BR112020014978A2 - Composição de conjugado polissacarídeo-proteína pneumocócico multivalente - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a composições de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto que compreendem 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferentes, em que cada um dos conjugados inclui um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de streptococcus pneumoniae conjugado a toxoide tetânico (tt) ou crm197, em que os serotipos de streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, 6a, 6b, 7f, 8, 9n, 9v, 10a, 11a, 12f, 14, 15b, 18c, 19a, 19f, 22f, 23f e 33f, em que os polissacarídeos capsulares de serotipos dois dos serotipos 1, 3 e 5 são conjugados a tt e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados a crm197. são também fornecidos métodos para produzir as composições de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e métodos para usar as mesmas para a profilaxia contra infecção ou doença por streptococcus pneumoniae em um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÃO DE CONJUGADO POLISSACARÍDEO-PROTEÍNA PNEUMO- CÓCICO MULTIVALENTE”.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício e depende da data de de- pósito do pedido de patente provisório número U.S. 62/626.482, depo- sitado em 5 de fevereiro de 2018, e do pedido de patente coreano nú- mero 10-2018-0045246, depositado em 18 de abril de 2018, cujas divul- gações completas estão incorporadas ao presente documento a título de referência.

CAMPO DA TÉCNICA

[002] A presente invenção refere-se, de modo geral, a composi- ções de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, vaci- nas que compreendem as mesmas e métodos para usar estas compo- sições e vacinas para profilaxia de infecção ou doença por Streptococ- cus pneumoniae em um indivíduo.

ANTECEDENTES

[003] O pneumococo (Streptococcus pneumoniae) é uma bactéria anaeróbica facultativa em formato de lanceta, Gram-positiva com mais de 90 serotipos conhecidos. Foi demonstrado que a maioria dos seroti- pos de S. pneumoniae causa doenças, com os 23 serotipos mais co- muns responsáveis por aproximadamente 90% das doenças invasivas em todo o mundo. Os serotipos são classificados com base na resposta serológica dos polissacarídeos capsulares, o fator de virulência mais im- portante para pneumococo. Os polissacarídeos capsulares são antíge- nos independentes de célula T que induzem a produção de anticorpos na ausência de células T auxiliares. Os antígenos independentes de cé- lula T geralmente induzem anticorpos com baixa afinidade e respostas imunológicas de curta duração com pouca ou nenhuma memória imu- nológica.

[004] As vacinas pneumocócicas iniciais incluíram combinações de polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos. Estas vacinas podem conferir imunidade contra S. pneumoniae em pacientes com sis- tema imunológico saudável ou desenvolvido; no entanto, não foram efi- cazes em bebês que não possuem um sistema imunológico desenvol- vido e em indivíduos idosos, que frequentemente têm função imunoló- gica prejudicada. Para melhorar a resposta imunológica às vacinas pneumocócicas, particularmente em bebês e idosos, que têm maior risco de desenvolver infecção por S. pneumoniae, os polissacarídeos capsulares foram conjugados com proteínas carreadoras adequadas para criar vacinas pneumocócicas conjugadas. A conjugação com uma proteína carreadora adequada altera o polissacarídeo capsular de um antígeno independente de célula T para um antígeno dependente de célula T. Deste modo, a resposta imunológica contra o polissacarídeo capsular conjugado envolve células T auxiliares, que ajudam a induzir uma resposta imunológica mais potente e rápida mediante a reexposi- ção ao polissacarídeo capsular.

[005] Há pelo menos duas abordagens para o desenvolvimento de vacinas pneumocócicas conjugadas: a abordagem de veículo único e a abordagem de veículo misto. A imunogenicidade de diferentes conjuga- dos de polissacarídeos capsulares pode variar dependendo do serotipo pneumocócico e da proteína carreadora usados. Na abordagem de ve- ículo único, os polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos são conjugados com um único veículo de proteína. A série de vacinas PRE- VNAR da Pfizer é um exemplo de uma abordagem de veículo único, em que os diferentes polissacarídeos capsulares são conjugados ao veículo de proteína CRM197, uma variante não tóxica do toxoide da difteria que tem uma única substituição de aminoácido do ácido glutâmico por gli- cina. A vacina PREVNAR 7-valente (PREVNAR) foi aprovada pela pri- meira vez em 2000 e contém os polissacarídeos capsulares dos sete serotipos mais prevalentes: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. A vacina 13- valente, PREVNAR 13, adicionou os serotipos 1, 5, 7F, 3, 6A e 19A ao veículo de proteína CRM197. O veículo de proteína, CRM197, o único ve- ículo usado nas vacinas PREVNAR nunca foi usado como parte de um sistema de veículo misto em uma vacina pneumocócica conjugada.

[006] A segunda abordagem de vacina pneumocócica é a aborda- gem de veículo misto. Na abordagem de veículo misto, em vez de usar um único veículo de proteína, são usados dois ou mais veículos de pro- teína, com polissacarídeos capsulares de serotipos específicos conju- gados a um primeiro veículo de proteína e polissacarídeos capsulares de diferentes serotipos conjugados a pelo menos um segundo veículo de proteína diferente. Por exemplo, GlaxoSmithKline desenvolveu SYN- FLORIX, uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto 10-va- lente (serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que usa proteína D de influenza H, toxoide tetânico e toxoide da difteria como os veículos de proteína. Em SYNFLORIX, os serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F são conjugados à proteína D; o serotipo 18C é conjugado ao toxoide tetânico; e o serotipo 19F é conjugado ao toxoide da difteria [2]. O sero- tipo 3 foi removido do precursor 11-valente para SYNFLORIX, em parte, devido ao fato de que o mesmo não mostrou eficácia específica para serotipo em um teste de otite média aguda [1]. Outro grupo, Aventis Pasteur, desenvolveu uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto 11-valente (serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que usa o toxoide da difteria e o toxoide tetânico como veículos de pro- teínas [3]. Os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 9V, 14 e 18C podem provocar uma resposta melhor quando conjugados ao toxoide da difteria do que os mesmos provocam quando conjugados ao toxoide tetânico [6]. Assim, os serotipos 3, 6B, 14 e 18C foram conjugados à toxina da difteria, e os serotipos 1, 4, 5, 7F, 9V, 19F e 23F foram conju-

gados ao toxoide tetânico. O desenvolvimento desta vacina pneumocó- cica de veículo misto foi encerrado devido, em parte, a razões técnicas e ao potencial de uma resposta reduzida quando administrada com va- cinas acelulares contra coqueluche [3]. Recentemente, foi relatado que os serotipos 5 assim como 1 têm um dos títulos de OPA mais baixos observados em todos os serotipos de PREVNAR 13, em que houve uma correlação associada entre o título de IgG e a atividade de OPA [4]. Também foi sugerido que, para o serotipo 3, seria necessária uma con- centração de IgG sérica muito maior para proteção [5].

SUMÁRIO

[007] Este pedido fornece composições novas e melhoradas de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e vacinas que compreendem as mesmas. Em um aspecto, este pedido fornece uma composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto que compreende 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são selecionados dentre 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o car- reado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que dois dos polis- sacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissa- carídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM197, e em que os dois polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5.

[008] Em algumas modalidades da composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsula- res dos serotipos 1 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polis- sacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A,

11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197.

[009] Em outra modalidade da composição de conjugado pneumo- cócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 3 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197.

[010] Em outra modalidade da composição de conjugado pneumo- cócico 21-valente de veículo misto, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197.

[011] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto compreende ainda um ad- juvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, incluindo, porém sem limitação, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

[012] Outro aspecto é direcionado ao uso da composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto como uma vacina.

[013] Ainda outro aspecto é direcionado a uma vacina que com- preende a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veí- culo misto e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[014] Ainda outro aspecto é direcionado a um método para profila- xia da infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae em um indi- víduo, tal como um ser humano, sendo que o método compreende ad- ministrar uma quantidade profilaticamente eficaz das composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto ou uma vacina que compreende as mesmas ao indivíduo.

[015] Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano que tem pelo menos 50 anos de idade, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD).

[016] Em outras modalidades, o indivíduo é um ser humano que tem pelo menos 6 semanas de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM). Em algumas modalidades, o indivíduo humano tem 6 semanas a 5 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo humano tem 2 a 15 meses de idade ou 6 a 17 anos de idade.

[017] Em certas modalidades, a composição de conjugado pneu- mocócico 21-valente de veículo misto ou vacina é administrada por in- jeção intramuscular. Em certas modalidades, a composição de conju- gado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina é adminis- trada como parte de uma série de imunizações.

[018] Ainda outro aspecto é direcionado a um conjugado imunogê- nico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N que contém: um sacarí- deo capsular de serotipo 9N de Streptococcus pneumoniae; e uma pro- teína carreadora ligada ao sacarídeo capsular, em que a proteína car- readora é CRM197. Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, as composições de conjugado pneumocócico multiva- lentes de veículo misto e as vacinas (e métodos/usos das mesmas), o sacarídeo de serotipo 9N pode ser ligado a CRM197 para formar um con- jugado em um estado em que é ativado para ter um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5 a 10 e um peso molecular de 200 a 700 kDa. Em certas modalidades do conjugado imunogênico de serotipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), o conjugado imunogênico de serotipo 9N pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa.

[019] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de sero- tipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de ve- ículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), a razão entre o sacarídeo capsular de serotipo 9N e a proteína carreadora no conjugado imunogênico de serotipo 9N é 0,1 a 5 (p/p). Em certas modalidades, a razão é 0,5 a 2,5.

[020] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de sero- tipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de ve- ículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), 15 a 60% do con- jugado imunogênico de serotipo 9N pode ter uma K d de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B.

[021] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de sero- tipo 9N, a composição de conjugado pneumocócico multivalente de ve- ículo mistos e vacinas (e métodos/usos das mesmas), o conjugado imu- nogênico de serotipo 9N foi preparado com um polissacarídeo de sero- tipo 9N que foi ativado para alcançar um grau de oxidação de 2 a 19. Em certas modalidades, o conjugado imunogênico de serotipo 9N foi preparado com um polissacarídeo de serotipo 9N que foi ativado para alcançar um grau de oxidação de 5 a 10.

[022] Em certas modalidades do conjugado imunogênico de sero- tipo 9N, as composições de conjugado pneumocócico multivalentes de veículo misto e vacinas (e métodos/usos das mesmas), quando o saca- rídeo de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N é conjugado ao CRM 197 adicionando-se 0,02 a 0,19 μg de periodato por 1 μg de açúcar, o conjugado pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa, uma distri- buição de peso molecular de 15 a 60% (Kd ≤ 0,3) e uma razão entre sacarídeo/proteína de 0,5 a 2,5.

[023] Em ainda outro aspecto, a presente divulgação também for- nece um método para preparar um conjugado imunogênico de Strepto- coccus pneumoniae serotipo 9N, sendo que o método compreende: (a) lisar uma célula bacteriana que produz polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N fermentando o mesmo; (b) purificar o sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae sero- tipo 9N da célula lisada;

(c) ativar o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae sero- tipo 9N reagindo com um agente oxidante para alcançar um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5 a 10; e (d) formar um conjugado do sacarídeo capsular de Streptococcus pneu- moniae serotipo 9N ligado ao CRM197 misturando-se o sacarídeo ativado com CRM197.

[024] Em certas modalidades, o CRM197 misturado na etapa (d) pode ser reagido com um agente redutor para formar o conjugado com o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ativado. Em certas modalidades, na etapa (c), 0,02 a 0,19 μg de perio- dato pode ser reagido com 1 μg do polissacarídeo capsular de Strepto- coccus pneumoniae serotipo 9N a 20 a 25ºC por 15 a 20 horas.

[025] Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de Strep- tococcus pneumoniae serotipo 9N reagido com o agente oxidante na etapa (c) pode ter um peso molecular de 400 a 900 kDa. Em certas mo- dalidades, o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae se- rotipo 9N ativado misturado com o CRM197 na etapa (d) pode ter um peso molecular de 200 a 700 kDa. Em certas modalidades, o conjugado imunogênico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N pode ter um peso molecular de 500 a 4000 kDa. Em certas modalidades, uma taxa de entrada inicial entre o CRM197 e o sacarídeo capsular de serotipo 9N ativado (veículo CRM197: sacarídeo) pode ser 0,5 a 2,5:1. Em certas mo- dalidades, pelo menos 15 a 60% do conjugado imunogênico pode ter uma Kd de 0,3 ou menos conforme medido em uma coluna CL-4B.

[026] Em certas modalidades, quando o polissacarídeo de Strep- tococcus pneumoniae serotipo 9N da presente divulgação é conjugado ao CRM197 adicionando-se 0,02 a 0,19 μg de periodato por 1 μg de açú- car, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa, uma distribuição de peso molecular de 15 a 60% (K d ≤ 0,3) con-

forme medido em uma coluna CL-4B e uma razão entre CRM197/polis- sacarídeo de 0,5 a 2,5.

[027] Os anteriores e outros objetos, recursos e vantagens das composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir.

DEFINIÇÕES

[028] A fim de que a presente divulgação seja entendida mais fa- cilmente, certos termos são definidos primeiro abaixo. Outras definições para os termos a seguir e outros termos podem ser apresentadas atra- vés do relatório descritivo.

[029] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções em anexo, as formas singulares “uma”, “um”, “o” e “a” incluem re- ferências no plural a menos que o contexto claramente determine de outro modo. Assim, por exemplo, uma referência a “um método” inclui um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito no presente docu- mento e/ou que se tornará aparente àqueles versados na técnica medi- ante a leitura desta revelação e assim por diante.

[030] Administrar: Conforme usado neste documento, “adminis- trar” uma composição a um indivíduo significa dar, aplicar ou colocar a composição em contato com o indivíduo. A administração pode ser rea- lizada por qualquer uma dentre várias vias, tais como, por exemplo, tó- pica, oral, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intra- tecal e intradérmica.

[031] Aproximadamente: Conforme usado no presente docu- mento, o termo “aproximadamente” ou “cerca de”, conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, se refere a um valor que é similar a um valor de referência determinado. Em certas modalidades, o termo “aproximadamente” ou “cerca de” se refere a uma faixa de valores que está dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%,

11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qual- quer direção (maior ou menor) do valor de referência a não ser que de- terminado de outro modo ou evidente de outro modo a partir do contexto (exceto nos casos em que tal número possa exceder 100 % de um valor possível).

[032] Conjugado: Conforme usado no presente documento e en- tendido a partir do contexto apropriado, os termos “conjugado (ou con- jugados)” ou “glicoconjugado (glicoconjugados)” se referem a um polis- sacarídeo de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína car- readora usando qualquer estratégia de bioconjugação covalente ou não covalente.

[033] Grau de oxidação: Conforme usado no presente documento, o termo “grau de oxidação” (DO) se refere ao número de unidades de repetição de açúcar por grupo aldeído gerado quando um sacarídeo pu- rificado ou dimensionado é ativado com um agente oxidante. O grau de oxidação de um sacarídeo pode ser determinado usando métodos de rotina conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica.

[034] Excipiente: Conforme usado no presente documento, o termo “excipiente” se refere a um agente não terapêutico que pode estar incluído em uma composição farmacêutica, por exemplo, para fornecer ou contribuir para uma consistência ou efeito estabilizante desejado.

[035] Veículo misto: Conforme usado no presente documento, uma composição de conjugado pneumocócico de veículo misto se re- fere a uma composição de conjugado pneumocócico que tem mais do que um tipo de veículo de proteína.

[036] Composição de conjugado pneumocócico 21-valente de ve- ículo misto: Conforme usado no presente documento, o termo “compo- sição (ou composições) de conjugado pneumocócico 21-valente de ve- ículo misto” se refere a uma composição que compreende ou consiste em 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um po- lissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneu- moniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que dois dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM197, e em que os dois polissacarídeos capsulares que são conjuga- dos ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5. Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos restantes são conjugados ao CRM197. Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 3 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos restantes são conjugados ao CRM197. Em ou- tra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restan- tes são conjugados ao CRM197.

[037] Peso molecular: A menos que especificado de outra forma, conforme usado no presente documento, o termo "peso molecular" de um sacarídeo capsular ou um conjugado de sacarídeo capsular-prote- ína carreadora se refere ao peso molecular médio calculado por croma- tografia de exclusão de tamanho (SEC) em combinação com dispersão de luz laser em múltiplos ângulos (MALLS).

[038] Multivalente: Conforme usado no presente documento, o termo "multivalente" se refere a uma composição de conjugado pneu- mocócico que tem polissacarídeos capsulares pneumocócicos de mais do que um serotipo de Streptococcus pneumoniae.

[039] Excipiente farmaceuticamente aceitável: Os excipientes far- maceuticamente aceitáveis úteis nesta divulgação são convencionais. Remingtons Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publis- hing Co., Easton, PA, 15ª Edição (1975), descreve composições e for- mulações adequadas para entrega farmacêutica de uma ou mais com- posições terapêuticas, incluindo vacinas, e agentes farmacêuticos adi- cionais. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem, por exemplo, amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e similares. Em geral, a natureza do excipiente dependerá do modo par- ticular de administração sendo empregado. Por exemplo, as formula- ções parenterais usualmente compreendem fluidos injetáveis que in- cluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis, tais como água, solução salina fisiológica, soluções de sal equilibradas, tampões, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composi- ções sólidas (por exemplo, formas de pó, pílula, tablete ou cápsula), os excipientes sólidos não tóxicos convencionais incluem, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magné- sio. Adicionalmente a veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter pequenas quanti- dades de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umec- tantes ou emulsificantes, um agente ativo de superfície, conservantes e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

[040] Quantidade Profilaticamente Eficaz: Conforme definido no presente documento, o termo “uma quantidade profilaticamente eficaz” ou “uma dose profilaticamente eficaz” se refere à quantidade ou dose necessária para induzir uma resposta imunológica suficiente para atra-

sar o início e/ou reduzir em frequência e/ou gravidade um ou mais sin- tomas causados por uma infecção por Streptococcus pneumoniae.

[041] Profilaxia: O termo “profilaxia”, conforme usado no presente documento, se refere a evitar a manifestação da doença, um atraso no início, e/ou redução na frequência e/ou gravidade de um ou mais sinto- mas de uma doença, distúrbio ou afecção particular (por exemplo, in- fecção por Streptococcus pneumoniae). Em algumas modalidades, a profilaxia é avaliada em uma base populacional de modo que um agente seja considerado para fornecer profilaxia contra uma doença, distúrbio ou afecção particular se uma diminuição estatisticamente significativa no desenvolvimento, frequência e/ou intensidade de um ou mais sinto- mas da doença, distúrbio ou afecção for observada em uma população suscetível à doença, distúrbio ou afecção.

[042] Indivíduo: Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” significa qualquer mamífero, incluindo camundongos, coe- lhos e seres humanos. Em certas modalidades, o indivíduo é um adulto, um adolescente ou um bebê. Em algumas modalidades, os termos “in- divíduo” ou “paciente” são usados e se destinam a ser intercambiáveis com “indivíduo”.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[043] A descrição a seguir é da modalidade (ou modalidades) di- vulgada e dos Exemplos é apenas exemplificativa na natureza e não se destina de forma alguma a limitar a invenção, sua aplicação ou usos.

[044] Este pedido fornece composições novas e melhoradas de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto e vacinas que compreendem as mesmas. Embora o veículo de proteína, CRM197, te- nha sido usado anteriormente em vacinas pneumocócicas conjugadas de veículo único, este pedido descreve o uso do CRM197 em uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto. Em particular, este pedido descreve o uso combinado de CRM197 e toxoide tetânico como proteínas carreadoras para serotipos pneumocócicos específicos em composi- ções e vacinas pneumocócicas conjugadas multivalentes.

[045] Conforme discutido acima, a imunogenicidade de diferentes conjugados de polissacarídeos capsulares pode variar dependendo do serotipo pneumocócico e da proteína carreadora usados. Este pedido descreve a conjugação bem-sucedida do serotipo 3 ao toxoide tetânico como parte de uma vacina de veículo misto, apesar dos ensinamentos anteriores de que o serotipo 3 era mais imunogênico quando conjugado ao toxoide da difteria em vez do toxoide tetânico [6]. O mesmo também descreve a conjugação bem-sucedida dos serotipos 1 e 5 ao toxoide tetânico como parte de uma vacina de veículo misto. O mesmo também divulga a constatação inesperada de que a resposta de anticorpo ao serotipo 3 conjugado ao toxoide tetânico em uma composição de conju- gado pneumocócico multivalente, por exemplo, 21-valente de veículo misto era cerca de 4 a 5 vezes maior do que quando o serotipo 3 foi conjugado ao CRM197 em uma composição de conjugado pneumocócico 13-valente de veículo único (PREVNAR 13).

[046] Ademais, a constatação inesperada não se limitou ao sero- tipo 3, mas também foi observada para outros serotipos conjugados ao toxoide tetânico em uma composição de conjugado pneumocócico mul- tivalente de veículo misto. Conforme mostrado nos Exemplos, a conju- gação dos serotipos 1 e 5 ou 3 e 5 ao toxoide tetânico em uma compo- sição de conjugado pneumocócico de veículo misto com os serotipos restantes conjugados ao CRM197 (por exemplo, PCV21(1/5)-TT e PCV21(3/5)-TT) induziu consistentemente respostas de anticorpo signi- ficativamente aprimoradas aos serotipos conjugados ao toxoide tetânico em comparação às respostas de anticorpo (resposta de IgG ou títulos MOPA) contra os mesmos serotipos conjugados ao CRM197 em uma composição de conjugado pneumocócico de veículo único (PREVNAR 13).

[047] As composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto descritas neste pedido também incluem serotipos pneu- mocócicos não atualmente cobertos pelas três vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis no mercado global: PREVNAR (cha- mada Prevenar em alguns países), SYNFLORIX e PREVNAR 13. As doenças causadas por serotipos pneumocócicos não atualmente cober- tos estão aumentando, devido, em parte, ao desenvolvimento de resis- tência antibacteriana, ao número aumentado de pacientes imunocom- prometidos e à falta de pressão imunológica. Por exemplo, nenhuma das vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis inclui o serotipo 9N. Adicionalmente, nenhuma das vacinas pneumocócicas conjugadas atualmente disponíveis inclui os serotipos 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F. A presente divulgação demonstra a implementação bem-sucedida dos serotipos 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F em um veículo misto (toxoide tetânico e CRM197), vacina pneumocócica conjugada, assim como respostas de anticorpos induzidas pelo serotipo 9N que foram cerca de 40 a 50 vezes maiores do que PREVNAR13. SEROTIPO 9N DE POLISSACARÍDEO PNEUMOCÓCICO

[048] O polissacarídeo de serotipo 9N pode ser obtido diretamente das bactérias usando um procedimento de isolamento conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica (incluindo, porém sem limita- ção, os métodos divulgados na Publicação de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380). Adicionalmente, o sacarídeo pode ser produzido usando protocolos sintéticos.

[049] A cepa de Streptococcus pneumoniae de serotipo 9N pode ser obtida a partir de coleções de culturas estabelecidas (por exemplo, o Laboratório de Referência Estreptocócica dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Atlanta, Geórgia)) ou amostras clínicas.

[050] A célula bacteriana é tipicamente cultivada em um meio, tal como um meio à base de soja. Após fermentação da célula bacteriana que produz o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae se- rotipo 9N, a célula bacteriana é lisada para produzir um lisado celular. Então, o polissacarídeo de serotipo 9N pode ser isolado do lisado celular usando técnicas de purificação conhecidas na arte, incluindo centrifuga- ção, filtração profunda, precipitação, ultrafiltração, tratamento com car- vão ativado, diafiltração e/ou cromatografia em coluna (incluindo, porém sem limitação, os métodos divulgados na Publicação de Pedido de Pa- tente nº U.S. 2006/0228380). O polissacarídeo capsular de serotipo 9N purificado pode ser usado para a preparação de um conjugado imuno- gênico. O polissacarídeo capsular de serotipo 9N obtido pela purificação do polissacarídeo de serotipo 9N do lisado de Streptococcus pneumo- niae e, opcionalmente, pelo dimensionamento do polissacarídeo purifi- cado pode ser caracterizado por diferentes parâmetros, incluindo, por exemplo, o peso molecular (PM) do polissacarídeo capsular de serotipo 9N.

[051] Em certas modalidades, o polissacarídeo purificado que é purificado a partir do serotipo 9N de Streptococcus pneumoniae antes da conjugação tem um peso molecular de 5 a 5000 kDa. Em certas mo- dalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N antes da conjuga- ção tem um peso molecular de 50 a 1000 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo capsular de serotipo 9N antes da conjugação tem um peso molecular de 70 a 900 kDa. Em certas modalidades, o polissaca- rídeo capsular de serotipo 9N antes da conjugação tem um peso mole- cular de 100 a 800 kDa. Em certas modalidades, o polissacarídeo cap- sular de serotipo 9N purificado pode ser ativado antes da conjugação para ter um peso molecular de 50 a 800 kDa, 80 a 780 kDa, 100 a 770 kDa, 120 a 760 kDa, 140 a 750 kDa, 150 a 740 kDa, 160 a 730 kDa, 170 a 735 kDa, 180 a 720 kDa, 190 a 710 kDa, 200 a 700 kDa, 220 a 690 kDa, 240 a 680 kDa, 260 a 670 kDa, 270 a 660 kDa ou faixas de peso molecular similares. Qualquer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é contemplado como uma modalidade da presente di- vulgação.

[052] O polissacarídeo de serotipo 9N ativado pode ser caracteri- zado por um grau de oxidação e peso molecular. Em certas modalida- des, o polissacarídeo de serotipo 9N ativado pode ter um grau de oxi- dação de 0,5 a 25, 0,6 a 23, 0,8 a 21, 1 a 20,8, 1,1 a 20,5, 1,2 a 20,3, 1,3 a 20, 1,4 a 19,5, 1,5 a 19,3, 1,6 a 19,2, 1,7 a 19,1, 2 a 19, 3 a 18, 4 a 15 ou 5 a 10.

[053] O polissacarídeo pode se tornar ligeiramente reduzido em tamanho durante um procedimento de purificação normal. Adicional- mente, conforme descrito na presente divulgação, o polissacarídeo pode ser submetido ao dimensionamento antes da conjugação. A faixa de peso molecular mencionada acima se refere à esta do polissacarídeo purificado após a etapa de dimensionamento final (por exemplo, após a purificação, hidrólise e ativação) antes da conjugação. COMPOSIÇÕES DE CONJUGADO PNEUMOCÓCICO MULTIVALEN- TES DE VEÍCULO MISTO E MÉTODOS PARA PRODUZIR AS MES-

MAS

[054] Esta divulgação fornece uma composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto que compreende ou con- siste em 21 conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneumocó- cicos diferente, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-pro- teína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o carreado de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, em que dois dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são con- jugados ao CRM197, e em que os dois polissacarídeos capsulares que são conjugados ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5.

[055] Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissaca- rídeos capsulares dos serotipos restantes são conjugados ao CRM197. Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 3 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM197. Em outra modalidade, os polissa- carídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 são conjugados ao toxoide te- tânico, e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados ao CRM197.

[056] Em uma vacina de conjugado de polissacarídeo-proteína, uma proteína carreadora é conjugada a um antígeno de polissacarídeo primariamente para ajudar a melhorar a resposta imunológica (por exemplo, resposta de anticorpo) ao antígeno de polissacarídeo. As pro- teínas carreadoras são, de preferência, proteínas que são não tóxicas. As proteínas carreadoras devem ser passíveis de conjugação a um po- lissacarídeo pneumocócico usando procedimentos de conjugação pa- drão, conforme discutido em mais detalhes abaixo. As proteínas carre- adoras usadas nas composições de conjugado pneumocócico 21-valen- tes de veículo misto são toxoide tetânico (TT) e CRM197, cada uma das quais foi usada no projeto de vacinas pneumocócicas conjugadas, mas nunca na mesma vacina de veículo misto.

[057] CRM197 é uma variante não tóxica (isto é, toxoide) da toxina da difteria que retém as propriedades imunológicas da toxina da difteria do tipo selvagem. CRM197 se difere da toxina da difteria do tipo selva- gem em uma única base no gene estrutural, que dá origem a uma única substituição de aminoácido do ácido glutâmico por glicina. CRM197 é ti- picamente isolado de culturas de cepa C7 de Corynebacterium diphthe- ria (β197) cultivada em casaminoácidos e meio à base de extrato de levedura. CRM197 pode ser purificado através de ultrafiltração, precipita- ção com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Alternativa- mente, CRM197 pode ser preparado de forma recombinante de acordo com a Patente nº U.S. 5.614.382, que é incorporada ao presente docu- mento a título de referência em sua totalidade. CRM197 foi usado no pro- jeto de vacinas pneumocócicas conjugadas, mas nunca como parte de uma vacina de veículo misto.

[058] O toxoide tetânico é preparado e usado em todo o mundo para imunização em grande escala contra tétano (ou trismo) causado por Clostridium tetani. O toxoide tetânico também é usado tanto isola- damente quanto em combinação com vacinas contra difteria e/ou co- queluche. A proteína original, a toxina tetânica, é geralmente obtida em culturas de Clostridium tetani. A toxina tetânica é uma proteína de cerca de 150 kDa e consiste em duas subunidades (cerca de 100 kDa e cerca de 50 kDa) ligadas por uma ligação de dissulfeto. A toxina é tipicamente desintoxicada com formaldeído e pode ser purificada a partir de filtrados de cultura usando métodos conhecidos, tais como precipitação com sul- fato de amônio (consultar, por exemplo, [7], [8]) ou técnicas de croma- tografia, conforme divulgado, por exemplo, no documento nº WO 1996/025425. A toxina tetânica também pode ser inativada por meios genéticos recombinantes.

[059] O toxoide tetânico também foi usado como uma proteína car- readora em outras vacinas, incluindo vacinas pneumocócicas conjuga- das. Porém, o uso da toxina tetânica em uma vacina pneumocócica con- jugada de veículo misto em combinação com CRM197 é novo. A técnica também se afasta da conjugação do serotipo 3 ao toxoide tetânico em uma vacina pneumocócica conjugada de veículo misto devido ao fato de que o serotipo 3 mostrou ser mais imunogênico quando conjugado ao toxoide da difteria em comparação com o toxoide tetânico [6].

[060] Os polissacarídeos capsulares pneumocócicos usados nas composições e vacinas descritas no presente documento, incluindo os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C , 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, podem ser preparados a partir de Streptococcus pneumoniae usando qualquer téc- nica disponível, incluindo técnicas padrão conhecidas por uma pessoa de habilidade comum na técnica, incluindo, por exemplo, aquelas divul- gadas nos documentos nº WO 2006/110381, WO 2008/118752, WO 2006/110352 e nas Publicações de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380, 2006/0228381, 2007/0184071, 2007/0184072, 2007/0231340, 2008/0102498 e 2008/0286838, todos os quais estão in- corporados a título de referência em suas totalidades. Por exemplo, cada serotipo de polissacarídeo capsular pneumocócico pode ser culti- vado em meio de cultura (por exemplo, um meio à base de soja). As células são lisadas, e polissacarídeos individuais podem ser purificados a partir do lisado através de centrifugação, precipitação, ultrafiltração e/ou cromatografia em coluna. Adicionalmente, o polissacarídeo capsu- lar pneumocócico pode ser produzido usando protocolos sintéticos.

[061] Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumo- niae compreendem unidades de oligossacarídeo de repetição que po- dem conter até 8 resíduos de açúcar. Um antígeno de sacarídeo capsu- lar pode ser um polissacarídeo de comprimento total ou pode ter tama- nho reduzido (por exemplo, uma única unidade de oligossacarídeo ou uma cadeia de sacarídeo de comprimento mais curto do que o nativo de unidades de oligossacarídeos de repetição). O tamanho dos polissaca- rídeos capsulares pode ser reduzido por vários métodos conhecidos na técnica, tais como tratamento de hidrólise ácida, tratamento com peró- xido de hidrogênio, dimensionamento por um homogeneizador de alta pressão, opcionalmente seguido por um tratamento com peróxido de hi- drogênio para gerar fragmentos de oligossacarídeos ou microfluidiza- ção.

[062] O conjugado pneumocócico de cada um dos serotipos pode ser preparado conjugando-se um polissacarídeo capsular de cada sero- tipo a uma proteína carreadora. Os diferentes conjugados pneumocóci- cos podem ser formulados em uma composição, incluindo uma formu- lação de dosagem única.

[063] Para preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína, os polissacarídeos capsulares preparados a partir de cada serotipo pneu- mocócico podem ser quimicamente ativados de modo que os polissaca- rídeos capsulares possam reagir com uma proteína carreadora. Uma vez ativado, cada polissacarídeo capsular pode ser conjugado separa- damente a uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. A ativação química dos polissacarídeos e a conjugação subsequente à proteína carreadora podem ser alcançadas por métodos convencionais.

[064] Por exemplo, os grupos hidroxila vicinais na extremidade dos polissacarídeos capsulares podem ser oxidados a grupos aldeído por agentes oxidantes, tais como periodatos (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico), conforme divulgado, por exemplo, nas Patentes nº U.S. 4.365.170, 4.673.574 e 4.902.506, que estão incorporadas ao presente documento a título de referência em suas totalidades. O periodato oxida aleatoriamente o grupo hidroxila vi- cinal de um carboidrato para formar um grupo aldeído reativo e causa a clivagem de uma ligação de C-C. O termo “periodato” inclui tanto perio- dato quanto ácido periódico. Este termo também inclui tanto metaperio- dato (IO4-) quanto ortoperiodato (IO65-). O termo “periodato” também in- clui vários sais de periodato incluindo periodato de sódio e periodato de potássio. Em certas modalidades, o polissacarídeo pode ser oxidado na presença de metaperiodato de sódio.

[065] Em certas modalidades, o periodato pode ser usado em uma quantidade de cerca de 0,03 a 0,17 µg por 1 µg de polissacarídeo. Em certas modalidades, o periodato pode ser usado em uma quantidade de cerca de 0,025 a 0,18 μg ou cerca de 0,02 a 0,19 μg por 1 μg de polis- sacarídeo. O sacarídeo pode ser ativado conforme desejado dentro da faixa acima. Fora da faixa, o efeito pode ser insatisfatório.

[066] Os polissacarídeos também podem ser ativados com tetra- fluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O polissacarídeo ativado é, então, acoplado direta- mente ou por meio de um grupo espaçador ou ligante a um grupo amino na proteína carreadora.

[067] Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cistea- mina para gerar um polissacarídeo tiolado que poderia ser acoplado ao veículo por meio de uma ligação de tioéter obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, usando éster de N-[i-maleimidobutirlóxi]succinimida (GMBS)) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo, usando iodoacetimida, bromoa- cetato de N-succinimidila (SBA; SIB), N-succinimidil(4-iodoacetil)amino- benzoato (SIAB), sulfossuccinimidil(4-iodoacetil)aminobenzoato (sulfo- SIAB), iodoacetato de N-succinimidila (SIA) ou 3-[bromoacetamido]pro- prionato de succinimidila (SBAP)). De preferência, o éster cianato (op- cionalmente produzido pela química de COAP) é acoplado à hexano diamina ou di-hidrazida do ácido adípico (AOH), e o sacarídeo derivado de amino é conjugado à proteína carreadora usando a química de car- bodi-imida (por exemplo, EDAC ou EDC) por meio de um grupo carbo- xila no veículo de proteína. Tais conjugados são descritos, por exemplo, nos documentos nº WO 93/15760, WO 95/08348 e WO 96/129094, to- dos os quais estão incorporados ao presente documento a título de re- ferência em suas totalidades.

[068] A conjugação dos polissacarídeos capsulares ativados e das proteínas carreadoras pode ser alcançada, por exemplo, por aminação redutora, conforme descrito, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente nº U.S. 2006/0228380, 2007/0231340, 2007/0184071 e

2007/0184072, WO 2006/110381, WO 2008/079653 e WO 2008/143709, todos os quais estão incorporados ao presente docu- mento a título de referência em suas totalidades. Por exemplo, os polis- sacarídeos capsulares ativados e a proteína carreadora podem ser rea- gidos com um agente redutor para formar um conjugado. Os agentes redutores que são adequados incluem boroidretos, tais como cianobo- roidreto de sódio, borano-piridina, triacetoxiboroidreto de sódio, sódio ou boroidreto ou resina de troca de boroidreto. No final da reação de redução, pode haver grupos aldeído não reagidos restantes nos conju- gados. Os grupos aldeído não reagidos podem ser submetidos a cape- amento usando um agente de capeamento adequado, tal como boroi- dreto de sódio (NaBH4). Em uma modalidade, a reação de redução é executada em solvente aquoso. Em outra modalidade, a reação é exe- cutada um solvente aprótico. Em uma modalidade, a reação de redução é executada em DMSO (dimetilsulfóxido) ou em solvente de DMF (di- metilformamida). Outros agentes redutores possíveis incluem, porém sem limitação, amina-boranos, tais como piridina-borano, 2-picolina-bo- rano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMeiPrN-BH3, benzilamina-BH3 ou 5-etil-2-metilpiridina-borano (PEMB).

[069] Os polissacarídeos capsulares ativados podem ser conjuga- dos diretamente à proteína carreadora ou indiretamente através do uso de um espaçador ou ligante, tal como um ligante bifuncional. O ligante é opcionalmente heterobifuncional ou homobifuncional, que tem, por exemplo, um grupo amino reativo e um grupo ácido carboxílico reativo, 2 grupos amino reativos ou dois grupos ácido carboxílico reativos.

[070] Outras técnicas adequadas para conjugação usam carbodi- imidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N- hidroxissuccinimida, S--NHS, EDC, TSTU, conforme descrito, por exem- plo, na Publicação de Pedido de Patente Internacional nº WO 98/42721,

que está incorporada a título de referência em sua totalidade. A conju- gação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com 1,1'-carbonildi-imi- dazol (CDl) (consultar Bethell et al. (1979) J. Biol. Chem. 254:2572- 2574; Hearn et al. (1981) J. Chromatogr. 218:509-518) seguido pela re- ação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução da terminação anomérica para um grupo hi- droxila primário, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila pri- mário, reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um in- termediário de carbamato de CDI e acoplamento do intermediário de carbamato de CDI a um grupo amino em uma proteína.

[071] A razão entre polissacarídeo e proteína carreadora para va- cinas pneumocócicas conjugadas está tipicamente na faixa de 0,3 a 3,0 (p/p), mas pode variar com o serotipo. A razão pode ser determinada pela medição independente das quantidades de proteína e polissacarí- deo presentes ou por métodos que fornecem uma medida direta da ra- zão conhecidos na técnica. Métodos incluindo espectroscopia de RMN de 1H ou SEC-HPLC-UV/RI com monitorização dupla (por exemplo, ín- dice de refracção e UV, para material total e teor de proteína, respecti- vamente) podem perfilar a razão entre sacarídeo/proteína através da distribuição de tamanho dos conjugados, assim como por SEC-HPLC- MALLS ou MALDI-TOF-MS.

[072] Os conjugados de polissacarídeo-proteína assim obtidos po- dem ser purificados e enriquecidos por uma variedade de métodos. Es- tes métodos incluem concentração/diafiltração, cromatografia em co- luna e filtração profunda. Os conjugados de polissacarídeo-proteína pu- rificados são combinados para formular uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto, que pode ser usada como uma vacina.

[073] A formulação de uma composição de vacina pode ser reali- zada usando métodos reconhecidos na técnica. Uma composição de vacina é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Os conjugados de polissacarídeo capsular-proteína pneu- mocócicos individuais podem ser formulados em conjunto com um veí- culo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Os exem- plos de tais veículos incluem, porém sem limitação, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenogli- col líquido) e soluções de dextrose.

[074] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto compreende ainda um adju- vante. Conforme usado no presente documento, um “adjuvante” se re- fere a uma substância ou veículo que melhora não especificamente a resposta imunológica a um antígeno. Os adjuvantes podem incluir uma suspensão de minerais (alume, sais de alumínio, tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, hidroxi fosfato sulfato de alumínio, etc.) nos quais o antígeno é adsorvido; ou emulsão de água em óleo em que a solução de antígeno é emulsificada em óleo mineral (por exemplo, adjuvante incompleto de Freund), às vezes com a inclu- são de micobactérias mortas (adjuvante completo de Freund) para me- lhorar adicionalmente a antigenicidade. Os oligonucleotídeos imunoes- timuladores (tais como aqueles que incluem um motivo CpG) também podem ser usados como adjuvantes (por exemplo, consultar as Paten- tes nº U.S. 6.194.388; 6.207.646; 6.214.806; 6.218.371; 6.239.116;

6.339.068; 6.406.705; e 6.429.199). Os adjuvantes também incluem moléculas biológicas, tais como lipídios e moléculas coestimuladoras. Os exemplos de adjuvantes biológicos incluem AS04 [9], IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L e 41 BBL.

[075] Em algumas modalidades, o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio. Tipicamente, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,1 mg a 2,5 mg do adjuvante à base de alumínio. Em outras modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter entre 0,1 mg a 2 mg, 0,1 mg a 1 mg, 0,1 mg a 0,5 mg, 0,1 mg a 0,2 mg, 0,125 mg a 2,5 mg, 0,125 mg a 0,5 mg, 0,125 mg a 0,2 mg ou 0,125 a 0,25 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,125 mg a cerca de 0,250 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,125 mg do adjuvante à base de alumínio. Em certas modalidades, uma dose única de vacina de 0,5 ml é formulada para conter cerca de 0,250 mg do adjuvante à base de alu- mínio.

[076] Em modalidades particulares, o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

[077] Em modalidades particulares, o adjuvante é fosfato de alu- mínio.

[078] Em algumas modalidades, a composição é para uso como uma vacina contra uma infecção por Streptococcus pneumoniae.

CARACTERIZAÇÃO DE CONJUGADOS DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR-VEÍCULO DE PROTEÍNA PNEUMÁTICOS

[079] Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veí- culo de proteína pode ter um peso molecular de 100 a 10000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 200 a 9000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 300 a 8000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 400 a 7000 kDa. Em certas modalidades, o conjugado tem um peso molecular de 500 a 6000 kDa. Em certas modalidades, o con-

jugado tem um peso molecular de 600 a 5000 kDa. Em certas modali- dades, o conjugado tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa. Qual- quer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é contem- plado como uma modalidade da presente divulgação.

[080] Quando o peso molecular está dentro da faixa acima, o con- jugado pode ser formado de forma estável com alto rendimento. Tam- bém, a proporção de um polissacarídeo livre pode ser reduzida. Adicio- nalmente, uma imunogenicidade superior pode ser alcançada dentro da faixa de peso molecular acima.

[081] Após os conjugados individuais de polissacarídeo-proteína serem purificados, os mesmos são compostos para formular a compo- sição imunogênica da presente divulgação.

[082] Os conjugados de sacarídeo-proteína dos serotipos da pre- sente divulgação podem ser caracterizados por uma razão entre o po- lissacarídeo e o veículo de proteína (quantidade de polissacarí- deo/quantidade de veículo de proteína, p/p).

[083] Em certas modalidades, a razão (p/p) entre o polissacarídeo e o veículo de proteína no conjugado de polissacarídeo-veículo de pro- teína para cada serotipo é 0,5 a 2,5, 0,4 a 2,3, 0,3 a 2,1, 0,24 a 2, 0,2 a 1,8, 0,18 a 1,6, 0,16 a 1,4, 0,14 a 1,2, 0,12 a 1 ou 0,1 a 1 (por exemplo, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4 ou cerca de 2,5).

[084] Quando a razão entre o polissacarídeo e o veículo de prote- ína está dentro da faixa acima, o conjugado pode ser formado de forma estável com alto rendimento. Também, a proporção de um polissacarí- deo livre pode ser reduzida. Adicionalmente, uma imunogenicidade su- perior pode ser alcançada, e o conjugado pode ser mantido de forma estável sem interferência de outros serotipos dentro da faixa acima.

[085] Os conjugados e composições imunogênicas da presente di- vulgação podem conter um polissacarídeo livre que não é covalente- mente conjugado ao veículo de proteína, mas está, no entanto, presente na composição de conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína. O polissacarídeo livre pode estar associado não covalentemente ao con- jugado de polissacarídeo-veículo de proteína (isto é, ligado não cova- lentemente, adsorvido ou aprisionado no ou pelo conjugado de polissa- carídeo-veículo de proteína).

[086] Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veí- culo de proteína contém menos do que cerca de 60%, cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veí- culo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 60% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o con- jugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 50% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 40% de um polissaca- rídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissaca- rídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polis- sacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 30% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modali- dades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada se- rotipo contém menos do que cerca de 25% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-

veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 20% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quanti- dade total do polissacarídeo de cada serotipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 15% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada sero- tipo. Em certas modalidades, o conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo contém menos do que cerca de 10% de um polissacarídeo livre de cada serotipo com base na quantidade total do polissacarídeo de cada serotipo.

[087] O conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode também ser caracterizado pela sua distribuição de tama- nho molecular (Kd). Um meio de cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B; microesferas de agarose reticuladas, 4%) pode ser usado para determinar a distribuição relativa de tamanho molecular do conjugado. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) é usada em uma coluna alimentada por gravidade para perfilar a distribuição de tamanho mole- cular do conjugado. As grandes moléculas excluídas dos poros no meio são eluídas mais rapidamente do que as pequenas moléculas. Um co- letor de frações é usado para coletar o eluato da coluna. As frações são testadas colorimetricamente por ensaio de sacarídeo. Para a determi- nação de Kd, a coluna é calibrada para estabelecer a fração em que as moléculas são completamente excluídas (V0; Kd = 0) e a fração que re- presenta a retenção máxima (Vi; Kd = 1). A fração na qual um atributo de amostra especificado é atingido (Ve) está relacionada à Kd pela ex- pressão Kd = (Ve - V0)/(Vi - V0).

[088] Em certas modalidades, pelo menos 15% do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B.

[089] Em certas modalidades, pelo menos 20 % do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo me- nos 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% do conjugado de polissacarídeo-veículo de pro- teína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 60 % do conjugado de po- lissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo me- nos 50 a 80% do conjugado de polissacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 65 a 80% do conjugado de polis- sacarídeo-veículo de proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B. Em certas modalidades, pelo menos 15 a 60% do conjugado de sacarídeo-proteína de cada serotipo pode ter uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B.

MÉTODOS E USOS PROFILÁTICOS

[090] Em um aspecto, esta divulgação fornece uma vacina que compreende uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em al- gumas modalidades, o excipiente farmaceuticamente aceitável compre- ende pelo menos um tampão, tal como um tampão de succinato, um sal, tal como cloreto de sódio, e/ou um agente ativo de superfície, tal como um éster de polioxietileno sorbitano (por exemplo, polissorbato 80). Em algumas modalidades, dois polissacarídeos selecionado a partir do grupo que consiste em serotipos 1, 3 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares restantes dentre 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente).

[091] Em uma modalidade, os polissacarídeos capsulares dos se- rotipos 1 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21- valente).

[092] Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos se- rotipos 1 e 3 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21- valente).

[093] Em outra modalidade, os polissacarídeos capsulares dos se- rotipos 3 e 5 são conjugados ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21- valente).

[094] Em algumas modalidades, a vacina produz uma resposta imunológica protetora em um indivíduo humano contra a doença cau- sada pela infecção por Streptococcus pneumoniae.

[095] De acordo com um aspecto adicional, esta divulgação for- nece um método para profilaxia da infecção ou doença por Streptococ- cus pneumoniae, sendo que o método compreende administrar a um indivíduo humano uma quantidade profilaticamente eficaz de uma com- posição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou uma vacina que compreende a mesma. A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto ou vacina que compreende a mesma pode ser administrada por qualquer via, incluindo, por exem- plo, por uma via sistêmica ou mucosa, conforme descrito abaixo em mais detalhes.

[096] Em certas modalidades, o indivíduo humano é um indivíduo idoso, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica invasiva (IPD). Em certas modalidades, o indivíduo idoso tem pelo menos 50 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo idoso tem mais do que 55 anos de idade. Em ainda outra modalidade, o indivíduo idoso tem pelo menos 60 anos de idade.

[097] Em outras modalidades, o indivíduo humano é um bebê, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica invasiva (IPD) ou otite mé- dia aguda (AOM). Em certas modalidades, o bebê tem de 0 a 2 anos. Em outras modalidades, o bebê tem de 2 a 15 meses.

[098] Em ainda outra modalidade, o indivíduo humano tem 6 se- manas a 17 anos de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumo- cócica invasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM). Em certas modalida- des, o indivíduo humano tem 6 semanas a 5 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo humano tem 5 a 17 anos de idade.

[099] A quantidade de conjugado em cada dose de vacina ou a quantidade profilaticamente eficaz da composição de conjugado pneu- mocócico multivalente de veículo misto pode ser selecionada como uma quantidade que induz a profilaxia sem efeitos adversos significativos. Tal quantidade pode variar dependendo do serotipo pneumocócico. Ge- ralmente, cada dose pode incluir cerca de 0,1 µg a cerca de 100 µg de polissacarídeo, especificamente, cerca de 0,1 a 10 µg e, mais especifi- camente, cerca de 1 µg a cerca de 5 µg. As quantidades ideais de com- ponentes para uma vacina específica podem ser verificadas por estudos padrão envolvendo a observação de respostas imunológicas apropria- das nos indivíduos. Por exemplo, a quantidade para vacinação de um indivíduo humano pode ser determinada extrapolando-se um resultado de teste em animal. Adicionalmente, a dose pode ser determinada em- piricamente.

[0100] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 1 µg a cerca de 5 µg de cada polissacarídeo capsular; cerca de 1 μg a cerca de 30 μg de TT; cerca de 20 μg a cerca de 85 μg de CRM197; e opcionalmente cerca de

0,1 mg a cerca de 0,5 mg do adjuvante de alumínio elementar. Em al- gumas modalidades, a vacina ou a composição de conjugado pneumo- cócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 µg a cerca de 2,5 µg de cada polissa- carídeo capsular exceto o serotipo 6B e, opcionalmente, o serotipo 3, que está/estão presentes em uma quantidade de cerca de 4 μg a cerca de 5 μg; cerca de 2 μg a cerca de 25 μg de TT; cerca de 40 μg a cerca de 75 μg de CRM197; e opcionalmente cerca de 0,1 mg a cerca de 0,25 mg do adjuvante de alumínio elementar.

[0101] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2,2 μg de cada polissa- carídeo capsular exceto o serotipo 6B, que está presente em uma quan- tidade de cerca de 4,4 μg.

[0102] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 μg a cerca de 2,5 μg de cada capsular polissacarídeo exceto até seis polissacarídeos capsu- lares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F, cada um dos quais está presente em uma quan- tidade de cerca de 4 μg a cerca de 5 μg. Em uma modalidade, os até seis polissacarídeos capsulares, presentes em uma quantidade de cerca de 4 μg a cerca de 5 μg, são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F. Em outras modalida- des, a vacina ou a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2,2 μg de cada capsular polissacarídeo exceto até seis polissacarídeos capsulares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F, cada um dos quais está presente em uma quantidade de cerca de 4,4 μg. Em uma modalidade,

os até seis polissacarídeos capsulares, presentes em uma quantidade de cerca de 4,4 μg, são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F.

[0103] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 μg a cerca de 2,5 μg dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 μg a cerca de 5 μg dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F.

[0104] Em certas modalidades, a vacina ou a composição de conju- gado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 a cerca de 2,5 μg dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 a cerca de 5 μg dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 6B.

[0105] Em algumas modalidades, a vacina ou a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser uma dose única de 0,5 ml formulada para conter cerca de 2 a cerca de 2,5 μg dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 5, 6A, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F e cerca de 4 a cerca de 5 μg dos polissacarídeos capsulares do serotipo 6B e cerca de 8 a cerca de 9 μg dos polissacarídeos capsulares do serotipo 3 e, mais pre- ferencialmente, cerca de 8,8 μg dos polissacarídeos capsulares do se- rotipo 3.

[0106] Em certas modalidades, a composição do conjugado pneu- mocócico 21-valente de veículo misto ou vacina que compreende a mesma compreende ainda cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0107] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada em uma formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 1 e 3 é conjugado ao TT, e os polissaca- rídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente). Cada dose de 0,5 ml pode ser formulada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polissacarídeo capsular, exceto o serotipo 6B a cerca de 4,4 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de prote- ína carreadora TT (apenas para os serotipos 1 e 3) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 a 0,250 mg de alumínio elementar (cerca de 0,5 a cerca de 1,2 mg de fosfato de alumínio) como um adjuvante; e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0108] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada em uma formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 1 e 5 é conjugado ao TT, e os polissaca- rídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente). Em uma modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formu- lada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polissacarídeo capsular, exceto o serotipo 6B a cerca de 4,4 µg e o serotipo 3 a cerca de 2,2 a 8,8 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de proteína carreadora TT (apenas para os serotipos 1 e 5) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 a 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes. Em certas modalidades, o serotipo 3 está presente em cerca de 2,2 µg. Em outras modalidades, o serotipo 3 está presente em cerca de 4,4 µg. Em outras modalidades, o serotipo 3 está presente em cerca de 8,8 µg. Em ainda outra modalidade, cada dose de 0,5 ml dose pode ser formulada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polissacarídeo cap- sular, exceto até seis polissacarídeos capsulares selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 9V, 19A e 19F a cerca de 4,4 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de proteína carreadora TT (apenas para os serotipos 1 e 5) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 mg a 0,250 mg de adju- vante de alumínio elementar (0,5 mg a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes. Em uma modalidade, até seis polissacarídeos capsulares a cerca de 4,4 µg são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F. Em outra modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polis- sacarídeo capsular, exceto os serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F a cerca de 4,4 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de proteína carreadora TT (apenas para os serotipos 1 e 5) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 mg a 0,250 mg de adju- vante de alumínio elementar (0,5 mg a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes. Em outra modalidade, cada dose de 0,5 ml pode ser formulada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polissacarídeo capsular, ex- ceto os serotipos 3 e 4 a cerca de 4,4 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de proteína carreadora TT (apenas para os serotipos 1 e 5) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 mg a 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0109] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada em uma formulação líquida em que cada um dos polissacarídeos capsulares pneumocócicos dos serotipos 3 e 5 é conjugado ao TT, e os polissaca- rídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados ao CRM197 (21-valente). Cada dose de 0,5 ml pode ser formulada em um líquido contendo: cerca de 2,2 µg de cada polissacarídeo capsular, exceto 6B a cerca de 4,4 µg; cerca de 2 µg a cerca de 25 µg de proteína carreadora TT (apenas para os serotipos 3 e 5) e cerca de 40 µg a cerca de 75 µg de proteína carreadora CRM197; cerca de 0,125 a 0,250 mg de adjuvante de alumínio elementar (cerca de 0,5 a 1,2 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão de succinato de sódio como excipientes.

[0110] Em algumas modalidades, a formulação líquida pode ser car- regada em uma seringa de dose única sem um conservante. Após agi- tação, a formulação líquida se torna uma vacina que é uma suspensão branca homogênea pronta para administração intramuscular.

[0111] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada em uma única injeção ou como parte de uma série de imunizações. Por exemplo, a composição de con- jugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser adminis- trada 2, 3, 4 ou mais vezes em intervalos apropriadamente espaçados, tais como um intervalo de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto é administrada a um bebê 4 vezes nos primeiros 15 meses de nascimento, incluindo, por exemplo, em cerca de 2, 3, 4 e 12 a 15 meses de idade; em cerca de 3, 4, 5 e 12 a 15 meses de idade; ou em cerca de 2, 4, 6 e 12 a 15 meses de idade. Esta primeira dose pode ser administrada tão cedo quanto 6 semanas de idade. Em outra modalidade, a composição de conjugado pneumo- cócico 21-valente de veículo misto é administrada a um bebê 3 vezes nos primeiros 15 meses de nascimento, incluindo, por exemplo, em cerca de 2, 4 e 11 a 12 meses.

[0112] A composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto também pode incluir uma ou mais proteínas de Strepto- coccus pneumoniae. Os exemplos de proteínas de Streptococcus pneu- moniae adequadas para inclusão incluem aquelas identificadas no Pe- dido de Patente Internacional WO02/083855, assim como aquelas des- critas no Pedido de Patente Internacional WO02/053761.

[0113] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada a um indivíduo por uma ou mais vias de administração conhecidas por uma pessoa de habilidade comum na técnica, tal como uma via parenteral, transdérmica ou transmucosal, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intracutânea, intravenosa ou subcutânea, e pode ser formulada em conformidade. A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formu- lada para ser compatível com sua via de administração pretendida.

[0114] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser administrada como uma formulação líquida por injeção intramuscular, intraperitoneal, sub- cutânea, intravenosa, intra-arterial ou transdérmica ou injeção mucosal respiratória. As composições de conjugado pneumocócico 21-valentes de veículo misto podem ser formuladas em forma líquida ou em uma forma liofilizada. Em algumas composições, as composições injetáveis são preparadas em formas convencionais, como soluções ou suspen- sões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Em algumas modalida- des, soluções e suspensões de injeção são preparadas a partir de pós ou grânulos estéreis. Considerações gerais sobre a formulação e fabri- cação de agentes farmacêuticos para administração por estas vias po- dem ser encontradas, por exemplo, em Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19ª edição, Mack Publishing Co., Easton, PA., 1995; incorpo-

rado ao presente documento a título de referência. Atualmente, a asper- são oral ou nasal ou via de aerossol (por exemplo, por inalação) são as mais comumente usadas para entregar agentes terapêuticos direta- mente aos pulmões e sistema respiratório. Em algumas modalidades, uma composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto é administrada usando um dispositivo que entrega uma dosagem medida da composição. Os dispositivos adequados para uso na entrega de composições farmacêuticas intradérmicas descritas no presente do- cumento incluem dispositivos de agulha curta, tais como aqueles des- critos na Patente nº U.S. 4.886.499, Patente nº U.S. 5.190.521, Patente nº U.S. 5.328.483, Patente nº U.S. 5.527.288, Patente nº U.S.

4.270.537, Patente nº U.S. 5.015.235, Patente nº U.S. 5.141.496, Pa- tente nº U.S. 5.417.662 (todas as quais estão incorporadas ao presente documento a título de referência). As composições intradérmicas podem também ser administradas por dispositivos que limitam a extensão de penetração eficaz de uma agulha na pele, tais como aqueles descritos no documento nº WO1999/34850, incorporado ao presente documento a título de referência, e equivalentes funcionais dos mesmos. São tam- bém adequados dispositivos de injeção a jato que entregam vacinas lí- quidas à derme por meio de um injetor de jato líquido ou por meio de uma agulha que perfura o estrato córneo e produz um jato que atinge a derme. Os dispositivos de injeção a jato são descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 5.480.381, Patente nº U.S. 5.599.302, Patente nº U.S.

5.334.144, Patente nº U.S. 5.993.412, Patente nº U.S. 5.649.912, Pa- tente nº U.S. 5.569.189, Patente nº U.S. 5.704.911, Patente nº U.S.

5.383.851, Patente nº U.S. 5.893.397, Patente nº U.S. 5.466.220, Pa- tente nº U.S. 5.339.163, Patente nº U.S. 5.312.335, Patente nº U.S.

5.503.627, Patente nº U.S. 5.064.413, Patente nº U.S. 5.520.639, Pa- tente nº U.S. 4.596.556, Patente nº U.S. 4.790.824, Patente nº U.S.

4.941.880, Patente nº U.S. 4.940.460, WO1997/37705 e

WO1997/13537 (todos os quais estão incorporados ao presente docu- mento a título de referência). São também adequados dispositivos de entrega de pó/partícula balísticos que usam gás comprimido para ace- lerar a vacina em forma de pó através das camadas externas da pele até a derme. Adicionalmente, seringas convencionais podem ser usa- das no método clássico de Mantoux para administração intradérmica.

[0115] As preparações para administração parenteral incluem solu- ções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas estéreis. Os exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenogli- col, óleos, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Os exemplos de óleo incluem óleo vegetal ou ani- mal, óleo de amendoim, óleo de soja, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de fígado, óleo sintético, tal como óleo marinho, e lipídios obtidos a partir de leite ou ovos. Os veículos aquosos incluem água, suspen- sões, emulsões ou soluções alcoólicas/aquosas, incluindo solução sa- lina e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de sódio e dextrose, Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem repositores de fluido e nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como aqueles ba- seados em dextrose de Ringer) e similares. Os conservantes e outros aditivos podem estar também presentes, tais como, por exemplo, anti- microbianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e simila- res.

[0116] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser formulada na forma de um frasco de dose unitá- ria, frasco de dose múltipla ou seringa pré-carregada. Um veículo far- maceuticamente aceitável para uma formulação líquida inclui solvente, suspensão, emulsão ou óleo aquoso ou não aquoso. A composição pode ser isotônica, hipertônica ou hipotônica. No entanto, é desejável que a composição para infusão ou injeção seja basicamente isotônica.

Assim, isotonicidade ou hipertonicidade podem ser vantajosas para o armazenamento da composição. Quando a composição é hipertônica, a composição pode ser diluída para isotonicidade antes da administração. Um agente de tonicidade pode ser um agente de tonicidade iônico, tal como sal, ou um agente de tonicidade não iônico, tal como carboidrato. O agente de tonicidade iônica inclui, porém sem limitação, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de potássio e cloreto de magnésio. O agente de tonicidade não iônica inclui, porém sem limitação, sorbitol e glicerol. De preferência, pelo menos um tampão farmaceuticamente aceitável está incluído. Por exemplo, quando a composição é uma infu- são ou injeção, é preferencial que seja formulada em um tampão com uma capacidade de tamponamento a pH 4 a pH 10, tal como pH 5 a pH 9 ou pH 6 a pH 8. O tampão pode ser selecionado dentre aqueles ade- quados para a Farmacopeia dos Estados Unidos (USP). Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um ácido monobásico, tal como ácido acético, ácido benzoico, ácido glucô- nico, ácido glicérico e ácido láctico; um ácido dibásico, tal como ácido aconítico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido carbônico, ácido glutâ- mico, ácido málico, ácido succínico e ácido tartárico; um ácido polibá- sico, tal como ácido cítrico e ácido fosfórico; e uma base, tal como amô- nia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

[0117] A composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode compreender um agente ativo de superfície. Os exemplos do agente ativo de superfície incluem, porém sem limitação, éster de polioxietileno sorbitano (geralmente denominado Tweens), em particular, polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros (tais como DOWFAX) de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), óxido de butileno (BO); octoxinóis com diferentes repetições do grupo etóxi(óxi- 1,2-etanodi-ila), em particular, octoxinol-9 (Triton-100); etilfenoxipolieto- xietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípido, tal como lecitina; etoxilato de nonilfenol, tal como a série TERGITOL NP; éter graxo de polioxieti- leno derivado de álcool laurílico, cetílico, estearílico, oleílico (tensoativo Brij), em particular, éter trietilenoglicol monolaurílico (Brij 30); éter de sorbitano conhecido como SPAN, em particular, trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano.

[0118] Misturas de agentes ativos de superfície, tais como Tween 80/Span 85, podem ser usadas. Uma combinação de éster de polioxie- tileno sorbitano, tal como Tween 80, e octoxinol, tal como Triton X-100, é também adequada. Uma combinação de Laureth 9 e Tween e/ou o octoxinol também é vantajosa. De preferência, a quantidade de éster de polioxietileno sorbitano (tal como Tween 80) incluída pode ser 0,01% a 1% (p/v), 0,01% a 0,1% (p/v), 0,01% a 0,05% (p/v) ou cerca de 0,02%; a quantidade de octilfenóxi polioxietanol ou nonilfenóxi polioxietanol (tal como Triton X-100) incluída pode ser 0,001% a 0,1% (p/v), em particu- lar, 0,005% a 0,02%; e a quantidade de éter de polioxietileno (tal como Laureth 9) incluída pode ser 0,1% a 20% (p/v), possivelmente, 0,1% a 10%, em particular, 0,1% a 1% ou cerca de 0,5%.

[0119] Em algumas modalidades, a composição de conjugado pneumocócico 21-valente de veículo misto pode ser entregue por meio de um sistema de controle de liberação. Por exemplo, infusão intrave- nosa, emplastro transdérmico, lipossoma ou outras vias podem ser usa- das para administração. Em um aspecto, macromoléculas, tais como microesfera ou implante, podem ser usadas.

[0120] A divulgação acima descreve, de modo geral, a presente in- venção. Um entendimento mais completo pode ser obtido em referência aos exemplos específicos a seguir. Estes exemplos são descritos ape- nas para o propósito de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS

[0121] Exemplo 1. Preparação de Polissacarídeos Capsulares de S.

pneumoniae

[0122] O cultivo de S. pneumoniae e a purificação de polissacarí- deos capsulares foram conduzidos conforme conhecido por um versado na técnica. Os serotipos de S. pneumoniae foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) (serotipo 1: ATCC nº 6301; serotipo 3: ATCC nº 6303; serotipo 4: ATCC nº 6304; serotipo 5: ATCC nº 6305; serotipo 6A: ATCC nº 6306; serotipo 6B: ATCC nº 6326; sero- tipo 7F: ATCC nº 10351; serotipo 9N: ATCC nº 6309; serotipo 9V: ATCC nº 10368; serotipo 14: ATCC nº 6314; serotipo 18C: ATCC nº 10356; serotipo 19A: ATCC nº 10357; serotipo 19F: ATCC nº 6319; serotipo 23F: ATCC nº 6323). Cepas internas para os serotipos 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F foram usadas, mas qualquer cepa publicamente dispo- nível pode ser usada. S. pneumoniae foi caracterizada por cápsulas e motilidade, diplococo Gram-positivo, em formato de lanceta e hemólise alfa em um meio de ágar-sangue. Os serotipos foram identificados pelo teste de Quelling usando antissoros específicos (Patente nº US

5.847.112).

[0123] Preparação de Bancos de Células

[0124] Várias gerações de estoques de sementes foram geradas a fim de expandir as cepas e remover componentes de origem animal (ge- rações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de semen- tes foram produzidas. A primeira geração adicional foi cultivada a partir de um frasco de F3, e a geração subsequente foi cultivada a partir de um frasco da primeira geração adicional. Os frascos de sementes foram armazenados congelados (abaixo de -70ºC) com glicerol sintético como um crioconservante. Para a preparação do banco de células, todas as culturas foram cultivadas em meio à base de soja. Antes do congela- mento, as células foram concentradas por centrifugação, o meio gasto foi removido, e os péletes celulares foram ressuspensos em um meio fresco contendo um crioconservante (tal como glicerol sintético).

[0125] Cultivo e Colheita

[0126] As culturas do banco de células de trabalho foram inoculadas em garrafas de sementes contendo um meio à base de soja e cultiva- das. Após a densidade óptica alvo (absorbância) ter sido alcançada, a garrafa de sementes foi usada para inocular um fermentador contendo o meio à base de soja. A cultura foi encerrada quando um valor de den- sidade óptica começou a ser mantido constante. Após o término da cul- tura, foi adicionado desoxicolato de sódio à cultura para lisar as células. O conteúdo do fermentador resultante foi resfriado, e a precipitação de proteínas foi induzida. Então, a mistura foi centrifugada para remover as proteínas precipitadas e detritos celulares.

[0127] Purificação

[0128] A solução obtida a partir da centrifugação foi filtrada através de um filtro de profundidade para remover as proteínas e detritos celu- lares que não precipitaram na centrifugação. O filtrado foi concentrado em uma membrana de 100 kDa PM, e o concentrado foi diafiltrado com 10 volumes de um tampão de fosfato de sódio 25 mM (pH 7,2) para obter uma amostra. A amostra foi filtrada para coletar um sobrenadante do qual os polissacarídeos foram precipitados e filtrados. O filtrado foi concentrado em uma membrana de 30 kDa, e o concentrado foi diafil- trado usando cerca de 10 volumes de água triplamente destilada. Após realizar a diafiltração, a solução restante foi filtrada através de um filtro de 0,2 µm. Um teste de controle em processo foi realizado no filtrado (aparência, proteínas restantes, ácidos nucleicos restantes, endotoxi- nas, pesos moleculares e a quantidade total de polissacarídeos). O con- centrado foi esterilizado por filtração e armazenado a -20ºC.

[0129] Exemplo 2. Preparação do Conjugado de Polissacarídeo Capsular S. pneumoniae e Proteína Carreadora

[0130] Polissacarídeos de diferentes serotipos foram ativados se-

guindo diferentes trajetórias e, então, conjugados a uma proteína carre- adora, CRM197 ou TT. Especificamente, os conjugados foram prepara- dos conjugando-se cada um dos polissacarídeos capsulares de todos os serotipos ao CRM197 e conjugando-se cada um dos polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 3 e 5 ao TT. Dependendo do tamanho do serotipo nativo, o processo de ativação pode incluir a redução do tama- nho de cada polissacarídeo capsular para o peso molecular alvo, ativa- ção química e troca de tampão por meio de ultrafiltração. Os conjugados foram purificados usando ultrafiltração e finalmente filtrados através de filtro de 0,2 µm. Os parâmetros do processo, tais como pH, temperatura, concentração e tempo, foram conforme segue.

[0131] (1) Processo de Ativação

[0132] Etapa 1: Hidrólise

[0133] A aminação redutiva é um método conhecido para a conju- gação de polímeros em que uma ligação amida é formada entre um grupo amina primária (-NH2) de uma proteína e um aldeído de um saca- rídeo. Grupos aldeídos são adicionados ao polissacarídeo capsular pneumocócico para promover a conjugação à proteína carreadora. Uma estrutura de diol vicinal de um monossacarídeo pode ser oxidada por periodato de sódio (NaIO4) para formar grupos aldeídos. Os polissaca- rídeos capsulares dos serotipos 1, 3, 4, 6A, 8, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 22F e 33F foram pré-tratados conforme segue.

[0134] No caso do serotipo 1, hidróxido de sódio (a uma concentra- ção final de base de 0,05 M) foi adicionado a uma solução do polissa- carídeo capsular, e a solução foi incubada a 50±2ºC. A solução foi, en- tão, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e ácido clorídrico foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0135] No caso do serotipo 3, 8, 11A e 15B, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60±2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0136] No caso do serotipo 4, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,1 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 45±2ºC. A solução foi, então, res- friada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0137] No caso do serotipo 6A, e ácido acético glacial (a uma con- centração final de ácido de 0,1 M) foi adicionado a uma solução do po- lissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60±2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e hidróxido de sódio 1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0138] No caso do serotipo 12F, ácido clorídrico (a uma concentra- ção final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissa- carídeo capsular, e a solução foi incubada a 70±2ºC. A solução foi, en- tão, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final da solução de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0139] No caso dos serotipos 14 e 18C, e ácido acético glacial (a uma concentração final de ácido de 0,2 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 94±2ºC. A solu- ção foi, então, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 1 M foi adicionado à mesma de modo que um pH final da solução tenha sido 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0140] No caso dos serotipos 22F e 33F, ácido clorídrico (a uma concentração final de ácido de 0,01 M) foi adicionado a uma solução do polissacarídeo capsular, e a solução foi incubada a 60±2ºC. A solução foi, então, resfriada até uma temperatura em uma faixa de cerca de 21ºC a cerca de 25ºC, e fosfato de sódio 0,1 M foi adicionado à mesma a um pH final de 6,0±0,1, interrompendo assim a hidrólise.

[0141] Cada um dos polissacarídeos capsulares obtidos foi diluído em água para injeção (WFI), acetato de sódio e fosfato de sódio até uma concentração final entre cerca de 1,0 mg/ml e cerca de 2,0 mg/ml.

[0142] Etapa 2: Reação de periodato

[0143] O equivalente molar de periodato de sódio para cada ativa- ção de sacarídeo pneumocócico foi determinado com base na massa molar de unidade de repetição. Com uma mistura completa, a reação de oxidação foi deixada prosseguir por 16 a 20 horas de 21ºC a 25ºC para todos os serotipos, exceto 1, 7F e 19F, para os quais a temperatura era de 10ºC ou menos. Para ajudar a manter a produção consistente e estável de conjugados, uma faixa de níveis de grau de oxidação (Do) para cada serotipo é alvejada durante o processo de conjugação. Uma faixa alvejada preferencial para os níveis de Do para cada serotipo é mostrada na Tabela 1 e na Tabela 2. TABELA 1. FAIXA DE DO PARA TODOS OS SEROTIPOS A SEREM CONJUGADOS AO CRM197 Serotipo Faixa de Do Serotipo Faixa de Do Serotipo 1 4 a 10 Serotipo 11A 1 a 15 Serotipo 3 2a8 Serotipo 12F 1a9 Serotipo 4 1a5 Serotipo 14 6 a 13 Serotipo 5 2a6 Serotipo 15B 1 a 17 Serotipo 6A 5 a 15 Serotipo 18C 6 a 14 Serotipo 6B 7 a 13 Serotipo 19A 7 a 13

Serotipo Faixa de Do Serotipo Faixa de Do Serotipo 7F 2a8 Serotipo 19F 6 a 12 Serotipo 8 1 a 17 Serotipo 22F 1 a 16 Serotipo 9N 5 a 10 Serotipo 23F 6 a 14 Serotipo 9V 4a9 Serotipo 33F 1 a 15 Serotipo 10A 1 a 12 TABELA 2. FAIXA DE DO PARA OS SEROTIPOS 1, 3 E 5 A SEREM

CONJUGADOS A TT Serotipo Faixa de Do Serotipo 1 (1-TT) 1 a 15 Serotipo 3 (3-TT) 2 a 14 Serotipo 5 (5-TT) 1 a 15

[0144] Etapa 3: Ultrafiltração

[0145] O sacarídeo oxidado foi concentrado e diafiltrado com WFI em um ultrafiltro de 100 kDa MWCO (ultrafiltro de 30 kDa para o serotipo 1 e ultrafiltro de 5 kDa para o serotipo 18C). A diafiltração foi conduzida com o uso de 0,9% de solução de cloreto de sódio para o serotipo 1, tampão de acetato de sódio 0,01 M (pH 4,5) para os serotipos 7F e 23F e tampão de fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0) para o serotipo 19F. O permeado foi descartado, e o retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 µm.

[0146] Etapa 4: Liofilização

[0147] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 22F e 33F que devem ser conjugados a uma pro- teína carreadora usando um solvente aquoso, uma solução mista de polissacarídeos e proteína carreadora foi preparada sem adição de sa- carose adicional, liofilizada e, então, armazenada a -25ºC ± 5ºC.

[0148] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 18C que devem ser conjugados a uma proteína carreadora usando um sol- vente aquoso, polissacarídeos e proteína carreadora foram independen- temente preparados sem adição de sacarose adicional, liofilizada e, en- tão, armazenada a -25ºC ± 5ºC.

[0149] Para polissacarídeos capsulares dos serotipos 6A, 6B, 7F, 19A, 19F e 23F que devem ser conjugados a uma proteína carreadora usando um solvente de DMSO, uma quantidade predeterminada de sa- carose para atingir uma concentração final de sacarose de 5% ± 3% (p/v) foi adicionada aos sacarídeos ativados, e as amostras foram inde- pendentemente preparadas, liofilizadas e, então, armazenadas a -25ºC ± 5ºC.

[0150] Para o polissacarídeo capsular do serotipo 11A, uma quanti- dade predeterminada de sacarose para atingir uma concentração de sa- carose final de 20% ± 5% (p/v) foi adicionada ao sacarídeo ativado, e os polissacarídeos e a proteína carreadora foram independentemente pre- parados, liofilizados e, então, armazenados a -25ºC ± 5ºC.

[0151] Para o polissacarídeo capsular do serotipo 12F, uma quanti- dade predeterminada de sacarose para atingir uma concentração de sa- carose final de 10 % ± 5% (p/v) foi adicionada ao sacarídeo ativado, e os polissacarídeos e a proteína carreadora foram independentemente preparados, liofilizados e, então, armazenados a -25ºC ± 5ºC.

[0152] (2) Processo de conjugação

[0153] A conjugação aquosa foi conduzida para os serotipos 1, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F e 33F, e a conjugação de DMSO foi conduzida para os serotipos 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 19A, 19F e 23F. Cada um dos polissacarídeos capsulares foi conjugado a uma proteína carreadora a uma razão de 0,2 a 2:1.

[0154] Etapa 1: Dissolução

[0155] Conjugação Aquosa

[0156] Para os serotipos 1, 3, 4, 5, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F e 33F, a amostra liofilizada foi descongelada e equilibrada à tem- peratura ambiente. A amostra liofilizada foi reconstituída a uma concen- tração de reação usando uma solução de tampão de fosfato de sódio a 23±2ºC a uma razão definida para cada serotipo.

[0157] Conjugação de Sulfóxido de Dimetila (DMSO)

[0158] Para os serotipos 6A, 6B, 7F, 11A, 12F, 19A, 19F e 23F, a amostra liofilizada foi descongelada, equilibrada à temperatura ambi- ente e reconstituída em DMSO.

[0159] Etapa 2: Reação de Conjugação

[0160] Conjugação Aquosa

[0161] Para os serotipos 3-TT, 4, 5, 5-TT, 8, 9N, 9V, 10A, 14, 15B, 18C, 22F e 33F, a reação de conjugação foi iniciada adicionando-se a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) a 1,0 a 1,4 mol de ci- anoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo. No entanto, para os sero- tipos 1, 1-TT e 3, a reação foi iniciada adicionando-se solução de ciano- boroidreto de sódio a 0,5 mol de cianoboroidreto de sódio por mol de sacarídeo.

[0162] A mistura de reação foi incubada a 23ºC a 37ºC por 44 a 106 horas. A temperatura e o tempo de reação foram ajustados por serotipo. A temperatura foi, então, reduzida para 23±2ºC, e cloreto de sódio 0,9% foi adicionado ao reator. Solução de boroidreto de sódio (100 mg/ml) foi adicionada para alcançar 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo. A mistura foi incubada a 23±2ºC por 3 a 6 horas. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos não reagidos presentes nos sacarídeos. Então, a mistura foi diluída com cloreto de sódio 0,9%, e a mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 0,8 ou 0,45 µm.

[0163] Conjugação de DMSO

[0164] Para os polissacarídeos capsulares dos serotipos 6A, 6B,

7F, 11A, 12F, 19A, 19F e 23F, a reação de conjugação foi iniciada adi- cionando-se a solução de cianoboroidreto de sódio (100 mg/ml) a uma razão de 0,8 a 1,2 equivalente molar de cianoboroidreto de sódio por um mol de sacarídeo ativado. WFI foi adicionada à mistura de reação até uma concentração alvo de 1% (v/v), e a mistura foi incubada por 12 a 26 horas a 23±2ºC. 100 mg/ml de uma solução de boroidreto de sódio (tipicamente 1,8 a 2,2 equivalentes molares de boroidreto de sódio por mol de sacarídeo ativado) e WFI (alvo 5% em v/v) foram adicionados à reação, e a mistura foi incubada por 3 a 6 horas a 23±2ºC. Este proce- dimento reduziu quaisquer aldeídos não reagidos presentes nos sacarí- deos. Então, a mistura de reação foi diluída com cloreto de sódio 0,9%, e a mistura de conjugação diluída foi filtrada usando um pré-filtro de 0,8 ou 0,45 µm.

[0165] Etapa 3: Ultrafiltração

[0166] A mistura de conjugado diluída foi concentrada e diafiltrada em um filtro de ultrafiltração de 100 kDa MWCO ou em um filtro de ul- trafiltração de 300 kDa MWCO com um mínimo de 15 volumes de clo- reto de sódio 0,9% ou tampão. Também, a composição e o pH do tam- pão usado no processo variaram dependendo de cada um dos seroti- pos.

[0167] Etapa 4: Esterilização por Filtração

[0168] O retentado após a ultrafiltração foi esterilizado por filtração (0,2 µm), e controles em processo (aparência, proteína livre, sacarídeo livre, distribuição de tamanho molecular, esterilidade, teor de sacarídeo, teor de proteína, pH, endotoxina, cianeto residual, DMSO residual, iden- tidade de sacarídeo, identidade de TT e identidade de CRM197) foram realizados nos conjugados filtrados. O concentrado final foi refrigerado e armazenado a 2ºC a 8ºC.

[0169] Exemplo 3. Formulação da Vacina Pneumocócica Conju- gada Multivalente

[0170] Os volumes desejados de concentrados a granel finais obti- dos a partir do Exemplo 2 foram calculados com base no volume de batelada e nas concentrações a granel de sacarídeos. Após cloreto de sódio 0,85% (solução salina fisiológica), polissorbato 80 e tampão de succinato terem sido adicionados ao vaso de formulação pré-identifi- cado, foram adicionados concentrados a granel. A preparação foi, en- tão, completamente misturada e esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,2 μm. O volume formulado foi gentilmente mistu- rado durante e após a adição de fosfato de alumínio a granel. O pH foi verificado e ajustado, se necessário. O produto a granel formulado foi armazenado a 2 a 8ºC. As seguintes formulações de vacinas pneumo- cócicas conjugadas multivalentes não limitantes foram preparadas e no- meadas PCV21(1/5)-TT e PCV21(3/5)-TT:

[0171] PCV21(1/5)-TT incluiu conjugados de polissacarídeos pre- parados conjugando-se cada polissacarídeo dos serotipos 1 e 5 a TT e cada polissacarídeo dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F a CRM197; e

[0172] PCV21(3/5)-TT incluiu conjugados de polissacarídeos pre- parados conjugando-se cada polissacarídeo dos serotipos 3 e 5 a TT e cada polissacarídeo dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F a CRM197.

[0173] A composição de PCV21(1/5)-TT em uma dose total de 0,5 ml incluía 2,2 µg de cada polissacarídeo, exceto o serotipo 6B a 4,4 µg; 2 μg a 25 μg de TT (para os serotipos 1 e 5) e 40 μg a 75 μg de CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alu- mínio); 4,25 mg de cloreto de sódio; cerca de 295 μg de uma solução de tampão de succinato; e cerca de 100 µg de polissorbato 80 no total de uma dose de 0,5 ml. Em certos experimentos, a quantidade de polis- sacarídeo de serotipo 3 foi aumentada para 4,4 μg ou 8,8 μg na compo-

sição de PCV21(1/5)-TT. Em certos experimentos, a quantidade de po- lissacarídeo para cada um dos serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F foi aumentada para 4,4 μg na composição de PCV21(1/5)-TT.

[0174] A composição de PCV21(3/5)-TT em uma dose total de 0,5 ml incluiu 2 μg a 25 μg de TT (para os serotipos 3 e 5) e 40 μg a 75 μg CRM197, respectivamente, com os outros componentes e conteúdo dos mesmos idênticos àqueles de PCV21(1/5)-TT. Em certas composições, a quantidade de alumínio elementar na dose de 0,5 ml foi aumentada para 0,250 mg.

[0175] Exemplo 4. Imunogenicidade da Vacina Pneumocócica Con- jugada Multivalente

[0176] As vacinas pneumocócicas multivalentes de veículo misto, PCV21(1/5)-TT e PCV21(3/5)-TT preparadas no Exemplo 3, foram tes- tadas quanto à capacidade para induzir uma resposta imunogênica em coelhos. A avaliação de imunogenicidade foi realizada por ELISA espe- cífico para antígeno para concentrações séricas de IgG e por ensaio opsonofagocítico (OPA) para a funcionalidade do anticorpo. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e na semana 2 com uma dose de 5% maior do que a dose clínica humana planejada de cada polissacarídeo (2,31 µg de cada po- lissacarídeo, exceto 6B a 4,62 µg) na formulação ou a dose humana (2,2 µg de cada polissacarídeo, exceto 6B a 4,4 µg). Os soros foram amos- trados a cada 2 semanas após a imunização. Ambas as concentrações mostraram os mesmos resultados.

[0177] 4-1. PCV21(3/5)-TT

[0178] Medição de concentração de IgG específica para serotipo

[0179] Polissacarídeos capsulares (PnPs) para cada serotipo foram revestidos em uma placa de 96 poços a 0,5 μg/poço a 1 μg/poço. Uma quantidade equivalente de soro foi amostrada de cada indivíduo e foi agrupada por grupo. O agrupamento de soro foi serialmente diluído 2,5 vezes com um tampão de diluição de anticorpo que compreende Tween 20 e polissacarídeo pneumocócico da parede celular (CWPS) obtido a partir do Statens Serum Institut (5 μg/ml) e, então, reagido à temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada 5 vezes com um tampão de lavagem e, então, soro pré-adsorvido e diluído 50 μl foi adicionado à placa de poço revestido, seguido pela incubação à temperatura ambi- ente por 2 horas a 18 horas. A placa de poço foi lavada da mesma ma- neira e, então, conjugados de IgG de anticoelho de cabra-fosfatase al- calina foram adicionados a cada poço, seguido pela incubação à tem- peratura ambiente por 2 horas. As placas foram lavadas conforme des- crito acima, e 1 mg/ml de tampão de p-nitrofenilamina como substrato foi adicionado a cada poço e, então, reagido à temperatura ambiente por 2 horas. A reação foi bruscamente arrefecida adicionando-se 50 μl de NaOH 3 M, e as absorbâncias a 405 nm e 690 nm foram medidas. Como um exemplo comparativo, a vacina 13-valente comercialmente disponível (PREVNAR13) foi submetida ao mesmo procedimento. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

[0180] Tabela 3. Concentração de IgG (U/ml) para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária PCV21(3/5)-TT PCV21(3/5)-TT Serotipo PREVNAR13 0,125 mg de Al 0,250 mg de Al 1 16770,4 15320,6 38499,1 3 6603,4 30132,8 32029,7 4 27969,9 51034,4 71638,3 5 5758,6 15627,5 11044,7 6A 9493,7 14205,8 30453,5 6B 8690,6 15023,6 11633,1 7F 60819,7 53696,7 48511,1

PCV21(3/5)-TT PCV21(3/5)-TT Serotipo PREVNAR13 0,125 mg de Al 0,250 mg de Al 8 594,8 58391,9 62852,2 9N 5186,2 208401,8 259323,2 9V 30043,9 38143,9 48677,2 10A 169,8 36437,6 55124,5 11A 184,5 36771,1 45762,9 12F 130,0 22278,5 14475,3 14 21906,0 37577,9 64409,8 15B 843,5 22065,2 25248,8 18C 91500,7 88824,7 137638,5 19A 16470,7 13070,9 11387,0 19F 13956,4 40516,9 84553,8 22F 139,7 51649,9 62072,7 23F 12089,4 5772,9 15565,5 33F 143,2 35602,4 46272,8

[0181] Quando os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para sero- tipo aumentou significativamente em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com o PCV21(3/5)-TT também demonstraram aumentos significativos na con- centração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). O serotipo 9N, em particular, quando administrado com 0,125 mg e 0,250 mg de alumínio teve um aumento inesperado de 40 e 50 vezes, respectiva-

mente, na concentração sérica de IgG específica em relação ao PRE- VNAR13. Ademais, vários outros polissacarídeos capsulares dos sero- tipos em PCV21(3/5)-TT mostraram um nível significativamente mais alto de concentração sérica de IgG específica do que em PREVNAR13.

[0182] Teste de imunogenicidade funcional (MOPA)

[0183] As funções de anticorpo foram avaliadas testando-se o soro em um ensaio MOPA. A cepa de MOPA de S. pneumoniae armazenada a -70ºC ou menos foi diluída à vez de diluição final correspondente, de modo que uma concentração de cada cepa tenha sido cerca de 50000 CFU/ml. Uma quantidade equivalente de soro foi amostrada de cada indivíduo, agrupada por grupo e diluída em série 2 vezes de modo que 20 μl de soro permanecessem em uma placa de fundo em U. Após a diluição da amostra, 10 μl da cepa preparada para cada serotipo foram misturados com a amostra diluída, e a mistura foi deixada reagir à tem- peratura ambiente por 30 minutos de modo que S. pneumoniae e o an- ticorpo fossem bem misturados. Uma mistura de células HL-60 pré-dife- renciadas e complemento foi adicionada e reagida em uma incubadora de CO2 (37ºC) por 45 minutos. A temperatura foi reduzida para interrom- per a fagocitose, e 10 μl da solução da reação foram pintados a uma placa de ágar pré-seca por 30 a 60 minutos e, então, deixados serem absorvidos na placa por 20 minutos até secarem. Uma solução de esto- que de TTC de 25 mg/ml foi adicionada a um ágar de sobreposição pre- parado, e um anticorpo apropriado para a cepa correspondente foi adi- cionado ao mesmo. A mistura foi completamente misturada e, então, cerca de 25 ml da mistura foram adicionados à placa e endurecidos por cerca de 30 minutos. A placa completamente endurecida foi incubada em uma incubadora de CO2 (37ºC) por 12 a 18 horas e, então, as colô- nias foram contadas. O título de MOPA foi expresso como uma taxa de diluição na qual 50% de extermínios foram observados. Como um exem-

plo comparativo, a vacina 13-valente comercialmente disponível (PRE- VNAR13) foi submetida ao mesmo procedimento. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[0184] Tabela 4. Títulos de MOPA para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária PCV21(3/5)-TT PCV21(3/5)-TT Serotipo PREVNAR13 0,125 mg de Al 0,250 mg de Al 1 94 72 244 3 829 740 3515 4 2428 2698 2675 5 1169 4154 2735 6A 4925 4567 4761 6B 5693 4959 6629 7F 2731 2095 2103 8 Não testado 710 731 9N Não testado 4660 1371 9V 271 280 254 10A Não testado 952 935 11A Não testado 743 1053 12F Não testado 846 737 14 1917 2119 2170 15B Não testado 713 849 18C 5347 2620 4546 19A 5760 2464 2253 19F 2059 2071 2137

PCV21(3/5)-TT PCV21(3/5)-TT Serotipo PREVNAR13 0,125 mg de Al 0,250 mg de Al 22F Não testado 6022 7783 23F 1975 1487 1566 33F Não testado 824 1924

[0185] Quando os serotipos 3 e 5 foram conjugados ao TT, títulos de MOPA funcionais aumentaram significativamente em comparação aos títulos de MOPA obtidos quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com PCV21(3/5)-TT também demonstra- ram aumentos significativos em títulos de MOPA funcionais contra cada um dos oito serotipos adicionais que não estão presentes em PRE- VNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F).

[0186] 4-2. PCV21(1/5)-TT

[0187] A concentração de IgG específica para serotipo e o título de imunogenicidade funcional foram medidos da mesma maneira que em 4-1, e os resultados são mostrados a seguir. Três modalidades de PCV21(1/5)-TT diferentes foram testadas: uma com 2,2 µg de polissa- carídeo capsular do serotipo 3 (“3-CRM197 2,2”), uma com 4,4 µg de po- lissacarídeo capsular do serotipo 3 (“3-CRM197 4,4”) e outra com 8,8 µg de capsular polissacarídeo do serotipo 3 (“3-CRM197 8,8”).

[0188] Medição de concentração de IgG específica para serotipo

[0189] Tabela 5. Concentração de IgG (U/ml) para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 3-CRM197 8,8 1 5105,5 33530,6 96552,2 44714,9 3 6303,0 7827,2 14676,2 13239,6 4 46727,3 58893,8 54382,8 39691,0 5 6873,9 14918,4 18743,2 11499,5

PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 3-CRM197 8,8 6A 32561,4 11493,2 13053,0 12494,6 6B 25398,7 11856,7 10013,2 4455,6 7F 27560,5 25799,0 70917,5 56448,2 8 521,0 70060,4 86634,8 63337,9 9N 5198,2 169584,3 240858,5 187203,6 9V 62169,3 42445,1 64084,4 34876,4 10A 166,4 25682,8 44186,9 15827,4 11A 195,3 34050,4 42558,8 33264,2 12F 154,4 27629,4 38459,7 25874,3 14 17765,9 23787,4 29262,4 24116,4 15B 436,0 22060,6 21777,0 22573,1 18C 103154,7 119672,1 141889,4 75549,1 19A 19191,1 4690,5 5516,9 3407,3 19F 16349,2 31789,8 24370,0 18846,2 22F 130,0 40963,1 49475,5 36246,2 23F 15166,5 6312,7 7499,9 5431,5 33F 146,1 39803,9 38378,5 26837,2

[0190] Quando os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para sero- tipo aumentou significativamente em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com o PCV21(1/5)-TT também demonstraram aumentos significativos na con- centração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Nova- mente, o serotipo 9N mostrou inesperadamente um aumento significa- tivo (cerca de 32 a 46 vezes) em relação ao PRENAR13. Ademais, vá- rios outros polissacarídeos capsulares dos serotipos em PCV21(1/5)-TT mostraram um nível significativamente mais alto de concentração sérica de IgG específica do que em PREVNAR13. Também foi observado que dobrar a quantidade de antígeno de serotipo 3 de 2,2 µg para 4,4 µg aumentou inesperadamente a concentração sérica de IgG específica para os serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 22F e 23F, com um aumento de mais do que 2 vezes para os se- rotipos 1 e 7F.

[0191] Teste de imunogenicidade funcional (MOPA)

[0192] Tabela 6. Títulos de MOPA para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 3-CRM197 8,8 1 99 198 916 241 3 479 565 1072 929 4 2560 3201 2571 2012 5 1046 3717 5430 2025 6A 5624 2708 5249 2415 6B 5451 3903 4143 2452 7F 2355 2521 2576 2125 8 Não testado 525 719 630 9N 54 790 1680 885 9V 282 251 307 183 10A Não testado 684 1065 760 11A Não testado 887 1751 747 12F Não testado 856 1016 824 14 1052 1221 1929 1513 15B 59 1042 823 732 18C 6257 4440 4663 2821 19A 2962 828 1362 686 19F 968 1971 1835 1453

PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 3-CRM197 8,8 22F Não testado 3576 5599 7193 23F 1854 769 1358 1050 33F Não testado 932 1982 808

[0193] Quando os serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, títulos de MOPA funcionais aumentaram significativamente em comparação aos títulos de MOPA obtidos quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com o PCV21(1/5)-TT também demons- traram aumentos significativos em títulos de MOPA funcionais contra cada um dos oito serotipos adicionais que não estão presentes em PRE- VNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Ademais, vários outros serotipos mostraram um nível significativamente mais alto de tí- tulos funcionais de MOPA do que em PREVNAR13. Também foi obser- vado que dobrar a quantidade de antígeno de serotipo 3 de 2,2 µg para 4,4 µg aumentou inesperadamente a concentração sérica de IgG espe- cífica para cada serotipo exceto 4, 15B e 19F, com um aumento de mais do que 4,5 vezes para o serotipo 1.

[0194] 4-3. PCV21(1/5)-TT

[0195] Os experimentos de 4-2 foram repetidos com uma modali- dade de PCV21(1/5)-TT que tem 2,2 µg de polissacarídeo capsular do serotipo 3 (“3-CRM197 2,2”), uma modalidade de PCV21(1/5)-TT que tem 4,4 µg de polissacarídeo capsular do serotipo 3 (“3-CRM197 4,4”) e uma modalidade de PCV21(1/5)-TT que tem 4,4 µg de polissacarídeos cap- sulares dos serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F ("Multi-CRM197 4,4"). A concentração de IgG específica para serotipo e o título de imunogenici- dade funcional foram medidos da mesma maneira que em 4-1, e os re- sultados são mostrados a seguir.

[0196] Medição de concentração de IgG específica para serotipo

[0197] Tabela 7. Concentração de IgG (U/ml) para 21 serotipos em

2 semanas após a imunização secundária PCV21(1/5)-TT PCV21(1/5)-TT 3- PCV21(1/5)-TT Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 CRM197 4,4 Multi-CRM197 4,4 1 14208,3 34503,1 49226,1 40684,4 3 6575,6 6634,1 13769,4 10841,3 4 16600,3 33352,0 43605,9 34387,8 5 5079,3 10847,5 20866,2 13405,1 6A 8965,5 2607,1 13781,5 9194,9 6B 5105,2 1233,5 9225,5 2428,9 7F 59993,0 27961,7 57039,5 33913,6 8 274,7 56735,3 72822,9 65528,5 9N 3824,7 140424,7 181325,9 142736,9 9V 39503,5 29139,3 61759,9 48711,5 10A 130,0 8017,0 14061,8 15832,8 11A 163,9 33051,7 51222,1 39311,8 12F 130,0 18160,9 22634,9 14877,6 14 12312,4 12868,7 15953,4 8538,5 15B 280,6 14339,7 22347,7 22692,0 18C 62963,5 56059,2 141911,5 70910,8 19A 9807,5 1185,7 4233,4 2649,2 19F 9838,7 9825,8 21175,9 10889,9 22F 130,0 20120,0 37833,7 21807,5 23F 5835,1 2084,1 4016,2 3152,3 33F 141,4 22732,6 19748,9 19179,6

[0198] Como em 4-2, quando os polissacarídeos capsulares dos se- rotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para serotipo aumentou significativamente em comparação a esta ob- tida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imuni- zados com o PCV21(1/5)-TT também demonstraram aumentos signifi- cativos na concentração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F), e o polissacarídeo capsular do serotipo 4 mostrou um nível signi- ficativamente mais alto de concentração sérica de IgG específica do que em PREVNAR13. Também foi observado que dobrar a quantidade de antígeno de serotipo 3 de 2,2 µg para 4,4 µg aumentou inesperada- mente a concentração sérica de IgG específica para todos exceto três serotipos. Também foi possível usar uma dose mais alta de múltiplos serotipos, conforme demonstrado pela modalidade de PCV21(1/5)-TT na qual a quantidade de serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F foi aumentada de 2,2 µg para 4,4 µg ("Multi-CRM197 4,4").

[0199] Teste de imunogenicidade funcional (MOPA)

[0200] Tabela 8. Títulos de MOPA para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária PCV21(1/5-TT) PCV21(1/5-TT) PCV21(1/5-TT) Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 Multi-CRM197 4,4 1 109 236 276 255 3 740 514 836 768 4 2272 2522 2216 2376 5 3638 12393 18293 2559 6A 4949 2187 3607 2401 6B 4915 767 5196 1555 7F 2414 2014 2227 1781 8 Não testado 582 694 690 9N 84 937 1252 983 9V 295 474 419 290 10A Não testado 566 737 674 11A Não testado 801 1666 1878 12F Não testado 600 1008 1298 14 1659 1503 1200 959 15B 79 902 1459 1794

PCV21(1/5-TT) PCV21(1/5-TT) PCV21(1/5-TT) Serotipo PREVNAR13 3-CRM197 2,2 3-CRM197 4,4 Multi-CRM197 4,4 18C 2933 2594 4095 2968 19A 3910 957 1244 751 19F 1570 908 2175 1453 22F Não testado 2268 7833 3516 23F 1956 677 786 709 33F Não testado 1021 1115 736

[0201] Como em 4-2, quando os serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a imunogenicidade funcional melhorou em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imu- nizados com o PCV21(1/5)-TT também demonstraram aumentos signi- ficativos em títulos de MOPA funcionais contra cada um dos oito seroti- pos adicionais conjugados ao CRM197 que não estão presentes em PRE- VNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Também foi possível usar uma dose mais alta de múltiplos serotipos, conforme de- monstrado por PCV21(1/5)-TT Multi-CRM197 4,4, em que a quantidade de serotipos 3, 4, 6B, 9V, 19A e 19F foi aumentada de 2,2 µg para 4,4 µg.

[0202] 4-4. PCV21(1/5)-TT

[0203] Os experimentos de 4-2 foram repetidos com uma modali- dade de PCV21(1/5)-TT que tem 4,4 µg de polissacarídeo capsular dos serotipos 3 e 4 ("3,4-CRM 197 4,4"). A concentração de IgG específica para serotipo e o título de imunogenicidade funcional foram medidos da mesma maneira que em 4-1, e os resultados são mostrados a seguir.

[0204] Medição de concentração de IgG específica para serotipo

[0205] Tabela 9. Concentração de IgG (U/ml) para 21 serotipos em 2 semanas após a imunização secundária para 3,4-CRM197 4,4

PCV21 (1,5-TT) Serotipo Prevnar13 3,4-CRM197 4,4

1 2512,6 11687,9

3 6160,3 16537,5

4 13018,1 23834,9

5 7738,6 35815,1

6A 13701,1 6476,3

6B 2290,0 881,1

7F 22885,1 25523,5

8 170,1 19027,5

9N 971,4 35064,1

9V 13803,2 18139,3

10A 130,0 7028,4

11A 165,6 10215,7

12F 130,0 3770,0

14 3333,0 4977,4

15B 203,2 8956,5

18C 28120,5 21748,1

19A 18587,6 6785,8

19F 29732,6 34497,2

22F 130,0 21193,6

23F 3962,9 1791,5

33F 130,0 13194,5

[0206] Quando os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a concentração de IgG específica para sero- tipo aumentou significativamente em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com o PCV21(1/5)-TT também demonstraram aumentos significativos na con- centração de IgG contra os oito serotipos adicionais não presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Foi também foi observado que dobrar a quantidade do antígeno de serotipo 3 e se- rotipo 4 de 2,2 µg para 4,4 µg mostrou um nível significativamente mais alto de concentração sérica de IgG específica do que em PREVNAR13. Também foi possível usar uma dose mais alta de múltiplos serotipos, conforme demonstrado pela modalidade de PCV21(1/5)-TT na qual a quantidade de serotipos 3 e 4 foi aumentada de 2,2 µg para 4,4 µg ("3,4- CRM197 4,4").

[0207] Teste de imunogenicidade funcional (MOPA)

[0208] Tabela 10. Títulos de MOPA para 21 serotipos em 2 sema- nas após a imunização secundária PCV21 (1,5-TT) Serotipo Prevnar13 3,4-CRM197 4,4 1 54 455 3 393 968 4 2072 3331 5 306 1621 6A 2355 1315 6B 1614 1410 7F 952 981 8 5 986

PCV21 (1,5-TT) Serotipo Prevnar13 3,4-CRM197 4,4 9N 52 2072 9V 324 479 10A 2 427 11A 4 1103 12F 2 266 14 539 969 15B 5 255 18C 1996 1392 19A 1870 774 19F 1516 1352 22F 2 1796 23F 928 496 33F 2 292

[0209] Quando os serotipos 1 e 5 foram conjugados ao TT, a imu- nogenicidade funcional melhorou em comparação a esta obtida quando os mesmos foram conjugados ao CRM197. Coelhos imunizados com o PCV21(1/5)-TT também demonstraram aumentos significativos em títu- los de MOPA funcionais contra cada um dos oito serotipos adicionais conjugados ao CRM197 que não estão presentes em PREVNAR13 (isto é, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F). Também foi possível usar uma dose mais alta de múltiplos serotipos, conforme demonstrado por PCV21(1/5)-TT 3,4-CRM197 4,4, em que a quantidade de serotipos 3 e 4 foi aumentada de 2,2 µg para 4,4 µg.

[0210] Exemplo 5. Detalhes Adicionais Sobre a Preparação do con- jugado sacarídeo-proteína de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N

[0211] Preparação de banco de células

[0212] Streptococcus pneumoniae serotipo 9N (ATCC 6309) foi ad- quirido a partir da American Type Culture Collection (ATCC). Para a pro- liferação da cepa e remoção de constituintes de origem animal, o esto- que de sementes foi cultivado por várias gerações. O frasco de estoque foi mantido em um refrigerador (< -70ºC) juntamente com glicerol sinté- tico como um crioprotetor. Para a preparação de um banco de células, a cultura celular foi proliferada em um meio à base de soja. Antes do congelamento, as células foram concentradas por centrifugação e, após a remoção do meio usado, os péletes celulares foram ressuspensos em um meio fresco contendo um crioprotetor (por exemplo, glicerol sinté- tico).

[0213] Fermentação

[0214] A cultura do banco de células foi inoculada em uma garrafa de sementes contendo um meio à base de soja. Até que a condição de crescimento tenha sido satisfeita, a cultura foi incubada à temperatura constante sem agitação. A cultura foi inoculada em um fermentador de sementes contendo um meio à base de soja, com temperatura, pH e velocidade de agitação controlados, usando uma garrafa de sementes. A fermentação terminou após o crescimento ter sido interrompido ou a capacidade de trabalho do fermentador ter sido atingida. Após o término da fermentação pela adição de um desativador, os detritos celulares fo- ram removidos usando uma combinação de filtração e centrifugação de fluxo contínuo.

[0215] Purificação

[0216] O processo de purificação de polissacarídeo pneumocócico consistiu em filtração multicamada, concentração/diafiltração e filtra- ção/eluição repetidas.

[0217] Ativação

[0218] A concentração final de polissacarídeo foi ajustada a cerca de 2,0 g/l adicionando-se sequencialmente WFI de uma quantidade cal- culada. Se necessário, o pH da reação foi ajustado a aproximadamente 6,0. Após o ajuste de pH, a temperatura de reação foi ajustada a 21 a 25ºC. Aproximadamente 0,024 a 0,189 mg de periodato de sódio foi adi- cionado por 1 mg de açúcar para iniciar a oxidação. A reação de oxida- ção foi conduzida por 16 a 20 horas a 21 a 25ºC.

[0219] O polissacarídeo ativado foi concentrado e diafiltrado usando uma membrana de ultrafiltração de 100 kDa MWCO. A diafiltração foi conduzida para WFI de 10 vezes o volume do volume de diafiltração. Então, o polissacarídeo ativado purificado foi armazenado a 2 a 8ºC. O sacarídeo ativado purificado foi caracterizado (i) pela concentração de sacarídeo determinada por ensaio colorimétrico, (ii) pela concentração de aldeído determinada por ensaio colorimétrico, (iii) pelo grau de oxi- dação e (iv) pelo peso molecular medido por SEC-MALLS.

[0220] SEC-MALLS é usado para determinar o peso molecular de polissacarídeos e conjugados de polissacarídeo-proteína. SEC é usado para separar o polissacarídeo com base no volume hidrodinâmico. Um detector de índice de refração (RI) e um detector de dispersão de luz laser de múltiplos ângulos (MALLS) são usados para determinar o peso molecular. Quando a luz reage com um material, a luz é dispersa. A quantidade de luz dispersa está relacionada à concentração, o qua- drado de dn/dc (incremento de índice de refração específico) e a massa molar do material. O peso molecular é calculado com base no sinal da luz dispersa do detector de MALLS e no sinal de concentração do de- tector de RI.

[0221] O grau de oxidação (DO) do polissacarídeo ativado é deter- minado como o mol de unidades de repetição de açúcar dividido pelo mol de aldeído. O mol de unidades de repetição de açúcar é determi- nado por várias técnicas colorimétricas, por exemplo, usando o ensaio de antrona. E o mol de aldeído é determinado pelo ensaio colorimétrico de Park-Johnson.

[0222] Usando estas técnicas descritas acima, foi determinado que o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ativado obtido pelo método descrito acima tem um grau de oxidação de 2 a 19, mais tipicamente, 5 a 10 e um peso molecular de cerca de 200 a 700 kDa.

[0223] Conjugação

[0224] O polissacarídeo ativado foi mesclado com a proteína carre- adora CRM197, a uma razão de 0,5 a 2 g de CRM197 por 1 g do polissa- carídeo ativado. Então, a mistura mesclada foi liofilizada. A mistura lio- filizada do polissacarídeo ativado e CRM197 foi armazenada a -20ºC.

[0225] A mistura liofilizada do polissacarídeo ativado e CRM197 foi reconstituída em uma solução de fosfato de sódio 0,1 M e, então, mis- turada o suficiente. A concentração final de polissacarídeo na solução da reação foi de cerca de 10 a 20 g/l. Após o início da conjugação pela adição de 1,0 a 1,2 equivalente molar de cianoboroidreto de sódio (NaBH3CN) à mistura de reação, a reação foi conduzida a 35 a 39ºC por 44 a 52 horas. A reação de conjugação foi terminada adicionando-se uma solução de cloreto de sódio 0,9% do mesmo volume que a solução de reação de conjugação e, então, adicionando-se 1,8 a 2,2 equivalen- tes molares de boroidreto de sódio (NaBH4) para submeter a capea- mento o aldeído não reagido. A reação de capeamento foi conduzida a 21 a 25ºC por 3 a 6 horas.

[0226] A solução de conjugado foi diluída com uma solução de clo- reto de sódio 0,9% para concentração e diafiltração usando uma mem- brana de 100 kDa MWCO. A solução de conjugado diluída foi filtrada através de um filtro de 0,8 a 0,45 μm e purificada por concentração e diafiltração. A diafiltração que usa uma membrana de 100 kDa MWCO foi conduzida usando uma solução de cloreto de sódio 0,9% de 15 a 40 vezes o volume de diafiltração. Após a diafiltração ter sido concluída, a solução restante foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm. A solução de conjugado foi diluída a uma concentração abaixo de aproximadamente 0,55 mg/ml, esterilizada por filtração e, então, armazenada a 2 a 8ºC.

[0227] O conjugado de serotipo 9N purificado foi caracterizado, em particular, (i) pela concentração de proteína determinada pelo ensaio colorimétrico (Lowry), (ii) pela concentração de aldeído determinada pelo ensaio colorimétrico, (iii) pela razão entre sacarídeo e proteína, (iv) pela distribuição de tamanho molecular determinada por cromatografia de exclusão de tamanho (CL-4B) e (v) pelo peso molecular medido por SEC-MALLS.

[0228] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar o grau de oxidação (DO). O resultado é resumido na Tabela 11.

[0229] Tabela 11 Número do conjugado 1 2 3 4 5 6 Peso molecular de polissacarídeo ativado, kDa 582 619 459 563 490 427 DO 18,2 9,4 7,4 6,7 4,3 2,3 Razão de entrada (P:S) 0,8:1 Concentração de polissacarídeos em solução de 20,0 reação de conjugação, g/l % de rendimento de conjugado 53 43 39 32 33 39 Razão entre sacarídeo e proteína 2,1 1,5 1,3 1,1 1,0 0,78 % de sacarídeo livre 44 28 22 20 21 31 % de distribuição de peso molecular 52 49 50 55 44 31 Peso molecular do conjugado, kDa 860 1110 1912 1168 1189 1160

[0230] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar a razão de mesclagem do polissacarídeo ativado e CRM197 durante a liofilização. O resultado é resumido na Tabela 12.

[0231] Tabela 12 Número do conjugado 7 8 9 10 11 Peso molecular de polissacarídeo ativado, kDa 287 DO 5,6

Número do conjugado 7 8 9 10 11 Razão de entrada (P:S) 2:1 1,5:1 1:1 0,67:1 0,5:1 Concentração de polissacarídeos em solução de 20,0 reação de conjugação, g/l % de rendimento de conjugado 25 50 43 41 66 Razão entre sacarídeo e proteína 0,71 0,85 1,0 1,2 1,8 % de sacarídeo livre 5 6 15 27 62 % de distribuição de peso molecular 52 58 50 40 22 Peso molecular do conjugado, kDa 3720 3713 1327 1016 545

[0232] A alteração nas características do conjugado de serotipo 9N foi observada ao variar a concentração de polissacarídeo na solução de reação de conjugação. O resultado é resumido na Tabela 13.

[0233] Tabela 13 Número do conjugado 12 13 14 15 16 Peso molecular de polissacarídeo ativado, kDa 560 DO 6,1 Razão de entrada (P:S) 0,8:1 Concentração de polissacarídeos em solução de 10,0 12,5 15,0 17,5 20,0 reação de conjugação, g/l % de rendimento de conjugado 20 31 28 40 42 Razão entre sacarídeo e proteína 1,0 1,0 0,93 0,99 0,97 % de sacarídeo livre 32 30 22 21 18 % de distribuição de peso molecular 17 27 40 47 54 Peso molecular do conjugado, kDa 560 546 845 932 1438

[0234] Exemplo 6. Análise de imunogenicidade

[0235] Uma composição de conjugado monovalente contendo o conjugado sacarídeo-proteína de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N conjugado a CRM197 foi formulada.

[0236] A imunogenicidade das composições imunogênicas mono- valentes das Tabelas 11 a 13 foi analisada por ELISA. A concentração sérica da IgG específica para serotipo foi determinada.

[0237] Cinco coelhos brancos fêmeas da Nova Zelândia pesando 2,5 a 3,5 kg foram imunizados com a dose clínica humana proposta

(conjugado 2,2 μg; + 0,25 mg/ml de alumínio como AlPO4) em 0 semana por meio de uma via intramuscular. Os coelhos foram imunizados nova- mente na semana 2 com a vacina conjugada da mesma dose, e amos- tras sanguíneas foram coletadas na semana 4. ELISA específico para serotipo foi conduzido para amostras de soro na semana 0 e na semana

4.

[0238] O resultado de análise é mostrado na Tabela 14. Os coelhos imunizados com a composição de conjugado monovalente (conjugado número 8) mostraram aumento significativo no título total de IgG para o serotipo 9N. Os coelhos imunizados com outros conjugados também mostraram aumento significativo no título total de IgG.

[0239] A Tabela 14 mostra um resultado da medição da concentra- ção de IgG após a imunização dos coelhos com o conjugado número 8 da Tabela 12.

[0240] Tabela 14 Concentração de IgG (U/ml) Serotipo Pré-imunização Pós-imunização 9N 130,0 656345,3

[0241] Embora uma ou mais modalidades exemplificativas tenham sido descritas no relatório descritivo, será compreendido pelos indiví- duos de habilidade comum na técnica que várias alterações na forma e nos detalhes podem ser realizadas às mesmas sem que se afaste do espírito e do escopo do conceito inventivo conforme definido pelas rei- vindicações a seguir.

REFERÊNCIAS

[0242] As referências a seguir são citadas no pedido e fornecem informações gerais sobre o campo da técnica e fornecem ensaios e ou- tros detalhes discutidos no pedido. As referências a seguir são incorpo- radas ao presente documento a título de referência em suas totalidades.

[0243] [1] Prymula et al., The Lancet, 367:740-48 (2006).

[0244] [2] Vesikari et al., PIDJ, 28(4):S66-76 (2009).

[0245] [3] Dagan et al., Infection & Immunity, 5383-91 (2004).

[0246] [4] Juergens et al., Clinical and Vaccine Immunology, 21(9):1277-1281 (2014).

[0247] [5] Andrews et al., The Lancet, 14:839-846 (2014).

[0248] [6] Nurkka et al., Vaccine, 20:194-201 (2001).

[0249] [7] Levin e Stone, J. Immunol., 67:235-242 (1951).

[0250] [8] W.H.O. Manual for the Production and Control of Vac- cines: Tetanus Toxoid, 1977 (BLG/UNDP/77.2 Rev.I.)

[0251] [9] Didierlaurent et al., J. Immunol., 183:6186-6197 (2009).

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, caracterizada pelo fato de que compreende 21 conjuga- dos de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócicos diferentes, em que cada conjugado de polissacarídeo capsular-proteína pneumocócico compreende um veículo de proteína conjugado a um polissacarídeo capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae, em que os serotipos de Streptococcus pneumoniae são selecionados den- tre 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, em que o veículo de proteína é CRM197 ou toxoide tetânico, e em que dois dos polissacarídeos capsulares são conjugados ao toxoide tetânico e os polissacarídeos capsulares restantes são conjugados a CRM197, em que os dois polissacarídeos capsulares que são conjuga- dos ao toxoide tetânico são selecionados a partir do grupo que consiste nos serotipos 1, 3 e 5.

2. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 5 são conjuga- dos ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados a CRM197.

3. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1 e 3 são conjuga- dos ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados a CRM197.

4. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os polissacarídeos capsulares dos serotipos 3 e 5 são conjuga- dos ao toxoide tetânico, e os polissacarídeos capsulares dos serotipos 1, 4, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F são conjugados a CRM197.

5. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações prece- dentes, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

6. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio.

7. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

8. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é fosfato de alumínio.

9. Composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, de acordo com qualquer uma das reivindicações prece- dentes, caracterizada pelo fato de que: o polissacarídeo capsular do serotipo 9N é conjugado ao CRM197 em um estado em que o polissacarídeo capsular do serotipo 9N é ativado para ter um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5 a 10 e um peso molecular de 200 a 700 kDa; o conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e CRM197 tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa; uma razão (P/P) entre o polissacarídeo capsular do serotipo 9N e CRM197 no conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do sero- tipo 9N e CRM197 é 0,5 a 2,5; e/ou

15 a 60% do conjugado formado entre o polissacarídeo capsular do se- rotipo 9N e CRM 197 tem uma Kd de 0,3 ou menos em uma coluna CL- 4B.

10. Uso da composição de conjugado pneumocócico multi- valente de veículo misto, como definido em qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizado pelo fato de que se destina à profi- laxia contra infecção ou doença por Streptococcus pneumoniae em um indivíduo.

11. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, e um excipi- ente farmaceuticamente aceitável.

12. Método para profilaxia da infecção ou doença por Strep- tococcus pneumoniae em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que o método compreende administrar uma quantidade profilaticamente efi- caz da composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a vacina, como definida na reivindicação 11, ao indivíduo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano que tem pelo menos 50 anos de idade, e a doença é pneumonia ou doença pneumocócica inva- siva (IPD).

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano que tem pelo menos 6 semanas de idade, e a doença é pneumonia, doença pneumocócica in- vasiva (IPD) ou otite média aguda (AOM).

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem 6 semanas a 5 anos de idade, 2 a 15 meses de idade ou 6 a 17 anos de idade.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 10, ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

17. Método, como definido em qualquer uma das reivindica- ções 12 a 16, caracterizado pelo fato de que a composição de conju- gado pneumocócico multivalente de veículo misto ou a vacina é admi- nistrada por injeção intramuscular.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que a composição de conjugado pneumocócico multivalente de veículo misto ou a vacina é administrada como parte de uma série de imunizações.

19. Método para preparar um conjugado imunogênico de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) lisar uma célula bacteriana que produz polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N fermentando a mesma; (b) purificar o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae se- rotipo 9N da célula lisada; (c) ativar o polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae sero- tipo 9N reagindo com um agente oxidante para alcançar um grau de oxidação de 2 a 19 ou 5 a 10; e (d) formar um conjugado do polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N ligado a um veículo de proteína misturando-se o polissacarídeo de serotipo 9N ativado com o veículo de proteína, em que o veículo de proteína é CRM197.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o CRM197 misturado na etapa (d) é reagido com um agente redutor para formar o conjugado com o polissacarídeo de sero- tipo 9N ativado.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, carac- terizado pelo fato de que:

na etapa (c), 0,02 a 0,19 μg de periodato é reagido com 1 μg do polis- sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae serotipo 9N a 20 a 25ºC por 15 a 20 horas; o polissacarídeo de serotipo 9N ativado misturado com o CRM197 na etapa (d) tem um peso molecular de 200 a 700 kDa; o conjugado formado na etapa (d) tem um peso molecular de 500 a 4000 kDa; uma taxa de entrada inicial entre o CRM197 e o polissacarídeo capsular de serotipo 9N ativado é 0,5 a 2,5:1; e/ou pelo menos 15 a 60% do conjugado formado na etapa (d) tem uma K d de 0,3 ou menos em uma coluna CL-4B.