TW201945028A - 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物 - Google Patents

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Abstract

提供含21種不同肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中各共軛物包括一種與破傷風類毒素(TT)或CRM197共軛、來自不同肺炎鏈球菌血清型的莢膜多醣，其中該肺炎鏈球菌血清型係選自於1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F，其中血清型1、3及5中的二血清型之該莢膜多醣係與TT共軛且該剩餘的莢膜多醣係與CRM197共軛。亦提供生產該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物的方法以及於一個體內使用其用於預防肺炎鏈球菌感染或疾病的方法。

Description

多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物
相關 申請案之交叉引述
此申請案主張並倚賴提申日期2018年二月5日的美國臨時申請案號碼62/626,482，及2018年四月18日之韓國專利申請案號碼10-2018-0045246的利益，其等之整體揭露內容被併入本文中以作為參考資料。
發明領域
此申請案一般而言係有關於混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物、包含其之疫苗以及於一個體內使用此等組成物及疫苗用於預防肺炎鏈球菌感染或疾病的方法。
發明背景
肺炎球菌(肺炎鏈球菌)為有超過90種已知血清型的革蘭氏陽性、柳葉刀型、兼性厭氧性細菌。多數肺炎鏈球菌血清型已經顯示出會造成疾病，且23種最常見的血清型在世界各地導致大概90%之侵入性疾病。血清型係根據莢膜多醣，肺炎球菌最重要的毒力因子之血清學反應予以分類。莢膜多醣為T細胞非依賴性抗原其於缺乏T輔助細胞之下誘發抗體生產。T細胞非依賴性抗原一般而言誘發低親和力及短期的免疫反應以及很少免疫記憶甚至於沒有免疫記憶。
起始的肺炎球菌疫苗包括來自不同血清型之莢膜多醣組合。此等疫苗能賦予有發達或健康的免疫系統的患者對抗肺炎鏈球菌的免疫力，然而，其等於沒有發達的免疫系統的嬰兒，及通常免疫功能減弱的年長個體體內沒有效果。為了改良肺炎球菌疫苗的免疫反應，特別是在處於發展肺炎鏈球菌感染較高的風險下之嬰兒及年長個體體內，使莢膜多醣與合適的載體蛋白質共軛以產生肺炎球菌共軛物疫苗。與合適的載體蛋白質共軛使莢膜多醣由T細胞非依賴性抗原改變成T細胞依賴性抗原。確切而言，對抗共軛的莢膜多醣之免疫反應涉及T輔助細胞，T輔助細胞於再暴露於莢膜多醣時協助誘發更有力且快速的免疫反應。
開發肺炎球菌共軛物疫苗有至少二種方法：單一載體方法及混合載體方法。不同的莢膜多醣共軛物的免疫原性可取決於所用的肺炎球菌血清型及載體蛋白質而變化。於單一載體方法方面，來自不同血清型的莢膜多醣係與一單一蛋白質載體共軛。不同的莢膜多醣與CRM197 蛋白質載體，一種具有以甘胺酸單一胺基酸取代麩胺酸之白喉類毒素的無毒變異體，進行共軛的一單一載體方法之實例是輝瑞的(Pfizer’s)沛兒(PREVNAR)系列的疫苗。7價沛兒疫苗(沛兒)首先於2000年得到批准且含有來自7種最盛行的血清型：4、6B、9V、14、18C、19F及23F之莢膜多醣。13價疫苗，PREVNAR 13，添加血清型1、5、7F、3、6A及19A至CRM197 蛋白質載體。PREVNAR疫苗內使用的單一載體，蛋白質載體，CRM197 ，從未使用作為肺炎球菌共軛物疫苗之混合的載體系統的一部分。
第二種肺炎球菌疫苗方法是混合載體方法。於混合載體方法方面，使用二種或更多種蛋白質載體，而非使用一單一蛋白質載體，且來自特定血清型的莢膜多醣係與第一蛋白質載體共軛及來自不同血清型的莢膜多醣係與至少第二、不同的蛋白質載體共軛。舉例而言，葛蘭素史克(GlaxoSmithKline)已經發展雙伏威(SYNFLORIX)，一種10價(血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F)、混合載體、肺炎球菌共軛物疫苗其使用流行性感冒嗜血桿菌蛋白質D、破傷風類毒素及白喉類毒素作為蛋白質載體。於雙伏威方面，血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及23F係與蛋白質D共軛；血清型18C係與破傷風類毒素共軛；以及血清型19F係與白喉類毒素共軛[2]。由11價前驅物部分地去除血清型3成為雙伏威，因為血清型3於急性中耳炎試驗內沒有顯示血清型專一性效力[1]。另一集團，安萬特巴斯德(Aventis Pasteur)，發展一種使用白喉類毒素及破傷風類毒素作為蛋白質載體之11價(血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F及23F)、混合載體、肺炎球菌共軛物疫苗[3]。來自血清型3、9V、14及18C的莢膜多醣與白喉類毒素共軛時能引起比其等與破傷風類毒素共軛時引起的反應更佳的反應[6]。因而，血清型3、6B、14及18C係與白喉類毒素共軛以及血清型1、4、5、7F、9V、19F及23F係與破傷風類毒素共軛。此混合載體、肺炎球菌疫苗之開發被終止，部分是由於技術因素以及與非細胞性百日咳疫苗一起投予時反應潛力降低之故[3]。近來，血清型5及1被報導為具有自所有的沛兒13血清型觀察到最低的OPA力價，其中於IgG力價及OPA活性之間有關聯的相關性[4]。還有人建議關於血清型3，保護作用需要高得多的血清IgG濃度[5]。
發明概要
本申請案提供新穎且改良的混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物以及包含其之疫苗。於一個態樣中，本申請案提供一種混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其包含21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物，其中各肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物包含與來自不同肺炎鏈球菌血清型之一莢膜多醣共軛的一蛋白質載體，其中該肺炎鏈球菌血清型係選自於1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F，其中該蛋白質載體為CRM197 或破傷風類毒素，其中該莢膜多醣中的二者係與破傷風類毒素共軛且該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛，以及其中與破傷風類毒素共軛之該二莢膜多醣係選自於由血清型1、3及5所組成的群組。
於該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物的一些具體例中，來自血清型1及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
於該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物的另一具體例中，來自血清型1及3的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
於該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物的另一具體例中，來自血清型3及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型1、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
於一些具體例中，該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物進一步包含一種佐劑，例如一種鋁基(aluminum-based)佐劑，其包括，但不限於磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁。
另一態樣係針對該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物作為一種疫苗之用途。
再一態樣係針對一種疫苗，其包含該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物以及一藥學上可接受的賦形劑。
再一態樣係針對一種用於在諸如人類之一個體中預防肺炎鏈球菌感染或疾病的方法，該方法包含投予一預防有效量之該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或包含其之一疫苗至該個體。
於某些具體例中，該個體為至少50歲的一人類且該疾病為肺炎或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)。
於其他的具體例中，該個體為至少6週大的一人類且該疾病為肺炎、侵入性肺炎球菌疾病(IPD)或急性中耳炎(AOM)。於一些具體例中，該人類個體為6週至5歲。於其他的具體例中，該人類個體為2至15個月或6至17歲。
於某些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或疫苗係藉由肌內注射來投予。於某些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或疫苗係作為免疫系列(immunization series)的一部分投予。
再一態樣係針對一種肺炎鏈球菌血清型9N之免疫原性共軛物，其含有：來自肺炎鏈球菌的血清型9N的莢膜多醣；以及與該莢膜多醣結合的載體蛋白質，其中該載體蛋白質為CRM197 。於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，該血清型9N多醣可與CRM197 結合以形成一共軛物，該血清型9N多醣之狀態係經活化以具有2-19或5-10的氧化程度及200-700 kDa的分子量。於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，該免疫原性血清型9N共軛物可具有500-4,000 kDa的分子量。
於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，該免疫原性血清型9N共軛物內的該血清型9N莢膜多醣與該載體蛋白質的比率為0.1-5(w/w)。於某些具體例中，該比率為0.5-2.5。
於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，該免疫原性血清型9N共軛物的15-60%於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。
於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，該免疫原性血清型9N共軛物已經以業已經活化以達到2-19的氧化程度之一血清型9N多醣予以製備。於某些具體例中，該免疫原性血清型9N共軛物已經以業已經活化以達到5-10的氧化程度之一血清型9N多醣予以製備。
於該免疫原性血清型9N共軛物、該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗(及其之方法/用途)之某些具體例中，當藉由每1 μg的糖添加0.02-0.19 μg的過碘酸鹽使該肺炎鏈球菌血清型9N醣與CRM197 共軛時，該共軛物可具有500-4,000 kDa的分子量、15-60%的分子量分佈(Kd ≤ 0.3)及0.5-2.5的醣/蛋白質比率。
於再一態樣中，本揭露內容亦提供一種用於製備一肺炎鏈球菌血清型9N之免疫原性共軛物的方法，該方法包含：
(a)藉由發酵一生產肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣的細菌細胞使其溶解；
(b)從該溶解的細胞純化肺炎鏈球菌血清型9N莢膜醣；
(c) 藉由與一氧化劑反應而使該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣活化以達到2-19或5-10的氧化程度；以及
(d) 藉由混合該經活化的醣與CRM197 而形成有該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜醣結合至CRM197 的一共軛物。
於某些具體例中，於步驟(d)混合的該CRM197 可與一還原劑反應以形成具有該經活化的肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣之共軛物。於某些具體例中，於步驟(c)中，0.02-0.19 μg的過碘酸鹽可與1 μg的該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣於20-25℃下反應歷時15-20小時。
於某些具體例中，於步驟(c)中與該氧化劑反應之該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣可具有400-900 kDa的分子量。於某些具體例中，於步驟(d)中與該CRM197 混合的該經活化的肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣可具有200-700 kDa的分子量。於某些具體例中，該肺炎鏈球菌血清型9N之免疫原性共軛物可具有500-4,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該CRM197 與該經活化的血清型9N莢膜醣之起始投入比率(載體CRM197 ：醣)可以為0.5-2.5:1。於某些具體例中，該免疫原性共軛物的至少15-60%如於CL-4B管柱測量可具有0.3或更低的Kd 。
於某些具體例中，當藉由每1 μg的糖添加0.02-0.19 μg的過碘酸鹽使本揭露內容的肺炎鏈球菌血清型9N多醣與CRM197 共軛時，該免疫原性共軛物具有500-4,000 kDa的分子量、如於CL-4B管柱測量為15-60%的分子量分佈(Kd ≤ 0.3)及0.5-2.5的CRM197 /多醣比率。
該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物之前述及其他目的、特徵與優點將由於下列詳細說明而變得更顯而易見。
較佳實施例之詳細說明
定義
為了更容易瞭解本揭露內容，首先定義某些術語如下。在本說明書中可能會提出下列術語額外的定義及其他術語。
當使用於本說明書及隨附的申請專利範圍中，除非上下文另外明確指定，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數的指示對象。因此舉例而言，提及「一方法」包括本文所述之一或更多方法，及/或類型的步驟及/或熟習此項技術者閱讀此揭露內容後會變得顯而易見者等等。
投予： 當使用於本文中，「投予」一種組成物至一個體係指給予、施用或使該組成物接觸該個體。投予可藉由一些途徑之任一者來完成，諸如，舉例而言，局部、口腔、皮下、肌內、腹膜內、靜脈內、脊椎腔內(intrathecal)及真皮內。
大概： 當使用於本文中，術語「大概」或「大約」，當用於一或更多感興趣的數值，係指與所述參考值相似的一數值。於某些具體例中，術語「大概」或「大約」係指落在所述參考值的任一方向(大於或小於)的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小之內範圍的數值，除非另外指定或從上下文明白(除了此數字會超過可能數值的100%以外)。
共軛物： 當使用於本文中，且由合適的上下文瞭解到，術語「共軛物」或「醣共軛物(glycoconjugate)」係指一種使用任何共價或非共價生物共軛策略而與一載體蛋白質共軛之肺炎鏈球菌多醣。
氧化程度： 當使用於本文中，術語「氧化程度」(DO)係指當以一氧化劑來活化一經純化或分粒的醣類時，每醛基產生的糖重複單元數目。醣類的氧化程度可使用熟悉此藝者已知的例行方法來判定。
賦形劑： 當使用於本文中，術語「賦形劑」係指一種組成物內可含括的非治療劑，舉例而言用以提供或促進所欲的濃度(consistency)或安定作用。
混合 載體： 當使用於本文中，一種混合載體、肺炎球菌共軛物組成物係指一種具有一種類型以上的蛋白質載體之肺炎球菌共軛物組成物。
混合 載體、21 價肺炎球菌共軛物組成物： 當使用於本文中，術語「混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物」係指一種組成物，其包含21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物或由21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物組成，其中各肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物包含一蛋白質載體與來自不同肺炎鏈球菌血清型之一莢膜多醣共軛，其中該肺炎鏈球菌血清型為1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F以及33F，其中該蛋白質載體為CRM197 或破傷風類毒素，其中該莢膜多醣中的二者係與破傷風類毒素共軛且該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛，以及其中與破傷風類毒素共軛之該二莢膜多醣係選自於由血清型1、3及5所組成的群組。於一些具體例中，來自血清型1及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自剩餘的血清型之該莢膜多醣係與CRM197 共軛。於一些具體例中，來自血清型1及3的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自剩餘的血清型之該莢膜多醣係與CRM197 共軛。於另一具體例中，來自血清型3及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛。
分子量： 當使用於本文中，除非另有說明，否則術語莢膜醣或莢膜醣-載體蛋白質共軛物之「分子量」係指粒徑篩析層析法(SEC)與多角雷射光散射檢測器(MALLS)組合所計算之平均分子量。
多價： 當使用於本文中，術語「多價」係指一種具有來自一種以上的肺炎鏈球菌血清型之肺炎球菌莢膜多醣之肺炎球菌共軛物組成物。
藥學上可接受的賦形劑： 此揭露內容內可用的藥學上可接受的賦形劑為慣用的。由E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA，第15版(1975)之Remington's Pharmaceutical Sciences，描述適合藥學遞送一或更多治療組成物之組成物及調配物，包括疫苗，及額外的藥學製劑。適合的藥學賦形劑包括，舉例而言，澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、乾燥脫脂牛奶、甘油、丙烯(propylene)、乙二醇、水、乙醇等等。一般而言，賦形劑的本質將取決於所使用的特定投予模式。舉例來說，非經腸調配物通常包含可注射流體包括藥學及生理上可接受的流體如水、生理食鹽水、平衡的鹽溶液、緩衝液、含水右旋糖、甘油等等作為媒液。就固體組成物(舉例來說，粉劑、藥片、錠劑或膠囊形式)而言，慣用的無毒固體賦形劑可包括，舉例而言，藥品級甘露糖醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外，待投予的藥學組成物可含較小量的無毒輔助物質，例如潤濕劑或乳化劑、界面活性劑、防腐劑及pH緩衝劑等等，舉例而言乙酸鈉或去水山梨醇單月桂酸酯。
預防有效量： 當使用於本文中，術語「一預防有效量」或「一預防有效劑量」係指誘發足以使肺炎鏈球菌感染所造成的一或更多症狀之開始延遲及/或降低頻率及/或嚴重性之免疫反應所需的量或劑量。
預防： 當使用於本文中，術語「預防」係指避免疾病顯現、延遲開始及/或降低一特定疾病、障礙或病況(如，肺炎鏈球菌感染)的一或更多症狀之頻率及/或嚴重性。於一些具體例中，預防係以族群基礎進行評估以使得設若於該疾病、障礙或病況易感的族群內觀察到該疾病、障礙或病況的一或更多症狀之發展、頻率及/或強度有統計上顯著的下降，則認為一製劑對一特定疾病、障礙或病況提供預防。
個體 (subject) ： 當使用於本文中，術語「個體」係指任何哺乳動物，包括小鼠、兔及人類。於某些具體例中個體為成年、青少年或嬰兒。於一些具體例中，使用術語「個體(individual)」或「患者」且意思是可與「個體(subject)」互換。
詳細說明
下列所揭露的具體例及實施例之說明在本質上僅僅是例示性的且決不打算限制本發明、其應用或用途。
本申請案提供新且改良的混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及包含其之疫苗。雖然蛋白質載體，CRM197 ，先前已使用於單一載體、肺炎球菌共軛物疫苗，但本申請案描述CRM197 於一種混合載體、肺炎球菌共軛物疫苗之用途。特別地，本申請案描述CRM197 及破傷風類毒素於多價肺炎球菌共軛物組成物及疫苗作為用於特定肺炎球菌血清型之載體蛋白質的組合用途。
如以上討論，不同莢膜多醣共軛物的免疫原性可取決於所用的肺炎球菌血清型及載體蛋白質而變化。本申請案描述血清型3與破傷風類毒素成功的共軛作為混合載體疫苗之一部分，儘管先前的教示為血清型3在與白喉類毒素共軛而非破傷風類毒素時為更有免疫原性的[6]。亦說明血清型1及5與破傷風類毒素成功的共軛作為混合載體疫苗之一部分。亦揭示了意想不到的發現，對一種混合載體、多價，例如21價，肺炎球菌共軛物組成物內與破傷風類毒素共軛的血清型3之抗體反應，比一種單一載體、13價肺炎球菌共軛物組成物(沛兒13)內血清型3與CRM197 共軛時更高大約4-5倍。
再者，意想不到的發現不限於血清型3而且於混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物內與破傷風類毒素共軛的其他血清型也觀察到。如同實施例中所示，當與一種單一載體、肺炎球菌共軛物組成物(沛兒13)內與CRM197 共軛之相同的血清型之抗體反應(IgG反應或MOPA力價)相比，一種混合載體、肺炎球菌共軛物組成物內血清型1及5或是3及5與破傷風類毒素共軛且剩餘的血清型與CRM197 共軛(例如，PCV21(1/5)-TT及PCV21(3/5)-TT)一致地對與破傷風類毒素共軛的血清型誘發顯著提升的抗體反應。
本申請案所述之混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物亦包括目前於全球市場上可得的三種肺炎球菌共軛物疫苗：沛兒(PREVNAR)(某些國家稱為沛兒(Prevenar))、雙伏威(SYNFLORIX)及沛兒(PREVNAR)13，目前未涵蓋的肺炎球菌血清型。目前未涵蓋的肺炎球菌血清型造成的疾病在上升中，部分是由於發展出抗菌抗性(antibacterial resistance)、免疫功能低下患者數量增加及缺乏免疫壓力。舉例而言，目前可得的肺炎球菌共軛物疫苗無一者含括血清型9N。此外，目前可得的肺炎球菌共軛物疫苗無一者含括血清型8、10A、11A、12F、15B、22F及33F。本揭露內容展示出成功的提供血清型8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F至混合載體(破傷風類毒素與CRM197 )、肺炎球菌共軛物疫苗內，以及血清型9N誘發比沛兒13更高大約40至50倍的抗體反應。
肺炎球菌多醣血清型9N
可使用熟悉此藝者已知的單離程序(包括，但不限於美國專利申請案公開案號碼2006/0228380內揭示的方法)以從細菌直接獲得血清型9N多醣。此外，該醣還能使用合成方案來生產。
血清型9N肺炎鏈球菌菌株可從已建立之培養物收集中心(諸如疾病控制及預防中心之鏈球菌參考實驗室(Streptococcal Reference Laboratory of the Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, Georgia))或臨床樣本獲得。
細菌細胞典型係在培養基中生長，例如以大豆為基的培養基。在生產肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣的細菌細胞發酵之後，使細菌細胞溶解以生產細胞溶解物。接著，可將血清型9N多醣使用本技術已知的純化技術自細胞溶解物分離，該等純化技術包括離心、深度過濾、沈澱、超過濾、以活性碳處理、透析過濾及/或管柱層析術(包括，但不限於美國專利申請公開案號2006/0228380中揭示的方法)。經純化之血清型9N莢膜多醣可用於製備免疫原性共軛物。藉由純化來自肺炎鏈球菌溶解物之血清型9N多醣且選擇性地粒度分級(sizing)經純化之多醣所獲得之血清型9N莢膜多醣可特徵在於不同的參數，包括例如血清型9N莢膜多醣的分子量(MW)。
於某些具體例中，從肺炎鏈球菌血清型9N純化之經純化的多醣在共軛前具有5-5,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該血清型9N莢膜多醣在共軛前具有50-1,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該血清型9N莢膜多醣在共軛前具有70-900 kDa的分子量。於某些具體例中，該血清型9N莢膜多醣在共軛前具有100-800 kDa的分子量。於某些具體例中，該經純化的血清型9N莢膜多醣在共軛前可予以活化以具有下列的分子量：50-800 kDa、80-780 kDa、100-770 kDa、120-760 kDa、140-750 kDa、150-740 kDa、160-730 kDa、170-735 kDa、180-720 kDa、190-710 kDa、200-700 kDa、220-690 kDa、240-680 kDa、260-670 kDa、270-660 kDa或類似的分子量範圍。涵蓋以上範圍的任一者內的任何整數作為本揭示的具體例。
該經活化的血清型9N多醣可特徵在於氧化程度及分子量。於某些具體例中，該經活化的血清型9N多醣可具有0.5-25、0.6-23、0.8-21、1-20.8、1.1-20.5、1.2-20.3、1.3-20、1.4-19.5、1.5-19.3、1.6-19.2、1.7-19.1 2-19、3-18、4-15或5-10的氧化程度。
多醣的大小可在正常的純化程序期間略微減小。另外，如本揭示所述，可使多醣在共軛前經受粒度分級技術。上文所提及之分子量範圍係指在共軛前的最終粒度分級步驟之後(例如純化、水解及活化後)的經純化的多醣之分子量範圍。
混合 載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及製造其之方法
本揭露內容提供一種混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其包含21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物或由21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物組成，其中各肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物包含與來自不同肺炎鏈球菌血清型之一莢膜多醣共軛的一蛋白質載體，其中該肺炎鏈球菌血清型係1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F，其中該蛋白質載體為CRM197 或破傷風類毒素，其中該莢膜多醣中的二者係與破傷風類毒素共軛且該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛，以及其中與破傷風類毒素共軛之該二莢膜多醣係選自於由血清型1、3及5所組成的群組。
於一些具體例中，來自血清型1及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自剩餘的血清型之該莢膜多醣係與CRM197 共軛。於另一具體例中，來自血清型1及3的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛。於另一具體例中，來自血清型3及5的該莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛。
於一種多醣-蛋白質共軛物疫苗方面，一種載體蛋白質係與一種多醣抗原共軛主要要幫助提升對多醣抗原之免疫反應(如抗體反應)。載體蛋白質較佳為無毒性之蛋白質。載體蛋白質應能夠經受使用標準共軛作用程序而與一肺炎球菌多醣進行共軛作用，如以下更詳盡所討論者。混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物內使用的載體蛋白質為破傷風類毒素(TT)及CRM197 ，其等各者已經使用於設計肺炎球菌共軛物疫苗但是從未於同一、混合的載體疫苗。
CRM197 為一種保留野生型白喉毒素的免疫性質之白喉毒素的無毒變異體(即，類毒素)。CRM197 與野生型白喉毒素的差異在一結構基因的一單一鹼基，其導致由甘胺酸單一胺基酸取代麩胺酸。CRM197 典型係從酪蛋白質胺基酸和酵母萃取物為基的培養基上生長的白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria )菌株C7(β197)的培養物所單離。CRM197 可以經由超過濾、硫酸銨沈澱以及離子交換層析術予以純化。任擇地，CRM197 能依照美國專利第5,614,382號的方式予以重組製備，其係藉此整體併入以作為參考資料。CRM197 已經使用於設計肺炎球菌共軛物疫苗但是從未作為混合載體疫苗的一部分。
破傷風類毒素被製備且全球性的使用於大規模免疫對抗破傷風桿菌(Clostridium tetani )造成的破傷風(或牙關緊閉(lockjaw))。破傷風類毒素亦單獨使用以及與白喉及/或百日咳疫苗組合使用。母蛋白質，破傷風毒素，一般而言從破傷風桿菌的培養物來得到。破傷風毒素為大約150 kDa的蛋白質且由一雙硫鍵鍵聯的二個次單元(大約100 kDa及大約50 kDa)組成。該毒素典型係用甲醛予以去毒且可使用已知的方法由培養物濾液純化，例如硫酸銨沉澱(參見，如，[7]、[8])或層析術技術，如同舉例而言，WO 1996/025425中揭示者。破傷風毒素也可以藉由重組遺傳方法予以不活化。
破傷風類毒素也已經使用作為其他疫苗的載體蛋白質，包括肺炎球菌共軛物疫苗。但是破傷風類毒素與CRM197 組合使用於一種混合載體、肺炎球菌共軛物疫苗是新穎的。本技藝對於一種混合載體、肺炎球菌共軛物疫苗內之血清型3與破傷風類毒素共軛亦有相反教示，因為該教示顯示出與破傷風類毒素相比，血清型3與白喉類毒素共軛時更有免疫原性[6]。
本文所述之組成物及疫苗使用的肺炎球菌莢膜多醣，包括來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的莢膜多醣，可以使用任何可得的技術，包括熟悉此藝者已知的標準技術，而由肺炎鏈球菌予以製備，該等技術包括舉例而言，WO 2006/110381、WO 2008/118752、WO 2006/110352及美國專利申請案公開案號碼2006/0228380、2006/0228381、2007/0184071、2007/0184072、2007/0231340、2008/0102498及2008/0286838內揭示的該等，其等全體係以其等之整體併入以作為參考資料。舉例而言，各肺炎球菌多醣血清型可於培養基(如一種大豆為基的培養基)內生長。溶解細胞，以及可以經由離心、沈澱、超過濾及/或管柱層析法而由溶解產物純化個別的多醣。此外，肺炎球菌多醣可使用合成程序來生產。
肺炎鏈球菌的莢膜多醣包含重複的寡醣單元，其可含有至多8個糖殘基。一種莢膜醣抗原可以為全長的多醣，或其可以降低大小(諸如，一單一寡醣單元，或比重複的寡醣單元之天然長度的醣鏈更短)。莢膜多醣的大小可以藉由本技藝者已知的各種方法予以降低，諸如酸水解處理、過氧化氫處理、藉由一高壓均質器予以粒度分級，選擇性地接著過氧化氫處理以產生寡醣片段，或微射流體法。
藉由使各血清型之莢膜多醣與一載體蛋白質共軛可以製備各血清型之肺炎球菌共軛物。可以將不同的肺炎球菌共軛物調配成一種組成物，包括一種單一劑量調配物。
為了製備一種多醣-蛋白質共軛物，由各肺炎球菌血清型製備的莢膜多醣可以予以化學活化以使得莢膜多醣可以與載體蛋白質起反應。一旦活化，各莢膜多醣會分別與載體蛋白質共軛以形成醣共軛物。多醣之化學活化及隨後與載體蛋白質之共軛作用可以藉由慣見的方法來達成。
舉例而言，莢膜多醣末端之鄰位的羥基可藉由氧化劑例如過碘酸鹽(包括過碘酸鈉、過碘酸鉀或過碘酸))予以氧化成醛基，如同譬如美國專利號碼4, 365,170、4,673,574以及4,902,506中所揭示者，其等係藉此以其等之整體併入以作為參考資料。過碘酸鹽隨機氧化碳水化合物之鄰位羥基以形成反應性醛基且造成C-C鍵裂解。術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽和過碘酸二者。此術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4- )以及原過碘酸鹽(IO65- )二者。術語「過碘酸鹽」亦包括過碘酸鹽的各種鹽，含括過碘酸鈉和過碘酸鉀。於某些具體例中，該多醣可在偏過碘酸鈉的存在下氧化。
於某些具體例中，每1 μg的多醣可使用大約0.03-0.17 μg的量之過碘酸鹽。於某些具體例中，每1 μg的多醣可使用大約0.025-0.18 μg或大約0.02-0.19 μg的量之過碘酸鹽。醣類可視希望活化至以上範圍內。超出該範圍，效應可能會不滿意。
多醣亦可用1-氰基-4-二甲基胺基四氟硼酸吡啶鎓(CDAP)來活化以形成氰酸酯。經活化的多醣繼而直接或經由間隔子(spacer)或連接子基團而偶合至載體蛋白質上之胺基。
舉例而言，間隔子可為胱胺或半胱胺以得到硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[y-馬來醯亞胺基丁醯基氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或鹵代乙醯化載體蛋白質(例如使用碘代乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SBA；SIB)、N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(SlAB)、磺酸琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸酯(磺酸基-SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)或琥珀醯亞胺基 3-[溴乙醯胺基]丙酸酯(SBAP))反應後、經由所獲得之硫醚鍵聯與載體偶合。較佳地，使氰酸酯(選擇性地藉由COAP化學物質製得)與己二胺或己二酸二醯肼(AOH)進行偶合，且使用碳二亞胺(例如EDAC或EDC)化學物質經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣與載體蛋白質共軛。此等共軛物係闡述於舉例而言WO 93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中，其等全體係以其等之整體併入以作為參考資料。
經活化的莢膜多醣及載體蛋白質之共軛作用可以舉例而言，藉由還原胺化來達成，如同舉例而言，美國專利申請案公開案號碼2006/0228380、2007/0231340、2007/0184071及2007/0184072、WO 2006/110381、WO 2008/079653及WO 2008/143709內所述者，其等全體係以其等之整體併入以作為參考資料。舉例而言，經活化的莢膜多醣及載體蛋白質可以與還原劑反應以形成共軛物。合適的還原劑包括硼氫化物，例如氰基硼氫化鈉、硼烷-吡啶、三乙醯氧基硼氫化鈉、鈉或硼氫化物、或硼氫化物交換樹脂。還原反應結束時，共軛物內可能存在有未反應的醛基。未反應的醛基可以使用合適的封蓋劑，例如硼氫化鈉(NaBH4 )予以封蓋。於一具體例中，還原反應係於水性溶劑內進行。於另一具體例中反應係於非質子溶劑內進行。於一具體例中，還原反應係於DMSO(二甲亞碸)或DMF(二甲基甲醯胺)溶劑內進行。其他可能的還原劑包括，但不限於，胺硼烷諸如吡啶-硼烷、2-甲吡啶-硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苯甲基胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶-硼烷(PEMB)。
經活化的莢膜多醣可以直接與載體蛋白質共軛或間接經由使用間隔子或連接子，例如雙功能性連接子而與載體蛋白質共軛。連接子選擇性地為異雙功能性或同雙功能性，具有例如反應性胺基及反應性羧酸基團、2個反應性胺基或2個反應性羧酸基團。
其他適合的共軛技術使用碳二亞胺、肼、活性酯、降硼烷(norborane)、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S--NHS、EDC、TSTU，如同舉例而言，國際專利申請案公開案號碼WO 98/42721內所述者，其係以其等之整體併入以作為參考資料。共軛可涉及羰基連接子，該羰基連接子可藉由使醣之游離羥基與1,1'-羰基二咪唑(CDI)進行反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chem. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)隨後與蛋白質進行反應以形成胺甲酸酯鍵聯來形成。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，選擇性保護/去保護一級羥基，使一級羥基與CDI進行反應以形成CDI胺甲酸酯中間體及使CDI胺甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基進行偶合作用。
肺炎球菌共軛物疫苗之多醣對載體蛋白質的比率典型係在0.3–3.0 (w/w)的範圍內，但是可以隨血清型而變化。可以藉由獨立測量蛋白質及多醣存在的量，或藉由本技藝已知作直接比率測量的方法來判定比率。包括1 H NMR光譜法或SEC-HPLC-UV/RI加上雙重監控(例如總物質及蛋白質含量分別的折射指數及UV)以及藉由SEC-HPLC-MALLS或MALDI-TOF-MS之方法，可作出醣/蛋白質比率關於共軛物大小分佈的剖面圖。
如此獲得的多醣-蛋白質共軛物可經由多種方法予以純化及富集。此等方法包括濃縮/透析過濾(dialfiltration)、管柱層析法及深度過濾(depth filtration)。經純化的多醣-蛋白質共軛物予以組合以調配一種混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物，其可以使用作為一種疫苗。
一種疫苗組成物之調配可以使用業內公認的方法來達成。一種疫苗組成物係予以調配為與其所欲投予途徑相容。可將個別的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物與生理上可接受的媒液調配在一起來製備該組成物。此等媒液之實例包括，但不限於，水、緩衝鹽水、多元醇(舉例而言，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。
於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物進一步包含一種佐劑。當使用於本文中，「佐劑」係指一種非專一性提升對一抗原的免疫反應之物質或媒液(vehicle)。佐劑可包括礦物的懸浮液(明礬、鋁鹽，例如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、羥基磷酸鋁硫酸鹽等等)，抗原吸附於其上；或抗原溶液被乳化於礦物油內的油包水型乳劑(諸如，佛恩得不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant))，有時加上殺死的分枝桿菌內含物(佛恩得完全佐劑(Freund's complete adjuvant))以進一步提升抗原性。免疫刺激寡核苷酸(諸如包括CpG部分(motif)的該等)亦可使用作為佐劑(舉例而言，見美國專利案號碼6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；及6,429,199)。佐劑亦包括生物分子，諸如脂質及共刺激分子。例示性生物佐劑包括AS04 [9]、IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L及41 BBL。
於一些具體例中，該佐劑係一種鋁基佐劑。典型地，單一0.5 ml疫苗劑量係調配為含有大約0.1 mg至2.5 mg的鋁基佐劑。於其他的具體例中，單一0.5 ml疫苗劑量係調配為含有介於0.1 mg至2 mg、0.1 mg至1 mg、0.1 mg至0.5 mg、0.1 mg至0.2 mg、0.125 mg至2.5 mg、0.125 mg至0.5 mg、0.125 mg至0.2 mg或0.125至0.25 mg之間的鋁基佐劑。於某些具體例中，單一0.5 ml疫苗劑量係調配為含有大約0.125 mg至大約0.250 mg的鋁基佐劑。於某些具體例中，單一0.5 ml疫苗劑量係調配為含有大約0.125 mg的鋁基佐劑。於某些具體例中，單一0.5 ml疫苗劑量係調配為含有大約0.250 mg的鋁基佐劑。
於特定具體例中，該佐劑係選自於由磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁所組成的群組。
於特定具體例中，該佐劑係磷酸鋁。
於一些具體例中，該組成物係供用於作為一種對抗肺炎鏈球菌感染的疫苗。
肺炎球菌莢膜多醣- 蛋白質載體共軛物之 特徵化
於某些具體例中，該多醣-蛋白質共軛物可具有100-10,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有200-9,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有300-8,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有400-7,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有500-6,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有600-5,000 kDa的分子量。於某些具體例中，該共軛物具有500-4,000 kDa分子量的分子量。涵蓋以上範圍的任一者內的任何整數作為本揭示的具體例。
當分子量落在以上範圍內時，可以高產率穩定地形成共軛物。而且，可降低游離多醣的比例。此外，以上分子量範圍內可達成優越的免疫原性。
在個別的多醣-蛋白質共軛物純化之後，使其等複合以調配本揭示的免疫原性組成物。
本揭示的血清型之醣-蛋白質共軛物可特徵在於多醣對蛋白質載體的比率(多醣的量/蛋白質載體的量，w/w)。
於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物內該多醣對蛋白質載體的比率(w/w)為0.5-2.5、0.4-2.3、0.3-2.1、0.24-2、0.2-1.8、0.18-1.6、0.16-1.4、0.14-1.2、0.12-1或0.1-1(例如大約0.7、大約0.8、大約0.9、大約1.0、大約1.1、大約1.2、大約1.3、大約1.4、大約1.5、大約1.6、大約1.7、大約1.8、大約1.9、大約2.0、大約2.1、大約2.2、大約2.3、大約2.4或大約2.5)。
當多醣對蛋白質載體的比率落在以上範圍內時，可以高產率穩定的形成共軛物。而且，可降低游離多醣的比例。此外，於以上分子量範圍內可達成優越的免疫原性及共軛物能穩定維持而不干擾其他血清型。
本揭示的共軛物及免疫原性組成物可含有不與蛋白質載體共價共軛，但是卻存在於多醣-蛋白質載體共軛物組成物內的游離多醣。游離多醣可與多醣-蛋白質載體共軛物非共價締合(亦即非共價連結至多醣-蛋白質載體共軛物、吸附至多醣-蛋白質載體共軛物或包埋於多醣-蛋白質載體共軛物中或與多醣-蛋白質載體共軛物一起包埋)。
於某些具體例中，該多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約60%、大約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約60%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約50%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約40%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約30%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約25%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約20%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約15%之各血清型之游離多醣。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物包含根據各血清型之多醣總量為少於大約10%之各血清型之游離多醣。
各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物亦可特徵在於其之分子大小分佈(Kd )。可使用粒徑篩析層析介質(CL-4B；交聯的瓊脂糖小珠，4%)測定共軛物的相對分子大小分佈。在重力進料管柱中使用粒徑篩析層析法(SEC)以定出共軛物的分子大小分佈。介質內自孔排除的大分子比小分子更快沖提出。使用餾分收集器來收集管柱沖出物。餾分係以醣檢定法經比色方式測試。校準用於測定Kd 之管柱，以確立完全排除分子之餾分(V0 ；Kd =0)及代表最大滯留之餾分(Vi ；Kd =1)。達到指定的樣品屬性之餾分(Ve )係以下式而與Kd 有關：Kd =(Ve -V0 )/(Vi -V0 )。
於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少15%於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。
於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少20%於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少15 %、20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %或90 %於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少60%於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少50-80 %於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。於某些具體例中，各血清型之多醣-蛋白質載體共軛物的至少65-80 %於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。於某些具體例中，各血清型之醣-蛋白質共軛物的至少15-60 %於CL-4B管柱可具有0.3或更低的Kd 。
預防 方法及用途
於一態樣中，本揭露內容提供一種疫苗，其包含一種混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物以及一藥學上可接受的賦形劑。於一些具體例中，該藥學上可接受的賦形劑包含至少一種緩衝劑例如琥珀酸鹽緩衝劑、一種鹽例如氯化鈉，及/或一種界面活性劑例如聚氧乙烯山梨醇酯(polyoxyethylene sorbitan ester)(如，聚山梨醇酯80)。於一些具體例中，選自於由血清型1、3及5所組成的群組之該二種多醣係與破傷風類毒素共軛，以及1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之中剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。
於一些具體例中，來自血清型1及5的莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。
於另一具體例中，來自血清型1及3的莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。
於另一具體例中，來自血清型3及5的莢膜多醣係與破傷風類毒素共軛，以及來自血清型1、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F以及33F的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。
於一些具體例中，該疫苗於一人類個體內引出對抗肺炎鏈球菌感染所造成的疾病之保護性免疫反應。
依據一另外的態樣，此揭露內容提供一種用於預防肺炎鏈球菌感染或疾病的方法，該方法包含投予一預防有效量之一種混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或包含其之疫苗至一人類個體。該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或包含其之疫苗可以藉由任何途徑來投予，包括，舉例而言，藉由全身或黏膜途徑來投予，如以下更詳盡所述。
於某些具體例中，該人類個體為年長的個體且該疾病為肺炎或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)。於某些具體例中，該年長的個體為至少50歲。於其他的具體例中，該年長的個體為至少55歲。於再其他的具體例中，該年長的個體為至少60歲。
於其他的具體例中，該人類個體為嬰兒且該疾病為肺炎、侵入性肺炎球菌疾病(IPD)或急性中耳炎(AOM)。於某些具體例中，該嬰兒為0-2歲。於其他的具體例中，該嬰兒為2至15個月。
於再一具體例中，該人類個體為6週至17歲大且該疾病為肺炎、侵入性肺炎球菌疾病(IPD)或急性中耳炎(AOM)。於某些具體例中，該人類個體為6週至5歲大。於其他的具體例中，該人類個體為5至17歲大。
各疫苗劑量內共軛物的量或該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物之預防有效量可以選擇為誘發預防作用而無明顯有害作用的量。此量會取決於肺炎球菌血清型而有所變化。一般而言，每劑量可包括大約0.1 µg至大約100 µg的多醣，特定而言，大約0.1至10µg，且更特定而言，大約1 µg至大約5 µg。用於特定疫苗之組份的最佳量可藉由標準研究來確定，標準研究涉及觀察個體體內適當的免疫反應。舉例而言，用於人類個體之疫苗接種的量可以藉由外推動物測試結果來判定。此外，可以憑經驗來判定劑量。
於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約1 μg至大約5 μg的各莢膜多醣；大約1 μg至大約30 μg的TT；大約20 μg至大約85 μg的CRM197 ；及選擇性地大約0.1 mg至大約0.5 mg的元素鋁佐劑。於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2 μg至大約2.5 μg之各莢膜多醣，除了血清型6B及選擇性地血清型3係以大約4 μg至大約5 μg的量存在；大約2 μg至大約25 μg的TT；大約40 μg至大約75 μg的CRM197 ；及選擇性地大約0.1 mg至大約0.25 mg的元素鋁佐劑。
於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2.2 μg的各莢膜多醣、除了血清型6B以外，血清型6B存在大約4.4 μg的量。
於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2 μg至大約2.5 μg的各莢膜多醣、除了選自於由血清型1、3、4、5、6B、9V、19A及19F所組成的群組之至多六種莢膜多醣以外，該等血清型各者存在大約4 μg至大約5 μg的量。於一具體例中，該至多六種莢膜多醣，存在大約4 μg至大約5 μg的量，係選自於由血清型1、3、4、6B、9V、19A及19F所組成的群組。於其他的具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2.2 μg的各莢膜多醣、除了選自於由血清型1、3、4、5、6B、9V、19A及19F所組成的群組之至多六種莢膜多醣以外，該等血清型各者存在大約4.4 μg的量。於一具體例中，該至多六種莢膜多醣，存在大約4.4 μg的量，係選自於由血清型1、3、4、6B、9V、19A及19F所組成的群組。
於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2 μg至大約2.5 μg的血清型1、5、6A、7F、8、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、22F、23F及33F之莢膜多醣，以及大約4 μg至大約5 μg的血清型3、4、6B、9V、19A及19F之莢膜多醣。
於某些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2至大約2.5 μg的血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之莢膜多醣，以及大約4至大約5 μg的血清型3及6B之莢膜多醣。
於一些具體例中，該疫苗或混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以為一種單一0.5 ml劑量，其係調配為含有大約2至大約2.5 μg的血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、9N、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F已及33F之莢膜多醣，以及大約4至大約5 μg的血清型6B之莢膜多醣及大約8至大約9 μg的血清型3之莢膜多醣，以及更佳為大約8.8 μg的血清型3之莢膜多醣。
於某些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物或含有其之疫苗進一步包含氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。
於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以調配為一種液體調配物，其中血清型1及3的肺炎球菌莢膜多醣之各者係與TT共軛以及來自血清型4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了血清型6B為大約4.4 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型1及3)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125至0.250 mg的元素鋁(大約0.5至1.2 mg磷酸鋁)作為佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。
於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以調配為一種液體調配物，其中血清型1及5的肺炎球菌莢膜多醣之各者係與TT共軛以及來自血清型3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。於一具體例中，每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了血清型6B為大約4.4 μg及血清型3為大約2.2-8.8 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型1及5)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125至0.250 mg的元素鋁(大約0.5至1.2 mg磷酸鋁)佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。於某些具體例中，血清型3存在大約2.2 μg。於其他具體例中，血清型3存在大約4.4 μg。於其他具體例中，血清型3存在大約8.8 μg。於再一具體例中，每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了選自於由血清型1、3、4、5、6B、9V、19A及19F所組成的群組之至多六種莢膜多醣為大約4.4 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型1及5)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125 mg至0.250 mg的元素鋁(0.5 mg至1.2 mg磷酸鋁)佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。於一具體例中，大約4.4 μg之該至多六種莢膜多醣係選自於由血清型1、3、4、6B、9V、19A及19F所組成的群組。於另一具體例中，每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了血清型3、4、6B、9V、19A及19F為大約4.4 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型1及5)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125 mg至0.250 mg的元素鋁(0.5 mg至1.2 mg磷酸鋁)佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。於另一具體例中，每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了血清型3及4為大約4.4 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型1及5)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125 mg至0.250 mg的元素鋁(0.5 mg至1.2 mg磷酸鋁)佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。
於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以調配為一種液體調配物，其中血清型3及5的肺炎球菌莢膜多醣之各者係與TT共軛以及來自血清型1、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的莢膜多醣係與CRM197 共軛(21價)。每0.5 mL劑量可以調配成一種含有下列的液體：大約2.2 μg的各莢膜多醣，除了6B為大約4.4 μg；大約2 μg至大約25 μg的TT載體蛋白質(只供用於血清型3及5)及大約40 μg至大約75 μg的CRM197 載體蛋白質；大約0.125至0.250 mg的元素鋁(大約0.5至1.2 mg磷酸鋁)佐劑；以及氯化鈉和琥珀酸鈉緩衝劑作為賦形劑。
於一些具體例中，該液體調配物可以填裝至一種不含防腐劑之單一劑量注射器中。震盪之後，該液體調配物成為均質的、白色懸浮液準備用於肌內投予之疫苗。
該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以以單一注射方式或作為免疫系列的一部分來投予。舉例而言，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以以適當隔開的間隔來投予2次、3次、4次或更多次，例如，以1、2、3、4、5或6個月的間隔或其之組合來投予。於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物係於出生的第一個15個月之內投予給嬰兒4次，包括舉例而言，在年齡大約2、3、4及12-15個月時；在年齡大約3、4、5及12-15個月時；或是在年齡大約2、4、6及12-15個月時。此首次劑量可以盡早於年齡6週大時投予。於另一具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物係於出生的第一個15個月之內投予給嬰兒3次，包括舉例而言，在大約2、4及11-12個月時。
該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物也可包括來自肺炎鏈球菌的一或更多蛋白質。適合含括之肺炎鏈球菌蛋白質之實例包括國際專利申請案WO02/083855內鑑別的該等，以及國際專利申請案WO02/053761內描述的該者。
該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以經由熟習此技藝者已知的一種或多種投予途徑來投予至個體並由此進行調配，該投予方法例如非經腸、經皮或經黏膜、鼻內、肌內、腹膜內、皮內、靜脈內或皮下的途徑。該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物能調配以可與其所欲投予途徑相容。
於一些具體例中，可以藉由肌內、腹膜內、皮下、靜脈內、動脈內、或經皮注射或是呼吸黏膜注射來投予如液體調配物的該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物。該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物能調配呈液體形式或凍乾形式。於一些具體例中，可注射組成物係製備呈慣用的形式，如液體溶液或懸浮液、適合用於液體之溶液或懸浮液之注射前的固體形式，或是如乳劑。於一些具體例中，注射溶液或懸浮液係由無菌粉末或顆粒來製備。供用於此等途徑投予之藥學製劑的調配及製造一般需要考慮的事可以，舉例而言，於Remington’s Pharmaceutical Sciences , 19th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995內找到；其係併入本文以作為參考資料。目前口服或鼻噴霧或氣霧劑(aerosol)途徑(譬如，藉由吸入)最普遍用來直接遞送治療劑至肺及呼吸系統。於一些具體例中，一種混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物係使用一裝置予以投予，該裝置遞送定劑量的組成物。適合用於遞送本文所述之真皮內藥學組成物的裝置包括短針裝置，例如於美國專利號碼4,886,499、美國專利號碼5,190,521、美國專利號碼5,328,483、美國專利號碼5,527,288、美國專利號碼4,270,537、美國專利號碼5,015,235、美國專利號碼5,141,496、美國專利號碼5,417,662(其等全體係併入本文以作為參考資料)內描述的該等。真皮內組成物亦可以透過限制注射針有效刺入皮膚內之長度的裝置予以投予，例如WO1999/34850內描述的該等，其係併入本文以作為參考資料，及其功能等效物。同樣適合的是噴射注射裝置，其經由液體噴射注射器或經由針刺穿角質層且產生噴出物到達真皮，來遞送液態疫苗至真皮。舉例而言於美國專利號碼5,480,381、美國專利號碼5,599,302、美國專利號碼5,334,144、美國專利號碼5,993,412、美國專利號碼5,649,912、美國專利號碼5,569,189、美國專利號碼5,704,911、美國專利號碼5,383,851、美國專利號碼5,893,397、美國專利號碼5,466,220、美國專利號碼5,339,163、美國專利號碼5,312,335、美國專利號碼5,503,627、美國專利號碼5,064,413、美國專利號碼5,520,639、美國專利號碼4,596,556、美國專利號碼4,790,824、美國專利號碼4,941,880、美國專利號碼4,940,460、WO1997/37705及WO1997/13537(其等全體係併入本文以作為參考資料)內描述了噴射注射裝置。同樣適合的是彈道粉末/粒子遞送裝置其使用壓縮氣體來使粉末形式的疫苗加速通過皮膚外層至真皮。此外，古典的芒圖(Mantoux)真皮內投予方法可以使用慣用的注射器。
供非經腸投予之製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液、及乳劑。非水性溶劑之實例為丙二醇、聚乙二醇，油例如橄欖油，及可注射的有機酯例如油酸乙酯。油之實例包括植物油或動物油、花生油、大豆油、橄欖油、向日葵油、肝油、合成油例如水產油，以及得自牛奶或雞蛋之脂質。水性載體包含水、醇/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括食鹽水及緩衝培養基。非經腸媒液包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發油。靜脈內媒液包括流體及營養素補充劑、電解質補充劑(例如以林格氏右旋糖為基的該等)等等。亦可以存在防腐劑及其他的添加劑，例如舉例而言，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及鈍氣等等。
該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物能調配呈單位劑量小瓶、多劑量小瓶或是預填充注射器形式。一種用於液體調配物之藥學上可接受的載體包括水性或非水性溶劑、懸浮液、乳劑或是油。該組成物可以為等滲透壓的、高滲透壓的或低滲透壓的。然而，用於輸液或注射之組成物基本上希望係呈等滲透壓的。因此，等滲透壓性或高滲透壓性可有利於組成物之儲存。當組成物呈高滲透壓，則可以在投予前稀釋該組成物成等滲透壓性。滲性劑(tonicity agent)可為離子型滲性劑例如鹽，或是非離子型滲性劑例如碳水化合物。離子型滲性劑包括，但不限於氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀以及氯化鎂。非離子型滲性劑包括，但不限於山梨醇及甘油。較佳地，包括至少一種藥學上可接受的緩衝劑。舉例而言，在組成物為輸液或注射時，該組成物較佳調配於一種緩衝劑之內，該緩衝劑具有pH 4至pH 10之間的緩衝能力，例如pH 5至pH 9或是pH 6至pH 8。緩衝劑可以選自於那些適用美國藥典(USP)的緩衝劑。舉例而言，緩衝劑可以選自於由下列所組成的群組：一元酸，例如乙酸、苯甲酸、葡萄糖酸、甘油酸及乳酸；二元酸，例如烏頭酸、己二酸、抗壞血酸、碳酸、麩胺酸、蘋果酸、琥珀酸及酒石酸；多元酸例如檸檬酸及磷酸；以及鹼例如氨、二乙醇胺、甘胺酸、三乙醇胺及TRIS。
該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以包含一種界面活性劑。界面活性劑之實例包括，但不限於聚氧乙烯山梨醇酯(polyoxyethylene sorbitan ester) (一般而言稱為妥文(Tweens))，尤其是，聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80；環氧乙烷(EO)、環氧丙烷(PO)、環氧丁烷(BO)之共聚物(例如DOWFAX)；具有不同的乙氧基(氧基-1,2-乙烷二基)基團重複之辛苯聚醇(octoxynol)，尤其是，辛苯聚醇-9(Triton-100)；乙基苯氧基聚乙氧基乙醇(ethylphenoxypolyethoxyethanol)(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂例如卵磷脂；壬基苯酚乙氧醚(nonylphenol ethoxylate)例如TERGITOL NP系列；月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇、油醇衍生的聚氧乙烯脂肪醚(Brij表面活性劑)，尤其是，三乙二醇單月桂基醚(Brij 30)；稱為SPAN之去水山梨醇醚(sorbitan ether)，尤其是，去水山梨醇三油酸酯(Span 85)及去水山梨醇單月桂酸酯。
可以使用界面活性劑混合物例如妥文80/Span 85。聚氧乙烯山梨醇酯如妥文80以及辛苯聚醇如Triton X-100之組合亦適宜。月桂醇聚醚9(Laureth 9)和妥文及/或辛苯聚醇亦為有用的組合。較佳地，含括的聚氧乙烯山梨醇酯(例如妥文80)的量可以為0.01%至1%(w/v)、0.01%至0.1%(w/v)、0.01%至0.05%(w/v)或大約0.02%；含括的辛基酚聚氧乙烯醚(octylphenoxy polyoxyethanol)或壬基酚聚氧乙烯醚(例如Triton X-100)的量可以為0.001%至0.1%(w/v)，尤其是0.005%至0.02%；以及含括的聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)的量可以為0.1%至20%(w/v)，可能為0.1%至10%，尤其是0.1%至1%或是大約0.5%。
於一些具體例中，該混合載體、21價肺炎球菌共軛物組成物可以經由一種釋放控制系統來遞送。舉例而言，可以使用靜脈內輸液、經皮貼片、脂質體或其他的途徑來投予。在一個態樣中，可以使用巨分子例如微球體或植入物。
以上的揭露內容概括地說明本發明。參考以下的特定實施例可以獲得更為全面之理解。此等實施例僅用於舉例說明之目的而非意欲對本發明範圍加以限制。
實施例
實施例1. 肺炎鏈球菌莢膜多醣之製備
肺炎鏈球菌之培養及莢膜多醣之純化係以如同熟習此技藝者已知的方式實施。肺炎鏈球菌血清型係得自於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection) (ATCC) (血清型1：ATCC編號6301；血清型3：ATCC編號6303；血清型4：ATCC編號6304；血清型5：ATCC編號6305；血清型6A：ATCC編號6306；血清型6B：ATCC編號6326；血清型7F：ATCC編號10351；血清型9N：ATCC編號6309；血清型9V：ATCC編號10368；血清型14：ATCC編號6314；血清型18C：ATCC編號10356；血清型19A：ATCC編號10357；血清型19F：ATCC編號6319；血清型23F：ATCC編號6323)。血清型8、10A、11A、12F、15B、22F及33F使用內部菌株(Internal strains)，但也可使用任何公開可得的菌株。肺炎鏈球菌特徵在於莢膜及運動性、革蘭氏陽性(Gram-positive)、柳葉刀型雙球菌，以及在血液瓊脂培養基上為α溶血性。血清型係藉由使用專一性抗血清之抑制(Quelling)測試來鑑定(美國專利號碼5,847,112)。
細胞庫之製備
產生若干代菌種儲備物(seed stocks)俾以擴繁菌株並去除動物源的組份(F1、F2、及F3代)。生產額外的兩代菌種儲備物。額外的第一代係由F3小瓶予以培養，而隨後的一代係由該額外的第一代予以培養。以合成甘油作為低溫保存劑來冷凍(低於-70℃)保存菌種小瓶。於細胞庫製備方面，使所有培養物生長於大豆為基的培養基內。冷凍之前，藉由離心來濃縮細胞，去除用過的培養基，並將細胞沉澱物再懸浮於含有低溫保存劑(諸如合成甘油)之新鮮培養基中。
培養及收穫
將來自工作細胞庫之培養物接種至含有以大豆為基的培養基之菌種瓶之內且予以培養。達到目標光密度(吸光度)之後，使用菌種瓶來接種含有以大豆為基的培養基之發酵器。當光密度值開始保持固定後終止培養。終止培養之後，添加去氧膽酸鈉至培養物以溶解細胞。冷卻生成的發酵器內含物，且誘導蛋白質沈澱。繼而，使混合物離心以移去沈澱的蛋白質及細胞碎片。
純化
從離心獲得的溶液係過濾通過一種深度濾器以移去離心中尚未沈澱的蛋白質及細胞碎片。於一種100 kDa MW膜上濃縮濾液且用10倍體積25 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)來透析過濾濃縮物以獲得一樣本。使樣本過濾以採集懸浮液，可由懸浮液沉澱及過濾多醣。於一種30 kDa膜上濃縮濾液，且使用大約10倍體積之三次蒸餾水來透析過濾濃縮物。執行透析過濾之後，剩餘的溶液係經由0.2 µm濾器予以過濾。對濾液執行一種製程中的控制測試(外觀、剩餘的蛋白質、剩餘的核酸、內毒素、分子量及多醣的總量)。濃縮物予以無菌過濾且儲存於-20℃下。
實施例2. 肺炎鏈球菌莢膜多醣及載體蛋白質共軛物之製備
不同血清型的多醣遵循不同的途徑予以活化然後與載體蛋白質，CRM197 或TT共軛。具體而言，藉由使所有血清型的莢膜多醣各者與CRM197 共軛以及藉由使血清型1、3及5的莢膜多醣各者與TT共軛來製備共軛物。活化的方法取決於天然血清型的大小而可包括減少各莢膜多醣的大小至目標分子量、化學活化以及藉由超過濾予以緩衝劑交換(buffer exchange)。共軛物係使用超過濾來純化以及最終經由0.2 µm濾器予以過濾。方法的參數如pH、溫度、濃度及時間如下。
(1)活化方法
步驟1：水解
還原胺化作用為一種已知用於共軛聚合物的方法，其中一種蛋白質的一級胺(-NH2 )基團與一醣的醛之間形成一醯胺鍵。將醛基加至肺炎球菌莢膜多醣以促進與載體蛋白質共軛。一種單醣的鄰位二元醇結構可以藉由過碘酸鈉(NaIO4 )予以氧化以形成醛基。來自血清型1、3、4、6A、8、11A、12F、14、15B、18C、22F及33F的莢膜多醣係予以預處理如下。
於血清型1的情況中，添加氫氧化鈉(以0.05M的最終鹼濃度)至莢膜多醣溶液，以及於50℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加鹽酸至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型3、8、11A及15B的情況中，添加鹽酸(以0.01M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於60℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加0.1M磷酸鈉至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型4的情況中，添加鹽酸(以0.1M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於45℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加1M磷酸鈉至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型6A的情況中，添加冰醋酸(以0.1M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於60℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加1M氫氧化鈉至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型12F的情況中，添加鹽酸(以0.01M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於70℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加0.1M磷酸鈉至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型14及18C的情況中，添加冰醋酸(以0.2M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於94±2 ℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加1M磷酸鈉至該處以使溶液的最終pH為6.0±0.1，藉此中止水解。
於血清型22F及33F的情況中，添加鹽酸(以0.01M的最終酸濃度)至莢膜多醣溶液，以及於60℃±2℃下孵育溶液。接而將該溶液冷卻到大約21℃至大約25℃範圍的溫度下，以及添加0.1M磷酸鈉至該處達最終pH 6.0±0.1，藉此中止水解。
每種所獲得的莢膜多醣係用注射用水(WFI)、乙酸鈉及磷酸鈉予以稀釋至介於大約1.0 mg/mL和大約2.0 mg/mL之間的最終濃度。
步驟2：過碘酸鹽反應
用於每種肺炎球菌醣類活化之過碘酸鈉的莫耳當量係根據重複單元莫耳質量來確定。在充分混合下，所有的血清型都在21℃至25℃下進行氧化反應歷時16至20小時，除了血清型1、7F，及19F以外，其溫度為10℃或更低。為了幫助維持一致且穩定的共軛物生產，所以設定共軛方法期間每種血清型的氧化程度(Do)位準範圍。表1及表2顯示每種血清型的Do位準之較佳的、設定範圍。
表1.要與CRM197 共軛的所有血清型之Do範圍
表2.要與TT共軛的血清型1、3及5之Do範圍
步驟3：超過濾
將氧化的醣類濃縮以及用WFI於100 kDa MWCO超濾器(就血清型1而言為30kDa超濾器以及就血清型18C而言為5 kDa超濾器)上予以透析過濾。血清型1之透析過濾係使用0.9%氯化鈉溶液來進行，就血清型7F及23F而言為0.01M乙酸鈉緩衝劑(pH 4.5)，以及就血清型19F而言為0.01M磷酸鈉緩衝劑(pH 6.0)。丟棄滲透物且經由0.2 µm濾器來過濾滲餘物。
步驟4：冷凍乾燥
關於要藉由使用水性溶劑來使與血清型3、4、5、8、9N、9V、10A、14、15B、22F及33F的莢膜多醣與載體蛋白質進行共軛方面，在不添加更多蔗糖之下來製備多醣與載體蛋白質的混合溶液、冷凍乾燥，然後儲存於-25℃ ± 5℃。
關於要藉由使用水性溶劑使與血清型1及18C的莢膜多醣與載體蛋白質進行共軛方面，在不添加更多蔗糖之下，獨立地製備多醣與載體蛋白質、冷凍乾燥，然後儲存於-25℃ ± 5℃。
關於要藉由使用DMSO溶劑使與血清型6A、6B、7F、19A、19F及23F的莢膜多醣與載體蛋白質進行共軛方面，添加要達成5 % ±3 % (w/v)之最終蔗糖濃度之預定量的蔗糖至經活化的醣類，以及獨立地製備樣本、冷凍乾燥，然後儲存於-25℃ ± 5℃。
關於血清型11A的莢膜多醣，添加要達成20 % ± 5 % (w/v)之最終蔗糖濃度之預定量的蔗糖至經活化的醣類，以及獨立地製備多醣與載體蛋白質、冷凍乾燥，然後儲存於-25℃ ± 5℃。
關於血清型12F的莢膜多醣，添加要達成10 % ± 5 % (w/v)之最終蔗糖濃度之預定量的蔗糖至經活化的醣類，以及獨立地製備多醣與載體蛋白質、冷凍乾燥，然後儲存於-25℃ ± 5℃。
(2)共軛方法
血清型1、3、4、5、8、9N、9V、10A、14、15B、18C、22F及33F實施水性共軛，以及血清型6A、6B、7F、11A、12F、19A、19F及23F實施DMSO共軛。每種莢膜多醣係以0.2至2:1之比率與載體蛋白質共軛。
步驟1：溶解
水性 共軛
在血清型1、3、4、5、8、9N、9V、10A、14、15B、18C、22F及33F方面，於室溫下解凍且平衡經冷凍乾燥的樣本。經冷凍乾燥的樣本係以各血清型設定的比率、於23±2℃下、藉由使用磷酸鈉緩衝劑溶液予以重組成反應濃度。
二甲亞碸(DMSO) 共軛
關於血清型6A、6B、7F、11A、12F、19A、19F及23F方面，經冷凍乾燥的樣本係於室溫下解凍、平衡且重組於DMSO之內。
步驟2：共軛反應
水性 共軛
關於血清型3-TT、4、5、5-TT、8、9N、9V、10A、14、15B、18C、22F及33F方面，透過添加氰基硼氫化鈉溶液(100 mg/mL)達每莫耳醣類為1.0至1.4莫耳的氰基硼氫化鈉來起始共軛反應。然而，關於血清型1、1-TT及3，透過添加氰基硼氫化鈉溶液達每莫耳醣類為0.5莫耳的氰基硼氫化鈉來起始反應。
反應混合物係於23℃至37℃下孵育歷時44至106小時。根據血清型來調整反應溫度和時間。接而將溫度降低至23℃±2℃以及添加氯化鈉0.9%至反應器。添加硼氫化鈉溶液(100 mg/mL)以達到每莫耳醣類為1.8至2.2莫耳當量的硼氫化鈉。混合物於23℃±2℃孵育歷時3至6小時。此程序減少醣類上存在的任何未反應的醛類。繼而，該混合物用氯化鈉溶液0.9%予以稀釋以及經稀釋的共軛物混合物係使用一種0.8或0.45 µm預濾器予以過濾。
DMSO 共軛
關於血清型6A、6B、7F、11A、12F、19A、19F及23F之莢膜多醣，透過添加氰基硼氫化鈉溶液(100 mg/mL)達每莫耳經活化的醣類為0.8至1.2莫耳當量的氰基硼氫化鈉之比率來起始共軛反應。將WFI添加至反應混合物以達1 %(v/v)的標的濃度，以及於23℃±2℃下孵育混合物歷時12至26小時。將100 mg/mL的硼氫化鈉溶液(典型每莫耳經活化的醣類為1.8至2.2莫耳當量的硼氫化鈉)和WFI(標的5% v/v)添加至反應以及於23℃±2℃孵育混合物歷時3至6小時。此程序減少醣類上存在的任何未反應的醛類。繼而，反應混合物用氯化鈉溶液0.9%予以稀釋，以及經稀釋的共軛物混合物係使用一種0.8或0.45 µm預濾器予以過濾。
步驟3：超過濾
將經稀釋的共軛物混合物濃縮以及用最少15倍體積的0.9%氯化鈉或緩衝劑、於100 kDa MWCO超過濾濾器或300 kDa MWCO超過濾濾器上實施透析過濾。並且，此方法中使用的組成物及緩衝劑的pH取決於每種血清型而變化。
步驟4：無菌過濾
超過濾後的滲餘物係予以無菌過濾(0.2 µm)，以及經過濾的共軛物執行製程中的控制(外觀、游離的蛋白質、游離醣、分子大小分佈、無菌、醣含量、蛋白質含量、pH、內毒素、殘留的氰化物、殘留的DMSO、醣類鑑定、TT鑑定及CRM197 鑑定)。最終的濃縮物冷藏並儲存於2℃至8℃。
實施例3. 多價肺炎球菌共軛物疫苗之調配
根據批料體積和本體醣類濃度來計算實施例2獲得之最終的本體濃縮物所需的體積。在添加0.85%氯化鈉(生理食鹽水)、聚山梨醇酯80和琥珀酸鹽緩衝劑至預先標記的調配物器皿之後，添加本體濃縮物。接而充分混合製備物以及經由0.2 µm膜予以無菌過濾。在添加本體磷酸鋁的期間及之後輕輕地混合經調配的本體。檢查pH且設若必需的話便調整pH。經調配的本體產物儲存於2至8℃。製備下列非限制性多價肺炎球菌共軛物疫苗調配物且命名為PCV21(1/5)-TT及PCV21(3/5)-TT：
藉由使血清型1及5的各多醣與TT共軛以及血清型3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的各多醣與CRM197 共軛來製備含括多醣共軛物之PCV21(1/5)-TT；以及
藉由使血清型3及5的各多醣與TT共軛以及血清型1、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的各多醣與CRM197 共軛來製備含括多醣共軛物之PCV21(3/5)-TT。
總劑量0.5 mL的PCV21(1/5)-TT組成物含括2.2 μg的各多醣，除了血清型6B為4.4 μg之外；2 ug至25 ug的TT(供用於血清型1及5)及40 μg至75 μg的CRM197 ；0.125 mg的元素鋁(0.5 mg磷酸鋁)佐劑；4.25 mg的氯化鈉；大約295 μg的琥珀酸鹽緩衝劑溶液；以及大約100 μg的聚山梨醇酯80於總計0.5 ml劑量內。於某些具體例中，PCV21(1/5)-TT組成物內的血清型3多醣的量增加到4.4 μg或8.8 μg。於某些具體例中，PCV21(1/5)-TT組成物內的血清型3、4、6B、9V、19A及19F各者多醣的量增加到4.4 μg。
總劑量0.5 mL之PCV21(3/5)-TT組成物分別含括2 μg至25 μg 的TT(供用於血清型3及5)及40 μg至75 μg CRM197 ，且其他的組分及其含量與PCV21(1/5)-TT之該等完全相同。於某些具體例中，0.5 mL劑量內的元素鋁的量增加到0.250 mg。
實施例4. 多價肺炎球菌共軛物疫苗之 免疫原性
測試實施例3內製備的混合載體、多價肺炎球菌疫苗，PCV21(1/5)-TT及PCV21(3/5)-TT於兔子體內誘發免疫性反應的能力。免疫原性評估係藉由關於血清IgG濃度之抗原專一性的ELISA以及關於抗體功能性之調理吞噬分析(opsonophagocytic assay) (OPA)來執行。在第0週和第2週用每種多醣有比計劃的人類臨床劑量更高5%之劑量(每種多醣2.31 μg，除了6B為4.62 μg之外)於調配物內或人類劑量(每種多醣2.2 ug，除了6B為4.4 μg之外)來肌內免疫紐西蘭白兔。免疫作用後的每2週取樣血清。二種濃度均顯示相同的結果。
4-1. PCV21(3/5)-TT
血清型專一性IgG 濃度測量
每種血清型之莢膜多醣(PnPs)係以0.5 μg/孔至1 μg/孔塗覆於96孔平盤。從各個個體取樣相等量的血清以及按組別來混合。用包含妥文20及得自於Statens Serum Institut之肺炎球菌細胞壁多醣(CWPS) (5 ug/mL)之抗體稀釋緩衝劑、以2.5倍來連續稀釋血清池然後於室溫下反應歷時30分鐘。用清洗緩衝劑來清洗平盤5次然後預先吸收且添加稀釋的血清50 uL至塗覆的孔狀平盤，接著於室溫下孵育歷時2小時至18小時。以相同方式清洗孔狀平盤然後添加山羊抗兔IgG-鹼性磷酸酶共軛物至各孔，接著於室溫下孵育歷時2小時。以如上所述的方式來清洗平盤以及添加作為受質之1 mg/mL對硝基苯胺緩衝劑至各孔然後於室溫下反應歷時2小時。透過添加50 uL的3 M NaOH來驟冷該反應以及測量405 nm和690 nm之吸光度。商業上可得的13價疫苗(沛兒13)經過相同的程序作為比較實施例。結果顯示於表3內。
表3. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的IgG濃度(U/mL)
和血清型3及5的莢膜多醣與CRM197 共軛所得到者相比，當其等與TT共軛時，血清型專一性IgG濃度顯著地增高。用PCV21(3/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之IgG濃度顯著增加。特別地，與沛兒13相比，當血清型9N與0.125 mg及0.250 mg的鋁一起投予時，血清專一性IgG濃度分別有出乎意料40倍及50倍的增加。並且，PCV21(3/5)-TT中一些其他的血清型莢膜多醣顯示出比沛兒13顯著更高的血清專一性IgG濃度位準。
功能性免疫原性試驗(MOPA)
抗體功能係藉由以MOPA分析來測試血清予以評估。儲存在-70℃或更低之下的肺炎鏈球菌MOPA菌株係稀釋至對應的最終稀釋倍數以使得各菌株的濃度為大約50,000 CFU/mL。從各個個體取樣相等量的血清，按組別來混合以及以2倍來連續稀釋以使得餘留20 μl的血清於U底平盤內。稀釋樣本之後，將各血清型製備的10 μl菌株和稀釋的樣本混合，以及使混合物於室溫下反應歷時30分鐘以使得肺炎鏈球菌及抗體充分混合。添加預先分化的(pre-differentiated)HL-60細胞及補體的混合物以及於CO2 恆溫箱(37℃)內反應歷時45分鐘。降低溫度以中止吞噬作用以及將10 uL的反應溶液沾至預先乾燥30至60分鐘的瓊脂平盤之上，然後允許被吸收至平盤之上歷時20分鐘直至乾燥。添加25 mg/mL TTC儲備物溶液至製備的覆蓋瓊脂，以及添加適合相應的菌株之抗體至該處。使混合物充分混合，然後添加大約25 mL的混合物至平盤之上以及硬化大約30分鐘。於CO2 恆溫箱(37℃)內孵育完全硬化的平盤歷時12至18小時然後計算菌落。MOPA力價表達為觀察到50%致死的稀釋率。商業上可得的13價疫苗(沛兒13)經過相同的程序作為比較實施例。結果顯示於表4之內。
表4. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的MOPA力價
和血清型3及5與CRM197 共軛所得到的MOPA力價相比，其等與TT共軛時之功能性MOPA力價顯著增加。用PCV21(3/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之各者的功能性MOPA力價顯著增加。
4-2. PCV21(1/5)-TT
血清型專一性IgG濃度及功能性免疫原性力價係以如同4-1中相同的方式測量，以及結果顯示如下。測試三種不同的PCV21(1/5)-TT具體例：一者具有來自血清型3之莢膜多醣2.2 µg("3-CRM197 2.2")、一者具有來自血清型3之莢膜多醣4.4 µg("3-CRM197 4.4")且一者具有來自血清型3之莢膜多醣8.8 µg("3-CRM197 8.8")。
血清型專一性IgG 濃度測量
表5. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的IgG濃度(U/mL)
和血清型1及5的莢膜多醣與CRM197 共軛所得到者相比，當其等與TT共軛時，血清型專一性IgG濃度顯著地增高。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之IgG濃度顯著增加。再次地，與沛兒13相比，血清型9N出乎意料地顯示出顯著增高(大約32-至46-倍的增高)。並且，PCV21(1/5)-TT中一些其他的血清型莢膜多醣顯示出比沛兒13顯著更高的血清專一性IgG濃度位準。也觀察到血清型3抗原的量從2.2 µg加倍到4.4µg出乎意料地使血清型1、3、5、6A、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、18C、19A、22F及23F的血清專一性IgG濃度增高，且血清型1及7F的增高超過2倍。
功能性免疫原性試驗(MOPA)
表6. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的MOPA力價
和血清型1及5與CRM197 共軛所得到的MOPA力價相比，其等與TT共軛時之功能性MOPA力價顯著增加。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之各者的功能性MOPA力價顯著增加。並且，數種其他的血清型顯示出比沛兒13顯著更高的功能性MOPA力價位準。也觀察到血清型3抗原的量從2.2 µg加倍到4.4µg出乎意料地使血清型4、15B及19F以外的各血清型之血清專一性IgG濃度增高，且血清型1的增高超過4.5倍。
4-3. PCV21(1/5)-TT
以具有來自血清型3之莢膜多醣2.2 µg("3-CRM197 2.2")之PCV21(1/5)-TT具體例、具有來自血清型3之莢膜多醣4.4 µg("3-CRM197 4.4")之PCV21(1/5)-TT具體例，及具有來自血清型3、4、6B、9V、19A及19F之莢膜多醣4.4 µg("多-CRM197 4.4")之PCV21(1/5)-TT具體例來重複4-2實驗。血清型專一性IgG濃度及功能性免疫原性力價係以如同4-1中相同的方式測量，以及結果顯示如下。
血清型專一性IgG 濃度測量
表7. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的IgG濃度(U/mL)
如同4-2，和血清型1及5的莢膜多醣與CRM197 共軛所得到者相比，其等與TT共軛時之血清型專一性IgG濃度顯著地增高。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之IgG濃度顯著增加，且血清型4之莢膜多醣顯示出比沛兒13顯著更高的血清專一性IgG濃度位準。也觀察到血清型3抗原的量從2.2 µg加倍到4.4µg出乎意料地使除了三個以外的所有血清型之血清專一性IgG濃度增高。也可以使用更高劑量的多血清型，如同PCV21(1/5)-TT具體例所示，其中血清型3、4、6B、9V、19A及19F的量從2.2 µg增加到4.4µg("多-CRM197 4.4")。
功能性免疫原性試驗(MOPA)
表8. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的MOPA力價
如同4-2，和血清型1及5與CRM197 共軛所得到的功能性免疫原性相比，其等與TT共軛時之功能性免疫原性獲得改良。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在、與CRM197 共軛的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之各者的功能性MOPA力價顯著增加。也可以使用更高劑量的多血清型，如同PCV21(1/5)-TT 多-CRM197 4.4所示，其中血清型3、4、6B、9V、19A及19F的量從2.2 µg增加到4.4µg。
4-4. PCV21(1/5)-TT
以具有來自血清型3及4之莢膜多醣4.4 µg("3,4-CRM197 4.4")之PCV21(1/5)-TT具體例來重複4-2實驗。血清型專一性IgG濃度及功能性免疫原性力價係以如同4-1中相同的方式測量，以及結果顯示如下。
血清型專一性IgG 濃度測量
表9. 3,4-CRM197 4.4之21種血清型於二次免疫作用2週之後的IgG濃度(U/mL)
和血清型1及5的莢膜多醣與CRM197 共軛所得到者相比，其等與TT共軛時之血清型專一性IgG濃度顯著地增高。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之IgG濃度顯著增加。也觀察到血清型3及血清型4抗原的量從2.2 µg加倍到4.4µg顯示出比沛兒13顯著更高的血清專一性IgG濃度位準。也可以使用更高劑量的多血清型，如同PCV21(1/5)-TT具體例所示，其中血清型3及4的量從2.2 µg增加到4.4µg(“3,4-CRM197 4.4”)。
功能性免疫原性試驗(MOPA)
表10. 21種血清型於二次免疫作用2週之後的MOPA力價
和血清型1及5與CRM197 共軛所得到的功能性免疫原性相比，其等與TT共軛時之功能性免疫原性獲得改良。用PCV21(1/5)-TT免疫的兔子亦展現出對沛兒13內不存在、與CRM197 共軛的八種額外的血清型(即，8、9N、10A、11A、12F、15B、22F及33F)之各者的功能性MOPA力價顯著增加。也可以使用更高劑量的多血清型，如同PCV21(1/5)-TT 3,4-CRM197 4.4所示，其中血清型3及4的量從2.2 µg增加到4.4µg。
實施例5. 關於來自肺炎鏈球菌血清型9N 的醣- 蛋白質共軛物之製備的額外細節
細胞庫之製備
肺炎鏈球菌血清型9N(ATCC 6309)係自美國菌種保存中心(ATCC)獲得。為了菌株增殖並去除動物源的組份，培養若干代菌種儲備物。儲備物小瓶和作為低溫保存劑之合成甘油一起保存於冷凍機內(＜-70℃)。於細胞庫製備方面，使細胞培養物於大豆為基的培養基內增殖。冷凍之前，藉由離心來濃縮細胞且，於去除用過的培養基之後，將細胞沉澱物再懸浮於含有低溫保存劑(諸如合成甘油)之新鮮培養基中。
發酵
將來自細胞庫之培養物接種至含有以大豆為基的培養基之菌種瓶內。在沒有攪拌的情況下於恆溫孵育培養物，直到滿足生長條件。使用菌種瓶將培養物接種至含有以大豆為基的培養基之菌種發酵器之內，且控制溫度、pH及攪拌速度。生長停止或到達發酵器之工作容量後終止發酵。藉由添加去活化劑以終止發酵之後，使用連續流離心法及過濾之組合以移去細胞碎片。
純化
肺炎球菌多醣純化方法係由多層過濾、重複濃縮/透析過濾及過濾/沖提所組成。
活化
藉由依序添加計算出用量的WFI而將最終多醣濃度調整至大約2.0 g/L。若需要，將反應pH調整至大概6.0。在調整pH之後，將反應溫度調整至21-25 ℃。每1 mg糖添加大概0.024-0.189 mg的過碘酸鈉來起始氧化作用。氧化反應在21-25 ℃下進行約16-20小時。
經活化的多醣的濃縮及透析過濾係使用100-kDa MWCO超過濾膜進行。透析過濾係以透析過濾體積之10倍體積的WFI進行。接著，將純化的經活化的多醣儲存在2-8 ℃下。純化的經活化的醣特徵在於(i)以比色檢定法判定的醣濃度，(ii)以比色檢定法判定的醛濃度，(iii)氧化程度及(iv)以SEC-MALLS測得的分子量。
SEC-MALLS係用於判定多醣及多醣-蛋白質共軛物之分子量。SEC係根據流體力學體積來分離多醣。折射率(RI)檢測器及多角雷射光散射(MALLS)檢測器係用於判定分子量。當光與物質反應時，光會散射。散射光之量與濃度、dn/dc之平方(比折射率增量)及物質的莫耳質量有關。分子量係以來自MALLS檢測器之散射光信號及來自RI檢測器之濃度信號為基準來計算。
經活化的多醣之氧化程度(DO)係以糖重複單元莫耳數除以醛莫耳數來判定。糖重複單元莫耳數係以多種比色技術來測定，例如使用蒽酮檢定法。並且，醛莫耳數係以帕克-傑克森(Park-Johnson)比色檢定法來測定。
使用以上所述的此等技術，確定藉由以上所述的方法所獲得的經活化的肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣有2-19的氧化程度，更典型為5-10的氧化程度，及大約200-700 kDa的分子量。
共軛
以每1g經活化的多醣為0.5-2 g的CRM197 之比率，將經活化的多醣與載體蛋白質CRM197 摻合。接著，將摻合的混合物冷凍乾燥。經活化的多醣與CRM197 的冷凍乾燥混合物儲存在-20 ℃下。
經活化的多醣與CRM197 的冷凍乾燥混合物係在0.1 M磷酸鈉溶液內重組然後充分混合。在反應溶液中的最終多醣濃度為大約10-20 g/L。藉由添加1.0-1.2莫耳當量的氰基硼氫化鈉(NaBH3 CN)至反應混合物而起始共軛作用之後，反應在35-39℃下進行44-52小時。藉由添加如同共軛反應溶液相同體積的0.9%氯化鈉溶液而終止共軛反應，然後添加1.8-2.2莫耳當量的硼氫化鈉(NaBH4 )以將未反應之醛封蓋。封蓋反應在21-25℃下進行3-6小時。
用0.9%氯化鈉溶液來稀釋共軛物溶液供用於使用100-kDa MWCO膜之濃縮及透析過濾。經稀釋的共軛物溶液係通過一種0.8-0.45 µm濾器予以過濾且透過濃縮及透析過濾予以純化。使用100-kDa MWCO膜之透析過濾係使用15-40倍透析過濾體積之0.9%氯化鈉溶液來進行。在完成透析過濾之後，剩餘的溶液通過0.2 μm濾器來過濾。將共軛物溶液稀釋至低於大概0.55 mg/mL的濃度，無菌過濾然後儲存於2-8℃。
經純化之血清型9N共軛物特別是特徵在於(i)以比色(洛瑞(Lowry))檢定法判定的蛋白質濃度，(ii)以比色檢定法判定的醛濃度，(iii)醣對蛋白質比率，(iv)以粒徑篩析層析法(CL-4B)判定的分子大小分佈及(v)以SEC-MALLS測得的分子量。
改變氧化程度(DO)時，觀察到血清型9N共軛物之特徵變化。結果總結於表11中。
表11
改變冷凍乾燥期間該經活化的多醣與CRM197 之摻合比率時，觀察到血清型9N共軛物之特徵變化。結果總結於表12中。
表12
改變共軛反應溶液內的多醣濃度時，觀察到血清型9N共軛物之特徵變化。結果總結於表13中。
表13
實施例6. 免疫原性之分析
調配一種含有與CRM197 共軛之肺炎鏈球菌血清型9N醣-蛋白質共軛物的單價共軛物組成物。
表11-13之單價免疫性組成物之免疫原性係透過ELISA來分析。測定血清型專一性IgG之血清濃度。
五隻稱重2.5-3.5 kg的雌性紐西蘭白兔係於第0週時用建議人類臨床劑量(共軛物2.2 μg；+ 0.25 mg/mL鋁如同AlPO4 )經由肌內途徑予以免疫。於第2週時再次以相同劑量的共軛物疫苗來免疫兔子並於第4週取血液樣本。於第0週及第4週進行血清樣本之血清型專一性ELISA。
表14顯示出分析結果。用單價共軛物組成物(共軛物編號8)免疫的兔子顯示出對於血清型9N之總IgG力價顯著增加。用其他共軛物免疫的兔子亦顯示出總IgG力價顯著增加。
表14顯示用表12的共軛物編號8免疫兔子之後測量IgG濃度的結果。
表14
雖然本說明書內已經描述一或更多例示具體例，但是熟習此項技術者應瞭解於形式及細節上可做出各種變化而不偏離如下列申請專利範圍所定義之本發明概念之精神及範疇。
參考文獻
本申請案內引述下列參考文獻且提供關於本技術領域之一般資訊以及提供本申請案所討論之分析法及其他的細節。下列參考文獻係以其等之整體併入以作為參考資料。
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Claims (21)

  1. 一種混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其包含21種不同的肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物，其中各肺炎球菌莢膜多醣-蛋白質共軛物包含與來自一不同肺炎鏈球菌血清型之一莢膜多醣共軛的一蛋白質載體，其中該肺炎鏈球菌血清型係選自於1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F， 其中該蛋白質載體為CRM197 或破傷風類毒素，以及 其中該莢膜多醣中的二者係與破傷風類毒素共軛且該剩餘的莢膜多醣係與CRM197 共軛，其中與破傷風類毒素共軛之該二莢膜多醣係選自於由血清型1、3及5所組成的群組。
  2. 如請求項1之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中來自血清型1及5的該莢膜多醣係與該破傷風類毒素共軛，以及來自血清型3、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
  3. 如請求項1之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中來自血清型1及3的該莢膜多醣係與該破傷風類毒素共軛，以及來自血清型4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
  4. 如請求項1之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中來自血清型3及5的該莢膜多醣係與該破傷風類毒素共軛，以及來自血清型1、4、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F的該莢膜多醣係與CRM197 共軛。
  5. 如請求項1至4中任一項之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其進一步包含一佐劑。
  6. 如請求項5之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中該佐劑係一鋁基(aluminum-based)佐劑。
  7. 如請求項6之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中該佐劑係選自於由磷酸鋁、硫酸鋁和氫氧化鋁所組成的群組。
  8. 如請求項7之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中該佐劑係磷酸鋁。
  9. 如請求項1至8中任一項之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物，其中： 來自血清型9N的該莢膜多醣係與CRM197 共軛，其係於以下狀態：來自血清型9N的該莢膜多醣係經活化成具有2-19或5-10的氧化程度及200-700 kDa的分子量； 來自血清型9N的該莢膜多醣與CRM197 之間形成的該共軛物具有500-4,000 kDa的分子量； 來自血清型9N的該莢膜多醣與CRM197 之間形成的該共軛物內來自血清型9N的該莢膜多醣與CRM197 的比率(W/W)為0.5-2.5；及/或 來自血清型9N的該莢膜多醣與CRM197 之間形成的該共軛物之15-60%於一CL-4B管柱內具有0.3或更低的Kd 。
  10. 一種如請求項1至9中任一項之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物的用途，其係用於在一個體中預防肺炎鏈球菌感染或疾病。
  11. 一種疫苗，其包含如請求項1-9中任一項之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物及一藥學上可接受的賦形劑。
  12. 一種用於在一個體中預防肺炎鏈球菌感染或疾病的方法，該方法包含將一預防有效量的如請求項1-9中任一項之混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物或如請求項11之疫苗投予至該個體。
  13. 如請求項12之方法，其中該個體為一至少50歲的人類且該疾病為肺炎或侵入性肺炎球菌疾病(IPD)。
  14. 如請求項12之方法，其中該個體為一至少6週的人類且該疾病為肺炎、侵入性肺炎球菌疾病(IPD)或急性中耳炎(AOM)。
  15. 如請求項14之方法，其中該個體為6週至5歲、2至15個月或6至17歲。
  16. 如請求項10之用途或如請求項12-15中任一項之方法，其中該個體為一人類。
  17. 如請求項12-16中任一項之方法，其中該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物或該疫苗係藉由肌內注射來投予。
  18. 如請求項12-17中任一項之方法，其中該混合載體、多價肺炎球菌共軛物組成物或該疫苗係作為一免疫系列(immunization series)的部分來投予。
  19. 一種用於製備一肺炎鏈球菌血清型9N之免疫原性共軛物的方法，其包含： (a) 溶解一生產肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣的細菌細胞，其係藉由發酵該細胞； (b) 從該溶解的細胞純化肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣； (c) 藉由與一氧化劑反應而使該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣活化以達到2-19或5-10的氧化程度；以及 (d) 藉由混合該經活化的血清型9N多醣與一蛋白質載體而形成有該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣結合至該蛋白質載體之一共軛物，其中該蛋白質載體為CRM197 。
  20. 如請求項19之方法，其中於步驟(d)混合的CRM197 係與一還原劑反應以形成具有該經活化的血清型9N多醣之該共軛物。
  21. 如請求項19或20之方法，其中： 於步驟(c)中，0.02-0.19 μg的過碘酸鹽與1 μg的該肺炎鏈球菌血清型9N莢膜多醣係於20-25 ℃下反應歷時15-20小時； 於步驟(d)中與該CRM197 混合的該經活化的血清型9N多醣具有200-700 kDa的分子量； 於步驟(d)中形成的該共軛物具有500-4,000 kDa的分子量； 該CRM197 與該經活化的血清型9N莢膜多醣之一起始投入比率為0.5-2.5:1；及/或 於步驟(d)中形成的該共軛物之至少15-60%於一CL-4B管柱中具有0.3或更低的Kd 。
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