CN103347862B

CN103347862B - 包含潜在的1,3-偶极-官能化合物的方法和由此制备的材料

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Publication number: CN103347862B
Application number: CN201180057007.1A
Authority: CN
Inventors: G-J.布恩斯; F.弗里斯库尔特; P.A.勒丁; N.E.姆布亚
Original assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2018-07-20
Anticipated expiration: 2031-09-27
Also published as: EP2621905A2; CN103347862A; US20130310570A1; US9315468B2; WO2012047663A3; EP2621905B1; EP2621905A4; WO2012047663A2

Abstract

本文公开包括潜在的1,3‑偶极‑官能化合物的方法。所述潜在的1,3‑偶极‑官能化合物(例如肟)可用于形成活性的1,3‑偶极‑官能化合物(例如腈氧化物)，后者可用于在偶极环加成反应中与环状炔烃反应。

Description

包含潜在的1,3-偶极-官能化合物的方法和由此制备的材料

本申请要求2010年9月27日递交的美国临时申请第61/386841号的权益，其通过引用以其全部结合到本文中。

政府资助

本发明在美国国家卫生研究院的国立癌症研究所(R01 CA88986, G.-J.B.)、国家科学基金会植物基因组计划(IOS-0923992, G.-J.B.)和国家科学基金会(CHE-0449478,V.V.P.)的政府支持下进行。政府对本发明具有一定权利。

背景

已经发现环辛炔与叠氮化物的不含金属的点击环加成反应(clickcycloadditions)得到稳定的1,2,3-三唑，这在标记活细胞的聚糖、蛋白和脂质；蛋白质组学的糖蛋白富集、蛋白和寡核苷酸修饰；以及组织再造工程学方面具有广泛用途。已经铸成“应变促进的炔-叠氮化物环加成反应(SPAAC)”的这些反应，也已经进入材料科学，并且例如已经用于树形分子(dendrimers)的装配、交联和表面修饰；聚合物与纳米结构的衍生化；以及表面的图案修饰。

尽管使叠氮化物与末端炔烃反应具有明显效用，在使用这种反应的生物系统的应用实际上已经受到包括不合需要地存在铜催化剂的因素的限制。因此，对新的生物正交反应(bioorthogonal reactions)继续存在未满足的需求。

概述

在一个方面，本公开提供制备杂环化合物的方法和由此制备的杂环化合物。在一个实施方案中，这种方法包括：提供至少一种潜在的1,3-偶极-官能化合物；把所述至少一种潜在的1,3-偶极-官能化合物转化为至少一种活性的1,3-偶极官能化合物；使所述至少一种活性的1,3-偶极官能化合物与至少一种环状炔烃接触；和使所述至少一种活性的1,3-偶极-官能化合物与所述至少一种环状炔烃，在有效用于环加成反应(例如 [3+2]偶极环加成反应)以形成杂环化合物的条件下，优选地在基本上没有添加的催化剂下反应。任选地，在所述至少一种环状炔烃存在下实施把所述至少一种潜在的1,3-偶极-官能化合物转化为所述至少一种活性的1,3-偶极官能化合物。

在另一方面，本公开提供制备具有一个或多个杂环基的化合物的方法和由此制备的化合物。在一个实施方案中，这种方法包括：合并包括第一组分(具有第一种1,3-偶极-官能团(例如叠氮基))、第二组分(具有潜在的1,3-偶极-官能团，后者可转化为不同于第一种1,3-偶极官能团的第二种活性1,3-偶极官能团)和环状炔烃的组分；使具有第一种1,3-偶极-官能团的第一种组分与环状炔烃，在有效用于环加成反应(例如 [3+2]偶极环加成反应)以形成第一杂环基的条件下反应；把第二种组分的潜在的1,3-偶极-官能团转化为第二种活性1,3-偶极官能团；和使具有第二种活性1,3-偶极-官能团的第二种组分与环状炔烃，在有效用于环加成反应(例如[3+2]偶极环加成反应)以形成第二杂环基的条件下反应。优选地，有效形成一种或两种杂环基的条件包括基本上没有所添加的催化剂。在一些实施方案中，单一化合物包括第一种组分和第二种组分。在其它的实施方案中，第一种组分和第二种组分为不同的化合物。

对于本文描述的方法的某些实施方案，一种或多种潜在的1,3-偶极-官能化合物和/或基团可为肟，和将一种或多种潜在的1,3-偶极-官能化合物和/或基团转化为一种或多种活性的1,3-偶极官能化合物和/或基团可包括将肟转化为腈氧化物。广泛种类的方法可用于将肟转化为腈氧化物。例如，用于将肟转化为腈氧化物的合适方法包括使用温和的氧化剂例如[双(乙酰氧基)碘]苯(BAIB)直接氧化。

对于本文描述的方法的其它某些实施方案，一种或多种潜在的1,3-偶极-官能化合物和/或基团可为亚氨酰氯，和将一种或多种潜在的1,3-偶极-官能化合物和/或基团转化为一种或多种活性的1,3-偶极官能化合物和/或基团可包括把亚氨酰氯转化为腈氧化物。广泛种类的方法可用于把亚氨酰氯转化为腈氧化物。例如，用于把亚氨酰氯转化为腈氧化物的合适方法包括例如用弱碱处理。

广泛种类的环状炔烃可用于本文公开的方法中，包括但不限于环辛炔、单芳基环辛炔和二芳基环辛炔。

示例性的二芳基环辛炔包括下式的二苯并环辛炔：

式I

其中：每一个R¹独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸酯、亚硝酸酯、硫酸酯和C1-C10有机基团；每一个R²独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸酯、亚硝酸酯、硫酸酯和C1-C10有机基团；X代表C=O、C=N-OR³、C=N-NR³R⁴、CHOR³、CHNHR³、BR³、NR³、O、SiR³R⁴、PR³、O=PR³或卤素；和每一个R³和R⁴独立地代表氢或有机基团。优选的环状炔烃包括式I的那些环状炔烃，其中每一个R¹代表氢，每一个R²代表氢；X代表CHOR³；和R³选自烷基、芳基、烷芳基和芳烷基。

另外的示例性二芳基环辛炔包括下式的氮杂-二苯并环辛炔：

式II

其中：每一个R¹独立地代表H或有机基团，R²代表-C(O)-R⁴基团；和R⁴代表有机基团。在一些实施方案中，每一个R¹为氢。

进一步的另外的示例性二芳基环辛炔包括下式的氮杂-二苯并环辛炔：

式III

其中：每一个R¹独立地代表H或有机基团；R²代表有机基团。在一些实施方案中，每一个R¹为氢。

示例性的环辛炔包括下式的二氟代环辛炔：

式IV

其中R¹代表有机基团。

本文公开的方法可任选地包括发生于活细胞内或活细胞表面上的一种或多种反应。在某些实施方案中，至少一种1,3-偶极-官能化合物和/或基团包括1,3-偶极-官能化的生物分子和/或可检测的标记(例如亲和性标记)，后者可使得能够使用例如亲和结合检测至少一种形成的杂环化合物。本文公开的方法可用于制备包括例如官能化底物表面的物品。

定义：

术语“包含”及其变体当出现于说明书和权利要求书中时，这些术语不具有限定意义。

本文使用的“一”、“一个”、“该”、“至少一个”和“一个或多个”可互换使用。

本文使用的术语“或”通常用于与包括“和/或”相同的含义，除非使用的上下文另外明确地指明。

同样在本文中，通过端点列举的数值范围包括在该范围内包含的所有数值(例如1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

以上概述不打算描述本发明的每一个公开的实施方案或每一种实施。随后的描述更具体地举例说明性的实施方案。在整个申请的几个地方，通过实施例列表提供指导，其实施例可用于各种组合。在每一种情况下，所列举的列表仅用作代表性的基团，并且不应解释为排他性的列表。

附图简述

图1说明环辛炔的示例性实施方案的结构。

图2说明单芳基环辛炔(例如单苯并环辛炔)的示例性实施方案的结构。

图3说明二芳基环辛炔(例如二苯并环辛炔)的示例性实施方案的结构。

图4说明可用于本文公开的方法的某些实施方案的偶极环加成反应的示例性环辛炔。

图5说明4-二苯并环辛炔醇(DIBO, 2)与各种1,3-偶极的示例性环加成反应和所述反应的速率常数。例证说明的1,3-偶极包括腈氧化物、叠氮化物、硝酮和重氮羰基衍生物。k’为苄基叠氮设定为1的相对速率。由于在305 nm的强吸光度，通过使用试剂的等摩尔混合物测定硝酮9的二级速率常数。

图6说明形成腈氧化物，随后对于各种腈氧化物与DIBO (2)进行环加成反应的一个实施方案。所述反应的速率常数和产率列于表1中。

图7为显示对于目前公开的发明的实施方案，在各种偶极(3 mM)存在下的DIBO 2(6 10⁻⁵ M在甲醇中，于25℃下)的消耗的图解积分法。所显示的线条使用通过单指数方程的最小二乘法拟合得到的参数绘制。插入显示DIBO与5a在不同时标的反应。

图8说明一釜法肟和腈氧化物的形成，随后对于各种腈氧化物与DIBO (2)进行环加成反应的一个实施方案。所述反应的速率常数和产率列于表2中。

图9为通过使用肟14的应变促进的炔-腈氧化物环加成反应(SPANOC)修饰乳糖的还原端的示例性实施方案的示意图。

图10为显示使用SPANOC标记和检测糖蛋白胎球蛋白上的唾液酸的实施方案的例证图解。胎球蛋白(泳道 (lanes) 1-4中的样品)和BSA (泳道5-8中的样品)受到使用NaIO₄(泳道3、4、7和8中的样品)的高碘酸盐氧化作用。然后，所产生的C-7醛(唾液酸上)与HONH₂·HCl反应形成肟，后者通过与BAIB反应被氧化产生腈氧化物，这种腈氧化物与DIBO衍生物15 (泳道2、4、6和8中的样品)反应。然后通过使用结合于HRP的抗生物素抗体进行蛋白质印迹检测所结合的生物素。通过考马斯染色(Coomassie staining)确定总蛋白负载。

图11说明半乳糖苷改性的DIBO 19与叠氮化物或连接子18的肟部分之间的选择性环加成反应的示例性实施方案。

图12 为依序通过SPAAC和SPANOC制备双官能化合物的示例性实施方案的示意图。

说明性实施方案的详述

尽管已经发现环辛炔与叠氮化物的不含金属的环加成反应得到稳定的1,2,3-三唑在化学生物学和材料科学方面具有广泛用途，但是迫切需要更快速和更加多功能的生物正交反应。我们已经发现，腈氧化物和重氮羰基衍生物经历与环辛炔易行的1,3-偶极环加成反应。与重氮羰基衍生物的环加成反应与叠氮化物相比较呈现类似的动力学，而与腈氧化物的环加成反应的反应速率快得多。腈氧化物可便利地通过相应的肟与BAIB的直接氧化进行制备，并且这些条件使得能够作为一釜法实施肟形成、氧化和环加成反应。这种方法学用于把碳水化合物的异头中心(anomeric center)用各种标记物官能化。此外，肟和叠氮化物对于依序不含金属的点击反应提供官能团的正交对，并且这种特征使得能够通过不需要毒性金属催化剂的简单合成程序将生物分子和材料多官能化。

广泛种类的环状炔烃，包括但不限于环辛炔、单芳基环辛炔和二芳基环辛炔，可用于本文公开的方法。

示例性的环辛炔包括，但不限于在图1中说明的那些环辛炔(例如单环或双环、未取代或取代的环辛炔，包括例如单氟代的环辛炔和二氟代的环辛炔)。也参见，Banert etal., Chem. Comm., 2010, 46(23):4058-4060; Agard et al., J. Am. Chem. Soc.,2004, 126(46):15046-7; Sletten et al., Organic Letters, 2008, 10(14):3097-3099; Agard et al., Acs化学生物学(Acs Chemical Biology), 2006, 1(10):644-648;Baskin et al., Proc. National Acad. Sci. USA, 2007, 104(43):16793-16797;Codelli et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(34)11486-11493; 和Dommerholt etal., Angew. Chemie-International Ed., 2010, 49(49)9422-9425。

示例性单芳基环辛炔包括但不限于在图2中说明的那些单芳基环辛炔(例如单苯并环辛炔)。也参见，Sletten et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(33)11799-11805。

示例性二芳基环辛炔包括但不限于在图3中列出的那些二芳基环辛炔(例如二苯并环辛炔、氮杂-二苯并环辛炔和氮杂-二苯并环辛炔酮)。也参见，McKay et al., Chem. Comm., 2010, 46(6):931-933; Wong et al., J. Am. Chem. Soc., 1974, 96(17):5604-5605; Kii et al., 有机与生物分子化学(Organic & Biomolecular Chemistry),2010, 8(18):4051-4055; Ning et al., Angew. Chemie-International Ed., 2008, 47(12):2253-2255; Debets et al., Chem. Comm., 2010, 46(1):97-99; Jewett et al.,J. Am. Chem. Soc., 2010, 132(11):3688-3690; Poloukhtine et al., J. Am. Chem. Soc., 2009, 131(43):15769-15776; 和Stockmann et al., 化学科学(Chemical Science), 2011, 2(5):932-936。

在本文公开的方法的某些实施方案中，至少一种环状炔烃包括二芳基环辛炔例如二苯并环辛炔。

示例性的二苯并环辛炔包括下式的那些二苯并环辛炔：

式I

其中：每一个R¹独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸酯、亚硝酸酯、硫酸酯和C1-C10有机基团(并且优选地为C1-C10有机部分)；每一个R²独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基、硝酸酯、亚硝酸酯、硫酸酯和C1-C10有机基团(并且优选地为C1-C10有机部分)；X代表C=O、C=N-OR³、C=N-NR³R⁴、CHOR³、CHNHR³、BR³、NR³、O、SiR³R⁴、PR³、O=PR³或卤素；和每一个R³和R⁴独立地代表氢或有机基团(并且在一些实施方案中为有机部分)。在优选的实施方案中，每一个R¹代表氢和/或每一个R²代表氢。任选地，R³包括共价键合的有机染料(例如荧光染料)。

本文使用的术语“有机基团”对于本发明的目的用于意指烃基，后者被分类为脂族基团、环状基团或者脂族与环状基团的组合(例如烷芳基和芳烷基)。在本发明的上下文中，对于本发明化合物的合适的有机基团为不干扰炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应以形成杂环化合物的那些有机基团。在本发明的上下文中，术语“脂族基团”意指饱和或不饱和的线形或分支的烃基。该术语用于包括例如烷基、链烯基和链炔基。术语“烷基”意指饱和的线形或分支一价烃基，包括例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基等。术语“链烯基”意指具有一个或多个烯属不饱和基团(即碳-碳双键)的不饱和线形或分支的一价烃基，例如乙烯基。术语“链炔基”意指具有一个或多个碳-碳叁键的不饱和线形或分支的一价烃基。术语“环状基团”意指被分类为脂环基、芳基或杂环基的闭环烃基。术语“脂环基”意指具有类似脂族基团的那些的性质的环状烃基。术语“芳族基团”或“芳基”意指一-或多环芳族烃基。术语“杂环基”意指其中环中的一个或多个原子为非碳元素(例如氮、氧、硫等)的闭环烃。

作为简化讨论和列举在整个申请书中使用的某些术语的一种手段，术语“基团”和“部分”用于在允许取代或可被取代的化学种类和不这样允许取代或不可这样被取代的化学种类之间进行区别。因此，当术语“基团”用于描述化学取代基时，所描述的化学物质包括未取代的基团和例如在链以及羰基或其它常规取代基中具有非过氧化的O、N、S、Si或F原子的基团。当术语“部分”用于描述化合物或取代基时，仅打算包括未取代的化学物质。例如，短语“烷基”打算不仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等，而且还包括带有本领域已知的其它取代基例如羟基、烷氧基、烷基磺酰基、卤原子、氰基、硝基、氨基、羧基等的烷基取代基。因此，“烷基”包括醚基、卤代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羟基烷基、磺基烷基等。在另一方面，短语“烷基部分”限于仅包括纯的开链饱和烃烷基取代基，例如甲基、乙基、丙基、叔丁基等。

式I的炔通常为应变的环状炔。出人意料地已经发现，本文描述的式I的炔(例如其中X代表C=O、C=N-OR³、C=N-NR³R⁴、CHOR³或CHNHR³，并且每一个R³和R⁴独立地代表氢或有机基团)已被发现对1,3-偶极-官能化合物比其它的应变的环状炔(例如其中X代表CH₂)具有更高的反应性。

例如在美国专利申请公布号2010/0297250 A1 (Boons等)中公开了制备式I的炔的示例性方法。

叠氮基苯与乙炔和环辛炔的环加成反应的过渡态的密度泛函理论(B3LYP)计算表明，“应变促进的(strain promoted)”环加成反应速度快实际上是由于1,3-偶极和炔扭曲成为过渡态几何学需要的能量较低。第一代环辛炔用相对慢速的反应进行；然而，已经发现，应变促进的环加成反应速度显著增加可能伴随在环辛炔的丙炔位附加吸电子基团得以实现(Agard et al., ACS Chem. Biol. 2006, 1644-648)。例如，二氟代环辛炔(DIFO, 1,图4; Baskin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007, 104, 16793-16797;Codelli et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486-11493)与叠氮化物反应比与未取代的环辛炔类似的环加成反应快约60倍。我们曾报道，4-二苯并环辛炔醇(DIBO, 2)的衍生物与含有叠氮基的糖类和氨基酸快速反应，并可用于视觉观察活细胞的代谢标记的聚糖(Ning et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2008, 47, 2253-2255)。DIBO的引人瞩目的特征包括易于通过简单的合成途径获得化合物、无毒性，及简单连接各种探针的可能性。此外，DIBO的结构易受到类似物合成的影响，并且据介绍衍生物(3和4)呈现甚至比母体化合物更高的反应速率(Poloukhtine et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 15769-15776; Debets et al., Chem. Commun. 2010, 46, 97-99; 和Jewett et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688-3690)。

示例性的氮杂-二苯并环辛炔包括下式的那些氮杂-二苯并环辛炔：

式II

示例性的氮杂-二苯并环辛炔酮包括下式的那些：

式III

示例性的二氟代环辛炔包括下式的那些：

式IV

其中R¹代表有机基团。

示例性的双环[6.1.0]壬炔包括下式的那些双环[6.1.0]壬炔：

式V

其中R¹代表有机基团。

我们关于环辛炔可经历与硝酮的快速环加成反应的发现已经进一步扩展不含金属的点击反应(click reactions)的范围(Ning et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2010,49, 3065-3068; McKay et al., Chem. Commun. 2010, 46, 931-933)，并且该方法的有用性已经通过经3步方案的位点特异性蛋白改性得到证实，这种3步方案需要N-末端丝氨酸的高碘酸盐氧化作用得到醛，后者可易于转化为硝酮，然后与探针修饰的二苯并环辛炔反应。

广泛种类的1,3-偶极-官能化合物可用于与本文公开的炔烃反应。本文使用的“1,3-偶极-官能化合物”意指包括具有至少一个附着于其上的1,3-偶极基团的化合物。本文使用的“1,3-偶极基团”打算指具有含有在3个原子上离域的4个电子的3-原子π电子系统的基团。示例性的1,3-偶极基团包括但不限于叠氮化物、腈氧化物、硝酮、氧化偶氮基和酰基重氮基。在某些实施方案中，1,3-偶极-官能化合物可为具有至少一个附着于其上的1,3-偶极基团的生物分子。任选地，至少一个1,3-偶极-官能化合物可包括可检测的标记(例如免疫分析或亲和性标记)。

一种或多种1,3-偶极-官能化合物(例如叠氮化物-官能化合物、腈氧化物-官能化合物、硝酮-官能化合物、氧化偶氮基-官能化合物和/或酰基重氮基-官能化合物)，可在于环合反应中有效反应并形成杂环化合物的条件下，与本文描述的炔烃化合。优选地，有效形成杂环化合物的条件可包括基本上没有所添加的催化剂。有效形成杂环化合物的条件也可包括存在或不存在广泛种类的溶剂，所述溶剂包括但不限于水性(例如水)和非水溶剂；质子和质子惰性溶剂；极性和非极性溶剂、及其组合。杂环化合物可在宽的温度范围内形成，当涉及生物分子时， 0℃-40℃ (并且在一些实施方案中为23℃-37℃)的温度范围为特别有用的。便利地，反应时间可少于1天，并且有时为1小时或者甚至更少。

我们在此报道，除了叠氮化物和硝酮外，腈氧化物和重氮羰基(diazocarbonyl)衍生物易于经历与二苯并环辛炔的环加成反应，分别得到稳定的异噁唑和吡唑。已经发现，各种1,3-偶极呈现不同水平的反应性，使得能够实施依序的环加成反应。另外，我们已经首次显示，肟可起腈氧化物的潜在1,3-偶极作用，其与叠氮化物的环加成反应完全正交。这些发现使得有可能采用应变促进的环加成反应，用于装配复杂的多功能和生物吸入性(bioinspired)材料，而不需采用有毒的金属催化剂。

腈氧化物可经历与末端炔烃的环加成反应，得到3,5-异噁唑(Huisgen, 在1,3-偶极环加成反应化学中(in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry); Padwa, A.编辑;Wiley: New York, 1984; 第1卷, 第1-176页)；然而，这些反应的成功通常受到反应的慢速和腈氧化物的竞争性二聚作用的损害(Grünanger, 在杂环化合物：异噁唑的化学中(inThe Chemistry of Heterocyclic Compounds: Isoxazoles); Taylor, E.C.,Weissberger, A.编辑; Wiley-Interscience: New York, 1991; 部分I, 第49卷, 第1-416页)。3,5-二取代的异噁唑已经通过分子内的环加成反应(Nair et al., Tetrahedron2007, 63, 12247-12275)，使用活化的亲偶极(König et al., Chem. Ber. 1983, 116,3580-3590; 例如使用苯炔，参见Crossley et al., Tetrahedron Lett. 2010, 51,2271-2273; Dubrovskiy et al., Org. Lett. 2010, 12, 1180-1183; Spiteri et al.,Org. Biomol. Chem. 2010, 8, 2537-2542; Spiteri et al., Chem. Commun. 2010,46, 1272-1274; 和例如使用降冰片烯，参见Gutsmiedl et al., Org. Lett. 2009, 11,2405-2408)，例如苯炔和降冰片烯，或者通过采用Cu(I)催化剂(Hansen et al.; J. Org. Chem. 2005, 70, 7761-7764)，以高产率制备。此外，对于用于化学合成足够稳定的重氮羰基试剂，已被用于与取代的炔烃和苯炔的1,3-偶极环加成反应，分别得到吡唑和吲唑(vonWittig et al., Liebigs Ann. Chem. 1970, 741, 79-88; Qi et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2007, 46, 3242-3244; He et al., Tetrahedron Lett. 2009, 50, 2443-2445; Jin et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2007, 46, 3323-3325; Liu et al., J. Org. Chem. 2008, 73, 219-226)。

本文讨论的为应变促进的炔烃-腈氧化物环加成反应(SPANOC)和炔烃重氮羰基(SPADC)与DIBO (2)，并把反应速率同类似的与叠氮化物(SPAAC)和硝酮(SPANC)的环加成反应相比较(图5)。通过相应的醛与羟胺反应(Ramón et al., J. Org. Chem. 2010, 75,1197-1202)，随后用N-氯代琥珀酰亚胺把生成的肟氯化(Grundmann et al., J. Org. Chem. 1969, 34, 2016-2018; Liu et al., J. Org. Chem. 1980, 45, 3916-3918)，制备一系列亚氨酰氯(5a-f)，后者可易于通过用弱碱处理转化为腈氧化物。在三乙胺存在下(图6)，把亚氨酰氯5a-f加入到DIBO在甲醇中的溶液中，在几分钟内，导致定量形成异噁唑6a-f (表1)。

通过于305 nm下，在DIBO (2)的乙炔特征吸收的衰减增长后的UV光谱学进行环加成反应的准确速率测量。在25 ± 0.1℃下，在甲醇或乙腈溶液中测量速率。通过保持固定浓度的DIBO (2)，同时变化偶极的浓度，在伪一阶条件(pseudo first-order conditions)下研究环加成反应的动力学。通过对单指数方程进行数据的最小二乘法拟合，先后得到起始原料的消耗、一阶方程和伪一阶速率常数。所观察的速率常数线性依赖于偶极的浓度，并且自所观察的速率的浓度依赖性计算的二阶环加成反应速率常数列于表1中。可以看出，与腈氧化物的环加成反应异常快速，并且取代基仅施加小的影响。似乎强的吸电子取代基，例如硝基(条目4)，稍微增加反应速率。此外，使用甲醇或乙腈对反应速率仅具有边际影响(条目1和2)。

表1：DIBO (2)与各种腈氧化物的环加成反应的速率常数和产率

^a 合并的异构体的分离产率

^b在25 ± 0.1℃下，于各种浓度就地形成的腈氧化物下，自伪一阶速率常数测定二阶速率常数

^c 通过于305 nm下，在化合物2的吸收衰减后，使用UV-Vis光谱学测定伪一阶动力学

^d [2] = 6 x10^-5 M

^e [2] = 3 x10^-5 M; [5b] = 2.5-5 x10^-4 M

^f于325 nm下，在5c的吸收衰减后，通过UV-Vis光谱学测定伪一阶动力学；[5c] =6 x10^-5 M, [2] = 7.0-17.5 x10^-4 M

^g 反应在甲醇中进行

^h反应在乙腈中进行

接下来，我们比较DIBO (2)与衍生于亚氨酰氯5a的腈氧化物、苄基衍生的叠氮化物7、硝酮9和重氮羰基衍生物11的1,3-偶极环加成反应，分别得到异噁唑6a、三唑8、N-甲基异噁唑啉10和吡唑12的速率常数(图5和7)。发现叠氮化物、硝酮和重氮羰基呈现类似的反应速率。然而，腈氧化物的环加成反应的速率比与苄基叠氮化物的类似反应快57倍。

已经确定腈氧化物与DIBO (2)反应异常快速，注意力集中在腈氧化物形成和环加成反应过程的流线化。预计通过使用温和的氧化剂例如[双(乙酰氧基)碘]苯(BAIB)将肟直接氧化为腈氧化物可减少反应步骤的数目(Mendelsohn et al., Org. Lett. 2009, 11,1539-1542; Das et al., Tetrahedon Lett. 2004, 45, 7347-7350)。此外，其中通过试剂的依序加入进行肟形成、氧化和环加成反应的一釜法多步骤序列，预计减少后处理和纯化步骤的数目，从而增加转化的效率和总产率。因此，苯甲醛(13a)与羟胺在甲醇中反应，在2小时的反应时间后得到中间体苯甲醛肟，后者用DIBO和BAIB处理，并且在10分钟的另外反应时间之后，TLC和MS分析表明，肟完全转化为异噁唑6a (图8)，明显地说明氧化和环加成反应步骤伴随异常高的反应速率进行(表2, 条目1)。另外的试验证实，DIBO (2)在单独暴露于BAIB时为稳定的，并且因此氧化和环加成反应可作为连续反应过程进行。然而，羟胺可能通过在应变炔烃的亲核进攻而分解DIBO (2)。因此，转化的成功需要使用等摩尔量的醛和羟胺或者更加便利地在环加成反应之前加入丙酮，以把过量的羟胺转化为酮肟，其可与BAIB反应但是不提供1,3-偶极。或者，在给予DIBO (2)之前加入过量的BAIB也导致完全消耗剩余过量的羟胺，并且造成顺利形成所需要的异噁唑6a,g-h。此外，该实验方法使得能够以高产率制备异噁唑，其具有不稳定的相应的亚氨酰氯，特别是在脂肪族系列(表2, 条目3)。

先后对肟氧化为腈氧化物和与2的1,3-偶极环加成反应的串联序列测量速率常数，确定了环加成反应为限速步骤，并且明显地说明用BAIB氧化为异常快速的。例如，当采用苯甲醛肟时，反应的速率常数为3.44 M^-1s^-1，这几乎与采用苯甲醛亚氨酰氯时得到的数值(3.38 M^-1s^-1)相同。此外，化合物6g和6h的动力学数据进一步证实，取代基的性质对反应速率仅具有小的影响。

表2：一釜法肟形成和用DIBO (2)的SPANOC

^a 自分离的肟测定速率常数

^b在25 ± 0.1℃下，于各种浓度的腈氧化物下，自伪一阶速率常数测定二阶速率常数

^c 于305 nm下，在化合物2的吸收衰减后，使用UV-Vis光谱学测定伪一阶动力学。[2] = 6 x10^-5 M

^d合并的异构体的分离产率

便利的生物正交反应需要转化为模块化的，对于官能团的存在具有高的容忍度，并且使用良性溶剂和试剂在环境温度下进行。为了确定SPANOC是否符合这些要求，我们检查了碳水化合物用生物素探针的标记。复合糖参与各种各样的生物过程(Ohtsubo et al.,Cell 2006, 126, 855-867)，并且荧光、生物素、多价和固定的糖类衍生物为研究该类生物分子的有趣性质的重要工具(Paulson et al., Nat. Chem. Biol. 2006, 2, 238-248;Kiessling et al., Annu. Rev. Biochem. 2010, 79, 619-653; Laurent et al.,Chem. Commun. 2008, 37, 4400-4412)。预计这样的衍生物可通过糖肟经醛糖与羟胺的反应得到肟，后者然后可通过在BAIB的存在下与DIBO衍生物反应而被官能化的依序反应的反应而容易地制备。这种方法的吸引力为使得复合糖的还原端能够使用低当量的昂贵试剂用各种探针官能化。因此，易于得到的肟14 (Brand et al., Chem.-Eur. J. 2006, 12,499-509)与2或生物素改性的DIBO 15 (等摩尔量, 图9)在BAIB存在下反应10分钟，分别得到糖衍生物16和17。有趣的是要注意，使用BAIB不是主要氧化乳糖的羟基或生物素的硫。在甲醇中，仅在15小时后观察到生物素的氧化。在水中，在10分钟后经MS观察到微量的亚砜副产物；因此，需要监测BAIB与肟的反应或预混。用生物素标记改性的化合物如16例如可用于固定用链霉抗生物素涂抹的表面。

我们设想SPANOC也可通过用NaIO₄进行温和的处理以形成C-7醛，其然后在用羟胺处理时得到肟，这种肟可被氧化为腈氧化物用于与DIBO的衍生物反应，用于把标记装配至含有糖蛋白的唾液酸中。这种策略的吸引力为标记可通过稳定的异噁唑连接而装配至糖蛋白中(Zeng et al., Nat. Methods 2009, 6, 207-209)。为了检查这种策略的有用性，把糖蛋白胎球蛋白用NaIO₄的1 mM溶液处理5分钟，之后经自旋过滤去除过量的氧化剂。所生成的含有糖蛋白的醛用羟胺处理以装配肟，这种肟通过用BAIB短暂处理立即被氧化为腈氧化物，然后与15反应15分钟得到含有唾液酸的生物素。作为对照，不含糖部分的BSA受到相同的反应序列。通过使用结合于HRP的抗生物素抗体进行免疫印迹试验来检测生物素的存在。在图10中可以看出，当受到依序3步骤程序时胎球蛋白显示强的反应，而BSA未检测到。此外，排除反应步骤之一则取消检测，证实所述程序的选择性。定量的蛋白和生物素测定表明，两个生物素部分被装配于每一个胎球蛋白分子中。

DIBO与各种1,3-偶极的环加成反应的反应性差异大可使得能够实施依序的点击反应，这可提供通过简单的合成程序制备多功能化合物或材料的机会。特别是，预计高反应性的腈氧化物可在叠氮化物存在下选择性地经历环加成反应。此外，我们设想肟可起潜在1,3-偶极的作用，并且因此，环辛炔应与叠氮化物反应而不影响肟。然而，在BAIB存在下，肟快速转化为腈氧化物，后者然后可与另一种官能化的环辛炔反应。因此，通过仔细选择合适的试剂，可以能够选择性地修饰含有叠氮化物和肟部分的双功能连接子(或复杂化合物)。

不出所料，把单糖改性的DIBO 19加入到在甲醇中的双功能叠氮基-肟连接子18中，导致在叠氮化物部分的选择性环加成反应，以高产率提供三唑20 (图11)。然而，当在BAIB存在下用DIBO衍生物19处理连接子18时，肟部分快速氧化为高反应性的腈氧化物，后者经历快速的SPANOC，导致选择性地形成异噁唑21。

已经确定了叠氮化物和肟/腈氧化物的正交性，我们检查了双功能连接子18与生物素(15)或荧光探针(22)和一组用DIBO改性的配醣(25) (Ledin et al., Chem.-Eur. J.2010, 17, 3, 839-846) (图12)的依序SPAAC-SPANOC点击反应。因此，把叠氮基-肟连接子18在环境温度下，分别用在甲醇或THF中的DIBO-改性的生物素(15)或DIBO-改性的香豆素(22)处理2小时，分别导致纯净地形成单官能化的三唑23和24。其次，使三唑23和24暴露于BAIB的混合物，以将肟部分转化为高反应性的腈氧化物，并且与DIBO-改性的糖类集群(saccharide cluster) 25的反应导致快速的SPANOC，得到双功能化合物26和27，分别呈现一组结合于生物素或荧光标记的半乳糖。有趣的是应注意，既未观察到生物素部分经BAIB的氧化，也未观察到在香豆素的碳双键就地产生的腈氧化物的环加成反应(在72小时后被报道在香豆素的C=C双键处腈氧化物的环加成反应，参见Baldoli et al., Heterocycl. Chem. 1994, 31, 251-253)，明显地说明SPANOC完全适合于敏感化合物的结合。

在某些实施方案中，在一种或多种1,3-偶极-官能化合物与炔烃之间的环合反应可发生于活细胞内或在活细胞的表面。这样的反应可在体内或离体发生。本文使用的术语“体内”指的是在受试者的身体内的反应。本文使用的术语“离体”指的是已自受试者的身体去除例如分离的组织(例如细胞)中的反应。可去除的组织包括例如初生细胞(例如新近自受试者去除并能够在组织培养基中有限生长或保持的细胞)、培养细胞(例如能够在组织培养基中扩展生长或保持的细胞)及其组合。

1,3-偶极-官能化合物的示例性实施方案为式R⁸-N₃ (例如由价结构R⁸-^-N-N=N⁺代表)的叠氮化物-官能化合物，其中R⁸代表有机基团(例如生物分子)。任选地，R⁸可包括可检测的标记(例如亲和性标记)。

在本文公开的炔烃与1,3-偶极-官能化合物之间的环合反应可用于广泛种类的应用。例如，本文公开的炔烃可附着于底物的表面。在某些实施方案中，炔烃的X基团代表与底物表面的附着点。本领域的技术人员应认识到，X基团可有利地被选择为包括官能度(例如生物素、活性酯、活性碳酸酯等)，以使得炔烃能够通过广泛种类的反应附着于官能底物(例如胺官能度、硫醇官能度等)。

具有附着于其表面的炔烃的底物可与1,3-偶极-官能化合物反应，以形成杂环化合物，使1,3-偶极-官能化合物有效地化学键合于底物。这样的底物可例如以树脂、凝胶、纳米颗粒(例如包括磁性纳米颗粒)或其组合的形式存在。在某些实施方案中，这样的底物可以微阵列(microarrays)或者甚至三维立体基体(three-dimensional matrices)或支架的形式存在。示例性的三维立体基体包括但不限于可以商品名ALGIMATRIX 3D Culture (培养)系统、GELTRIX基质和GIBCO三维立体支架得到的那些三维立体基体，其全部可得自Invitrogen (Carlsbad, CA)。这样的三维立体基体可特别用于包括细胞培养的应用。

通过1,3-偶极-官能化生物分子与具有附着于其表面的炔烃的底物，在对环合反应形成杂环化合物有效的条件下接触，1,3-偶极-官能化生物分子(例如1,3-偶极-官能肽、蛋白、糖蛋白、核酸、脂质、糖、寡糖和/或多糖)可固定于，并且优选地共价附接于底物表面。优选地，有效形成杂环化合物的条件可包括基本上没有添加的催化剂。有效形成杂环化合物的条件也可包括存在或不存在广泛种类的溶剂，这些溶剂包括但不限于水性(例如水和其它生物流体)和非水性溶剂；质子和质子惰性溶剂；极性和非极性溶剂、及其组合。杂环化合物可在宽的温度范围内形成，0℃-40℃ (并且在一些实施方案中为23℃-37℃)的温度范围为特别有用的。便利地，反应时间可为少于1天，并且有时为1小时或者甚至更少。

例如，当底物以三维立体基体的形式存在和1,3-偶极-官能化生物分子为1,3-偶极-官能化蛋白(例如叠氮化物-官能化蛋白)时，环合反应可导致形成具有固定于三维基质上的蛋白的物品。这样的基质可具有广泛种类的用途，所述用途包括但不限于分离和/或固定细胞系。对于这些应用特别有用的蛋白包括但不限于胶原、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、玻连蛋白和/或通常用于细胞板(cell plating)的其它蛋白。

进一步地，因为其不需要有毒的催化剂例如铜，本发明提供的新型环加成反应可用于标记活细胞。例如，细胞可首先用叠氮化物-官能前体进行代谢性标记，以产生叠氮化物-官能化生物分子(也称为生物共轭体)例如叠氮化物-官能糖蛋白(也称为糖结合物)。细胞然后可在允许于细胞表面标记(经环加成反应)叠氮化物-官能化生物分子的条件下，或者在溶液中或者在以上讨论的底物上与式I的炔烃接触。可在细胞表面检测所生成的三唑结合物，或者其可被细胞吞噬并在细胞内检测。

式I的炔烃也可对于成像应用具有用途，包括例如作为磁共振成像(MRI)的试剂。对于另一个实例，式I的炔烃可含有荧光标记。式I的炔烃也可用于采用质谱法的定性或定量蛋白质组学和糖组学应用。式I的炔烃可被选择含有一种或多种重质量同位素，例如氘、¹³C、¹⁵N、³⁵S等，然后可用于标记和/或固定本文描述的叠氮化物-官能化生物分子。

式I的炔烃也可对于应用例如疫苗具有用途。例如，式I的炔烃可与叠氮化物-官能化蛋白(例如叠氮化物-官能化碳水化合物、叠氮化物-官能肽和/或叠氮化物-官能化糖肽)反应，并且所生成的三唑结合物可用作疫苗的载体蛋白。

总之，我们已经发现，环辛炔与腈氧化物的1,3-偶极环加成反应呈现比与叠氮化物的类似反应快得多的动力学。腈氧化物可易于通过用BAIB直接氧化相应的肟进行制备，并且这些反应条件使得可用于作为一釜法程序实施的肟形成、氧化和环加成反应。转化对于官能团的存在具有高的容忍度，使用良性溶剂和试剂在环境温度下进行，并且使得能够通过模块化方法修饰化合物。此外，这里呈现的结果证实，肟和叠氮化物对于依序不含金属的点击反应提供官能团的正交对。在这方面，依序的点击反应已经通过Cu(I)-催化的炔烃叠氮化物环加成反应(对于原始出版物，参见Tornøe et al., J. Org. Chem. 2002, 41,2596-2599; Rostovtsev et al., Angew. Chem., Int. Ed. 2002, 41, 2596-2599; 对于详细综述，参见Meldal et al., Chem. Rev. 2008, 108, 2952-3015) (CuAAC)，使用末端-和甲硅烷基保护的炔烃(Valverde et al., Tetrahedron 2009, 65, 7597-7602)和通过利用CuAAC与SPAAC的差别反应性和硫醇-烯点击反应(Nurmi et al., Chem. Commun.2009, 2727-2729)进行报道。这些方法的有用性已经通过寡核苷酸(Isobe et al., Org. Lett. 2008, 10, 3729-3732)、蛋白(Aucagne et al., Org. Lett. 2006, 8, 4505-4507; Kuijpers et al., , B.H.M.; Groothuys, S.; Org. Process Res. Dev. 2008,12, 503-511)和富勒烯(fullerenes) (Iehl et al., Chem. Commun. 2010, 46, 4160-4162)用两种或更多种标记的控制修饰证实。这里报道的结果首次证实，应变促进的点击反应可以依序方式，通过调整1,3-偶极的反应性或者通过使用潜在的1,3-偶极进行。所述新方法的吸引力为其提供化学灵活性，避免有毒的金属催化剂，并且使得能够通过简单的化学处理把化合物多官能化。

对于便利地在生物分子中装配其可易于转化为肟的醛已报道多种方法(Gilmoreet al., Angew. Chem., Int. Ed. 2006, 45, 5307-5311; Carrico et al., Nat. Chem. Biol. 2007, 3, 321-322; Zeng et al., Nat. Methods 2009, 6, 207-209;Ebisu et al., ChemBioChem 2009, 10, 2460-2464)。因此，预计多种生物分子可经SPANOC进行修饰。不含金属的点击反应已经发现进入材料科学(Wilson et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 18228-18229)，并且预计SPANOC将提供通过简单和灵活的化学处理制备日益复杂的材料的另外手段。最后，我们预期SPANOC将提供很好建立的肟连接反应的有吸引力的备选方法(Dawson et al., Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 923-960;Borgia et al., Trends Biotechnol. 2002, 18, 243-251)，因为肟的合成简单，异噁唑产物稳定，并且与SPAAC组合使用使得能够引入两种不同的官能团。

本发明通过以下实施例进行说明。应该理解，具体的实施例、材料、量和程序将按照本文阐述的本发明的范围和精神广泛阐释。

实施例

一般方法

室温指的是环境室温(20-22℃)。反应经使用铝衬硅胶60 (F254)板的薄层色谱法(TLC)监测，视情况而定使用UV254 nm和高锰酸钾和茚三酮浸渍目视检查。除非另外指明，使用硅胶G60 (SiliCycle, 60-200 μm 60 Å)作为固定相，常规实施快速层析。在VarianMercury (300 MHz)光谱仪上记录NMR光谱。化学位移以δ单位报道，其为低场距离TMS的每百万分之几(ppm)。耦合常数(J)以赫兹(Hz)测量并且未经调整；因此，由于极限分辨率，在一些情况中，在自不同信号测定的相同耦合常数测量的J值存在细微差异(<1 Hz)。分裂模式指定如下：s-单峰，d-双峰，t-三重峰，dd-双重双峰，dt-双重三峰，td-三重双峰，ddd-双重的双重双峰，tt-三重三峰，sp-七重峰，m-多重峰，br-宽峰。各种2D技术和DEPT实验用于建立结构和指定信号。通过使用2,5-二羟基苯甲酸作为基质的MALDI-ToF (AppliedBiosystems 4700 Proteomics Analyzer)或具有电子电离源的Sciex API-1 Plus四极质谱仪得到高分辨质谱。在配备有自动注射器、UV检测器、流分收集器和Agilent ZorbaxEclipse XD8-C18柱(5 μm, 9.4 × 250 mm)的Agilent 1200系列系统上S实施反相HPLC纯化。用于所有纯化的洗脱剂为：A 0.1% TFA在水中；B 0.1% TFA在CH₃CN中，流速设定在1.5ml/分钟。

材料.

所有溶剂属于试剂级。所有的醛、羟胺盐酸盐、BAIB购自Sigma-Aldrich。苄基叠氮化物购自Alfa Aesar。

试验程序.

由于所有点击产物的区域异构体和非对映体的复杂混合物不可分离，¹H-NMR和¹³C-NMR光谱难以详细分析。因此，仅记录¹H-NMR以及HRMS。

动力学测量. 通过使用Cary 50和Cary 100 UV-vis分光光度计，在25.0 ± 0.1℃下实施二苯并环辛炔醇2与各种偶极的环加成反应的速率测量。把获得要求的偶极浓度(2.5 x 10^-4-2.7 x 10^-2 M)需要的计算量的偶极(5a、b、d-f、7、9、11、13a-h、14)的0.1 M溶液加入到二苯并环辛炔醇2 (3.0 x 10^-5-6.0 x 10^-5 M)在MeOH中的热平衡溶液中。在5a、b、d-f的腈氧化物衍生物的情况下，用三乙胺处理在甲醇中的亚氨酰氯5a-f (6.0 x 10^-4-1.5 x 10^-2 M)，然后加入到2的热平衡溶液中，而13a-h的腈氧化物衍生物通过使用[双(乙酰氧基)碘]苯氧化肟13a-h产生。通过于305 nm下，在二苯并环辛炔醇2的特征吸收衰减后监测反应。

在二苯并环辛炔醇2与腈氧化物5c的环加成反应的情况下，需要2的0.1 M溶液以获得要求浓度的2 (7.0 x 10^-4-1.75 x 10^-3 M)，并把三乙胺(反应混合物中三乙胺的浓度为1.2 x 10^-4 M)加入到5c在甲醇中的热平衡溶液(6.0 x 10^-5 M)中。通过在330 nm下产物的二阶生长后试剂的等摩尔混合物的衰减监测硝酮9的反应动力学。通过曲线与以下方程拟合测定二阶速率常数：

其中y为在给定的时间“t”观察的吸光度；A ₀为以摩尔浓度表示的起始原料的初始浓度；E _SM为起始原料的消光系数的总和；E _p为产物的消光系数；和k为以M^-1s^-1表示的二阶速率常数。

合成. 所有的点击产物作为区域异构体和非对映体的混合物分离。

1-苄基-8,9-二氢-1H-二苯并环辛烷并[1,2,3]三唑-8-醇(8). 把苄基叠氮化物(7) (13 µL, 0.1 mmol)滴加入到4-二苯并环辛炔醇(2) (22 mg, 0.1 mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。真空浓缩溶液，并使用己烷与乙酸乙酯的合适混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的三唑8 (34 mg, 97%)：¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 2.90-3.65 (m, 2H, CH ₂CH), 4.55-5.10 (m, 1H, CHOH), 5.40-5.85 (m, 2H, CH₂N), 6.90-7.70 (m, 13H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 354.1295(C₂₃H₂₀N₃O (M+H⁺)需要354.1601)。

2-甲基-3-苯基-2,3,8,9-四氢二苯并[3,4:7,8]环辛烷-异噁唑-9-醇(10). 将苯基硝酮9 (14 mg, 0.1 mmol)加入到4-二苯并环辛炔醇(2) (22 mg, 0.1 mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。真空浓缩溶液，并使用己烷与乙酸乙酯的合适混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的N-甲基二氢异噁唑10 (33 mg,92%): ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.50-1.95 (m, 1H, OH), 2.95-3.65 (m, 5H, CH₃,CH ₂CH), 4.90-5.26 (m, 2H, CHN, CHOH), 6.75-7.65 (m, 13H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 356.1299 (C₂₄H₂₂NO₂ (M+H⁺)需要356.1645)。

N-苄基-9-羟基-8,9-二氢-3H-二苯并环辛烷并吡唑-3-甲酰胺(12). 把重氮苄基酰胺11 (18 mg, 0.1 mmol)加入到4-二苯并环辛炔醇(2) (22 mg, 0.1 mmol)在甲醇(5mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌过夜。真空浓缩溶液，并使用己烷与乙酸乙酯的合适混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的吡唑12 (36 mg, 92%): ¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 2.75-3.60 (m, 2H, CH ₂CH), 4.00-4.60 (m, 2H, CH ₂NH), 4.70-5.15 (m, 1H, CHOH), 6.65-7.90 (m, 15H, 芳族H, CHN, NH); HRMS (MALDI-ToF)396.1426 (C₂₅H₂₂N₃O₂ (M+H⁺)需要396.1707)。

用于自亚氨酰氯5a-f形成二苯并环辛基-异噁唑6a-f的通用程序. 把亚氨酰氯5a-f (0.11 mmol)加入到4-二苯并环辛炔醇(22 mg, 0.1 mmol)和三乙胺(16 µL, 0.11mmol)在THF (10 mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。真空浓缩溶液，并使用己烷与乙酸乙酯的合适混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的二苯并环辛基-异噁唑6a-f。

3-苯基-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6a). ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃)δ 2.09 (s, 1H, OH), 2.75-3.25 (m, 2H, CH₂), 4.66-5.05 (m, 1H, CHOH), 6.55-7.55 (m, 13H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 340.1075 (C₂₃H₁₈NO₂ (M+H⁺)需要340.1332)。

3-(4’-甲氧基苯基)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6b).¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ 208 (s, 1H, OH), 3.10-3.50 (m, 2H, CH₂), 3.70-3.76 (m, 3H, OMe),5.00-5.65 (m, 1H, CHOH), 6.75-7.55 (m, 12H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 370.1027(C₂₄H₂₀NO₃ (M+H⁺)需要370.1438)。

3-(4’-硝基苯基)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6c).¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ 2.08 (brs, 1H, OH), 3.15-3.75 (m, 2H, CH₂), 5.00-5.75 (m, 1H,CHOH), 6.70-7.80 (m, 10H, 芳族H), 8.00-8.20 (m, 2H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF)385.0961 (C₂₃H₁₇N₂O₄ (M+H⁺)需要385.1183)。

3-(4’-氟苯基)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6d).¹H NMR (300 MHz,CDCl₃) δ 1.97 (brs, 1H, OH), 3.15-3.75 (m, 2H, CH₂), 5.10-5.70 (m, 1H, CHOH),6.75-7.55 (m, 12H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 358.1016 (C₂₃H₁₇FNO₂ (M+H⁺)需要358.1238)。

3-(4’-氯苯基)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6e).¹H NMR (300 MHz,CDCl₃) δ 2.08 (brs, 1H, OH), 3.15-3.75 (m, 2H, CH₂), 5.00-5.70 (m, 1H, CHOH),6.75-7.65 (m, 12H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 374.0579 (C₂₃H₁₇ ³⁵ClNO₂ (M+H⁺)需要374.0942)。

3-(4’-溴苯基)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6f).¹H NMR (300 MHz,CDCl₃) δ 2.07 (brs, 1H, OH), 3.15-3.75 (m, 2H, CH₂), 5.00-5.60 (m, 1H, CHOH),6.70-7.85 (m, 12H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 417.9794 (C₂₃H₁₇ ⁷⁹BrNO₂ (M+H⁺)需要418.0437)。

用于自相应的醛13a,g-h一釜法形成二苯并环辛基-异噁唑6a,g-h的通用程序.将羟胺盐酸盐(10.4 mg, 0.15 mmol)加入到醛13a,g-h (1.0 mmol)和氢氧化钠(6 mg,0.15 mmol)在甲醇(5 mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时(经TLC监测)。然后加入[双(乙酰氧基)碘]苯(BAIB) (64 mg, 0.20 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌5分钟。然后加入4-二苯并环辛炔醇(22 mg, 0.1 mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌另外10分钟。真空浓缩溶液，并使用己烷与乙酸乙酯的合适混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的二苯并环辛基-异噁唑6a,g-h。

3-(2’-甲苯甲酰)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6g). ¹H NMR (300MHz, CDCl₃) δ 1.88-2.20 (m, 4H, CH₃, OH), 3.20-3.65 (m, 2H, CH₂), 5.12-5.48(m, 1H, CHOH), 6.60-7.60 (m, 12H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 354.1031 (C₂₄H₂₀NO₂(M+H⁺)需要354.1489)。

3-(2-苯基乙基)-8,9-二氢二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(6h). ¹H NMR (300 MHz,CDCl₃) δ 1.50-1.90 (m, 1H, OH), 2.65-3.65 (m, 6H, 3×CH₂), 4.90-5.10 (m, 1H,CHOH), 6.90-7.70 (m, 13H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 368.1210 (C₂₅H₂₂NO₂ (M+H⁺)需要368.1645)。

用于形成乳糖衍生物的通用程序. 将4-二苯并环辛基-衍生物2或15 (0.1 mmol)加入到[双(乙酰氧基)碘]苯(35 mg, 0.11 mmol)和乳糖肟14 (40 mg, 0.11 mmol)在甲醇(4 mL)中的溶液中，预混1分钟。然后将反应混合物在室温下搅拌10分钟(TLC监测)。真空浓缩溶液，并经使用水在乙腈中的10%混合物的Iatrobeads (对于16)或经RP-HPLC (0-2分钟0.1% TFA/H₂O, v/v; 0-20% 0.1% TFA/CH₃CN的2-5分钟梯度, v/v; 20-60% 0.1% TFA/CH₃CN (v/v)的5-30分钟梯度; 60-100% 0.1% TFA/CH₃CN的30-35分钟梯度, v/v; 100-0%0.1% TFA/CH₃CN的35-45分钟梯度, v/v; t = 21.8和23.9分钟)纯化残余物。合并合适的流分并冻干，分别得到纯的二苯并环辛基-异噁唑16和17。

3-(乳糖)-8,9-二氢-二苯并环辛基-异噁唑-9-醇(16).¹H NMR (600 MHz, CDCl₃)δ 3.00-3.85 (m, 11H, 2 C H ₂OH, 4 CH_gal, 3 CH_glu), 3.95-4.30 (m, 2H, CH₂Ar),4.35-5.45 (m, 3H, ArCHOH, OCHO, CHC=N), 7.20-7.80 (m, 8H, 芳族H); HRMS(MALDI-ToF) 598.1693 (C₂₈H₃₃NO₁₂Na (M+Na⁺)需要598.1895)。

乳糖-生物素异噁唑17.¹H NMR (600 MHz, D₂O) δ 1.00-1.45 (m, 6H, 3CH_2生物素), 2.00-2.10 (m, 2H, CH_2biotin), 2.40-4.30 (m, 32H, 6 CH_2PEG, CH_2生物素, 3CH_生物素, CH₂Ar, 2 C H ₂OH, 5 CH_gal, 4 CH_glu), 5.90-6.00 (m, 1H, ArCHOCO), 7.00-7.48(m, 8H, 芳族H); HRMS (MALDI-ToF) 998.2939 (C₄₅H₆₁N₅O₁₇SNa (M+Na⁺)需要998.3681)。

糖蛋白上的唾液酸残基的标记. 作为对照组的胎球蛋白(唾液酸化)和BSA (非唾液酸化)在4℃下受到高碘酸盐氧化作用(1 mM NaIO₄) 5分钟。把蛋白溶液在14 000g下自旋过滤15分钟以去除过量的溶剂。其次，使产生的C-7醛(在唾液酸上)与HONH₂ · HCl(100 μM在DPBS中, pH 6.7)在室温下反应1小时。所产生的肟通过在室温下与BAIB反应5分钟进行氧化，以产生腈氧化物。在经14 000g下离心15分钟去除过量的试剂后，使腈氧化物通过在室温下与DIBO 15进行不含铜的环加成反应而反应30分钟。把样品(25 μg的蛋白每泳道)在4-20% SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)上进行拆分，并转移至硝酸纤维素膜。接下来，把膜在室温下于封闭缓冲液(在PBST (含有0.1% Tween-20和0.1% Triton X-100的PBS)中的脱脂奶粉(5%; Bio-Rad))中封闭2小时。然后将所封闭的膜于封闭液中，在室温下用结合于辣根过氧化物酶(HRP) (1:100000; Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.)的抗生物素抗体温育1小时，并用PBST (4 x 10分钟)冲洗。使用ECL加化学发光的底物(Amersham)，暴露于膜(Kodak)，并使用数字X-射线成像机(Kodak)显像，实施HRP活性的最终检测。考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant blue)染色用于证实总的蛋白负载。

生物素定量. 按照制造商的方案，使用荧光生物素定量试剂盒(ThermoScientific)量化结合于蛋白的生物素。简言之，把生物素化的蛋白溶于PBS中，并把DyLight Reporter (指示剂) (荧光亲和素与40-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)的预混物)加入到生物素化的样品和一系列的生物胞素标准品中。当用生物素替代弱相互作用的HABA时，该报告中的亲和素发荧光。生物胞素标准品的校准曲线用于计算。生物素酰化的程度表达为摩尔生物素/摩尔蛋白。

三唑20. 把叠氮化物18 (10 mg, 0.03 mmol)加入到半乳糖-DIBO衍生物19(14.3 mg, 0.03 mmol)在甲醇(2 mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。真空浓缩溶液，并使用在CH₂Cl₂中的10%甲醇混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的三唑20 (23 mg, 93%): ¹H NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 1.74 (m, 2H, CH₂), 2.90-3.28(m, 4H, 2 CH₂), 3.35-4.24 (m, 23H, 8 CH₂,CHCH ₂, CH_2gal, 3 CH_gal), 4.50-4.62 (m,2H, 2 CH_gal), 5.85-6.20 (m, 2H, CH₂CHO, NH), 6.80-7.70 (m, 12H, 芳族H), 8.01(s, 1H, CH=N); HRMS (MALDI-ToF) 844.3492 (C₄₁H₅₁N₅O₁₃Na (M+Na⁺)需要844.3376)。

异噁唑21. 把半乳糖-DIBO衍生物19 (14.3 mg, 0.03 mmol)的甲醇溶液(1 mL)滴加入到肟18 (12.2 mg, 0.036 mmol)和BAIB (11.6 mg, 0.036 mmol)在甲醇(1 mL)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。真空浓缩溶液，并使用在CH₂Cl₂中的8%甲醇混合物经硅胶快速柱层析法纯化残余物，得到纯的异噁唑21 (14.6 mg, 61%): ¹H NMR(500 MHz, CD₃OD) δ 1.70-1.84 (n, 2H, CH₂), 3.30-4.30 (m, 29H, 10 CH₂, CH ₂CHOH,CH_2gal, 5 CH_gal), 6.10-6.40 (m, 1H, CH₂CHOH), 6.70-7.70 (m, 13H, 芳族H, NH);HRMS (MALDI-ToF) 842.2192 (C₄₁H₄₉N₅O₁₃Na (M+Na⁺)需要842.3219)。

用双功能连接子18进行SPAAC的通用程序. 把双功能连接子18 (0.03 mmol,10.1 mg)和相应的DIBO衍生物15或22 (0.03 mmol)溶于MeOH或THF (在香豆素-DIBO衍生物22的情况下) (2 mL)中。将反应混合物搅拌3小时，并真空浓缩溶液。残余物经硅胶上的柱层析法纯化。

三唑23. 经硅胶柱层析法(先后用在CH₂Cl₂中的5和10% MeOH)纯化，得到为无色油的23 (25.1 mg, 87%): ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ 1.34-1.45 (m, 2H, CHCH₂CH ₂),1.52-1.76 (m, 4H, CHCH ₂CH₂CH ₂), 2.15-2.21 (m, 2H, CH ₂C=O), 2.64-2.69 (m, 1H,CHHS), 2.85-3.74 (m, 26H, CHHS, 9 CH₂O, 2 CH₂NH, CH ₂CHO, CHS), 3.83-4.06 (m,4H, 2×CH₂O), 4.21-4.28 (m, 1H, CHNH), 4.41-4.47 (m, 1H, CHNH), 4.55-4.61 (m,2H, CH₂-三唑), 5.89-6.17 (m, 1H, CH₂CHO), 6.83-6.88 (m, 2H, 芳族H), 7.15-7.65(m, 10H, 芳族H), 8.01 (s, 1H, CH=N); MS (MALDI-ToF) 981.4092 (C₄₆H₆₂N₈O₁₁SNa (M+Na⁺)需要981.4157)。

三唑24. 经硅胶柱层析法(在CH₂Cl₂中的3% MeOH)纯化，得到为黄色无定形固体的24 (22 mg, 73%): ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 1.80-2.02 (m, 4H, 2 NCH₂CH ₂CH₂),2.66-2.86 (m, 4H, 2 NCH₂CH₂CH ₂), 3.01-4.12 (m, 32H, 2 NCH ₂CH₂CH₂, 11 CH₂O, 2CH₂NH, CH ₂CHO), 4.37-4.61 (m, 2H, CH₂-三唑), 5.34-6.49 (m, 2H, CH₂CHO, NH),6.73-6.82 (m, 2H, 芳族H), 6.93-7.60 (m, 11H, 芳族H), 7.92-8.10 (m, 1H, NH),8.56-8.68 (m, 1H, CH=N), 9.01-9.25 (m, 1H, CH-乙烯基);MS (MALDI-ToF)1022.4133 (C₅₄H₆₁N₇O₁₂Na (M+Na⁺)需要1022.4270)。

用于在三唑23/24和糖树状分子25之间进行SPANOC的通用程序. 向DIBO-糖树状分子25 (20.5 mg, 5.2 μmol)和肟15或22 (5.2 μmol)在MeOH/CH₂Cl₂ (4/1, v/v, 1.2ml)中的搅拌着的溶液中加入BAIB (1.8 mg, 5.7 μmol)在MeOH (0.18 mL)中的溶液，并将反应混合物搅拌30分钟。蒸发溶剂，并经RP-HPLC纯化残余物。合并合适的流分并冻干。

糖树状分子-生物素结合物26. 在RP-HPLC纯化(0-5分钟0% B, 0-100% B的5-40分钟梯度, t = 29.4分钟)并冻干后，得到为白色粉末的26 (14.0 mg, 55%): ¹H NMR(500 MHz, D₂O) δ 0.88-1.22 (m, 23H, 7 CH₃, CHCH₂CH ₂), 1.32-1.63 (m, 4H,CHCH ₂CH₂CH ₂), 1.95-2.22 (m, 18H, 8 CH₂CH ₂CH₂-三唑, CH ₂C=O), 2.48-2.80 (m, 17H,CHHS, 8 CH ₂CH₂-三唑), 2.80-3.02 (m, 17H, CHHS, 8 CH₂CH ₂-三唑), 3.08-3.95 (m,107H, 2 CH₂CHO, 4 CH ₂NH, 15 CH₂O, 8 CH-2_gal, 8 CH-3_gal, 8 CH-5_gal, 8 CH₂-6_gal, 8CH-4_gal, 8 CH ₂CH₂CH₂-三唑, CHS), 3.99-4.55 (m, 56H, 9 CH₂-三唑, 14 OCH₂, 2 CHNH, 8 CH-1_gal), 5.55-6.15 (m, 2H, 2 CH₂CHO), 6.33-7.60 (m, 20H, 芳族H), 7.87(s, 8H, 8 CH_三唑); MS (MALDI-ToF) 4933.4 (C₂₁₈H₃₁₀N₃₄O₉₂SNa (M+Na⁺)需要4933.0)。

糖树状分子-香豆素结合物27. 在RP-HPLC纯化(0-5分钟0% B, 0-40% B的5-10分钟梯度, 40-60% B的10-30分钟梯度, t = 25.3分钟)并冻干后，得到为黄色粉末的27(15.1 mg, 61%): ¹H NMR (500 MHz, D₂O:CD₃CN, 1:1, v/v) δ 0.99-1.20 (m, 21H, 7CH₃), 1.65-1.81 (m, 4H, 2 NCH₂CH ₂CH₂), 1.99-2.08 (m, 16H, 8 CH₂CH ₂CH₂-三唑),2.59-2.62 (m, 20H, 2 NCH₂CH₂CH ₂, 8 C H ₂CH₂-三唑), 2.84 (t, J = 7.3 Hz, 16H, 8CH₂CH ₂-三唑), 3.10-3.94 (m, 110H, 2 C H ₂CHO, 4 CH ₂NH, 15 CH₂O, 2 NCH ₂CH₂CH₂, 8CH-2_gal, 8 CH-3_gal, 8 CH-5_gal, 8 CH₂-6_gal, 8 CH-4_gal, 8 CH ₂CH₂CH₂-三唑), 3.94-4.25(m, 36H, 14 OCH₂, 8×CH-1_gal), 4.25-4.45 (m, 18H, 9 CH ₂-三唑), 5.41-6.19 (m,2H, 2 CH₂CHO), 6.58-7.51 (m, 21H, 芳族H), 7.64 (s, 8H, 8 CH_三唑), 8.36-9.12 (m,1H, CH-乙烯基); MS (MALDI-ToF) 4972.8 (C₂₂₄H₃₀₉N₃₃O₉₃Na (M+Na⁺)需要4974.0)。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及可获得的电子材料(例如GenBank氨基酸和核苷酸序列提交；和蛋白数据库(pdb)提交)的完整公开通过引用结合到本文中。给予上述详细描述和实施例仅为了清晰的理解。不应从中理解不必要的限制。本发明不限于所显示和描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变化将包括在权利要求书限定的本发明内。

Claims

1.一种制备杂环化合物的方法，所述方法包括：

提供潜在的1,3-偶极-官能化合物，所述潜在的1,3-偶极-官能化合物选自

(i)下式的肟

其中R选自C₆H₅、2-Me-C₆H₄、C₆H₅-CH₂CH₂；和

(ii)下式的亚氨酰氯

其中R选自C₆H₅、4-MeO-C₆H₄、4-O₂N-C₆H₄、4-F-C₆H₄、4-Cl-C₆H₄、4-Br-C₆H₄；

在环状炔烃存在下把所述潜在的1,3-偶极-官能化合物转化为活性的1,3-偶极官能化合物，其中所述肟或亚氨酰氯转化成腈氧化物；

使所述活性的1,3-偶极官能化合物与所述环状炔烃接触；和

使所述活性的1,3-偶极-官能化合物与所述环状炔烃在有效用于环加成反应以形成杂环化合物的条件下反应，

其中所述环状炔烃具有下式：

(i)

其中：

每一个R¹独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基，其中烷氧基的烷基部分是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基的烷基；

每一个R²独立地选自氢、卤素、羟基、烷氧基，其中烷氧基的烷基部分是选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基的烷基；

X代表CHOR³；和

R³代表氢或选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基的烷基。

2.根据权利要求1所述的制备化合物的方法，所述方法包括：

合并包括第一组分、第二组分和环状炔烃的组分，所述第一组分具有第一种1,3-偶极-官能团，第二组分具有潜在的1,3-偶极-官能团，所述第二组分选自(i)肟和(ii)亚氨酰氯，并可转化为不同于第一种1,3-偶极-官能团的第二种活性1,3-偶极-官能团；

使具有第一种1,3-偶极-官能团的第一组分与环状炔烃在有效用于环加成反应以形成第一杂环基的条件下反应；

在所述环状炔烃存在下把第二组分的潜在的1,3-偶极-官能团转化为包含腈氧化物的第二种活性1,3-偶极官能团；和

使具有第二种活性1,3-偶极-官能团的第二组分与环状炔烃在有效用于环加成反应以形成第二杂环基的条件下反应，

其中所述肟、所述亚氨酰氯和所述环状炔烃如权利要求1中所定义。

3.权利要求2的方法，其中第一组分和第二组分为不同的化合物。

4.权利要求2或3的方法，其中第一组分的第一种1,3-偶极-官能团为叠氮基。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述潜在的1,3-偶极-官能化合物包括如权利要求1中所定义的肟，并且其中转化包括直接氧化。

6.权利要求5的方法，其中所述直接氧化包括存在氧化剂。

7.权利要求6的方法，其中所述氧化剂包括[双(乙酰氧基)碘]苯。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述潜在的1,3-偶极-官能化合物包括如权利要求1中所定义的亚氨酰氯，并且转化包括用弱碱处理。

9.权利要求1-3中任一项的方法，其中有效用于环加成反应以形成一种或多种杂环化合物和/或基团的条件包括没有添加的催化剂。

10.权利要求1-3中任一项的方法，其中在式(I)的环状炔烃中，每一个R¹代表氢。

11.权利要求1-3中任一项的方法，其中在式(I)的环状炔烃中，每一个R²代表氢。

12.权利要求1-3中任一项的方法，其中在式(I)的环状炔烃中，R³选自选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基、戊基、庚基。