CN112424589A - 用于进行生物素测定的试剂盒、微流体装置和方法 - Google Patents

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Abstract

公开了含有化学发光检测系统的试剂盒和微流体装置以及用于测定样品中生物素的浓度的方法。所述试剂盒、微流体装置和方法利用能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或其类似物的敏化剂，以及具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物。

Description

用于进行生物素测定的试剂盒、微流体装置和方法
相关申请的交叉引用/通过引用并入声明
本申请根据35 USC § 119(e)要求2018年7月30日提交的美国临时申请号62/711,694的权益。上述引用的专利申请的全部内容在此明确通过引入并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
背景
生物素经常用于与抗体或其他小药物分子的缀合物中，用于测定试剂。生物素与包被在固体支持物上的大蛋白分子(例如，抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白)的紧密结合提供了将抗体或药物固定在固体支持物上的方便方法。
生物素由于其作为食品补充剂的用途在本领域中众所周知；例如，生物素用于促进健康的毛发和指甲生长并治疗各种疾病状况。鉴于这种用途，可以在生物样品、诸如(但不限于)血液中发现显著水平的生物素。由于生物素用于许多诊断测定中(例如，以包被固体支持物)，因此在采用生物素化测定组分的任何测定中，测试样品中的高水平的生物素可以干扰测定信号。因为在不同生物素浓度的各种测定方法中观察到干扰，所以应当定量患者样品中存在的生物素水平以确定样品是否适合用于特定测定中。然而，大多数当前可用的生物素测定具有窄范围(即，0-50 ng /ml)，其不适合用于检测通常在实际患者样品中发现的宽动态范围的生物素浓度(即，0-1500 ng /ml)。
用于处理当前可用的生物素测定的窄检测范围的唯一方法是进行测试样品的系列稀释，以有希望达到预期的测定范围；然而，这是繁琐的过程，其浪费测试样品以及试剂，并且还降低周转时间。
医学诊断领域利用许多不同形式的测定技术。商业使用的测定的一个实例是发光氧通道测定(LOCI®)技术。LOCI®先进化学发光测定描述于例如美国专利号5,340,716(Ullman等人)，其全部内容明确地通过引用并入本文。当前可用的LOCI®技术具有高灵敏度，并且使用几种试剂。具体而言，LOCI®测定要求这些试剂中的两种(被称为“sensibead”和“chemibead”)通过其他特异性结合配偶体测定试剂以如下的方式保持，其中sensibead和chemibead彼此密切接近以实现信号。在暴露于特定波长的光后，sensibead释放单线态氧，并且如果两个珠粒密切接近，则单线态氧被转移至chemibead；这引起化学反应，其导致所述chemibead发出光，所述光可以在不同波长处测量。
然而，没有以LOCI®形式可用的生物素测定。
因此，在本领域中需要克服现有技术的缺点和缺陷的新的和改进的生物素测定。本公开涉及此类测定，以及含有其的试剂盒和微流体装置及其使用方法。
附图简述
图1图示描绘根据本公开构建的生物素LOCI®测定法的一个非限制性实施方案。
图2图示描绘根据本公开构建的生物素LOCI®测定法的一个非限制性实施方案的标准曲线，其中所述测定法利用生物素包被的chemibead和链霉抗生物素蛋白包被的sensibead。
图3图示描绘根据本公开构建的生物素LOCI®测定法的另一个非限制性实施方案的标准曲线，其中所述测定法利用生物素包被的chemibead和traptavidin包被的sensibead。
图4图示描绘来自图2和3的标准曲线的比较。
图5图示描绘根据本公开构建的生物素LOCI®测定法的又另一个非限制性实施方案的标准曲线，其中所述测定法利用4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)包被的chemibead和链霉抗生物素蛋白包被的sensibead。
图6图示描绘根据本公开构建的生物素LOCI®测定法的又另一个非限制性实施方案，其中所述测定法利用亚氨基生物素包被的chemibead和抗生物素蛋白包被的sensibead。
详细描述
在通过示例性语言和结果的方式详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，所述本公开不限于下面的描述中阐述的其对组分的构造和排列的细节的应用。本公开能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式实践或实施。因此，本文使用的语言意欲被给予最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意味着是示例性的—而非穷举性的。而且，应该理解，本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法、并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述而实施。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合利用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成和化学分析。
本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物在本文中明确地通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体和个别地指出通过引用并入一样。
鉴于本公开，无需过度实验即可制备和执行本文公开的所有物品、组合物、试剂盒和/或方法。尽管已经在具体实施方案的方面描述了所述物品、组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的构思、精神和范围的情况下，可对所述物品、组合物、试剂盒和/或方法、以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的取代和修改在如所附权利要求书限定的本公开的精神、范围和构思内。
如根据本公开所利用，除非另有指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一种化合物”的提及可指一种或多种化合物、2种或更多种化合物、3种或更多种化合物、4种或更多种化合物或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。
术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种，这取决于它所附接的术语；此外，100/1000的数量不视为限制性的，因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的，并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。
在权利要求中使用术语“或”用于意指包括性的“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如，以下任一种都满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，并且A和B两者均为真(或存在)。
如本文所用，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何引用意指结合该实施方案描述的具体要素、特征、结构或特点包括在至少一个实施方案中。例如，说明书中各个地方出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”不一定全部是指同一实施方案。此外，对一个或多个实施方案或实例的所有引用都应被解释为对权利要求非限定性的。
在整个申请中，术语“约”用于指示，值包括用于测定该值的组合物/仪器/装置、方法的误差的固有变化，或研究受试者间存在的变化。例如，但不限于，当利用术语“约”时，指定值可以与列举值相差正负20%，或15%，或12%，或11%，或10%，或9%，或8%，或7%，或6%，或5%，或4%，或3%，或2%，或1%，因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。
如在本说明书和一个或多个权利要求中所用，术语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所用的术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定上下文中是重要的，则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。本领域技术人员将理解，除非从上下文可见，否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。
如本文所用，术语“实质上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如，当与具体事件或环境相关时，术语“实质上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少80％的时间、或至少85％的时间、或至少90％的时间、或至少95％的时间。术语“实质上相邻”可以意指两个事项与彼此100%相邻，或者两个事项与彼此密切接近，但与彼此不是100%相邻，或者两个事项之一的一部分与另一事项不是100%相邻，而是与另一事项密切接近。
如本文所用，短语“与…缔合(associated with)”和“与…偶联(coupled to)”包括两个部分彼此直接缔合/结合以及两个部分彼此间接缔合/结合二者。缔合/偶联的非限制性实例包括例如通过直接的键或通过间隔基团将一个部分与另一个部分共价结合，直接或借助与所述部分结合的特异性结合对成员将一个部分与另一个部分非共价结合，诸如通过将一个部分溶解在另一个部分中或通过合成而将一个部分掺入另一个部分，和将一个部分涂覆在另一个部分上。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且是指如下的物质，其在其结构中包含与给定化合物相同的基本碳骨架和碳官能度，但也可以含有对其的一个或多个取代。如本文中所用，术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，R可以包括H，羟基，硫醇，选自氟化物、氯化物、溴化物或亚碘酸盐(iodite)的卤化物，选自下列之一的C1-C4化合物：任选取代的直链、支链或环状烷基，和直链支链或环状烯基，其中任选的取代基选自一种或多种烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其中每个是任选取代的，其中所述任选的取代基选自下列中的一种或多种：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。
如本文所用的术语“样品”将被理解为包括可以根据本公开利用的任何类型的生物样品。可利用的流体生物样品的实例包括但不限于：全血或其任何部分(即，血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液(cystic fluid)、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等。
本公开的某些非限制性实施方案涉及生物素测定组合物以及含有其的试剂盒及其使用方法。在一些测定实施方案中，信号产生系统(sps)成员包括敏化剂，诸如，例如，光敏剂和化学发光组合物；在这些测定实施方案中，所述敏化剂的激活产生的产物激活化学发光组合物，由此生成可检测信号，所述可检测信号涉及所检测的结合和/或未结合的生物素的量。本公开可基于的测定平台的一个示例性(但非限制性)实施方案是发光氧通道测定(LOCI®; Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY)。LOCI®测定描述于例如美国专利号5,340,716 (Ullman等人)，其全部内容明确地通过引用并入本文。
本公开的某些非限制性实施方案涉及含有用于测定样品中生物素的浓度的化学发光检测系统的试剂盒。所述试剂盒包括：(a)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物(诸如但不限于4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA))的单线态氧可激活的化学发光化合物；和(b)组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或其类似物(诸如但不限于链霉抗生物素蛋白或traptavidin)的敏化剂，其中所述抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物能够结合样品中的生物素或结合(a)。
化学发光化合物(化学发光剂)是化学可激活且作为这种激活的结果而发射特定波长的光的化合物。通过举例说明而非限制性地，化学发光剂的实例包括例如：能够与单线态氧或过氧化物反应以形成可以分解成酮类或羧酸衍生物的氢过氧化物或二氧环丁烷(dioxetane)的烯烃类；可以通过光的作用分解的稳定二氧环丁烷；可以与单线态氧反应以形成二酮类的炔烃类；可以形成偶氮化合物或偶氮羰基化合物的腙类或酰肼类，诸如(但不限于)鲁米诺；和可以形成内过氧化物的芳族化合物。作为激活反应的结果，化学发光剂直接或间接引起发光。
在某些实施方案中，单线态氧可激活的化学发光化合物可以是这样的物质，其经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可分解，并同时或随后发射光。包含化学发光化合物的组合物可通过激活的化学发光化合物直接激发；或者，所述组合物可进一步包含至少一种荧光分子，所述荧光分子由激活的化学发光化合物激发。
敏化剂是生成用于激活化学发光化合物的反应性中间产物(诸如例如单线态氧)的分子，通常是化合物。在一些实施方案中，所述敏化剂是光敏剂。通过实例而非限制性地，可以化学激活(通过，例如酶和金属盐)的其他敏化剂包括，借助外部光源的激活或不借助外部光源的激活而可以产生单线态氧的其他物质和组合物。例如，某些化合物已经显示催化过氧化氢转化为单线态氧和水。其他敏化剂物质和组合物的非限制性实例包括碱土金属Ca、Sr和Ba的氧化物；d0构型中的3A、4A、SA和6A族的元素的衍生物；锕系元素和镧系元素的氧化物；和氧化剂CIO-、BrO-、Au3+、IO3 -和IO4 -；和具体而言，钼酸根、过氧钼酸根、钨酸根和过氧钨酸根离子，和乙腈。下列参考文献(其在此明确地以其整体通过引用并入)提供了关于也落入本公开和要求保护的发明构思的范围内的敏化剂物质和组合物的进一步公开内容：Aubry, J. Am. Chem. Soc., 107:5844-5849 (1985)；Aubry, J. Org. Chem., 54:726-728 (1989)；Böhme和Brauer, Inorg. Chem., 31:3468-3471 (1992)；Niu和Foote,Inorg. Chem., 31:3472-3476 (1992)；Nardello等人, Inorg. Chem., 34:4950-4957(1995)；Aubry和Bouttemy, J. Am. Chem. Soc., 119:5286-5294 (1997)；和Almeida等人, Anal. Chim. Acta, 482:99-104 (2003)；其各自的完整内容在此明确地通过引用并入本文。
光敏剂的范围内还包括不是真的敏化剂、但在热、光、电离辐射或化学激活的激发下将释放单线态氧分子的化合物。此类化合物的成员包括例如(但非限制性地)，内过氧化物，诸如1,4-二羧基乙基-1,4-萘内过氧化物、9,10-二苯基蒽-9,10-内过氧化物和5,6,11,12-四苯基萘5,12-内过氧化物。加热这些化合物或这些化合物直接吸收光而释放单线态氧。
光敏剂是用于通过例如用光激发生成单线态氧而激活光活性化合物的敏化剂。光敏剂是光可激活的，且包括例如染料和芳族化合物，并且通常是由共价键合的原子构成的化合物，通常具有多个共轭的双键或三键。所述化合物应当吸收在约200 nm至约1,100 nm的波长范围内、诸如(但不限于)约300 nm至约1,000 nm的范围内或约450 nm至950 nm的范围内的光，在激发波长下，其最大吸光度时的消光系数大于500 M-1 cm-1，或大于5,000 M-1cm-1，或大于50,000 M-1 cm-1。光敏剂应当是相对光稳定的，且可以不与单线态氧有效反应。通过举例说明而非限制性地，光敏剂的实例包括：丙酮；二苯甲酮；9-噻吨酮；伊红；9,10-二溴蒽；亚甲基蓝；金属卟啉类诸如(但不限于)血卟啉；酞菁；叶绿素；玫瑰红；和巴克敏斯特富勒烯以及这些化合物的衍生物。
因此，本公开的某些非限制性实施方案涉及含有用于测定样品中生物素的浓度的化学发光检测系统的试剂盒，其中所述试剂盒包括：(a)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和(b)组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的traptavidin的敏化剂，其中所述traptavidin能够结合样品中的生物素或结合(a)。在其他非限制性实施方案中，所述试剂盒包括：(a)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和(b)组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或其类似物的敏化剂，其中所述抗生物素蛋白或其类似物能够结合样品中的生物素或结合(a)。在还有其他非限制性实施方案中，所述试剂盒包括：(a)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)的单线态氧可激活的化学发光化合物；和(b)组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的traptavidin的敏化剂，其中所述traptavidin能够结合样品中的生物素或结合(a)。
可以根据本公开利用的包含化学发光化合物的组合物和/或包含敏化剂的组合物的具体、非限制性实例记载于美国专利号5,340,716；5,538,834；5,545,834；5,578,498；5,618,732；5,672,478；5,709,994；5,811,311；5,780,646；5,929,049；5,936,070；6,002,000；6,143,514；6,180,354；6,251,581；6,340,599；6,406,913；6,406,667；6,489,309；6,692,975；6,703,248；6,797,481；6,916,667；6,949,524；7,022,529；7,033,775；7,101,682；7,179,660；7,229,842；和7,709,273；其各自的完整内容在此明确地通过引用并入本文。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，(a)和(b)的组合物是具有与其偶联和/或设置在其中的其他列出的组分的颗粒，诸如(但不限于)珠粒、球、球状体或脂质体。可以根据本公开利用的颗粒的一个具体(但非限制性)实例是乳胶颗粒，诸如(但不限于)乳胶珠粒。可以用作(a)和(b)的组合物的颗粒类型的其他非限制性实例公开于以上段落中列出的专利中。
根据本公开，可以利用本领域已知或本文另外考虑的任何生物素类似物，只要该生物素类似物：(1)能够与单线态氧可激活的化学发光化合物缔合；和(2)能够结合与敏化剂缔合的抗生物素蛋白或其类似物，且由此作为样品中存在的任何生物素的竞争剂发挥功能。可以根据本公开利用的生物素类似物的实例包括但不限于Athappilly等人(Protein Science (1997) 6:1338-1342)，Torreggiani等人(Biospectroscopy (1998) 4:197-208)，Levert等人 (J Biol Chem (2002) 277:16347-16350)，Yamamoto等人(Chem Asian J, (2015) 10:1071-8)(其各自的全部内容明确地通过引用并入本文)中公开的那些。生物素类似物的具体非限制性实例包括4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素(诸如但不限于2-亚氨基-生物素(IMBio))、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯(MEBio)、脱硫生物素(DEBio)(诸如但不限于d-脱硫生物素、dl-脱硫生物素、dl-脱硫生物素甲酯和dl-脱硫生物素醇(dl-Desthiobiotinol))，二氨基生物素(DABio)、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素(诸如但不限于2-硫代生物素)，甲氧基羰基生物素甲酯(1'-N-甲氧基羰基生物素甲酯和3'-N-甲氧基羰基生物素甲酯)，双生物素(例如但不限于双生物素磷酸酯)，四生物素，上述任一种的酯、盐和/或衍生物等。在一个具体(但非限制性)实例中，所述生物素类似物是HABA或亚氨基生物素。
根据本公开，可以利用本领域已知或本文另外考虑的任何抗生物素蛋白类似物，只要抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类似物：(1)能够与敏化剂缔合；和(2)能够结合样品中存在的任何生物素；和(3)还能够结合与单线态氧可激活的化学发光化合物缔合的生物素或其类似物。可以根据本公开利用的抗生物素蛋白类似物的非限制性实例包括Kang等人(J Drug Target (1995) 3:159-65)(其全部内容明确地通过引用并入本文)中公开的那些。抗生物素蛋白类似物的具体非限制性实例包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白，上述任一种的酯、盐和/或衍生物等。
可以以任何形式提供组合物/试剂盒/方法的试剂，所述形式允许它们根据本公开概念发挥功能。例如但非限制性地，每种试剂可以以液体形式提供并且以散装和/或单一等分试样形式设置在试剂盒内。或者，在一个具体(但非限制性)实施方案中，一种或多种试剂可以以单一等分试样冻干试剂的形式设置于试剂盒中。微流体装置中干燥试剂的使用详细描述于美国专利号9,244,085 (Samproni)，其完整内容在此明确地通过引用并入本文。
除了上文详细描述的试剂以外，所述试剂盒可以进一步含有用于进行本文描述或另外考虑的任何特定测定的其他试剂。这些额外的试剂的性质将取决于特定的测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技能范围内；因此，认为没有必要对其另外描述。此外，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/隔室中，或者各种组分/试剂可以被组合于一个或多个容器/隔室中，这取决于所述组分/试剂的交叉反应性和稳定性。此外，所述试剂盒可包括其中设置组分/试剂的微流体装置。
所述试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以广泛变化，以提供组分/试剂的浓度，其实质上优化需要在测定方法期间发生的反应，并且进一步实质上优化测定的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以提供为干燥粉末，诸如冻干粉末，并且所述试剂盒可进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以该方式，可以从这些组分获得具有用于进行根据本公开的方法或测定的适当浓度的试剂溶液。试剂盒也可以包括阳性和/或阴性对照。此外，所述试剂盒可进一步包括解释如何使用试剂盒的一组书面说明。该性质的试剂盒可用于本文描述或另外考虑的任何方法。
本公开的某些额外非限制性实施方案涉及微流体装置，其包括上文所述的任何试剂盒的组分。具体而言，某些非限制性实施方案包括用于测定样品中生物素的浓度的微流体装置，其中所述微流体装置包括：(a)通过其施加样品的入口通道；(b)至少一个能够与所述入口通道流体连通的第一隔室，所述第一隔室含有能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的任何抗生物素蛋白或其类似物的敏化剂；和(c)至少一个能够与所述第一隔室流体连通的第二隔室，所述第二隔室含有组合物，所述组合物包含具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物。
本公开的微流体装置中可以利用上文详细描述或本文另外考虑的任何敏化剂、抗生物素蛋白或其类似物、单线态氧可激活的化学发光化合物，和生物素或其类似物。
在某些具体(但非限制性)实施方案中，(b)的敏化剂具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白类似物。可以使用的抗生物素蛋白类似物的具体非限制性实例包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白和其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
在某些具体(但非限制性)实施方案中，(c)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的生物素类似物。可以使用的生物素类似物的非限制性实例包括4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素和四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。可以使用的生物素类似物的具体非限制性实例是4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)。
在一个非限制性实施方案中，(b)的敏化剂具有与其直接或间接结合的traptavidin，和/或(c)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的HABA。
所述装置可以提供有隔室的任何排列以及两种组分在其之间的分布，其允许所述装置根据本公开发挥功能。
可以密封微流体装置的任何隔室，以便将其中设置的试剂保持于基本上气密的环境中，直至使用它们；例如，可以密封含有冻干试剂的隔室以防止试剂的任何无意重构。入口通道和一个隔室，以及两个隔室可以被描述为“能够与彼此流体连通”；该短语指示所述隔室各自仍可以被密封，但在刺穿在其中或在其之间形成的密封物后，两个隔室能够在其之间具有流体流动。
本公开的微流体装置可以提供有本领域中已知的或本文另外考虑的任何其他期望特征。例如但非限制性地，本公开的微流体装置可以进一步包括读取室；所述读取室可以是含有上文所述的试剂的任何隔室，或者所述读取室可以与所述隔室流体连通。所述微流体装置可以进一步包括一个或多个额外的隔室，其含有其他溶液，诸如(但不限于)洗涤溶液、稀释溶液、赋形剂、干扰溶液、阳性对照、阴性对照、质量对照等。这些额外隔室可以与其他隔室中的一个或多个流体连通。例如，所述微流体装置可以进一步包括一个或多个含有洗涤溶液的隔室，并且这些隔室能够与所述装置的任何其他隔室流体连通。在另一个实例中，所述微流体装置可以进一步包括一个或多个含有用于溶解一种或多种干燥试剂的赋形剂的隔室，并且所述隔室可能够与所述装置的任何其他隔室流体连通。在又一个进一步实例中，所述微流体装置可以包括一个或多个含有稀释溶液的隔室，并且所述隔室能够与所述装置的任何其他隔室流体连通。
此外，本文描述或另外考虑的任何试剂盒/微流体装置可以包括单个试剂盒/装置中复用的多个测定。当多个测定存在时，所述测定各自可以如本文所述构建和发挥功能。或者，如本文所述的测定可以与本领域已知的能够包含在本公开的试剂盒/微流体装置内的任何其他测定复用。可以与本文公开和请求保护的测定复用的其他测定的非限制性实例包括BNP、NT-proBNP、D-二聚体、CKMB、肌红蛋白、髓过氧化物酶、ST2、PCT、hCG、LH、FSH、iPTH、TSH、fT4、T4、PSA、fPSA和cPSA及其组合。
当多个测定存在于单个微流体装置中时，多个入口通道可以连接至样品应用室。在某些实施方案中，部分样品可以从样品应用室穿过至多个入口通道，而不考虑其内容物。或者，结构可以存在于样品应用室、入口通道和/或其之间的连接，其允许从整个样品分离某些组分并将所述组分递送至不同测定。可以根据本公开利用的样品分配装置的非限制性实例详细描述于美国专利号9,416,776 (Ledden, 等人)，其完整内容在此明确地通过引用并入本文。
某些非限制性实施方案还涉及用于检测样品中生物素的存在和/或浓度的方法。所述方法包括以下步骤：(a)同时或全部或部分依次组合：(1)怀疑含有生物素的样品；(2)组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素或生物素类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和(3)过量组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类似物的敏化剂；(b)使(3)与样品中存在的生物素或与(2)结合，由此在生物素不存在的情况下，在(2)和(3)之间形成复合物，并使所述敏化剂与所述化学发光化合物密切接近；(c)激活所述敏化剂以生成单线态氧，其中所述复合物中存在的敏化剂的激活引起所述复合物中存在的化学发光化合物的激活；(d)测定由激活的化学发光化合物生成的化学发光的量；(e)任选地重复步骤(b)-(d)；和(f)通过分析如此产生的化学发光的量来检测生物素的存在和/或浓度，其中化学发光的量与所述样品中生物素的量成反比。
可以利用期望针对其进行生物素的存在测定的任何样品可以用作根据本公开的方法的样品。样品的非限制性实例包括生物样品，诸如但不限于，全血或其任何部分(即，血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。具体非限制性实例包括裂解的全血细胞和裂解的红血细胞。
本公开的微流体装置中可以利用上文详细描述或本文另外考虑的任何敏化剂、抗生物素蛋白或其类似物、单线态氧可激活的化学发光化合物和生物素或其类似物。
在某些具体(但非限制性)实施方案中，步骤(a)(2)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的生物素类似物。可以使用的生物素类似物的非限制性实例包括4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素和四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。可以使用的生物素类似物的具体非限制性实例是4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)。
在某些具体(但非限制性)实施方案中，步骤(a)(3)的敏化剂具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白类似物。可以使用的抗生物素蛋白类似物的具体非限制性实例包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白和其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
在一个非限制性实施方案中，步骤(a)(2)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的HABA，和/或步骤(a)(3)的敏化剂具有与其直接或间接结合的traptavidin。
当样品中不存在生物素时，形成敏化剂和化学发光化合物的复合物，并产生信号。相反，如果样品中存在生物素，则其结合与敏化剂结合的抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物并防止复合物的形成，由此防止信号的产生。因此，样品中存在的生物素的量与产生的信号的量成反比。
如上所提及，组合(同时或依次)提供所述方法的各种组分。当依次添加所述方法的各种组分时，可以改变组分的添加次序；本领域普通技术人员可确定向测定添加不同组分的具体期望次序。最简单的添加次序当然是同时添加所有物质，并测定由其产生的信号。或者，可以依次组合每种组分，或组分的组。在某些实施方案中，可以在如上所讨论的每次添加之后包括孵育步骤。
在一个替代(但非限制性)实施方案中，所述方法的步骤(a)包括：首先将样品与组合物组合并将其孵育，所述组合物包含具有与其结合的抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物的敏化剂，然后添加包含具有与其结合的生物素/生物素类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物的组合物。
在本文描述或另外考虑的试剂盒、微流体装置或方法的任何非限制性实施方案中，所述敏化剂可以是光敏剂。因此，所述光敏剂的激活将包括用光照射。
在本文描述或另外考虑的试剂盒、微流体装置或方法的任何非限制性实施方案中，所述单线态氧可激活的化学发光化合物可以是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可以分解并同时或随后发射光。
另外，在本文描述或另外考虑的试剂盒、微流体装置或方法的任何非限制性实施方案中，包含化学发光化合物的组合物可以进一步包含至少一种被激活的化学发光化合物激发的荧光分子。在该情况下，本文描述或另外考虑的方法可以进一步包括测量所述荧光分子发射的光的量以确定样品中分析物的量的步骤。
实施例
下文提供了实施例。然而，应理解本公开，其应用不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。反而，该实施例仅作为各个实施方案之一提供，并且意在是示例性的，而非穷举性的。
实施例1
本公开涉及具有广泛测定范围的稳健的生物素LOCI®测定。在本实施例的某些非限制性实施方案中使用的样品量为约20 μl；然而，通过使用较小的样品量(诸如但不限于约3μl)，可以实现具有更宽的测定范围(例如，最高1,500 ng/ml或甚至40,000 ng /ml)的生物素测定。然而，这些样本量不应被解释为对本公开的限制；能够被测定的任何样品量的使用落入本公开的范围内。例如(但非限制性地)，样品量可以落入约0.1 μl至约1,000 μl的范围内，或约0.5 μl至约100 μl的范围内，或约1μl至约50 µl的范围内，或者落入上述任何范围内的任何整数或非整数百分比值。
生物素LOCI®测定图示描绘于图1中且详细描述于下文中。
生物素LOCI®测定包括：(i)用生物素或生物素类似物(诸如但不限于4'羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)或本文公开或另外考虑的任何其他生物素类似物)包被的chemibead(CB)；和(ii)用抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类似物(诸如但不限于链霉抗生物素蛋白、traptavidin或本文公开或另外考虑的任何其他抗生物素蛋白类似物)包被的sensibead(SB)。生物素/生物素类似物包被的chemibead与患者样品中的游离生物素竞争结合抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物包被的sensibead。患者中的游离生物素浓度越高，观察到的chemibead和sensibead的结合越少，其产生反曲线。如本实施例以及随后的实施例中所述，已经证实使用生物素/生物素类似物包被的chemibead和抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物包被的sensibead的该生物素LOCI®测定的可行性。
基于上述内容，已经开发了生物素测定(使用生物素LOCI®测定作为实例)。该测定的第一步涉及将过量的抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物包被的sensibead(诸如但不限于traptavidin包被的sensibead)与样品一起孵育，使得可以通过sensibead“锁入(locked-in)”样品中存在的任何游离生物素。然后添加生物素/生物素类似物包被的chemibead (诸如但不限于生物素包被或HABA包被的chemibead)，以从生物素-抗生物素蛋白结合清除剩余的结合位点。如果样品中不存在生物素，则抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物包被的sensibead结合生物素/生物素类似物包被的chemibead，并产生信号(图1的上小图)。如果样品中存在生物素，则样品生物素结合抗生物素蛋白/抗生物素蛋白类似物包被的sensibead，并且sensibead不再能够结合生物素/生物素类似物包被的chemibead (图1的下小图)。因此，患者样品中的游离生物素浓度越高，观察到的chemibead和sensibead的结合越少，其产生反标准曲线。
实施例2
在本实施例中，使用用生物素包被的chemibead (CB)和用链霉抗生物素蛋白包被的sensibead (SB)进行实施例1中描述的生物素LOCI®测定。使用的样品量为20 µl。总反应体积为218 µl，且得到第一结果的时间为16分钟。
从该生物素LOCI®测定获得的数据显示于图2和表1中。可见，与目前任何可用的生物素测定相比，在宽得多的生物素浓度范围内获得标准曲线。
表1：使用生物素-CB和链霉抗生物素蛋白-SB的生物素LOCI®测定的精确度
重复 0 ng/ml 10 ng/ml 35 ng/ml 80 ng/ml 200 ng/mL
平均值 0 9.9 36 78 186
SD 0.19 0.56 1.16 2.84 7.11
CV -- 5.7% 3.2% 3.7% 3.9%
实施例3
除了实施例1和2中所述的生物素LOCI®测定实施方案以外，生物素LOCI®测定的某些额外非限制性实施方案包括使用生物素类似物和/或抗生物素蛋白类似物。例如(但非限制性地)，在生物素LOCI®测定中使用HABA包被的chemibead和/或traptavidin包被的sensibead提供了相比于现有技术的多个优点。首先，HABA是与抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白或traptavidin)弱结合的染料，并且HABA与抗生物素蛋白或其类似物的结合弱于生物素；作为结果，HABA的使用为生物素测定提供了更高的灵敏度，因为HABA充当生物素与sensibead的结合的清除剂(而非竞争剂)。其次，由于其独特的特性，traptavidin以一半的结合速率和1/10的解离速率结合游离生物素。因此，traptavidin的使用为游离生物素提供了“锁定”机制，因为一旦生物素与traptavidin结合，它就几乎不从结合位点解离。
当使用traptavidin包被的sensibead时，生物素-traptavidin结合将样品生物素“锁定”到位，并具有最少生物素解离，且因此添加的chemibead不与样品生物素竞争traptavidin的结合；因此，traptavidin包被的sensibead的使用产生具有更稳健精确度的半抗原测定。另外，由于没有来自样品生物素的竞争，因此，当与常规竞争测定相比时，测定信号在更宽的动态范围内与游离生物素浓度呈更线性的比例，导致扩展的测定范围。
因此，在某些非限制性实施方案中，利用traptavidin (单独或与HABA或另一种生物素类似物的使用组合)的独特特征来产生具有稳健精确度和扩展动态范围的生物素测定。
实施例4
在本实施例中，使用用生物素包被的chemibead (CB)和用traptavidin包被的sensibead (SB)进行实施例3中描述的生物素LOCI®测定。从该生物素LOCI®测定获得的数据显示于图3和表2中。可见，与目前任何可用的生物素测定相比，在宽得多的生物素浓度范围内获得标准曲线。
表2：使用生物素-CB和Traptavidin-SB的生物素LOCI®测定的精确度
重复 0 ng/ml 10 ng/ml 35 ng/ml 80 ng/ml 200 ng/mL
平均值 0 9.4 35 84 205
SD 0.296 0.54 0.98 2.34 5.39
CV -- 5.7% 2.8% 2.8% 2.6%
总的来说，除了0 ng /mL，用traptavidin包被的sensibead显示比链霉抗生物素蛋白包被的sensibead显著的精确度提高，这是由于traptavidin的慢十倍的解离速率，其将结合的样品生物素锁定(或“捕获”)到sensibead表面上的位置(参见图4以及表1和2)。此外，traptavidin-SB曲线比链霉抗生物素蛋白-SB的曲线更陡峭(图4)。
实施例5
在本实施例中，使用用HABA包被的chemibead (CB)和用链霉抗生物素蛋白包被的sensibead (SB)进行实施例3中描述的生物素LOCI®测定。从该生物素LOCI®测定获得的数据显示于图5中。可见，与目前任何可用的生物素测定相比，在宽得多的生物素浓度范围内获得标准曲线。
实施例6
图6描绘生物素LOCI®测定的另一个非限制性实施方案，其中利用亚氨基生物素包被的chemibead。在该本施例中，chemibead用亚氨基生物素包被，且sensibead用链霉抗生物素蛋白或trapavidin包被。亚氨基生物素与抗生物素蛋白具有pH依赖性结合；亚氨基生物素在较高pH下与抗生物素蛋白具有较高的亲和力，并且当pH低时从抗生物素蛋白解离。利用该特征，可以将亚氨基生物素包被的CB与SB和样品在较低pH下一起孵育，以确保生物素结合SB。SB和生物素的结合完成后，pH升高以使得CB和SB能够结合，因此生成LOCI信号。
因此，根据本公开，已经提供了完全满足上文所述的目的和优点的组合物、试剂盒和装置以及其生产和使用方法。尽管已经结合上文阐述的具体附图、实验、结果和语言描述了本公开，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。

Claims (32)

1.含有用于测定样品中生物素的浓度的化学发光检测系统的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a) 组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
(b) 组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的traptavidin的敏化剂。
2.权利要求1的试剂盒，其中(a)的组合物具有与所述单线态氧可激活的化学发光化合物直接或间接结合的生物素类似物，且其中所述生物素类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素、四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
3.权利要求2的试剂盒，其中所述生物素类似物是HABA或亚氨基生物素。
4.权利要求1的试剂盒，其中所述单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可以分解，并同时或随后发射光。
5.权利要求1的试剂盒，其中包含化学发光化合物的组合物进一步包含至少一种被激活的化学发光化合物激发的荧光分子。
6.权利要求1的试剂盒，其中所述敏化剂是光敏剂。
7.含有用于测定样品中生物素的浓度的化学发光检测系统的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a) 组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
(b) 组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或其类似物的敏化剂，其中所述抗生物素蛋白或其类似物能够结合样品中的生物素或结合(a)。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述生物素类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素、四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
9.权利要求8的试剂盒，其中所述生物素类似物是HABA或亚氨基生物素。
10.权利要求7的试剂盒，其中(b)的组合物具有与所述敏化剂直接或间接结合的抗生物素蛋白类似物，且其中所述抗生物素蛋白类似物选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白以及任何上述类似物的任何酯、盐或其衍生物。
11.权利要求7的试剂盒，其中所述单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可以分解，并同时或随后发射光。
12.权利要求7的试剂盒，其中包含化学发光化合物的组合物进一步包含至少一种被激活的化学发光化合物激发的荧光分子。
13.权利要求7的试剂盒，其中所述敏化剂是光敏剂。
14.含有用于测定样品中生物素的浓度的化学发光检测系统的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a) 组合物，其包含具有与其直接或间接结合的4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
(b) 组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的traptavidin的敏化剂。
15.用于测定样品中生物素的浓度的微流体装置，所述微流体装置包括：
(a) 通过其施加样品的入口通道；
(b) 至少一个能够与所述入口通道流体连通的第一隔室，所述第一隔室含有能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或其类似物的敏化剂；和
(c) 至少一个能够与所述第一隔室流体连通的第二隔室，所述第二隔室含有组合物，所述组合物包含具有与其直接或间接结合的生物素或其类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物。
16.权利要求15的微流体装置，其中(b)的敏化剂具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白类似物，且其中所述抗生物素蛋白类似物选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白以及任何上述类似物的任何酯、盐或其衍生物。
17.权利要求15的微流体装置，其中(c)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的生物素类似物，且其中所述生物素类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素、四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
18.权利要求15的微流体装置，其中满足以下中的至少一种：
(b)的敏化剂具有与其直接或间接结合的traptavidin；且
(c)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的HABA。
19.权利要求15的微流体装置，其中(c)的单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可以分解，并同时或随后发射光。
20.权利要求15的微流体装置，其中(c)的包含化学发光化合物的组合物进一步包含至少一种被激活的化学发光化合物激发的荧光分子。
21.权利要求15的微流体装置，其中所述敏化剂是光敏剂。
22.用于检测样品中生物素的存在和/或浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 同时或全部或部分依次组合：
(1) 怀疑含有生物素的样品；
(2) 组合物，其包含具有与其直接或间接结合的生物素或生物素类似物的单线态氧可激活的化学发光化合物；和
(3) 过量组合物，其包含能够在其激发态下生成单线态氧并且具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白或抗生物素蛋白类似物的敏化剂；
(b) 使(3)与样品中存在的生物素或与(2)结合，由此在生物素不存在的情况下，在(2)和(3)之间形成复合物，并使所述敏化剂与所述化学发光化合物密切接近；
(c) 激活所述敏化剂以生成单线态氧，其中所述复合物中存在的敏化剂的激活引起所述复合物中存在的化学发光化合物的激活；
(d) 测定由激活的化学发光化合物生成的化学发光的量；
(e) 任选地重复步骤(b)-(d)；和
(f) 通过分析如此产生的化学发光的量来检测生物素的存在和/或浓度，其中化学发光的量与所述样品中生物素的量成反比。
23.权利要求22的方法，其中步骤(a)(2)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的生物素类似物，且其中所述生物素类似物选自4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)、亚氨基生物素、生物素碳酸酯、生物素氨基甲酸酯、生物素甲酯、脱硫生物素、二氨基生物素、氯乙酰化生物素、生物素砜、硫代生物素、甲氧基羰基生物素甲酯、双生物素、四生物素以及任何上述类似物的任何酯、盐或衍生物。
24.权利要求22的方法，其中步骤(a)(3)的敏化剂具有与其直接或间接结合的抗生物素蛋白类似物，且其中所述抗生物素蛋白类似物选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、traptavidin、中性抗生物素蛋白、Neutralite抗生物素蛋白、Neutravidin、Lite-抗生物素蛋白、琥珀酰化抗生物素蛋白、其他形式的修饰或基因工程改造的抗生物素蛋白以及任何上述类似物的任何酯、盐或其衍生物。
25.权利要求22的方法，其中满足以下中的至少一种：
步骤(a)(2)的单线态氧可激活的化学发光化合物具有与其直接或间接结合的HABA；且
步骤(a)(3)的敏化剂具有与其直接或间接结合的traptavidin。
26.权利要求22的方法，其中所述单线态氧可激活的化学发光化合物是经历与单线态氧的化学反应以形成亚稳态中间物质，所述亚稳态中间物质可以分解，并同时或随后发射光。
27.权利要求22的方法，其中所述敏化剂是光敏剂，且步骤(c)中的敏化剂的激活包括用光照射。
28.权利要求22的方法，其中所述样品是生物样品。
29.权利要求28的方法，其中所述生物样品选自全血或其任何部分、尿液、唾液、痰、脑脊液、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液及其组合。
30.权利要求28的方法，其中所述生物样品包括裂解的全血细胞和裂解的红血细胞中的至少一种。
31.权利要求22的方法，其中包含化学发光化合物的组合物进一步包含至少一种被激活的化学发光化合物激发的荧光分子。
32.权利要求31的方法，其进一步包括测量所述荧光分子发射的光的量以确定所述样品中分析物的量的步骤。
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