mg)に、10倍の質量の過度のショ糖(0.85mLの水中に85mg)を加えた。合わされた溶液を、凍結乾燥された3つの部分に分解して、白色粉末の3つの試料を得た。2つの試料は、合計3つについて残りの試料中に8.5mgを有する、次の接合反応で使用するための5.0mgの3-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000056

3.eCRMとのPS 3-DBCO誘導体の接合
PS 3-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):5.0%
CRM濃度:4.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
3-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(6.39mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.333mL)、およびDMSO(0.833mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.770mL)を、滴下で加えて、1:1(w/w)のPS3:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、3-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000057


*CJF=透析および濾過された接合体
実施例11:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型3接合体の調製
1.酸化
3型PSの純度:86%(アントロン)
分子量:360.3gモル-1
反応手順
天然多糖類3(14.4mg、86%に修正、12.4mg、34.4μモル)を、7.2mLの水溶液(5.9mLの水および1.3mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、300μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.10mg、5.16μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS3-OX溶液を得た。
Figure 2023022188000058

2.DBCO誘導体化
反応手順
PS3-OX(9.05mg、25.1μモル)を、リン酸緩衝液(2.11mL、50mM、pH6.7)中に溶解し、これに、DBCO-PEG-NH(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、0.40mL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムの溶液(2当量、44.5mg/mL、35μL)を加えて、2日間攪拌した。この時点で、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、3-DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.20mL、8.60mg)に、10倍の質量の過度のショ糖(0.86mLの水中に86mg)を加えた。合わされた溶液を、4つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。3つの試料は、合計4つについて、残りの試料中に2.6mgを有する、次の接合反応で使用するための2.0mgの3-DBCOおよび20mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000059

3.eCRMとのPS 3-DBCO誘導体の接合
PS 3-DBCO:2.0mg(20mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.3%
CRM濃度:4.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
3-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.400mL、0.22μmに濾過)およびDMSO(0.100mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.330mL)を、滴下で加えて、1:1(w/w)のPS3:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で48時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、3-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000060

実施例12:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型4接合体の調製
1.酸化
4型PSの純度:80%(アントロン)
分子量:825.78
反応手順
4型PS(27.5mg、33.30μモル)粉末を、13.75mLの水溶液(12.38mLの水および1.37mLの0.1MのHCl)中に溶解した。次に、溶液を、45℃で30分間加熱し、次に、冷却し、そのとき、NaOH溶液(0.1M、1.37mL)を加えて、pHを6.70に調節した。反応混合物を、HPLC等級水との3回の交換(各々12mL)によってAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)を使用して透析した。上清を、9.84mLの水を含む50mLのファルコンチューブに移した。この溶液に、3.43mLの200mMの酢酸緩衝液(pH5.35)および632μLのNaIO溶液(3.56mg、16.65μモル、0.5当量)を加えた。混合物を、25℃で17時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-4溶液を得た。
Figure 2023022188000061

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)4型PS溶液(24.58mg、29.77μモル、2.4mLの水)に、緩衝溶液(1.8mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.79)、DMSO(0.6mL)、およびDBCO-PEG-4-NHの溶液(200μLのDMSO中に15mg、28.65μモル、9.6当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、224μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(300μLの水中に5.0mg、59.54μモル、20当量)を加え、2日間25℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、225μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間の攪拌後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、4 DBCO誘導体型の溶液を得た。この溶液(4.75mL、15.25mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に153mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。2つの試料は、5.35mgの4DBCOおよび54mgのショ糖を含有し、1つの試料は、次の接合反応で使用するための4.55mgの4DBCOおよび45mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000062

3.eCRMとのPS 4-DBCO誘導体の接合
PS 4-DBCO:5.35mg(54mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.52%
CRM濃度:4mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.20:1
反応手順
4型DBCO試料(54mgのショ糖を含む5.35mgの白色粉末)を、0.67mLの0.9%のNaCl溶液中に溶解し、次に、アジド官能化eCRM溶液(0.74mL)を加えた。10分後、アジド官能化eCRMの別の部分(0.37mL)を加えて、1.20:1(w/w)のPS4:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で2日間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、4型PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000063

実施例13:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型5接合体の調製
1.酸化
5型PSの純度:89%(ウロン酸)
分子量:919.32
反応手順
5型PS(22.8mg、24.36μモル)粉末を、8.26mLの水および3.14mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.26)および163μLのNaIO溶液(1.3mg、6.1μモル、0.25当量)中に溶解した。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-5溶液を得た。
Figure 2023022188000064

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)5型PS溶液(6.25mg、6.68μモル、0.992mLの水)に、緩衝溶液(0.063mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(25μL)、およびDBCO-PEG-4-NHの溶液(100μLのDMSO中に3.5mg、6.68μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、37℃で30分間攪拌し、その後、84μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(84μLの水中に0.84mg、13.36μモル、20当量)を加え、37℃で24時間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸(6×10mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの8回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、5 DBCO誘導体型を得た。この溶液(5.35mL、6.0mg)に、ショ糖溶液(0.6mLの水中に60mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための3.0mgの5DBCOおよび30mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000065

3.eCRMとのPS 5-DBCO誘導体の接合
PS 5-DBCO:3.0mg(30mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.17%
CRM濃度:3.25mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1:1
反応手順
5-DBCO誘導体(30mgのショ糖を含む3.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(4.48mL)およびDMSO(0.6mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.92mL)を加えて、1:1(w/w)のPS5:CRM質量比率を得た。反応混合物を、緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で5時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液(20μL、水中で10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、5PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000066

実施例14:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型6A接合体の調製
1.酸化
6A型PSの分子量:706
水中のNaIO溶液(10mg/mL)
反応手順
PS-6A(15mg、21.2μモル)粉末を、7.5mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、36.3μLのNaIO溶液(0.363mg、1.69μモル、0.08当量)を加えた。混合物を、4℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析し、酸化PS-6A溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液で10%DMSOにPS-6Aを作製する。
Figure 2023022188000067

2.DBCO誘導体化
PSの最終濃度:3.37mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化6A型PS溶液(13.5mg、19.1μモル、10%DMSO中に4mL、50MmのPB、PH6.8)に、DBCO-PEG-NHの溶液(100.1μLのDMSO中に10.01mg、19.1μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に1.2mg、19.1μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、6A DBCO誘導体型を得た。
Figure 2023022188000068

3.eCRMとのPS 6A-DBCO誘導体の接合
PS 6A-DBCO:7.1mg(71mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:9%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.4mL)を、6A DBCO誘導体(71mgのショ糖を含む7.1mgの白色粉末)を加えて、2:1(w/w)のPS 6A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(23℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(191μLの水中に1.9mg、50.2μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235072,300K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、6A PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000069

実施例15:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型6B接合体の調製
1.酸化
6B型PSの純度:80%(アントロン)
分子量:706.18
水中のNaIO溶液(5.45mg/mL)
反応手順
PS-6B(27.28mg、80%に修正、21.82mg、30.9μモル)粉末を、14mLの水溶液(9.5mLの水および4.5mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、145μLのNaIO溶液(0.79mg、3.71μモル、0.12当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心デバイス(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-6B溶液を得た。
Figure 2023022188000070

2.DBCO誘導体化
PSの最終濃度:3.5mg/ml
緩衝液の最終濃度:53μM(pH6.0)
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)6B型PS溶液(18.4mg、27.6μモル、3.35mLの水)に、緩衝溶液(1.4mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(700μL)、およびDBCO-PEG-4-NHの溶液(295μLのDMSO中に14.43mg、27.6μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、75μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に9.39mg、55.6μモル、20当量)を加え、2日間25℃で攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、104μLの水素化ホウ素ナトリウムの溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、その後、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、6B DBCO誘導体型の溶液を得た。この溶液(2.96mL、20.1mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に200mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.7mgの6B DBCOおよび67mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000071

3.eCRMとのPS 6B-DBCO誘導体の接合
PS 6B-DBCO:6.7mg(67mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.2%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.23mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.28mL)を、6B-DBCO誘導体(67mgのショ糖を含む6.70mgの白色粉末)に加えて、2:1(w/w)のPS6B:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に2時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、6B PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000072

実施例16:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型7F接合体の調製
1.CDAP活性化およびDBCO架橋
PS 7Fを精製:n.d.%(アントロン)-100%を想定
分子量:1227gモル-1(繰り返し単位)
反応手順
PS7F(6.2mg、5.1μモル)を、水(3.1mL)中に溶解し、これに、CDAP(2.0当量、アセトニトリル中に100mg/mL、24μL)を加えた。反応混合物を、室温(室温)で30秒間攪拌した。この時点で、トリエチルアミン(TEA、2.5当量、0.2M、63μL)を加え、反応混合物を120秒間攪拌した。DBCO-PEG-NH(1.0当量、DMSO中に28.7μモル/mL、180μL)を、ホウ酸緩衝液(0.1M、pH8.5、1.0mL)と共に加え、室温で一晩攪拌した。DBCO-誘導体化PS7Fを、エタノール沈殿によって、かつ水との3回の交換を使用した遠心透析(Amicon 100kDa MWCO)によって精製した。UV吸収分光法、アントロンアッセイ、およびSECによる分析後、この溶液(3.61mL、3.05mg)を、ショ糖溶液(10倍の質量含有量、100mg/mL)で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
Figure 2023022188000073

2.eCRMとのPS 7F-DBCO誘導体の接合
PS 7F-DBCO:2.62mg(26.2mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):8.1%
CRM:PBS緩衝液中に5.0mg/mL
PS:CRM(投入質量比率):1.73:1
反応手順
凍結乾燥された7F-DBCOを、塩水(0.9%(w/v)、0.938mL)、リン酸緩衝液(0.5M、pH7.0、58μL)、およびDMSO(144μL)中に溶解し、これに、eCRM溶液(0.300mL)を加えて、1.73:1.00(w/w)のPS7F:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して滅菌濾過し、7F-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000074

実施例17:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型8接合体の調製
1.酸化
8型PSの純度 84%
分子量:684.54gモル-1
反応手順
天然多糖類(42mg、61.3μモル)を、21mLの水溶液(14.7mLの水および6.3mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液(2.63mgに対して計算される、0.20当量)に加えた。混合物を、NaIOに対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-8溶液を得た。
Figure 2023022188000075

2.DBCO誘導体化
反応手順
3.14mLの水中のPS8-OX(33.8mg、49.4μモル)を、リン酸緩衝液(789μL、0.5M、pH6.0)、1mLのHO、およびDMSO(313μL)で希釈し、これに、DBCO-PEG-NH(25mg、1当量、DMSO中、250μL)を加えた。10分後、NaCNBH(6.2mg、2当量(200μLのHO中の9.43mgから132μLを添加することによる))を加えた。反応混合物を、サーモスタット浴槽中に25℃で2日間攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.5mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH(1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(3×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、100kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、20%EtOHとの6回の交換、および水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析によって精製し、8-DBCO誘導体型を得た。この溶液(5.63mL、25mg)にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
Figure 2023022188000076

3.eCRMとのPS 8-DBCO誘導体の接合
PS 8-DBCO:3.77mg(38mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):3.57%
CRM濃度:5.966mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS8-DBCOを、0.9%NaCl(2.28mL)、リン酸緩衝液(0.126mL、0.5M、pH7.0)、およびDMSO(0.314mL)中に溶解した。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.42mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS8:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で1時間環状撹拌器で緩やかに混合し、次に、37℃で一晩オーブン中に置いた。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、8-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000077

実施例18:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型9N接合体の接合
1.酸化
9N型PSの純度:75%
分子量:928.29gモル-1
反応手順
天然多糖類(19.0mg、20.4μモル)を、9.49mLの水溶液(7.12mLの水および2.37mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.5)中に溶解した。この溶液に、過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.31mg、0.30当量、1.0mLの水溶液中に23.65mgからの56μL)を加えた。混合物を、NaIOに対して222nmでのUV吸収によって監視しながら、25℃で18時間攪拌した。酸化PSを、水との4回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-9溶液を得た。
Figure 2023022188000078

2.DBCO誘導体化
反応手順
1.643mLの水中のPS9N-OX(12.6mg、13.6μモル)を、リン酸緩衝液(0.945mL、94.5mgのショ糖を含有するpH6.0の200mM)およびDMSO(0.33mL)で希釈し、これに、DBCO-PEG-NH(7.2mg、1当量、DMSO中、0.142mL)を加えた。10分後、NaCNBH(1.71mg、2当量(200μLのHO中の7.36mgから47μLを添加することによる))を加えた。反応混合物を、25℃で2日間サーモスタット浴槽中で攪拌し、続いて、リン酸緩衝液(0.4mLの200mM、pH=6)を加えた。これに、NaBH(0.51mg、1当量)を加えた。30分間の攪拌後、混合物を、エチル酢酸(5×5mL)で抽出した。残留エチル酢酸を、窒素ガスでバブリングすることによって除去し、混合物を、30kDa MWCO Amicon遠心分離機フィルタに移した。DBCO誘導体を、水との3回の交換(各々12mL)、続いて、20%の水性エタノールとの6回の交換(各々12mL)、最後に、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心分析によって精製し、9N-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.388mL、9.05mg)にショ糖溶液を加え、凍結乾燥した。
Figure 2023022188000079

3.eCRMとのPS 9N-DBCO誘導体の接合
PS 9N-DBCO:4.5mg(45mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):4.9%
CRM濃度:3.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
PS9N-DBCOを、pH=7のリン酸緩衝液(96μLの0.5M)と共に0.9%NaCl(1.30mL)中に溶解し、DMSO(0.24mL)を加えた。次に、アジド官能化eCRM溶液(0.60mL)を加えて、1.5:1(w/w)のPS:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、100μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、これに加えられた3mLのpH=7の緩衝液を含む0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(7回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9N-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000080

実施例19:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型9V接合体の調製
1.酸化
9V型PSの純度:85%(アントロン)
分子量:704kDa(繰り返し単位=971.8g/モル)
反応手順
9V型PS(35.90mg、37.80μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の17.95mLの水溶液(12.565mLの水および5.385mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、852μLのNaIO溶液(2.83mg、13.23μモル、0.35モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、24℃の水槽中に置いた。混合物を24℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との4回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-9V溶液を得た。
Figure 2023022188000081

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化9V型PS溶液(21.64mg、22.78μモル、4.27mL)に、緩衝溶液(0.541mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(66μL)、およびDBCO-PEG-NH溶液(475μLのDMSO中に11.9mg、22.78μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、140μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(140μLの水中に2.86mg、45.56μモル、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、163μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(163μLの水中に1.72mg、45.56μモル、2モル当量)を加えることよって、反応を中断させた。30分間攪拌した後(観察可能なバブリングが停止したとき)、反応混合物を、エチル酢酸(2×10mL)、続いてジクロロメタン(2×10mL)で抽出した。抽出物を、20分間Nでバブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、2 AMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(50kDa MWCO、15mL)に移した。透析を、3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(各々15mL)、およびHPLC-等級水との2回の交換(各々15mL)を行うことによって実行し、9V DBCO誘導体を得た。この溶液(4.40mL、12.144mg)に、ショ糖溶液(121.44mg、1.214mLの水)に加えた。この合わされた溶液を、3つの画分(2×5mgおよび1×2.14mg)に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、4℃で保存した。
Figure 2023022188000082

3.eCRMとのPS 9V-DBCO誘導体の接合
PS 9V-DBCO:5mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.0%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
9V DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.881mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.067mL、0.5M)、およびDMSO(0.167mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.555mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS9V:CRM質量比率を得た。反応混合物を、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で、次にさらに2時間37℃で緩やかに混合した。総反応時間後、ある容量のアジ化ナトリウムを、接合混合物(0.33mg、5.15μモル)に加えた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(2.83mL)で希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9V PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000083

実施例20:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型9V接合体の調製
1.酸化
9V型PSの純度:81%(アントロン)
分子量:949.83
水中のNaIO溶液(5.41mg/mL)
反応手順
PS-9V(21.15mg、81%に修正、17.13mg、18.04μモル)粉末を、10.57mLの水溶液(7.4mLの水および3.17mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、214μLのNaIO溶液(1.16mg、5.41μモル、0.3当量)を加えた。混合物を、25℃で20時間攪拌した。酸化試料を、HPLC等級水の6回の交換(12mL)を使用したAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)を介して精製し、酸化PS-9V溶液を得た。
Figure 2023022188000084

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)9V型PS(15.36mg、16.17μモル、2.20mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.4mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(500μL)およびDBCO-PEG-4-NH(131μLのDMSO中に8.46mg、16.17μモル、10当量)の溶液をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、41μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に15.5mg、32.34μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、62μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、9V DBCO誘導体型を得た。この溶液(4.0mL、10.08mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.04mgの9V DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000085

3.eCRMとのPS 9V-DBCO誘導体の接合
PS 9V-DBCO:5.04mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.42%
CRM濃度:3.923mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.11:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.1.156mLの溶液中のCRM)を、9V DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5.04mgの白色粉末)に加えて、1.11:1(w/w)のPS9V:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、9V PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000086

実施例21:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型10A接合体の調製
1.CDAP活性化およびDBCO架橋
PS 10Aの純度:77%(アントロン)
分子量:1227gモル-1(繰り返し単位)
反応手順
PS10A(18.7mg、15.2μモル)を、水(7.9mL)中に溶解し、これに、CDAP(0.8当量、アセトニトリル中に100mg/mL、30μL)を加えた。反応混合物を、室温(室温)で30秒間攪拌した。この時点で、水酸化ナトリウム溶液(0.2M、200μL)を加えて、pH9.5を達成し、反応混合物を150秒間攪拌した。次に、DMSO(1.2mL)、続いてDBCO-PEG-NH(0.5当量、DMSO中に32.0μモル/mL、238μL)を加え、室温で一晩攪拌した。DBCO-誘導体化PS10Aを、溶媒抽出によって、かつ3%(v/v)DMSOの3回の交換、0.9%(v/v)塩水との2回の交換、および水との3回の交換を使用した遠心透析(Amicon 30kDa MWCO)によって精製した。UV吸収分光法、アントロンアッセイ、およびSECによる分析後、この溶液(3.18mL、13.5mg)を、ショ糖溶液(10倍の質量含有量、100mg/mL)で希釈し、白色粉末に凍結乾燥した。
Figure 2023022188000087

2.eCRMとのPS10A-DBCO誘導体の接合
PS 10A-DBCO:5.00mg(50.0mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):8.8%
CRM:PBS緩衝液中に5.0mg/mL
PS:CRM(投入質量比率):1.75:1
反応手順
凍結乾燥された10A-DBCOを、塩水(0.9%(w/v)、3.759ml)、リン酸緩衝液(0.5M、pH7.0、200μL)、およびDMSO(500μL)中に溶解し、これに、eCRM溶液(0.541mL)を加えて、1.75:1.00(w/w)のPS10A:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。CRM接合体を、2つの予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して滅菌濾過して、10A-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000088

実施例22:表2からのへのeCRM肺炎球菌PS血清型11A接合体の調製
1.加水分解
11A型PSの純度:69%(アントロン)
分子量:908.7gモル-1
反応手順
天然多糖類11A(35.0mg)を、17.5mLの水溶液(15.75mLの水および1.75mLの酢酸、2M)中に溶解した。混合物を、80℃で1時間加熱し、その後、周囲温度まで冷却した後、水酸化ナトリウム溶液を、pH5.5(3.2mL、1M)まで加えた。加水分解されたPSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-3溶液を得、次に、これを1つの分割量として凍結乾燥した。
Figure 2023022188000089

2.酸化
反応手順
加水分解された多糖類溶液(5.027mL、28.75mg、31.6μモル)に、水(5.75mL)および酢酸緩衝液(0.2M、pH5.5、3.6mL)をさらに加えた。この溶液に、135μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(1.35mg、6.32μモル、0.20当量)を滴下で加えた。混合物を、25℃で8時間攪拌した。酸化PSを、水との少なくとも6回の交換を使用したAmicon遠心100kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-11A-OX溶液を得た。
Figure 2023022188000090

3.DBCO誘導体化
反応手順
PS11A-OX(22.0mg、24.2μモル、2.235mL)を、リン酸緩衝液(1.37mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG-NH(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、100mg/mL、127μL)および追加量のDMSO(560μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、44.5mg/mL、68μL)を加えて、2日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、0.45μmの注射器フィルタを通して濾過した。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの7回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 100kDa MWCO)によって精製し、11A-DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.535mL、15.00mg)に、ショ糖溶液(1.5mLの水中に150mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.00mgの11A-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000091

4.eCRMとのPS 11A-DBCO誘導体の接合
PS 11A-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):5.77%
CRM濃度:5.42mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
11A-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(7.656mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.385mL)、およびDMSO(0.962mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(5.42mg/mL、0.617mL)を滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS11A:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、11A-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000092

実施例23:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型12F接合体の調製
1.酸化
12F型PSの純度:82%(アントロン)
分子量:1094gモル-1
反応手順
12F型PS(21.8mg、20μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の10.9mLの水溶液(8.175mLの水および2.725mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO溶液(0.64mg、3μモル、0.15モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、25℃の水槽中に置いた。混合物を25℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による2つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-12F溶液を得た。
Figure 2023022188000093

2.DBCO誘導体化
反応手順
PS12F-OX(13.1mg、12μモル、2.68mL)を、リン酸緩衝液(1.00mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG-NH(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、33mg/mL、199μL)および追加量のDMSO(500μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、52.5mg/mL、29μL)を加えて、2日間攪拌した。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、溶媒なしでバブリングした。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、毎回の水との3回の交換(各々12mL)を使用した2回の遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって精製し、12F-DBCO誘導体を得た。この溶液(2.2mL、10.45mg)に、ショ糖溶液(1.05mLの水中に104.5mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための5.0mgの12F-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000094

3.eCRMとのPS 12F-DBCO誘導体の接合
PS 12F-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.0%
CRM濃度:5.29mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
12F-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(6.542mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.334mL)、およびDMSO(0.834mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(5.29mg/mL、0.630mL)を、滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS12F:CRM投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、無菌の12F-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000095

実施例24:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型14接合体の調製
1.酸化
14型PSの純度:91%(アントロン)
分子量:689.25
水中のNaIO溶液(7.8mg/mL)
反応手順
PS-14(28.3mg、80%に修正、25.75mg、37.36μモル)粉末を、14mLの水溶液(10mLの水および4mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、110μLのNaIO溶液(0.86mg、4.05μモル、0.13当量)を加えた。混合物を、25℃で3時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-14溶液を得た。
Figure 2023022188000096

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)14型PS(20.5mg、29.74μモル、2.92mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.3mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.8)、DMSO(550μL)、およびDBCO-PEG-4-NHの溶液(150μLのDMSO中に11.68mg、22.3μモル、0.75当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に6.39mg、59.48μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、100μL溶液の水素化ホウ素ナトリウム(1.13mg、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの7回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、14DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.78mL、17.7mg)に、ショ糖溶液(1.17mLの水中に177mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.9mgの14DBCOおよび59mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000097

3.eCRMとのPS 14-DBCO誘導体の接合
PS 6B-DBCO:5.9mg(59mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.5%
CRM濃度:5.06mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.779mL)を、14DBCO誘導体(59mgのショ糖を含む5.9mgの白色粉末)に加えて、1.5:1(w/w)のPS14:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、14 PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000098

実施例25:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型14接合体の調製
1.酸化
14型PSの純度:91%(アントロン)
分子量:689.25
水中のNaIO溶液(10.19mg/mL)
反応手順
PS-14(23.5mg、80%に修正、21.38mg、31.02μモル)粉末を、11.75mLの水溶液(8.2mLの水および3.55mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、97μLのNaIO溶液(0.95mg、4.03μモル、0.13当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-14溶液を得た。
Figure 2023022188000099

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)14型PS(14.3mg、20.75μモル、3.46mLの水)の溶液に、緩衝溶液(1.3mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.8)、DMSO(637μL)、およびDBCO-PEG-4-NHの溶液(263μLのDMSO中に10.86mg、20.75μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、51μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に10.2mg、41.50μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、78μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、14DBCO誘導体型を得た。この溶液(4.12mL、12.24mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に12mg)を加えた。合わされた溶液を、3つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.12mgの14DBCOおよび6mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000100

3.eCRMとのPS 14-DBCO誘導体の接合
PS 6B-DBCO:6.12mg(62mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):4.42%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.3mL)を、14DBCO誘導体(62mgのショ糖を含む6.12mgの白色粉末)を加え、1.8:1(w/w)のPS14:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液(1.5mL)を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、14 PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000101

実施例26:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型15B接合体の調製
1.酸化
15B型PSの純度:71%(アントロン)
分子量:1185kDa(繰り返し単位=1069.80g/モル)
反応手順
15B型PS(14.6mg、13.65μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の7.30mLの水溶液(5.1mLの水および2.2mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO溶液(0.59mg、2.75μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、24℃で攪拌する。3.5時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-15B溶液を得た。
Figure 2023022188000102

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化15B型PS溶液(7.56mg、7.07μモル、1.271mL)に、緩衝溶液(0.640mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(0.063mL)、およびDBCO-PEG-NH溶液(221μLのDMSO中に17mg、7.07μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、350μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(350μLの水中に0.90mg、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、163μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.27mg、7.07μモル、2モル当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、Nで20分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(15mL)、およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、15B DBCO誘導体を得た。この溶液(1.982mL、6.86mg)に、ショ糖溶液(0.686mLの水中に68.6mg)を加えた。この合わされた溶液を、2つの画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、4℃で保存した。
Figure 2023022188000103

3.eCRMとのPS 15B-DBCO誘導体の接合
PS 15B-DBCO:3.85mg(38.5mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.9%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
15B DBCO誘導体(38.5mgのショ糖を含む3.85mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(4.302mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.220mL、0.5M)、およびDMSO(0.550mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.467mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS15B:CRM質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温(20℃)で18時間、次にさらに2時間37℃で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム(0.23mg、3.60μモル)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で7mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、15B PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000104

実施例27:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型17F接合体の調製
1.酸化
17F型PSの純度:84%(アントロン)
分子量:1274kDa(繰り返し単位=1203.00g/モル)
反応手順
17F型PS(28.50mg、23.69μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の14.25mLの水溶液(9.925mLの水および4.275mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、53.8μLのNaIO溶液(0.65mg、3.03μモル、0.128モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、水槽中に置いて、24℃で攪拌する。1時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との5回の交換(各々15mL)による2つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-17F溶液を得た。
Figure 2023022188000105

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化17F型PS溶液(22.0mg、18.29μモル、2.48mL)に、緩衝溶液(1.31mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、およびDBCO-PEG-NHの溶液(95.8μLのDMSO中に9.58mg、18.29μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に2.30mg;36.60μモル、2モル当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.48mg、18.29μモル、1モル当量)を加えることよって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、Nで20分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。20%エタノール溶液との5回の交換(15mL)およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、17F DBCO誘導体を得た。この溶液(3.27mL、11.58mg)に、ショ糖溶液(1.158mLの水中の115.8mg)を加えた。この合わされた溶液を、3つの画分(2×5mg、1×1.58mg)に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで、乾燥するまで凍結乾燥した後、4℃で保存した。
Figure 2023022188000106

3.eCRMとのPS 17F-DBCO誘導体の接合
PS 17F-DBCO:5mg(50mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.1%
CRM濃度:5.996mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
17F DBCO誘導体(50mgのショ糖を含む5mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(3.742mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.200mL、0.5M)、およびDMSO(0.500mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.558mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS17F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、室温(20℃)で19時間環状撹拌器で緩やかに混合した。アジ化ナトリウム(0.27mg、4.16μモル、1モル当量)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で8mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、17F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000107

実施例28:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型18C接合体の調製
1.酸化
18C型PSの純度:72%(アントロン)
分子量:970.76
水中のNaIO溶液(5.41mg/mL)
反応手順
18C型PS(61mg、62.84μモル)粉末を、30.5mLの水溶液(27.45mLの水および3.05mLの2Mの酢酸)中に溶解した。次に、溶液を、95℃で40分間加熱し、次に冷却し、そのとき、NaOH溶液(1N、5.2mL)を加えて、pHを6.0に調節した。反応混合物を、HPLC等級水との3回の交換(各々12mL)によるAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)を使用して透析した。上清を、12.4mLの水を含む50mLのファルコンチューブに移した。この溶液に、5.15mLの水および5.8mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.35)および153μLのNaIO溶液(1.53mg、7.175μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で3時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-18C溶液を得た。
Figure 2023022188000108

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)18C型PS溶液(10.0mg、10.3μモル、1.55mLの水)に、緩衝溶液(0.211mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(141μL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(54μLのDMSO中に5.4mg、16.17μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、130μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(130μLの水中に1.3mg、20.6μモル、20当量)を加え、37℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、80μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(2×10mL)、続いてエチル酢酸(10mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(100kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの4回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、18C DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.31mL、7.0mg)に、ショ糖溶液(0.7mLの水中に70mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための3.5mgの18C DBCOおよび35mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000109

3.eCRMとのPS 18C-DBCO誘導体の接合
PS 18C-DBCO:3.5mg(35mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.32%
CRM濃度:2.76mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
18C DBCO誘導体(35mgのショ糖を含む3.5mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.661mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.07mL、0.5M)、およびDMSO(0.175mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.844mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS18C:CRM質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で2時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.661mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.07mL、0.5M)、およびDMSO(0.175mL)で希釈して、PS-18の最終濃度を1mg/mLにし、18時間反応させた。アジ化ナトリウム溶液(23μL、水中に10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、18C PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000110

実施例29:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型18C接合体の調製
1.酸化
18C型PSの繰り返し単位の分子量:1012
水中のNaIO溶液(10mg/mL)
反応手順
PS-18C(20mg、19.76μモル)粉末を、3mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、63.4μLのNaIO溶液(0.634mg、2.96μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、23℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析して、酸化PS-18C溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液を含む10%DMSO中にPS-18Cを作製する。
Figure 2023022188000111

2.DBCO誘導体化
PSの最終濃度:3.75mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化18C型PS溶液(15mg、14.8μモル、10%DMSO中に4.4mL、50mMのPB、PH6.8)に、DBCO-PEG-NH溶液(77.6μLのDMSO中に7.76mg、14.8μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(93μLの水中に0.93mg、14.8μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、18C DBCO誘導体型を得た。
Figure 2023022188000112

3.eCRMとのPS 18C-DBCO誘導体の接合
PS 18C-DBCO:6mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:3%
eCRM濃度:6.5mg/mL
PS:CRM(投入比率):1.5:1
PSの最終濃度:2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.615mL)を、18C DBCO誘導体(3mLの水中に予め溶解された6mgの白色粉末、5.9μモル)に加え、1.5:1(w/w)のPS 18C:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(23℃)で17時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(112μLの水中に1.12mg、29.64μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(Spectrum Lab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235072,300K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.45μmおよび0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、18C PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000113

実施例30:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型19A接合体の調製
1.酸化
19A型PSの純度:90%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO溶液(5.69mg/mL)
反応手順
PS-19A(22.10mg、90%に修正、19.89mg、32.37μモル)粉末を、11.05mLの水溶液(7.73mLの水および3.32mLの0.2Mの酢酸緩衝液;pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、304μLのNaIO溶液(1.73mg、8.09μモル、0.25当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(10mL)を使用して精製し、酸化PS-19A溶液を得た。
Figure 2023022188000114

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19A型PS溶液(17.14mg、27.9μモル、2.50mLの水)に、緩衝溶液(1.0mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(0.4mL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(190μLのDMSO中に14.61mg、27.9μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70.2μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(313μLの水中に15.6mg、55.8μモル、20当量)を加え、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、105μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19A DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.12mL、11.4mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に114mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.70mgの19A DBCOおよび57mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000115

3.eCRMとのPS 19A-DBCO誘導体の接合
PS 19A-DBCO:5.7mg(57mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.31%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.49mL)を、19A DBCO誘導体(57mgのショ糖を含む5.7mgの白色粉末)に加えて、1.8:1(w/w)のPS19A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19A PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000116

実施例31:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型19A接合体の調製
1.酸化
19A型PSの純度:90%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO溶液(5.45mg/mL)
反応手順
PS-19A(20.83mg、90%に修正、18.75mg、30.5μモル)粉末を、9.5mLの水溶液(6.5mLの水および3mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、305μLのNaIO溶液(1.63mg、7.62μモル、0.25当量)を加えた。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(10mL)を使用して精製し、酸化PS-19A溶液を得た。
Figure 2023022188000117

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19A型PS溶液(17.57mg、28.59μモル、2.90mLの水)に、緩衝溶液(0.87mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(0.7mL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(306μLのDMSO中に14.97mg、28.59μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、79μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(200μLの水中に9.39mg、57.2μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌した。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、110μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19A DBCO誘導体型を得た。この溶液(3.56mL、11.9mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に120mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.95mgの19A DBCOおよび60mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000118

3.eCRMとのPS 19A-DBCO誘導体の接合
PS 19A-DBCO:5.95mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):4.68%
CRM濃度:6.5mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.8:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.51mL)を、19A DBCO誘導体(60mgのショ糖を含む5.95mgの白色粉末)に加えて、1.8:1(w/w)のPS19A:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間環状撹拌器で緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に2時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19A PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000119

実施例32:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型19F接合体の調製
1.酸化
19F型PSの純度:90.7%(アントロン)
分子量:614.44
水中のNaIO溶液(5.21mg/mL)
反応手順
PS-19F(22.0mg、35.8μモル)粉末を、13.75mLの水溶液(11mLの水および2.75mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、117μLのNaIO溶液(0.61mg、2.86μモル、0.08当量)に加えた。混合物を、冷蔵庫で17時間4℃で攪拌し、その後、酸化試料を、pH6.7の10mMリン酸緩衝液のAMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-19F溶液を得た。
Figure 2023022188000120

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)19F型PS溶液(13.7mg、22.3μモル、2.50mLの水)に、緩衝溶液(1.0mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、DMSO(0.483mL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(117μLのDMSO中に11.68mg、22.3μモル、10当量)すべて25℃を加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、70.2μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(280μLの水中に2.8mg、44.6μモル、20当量)を加えて、25℃で一晩攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(500μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、84μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.01mg/μL、10当量)を水中に加えた。30分間攪拌した後、反応混合物を、エチル酢酸(5×12mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの5回の交換、続いて、pH7.0の5mMリン酸緩衝液との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、19F DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.11mL、7.0mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に70mg)を加えた。合わされた溶液を、各々4mgおよび3mgの2つの部分に分割し、凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。これらの19F DBCOの凍結乾燥された試料を、次の接合反応で使用した。
Figure 2023022188000121

3.eCRMとのPS 19F-DBCO誘導体の接合
PS 19F-DBCO:4.0mg(40mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):5.14%
CRM濃度:5.0mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.6:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(0.5mL)に、19F DBCO誘導体(40mgのショ糖を含む4.0mgの白色粉末)を加えて、1.6:1(w/w)のPS19F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で18時間、続いて37℃で1時間緩やかに混合した。42μLのアジ化ナトリウム(0.42mg、1当量)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で2日間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000122

実施例33:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型19F接合体の調製
1.酸化
19F型PS分子量:613
水中のNaIO溶液(10mg/mL)
反応手順
PS-19F(10mg、16.31μモル)粉末を、2mLの水溶液(10mMの酢酸ナトリウム溶液、PH4.5)中に溶解した。この溶液に、34.9μLのNaIO溶液(0.349mg、1.63μモル、0.1当量)を加えた。混合物を、4℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、PH6.8の50mmのPB緩衝液で24時間(4回の交換、各々600ml)透析して、酸化PS-19F溶液を得た。透析後、DMSOを加えて、PH6.8の50mmのPB緩衝液を含む10%DMSO中にPS-19Fを作製する。
Figure 2023022188000123

2.DBCO誘導体化
PSの最終濃度:3.32mg/ml
緩衝液の最終濃度:50mMのPB(pH6.8)中に10%DMSO
反応手順
酸化19F型PS溶液(8.3mg、13.53μモル、10%DMSO中に2.5mL、50MmのPB、PH6.8)、DBCO-PEG-NH溶液(70.84μLのDMSO中に7.08mg、13.53μモル、10当量)を25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で60分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(85μLの水中に0.85mg、13.53μモル、10当量)を加え、25℃で24時間攪拌し続けた。次に、反応混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235057、20K MWCO)に移し、次に、50mMのPB緩衝液中の20%エタノールとの4回の交換、続いて、50mMのPB緩衝液との3回の交換を使用して透析し、19F DBCO誘導体型を得た。
Figure 2023022188000124

3.eCRMとのPS 19F-DBCO誘導体の接合
PS 19F-DBCO:6mg(60mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO:7%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
PSの最終濃度:5.2mg/ml
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.15mL)を、19F DBCO誘導体(60mgのショ糖を含む6mgの白色粉末、9.7μモル)に加え、2:1(w/w)のPS 19F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(23℃)で17時間緩やかに混合した。次に、混合物を、培養器(37℃)中に3時間置いた。反応後、混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液によって2倍に希釈し、水素化ホウ素ナトリウム(184.9μLの水中に1.849mg、48.9μモル、50当量)によって3時間還元した。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、PH7のPBSで24時間(3回の交換、各々1000ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、19F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000125

実施例34:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型20接合体の調製
1.酸化
20型PSの純度:68%(アントロン)
分子量:1157.9gモル-1
反応手順
20型PS(30.1mg、26μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の15.00mLの水溶液(11.25mLの水および3.75mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、160μLのNaIO溶液(1.11mg、5.2μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、25℃の水槽中に置いた。混合物を25℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水(各々15mL)との5回の交換による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-20溶液を得た。
Figure 2023022188000126

2.DBCO誘導体化
反応手順
PS20-OX(11.7mg、10.1μモル、1.61mL)を、リン酸緩衝液(0.600mL、200mM、pH6.0)に加え、これに、DBCO-PEG-NH(1.0当量、DMSO中に523gモル-1、33mg/mL、160μL)および追加量のDMSO(207μL)を加えた。反応混合物を、25℃で25分間攪拌し、その後、シアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2当量、52.5mg/mL、24μL)を加えて、1日間攪拌した。1当量の水素化ホウ素ナトリウム溶液でキャッピングした後、反応混合物を、エチル酢酸(3×20mL)で抽出し、溶媒を含まずバブリングした。DBCO誘導体を、水中の20%エタノールとの5回の交換、続いて、毎回水との3回の交換(各々12mL)を使用した遠心透析ユニット(Amicon 30kDa MWCO)によって2回精製し、20-DBCO誘導体を得た。この溶液(2.09mL、13.65mg)に、ショ糖溶液(1.37mLの水中に136.5mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、接合反応で使用するための6.0mgの20-DBCOおよび60mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000127

3.eCRMとのPS 20-DBCO誘導体の接合
PS 20-DBCO:5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.0%
CRM濃度:5.29mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
20-DBCOを、0.9%塩化ナトリウム溶液(2.684mL、0.22μmに濾過)、リン酸緩衝液(pH7.0、0.5M、0.160mL)、およびDMSO(0.400mL)中に溶解した。アジド-CRM溶液(5.29mg/mL、0.756mL)を、滴下で加えて、1.5:1(w/w)のPS20:CRM投入比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で36時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(4回の交換、各々1L)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、無菌の20-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000128

実施例35:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型22F接合体の調製
1.酸化
22F型PSの純度:89%(アントロン)
分子量:996.88
水中のNaIO溶液(5mg/mL)
反応手順
22F型PS(30.2mg、30.3μモル)粉末を、10.5mLの水および4.5mLの200mM酢酸緩衝液(pH5.26)および132μLのNaIO溶液(0.65mg、3.03μモル、0.1当量)中に溶解した。混合物を、25℃で18時間攪拌し、その後、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機(100kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-22F溶液を得た。
Figure 2023022188000129

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)22F型PS溶液(7.0mg、7.02μモル、0.956mLの水)に、緩衝溶液(0.525mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、DMSO(151μL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(112μLのDMSO中に3.67mg、7.02μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、17μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(17μLの水中に0.88mg、14.06μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、リン酸緩衝液(250μLの200mM溶液、pH=6)で希釈し、その後、9μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(31mg/mL、10当量)を水中に加えた。30分後、反応混合物を、エチル酢酸(4×5mL)で抽出した。抽出物を、AMICON超遠心分離機フィルタ(100kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12mL)、続いて水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析した。SEC-HPLCは、遊離DBCOを示すため、試料を、水中の20%エタノールとの3回の交換(各々12mL)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して再透析し、22F DBCO誘導体型を得た。この溶液(2.35mL、5.2mg)に、ショ糖溶液(0.520mLの水中に52mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。試料は、次の接合反応で使用するための、それぞれ、2.4mgおよび2.8mgの22F DBCO、ならびに24mgおよび28mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000130

3.eCRMとのPS 22F-DBCO誘導体の接合
PS 22F-DBCO:2.4mg(24mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):1.24%
CRM濃度:4mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.4:1
反応手順
22F DBCO誘導体(24mgのショ糖を含む2.4mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(0.075mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.142mLの溶液)を加えて、1.4:1(w/w)のPS22F:CRM質量比率を得た。反応混合物を緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で48時間緩やかに混合した。アジ化ナトリウム溶液(16μL、水中に10mg/mL)を加えた。30分後、接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移し、その後、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(5回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、22F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000131

実施例36:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型23F接合体の調製
1.酸化
23F型PSの純度:85%(アントロン)
分子量:792.62
水中のNaIO溶液(5.86mg/mL)
反応手順
PS-23F(20.21mg、85%に修正、17.18mg、26.7μモル)粉末を、10mLの水溶液(7.5mLの水および2.5mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH=5.5)中に溶解した。この溶液に、119μLのNaIO溶液(0.695mg、4.0μモル、0.15当量)を加えた。混合物を、25℃で4時間攪拌した。次に、酸化試料を、HPLC等級水のAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)の6回の交換(12mL)を使用して精製し、酸化PS-23F溶液を得た。
Figure 2023022188000132

2.DBCO誘導体化
反応手順
(10%の酸化レベルを想定)23F型PS溶液(13.51mg、17.0μモル、2.14mLの水)に、緩衝溶液(0.85mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.01)、DMSO(310μL)、およびDBCO-PEG-4-NH溶液(170μLのDMSO中に8.93mg、17.0μモル、10当量)をすべて25℃で加えた。次に、反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、42μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(120μLの水中に6.1mg、34.0μモル、20当量)を加えて、25℃で2日間攪拌し続けた。反応混合物を、エチル酢酸(3×20mLのエチル酢酸)で抽出し、次に、AMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの6回の交換(各々12ml)、続いて、水との3回の交換(各々12mL)を使用して透析し、23F DBCO誘導体型を得た。この溶液(7.58mL、13.8mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に138mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の3つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための6.9mgの23F DBCOおよび69mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000133

3.eCRMとのPS 23F-DBCO誘導体の接合
PS 23F-DBCO:69mgのショ糖を含む6.90mgの白色粉末
DBCO割合(%):5.1%
CRM濃度:2.617mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):2:1
反応手順
アジド官能化eCRM溶液(1.32mLの溶液)を、23F DBCO誘導体(69mgのショ糖を含む6.90mgの白色粉末)に加えて、2:1(w/w)のPS23F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、手で緩やかに混合し、その後、環状撹拌器で室温(20℃)で17時間緩やかに混合した。次に、混合物を、オーブン(37℃)中に3時間置いた。接合されたPS-CRM混合物を、予め洗浄された透析フィルタ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235071、100K MWCO)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で24時間(3回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-HVフィルタ(0.45μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、23F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000134

実施例37:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型33F接合体の調製
1.酸化
33F PS型の純度:75%(アントロン)
分子量:973
反応手順
33F PS型(34.0mg、35.0μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の17.0mLの水溶液(12.0mLの水および5.0mLの0.2Mの酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、59μLのNaIO溶液(1.49mg、7.0μモル、0.20モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、4℃の水槽中に置いた。混合物を4℃で攪拌した。18時間後、反応混合物を、HPLC-等級水との4回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(100kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-33F溶液を得た。
Figure 2023022188000135

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化33F PS型溶液(11.2mg、11.51μモル、2.49mL)に、緩衝溶液(0.114mLの0.5Mのリン酸緩衝液、pH6.0)、DBCO-PEG-NH溶液(200μLのDMSO中に6.039mg、6.33μモル、0.55当量)を加えた。反応混合物を、25℃で30分間攪拌し、その後、63μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(100μLの水中に4.5mg、34.54μモル、2.0当量)を加えた。反応混合物を、アルミニウムホイルで包み、25℃に設定された水槽中で2日間攪拌し続けた。2日目に、44μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(312μLの水中に3.12mg、11.51μモル、1.0当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×10mL)、続いてエチル酢酸(3×10mL)で抽出した。抽出物を、Nで20分間バブリングして、残留エチル酢酸を除去し、次に、2 AMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(100kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との6回の交換(各々15mL)、およびHPLC-等級水との3回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、33F DBCO誘導体を得た。この溶液(1.23mL、4.0mg)に、ショ糖溶液(40mgの0.4mLの水)を加えた。この合わされた溶液を凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。PS33F DB試料を、接合反応のために必要とされるまで4℃で保存した。
Figure 2023022188000136

3.eCRMとのPS 33F-DBCO誘導体の接合
PS 33F-DBCO:4mg(40mgのショ糖を含む)の白色粉末
DBCO割合(%):3.0%
CRM濃度:6.009mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.5:1
反応手順
33F DBCO誘導体(40mgのショ糖を含む4.0mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(5.32mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.267mL、0.5M)、およびDMSO(0.667mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.445mLの溶液)を加えて、1.5:1(w/w)のPS33F:CRM質量比率を得た。反応混合物を、環状撹拌器で室温(20℃)で19時間緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、50μL)の付加によってクエンチした。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液(7.0mL)で希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間透析を受けた(8回の交換、各々800ml)。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、33F PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000137

実施例38:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型7F接合体の調製
1.酸化
7F PS型の純度:86%(アントロン、CRB-21-20)
分子量:1227gモル-1
反応手順
天然多糖類(19.5mg、86%に修正、16.8mg、13.7μモル)を、3.9mLの水中に溶解した。この溶液に、4.58mLの水および0.293mLの酢酸ナトリウム緩衝液(1.5M、pH5.4)を加えた。次に、30μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(300μg、1.4μモル、0.1当量)を攪拌溶液に加えた。反応物を22℃で3時間攪拌した。次に、酸化PSを、回転濃縮器(Amicon 30kDa MWCO)を使用して、2倍に濃縮した。次に、濃縮されたPSを、ゲル濾過塔(GE Healthcare PD-10、回転方法)を使用して水に緩衝液交換した。
Figure 2023022188000138

2.DBCO誘導体化
反応手順
7F-OX(1.9mLの4.0mg/mL、7.6mg、6.2μモル)に、0.15mLのリン酸ナトリウム(1M、pH6.3)を加えた。次に、0.23mLのDBCO-PEG-NH(DMSO中に27.1mM、ロット1730、6.2μモル、1.0当量)を攪拌溶液に加えた。5分攪拌した後、0.039mLのNaCNBH(水中に20mg/mL、12.4μモル、2.0当量)を攪拌溶液に加えた。反応物を22℃で40時間攪拌した。次に、溶液に、0.024mL水素化ホウ素ナトリウム(水中に10mg/mL、6.3μモル、1.0当量)を加えた。15分攪拌した後、ゲル濾過塔(Thermo Zeba Columns,40kDa MWCO)を介した水への緩衝液交換によって、PSを精製した。
Figure 2023022188000139

3.eCRMとのPS 7F-DBCO誘導体の接合
PS 7F-DBCO:2.8mg(水中に2.8mg/mL)
DBCO割合(%):4.8%
CRM濃度:4.7mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.6:1
反応手順
5mLの遠心分離機チューブ中の7F-DBCO(水中に1mLの2.8mg/mL)に、0.128mLのリン酸カリウム(0.5M、pH7.5)を加えた。次に、この溶液に、0.372mLのアジド官能化eCRM(pH7.1の20mMリン酸カリウム中に4.7mg/mL、7.5%のショ糖)を加えることによって、1.6:1(w/w)の投入質量比率を得た。溶液を、環状ロッカー上に置き、(溶液がチューブの端から端へと動くように)22℃で16時間揺り動かした。次に、接合体を、1時間後および4時間後の透析液の変化(500mL)を含む、48時間300kDaの透析膜(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2、1mL)を使用して0.9%塩化ナトリウムに透析した。透析された溶液を、注射器フィルタ(Pall Acrodisc Supor、0.22μm、直径13mm)を通して濾過し、7F-CRM接合体溶液を得た。
実施例39:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型1接合体の調製
1.酸化
1型PSの純度:80%(ウロン酸アッセイ)
分子量:625gモル-1
反応手順
天然多糖類(20.2mg、32.32μモル)を、9.5mLの水溶液(7.0mLの水および2.5mLの酢酸緩衝液、200mM、pH5.24)中に溶解した。この溶液に、492μLの過ヨウ素酸ナトリウム溶液(3.45mg、16.16μモル、0.5当量)を加えた。混合物を25℃で8時間攪拌した。酸化PSを、水との6回の交換を使用したAmicon遠心30kDa MWCO透析を使用して精製し、精製されたPS-1溶液を得た。
Figure 2023022188000140

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化(10%の酸化レベルを想定)1型PS溶液(16mg、25.6μモル、2.4mLの水)に、緩衝溶液(0.424mLの500mMリン酸緩衝液、pH=6.74)、DMSO(572μL)、およびDBCO-PEG-NH溶液(134μLのDMSO中に13.4mg、25.6μモル、10当量)を加えた。次に、反応混合物を25℃で30分間攪拌し、その後、32μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(32μLの水中に3.2mg、51.2μモル、20当量)を加え、25℃で3日間攪拌し続けた。緩衝溶液(0.300mLの200mMリン酸緩衝液、pH=6.0)、続いて水素化ホウ素ナトリウム(100μL中に0.97mg、25.6μモル、10当量)を加え、25℃で30分間攪拌した。反応混合物を、ジクロロメタン(4×5mL)で抽出した。水性抽出物を、2つのAMICON超遠心分離機フィルタ(30kDa MWCOが6~12mL)に移し、次に、水中の20%エタノールとの5回の交換(各々12mL)、続いて、水中の3%DMSOとの3回の交換(各々12mL)、0.9%塩化ナトリウムとの3回の交換、および水との3回の交換を使用して透析し、1 DBCO誘導体型を得た。この溶液(1.37mL、10.0mg)に、ショ糖溶液(1mLの水中に100mg)を加えた。合わされた溶液を、2つの等しい部分に分割し、各々凍結乾燥して、白色粉末の2つの試料を得た。各試料は、次の接合反応で使用するための5.0mgの1-DBCOおよび50mgのショ糖を含有した。
Figure 2023022188000141

3.eCRMとのPS 1-DBCO誘導体の接合
PS 1-DBCO5.0mg(50mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.5%
CRM濃度:4.86mg/mLの溶液
PS:CRM(投入比率):1.7:1
反応手順
凍結乾燥された1-DBCO型粉末(5mg)を、濾過された0.9%塩化ナトリウム溶液(5.39mL)およびリン酸緩衝液(250μL、0.5M、pH7.0)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.47mL)を加えて、1.7:1(w/w)のPS-1:CRM投入質量比率を得た。溶液を、手で非常に緩やかに混合し、その後、室温(20℃)で18時間、環状撹拌器で緩やかに混合した。クリック反応を、アジ化ナトリウム溶液(10mg/mL、52μL)の付加によってクエンチした。CRM接合体を、予め洗浄された透析チューブ(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,300K MWCO、10mL)に移し、次に、0.9%塩化ナトリウム溶液で48時間(8回の交換、各々800ml)透析した。透析された溶液を、Millex-GP注射器フィルタ(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、1-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000142

実施例40:表2からのeCRMへの肺炎球菌PS血清型10A接合体の調製
1.酸化
PS血清型10A ロット#:63662302(ATCC)
PS 10Aの純度:77%(アントロン)
分子量:1013kDa(繰り返し単位=1227g/モル)
反応手順
10A型PS(25.99mg、21.18μモル)粉末を、攪拌子により50mLのポリスチレン試料チューブ中の12.995mLの水溶液(9.746mLの水および3.249mLの0.2M酢酸緩衝液、pH5.5)中に溶解した。いったんPSが可溶化されると、135μLのNaIO溶液(0.27mg、1.26μモル、0.06モル当量)を加えた。反応チューブをホイルで包み、冷蔵庫中に置いて、4℃で攪拌した。45分後、反応混合物を、HPLC-等級水との6回の交換(各々15mL)による3つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)を使用して透析し、酸化PS-10A溶液を得た。
Figure 2023022188000143

2.DBCO誘導体化
反応手順
酸化10A型PS溶液(18.15mg、14.79μモル、3.371mL)に、緩衝溶液(0.259mLの0.5Mリン酸緩衝液、pH6.0)、DMSO(0.145mL)、およびDBCO-PEG-NH溶液(154μLのDMSO中に7.7mg、14.79μモル、1モル当量)を加えた。反応混合物を4℃で30分間攪拌し、その後、101μLのシアノ水酸化ホウ素ナトリウム溶液(101μLの水中に1.9mg、2モル当量)を加えた。反応混合物をアルミニウムホイルで包み、4℃の冷蔵庫で2日間攪拌し続けた。2日目に、85μLの水素化ホウ素ナトリウム溶液(0.56mg、14.79μモル、1モル当量)を加えることによって、反応を中断させた。30分間攪拌した後、反応混合物を、ジクロロメタン(3×15mL)で抽出した。抽出物を、Nで15分間バブリングして、残留ジクロロメタンを除去し、次に、1つのAMICON(登録商標)Ultra-15遠心フィルタデバイス(30kDa MWCO、15mL)に移した。3%DMSO溶液との3回の交換(各々15mL)、20%エタノール溶液との3回の交換(15mL)、0.9%塩化ナトリウム溶液との2回の交換、およびHPLC-等級水との2回の交換(各々15mL)を行うことによって、透析を実行し、10A DBCO誘導体を得た。この溶液(3.371mL、15.06mg)に、ショ糖溶液(1.506mLの水中に150.6mg)を加えた。この合わされた溶液を、3つの等しい画分に分割し、各々凍結乾燥して、微細な白色粉末を得た。凍結乾燥後、すべての画分を、接合反応のために必要とされるまで4℃で保存した。
Figure 2023022188000144

3.eCRMとのPS 10A-DBCO誘導体の接合
PS 10A-DBCO:5.20mg(52.0mgのショ糖を含む)の凍結乾燥粉末
DBCO割合(%):2.1%
CRM:pH7.1の20mMヒスチジン中に4.962mg/mL(7.5%のショ糖)
PS:CRM(投入質量比率):1.25:1
反応手順
10A DBCO誘導体(52.0mgのショ糖を含む5.2mgの白色粉末)を、0.9%塩化ナトリウム溶液(1.502mL)、pH7のリン酸緩衝液(0.104mL、0.5M)、およびDMSO(0.156mL)中に溶解した。アジド官能化eCRM溶液(0.838mLの溶液)を加えて、1.25:1(w/w)のPS10A:CRM質量比率を得た。2.0mg/mLのPSの濃度の反応混合物を、環状撹拌器で室温(22℃)で2時間緩やかに混合した。次に、反応混合物を、1.0mg/mLに希釈し、さらに20時間22°Cで攪拌し続けた。アジ化ナトリウム(7.5mg、115μモル)の付加により、接合反応を終了させた。次に、反応混合物を、0.9%塩化ナトリウム溶液で7mLの最終容量まで希釈し、予め洗浄された透析デバイス(SpectrumLab Float-A-Lyzer G2,Cat.No.G235060,300K MWCO)に移した。試料は、0.9%塩化ナトリウム溶液中で48時間(2回の交換、各々1L、1回の交換、4L)透析を受けた。透析された溶液を、Millex-GP(0.22μm、33mmのポリエーテルスルホン)を通して濾過し、10A PS-CRM接合体溶液を得た。
Figure 2023022188000145

実施例41:肺炎球菌多糖類へのDBCO-PEG-アミンおよびDBCO-アミンの組み込みの評価
様々な肺炎球菌多糖類を、上記に記載されるように酸化し、同じ条件下でDBCO-PEG-アミン(DBCOもしくはDB)またはDBCO-アミン(DBCAもしくはDA)と反応させて、組み込み効率に対するリンカーの効果を判定した。以下の表は、試験された血清型のうちの1つを除いてすべてにおいて、DBCO-アミンが、100個の多糖類の繰り返し単位当たり、DBCO-PEG-アミンと比較して、より高い効率で組み込まれることを示す。
Figure 2023022188000146


Figure 2023022188000147

実施例42:eCRMへのDBCO-PEG-アミンおよびDBCO-アミンの接合の比較
DBCO-PEG-アミン(DB)またはDBCO-アミン(DA)に連結された肺炎球菌多糖類を、上記の実施例に沿って同一の反応条件下で表2からの同じeCRMに接合させて、接合効率に対するリンカーの効果を評価した。以下の表は、DBCO-アミンに連結された多糖類と共に形成された接合体が、一般に、より少ない遊離多糖類およびより大きい接合体サイズをもたらすことを示す。
Figure 2023022188000148

実施例43:肺炎球菌PS血清型-eCRM接合体の免疫原性
本開示により生成された様々な一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後の、マウスまたはウサギにおける総IgGおよび機能的OPA抗体反応を判定するための実験を行った。Opsono食細胞活性(OPA)アッセイを使用して、様々な肺炎連鎖球菌の血清型に特異的なネズミの血清中の機能的抗体を測定した。OPA測定は、Moon H.Nahm&Robert L.Burton,“Protocol for opsonophagocytic killing assay for antibodies against Group B Streptococcus (UAB GBS OPA),” Version B.04,March 2016(Original Version A.01 posted September 2011)(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-GBS-OPA.pdf)and “Protocol for multiplexed opsonophagocytic killing assay(UAB-MOPA)for antibodies against Streptococcus pneumoniae”Version E.02,December 2014(www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf)に基づく。図3は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のオプソニン食作用(OPA)活性を示す。Yu et al.,“Development of an Automated and Multiplexed Serotyping Assay for Streptococcus pneumoniae,”Clin Vaccine Immunol.2011,18(11):1900-7に記載されている方法に従って、各肺炎球菌多糖類に特異的な総多糖類結合抗体(IgG)も測定した。図4は、マウスにおける一価肺炎球菌多糖類-eCRM接合体の投与後のIgG応答を示す。
以下の表に要約されるように、試験されたすべての接合体が、図3および図4に示されるOPAおよびIgGの結果に匹敵するか、またはそれより優れたIgGおよび機能的抗体反応をマウスまたはウサギにおいて誘発した。
Figure 2023022188000149
24個の肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、および33Fの各々に対する接合体の組み合わせを、各接合体中の担体として配列番号9のCRM197誘導体を使用して調製した。この組成物の免疫原性を、7匹ウサギの群における3つの投与計画を使用して試験した。接合された13価のPrevnar(商標)ワクチン、および比較を助けるために非接合血清型6A多糖類を加えた、非接合23価のPneumovax(商標)ワクチンとも比較した。3つの組成物は、Prevnar(商標)およびPneumovax(商標)を希釈することを伴う、血清型当たり当量の多糖類用量(Prevnar(商標)が2倍の投与量を含む、6Bを除く)を有した。すべての3つの組成物は、アジュバントをPneumovax(商標)に加えることを伴う、用量当たり60μgのリン酸アルミニウムアジュバントを含んだ。
本明細書に開示される接合技術は、11個の追加の血清型由来の莢膜多糖も含む、承認されたPrevnar-13(商標)ワクチン中よりも低量のCRM197担体を含む組成物をもたらした。接合された24価の組成物中の莢膜多糖とCRM197との全体的な重量比率は、13価のPrevnar(商標)中に見られるものの約2倍であった。
第3の用量後の応答を、図5(IgG応答)および図6(OPA応答)に示す。期待されるように、2つの接合されたワクチンを使用した応答は、非接合体ワクチンによるよりもはるかに大きかった。さらに、24価のワクチンを使用したIgGおよびOPA応答は、承認されたワクチンが適用される血清型においてPrevnar-13(商標)を使用することによって達成されるものに匹敵したが、加えて、Prevnar-13に含まれない11個の血清型よりも優れていた。驚くべきことに、担体誘発されたエピトープ抑制の証拠はなかった。
実施例44:歯周炎のための接合体ワクチンの調製
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対するワクチンを、以下のとおりに、ポルフィロモナス・ジンジバリス血清型K1、K2、K3、K4、K5、および/またはK6由来の莢膜多糖(CPS)をeCRM担体タンパク質に接合させることによって調製する。
ポルフィロモナス・ジンジバリスを増殖させ、任意の好適な方法によって取り扱う。例えば、Huang et al.,Mol Oral Microbiol.30:438-50(2015)を参照されたい。CPSを、最適な任意の方法によって精製する。例えば、Gonzalez et al.,Infect.Immun.71:2283-2287(2003)、Schifferle et al.,J.Immunol.143:3035-3042(1989)、Pantosti et al.,Infect.Immun.59:2075-2082(1991)を参照されたい。簡潔に言うと、ポルフィロモナス・ジンジバリスを遠心分離によって回収し、生理食塩水ですすぎ洗い、水に懸濁し、加熱フェノール水抽出に供した。水相を回収し、エーテルで抽出し、除菌濾過水に対して透析した。水性材料をpH5.5に調節し、デオキシリボヌクレアーゼIおよびリボヌクレアーゼA(シグマ)からなるヌクレアーゼカクテルで一晩消化した。pHを中性に調節し、タンパク質分解酵素K(1mg/ml、シグマ)を試料に加え、37℃で一晩緩やかな振とうで培養した。次に、第2のタンパク質分解酵素Kの消化を実行し、結果として生じた炭水化物を、10,000分子量分画膜を使用して濃縮した。CPSを低温エタノールで凝結させ、デオキシコール酸緩衝液に懸濁し、S-400ゲル濾過塔(スウェーデン国ウプサラPharmacia)を使用して単離した。高分子質量のCPSを含有する画分(SEC-MALSを介して)をプールし、LPSを含有する画分を廃棄する。プールされた画分を濃縮し、凝結させ、透析し、凍結乾燥する。
緩衝化された多糖類溶液に、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸(CDAP、アセトニトリル中の100mg/mLの溶液由来)のXモル当量(多糖類の繰り返し単位まで、Xはスクリーニングによって判定される)を、激しく攪拌しながら加える。CDAPを加えた5分後に、0.5モル当量のジベンゾシクロオクタン-アミンリンカー(DMSO原液由来の)を加えた。さらに1時間後、グリシンを加えて、任意の未反応シアン酸エステルをクエンチする。代替的に、過ヨウ素酸塩またはTEMPO/NCS化学を使用して、CPSを改変し得る。次に、誘導体化された多糖類を、透析またはUF/DFを介して精製する。アントロン比色分析を使用して、多糖類の濃度を測定し、309nmでの吸光度を使用して、ジベンゾシクロオクチンの濃度を測定する。これらの2つの値を組み合わせて、ジベンジシクロオクチン官能基で誘導体化された多糖類の百分率の推定値を得ることができる。
表2のものなど、最適なeCRMタンパク質と誘導体化された多糖類とを混合することによって、接合体を調製した。18時間の培養後、1モル当量のアジ化ナトリウムを加え、任意の未反応ジベンゾシクロオクチン官能基をクエンチする。次に、透析またはUF/DFを介して接合体を精製し、未反応eCRMタンパク質を除去する。次に、接合体を分析して、多糖類の濃度(比色分析)、タンパク質の濃度(比色分析)を判定し、遊離/非接合単糖類百分率を計算する。SEC-MALSを使用して、分子量を測定する。
1%デオキシコール酸溶液(pH6.8)の付加および30分間の氷上での培養によって、多糖類:タンパク質接合体を凝結させた。培養後、1MのHClを加え、混合物を、20分間10,000rpmで遠心分離する。残りの上清は、非接合多糖類を含有している。多糖類の濃度を判定するために、硫酸中に溶解したアントロンを試料に加え、10分間95℃まで加熱する。混合物を冷却し、620nmでの吸光度を測定する。多糖類の単糖類成分の標準的な曲線を使用して、濃度を計算する。
本明細書に記載される実施形態は、例示のみの方法によって提供され、実施形態に対する様々な代替例は、本明細書に記載される実施形態を実践する際に除外されない。
Figure 2023022188000150
Figure 2023022188000151
Figure 2023022188000152
Figure 2023022188000153
Figure 2023022188000154
Figure 2023022188000155
Figure 2023022188000156
Figure 2023022188000157
Figure 2023022188000158
本明細書に記載される実施形態は、例示のみの方法によって提供され、実施形態に対する様々な代替例は、本明細書に記載される実施形態を実践する際に除外されない。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
1. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であり、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)前記抗原が、前記nnAA残基と接合している、接合体。
2. 前記担体タンパク質が、4~9個のnnAA残基を含む、項1に記載の接合体。
3. 少なくとも1つのnnAAが、天然担体タンパク質中のリジンと置換される、項1または2に記載の接合体。
4. 前記担体タンパク質が、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する、項1~3のいずれかに記載の接合体。
5. 少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換される、項4に記載の接合体。
6. 前記担体タンパク質が、配列番号9のアミノ酸配列を含む、項1~5のいずれかに記載の接合体。
7. 前記少なくとも1つのnnAAが、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ2,3-二置換プロパン酸である、項1~6のいずれかに記載の接合体。
8. 前記nnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、項1~7のいずれかに記載の接合体。
9. 前記抗原が、トリアゾール連結部分を介して前記nnAAと接合している、項1~8のいずれかに記載の接合体。
10. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む担体タンパク質であり、前記抗原が、前記nnAAと接合し、さらに、前記少なくとも1つのnnAA残基が、式XIIの構造を有するアミノ酸に対応し、
Figure 2023022188000175
式中、Arが、任意選択的に少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、W が、C ~C 10 アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、Q1が、ゼロまたは1であり、W が、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、その結果、前記ポリペプチド中の前記nnAA残基が、式XIIIの構造を有し、
Figure 2023022188000176
式中、R が、OHまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基であり、R が、Hまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基である、接合体。
11. W がアジドであり、Arがフェニレンであり、またはArが、窒素ヘテロ原子および任意選択的に、N、O、およびSから選択される少なくとも1つの追加のヘテロ原子を含有し、Q1が1であり、かつ/またはW が低級アルキレンである、項10に記載の接合体。
12. 前記抗原が、式XIまたはXIaによる前記担体タンパク質に連結され、
Figure 2023022188000177
式中、
が、H、ホルミル、または前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
が、OHまたは前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
Wが、CまたはNであり、
yが、少なくとも1であり、
nが、少なくとも1であり、
Xが、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである、項1~11のいずれかに記載の接合体。
13. 前記抗原が、細菌莢膜多糖、例えば、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびポルフィロモナス・ジンジバリスからなる群から選択される細菌由来の莢膜多糖である、項1~12のいずれかに記載の接合体。
14. 前記抗原が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である、項12に記載の接合体。
15. 多糖類と担体タンパク質との比率(w/w)が、1を上回る、項1~14のいずれかに記載の接合体。
16. 前記ポリペプチドが、3つ以上のnnAA残基を含み、前記接合体が、少なくとも500kDaの分子量を有する、項1~15のいずれかに記載の接合体。
17. 前記ポリペプチドが、(a)CRM197であるか、または配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(b)3~9つのnnAA残基を含む、項15に記載の接合体。
18. 前記接合体が、タンパク質-抗原-タンパク質連結を通して架橋される、項1~17のいずれかに記載の接合体。
19. 前記接合体が、少なくとも900kDaの分子量を有する、項1~18のいずれかに記載の接合体。
20. 分子量が900kDa~5MDaである、項19に記載の接合体。
21. 接合体を生成するための方法であって、
a.非天然アミノ酸(「nnAA」)の第2の化学ハンドルに接合することができる第1の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、
b.前記第1および第2の化学ハンドルが反応して抗原-ポリペプチド接合体を形成する条件下で、前記nnAAのうちの少なくとも1つを含むポリペプチドと前記活性化抗原を組み合わせることであって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、
c.前記接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法。
22. 前記第1の化学ハンドルが、アルキン基を含み、かつ/または前記第2の化学ハンドルがアジド基を含む、項21に記載の方法。
23. 前記抗原が、プロパルギル、DIFO、DBCO、DBCO-NH 、およびDBCO(PEG)n-NH からなる群から選択される官能基を含む第2の試薬と反応されている、項21または22に記載の方法。
24. (i)前記抗原が、式V、式VI、もしくは式VIaの構造を含み、
Figure 2023022188000178
式中、L が、結合、-NH-、-O-、-S-、-NH(L 12 )-、-O(L 12 )-、もしくは-S(L 12 )-であり、
が、結合、-C(=O)-、-S(=O) -、-C(=O)L 12 -、-S(=O) 12 であり、
12 が、L 22 もしくはL 22 NH-であり、
22 が、C 1-10 アルキルまたは-(CH CH O) 1-10 -であり、
が、前記抗原の少なくとも1つの部分であるか、
または(ii)前記抗原が、式VIIもしくは式VIIaの構造を含み、
Figure 2023022188000179
式中、Xが、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nが少なくとも1であるか、
または(iii)前記抗原が、式VIIbもしくは式VIIcの構造を含み、
Figure 2023022188000180
式中、Xが、多糖類の少なくとも1つのアミノ糖のアミンであり、
nが少なくとも1であるか、
または(iv)前記抗原が、構造A-Xのz部分を含み、式中、
Aが、
Figure 2023022188000181
であり、
Xが、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
nが、少なくとも1であり、
zが1を上回るか、
または(v)前記抗原が式VIIIの構造を含み、
Figure 2023022188000182
式中、L 22 が、結合、アルキル、またはポリ(アルキルオキシ)であり、
が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、
または(vi)前記抗原が、式IXの構造を含み、
Figure 2023022188000183
式中、U が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、
または(vii)前記抗原が、式IXaの構造を含み、
Figure 2023022188000184
式中、L 22 が、C 1-10 アルキルまたは-(CH CH O) 1-10 -であり、
が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、項21または項22に記載の方法。
25. 項1~20のいずれかに記載の接合体を生成するための、項21~24のいずれかに記載の方法。
26. 抗原がT細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合している、タンパク質-接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、前記改善が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを前記担体タンパク質として用いることを含み、前記非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて前記抗原が前記ポリペプチドに接合される、改善された方法。
27. 少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であって、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、担体タンパク質。
28. 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも1つのnnAAを含む、担体タンパク質であって、前記少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換され、前記nnAAが、連結部分を含む、担体タンパク質。
29. 免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するための担体タンパク質であって、前記タンパク質が、(i)少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)少なくとも1つのnnAAを含み、かつ(iii)pH7.4のトリス緩衝液中、20℃で少なくとも50mg/Lの溶解度を有する、担体タンパク質。
30. 項26~28のいずれかに記載の担体タンパク質を生成するためのプロセスであって、
(a)前記担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、
(b)前記非天然アミノ酸、前記抑制コドンに相補的であるtRNA、およびアミノアシル-tRNA合成酵素を含む無細胞抽出物と前記核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、
(c)前記担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位に前記非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、前記(b)の前記反応混合物を培養することと、を含む、プロセス。
31. 前記非天然アミノ酸が、4-アジドメチル-フェニルアラニン(pAMF)であり、前記(b)のtRNAが、pAMFで荷電されることができる、項30に記載の方法。
32. 約10℃~約30℃の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも2つのnnAAを含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成された前記ポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、前記可溶性画分と前記不溶性画分との比率が、少なくとも30%(w/w)である、方法。
33. 前記温度が、(i)約20℃を上回るか、または(ii)約20℃を下回り、例えば、前記温度が、約14℃~約18℃である、項32に記載の方法。
34. 項1~19に記載の複数の接合体を含む組成物であって、前記複数の接合体の各々が、異なる抗原を含む、組成物。
35. 血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される2つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される14個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される15個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される20個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される21個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される24個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される25個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清群A、C、W135、X、およびYからなる群から選択される4つ以上の異なる髄膜炎菌血清群由来の莢膜多糖の接合体、または
血清型K1、K2、K3、K4、K5、およびK6からなる群から選択される2つ以上の異なるポルフィロモナス・ジンジバリス血清型由来の莢膜多糖の接合体を含む、項34に記載の組成物。
36. 対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、項1~20のいずれかに記載の接合体または項34もしくは項35に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

Claims (36)

  1. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であり、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)前記抗原が、前記nnAA残基と接合している、接合体。
  2. 前記担体タンパク質が、4~9個のnnAA残基を含む、請求項1に記載の接合体。
  3. 少なくとも1つのnnAAが、天然担体タンパク質中のリジンと置換される、請求項1または2に記載の接合体。
  4. 前記担体タンパク質が、配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項1~3のいずれかに記載の接合体。
  5. 少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換される、請求項4に記載の接合体。
  6. 前記担体タンパク質が、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項1~5のいずれかに記載の接合体。
  7. 前記少なくとも1つのnnAAが、2位のアミノ置換基と、3位のアジド含有置換基、1,2,4,5-テトラジニル置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ2,3-二置換プロパン酸である、請求項1~6のいずれかに記載の接合体。
  8. 前記nnAAが、2-アミノ-3-(4-アジドフェニル)プロパン酸(pAF)、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸(pAMF)、2-アミノ-3-(5-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)ピリジン-2-イル)プロパン酸、2-アミノ-3-(6-(アジドメチル)ピリジン-3-イル)プロパン酸、2-アミノ-5-アジドペンタン酸、および2-アミノ-3-(4-(アジドメチル)フェニル)プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項1~7のいずれかに記載の接合体。
  9. 前記抗原が、トリアゾール連結部分を介して前記nnAAと接合している、請求項1~8のいずれかに記載の接合体。
  10. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも1つの非天然アミノ酸(nnAA)を含む担体タンパク質であり、前記抗原が、前記nnAAと接合し、さらに、前記少なくとも1つのnnAA残基が、式XIIの構造を有するアミノ酸に対応し、
    Figure 2023022188000159
    式中、Arが、任意選択的に少なくとも1つのヘテロ原子を含有する5員または6員芳香族環を含み、Wが、C~C10アルキレン、-NH-、-O-、および-S-から選択され、Q1が、ゼロまたは1であり、Wが、アジド、任意選択的に低級アルキル基とC置換される1,2,4,5-テトラジニル、およびエチニルから選択され、その結果、前記ポリペプチド中の前記nnAA残基が、式XIIIの構造を有し、
    Figure 2023022188000160
    式中、Rが、OHまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Rが、Hまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基である、接合体。
  11. がアジドであり、Arがフェニレンであり、またはArが、窒素ヘテロ原子および任意選択的に、N、O、およびSから選択される少なくとも1つの追加のヘテロ原子を含有し、Q1が1であり、かつ/またはWが低級アルキレンである、請求項10に記載の接合体。
  12. 前記抗原が、式XIまたはXIaによる前記担体タンパク質に連結され、
    Figure 2023022188000161
    式中、
    が、H、ホルミル、または前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
    が、OHまたは前記担体タンパク質の少なくとも1つのアミノ酸であり、
    Wが、CまたはNであり、
    yが、少なくとも1であり、
    nが、少なくとも1であり、
    Xが、莢膜多糖の少なくとも1つのポリオールである、請求項1~11のいずれかに記載の接合体。
  13. 前記抗原が、細菌莢膜多糖、例えば、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびポルフィロモナス・ジンジバリスからなる群から選択される細菌由来の莢膜多糖である、請求項1~12のいずれかに記載の接合体。
  14. 前記抗原が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である、請求項12に記載の接合体。
  15. 多糖類と担体タンパク質との比率(w/w)が、1を上回る、請求項1~14のいずれかに記載の接合体。
  16. 前記ポリペプチドが、3つ以上のnnAA残基を含み、前記接合体が、少なくとも500kDaの分子量を有する、請求項1~15のいずれかに記載の接合体。
  17. 前記ポリペプチドが、(a)CRM197であるか、または配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、(b)3~9つのnnAA残基を含む、請求項15に記載の接合体。
  18. 前記接合体が、タンパク質-抗原-タンパク質連結を通して架橋される、請求項1~17のいずれかに記載の接合体。
  19. 前記接合体が、少なくとも900kDaの分子量を有する、請求項1~18のいずれかに記載の接合体。
  20. 分子量が900kDa~5MDaである、請求項19に記載の接合体。
  21. 接合体を生成するための方法であって、
    a.非天然アミノ酸(「nnAA」)の第2の化学ハンドルに接合することができる第1の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、
    b.前記第1および第2の化学ハンドルが反応して抗原-ポリペプチド接合体を形成する条件下で、前記nnAAのうちの少なくとも1つを含むポリペプチドと前記活性化抗原を組み合わせることであって、前記ポリペプチドが、少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、
    c.前記接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法。
  22. 前記第1の化学ハンドルが、アルキン基を含み、かつ/または前記第2の化学ハンドルがアジド基を含む、請求項21に記載の方法。
  23. 前記抗原が、プロパルギル、DIFO、DBCO、DBCO-NH、およびDBCO(PEG)n-NHからなる群から選択される官能基を含む第2の試薬と反応されている、請求項21または22に記載の方法。
  24. (i)前記抗原が、式V、式VI、もしくは式VIaの構造を含み、
    Figure 2023022188000162
    式中、Lが、結合、-NH-、-O-、-S-、-NH(L12)-、-O(L12)-、もしくは-S(L12)-であり、
    が、結合、-C(=O)-、-S(=O)-、-C(=O)L12-、-S(=O)12であり、
    12が、L22もしくはL22NH-であり、
    22が、C1-10アルキルまたは-(CHCHO)1-10-であり、
    が、前記抗原の少なくとも1つの部分であるか、
    または(ii)前記抗原が、式VIIもしくは式VIIaの構造を含み、
    Figure 2023022188000163
    式中、Xが、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
    nが少なくとも1であるか、
    または(iii)前記抗原が、式VIIbもしくは式VIIcの構造を含み、
    Figure 2023022188000164
    式中、Xが、多糖類の少なくとも1つのアミノ糖のアミンであり、
    nが少なくとも1であるか、
    または(iv)前記抗原が、構造A-Xのz部分を含み、式中、
    Aが、
    Figure 2023022188000165
    であり、
    Xが、多糖類の少なくとも1つのポリオールであり、
    nが、少なくとも1であり、
    zが1を上回るか、
    または(v)前記抗原が式VIIIの構造を含み、
    Figure 2023022188000166
    式中、L22が、結合、アルキル、またはポリ(アルキルオキシ)であり、
    が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、
    または(vi)前記抗原が、式IXの構造を含み、
    Figure 2023022188000167
    式中、Uが、抗原の少なくとも1つの部分であるか、
    または(vii)前記抗原が、式IXaの構造を含み、
    Figure 2023022188000168
    式中、L22が、C1-10アルキルまたは-(CHCHO)1-10-であり、
    が、抗原の少なくとも1つの部分であるか、請求項21または請求項22に記載の方法。
  25. 請求項1~20のいずれかに記載の接合体を生成するための、請求項21~24のいずれかに記載の方法。
  26. 抗原がT細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合している、タンパク質-接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、前記改善が、少なくとも1つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを前記担体タンパク質として用いることを含み、前記非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて前記抗原が前記ポリペプチドに接合される、改善された方法。
  27. 少なくとも1つのT細胞活性化エピトープおよび少なくとも2つの非天然アミノ酸(「nnAA」)残基を含む担体タンパク質であって、(i)前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質D、およびCRM197からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含む、担体タンパク質。
  28. 配列番号1と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号1内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも1つのnnAAを含む、担体タンパク質であって、前記少なくとも1つのnnAAが、配列番号1のK25、K34、K38、K40、K213、K215、K228、K245、K265、K386、K523、またはK527と置換され、前記nnAAが、連結部分を含む、担体タンパク質。
  29. 免疫原性多糖類-タンパク質接合体を調製するための担体タンパク質であって、前記タンパク質が、(i)少なくとも1つのT細胞活性化エピトープを含み、(ii)少なくとも1つのnnAAを含み、かつ(iii)pH7.4のトリス緩衝液中、20℃で少なくとも50mg/Lの溶解度を有する、担体タンパク質。
  30. 請求項26~28のいずれかに記載の担体タンパク質を生成するためのプロセスであって、
    (a)前記担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、
    (b)前記非天然アミノ酸、前記抑制コドンに相補的であるtRNA、およびアミノアシル-tRNA合成酵素を含む無細胞抽出物と前記核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、
    (c)前記担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位に前記非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、前記(b)の前記反応混合物を培養することと、を含む、プロセス。
  31. 前記非天然アミノ酸が、4-アジドメチル-フェニルアラニン(pAMF)であり、前記(b)のtRNAが、pAMFで荷電されることができる、請求項30に記載の方法。
  32. 約10℃~約30℃の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも2つのnnAAを含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成された前記ポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、前記可溶性画分と前記不溶性画分との比率が、少なくとも30%(w/w)である、方法。
  33. 前記温度が、(i)約20℃を上回るか、または(ii)約20℃を下回り、例えば、前記温度が、約14℃~約18℃である、請求項32に記載の方法。
  34. 請求項1~19に記載の複数の接合体を含む組成物であって、前記複数の接合体の各々が、異なる抗原を含む、組成物。
  35. 血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される2つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される14個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される15個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される20個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される21個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される24個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、13、14、15B、16、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、24F、31、および33Fからなる群から選択される25個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
    血清群A、C、W135、X、およびYからなる群から選択される4つ以上の異なる髄膜炎菌血清群由来の莢膜多糖の接合体、または
    血清型K1、K2、K3、K4、K5、およびK6からなる群から選択される2つ以上の異なるポルフィロモナス・ジンジバリス血清型由来の莢膜多糖の接合体を含む、請求項34に記載の組成物。
  36. 対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、請求項1~20のいずれかに記載の接合体または請求項34もしくは請求項35に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
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