DE69736382T2

DE69736382T2 - Chemilumineszente zusammensetungen und ihre verwendung zum nachweis von wasserstoffperoxid

Info

Publication number: DE69736382T2
Application number: DE69736382T
Authority: DE
Inventors: F. Edwin Atherton ULLMAN; Sharat San Jose SINGH
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2017-05-02
Also published as: EP0852012A1; WO1997041442A1; US6143514A; DE69736382D1; EP0852012B1; ES2270459T3

Description

Allgemeiner Stand der Technik
1. Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren, Zusammensetzungen und Kits zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid oder einer Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag.
Das klinisch-diagnostische Gebiet hat sowohl hinsichtlich der Vielfalt an interessierenden Materialien, die sich problemlos und exakt bestimmen lassen, als auch hinsichtlich der zur Bestimmung eingesetzten Verfahren in den zurückliegenden Jahren eine starke Ausdehnung erfahren. Es werden bequeme, verlässliche und ungefährliche Mittel zum Nachweisen des Vorhandenseins geringer Konzentrationen von Materialien in Flüssigkeiten benötigt. In der klinischen Chemie können diese Materialien in Körperfluiden in Konzentrationen von weniger als 10^–12 Mol vorkommen. Die Schwierigkeit des Nachweises geringer Konzentrationen dieser Materialien wird noch durch die relativ kleinen Probengrößen, die verwendet werden können, verschärft.
Der Nachweis geringer Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ist für zahlreiche analytische Verfahren, insbesondere in der klinischen Chemie, von Nutzen. Wasserstoffperoxid wird von Zellen, wie zum Beispiel Monozyten, erzeugt und ist ein Indikator einer Monozytenaktivierung. Außerdem kann jedes beliebige interessierende Material, das in ein Substrat für eine Oxidase umgewandelt wird oder umgewandelt werden kann, wie zum Beispiel Xanthenoxidase, Aminosäureoxidase, NADH-Oxidase, Glucoseoxidase, Galactoseoxidase, Glycerolphosphatoxidase und dergleichen, anhand des Wasserstoffperoxids nachgewiesen werden, das durch die Wirkung des Enzyms auf dem Substrat hervorgebracht wird. Tests auf Glucose, Triglyceride, d-Aminosäuren und Cholesterin können routinemäßig anhand des Nachweises von Wasserstoffperoxid durchgeführt werden, gewöhnlich durch Reagieren einer Peroxidase mit einem chromogenen Substrat. Enzym-Immunoassays, die eine Oxidase wie zum Beispiel Glucoseoxidase als einen Marker verwenden, bedürfen ebenfalls eines empfindlichen Verfahrens zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid. Wenn zum Beispiel Glucoseoxidase als ein Marker verwendet wird, so kann das Wasserstoffperoxid unter Verwendung von Meerrettichperoxidase und eines chromogenen Substrats nachgewiesen werden, oder das Wasserstoffperoxid kann elektrochemisch nachgewiesen werden.
Der Nachweis von Wasserstoffperoxid gewinnt auch auf dem Gebiet der Lebensmittel zunehmend an Bedeutung. Zum Beispiel wird in einigen Ländern Wasserstoffperoxid als Bleichmittel für Lebensmittel verwendet. Es ist wichtig, dass der Restgehalt an Wasserstoffperoxid in den Lebensmitteln nach dem Bleichen im Wesentlichen gleich null ist, um Gesundheitsgefährdungen zu vermeiden.
Ein Verfahren mit höherer Empfindlichkeit, das weniger Störeinflüssen durch die Probe unterliegt und mit weniger, aber dafür stabileren Reagenzien arbeitet, würde die Einfachheit und Verlässlichkeit von Assays, die dem Nachweis von Wasserstoffperoxid dienen oder auf dem Nachweis von Wasserstoffperoxid beruhen, verbessern.
Es sind schon homogene Immunoassays für kleine Moleküle beschrieben worden. Zu diesen Assays gehören unter anderem der FRAT^®-Assay, der EMIT^®-Assay, der Enzymkanalisierungsimmunoassay und der Fluoreszenzenergietransferimmunoassay (FETI) von der Syva Company; Enzymhemmerimmunoassays (Hoffman LaRoche und Abbott Laboratories) und der Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay (Dandlicker). Alle diese Verfahren haben eine begrenzte Empfindlichkeit, und nur einige wenige, darunter FETI und Enzymkanalisierung, eignen sich für große multiepitope Analyten.
Lumineszente Verbindungen, wie zum Beispiel Fluoreszenzverbindungen und chemilumineszente Verbindungen, finden auf dem Gebiet der Assays weite Anwendung, weil sie zur Abgabe von Licht befähigt sind. Aus diesem Grund sind schon Leuchtstoffe als Marker in Assays wie zum Beispiel Nukleinsäureassays und Immunoassays verwendet worden. Zum Beispiel wird ein Partner eines bestimmten Bindungspaares mit einem Leuchtstoff konjugiert, und es werden verschiedene Verfahrensvorschriften angewendet. Das Leuchtstoffkonjugat kann im Verhältnis zur Analytmenge in einer Probe, in der man den Analyten vermutet, zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase getrennt werden. Durch Messen der Lumineszenz beider Phasen kann man die beobachtete Lumineszenzstärke zu einer Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung setzen.
Partikel, wie zum Beispiel Liposome und Erythrocyten-Ghosts, sind schon als Träger von verkapselten wasserlöslichen Materialien verwendet worden. Zum Beispiel sind Liposome schon zum Verkapseln von biologisch aktivem Material für eine Vielzahl verschiedener Anwendungszwecke verwendet worden, wie zum Beispiel Arzneistoffverabreichungssysteme, wobei ein Medikament während der Liposomherstellung eingeschlossen und dann an den zu behandelnden Patienten verabreicht wird.
Partikel, wie zum Beispiel Latexkügelchen und Liposome, sind ebenfalls schon in Assays verwendet worden. Zum Beispiel kann in homogenen Assays ein Enzym in der wässrigen Phase eines Liposoms, das mit einem Antikörper oder Antigen markiert ist, eingeschlossen sein. Die Liposome werden veranlasst, das Enzym in Gegenwart einer Probe und eines Komplements freizusetzen. Mit einem Antikörper oder einem Antigen markierte Liposome, bei denen wasserlösliche fluoreszente oder nicht-fluoreszente Farbstoffe in einem Vesikel einer wässrigen Phase verkapselt sind oder lipidlösliche Farbstoffe in der Lipiddoppelschicht eines Lipids aufgelöst sind, sind ebenfalls schon in Assays für Analyten verwendet worden, die in eine immunchemische Reaktion mit dem oberflächengebundenen Antikörper oder Antigen treten können. Die Farbstoffe wurden mittels Detergenzien aus der wässrigen Phase der Liposome herausgelöst.
2. Kurze Beschreibung des Standes der Technik
US-Patent Nr. 5,084,381 (Akimoto und Mitarbeiter) bespricht ein Assayverfahren zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid.
Prozesse und Materialien zum Ausführen spezifischer Bindungsassays sind in der Patentanmeldung WO 86/01899 (Davis und Mitarbeiter) offenbart.
US-Patent Nr. 5,108,893 (Baret) offenbart die Verwendung von Oxidaseenzymsystemen in Chemilumineszenz-Assays.
Die europäische Patentanmeldung 0 421 788 A2 (Allen) offenbart ein Haloperoxidase-Säure-Oxidans-Chemilumineszenz-Assaysystem zum Feststellen des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe.
US-Patent Nr. 4,315,998 bespricht polymergebundene lichtsensibilisierende Katalysatoren.
Lichtaktivierbare chemilumineszente Matrizes sind in der Patentanmeldung WO 94/03812 (Pease und Mitarbeiter) beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0 515 194 A2 offenbart Assayverfahren, die mit induzierter Lumineszenz arbeiten. US-Patent Nr. 5,017,473 (Wagner) offenbart einen homogenen Chemilumineszenz-Immunoassay, der mit einem lichtabsorbierenden Material arbeitet. Die europäische Patentanmeldung Nr. 0,345,776 (McCapra) offenbart spezifische Bindungsassays, die einen Sensibilisierer als Marker verwenden. US-Patent Nr. 4,193,983 (Ullman und Mitarbeiter) offenbart markierte Liposompartikelzusammensetzungen und Immunoassays, die solche enthalten. US-Patent Nr. 4,891,324 (Pease und Mitarbeiter) beschreibt einen Partikel mit Leuchtstoff für Assays.
WO-A 95/08677 offenbart eine Zusammensetzung, wobei ein Fotosensibilisierer und/oder ein Vorläufer von lichtaktiven Indikatoren kovalent an Partikel gebunden werden können, und zwar entweder durch Anordnen von vernetzenden funktionalen Gruppen an den zu bindenden Bestandteilen oder durch Einarbeiten des Fotosensibilisierers oder des Vorläufers von lichtaktiven Indikatoren in ein Polymer, das die Partikel umfasst.
Kurzdarstellung der Erfindung
Im weitesten Sinne betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine Matrix umfassen, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann. Ein Katalysator, der die Entstehung von Singulettsauerstoff katalysieren kann, ist an die Oberfläche der Matrix gebunden oder angeheftet, wodurch Singulettsauerstoff darin diffundieren kann.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus Latexpolymeren und Lipiddoppelschichten ausgewählt ist. In die Matrix ist ein Marker eingearbeitet, der durch Singulettsauerstoff aktiviert werden kann. Eine Peroxidase wird an die Oberfläche der Matrix gebunden, wodurch Singulettsauerstoff darin diffundieren kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid oder einer Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die Folgendes umfasst: (i) eine Probe, in der Wasserstoffperoxid oder eine solche Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, vermutet wird, und (ii) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff aktiviert werden kann. Ein Katalysator, der die Entstehung von Singulettsauerstoff aus Wasserstoffperoxid katalysieren kann, wird an die Matrix gebunden, wodurch Singulettsauerstoff darin diffundieren kann. Die Kombination wird Bedingungen ausgesetzt, unter denen dieser Katalysator Singulettsauerstoff erzeugt. Die Lumineszenz, die durch die Reaktion von Singulettsauerstoff mit dem Marker hervorgerufen wird, wird festgestellt. Die entsprechende Reaktion zeigt das Vorhandensein einer solchen Verbindung an.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid oder einer Substanz, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die Folgendes umfasst: (i) eine Probe, in der Wasserstoffperoxid oder eine Substanz, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, vermutet wird, und (ii) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff aktiviert werden kann. Ein Katalysator, der die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Singulettsauerstoff katalysieren kann, wird an die Oberfläche der Matrix gebunden oder angeheftet, wodurch Singulettsauerstoff darin diffundieren kann. Die Kombination wird Bedingungen ausgesetzt, unter denen Wasserstoffperoxid mit dem Katalysator zu Singulettsauerstoff reagiert. Es wird festgestellt, ob Singulettsauerstoff mit dem Marker reagiert hat. Das Ausmaß dieser Reaktion zeigt das Vorhandensein oder die Menge von Wasserstoffperoxid oder der Substanz in der Probe an.
Eine weitere Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid oder einer Substanz, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die Folgendes umfasst: (i) eine Probe, in der Wasserstoffperoxid oder eine Substanz, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, vermutet wird, und (ii) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Latexpolymeren und Lipiddoppelschichten. Die Matrix enthält ein Olefin, das mit Singulettsauerstoff reagieren kann. Eine Peroxidase ist an die Oberfläche der Matrix gebunden, wodurch Singulettsauerstoff darin diffundieren kann. Die Kombination wird Bedingungen ausgesetzt, unter denen Wasserstoffperoxid mit der Peroxidase zu Singulettsauerstoff reagiert, und dann wird festgestellt, ob Singulettsauerstoff mit dem Olefin reagiert hat. Diese Reaktion zeigt das Vorhandensein von Wasserstoffperoxid oder der Substanz in die Probe an.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyten, der ein Partner eines spezifischen Bindungspaares (sBP) ist. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die Folgendes umfasst: (i) eine Probe, in der man den Analyten vermutet, (ii) einen sBP-Partner, der entweder an eine Oxidase oder eine Peroxidase gebunden ist, wobei der sBP-Partner in der Lage ist, sich an den Analyten oder an einen sBP-Partner zu binden, der in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden, (iii) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, (iv) die andere einer Oxidase oder einer Peroxidase, die an die Matrix gebunden ist oder an einen sBP-Partner gebunden ist, der in der Lage ist, sich an die Matrix zu binden (d. h. eine Oxidase ist an die Matrix gebunden, wenn der sBP-Partner von (ii) oben an eine Peroxidase gebunden ist, und eine Peroxidase ist an die Matrix gebunden, wenn der sBP-Partner von (ii) oben an eine Oxidase gebunden ist), wobei die Matrix das Diffundieren von Singulettsauerstoff darin gestattet, und (v) ein Substrat für die Oxidase, das bei Reaktion mit der Oxidase Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag. Die Kombination wird in einem Medium unter Bedingungen inkubiert, die es den sBP-Partnern ermöglichen, sich zu binden, und die es dem Substrat für die Oxidase ermöglichen, mit der Oxidase zu reagieren. Es wird festgestellt, ob Singulettsauerstoff mit dem Marker reagiert hat. Das Ausmaß einer solchen Reaktion wird mit dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, das in verpackter Kombination Folgendes umfasst: (a) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, wobei ein Enzym, das in der Lage ist, die Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu Singulettsauerstoff zu katalysieren, an die Matrix gebunden ist, oder, wenn es nicht in dieser Weise gebunden ist, an einen sBP-Partner gebunden ist, der in der Lage ist, sich an die Matrix zu binden, und die Matrix das Diffundieren von Singulettsauerstoff darin gestattet, und (b) ein Substrat für das Enzym, bei dem es nicht um Wasserstoffperoxid handelt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, das in verpackter Kombination Folgendes umfasst: (a) eine Zusammensetzung, die eine Matrix und einen Marker umfasst, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, (b) eine Peroxidase und (c) eine Oxidase. Die Peroxidase und die Oxidase sind an die Matrix gebunden oder sind in der Lage, an die Matrix gebunden zu werden.
Beschreibung der konkreten Ausführungsformen
In einem Aspekt nutzt die vorliegende Erfindung die Entstehung von Singulettsauerstoff aus Wasserstoffperoxid, um den Nachweis von Wasserstoffperoxid mit minimalen Störeinflüssen seitens einer Probe zu ermöglichen. An die Oberfläche einer Matrix ist ein Katalysator gebunden, der sich in einem Assaymedium nicht auflöst und in den ein Marker, wie zum Beispiel ein chemilumineszentes Material, eingearbeitet ist. Der Katalysator ist in der Lage, direkt oder indirekt die Entstehung von Singulettsauerstoff über ein Hervorrufen der Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu bewirken. Die Erfindung findet Anwendung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid, das infolge seiner Beigabe zu einem Medium oder infolge seiner Entstehung als ein Reaktionsprodukt vorhanden sein kann, zum Beispiel zum Nachweis eines Analyten. In dieser letzteren Hinsicht findet die vorliegende Erfindung Verwendung in Assays für den Nachweis und das Messen einer breiten Vielfalt von Analyten auf eine einfache, effiziente und reproduzierbare Weise, wobei mit Beobachtung mit bloßem Auge oder unter Verwendung herkömmlicher Geräte zum Messen der Menge von Licht, das während der Reaktion entsteht, gearbeitet wird.
Bevor wir zu einer Beschreibung der konkreten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung übergehen, werden eine Anzahl von Begriffen näher definiert und beschrieben.
"Marker, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann": eine Substanz, die in Gegenwart von Singulettsauerstoff eine erkennbare Änderung erfährt, wie zum Beispiel eine Reaktion mit Singulettsauerstoff zu einer anderen Substanz, wie zum Beispiel eine fluoreszente oder chemilumineszente Substanz oder ein Vorläufer dafür. Als nicht-einschränkende Beispiele solcher Marker seien genannt: Olefine, die in der Lage sind, mit Singulettsauerstoff beispielsweise zu Hydroperoxiden oder Dioxetanen zu reagieren; Acetylene, die mit Singulettsauerstoff zu Diketonen reagieren können; Hydrazone oder Hydrazide, die Azo-Verbindungen oder Azo-Carbonyle bilden können; aromatische Verbindungen, die Endoperoxide bilden können, usw. Die Marker können ein erkennbares Signal bei Reaktion mit Singulettsauerstoff entweder direkt oder mittels anschließender Reaktion des anfänglichen Reaktionsprodukts hervorbringen. Das Signal wird in der Regel durch elektromagnetische Strahlung stimuliert und/oder als elektromagnetische Strahlung erkannt und ist vorzugsweise Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder Phosphoreszenz.
"Olefine, die in der Lage sind, mit Singulettsauerstoff zu reagieren": eine typische Reaktion von Olefinen mit Singulettsauerstoff ist eine 2 + 2-Addition zu einem Dioxetan. Als nicht-einschränkende Beispiele dieser Olefine seien chemilumineszente und fluoreszente Olefin-Vorläufer genannt. Dioxetane können spontan oder durch Erwärmen mit spontaner Chemilumineszenz dissoziieren, oder die gebildeten Carbonyl-Gruppen können als Teil einer fluoreszenten Gruppe gebildet werden oder zu anschließenden Reaktionen befähigt sein, die zu einem fluoreszenten Molekül führen. Alternativ kann diese Dissoziationsreaktion zu einer Abtrennung einer Löscher-Gruppe von einer grundlegend fluoreszenten Gruppe führen, die dadurch ihre Fluoreszenz wiedererlangt.
Bei den oben angesprochenen Olefin-Reaktionen ist die Rate der Bindungsbrüche oft schneller, wenn das Olefin mit elektronenspendenden Gruppen, wie zum Beispiel Ethern, Thioethern, Aminen und dergleichen, substituiert wird.
Ein weiterer Reaktionstyp von Singulettsauerstoff mit Olefinen ist die 4 + 2-Cycloaddition mit Dienen, gewöhnlich aromatischen Verbindungen wie zum Beispiel Naphthalenen und Naphthacenen. Eine solche Reaktion führt anfänglich zu einem Endoperoxid. In einigen Fällen können sich Endoperoxide zu aktiven Estern oder Anhydriden umordnen, die in der Lage sind, mit einer in geeigneter Weise platzierten Gruppe zu einem Lacton oder Lactam zu reagieren, das fluoreszent sein kann. Alternativ können die Endoperoxide einen Fluoreszenz- oder Chemilumineszenzverbindungsvorläufer oxidieren. Endoperoxide können ebenfalls spontan oder bei Erwärmen mit chemilumineszenter Abstrahlung dissoziieren.
Ein weiterer Reaktionstyp von Singulettsauerstoff mit Olefinen ist die "ene"-Reaktion, die ein Allylhydroperoxid hervorbringt. Dieses Produkt kann mit einem aktiven Ester im selben Molekül zu einem Dioxetanon reagieren, das spontan oder durch Erwärmen mit chemilumineszenter Abstrahlung dissoziieren kann.
"Chemilumineszentes Olefin (CC)": eine olefinische Substanz, die bei Reaktion mit Singulettsauerstoff zu einem metastabilen Reaktionsprodukt reagiert, gewöhnlich ein Dioxetan oder Endoperoxid, das in der Lage ist, sich unter gleichzeitiger oder anschließender Abstrahlung von Licht zu zersetzen, gewöhnlich im Wellenlängenbereich von 250 bis 1200 nm. CCs, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind, sind jene, die mit Singulettsauerstoff zu Dioxetanen reagieren. Bevorzugte CCs sind elektronenreiche Olefine. Beispiele solcher elektronenreichen Olefine sind Enolether, Enamine, 9-Alkyliden-N-alkylacridane, Arylvinylether, 1,4-Dioxene, 1,4-Thioxene, 1,4-Oxazine, Arylimidazole, 9-Alkyliden-Xanthene und Lucigenin.
Die interessierenden CCs emittieren bevorzugt mit einer Wellenlänge oberhalb 300 Nanometer, bevorzugt oberhalb 500 Nanometer, und besonders bevorzugt oberhalb 550 nm. Verbindungen, die Licht mit Wellenlängen jenseits der Region absorbieren und aussenden, wo die Probenbestandteile in signifikantem Umfang zur Lichtabsorption beitragen, sind für die vorliegende Erfindung besonders geeignet. Die Extinktion von Serum fällt oberhalb 500 nm schroff ab und wird oberhalb 600 nm insignifikant. Chemilumineszente Olefine, die Licht oberhalb 550 nm aussenden, sind von besonderem Interesse. Jedoch sind chemilumineszente Olefine, die bei kürzeren Wellenlängen absorbieren, nützlich, wenn keine störende Extinktion von der Probe ausgeht. Bevorzugt absorbieren die chemilumineszenten Olefine Licht mit weniger als etwa 400 nm, um ein bequemes Arbeiten bei Raumlicht zu ermöglichen, ohne dass das Risiko einer versehentlichen Entstehung von Singulettsauerstoff durch Lichtsensibilisierung besteht.
Wenn eine langwellige Abstrahlung von dem chemilumineszenten Olefin gewünscht wird, so kann ein langwelliger Emitter, wie zum Beispiel ein Oxazin-Farbstoff, der an das chemilumineszente Olefin gebunden ist, verwendet werden. Alternativ kann ein fluoreszentes Molekül in das Medium, das das chemilumineszente Olefin enthält, eingebunden werden. Bevorzugte fluoreszente Moleküle werden durch das aktivierte chemilumineszente Olefin erregt und strahlen mit einer Wellenlänge an, die länger ist als die Abstrahlungswellenlänge des chemilumineszenten Olefins, gewöhnlich größer als 550 nm. Beispiele brauchbarer Farbstoffe sind Rubren, bis-Phenylethynylanthracen, Phthalocyanin, bis-(4-Diimethlyaminophenyl)squarain, Dansyl, Eu(fod)₃, Eu(TTA)₃ usw. Im Allgemeinen fungieren diese Farbstoffe als Akzeptoren in Energieübertragungsprozessen und haben vorzugsweise hohe Fluoreszenzquantenausbeuten und reagieren nicht rasch mit Singulettsauerstoff. Sie können zusammen mit dem chemilumineszente Olefin in die Partikel eingearbeitet werden. Die CCs enthalten im Allgemeinen keine chemisch reaktiven allylischen CH- oder NH-Gruppen.
Beispiele geeigneter elektronenreicher chemilumineszenter Olefine sind in EP-A 0 653 066 dargestellt. Solche Olefine haben im Allgemeinen eine elektronenspendende Gruppe in Konjugation mit dem Olefin.
Die besonders bevorzugten Olefine sind jene, die ein Dioxetan erbringen, das bei Raumtemperatur rasch zerfällt (weniger als 60 Minuten, bevorzugt weniger als 5 Minuten, am besten weniger als 30 Sekunden). Die Dioxetane können allein oder in Verbindung mit einem fluoreszenten Energieakzeptor lumineszent sein. Enolether sind Beispiele solcher Olefine. Häufig haben die Enoletherverbindungen wenigstens eine Aryl-Gruppe, die an die olefinischen Kohlenstoffe gebunden ist, wobei der Arylring durch eine elektronenspendende Gruppe an einer Position substituiert ist, die die Reaktionsfreudigkeit des Olefins mit Singulettsauerstoff erhöht und/oder dem Dissiziationsprodukt des entstandenen Dioxetans Fluoreszenz verleiht. Die elektronenspendende Gruppe kann zum Beispiel Hydroxyl, Alkoxy, disubstituiertes Amino, Alkylthio, Furyl, Pyryl usw. sein. Bevorzugt haben die Enolether eine elektronenspendende Gruppe, die direkt an einen olefinischen Kohlenstoff gebunden ist.
Enamine sind ein weiteres Beispiel solcher Olefine. Im Allgemeinen gelten für brauchbare Enamine die oben genannten Regeln für Enolether.
Eine weitere Familie von CCs sind die 2,4,5-Triphenylimidazole, wobei Lophin der gängige Name für das Mutterprodukt ist. Zu chemilumineszenten Analogen gehören Paradimethylamino- und -methoxy-Substituenten.
Weitere chemilumineszente Olefine, die die oben genannten Anforderungen erfüllen, finden sich in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0,345,776.
Einige der Dioxetane zersetzen sich spontan, andere durch Erwärmen, mit der Abgabe von Licht.
"Fluoreszenzverbindungsvorläufer": meint Verbindungen, die mit Singulettsauerstoff zu einer Fluoreszenzverbindung oder zu einer Verbindung reagieren, die mit einer Nebenverbindung reagieren kann, die daraufhin in eine Fluoreszenzverbindung umgewandelt wird. Es gibt verschiedene Reaktionstypen von Singulettsauerstoff, die Verbindungen erbringen können, die zu einer Fluoreszenzverbindung führen. Der verwendete Reaktionstyp und die Wahl der gewünschten Fluoreszenzverbindung sind eine Richtlinie, die zu den Strukturen der Fluoreszenzverbindungsvorläufer und allen Nebenverbindungen weist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Der Fluoreszenzverbindungsvorläufer vollzieht vorzugsweise eine Reaktion mit Singulettsauerstoff, die sehr schnell abläuft, gewöhnlich wenigstens 10⁴ – 10⁶ s^–1, bevorzugt wenigstens 10⁶ – 10⁸ s^–1, besonders bevorzugt >10⁸ s^–1. Wenn das anfängliche Reaktionsprodukt ein Zwischenprodukt ist, das zu einer Fluoreszenzverbindung reagiert, so hat das Zwischenprodukt bevorzugt eine Lebensdauer, die im Vergleich zu der gewünschten Zeit zwischen der Entstehung von Singulettsauerstoff und dem Detektieren der Fluoreszenz, die von der Fluoreszenzverbindung nach dem Bestrahlen mit Licht abgegeben wird, relativ kurz ist. Für eine Singulettsauerstofferzeugung und einen Fluoreszenznachweis, die gleichzeitig stattfinden, ist die Lebensdauer gewöhnlich kürzer als der Gesamtmessungszeitraum, bevorzugt wenigstens 10-mal kürzer. Wenn die Erzeugung von Singulettsauerstoff und der Fluoreszenznachweis hintereinander erfolgen, so ist die Lebensdauer gewöhnlich kürzer als der Zeitraum zwischen der Erzeugung von Singulettsauerstoff und dem Nachweis, bevorzugt wenigstens 10-mal kürzer.
Höhere Reaktionsraten von Singulettsauerstoff erreicht man durch Anordnen von elektronenreichen Singulettsauerstoff-reaktiven Gruppen in dem Fluoreszenzverbindungsvorläufer. Diese Gruppen sind gewöhnlich ein Olefin oder Acetylen, Hydrazin- und Hydroxylaminderivate, Selenide und Telluride, sind aber nicht auf diese Gruppen beschränkt. Zum Beispiel haben sich Alkyltelluride mit einem β-Wasserstoffatom als besonders brauchbar erwiesen, weil sie schnell mit Singulettsauerstoff zu einem Olefin reagieren. Die Reaktionsrate hängt von der Elektronenverfügbarkeit (Oxidationspotenzial) des Tellurs. Zum Beispiel können elektronenspendende Gruppen an einem Arylringsubstituenten an dem Telluratom die Reaktionsrate erhöhen. Ein Wechsel von Tellur zu Selen (dem nächstniedrigeren Chalcogenid) verringert die Rate, erhöht aber die Stabilität des Moleküls gegenüber spontaner Oxidation.
Wenn der Fluoreszenzverbindungsvorläufer ein Hydrazin oder Hydrazid enthält, so kann die Reaktion mit Singulettsauerstoff eine Doppelbindung hervorbringen. Zum Beispiel kann Singulettsauerstoff Hydrazide direkt in Fluoreszenzverbindungen umwandeln, wie bei der Umwandlung von 1,2-Indazolin-3-one in 1,2-Indazol-3-one. Das Oxidationspotenzial eines Hydrazins ist ein wichtiger Faktor für die Erreichung einer hohen Reaktionsrate. Elektronenabziehende Gruppen wie zum Beispiel eine Acyl-Gruppe (zum Beispiel wie in einem Hydrazid) verlangsamen die Reaktion, obgleich Acylhydrazide und Diacylhydrazide in der vorliegenden Erfindung immer noch als Fluoreszenzverbindungsvorläufer verwendet werden können.
Ein weiteres Beispiel einer brauchbaren Singulettsauerstoffreaktion ist die Reaktion mit elektronenreichen Olefinen, wie zum Beispiel jenen, die in der europäischen veröffentlichten Patentanmeldung Nr. 0 515 194 beschrieben sind. Es werden zwei grundlegende Reaktionstypen beschrieben. Einer davon ist die "ene"-Reaktion, die die Position einer Doppelbindung verschiebt und ein Hydroperoxid entstehen lässt. Die Doppelbindungsverschiebung kann bewirken, dass zwei auxochrome Gruppen in dem Fluoreszenzverbindungsvorläufer in Konjugation kommen und so eine Fluoreszenzverbindung entstehen lassen.
Andere Fluoreszenzverbindungsvorläufer reagieren mit Singulettsauerstoff zu Hydroperoxiden, die intern mit einer oxidierbaren Gruppe zu einer Fluoreszenzverbindung reagieren können. Alternativ kann ein Hydroperoxid, das durch Reaktion von Singulettsauerstoff mit einem Fluoreszenzverbindungsvorläufer gebildet wird, wie zum Beispiel 1,3-Diphenylpropen, zum Oxidieren der Leuco-Form eines Farbstoffs dienen, der als eine Nebenverbindung vorliegt, so dass eine Fluoreszenzverbindung entsteht. Das Hydroperoxid kann auch ein Element der Gruppe V in einer Nebenverbindung mit Sauerstoff anreichern, damit sie nicht länger als ein elektronenspendender Löscher einer assoziierten fluoreszenten Gruppe agiert. Die Nebenverbindung könnte alternativ ein Selen- oder Telluratom haben, das mit einem Hydroperoxid zu einem Zwischenprodukt reagieren könnte, das anschließend eliminiert werden könnte, so dass eine Fluoreszenzverbindung entsteht.
Die Struktur des Fluoreszenzverbindungsvorläufers hängt darum von der konkreten Singulettsauerstoffreaktion ab, die verwendet werden soll, und sie ist gewöhnlich dafür ausgelegt zu gewährleisten, dass alle anschließenden Reaktionen, die durch Reaktion mit Singulettsauerstoff initiiert werden und zum Erzeugen einer Fluoreszenzverbindung erforderlich sind, relativ schnell ablaufen. Außerdem führt die Struktur des Fluoreszenzverbindungsvorläufers zur Entstehung einer Fluoreszenzverbindung, die die gewünschten Absorptions- und Abstrahlungswellenlängen hat und relativ hohe Fluoreszenzquantenausbeuten aufweist, bevorzugt >0,1, besonders bevorzugt größer als 0,4, und einen hohen Extinktionskoeffizienten bei der gewünschten Erregungswellenlänge aufweist, bevorzugt >1000 M^–1 cm^–1, besonders bevorzugt >10.000 M^–1 cm^–1.
Besonders bevorzugt unter diesen Verbindungen sind jene Verbindungen, die ein Tellur enthalten.
Es können auch andere Klassen von Fluoreszenzverbindungsvorläufern in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel werden Verbindungen, die bei Reaktion mit Singulettsauerstoff Chemilumineszenz erzeugen, häufig zu fluoreszenten Produkten umgewandelt, die als Fluoreszenzverbindungen der vorliegenden Erfindung dienen können.
Beispiele von Fluoreszenzverbindungsvorläufern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt.
Andere Klassen von Vorläufern für lichtaktive Indikatoren können ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel werden Verbindungen, die bei Reaktion mit Singulettsauerstoff chemilumineszieren, häufig zu fluoreszenten Produkten umgewandelt, die als lichtempfindliche Indikatoren der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Beispiele solcher Vorläufer für lichtaktive Indikatoren und die lichtempfindlichen Indikatoren, die bei Reaktion mit Singulettsauerstoff entstehen, sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
"Fluoreszenzverbindung": meint ein Molekül, das nach der Absorption von Licht mit Wellenlängen von 250 bis 1100 nm, bevorzugt 300 bis 950 nm, Licht durch Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, bevorzugt durch Fluoreszenz, abgibt oder seine Erregungsenergie an ein Akzeptormolekül überträgt, das daraufhin Licht durch Fluoreszenz oder Phosphoreszenz aussendet. Die Abstrahlungsquantenausbeute ist bevorzugt hoch, gewöhnlich wenigstens 0,1, bevorzugt wenigstens 0,4, besonders bevorzugt größer als 0,7 und der Extinktionskoeffizient des Absorptionsmaximums ist gewöhnlich größer als 5000 M^–1 cm^–1.
Zu typischen Fluoreszenzverbindungen gehören zum Beispiel Fluoreszenzaufheller, die in der Regel Licht zwischen 300 und 400 Nanometern absorbieren und zwischen 400 und 500 Nanometern aussenden; Xanthene wie zum Beispiel Rhodamin und Fluorescein; Bimane; Coumarine wie zum Beispiel Umbelliferon; aromatische Amine wie zum Beispiel Dansyl; Squarat-Farbstoffe; Benzofurane; Cyanine, Merocyanine, Seltenerdenchelate und dergleichen. Zu Phosphoreszenzverbindungen gehören Porphyrine, Phthalocyanine, polyaromatische Verbindungen wie zum Beispiel Pyren, Anthracen und Acenaphthen.
"Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag": jede Substanz außer molekularem Sauerstoff, die in der Lage ist, Wasserstoffperoxid entweder direkt oder über die Bildung eines oder mehrerer Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Wasserstoffperoxid hervorzubringen, zu erzeugen. Verbindungen, die zu Wasserstoffperoxid umgewandelt werden können oder die die Entstehung von Wasserstoffperoxid katalysieren können oder die als Katalysator für die Entstehung von Wasserstoffperoxid existieren oder die in einen Katalysator für die Entstehung von Wasserstoffperoxid umgewandelt werden können, können als Analyten in dem Verfahren dieser Erfindung detektiert werden und sind in der obigen Definition von "Verbindungen, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermögen" enthalten.
Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung dafür verwendet werden, Enzyme wie zum Beispiel Phosphatase, Amylase, Cholinesterase, Creatininkinase und dergleichen und Enzymsubstrate wie zum Beispiel Glucose, Cholesterin, Creatinin, Harnsäure und dergleichen zu detektieren. Die folgende Besprechung veranschaulicht, beispielhaft und ohne Einschränkung, das oben Dargelegte, wobei H₂O₂ entweder direkt oder indirekt über die Entstehung eines oder mehrerer Zwischenprodukte in einem System erzeugt wird, das schlussendlich H₂O₂ erzeugt

1) Amylase katalysiert die Reaktion ihres Substrats Stärke zu dem Zwischenprodukt Glucose, einem Substrat für Glucoseoxidase (1.1.3.4), das in Gegenwart von molekularem Sauerstoff die Umwandlung von Glucose zu Gluconsäure katalysiert, wobei auch H₂O₂ entsteht.
2) Cholinesterase katalysiert die Reaktion ihres Substrats Acetylcholin zu dem Zwischenprodukt Cholin, einem Substrat für Cholinoxidase (1.1.3.17), das die Umwandlung von Cholin zu Trimethylammoniumacetaldehyd katalysiert, wobei auch H₂O₂ entsteht.
3) Creatininkinase katalysiert die Reaktion ihres Substrats Creatinin in Gegenwart von Adenosindiphosphat (ADP) zu dem Zwischenprodukt Adenosintriphosphat (ATP), das in Gegenwart von Hexokinase die Umwandlung von Glucose zu dem Zwischenprodukt Glucose-6-phosphat (G-6-P) bewirkt, das seinerseits ein Substrat für das Enzym Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) ist, wobei NAD während der katalytischen Reaktion von G-6-P mit G-6-PDH zu dem Zwischenprodukt NADH umgewandelt wird; bei der Reaktion von NADH-FMN-Oxidoreduktase (1.6.99.3) mit NADH entstehen H₂O₂ und NAD.
4) Phosphatase katalysiert die Reaktion ihres Substrats CH₃-CH₂-OPO₃-H₂ zu dem Zwischenprodukt Ethanol, das seinerseits ein Substrat für das Enzym Alkoholdehydrogenase (ADH) ist, wobei NAD während der katalytischen Reaktion von Ethanol mit ADH zu Acetaldehyd zu dem Zwischenprodukt NADH umgewandelt wird; bei der Reaktion von NADH-FMN-Oxidoreduktase (1.6.99.3) mit NADH entstehen H₂O₂ und NAD.
5) Bei der katalytischen Reaktion von Lactatdehydrogenase mit ihrem Substrat Lactat in Gegenwart von NAD wird das Zwischenprodukt NADH gebildet; bei der Reaktion von NADH-FMN-Oxidoreduktase (1.6.99.3) mit NADH entstehen H₂O₂ und NAD.
6) Glucose ist ein Enzymsubstrat für Glucoseoxidase (1.1.3.4), wobei als Produkte Gluconsäure und H₂O₂ entstehen.
7) Cholesterin ist ein Enzymsubstrat für Cholesterinoxidase, wobei während der Reaktion H₂O₂ entsteht.
8) Creatinin ist ein Enzymsubstrat für Creatininamidinhydrolase, wodurch das Zwischenprodukt Sarcosin erzeugt wird, das seinerseits ein Enzymsubstrat für das Enzym Sarcosinoxidase (1.5.3.1) ist, wobei die Produkte Formaldehyd und H₂O₂ sind.
9) Harnsäure ist ein Enzymsubstrat für Uricase, wobei H₂O₂ während der katalytischen Reaktion entsteht.

Wasserstoffperoxid wird auch durch bestimmte Arten von Zellen erzeugt, so dass die vorliegende Erfindung den Nachweis von Wasserstoffperoxid als einen Indikator für Zellenaktivität ermöglicht.
Wasserstoffperoxid entsteht auch durch Substrate für Oxidaseenzyme bei der katalysierten Reaktion des Substrats mit molekularem Sauerstoff. Bei einer solchen Reaktion wird das Substrat oxidiert und ist der Wasserstoffspender, und molekularer Sauerstoff ist der Akzeptor. Zu solchen Substraten und ihren entsprechenden Oxidasen gehören, nur beispielhaft und ohne Einschränkung, folgende:
"Analyt": die zu detektierende Verbindung oder Zusammensetzung, die Wasserstoffperoxid oder eine Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, enthält.
Der Begriff "Analyt" beinhaltet auch Verbindungen oder Zusammensetzungen, bei denen es sich nicht um Wasserstoffperoxid oder um eine Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, handelt und deren Nachweis die Verwendung eines signalerzeugenden Systems, zum Beispiel Enzymsystems, beinhaltet, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wird. Der Analyt kann aus einem Partner eines spezifischen Bindungspaares (sBP) bestehen und kann ein Ligand sein, der monovalent (monoepitop) oder polyvalent (polyepitop), gewöhnlich antigenisch oder haptenisch, ist und eine Einzelverbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen ist, die wenigstens eine gemeinsame epitope oder determinante Stelle haben. Der Analyt kann ein Teil einer Zelle, wie zum Beispiel Bakterien, oder eine Zelle, die ein Blutgruppenantigen wie zum Beispiel A, B, D usw. trägt, oder ein HLA-Antigen oder ein Mikroorganismus, zum Beispiel Bakterium, Pilz, Protozoen oder Virus, sein.
Die polyvalenten Ligand-Analyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon. Zu solchen Kombinationen gehören Bestandteile von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Nuklei, Zellmembranen und dergleichen.
Die polyepitopen Ligand-Analyten, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, haben größtenteils ein Molekulargewicht von wenigstens etwa 5.000, häufiger wenigstens etwa 10.000. In der Poly(aminosäure)-Kategorie haben die interessierenden Poly(aminosäuren) im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 5.000.000, häufiger von etwa 20.000 bis 1.000.000. Unter den interessierenden Hormonen liegen die Molekulargewichte gewöhnlich im Bereich von etwa 5.000 bis 60.000.
Eine breite Vielfalt von Proteinen kann hinsichtlich der Familie von Proteinen mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, Proteinen mit besonderen biologischen Funktionen, Proteinen, die zu bestimmten Mikroorganismen, insbesondere krankheitserregende Mikroorganismen, gehören, usw. in Betracht gezogen werden. Zu solchen Proteinen gehören zum Beispiel Immunoglobuline, Cytokine, Enzyme, Hormone, Krebs-Antigene, Ernährungsmarker, gewebespezifische Antigene usw. Zu solchen Proteinen gehören, nur beispielhaft und ohne Einschränkung, Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Scleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nukleoproteine, Glycoproteine, T-Zellenrezeptoren, Proteoglycane, HLA, unklassifizierte Proteine, zum Beispiel Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin, Proteine, die man in menschlichem Plasma findet, Blutgerinnungsfaktoren, Proteinhormone wie zum Beispiel follikelstimulierende Hormone, luteinisierende Hormone, Luteotropin, Prolactin, Choriongonadotropin, Gewebshormone, Cytokine, Krebs-Antigene wie zum Beispiel PSA, CEA, a-Fetoprotein, Säurephosphatase, CA19.9 und CA125, gewebespezifische Antigene, wie zum Beispiel Alkalinphosphatase, Myoglobin, CPK-MB und Calcitonin, und Peptidhormone. Weitere interessierende Polymermaterialien sind Mucopolysaccharide und Polysaccharide.
Die monoepitopen Ligand-Analyten haben im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2.000, häufiger von 125 bis 1.000. Zu den Analyten gehören Arzneistoffe, Metaboliten, Pestizide, Verunreinigungsstoffe und dergleichen. Zu den interessierenden Arzneistoffen gehören zum Beispiel Alkaloide. Zu den Alkaloiden gehören Morphinalkaloide, zu denen Morphin, Codein, Heroin, Dextromethorphan, ihre Derivate und Metaboliten zählen; Kokainalkaloide, zu denen Kokain und Benzylecgonin, ihre Derivate und Metaboliten zählen; Ergotalkaloide, zu denen das Diethylamid von Lysergsäure zählt; Steroidalkaloide; Iminazoylalkaloide; Quinazolinalkaloide; Isoquinolinalkaloide; Quinolinalkaloide, zu denen Quinin und Quinidin zählen; Diterpenalkaloide, ihre Derivate und Metaboliten.
Zur nächsten Gruppe von Arzneistoffen gehören Steroide, zu denen die Östrogene, Androgene, Andreokortikalsteroide, Gallensäuren, kardiotinischen Glycoside und Aglycone zählen, zu denen Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, ihre Derivate und Metaboliten zählen. Dazu gehören auch die steroidmimetischen Substanzen, wie zum Beispiel Diethylstilbestrol.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Laktame mit 5 bis 6 Ringgliedern, zu denen die Barbiturate, zum Beispiel Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantoin, Primidon, Ethosuximid und ihre Metaboliten gehören.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoalkylbenzene, mit Alkyl von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, zu denen die Amphetamine; Catecholamine, zu denen Ephedrin, L-dopa, Epinephrin zählen; Narcein; Papaverin; und Metaboliten der oben genannten Stoffe gehören.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Benzheterocyclen, zu denen Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, ihre Derivate und Metaboliten gehören, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Purine, zu denen Theophyllin, Koffein, ihre Metaboliten und Derivate gehören.
Zur nächsten Gruppe von Arzneistoffen gehören jene, die von Marihuana abgeleitet sind, wozu Cannabinol und Tetrahydrocannabinol zählen.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Hormone, wie zum Beispiel Thyroxin, Cortisol, Triiodothyronin, Testosteron, Estradiol, Estrone, Progestron, Polypeptide wie zum Beispiel Angiotensin, LHRH, und Immunsuppressoren wie zum Beispiel Cyclosporin, FK506, Mycophenolsäure und so weiter.
Zur nächsten Gruppe von Arzneistoffen gehören die Vitamine wie zum Beispiel A, B, zum Beispiel B12, C, D, E und K, Folsäure, Thiamin.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Prostaglandine, die sich durch den Grad und die Stellen der Hydroxylierung und Ungesättigtheit unterscheiden.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die tricyclischen Antidepressiva, zu denen Imipramin, Dismethylimipramin, Amitriptylin, Nortriptylin, Protriptylin, Trimipramin, Chlomipramin, Doxepin und Desmethyldoxepin gehören.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Anti-Neoplastika, zu denen Methotrexat gehört.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Antibiotika, zu denen Penicillin, Chlormycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin, ihre Metaboliten und Derivate gehören.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Nukleoside und Nukleotide, zu denen ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit ihren entsprechenden Zucker- und Phosphatsubstituenten gehören.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind sonstige individuelle Arzneistoffe, zu denen Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valpronsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Chloramphenicol, anticholinergenische Arzneistoffe, wie zum Beispiel Atropin, ihre Metaboliten und Derivate gehören.
Metaboliten, die zu Krankheitszuständen gehören, zählen Spermin, Galactose, Phenylpyruvinsäure und Porphyrin Typ 1.
Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoglycoside, wie zum Beispiel Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.
Zu den interessierenden Pestiziden gehören zum Beispiel polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide, ihre Metaboliten und Derivate.
Bei Rezeptor-Analyten liegen die Molekulargewichte im Allgemeinen im Bereich von 10.000 bis 2 × 10⁸, häufiger von 10.000 bis 10⁶. Bei Immunoglobulin, IgA, IgG, IgE und IgM variieren die Molekulargewichte im Allgemeinen von etwa 160.000 bis etwa 10⁶. Enzyme haben normalerweise ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 10.000 bis 1.000.000. Natürliche Rezeptoren variieren in einem weiten Bereich. Im Allgemeinen beträgt das Molekulargewicht wenigstens etwa 25.000 und kann bis 10⁶ oder höher reichen, wie zum Beispiel bei Materialien wie Avidin, DNS, RNS, thyroxinbindendes Globulin, thyroxinbindendes Präalbumin, Transcortin usw.
Die Begriff "Analyt" beinhaltet des Weiteren Polynukleotid-Analyten wie zum Beispiel jene Polynukleotide, die unten definiert sind. Dazu gehören m-RNS, r-RNS, t-RNS, DNS, DNS-RNS-Duplexe usw. Der Begriff "Analyt" beinhaltet außerdem Rezeptoren, die polynukleotidbindende Stoffe sind, wie zum Beispiel Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nukleasen, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme, chemotherapeutische Stoffe und dergleichen.
Der Analyt kann ein Molekül sein, das direkt in einer Probe gefunden wird, wie zum Beispiel biologisches Gewebe, einschließlich Körperfluiden, von einem Wirt. Die Probe kann direkt untersucht werden oder kann vorbehandelt werden, damit der Analyt leichter erkennbar wird. Des Weiteren kann der interessierende Analyt bestimmt werden, indem man ein Agens detektiert, das den Nachweis für den interessierenden Analyten darstellt, wie zum Beispiel ein Partner eines spezifischen Bindungspaares, der zu dem interessierenden Analyten komplementär ist, dessen Vorhandensein nur detektiert wird, wenn der interessierenden Analyt in einer Probe vorliegt. Somit wird das Agens, das den Nachweis für den Analyten bildet, zum Analyten, der in einem Assay detektiert wird. Zu biologischem Gewebe zählen exzidiertes Gewebe von einem Organ oder einem anderen Körperteil eines Wirtes sowie Körperfluide, zum Beispiel Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Samen, Stuhl, Sputum, Gehirn-Rückenmarks-Fluid, Tränen, Mucus und dergleichen.
"Katalysator, der die Entstehung von Singulettsauerstoff katalysieren kann": eine Substanz, die direkt oder indirekt die Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu Singulettsauerstoff katalysieren kann, gewöhnlich ein Enzym. Zu Beispielen solcher Katalysatoren gehören, lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung, Enzyme wie zum Beispiel Peroxidasen oder Enzyme mit Peroxidaseaktivität, wie zum Beispiel Lactoperoxidase, Haloperoxidase, Metalle, wie zum Beispiel Platin, und Übergangsmetalle, wie zum Beispiel Wolframat-, Titanat-, Vanadat- und Molybdatsalze, und Lanthanidoxide, zum Beispiel Europiumoxid, Ytterbiumoxid und so weiter.
Bestimmte Enzyme erfordern ein anderes Substrat als Wasserstoffperoxid, um die Entstehung von Singulettsauerstoff hervorzurufen. Dementsprechend muss ein solches Substrat in einem Assaymedium enthalten sein. Zum Beispiel sind Chlorid- oder Bromidionen bekannte Substrate für Haloperoxidasen und Lactoperoxidase und werden durch Wasserstoffperoxid enzymatisch zu Chlor bzw. Brom oxidiert. Die resultierenden Halogene reagieren bekanntlich weiter mit Wasserstoffperoxid zu Singulettsauerstoff. Prinzipiell können auch andere Peroxidase-Substrate verwendet werden, die die Entstehung von Singulettsauerstoff bewirken.
"Matrix": ein Träger, der aus einem organischen oder anorganischen, festen oder fluiden, wasserunlöslichen Material besteht, das transparent oder teilweise transparent sein kann. Die Hauptanforderung an die Matrix ist, dass sie die Diffusion von Singulettsauerstoff darin wenigstens ungefähr zu der Stelle des eingearbeiteten Markers gestattet. Es ist bevorzugt, dass die Matrix auch Bestandteile der Probe ausschließt, die mit Singulettsauerstoff reagieren können oder das Signal von dem CC oder der Fluoreszenzverbindung beeinträchtigen können. Die Matrix kann eine beliebige aus einer Anzahl von Formen haben, wie zum Beispiel Partikel, einschließlich Kügelchen, Film, Membran, Röhre, Mulde, Streifen, Stab und dergleichen. Die Oberfläche der Matrix ist vorzugsweise hydrophil oder lässt sich hydrophilieren. Der Körper der Matrix ist vorzugsweise hydrophob. Die Matrix kann in dem Medium, in dem sie verwendet wird, suspendierbar sein. Beispiele suspendierbarer Matrizes gemäß der vorliegenden Erfindung sind, lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung, Polymermaterialien wie zum Beispiel Latex, Lipiddoppelschichten, Öltröpfchen, Zellen und Hydrogele. Zu weiteren Matrixzusammensetzungen gehören Polymere, wie zum Beispiel Nitrocellulose, Celluloseacetat, Poly(vinylchlorid), Polyacrylamid, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyren, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw., entweder für sich allein verwendet oder in Verbindung mit anderen Materialien.
Das Binden des Katalysators und gegebenenfalls von sBP-Partnern an die Matrix kann direkt oder indirekt, kovalent oder nicht-kovalent sein und kann mittels einschlägig bekannter Techniken erreicht werden, die in der Literatur nachgeschlagen werden können. Siehe zum Beispiel "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978), und Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970).
Die Oberfläche der Matrix ist gewöhnlich polyfunktional oder lässt sich polyfunktionalisieren oder lässt sich durch spezifische oder unspezifische kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen an einen Katalysator, einen sBP-Partner oder dergleichen binden. Eine solche Bindung ist indirekt, wo spezifische, nicht-kovalente Wechselwirkungen stattfinden, und ist direkt, wo kovalente Wechselwirkungen stattfinden. Ein breite Vielfalt von funktionalen Gruppen stehen zur Verfügung oder lassen sich einarbeiten. Zu funktionalen Gruppen gehören Carbonsäuren, Aldehyde, Amino-Gruppen, Cyano-Gruppen, Ethylen-Gruppen, Hydroxyl-Gruppen, Mercapto-Gruppen und dergleichen. Die Art und Weise des Verknüpfees einer breiten Vielfalt von Verbindungen mit Oberflächen ist einschlägig bekannt und ist in der Literatur zur Genüge veranschaulicht (siehe oben). Die Länge einer Verknüpfungsgruppe zu dem Oligonukleotid oder sBP-Partner kann über einen weiten Bereich variieren, und zwar je nach der Art der verknüpften Verbindung, der Auswirkung der Entfernung zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und der Oberfläche auf die Eigenschaften der spezifischen Bindung und dergleichen.
Die Menge des Katalysators, der an die Oberfläche der Matrix gebunden wird, hängt von einer Reihe von Faktoren ab, darunter der Art des Katalysators und der vorgesehenen Verwendung der Zusammensetzung. Der Katalysator liegt auf der Matrix in einer Menge vor, die nach Erfahrungswerten so gewählt ist, dass das stärkste Signal relativ zum Hintergrund in einem Assay entsteht. Weil der Marker ein Hintergrundsignal haben kann, kann es zweckmäßig sein, ein hohes Verhältnis des Katalysators zu der Markerverbindung zu haben, insbesondere wenn ein Leuchtstoff-Vorläufer verwendet wird. Relativ hohe Mengen an Katalysator erhöhen auch die Rate oder die Empfindlichkeit des Assays, aber Kosten und unerwünschte Oberflächeneigenschaften können bei einigen Katalysatoren Beschränkungen auferlegen. Die Oberflächendichte des Katalysators auf der Matrix liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 10⁸ bis 10¹⁴ Molekülen je Quadratzentimeter, gewöhnlich 10⁹ bis 10¹² Molekülen je Quadratzentimeter.
Wie oben angesprochen, ist ein Marker in die Matrix eingearbeitet. Der Marker kann in die Matrix entweder während oder nach der Herstellung der Matrix eingearbeitet werden. Der Marker wird gewöhnlich so gewählt, dass er sich in der Matrix auflöst, doch er kann auch kovalent an die Matrix angeheftet werden. Die Markerverbindungen sind gewöhnlich hydrophob, um ihre Fähigkeit zu mindern, sich von der Matrix abzutrennen. Im Allgemeinen wird die Matrixzusammensetzung so gewählt, dass eine Assoziation des Markers mit der Matrix begünstigt wird. Die Menge an Marker, die in die Matrix in den Zusammensetzungen der Erfindung eingearbeitet wird, hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, wie zum Beispiel der Art des Markers und der Matrix und der vorgesehenen Verwendung der Zusammensetzung. Der Marker liegt in der Matrix in einer Menge vor, die notwendig ist, um das Signal, das gemäß der Erfindung erzeugt wird, zu maximieren, d. h. um das stärkste Signal relativ zum Hintergrund in einem Assay zu erhalten. Im Allgemeinen wird die Menge an Marker anhand von Erfahrungswerten festgelegt und liegt gewöhnlich bei etwa 10^–8 bis 5 M, bevorzugt 10^–5 bis 10^–2 M, besonders bevorzugt 10^–3 bis 10^–1 M.
Die Oberflächendichte des sBP-Partners auf der Matrix liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 10⁸ bis 10¹⁴ Molekülen je Quadratzentimeter, gewöhnlich 10⁹ bis 10¹² Molekülen je Quadratzentimeter. Die konkrete Menge des sBP-Partners hängt ebenfalls von einer Anzahl von Faktoren ab und wird gewöhnlich am besten anhand von Erfahrungswerten bestimmt.
"Partikel": Partikel von wenigstens etwa 20 nm und nicht mehr als etwa 20 Mikron, gewöhnlich wenigstens etwa 40 nm und weniger als etwa 10 Mikron, bevorzugt von etwa 0,10 bis 2,0 Mikron Durchmesser, normalerweise mit einem Volumen von weniger als 1 Pikoliter. Der Partikel kann jede beliebige Dichte haben, hat aber bevorzugt eine Dichte ähnlich der von Wasser, im Allgemeinen etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/ml. Die Partikel können gegebenenfalls eine Ladung haben, und wenn sie geladen sind, so sind sie bevorzugt negativ. Die Partikel können fest sein (zum Beispiel aus organischen und anorganischen Polymeren oder Latex bestehen), als Öltröpfchen (zum Beispiel Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenwasserstoff, Siliciumfluid) oder als Vesikel vorliegen (zum Beispiel synthetisch, wie zum Beispiel Phospholipid, oder natürlich, wie zum Beispiel Zellen und Organellen).
Die festen Partikel sind normalerweise Polymere, entweder Additions- oder Kondensationspolymere, die sich problemlos in dem Assaymedium dispergieren lassen. Die festen Partikel sind auch adsorptiv oder funktionalisierbar, um an ihrer Oberfläche, entweder direkt oder indirekt, einen sBP-Partner zu binden oder anzuheften und um in ihrem Volumen einen Marker aufzunehmen, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, wie zum Beispiel ein chemilumineszentes Olefin.
Die festen Partikel können aus Polystyren, Polyacrylamid, Homopolymeren und Copolymeren von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Estern und Amiden, Silikonen und dergleichen bestehen.
Die Partikel sind normalerweise an einen Katalysator und, in einigen Fällen, an einen sBP-Partner gebunden oder angeheftet, wie oben beschrieben.
"Öltröpfchen": sind mit Wasser nicht mischbare Fluidpartikel, die aus einer lipophilen Verbindung bestehen und mit einem Emulgator überzogen und stabilisiert sind, der ein amphiphiles Molekül ist, wie zum Beispiel Phospholipide, Sphingomyelin, Albumin und dergleichen, die in einer Suspension in einer wässrigen Lösung, d. h. einer Emulsion, vorliegen.
Die Phospholipide basieren auf aliphatischen Carboxylsäureestern von aliphatischen Polyolen, wobei wenigstens eine Hydroxyl-Gruppe durch ein Carboxylsäureester von etwa 8 bis 36, häufiger von etwa 10 bis 20 Kohlenstoffatomen, substituiert ist, das 0 bis 3 Stellen, häufiger 0 bis 1 Stelle, mit ethylenischer Ungesättigtheit aufweist, und wobei wenigstens 1, normalerweise nur 1, Hydroxyl-Gruppe durch Phosphat substituiert ist, so dass ein Phosphatester gebildet wird. Die Phosphat-Gruppe kann weiter durch kleine aliphatische Verbindungen substituiert sein, die difunktional oder von höherer Funktionalität sind und im Allgemeinen Hydroxyl- oder Amino-Gruppen aufweisen.
Emulsionen, die Öltröpfchen umfassen, können gemäß den herkömmlichen Verfahrensweisen hergestellt werden, und zwar durch Kombinieren der entsprechenden lipophilen Verbindungen mit einer oberflächenaktiven Substanz, anionisch, kationisch oder nicht-ionisch, wobei die oberflächenaktive Substanz in etwa 0,1 bis 5, häufiger von etwa 0,1 bis 2, Gewichtsprozent des Gemisches vorliegt, und durch Agitieren des Gemisches in einem wässrigen Medium, wie zum Beispiel mittels Beschallung oder Verwirbelung. Zu veranschaulichenden lipophilen Verbindungen gehören Kohlenwasserstofföle, Halogenkohlenwasserstoffe, einschließlich Fluorkohlenwasserstoffe, Alkylphthalate, Trialkylphosphate, Triglyceride usw.
Ein Katalysator wird gewöhnlich an die Oberfläche des Öltröpfchens adsorbiert oder direkt oder indirekt an die Oberflächenkomponente des Öltröpfchens gebunden.
Es folgt eine Aufzählung, lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung, von amphiphilen Verbindungen, die zum Stabilisieren von Öltröpfchen verwendet werden können: Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidinsäure, Kardiolipin, Lecithin, Galactocerebrosid, Sphingomyelin, Dicetylphosphat, Phosphatidylinositol, 2-Trihexadecylammoniumethylamin, 1,3-bis(octadecylphosphat)-propanol, Stearoyloxyethylenphosphate, Phospholipide, Dialkylphosphate, Natriumdodecylsulfat, kationische Detergenzien, anionische Detergenzien, Proteine wie zum Beispiel Albumin, nicht-ionische Detergenzien usw.
Es können noch weitere Verbindungen verwendet werden, die lipophile Gruppen haben und die zuvor beschrieben wurden. Größtenteils haben diese Verbindungen eine lipophile Komponente, wie zum Beispiel ein Alkylbenzen, mit Alkyl-Gruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich Gemische aus Alkyl-Gruppen, die gerad- oder verzweigtkettig sein können, und eine hydrophile Komponente wie zum Beispiel ein Carboxyl-Gruppe, eine Hydroxyl-Gruppe, eine Polyoxyalkylen-Gruppe (Alkylen von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen), eine Sulfonsäure-Gruppe oder eine Amino-Gruppe. Es können aliphatische Fettsäuren verwendet werden, die normalerweise etwa 10 bis 36, häufiger etwa 12 bis 20 Kohlenstoffatome aufweisen. Es können auch Fettalkohole mit den Kohlenstoffgrenzwerten, die für die Fettsäuren angezeigt sind, Fettamine mit ähnlichen Kohlenstoffbeschränkungen sowie verschiedene Steroide Verwendung finden.
Die Öltröpfchen können ein Fluorkohlenwasserstofföl oder ein Silikonöl (Siliciumpartikel) umfassen. Solche Tröpfchen werden von Giaever in den US-Patenten Nr. 4,634,681 und Nr. 4,619,904 beschrieben. Diese Tröpfchen werden durch Dispergieren eines Fluorkohlenwasserstofföls oder Silikonöl in einer wässrigen Phase gebildet. Die Tröpfchen stellt man her, indem man eine kleine Menge des gewählten Öls (solche Öle sind im Allgemeinen auf dem freien Markt erhältlich) in einen Behälter mit einer großen Menge der wässrigen Phase gibt. Das flüssige System wird agitiert, um eine Emulgierung zu bewirken, und wird dann zentrifugiert. Die homogene Phase wird entfernt, und die restlichen Tröpfchen werden in einem wässrigen gepufferten Medium resuspendiert. Die oben erwähnten Zentrifugierungs- und Dekantierungsschritte können ein- oder mehrere Male wiederholt werden, bevor die Tröpfchen verwendet werden.
Katalysator und sBP-Partner können in einer Anzahl von Wegen an die Tröpfchen gebunden werden. Wie von Giaever beschrieben (siehe oben), kann der konkrete sBP-Partner, zum Beispiel ein proteinischer sBP-Partner, auf die Tröpfchen aufbeschichtet werden, indem man einen Überschuss des sBP-Partners vor oder nach dem Emulgierungsschritt in das wässrige Medium gibt. Waschschritte sind zweckmäßig, um überschüssigen sBP- Partner zu entfernen. Eine Funktionalisierung des Öls führt zu Funktionalitäten, die oben für das Verknüpfen mit sBP-Partnern beschrieben wurden.
Ein chemilumineszentes Olefin als ein Marker wird oft so gewählt, dass es in der Ölphase des Öltröpfchens löslich ist. Wenn das Öl ein Fluorkohlenwasserstoff ist, so ist ein fluoriniertes chemilumineszentes Olefin oft besser löslich als die entsprechende unfluorinierte Ableitung.
Es finden noch weitere Öltröpfchen, die von Giaever beschrieben werden, in der vorliegenden Erfindung Verwendung.
"Liposome": Mikrovesikel, die aus einer oder mehreren Lipiddoppelschichten bestehen, von ungefährer Kugelgestalt; sind eines der bevorzugten Materialien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Die Liposome haben einen Durchmesser von wenigstens etwa 20 nm und nicht mehr als etwa 20 Mikron, gewöhnlich wenigstens etwa 40 nm und weniger als etwa 10 Mikron. Bevorzugt misst der Durchmesser der Liposome weniger als etwa zwei Mikron, um ein Absetzen oder Aufschwimmen zu begrenzen.
Die äußere Hülle eines Liposoms besteht aus einer amphiphilen Doppelschicht, die ein Volumen aus Wasser oder einer wässrigen Lösung umschließt. Liposome mit mehr als einer einzigen Doppelschicht werden als multilamellare Vesikel bezeichnet. Liposome mit nur einer einzigen Doppelschicht werden als unilamellare Vesikel bezeichnet. Multilamellare Vesikel sind in der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn ein lipophiles chemilumineszentes Olefin verwendet wird, weil sie größere Mengen dieses Materials aufnehmen können als unilamellare Vesikel. Die amphiphile Doppelschicht besteht häufig aus Phospholipiden. Die Phospholipide, die zur Herstellung von Partikeln verwendet werden, die sich für die vorliegende Erfindung eignen, können jedes beliebige Phospholipid oder Phospholipid-Gemisch sein, das sich in natürlichen Membranen findet, einschließlich Lecithin, oder synthetische Glycerylphosphatdiester von gesättigten oder ungesättigten linearen Fettsäuren mit 12 Kohlenstoffatomen oder 24 Kohlenstoffatomen, wobei das Phosphat als ein Monoester oder als ein Ester eines polaren Alkohols vorliegen kann, wie zum Beispiel Ethanolamin, Cholin, Inositol, Serin, Glycerol und dergleichen. Zu besonders bevorzugten Phospholipiden gehören L-a-Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPO), Palmitoyloleoylphosphatidylglycerol (POPG), L-a-Dioleoylphosphatidylglycerol, L-a(Dioleoyl)-phosphatidylethanolamin (DOPE) und L-a(dioleoyl)-phosphatidyl-(4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexan-1-carboxyamido)ethanol (DOPE-MCC).
Die Phospholipide in der Doppelschicht können mit Cholesterin ergänzt werden und können durch andere amphiphile Verbindungen ersetzt werden, die eine polare Kopf-Gruppe, gewöhnlich geladen, und einen hydrophoben Abschnitt aufweisen, der gewöhnlich aus zwei linearen Kohlenwasserstoffketten besteht. Zu Beispielen solcher Substituenten gehören Dialkylphosphate, Dialkoxypropylphosphate, wobei die Alkyl-Gruppen lineare Ketten von 12-20 Kohlenstoffatomen aufweisen, N-(2,3-di-(9-(Z)-octadecenyloxy))-prop-1-yl-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), Sphingomyelin, Kardiolipin und dergleichen.
Liposome, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, haben bevorzugt ein hohe negative Ladungsdichte, um die Suspension zu stabilisieren und eine spontane Aggregation zu verhindern.
Für Verwendung in der vorliegenden Erfindung sollten die Liposome in der Lage sein, sich an einen Katalysator zu binden, und in der Lage sein, einen Marker zu haben, wie zum Beispiel ein chemilumineszentes Olefin, das entweder mit der wässrigen oder die nicht-wässrigen Phase assoziiert ist.
Liposome können mittels vielfältiger Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel Hydratation und mechanische Dispersion von getrocknetem Phospholipid oder Phospholipid-Substitut in einer wässrigen Lösung. Auf diese Weise hergestellte Liposome haben eine Vielfalt von Abmessungen, Zusammensetzungen und Verhaltensweisen. Ein Verfahren zum Verringern der Heterogenität und Ungleichmäßigkeit des Verhaltens von mechanisch dispergierten Liposomen ist die Beschallung. Ein solches Verfahren verringert die durchschnittliche Liposomgröße. Alternativ kann als letzter Schritt während der Herstellung der Liposome eine Extrusion ausgeführt werden. US-Patent Nr. 4,529,561 offenbart ein Verfahren zum Extrudieren von Liposomen unter Druck durch eine Membran von gleichmäßiger Porengröße zum Verbessern der Größengleichmäßigkeit.
Die Herstellung von Liposomen, die ein chemilumineszentes Olefin enthalten, das in der Lipiddoppelschicht aufgelöst ist, kann auf verschiedene Weise vollzogen werden, einschließlich eines Verfahrens, das von Olsen und Mitarbeiter, Biochemica et Biophysica Acta, 557(9), 1979, beschrieben wurde. Kurz gesagt, wird ein Gemisch aus Lipiden, die das entsprechende chemilumineszentes Olefin in einem organischen Lösemittel, wie zum Beispiel Chloroform, enthalten, an den Wänden eines Glasgefäßes zu einem dünnen Film getrocknet. Der Lipidfilm wird in einem geeigneten Puffer durch Schütteln oder Verwirbeln hydriert. Danach wird die Lipidsuspension durch eine Reihe von Polycarbonatfiltermembranen mit sukzessive kleiner werdenden Porengrößen extrudiert, zum Beispiel 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 und 0,2 Mikron. Eine wiederholte Filtration durch alle Filter, und insbesondere durch den kleinsten Filter, ist wünschenswert. Die Liposome können zum Beispiel durch Gelfiltration gereinigt werden, wie zum Beispiel durch eine Kolonne einer Sephacryl S-1000. Die Kolonne kann mit Puffer eluiert werden, und die Liposome können aufgefangen werden. Eine kühle Lagerung verlängert die Verwendbarkeitsdauer der durch dieses Verfahren hergestellten Liposome. Alternativ kann das chemilumineszente Olefin im Anschluss an die Herstellung der Liposome zu der flüssigen Suspension gegeben werden.
Liposome und Öltröpfchen haben oft zum Beispiel Thiol- oder Maleimid- oder Biotin-Gruppen an den Molekülen, aus denen die Lipiddoppelschicht besteht. Katalysatormoleküle und sBP-Partner können dann an die Oberfläche gebunden werden, und zwar durch Reaktion der Partikel mit einem dieser Materialien, das an ein sulfhydrylreaktives Reagens, eine Sulfhydryl-Gruppe bzw. Avidin gebunden ist. Zu sulfhydrylreaktiven Gruppen gehören unter anderem aktivierte Disulfide wie zum Beispiel 2-Pyridyldisulfide und alkylierende Reagenzien wie zum Beispiel Bromacetamid und Maleimid.
Katalysatormoleküle und sBP-Partner können durch schwache hydrophobe Wechselwirkungen an die Oberfläche der Liposompartikel gezogen werden, doch reichen solche Wechselwirkungen im Allgemeinen nicht aus, um der Scherkraft zu widerstehen, die während der Inkubation des Waschens einwirkt. Es ist bevorzugt, Katalysatormoleküle und sBP-Partner kovalent an einen Liposompartikel zu binden, der funktionalisiert wurde, zum Beispiel durch Verwendung von DOPE-MCC, wie oben gezeigt, und zwar durch Kombinieren des Liposoms mit dem gewählten Katalysator oder sBP-Partner, der mit einer Mercaptan-Gruppe funktionalisiert wurde. Wenn zum Beispiel der sBP-Partner ein Antikörper ist, so kann er mit S-Acetylmercaptosuccinanhydrid (SAMSA) reagiert und hydrolysiert werden, so dass ein sulfhydrylmodifizierter Antikörper entsteht. Zu weiteren Beispielen gehören die N-hydroxysuccinimidester von Oberflächencarboxyl-Gruppen, die dann mit einem Linker in Kontakt gebracht werden, der Amino-Gruppen aufweist, die mit den Ester-Gruppen oder direkt mit einem Katalysator oder einem sBP-Partner reagieren, der eine Amino-Gruppe aufweist. Der Linker wird gewöhnlich so gewählt, dass unspezifische Bindungen von Assay-Bestandteilen an der Partikeloberfläche verringert werden, und erzeugen vorzugsweise eine geeignete Funktionalität sowohl für das Anhaften an dem Partikel als auch das Anhaften an dem Katalysator oder sBP-Partner. Zu geeigneten Materialien gehören maleimidiertes Aminodextran (MAD), Polylysin, Aminosaccharide und dergleichen. MAD kann wie von Hubert und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci., 75(7), 3143, 1978, beschrieben hergestellt werden.
"Latex-Partikel": "Latex" bezeichnet ein teilchenförmiges, in Wasser suspendierbares, wasserunlösliches Polymermaterial, gewöhnlich mit Partikelabmessungen von 20 nm bis 20 μm, besonders bevorzugt 100 bis 1000 nm im Durchmesser. Das Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen, wie zum Beispiel Polystyrenbutadien, Polyacrylamidpolystyren, Polystyren mit Amino-Gruppen, Polyacrylsäure, Polymethacrysäure, Acrylnitrilbutadien, Styren-Copolymere, Polyvinylacetatacrylat, Polyvinylpyridin, Vinylchloridacrylat-Copolymere und dergleichen. Nichtvernetzte Polymere von Styren und carboxyliertem Styren oder Styren, das mit anderen aktiven Gruppen wie zum Beispiel Amino, Hydroxyl, Halogen und dergleichen funktionalisiert ist, sind bevorzugt. Häufig werden Copolymere von substituierten Styrenen mit Dienen, wie zum Beispiel Butadien, verwendet.
Um die Marker mit Latex-Partikeln, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, zu verbinden, können diese während der Bildung der Partikel durch Polymerisation eingearbeitet werden, doch gewöhnlich werden sie in die vorgeformten Partikel eingearbeitet, gewöhnlich durch nicht-kovalentes Auflösen in die Partikel hinein. Gewöhnlich wird eine Lösung des Markers verwendet, insbesondere, wenn der Marker ein chemilumineszentes Olefin ist. Zu Lösemittel, die verwendet werden können, gehören Alkohole, einschließlich Ethanol, Ethylenglycol und Benzylalkohol; Amide wie zum Beispiel Dimethylformamid, Formamid, Acetamid und Tetramethylharnstoff und dergleichen; Sulfoxide wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid und Sulfolan; und Ether wie zum Beispiel Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und dergleichen, und Wasser. Die Verwendung von Lösemitteln mit hohen Siedepunkten, in denen die Partikel unlöslich sind, gestattet die Verwendung von erhöhten Temperaturen zum Erleichtern des Auflösens der Markerverbindungen in die Partikel hinein und sind besonders geeignet. Die Lösemittel können für sich allein oder in Kombination verwendet werden.
Zum Einarbeiten chemilumineszenter Olefine in Partikel können Hilfslösemittel verwendet werden, die dauerhaft in den Partikeln verbleiben. Diese Lösemittel dienen als Weichmacher und werden als Lumineszenzverstärker verwendet. Häufig werden aromatische Hilfslösemittel verwendet, einschließlich Dibutylphthalat, Naphthonitril, Dioctylterephthalat, Decyldichlorbenzen, Diphenylether, Dibutoxybenzen usw. Diese Hilfslösemittel werden in Konzentrationen eingesetzt, die gering genug sind, um ein Auflösen der Partikel zu vermeiden, aber hoch genug sind, um die Partikel zum Schwellen zu bringen.
Im Allgemeinen wird die Temperatur, die während des Verfahrens verwendet wird, so gewählt, dass die Singulettsauerstoffentstehung und die Quantenausbeute des chemilumineszenten Olefins, das mit den Partikeln assoziiert ist, zu maximieren, unter dem Vorbehalt, dass die Partikel bei der gewählten Temperatur weder schmelzen noch klumpen dürfen. Es wird normalerweise mit erhöhten Temperaturen gearbeitet. Die Temperaturen für das Verfahren liegen im Allgemeinen im Bereich von 20°C bis 200°C, häufiger von 70°C bis 130°C. Es wurde festgestellt, dass einige Verbindungen, die bei Raumtemperatur nahezu unlöslich sind, zum Beispiel in Alkoholen mit geringem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Ethanol und Ethoxyethanol und dergleichen, bei erhöhten Temperaturen löslich sind. Es hat sich gezeigt, dass carboxylierte modifizierte Latex-Partikel Alkohole mit geringem Molekulargewicht bei solchen Temperaturen tolerieren.
Ein Katalysator oder ein sBP-Partner kann physisch auf der Oberfläche der Latex-Partikel adsorbiert werden oder kann in einer ähnlichen Weise, wie oben mit Bezug auf andere Matrizes besprochen, kovalent an den Partikel gebunden oder angeheftet sein.
"Partner eines spezifischen Bindungspaares ("sBP-Partner")": eines von zwei verschiedenen Molekülen, mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und dadurch als zu dieser besonderen räumlichen und polaren Organisation komplementär definiert ist. Die Partner des spezifischen Bindungspaares sind werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Diese sind gewöhnlich Partner eines immunologischen Paares, wie zum Beispiel ein Antigen-Antikörper. Obgleich andere spezifische Bindungspaare, wie zum Beispiel Biotinavidin, Hormone-Hormon-Rezeptoren, Nukleinsäureduplexe, IgG-Protein A, Polynukleotidpaare wie zum Beispiel DNS-DNS, DNS-RNS und dergleichen, keine immunologischen Paare sind, sind sie dennoch in die Erfindung und die Definition von "sBP-Partner" aufgenommen.
"Polynukleotide": eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nukleotide ist, das im natürlichen Zustand etwa 50 bis 500.000 oder mehr Nukleotide aufweist und im isolierten Zustand etwa 15 bis 50.000 oder mehr Nukleotide aufweist, gewöhnlich etwa 15 bis 20.000 Nukleotide, häufiger 15 bis 10.000 Nukleotide. Zu den Polynukleotiden gehören Nukleinsäuren aus jeglicher Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, einschließlich DNS (dsDNS und ssDNS) und RNS, gewöhnlich DNS, und können t-RNS, m-RNS, r-RNS, mitochondrische DNS und RNS, Chloroplast-DNS und -RNS, DNS-RNS-Hybride oder Gemische daraus, Gene, Chromosomen, Plasmide, die Genome von biologischem Material wie zum Beispiel Mikroorganismen, zum Beispiel Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmel, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen und Fragmenten davon und dergleichen sein.
"Ligand": jegliche organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.
"Ligandanalog": ein modifizierter Ligand, ein organisches Radikal oder ein Analytanalog, gewöhnlich mit einem Molekulargewicht größer als 100, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifizierung Mittel schafft, um einen Ligandanalog mit einem weiteren Molekül zu verbinden. Das Ligandanalog unterscheidet sich gewöhnlich von dem Liganden durch mehr als den Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, die das Ligandanalog mit einem Knotenpunkt oder Marker verknüpft, muss aber nicht. Das Ligandanalog kann sich in einer ähnlichen Weise wie der Ligand an den Rezeptor binden. Das Analog könnte zum Beispiel ein Antikörper sein, der gegen den Idiotyp eines Antikörper zu dem Liganden gerichtet ist.
"Rezeptor ("Antiligand")": jede beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die in der Lage ist, eine besondere räumliche und polare Organisation eines Moleküls zu erkennen, zum Beispiel epitope oder determinante Stelle. Zu veranschaulichenden Rezeptoren gehören natürlich vorkommende Rezeptoren, zum Beispiel thyroxinbindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nukleinsäuren, Protein A, Komplementkomponente C1q und dergleichen.
"Spezifische Bindung": die spezifische Erkennung eines von zwei verschiedenen Molekülen für das andere im Vergleich mit bedeutend weniger Erkennung anderer Moleküle. Generell haben die Moleküle Bereiche auf ihren Oberflächen oder in Hohlräumen, die zu einer spezifischen Erkennung zwischen den zwei Molekülen führen. Beispiele spezifischer Bindungen sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynukleotid-Wechselwirkungen und so weiter.
"Unspezifische Bindung": nicht-kovalente Bindung zwischen Molekülen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächenstrukturen ist. Eine unspezifische Bindung kann aus verschiedenen Faktoren herrühren, darunter hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
"Antikörper": ein Immunoglobulin, das sich spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation eines weiteren Moleküls bindet und darum als komplementär zu dieser besonderen räumlichen und polaren Organisation des weiteren Moleküls definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann durch einschlägig bekannte Techniken hergestellt werden, wie zum Beispiel Immunisierung eines Wirtes und Auffangen von Sera (polyklonal), oder durch Bilden durchgängiger Hybridzellenlinien und Auffangen des sekretierten Proteins (monoklonal), oder durch Klonen und Exprimieren von Nukleotidsequenzen oder mutagenisierter Versionen von Nukleotidsequenzen, die wenigstens für die Aminosäuresequenzen codieren, die für eine spezifische Bindung von natürlichen Antikörpern erforderlich sind. Antikörper können ein vollständiges Immunoglobulin oder ein Immunoglobulinfragment enthalten, wobei zu diesem Immunoglobulin die verschiedenen Klassen und Isotypen gehören, wie zum Beispiel IgA, IgD, IgE, Ige1, IgG2a, IgG2b und IgG3, IgM usw. Zu den Immunoglobulinfragmenten können Fab, Fv und F(ab')₂, Fab' und dergleichen gehören. Außerdem können gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunoglobulinen oder ihren Fragmenten verwendet werden, solange die Bindungsaffinität für ein besonderes Molekül beibehalten bleibt.
Antiserum, das Antikörper (polyklonal) enthält, erhält man durch bewährte Techniken, wobei ein Tier, wie zum Beispiel ein Kaninchen, ein Meerschweinchen oder eine Ziege, mit einem entsprechenden Immunogen immunisiert wird und man Antisera von dem Blut des immunisierten Tieres nach einem entsprechenden Wartezeitraum erhält. Den Stand der Technik darstellende Besprechungen findet man bei Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); und Playfair und Mitarbeiter, Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).
Antikörper kann man auch mittels somatischer Zellhybridisierungstechniken herstellen, wobei man solche Antikörper üblicherweise als monoklonale Antikörper bezeichnet. Monoklonale Antikörper kann man gemäß den Standardtechniken von Köhler und Milstein, Nature 265: 495-497, 1975, herstellen. Besprechungen von monoklonalen Antikörpertechniken finden sich in Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers und Mitarbeiter, Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), und Methods of Enzymology 73 (Teil B): 3-46 (1981). Proben eines entsprechenden Immunogenpräparats werden einem Tier, zum Beispiel einer Maus, injiziert, und nach einer ausreichenden Zeit wird das Tier getötet, und es werden Milzzellen entnommen. Alternativ können die Milzzellen eines nicht-immunisierten Tieres in vitro für das Immunogen sensibilisiert werden. Die Milzzellenchromosomen, welche die Basissequenzen für die gewünschten Immunoglobine codieren, können durch Verschmelzen der Milzzellen, im Allgemeinen in Gegenwart eines nicht-ionischen Detergens, zum Beispiel Polyethylenglycol, mit einer Myelomzelllinie komprimiert werden. Die resultierenden Zellen, die verschmolzene Hybridome enthalten, lässt man in einem selektiven Medium, wie zum Beispiel HAT-Medium, wachsen, und die überlebenden immortalisierten Zellen werden in diesem Medium unter Verwendung begrenzender Verdünnungsbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden in einem geeigneten Behälter, zum Beispiel Mikrotitermulden, gezüchtet, und der Überstand wird auf monoklonale Antikörper mit der gewünschten Spezifizität geprüft.
Es gibt verschiedene Techniken zum Verbessern der Ausbeute monoklonaler Antikörper, wie zum Beispiel Injizieren der Hybridomzellen in die Bauchfellhöhle eines Säugetierwirtes, der die Zellen annimmt, und Ernten des Ascites-Fluids. Wo sich eine unzureichende Menge der monoklonalen Antikörper in dem Ascites-Fluid ansammelt, wird der Antikörper aus dem Blut des Wirtes geerntet. Alternativ kann die Zelle, die den gewünschten Antikörper erzeugt, in einer Hohlfaserzellkulturvorrichtung oder einer Spinnerkolbenvorrichtung gezüchtet werden, die beide einschlägig bekannt sind. Es gibt verschiedene konventionelle Wege zum Isolieren und Reinigen der monoklonalen Antikörper von anderen Proteinen und anderen Kontaminanten (siehe Köhler und Milstein, oben).
Bei einer weiteren Vorgehensweise zur Herstellung von Antikörpern kann die Sequenz, die für Antikörperbindungsstellen codiert, aus cDNS repliziert und in einen Kloning-Vektor eingefügt werden, der in Bakterien exprimiert werden kann, so dass rekombinante Proteine mit den entsprechenden Antikörperbindungsstellen entstehen.
Im Allgemeinen können Antikörper mittels bekannter Techniken gereinigt werden, wie zum Beispiel Chromatografie, beispielsweise DEAE-Chromatografie, ABx-Chromatografie und dergleichen, Filtration und so weiter.
"Alkyl": ein monovalentes verzweigtes oder unverzweigtes Radikal, das aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernen eines H-Atoms gewonnen wird. Dazu gehören sowohl ein niederes Alkyl als auch ein höheres Alkyl.
"Niederes Alkyl": Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl usw.
"Höheres Alkyl": Alkyl mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Hexyl, Heptyl, Octyl usw.
"Alkyliden": ein divalentes organisches Radikal, das aus einem aliphatischen Kohlenwasserstoff gewonnen wird, wie zum Beispiel Ethyliden, wobei 2 Wasserstoffatome von demselben Kohlenstoffatom genommen werden.
"Aryl": ein organisches Radikal, das aus einem aromatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernen eines Atoms gewonnen wird und einen oder mehrere aromatische Ringe enthält, gewöhnlich einen bis vier aromatische Ringe, wie zum Beispiel Phenyl (aus Benzen), Naphthyl (aus Naphthalen) usw.
"Aralkyl": ein organisches Radikal mit einer Alkyl-Gruppe, an die eine Aryl-Gruppe angeheftet ist, zum Beispiel Benzyl, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, 1-Naphthylethyl usw.
"Alkoxy": ein Alkyl-Radikal, das durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls angeheftet ist, zum Beispiel Methoxy, Ethoxy usw.
"Aryloxy": ein Aryl-Radikal, das durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls angeheftet ist, zum Beispiel Phenoxy, Naphthoxy usw.
"Aralkoxy": ein Aralkyl-Radikal das durch ein Sauerstoffatom an den Rest eines Moleküls angeheftet ist, zum Beispiel Benzoxy, 1-Naphthylethoxy usw.
"Substituiert": bedeutet, dass ein Wasserstoffatom eines Moleküls durch ein anderes Atom ersetzt ist, das ein einzelnes Atom sein kann, wie zum Beispiel ein Halogen usw., oder Teil einer Gruppe von Atomen sein kann, die eine Funktionalität bilden, wie zum Beispiel ein Substituent mit 1 bis 50 Atomen (die nicht den erforderlichen Wasserstoffatomen entsprechen, die benötigt werden, um die Valenzen solcher Atome zu füllen), wobei diese Atome unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen (Chlor, Brom, Iod, Fluor) und Phosphor ausgewählt sind, und wobei diese Atome gegebenenfalls an ein oder mehrere Metallatome gebunden sein können.
"Alkylthio": ein Alkyl-Radikal, das durch ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls angeheftet sein kann, zum Beispiel Methylthio, Ethylthio usw.
"Arylthio": ein Aryl-Radikal, das durch ein Schwefelatom an den Rest eines Moleküls angeheftet sein kann, zum Beispiel Phenylthio, Naphthylthio usw.
"Elektronenspendende Gruppe": ein Substituent, der, wenn er an ein Molekül gebunden ist, in der Lage ist, das Molekül so zu polarisieren, dass die elektronenspendende Gruppe relativ zu einem anderen Abschnitt des Moleküls elektronenarm und positiv geladen wird, d. h. eine verringerte Elektronendichte hat. Zu solchen Gruppen gehören, lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung, Amine, Ether, Thioether, Phosphine, Hydroxy, Oxyanionen, Mercaptane und ihre Anionen, Sulfide usw.
"Ein Substituent mit 1 bis 50 Atomen (die nicht den erforderlichen Wasserstoffatomen entsprechen, die benötigt werden, um die Valenzen solcher Atome zu füllen), wobei diese Atome unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Halogen und Phosphor ausgewählt sind": ein organisches Radikal; das organische Radikal hat 1 bis 50 Atome, die nicht der benötigten Anzahl von Wasserstoffatomen entsprechen, die erforderlich sind, um die Valenzen der Atome in dem Radikal zu füllen. Im Allgemeinen ist das vorherrschende Atom Kohlenstoff (C), aber es kann auch Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S) oder Phosphor (P) sein, wobei O, N, S oder P, wenn vorhanden, an Kohlenstoff oder beliebig untereinander oder an Wasserstoff oder ein Metallatom gebunden sind, so dass verschiedene funktionale Gruppen entstehen, wie zum Beispiel Carboxyl-Gruppen (Carbonsäuren), Hydroxyl-Gruppen (Alkohole), Mercapto-Gruppen (Thiole), Carboxamide, Carbamate, Carboxylsäureester, Sulfonsäuren, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphorsäureester, Harnstoffe, Carbamate, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Ketone, Aldehyde und Nitrile, und Alkyl, Alkylidin, Aryl, Aralkyl und Alkyl, Aryl und Aralkyl, die durch eine oder mehrere der oben genannten funktionalen Gruppen substituiert sind, zum Beispiel Phenyl, Naphthyl, Phenanthryl, m-Methoxyphenyl, Dimethylamino, Trityl, Methoxy und N-morpholeno, und können zusammengenommen werden, so dass ein Ring entsteht, wie zum Beispiel Adamantyl, N-methyacridanylid, Xanthanylidin, 1-(3,4-benzo-5-hydrofuryliden) und dergleichen.
"Verknüpfungsgruppe": eine Gruppe, die an der kovalenten Verknüpfung zwischen Molekülen beteiligt ist. Die Verknüpfungsgruppe variiert je nach der Art der Moleküle, d. h. Marker, Matrix, Katalysator, sBP-Partner oder Molekül, die mit einem zu verknüpfenden Partikel assoziiert sind oder ein Teil eines zu verknüpfenden Partikels sind. Funktionale Gruppen, die normalerweise in einer Matrix, einem Katalysator oder einem sBP-Partner vorhanden sind oder in eine Matrix, einen Katalysator oder einen sBP-Partner eingearbeitet werden, werden zum Verknüpfen dieser Materialien verwendet.
Größtenteils finden Carbonylfunktionalitäten Verwendung, sowohl Oxocarbonyl, zum Beispiel Carboxy und Aldehyd, als auch nicht-Oxocarbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefelanaloge), zum Beispiel Amidin, Amidate, Thiocarboxy und Thionocarboxy.
Zu alternativen Funktionalitäten gehören aktives Halogen, Diazo, Mercapto, Olefin, insbesondere aktiviertes Olefin, Amino, Phosphatester und dergleichen. Eine Beschreibung von Verknüpfungsgruppen findet sich im US-Patent Nr. 3,817,837.
Die Verknüpfungsgruppen können von einer Bindung zu einer Kette mit 1 bis 100 Atomen variieren, gewöhnlich etwa 1 bis 70 Atomen, bevorzugt 1 bis 50 Atomen, besonders bevorzugt 1 bis 20 Atomen, jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, die normalerweise aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Halogen und Phosphor besteht. Die Anzahl der Heteroatome in den Verknüpfungsgruppen liegt normalerweise im Bereich von etwa 0 bis 20, gewöhnlich von etwa 1 bis 15, besonders bevorzugt 2 bis 6. Die Atome in der Kette können durch andere Atome als Wasserstoff in einer ähnlichen Weise substituiert sein, wie es oben für den Substituenten mit 1 bis 50 Atomen beschrieben ist. Generell gilt, dass die Länge einer bestimmten Verknüpfungsgruppe beliebig so gewählt werden kann, dass die Synthese erleichtert wird und dass die Einarbeitung jeder beliebigen gewünschten Gruppe, wie zum Beispiel ein Energieakzeptor, ein Fluorophor, eine Gruppe zur Katalyse von Intersystemübergängen, wie zum Beispiel ein Schweratom, und dergleichen vereinfacht wird. Die Verknüpfungsgruppen können aliphatisch oder aromatisch sein, obgleich bei Diazo-Gruppen gewöhnlich aromatische Gruppen beteiligt sind.
Wenn Heteroatome vorhanden sind, so liegt Sauerstoff normalerweise als Oxo oder Oxy vor und ist an Kohlenstoff, Schwefel, Stickstoff oder Phosphor gebunden; Stickstoff liegt normalerweise als Nitro, Nitroso oder Amino vor und ist normalerweise an Kohlenstoff, Sauerstoff, Schwefel oder Phosphor gebunden; Schwefel wäre analog zu Sauerstoff; während Phosphor an Kohlenstoff, Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff gebunden ist, gewöhnlich als Phosphonat und Phosphatmono- oder -diester.
Gängige Funktionalitäten bei der Herstellung einer kovalenten Bindung zwischen der Verknüpfungsgruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, Azo, Thioether und Carboxylat, Sulfonat und Phosphatester, Amide und Thioester.
Größtenteils hat eine Verknüpfungsgruppe eine nicht-Oxocarbonyl-Gruppe, einschließlich Stickstoff- und Schwefelanaloge, eine Phosphat-Gruppe, eine Amino-Gruppe, ein Alkylierungsmittel wie zum Beispiel Halogen oder Tosylalkyl, Oxy (Hydroxyl oder das Schwefelanalog, Mercapto) Oxocarbonyl (zum Beispiel Aldehyd oder Keton), oder ein aktives Olefin wie zum Beispiel ein Vinylsulfon oder a,b-ungesättigtes Ester. Diese Funktionalitäten werden mit Amin-Gruppen, Carboxyl-Gruppen, aktiven Olefinen, Alkylierungsmitteln, zum Beispiel Bromacetyl, verknüpft. Wo ein Amin und Carboxylsäure oder ihr Stickstoffderivat oder Phosphorsäure verknüpft werden, entstehen Amide, Amidine und Phosphoramide. Wo Mercaptan und aktiviertes Olefin verknüpft werden, entstehen Thioether. Wo ein Mercaptan und ein Alkylierungsmittel verknüpft werden, entstehen Thioether. Wo Aldehyd und ein Amin unter reduzierenden Bedingungen verknüpft werden, entstehet ein Alkylamin. Wo eine Carboxylsäure oder Phosphatsäure und ein Alkohol verknüpft werden, entstehen Ester.
"Eine Gruppe oder Funktionalität, die Hydrophilizität oder Wasserlöslichkeit verleiht": ist eine hydrophile Funktionalität, welche die Netzbarkeit von Feststoffen mit Wasser und die Wasserlöslichkeit von Verbindungen, an die sie gebunden ist, erhöhen. Eine solche funktionale Gruppe oder Funktionalität kann ein Substituent mit 1 bis 50 oder mehr Atomen sein. Dazu kann eine Gruppe gehören, die ein Sulfonat, Sulfat, Phosphat, Amidin, Phosphonat, Carboxylat, Hydroxyl, insbesondere Polyole, Amin, Ether, Amid und dergleichen aufweist. Veranschaulichende funktionale Gruppen sind Carboxyalkyl, Sulfonoxyalkyl, CONHOCH₂COOH, CO(glucosamin), Zucker, Dextran, Cyclodextrin, SO₂NHCH₂COOH, SO₃H, CONHCH₂CH₂SO₃H, PO₃H₂, OPO₃H₂, Hydroxyl, Carboxyl, Keton und Kombinationen davon. Die meisten der oben genannten Funktionalitäten können auch als Anheftungsgruppen verwendet werden, die das Anheften eines Katalysators, eines sBP-Partners oder dergleichen an eine teilchenförmige Zusammensetzung, die aus dem Marker besteht, gestattet.
"Eine Gruppe oder Funktionalität, die Lipophilizität oder Lipidlöslichkeit verleiht": ist eine lipophile Funktionalität, welche die Netzbarkeit von Oberflächen durch Wasser und die Wasserlöslichkeit von Verbindungen. an die sie gebunden ist, verringert. Eine solche funktionale Gruppe oder Funktionalität kann 1 bis 50 oder mehr Atome, gewöhnlich Kohlenstoffatome, enthalten, die durch Wasserstoff oder Halogen substituiert sind. Dazu können Alkyl, Alkyliden, Aryl und Aralkyl gehören. Die lipophile Gruppe oder Funktionalität hat normalerweise eine bis sechs gerad- oder verzweigtkettige aliphatische Gruppen mit wenigstens 6 Kohlenstoffatomen, häufiger wenigstens 10 Kohlenstoffatomen, und bevorzugt wenigstens 12 Kohlenstoffatomen, gewöhnlich nicht mehr als 30 Kohlenstoffatome. Die aliphatische Gruppe kann an Ringe mit 5 bis 6 Partnern gebunden sein, die alicyclisch, heterocyclisch oder aromatisch sein können. Lipophile Gruppen können an einen Marker oder eine andere Substanz gebunden sein, um ihre Löslichkeit in einer nicht-wässrigen Matrix zu erhöhen.
"Energieakzeptor": im vorliegenden Text auch als Fluoreszenzenergieakzeptor bezeichnet. Ein Chromophor mit wesentlicher Absorption höher als 310 nm, normalerweise höher als 350 nm, und bevorzugt höher als etwa 400 nm. Die Wahl des Energieakzeptors wird auch durch das konkrete CC bestimmt. Der Energieakzeptor sollte in der Lage sein, Licht zu absorbieren, das durch das CC ausgesandt wird. Bevorzugt sollte das Absorptionsmaximum des Energieakzeptors bei einer ähnlichen Wellenlänge liegen wie das Abstrahlungsmaximum des chemilumineszenten Olefins. Ein hoher Extinktionskoeffizient ist wünschenswert, gewöhnlich höher als 10, bevorzugt höher als 10³, und besonders bevorzugt höher als 10⁴. Der Energieakzeptor muss fluoreszent sein und hat bevorzugt eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, gewöhnlich wenigstens 0,1, bevorzugt größer als 0,4. Der Energieakzeptor dient einfach dem Verschieben der Abstrahlungswellenlänge und wird in Partikel, die das CC enthalten, eingearbeitet. Brauchbare Energieakzeptoren sind alle beliebigen fluoreszenten Moleküle, die mit langen Wellenlängen abstrahlen, vorzugsweise hydrophobe Verbindungen, zum Beispiel Phthalocyanine, Squaraine, Porphyrine, Polyacetylene, Naphthacene, Bisphenylethynylanthracen, Coumarine, polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe usw.
Eine Anzahl verschiedener Moleküle, die als Energieakzeptor brauchbar sind, werden von Ullman und Mitarbeitern in den US-Patenten Nr. 4,261,968, Nr. 4,174,384, Nr. 4,199,559 und Nr. 3,996,345 in den Spalten 8 und 9 beschrieben.
Eine weiterer Gruppe von Fluoreszenzverbindungen sind die Naphthylamine mit einer Amino-Gruppe in der alpha- oder beta-Position, gewöhnlich in der alpha-Position. Zu den Naphthylamino-Verbindungen gehören unter anderem 1-Dimethylaminonaphthalen, 1-Anilino-8-naphthalen und 2-p-Toluidinyl-6-naphthalen.
Der Marker und Energieakzeptor, wenn einer verwendet wird, werden mit der Matrix der vorliegenden Erfindung wie oben beschrieben assoziiert. Im Sinne des vorliegenden Textes beinhaltet der Begriff "assoziiert mit" Folgendes: Die Assoziation kann durch kovalente oder nicht-kovalente Bindung oder durch Einarbeitung in die Matrix, wie zum Beispiel einen Partikel, erfolgen. Im Allgemeinen wird an einen suspendierbaren Partikel, in den der Marker eingearbeitet ist, vor dem Assay oder während des Assays ein Katalysator gebunden.
"Hilfsmaterialien": Häufig werden verschiedene Hilfsmaterialien in dem Assay gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt. Zum Beispiel sind normalerweise Puffer in dem Assaymedium vorhanden, wie auch Stabilisatoren für das Assaymedium und die Assaybestandteile. Häufig können zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen Proteine enthalten sein, wie zum Beispiel Albumine; organische Lösemittel wie zum Beispiel Formamid; quaternäre Ammoniumsalze; Polyanionen wie zum Beispiel Dextransulfat; oberflächenaktive Substanzen, insbesondere nicht-ionische oberflächenaktive Substanzen; Bindungsverstärker, zum Beispiel Polyalkylenglycole; oder dergleichen.
"Vollständig oder teilweise sequenziell": Wenn die Probe und verschiedene Stoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf andere Weise als gleichzeitig kombiniert werden, so können einer oder mehrere mit einem oder mehreren der übrigen Stoffe zu einer Teilkombination kombiniert werden. Jede Teilkombination kann dann einem oder mehreren Schritten des vorliegenden Verfahrens unterworfen werden. Somit kann jede der Teilkombinationen unter Bedingungen inkubiert werden, die zu einem oder mehreren der gewünschten Ergebnisse führen.
Wie oben angesprochen, finden die vorliegenden Zusammensetzungen Verwendung in Verfahren zum Nachweisen von Wasserstoffperoxid oder einer Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag. Normalerweise wird der Assay in der Weise ausgeführt, dass man die Zusammensetzung mit dem Assaymedium, worin man Wasserstoffperoxid oder die Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, vermutet, in Kontakt bringt. Wenn Wasserstoffperoxid bei einer Reaktion eines Analyten entsteht, so sind auch alle nötigen Reagenzien, die erforderlich sind, um die Reaktion stattfinden zu lassen, in dem Assaymedium enthalten. Die Zusammensetzungen umfassen eine Matrix, bevorzugt in der Form von Partikeln. In die Matrix ist ein Marker eingearbeitet, und an ihre Oberfläche ist oder wird ein Katalysator gebunden. Wasserstoffperoxid reagiert mit dem Katalysator unter Entstehung von Singulettsauerstoff, der in die Matrix diffundieren und mit dem Marker reagieren kann. Im Fall eines chemilumineszenten Olefins wird ein chemilumineszentes Signal erzeugt, das zu der Menge an Wasserstoffperoxid in dem Medium in Beziehung steht.
Der Assay wird gewöhnlich in einem wässrigen gepufferten Medium bei einem mittleren pH ausgeführt, im Allgemeinen jenem, der eine optimale Assay-Empfindlichkeit erbringt. Das wässrige Medium kann allein Wasser sein oder kann 0,01 bis 80 oder mehr Volumenprozent eines Hilfslösemittels enthalten. Der pH für die Medium liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 4 bis 13, häufiger im Bereich von etwa 5 bis 10, und bevorzugt im Bereich von etwa 5 bis 9, besonders bevorzugt 6 bis 8. Der pH wird im Allgemeinen so gewählt, dass eine optimale Assay-Empfindlichkeit und – Spezifizität erreicht wird. Zu den Faktoren, die zu berücksichtigen sind, gehören die pH-Abhängigkeit der Raten der Reaktionen, die Wasserstoffperoxid entstehen lassen, die Effizienz der Bildung von Singulettsauerstoff aus Wasserstoffperoxid, die Bindung der Bindungspartner und die Minimierung unspezifischer Bindung.
Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während der Bestimmung aufrecht zu erhalten. Zu veranschaulichenden Puffern gehören Acetat, Borat, Phosphat, Carbonat, TRIS, Barbital und dergleichen. Der konkret verwendete Puffer ist für diese Erfindung nicht maßgeblich, aber für einen individuellen Assay kann der eine oder der andere Puffer bevorzugt sein.
Mittlere Temperaturen werden normalerweise zum Ausführen des Assays verwendet, und eine konstante Temperatur, vorzugsweise Raumtemperatur, wird gewöhnlich während des Messungszeitraums verwendet. Die Inkubationstemperaturen liegen normalerweise im Bereich von etwa 5° bis 99°C, gewöhnlich von etwa 15° bis 70°C, häufiger 20 bis 45°C. Die Temperaturen während der Messungen liegen im Allgemeinen im Bereich von etwa 10° bis 70°C, häufiger von etwa 20° bis 45°C, häufiger 20° bis 25°C
In einigen Fällen muss das aktivierte CC möglicherweise erwärmt werden, um Lumineszenz hervorzubringen, was an seiner relativen Stabilität bei Umgebungstemperaturen liegt. Relativ stabile Dioxetanen kann man zum Beispiel durch Reaktion von Singulettsauerstoff mit Adamantylidenen herstellen (siehe zum Beispiel McCapra, oben), und relativ stabile Endoperoxide können durch Reaktion von Singulettsauerstoff mit 1,4-disubstituierten Naphthacenen herstellen (siehe zum Beispiel Wilson, J., J. Am. Chem. Soc. (1969) 91: 2387). In beiden oben genannten Fällen zersetzen sich die stabilen Materialien beim Erwärmen, gewöhnlich bei einer Temperatur von weniger als 200°C, bevorzugt etwa 50 bis 100°C. Ein solches Erwärmen kann das rasche Zersetzen des Singulettsauerstoff/Olefin-Addukts verursachen, und somit kann die Abstrahlung von Licht über einen kurzen Zeitraum erfolgen. Eine solche Vorgehensweise kann wünschenswert sein, wenn sehr geringe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid nachgewiesen werden, und wird weiter unten noch eingehender besprochen.
Die Konzentration an nachzuweisender Verbindung variiert im Allgemeinen von etwa 10^–5 bis 10^–17 M, häufiger von etwa 10^–6 bis 10^–14 M. Überlegungen wie zum Beispiel, ob der Assay qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist, die konkrete Nachweistechnik und die Art und Konzentration der interessierenden Verbindung bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
Obgleich die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien in dem Assaymedium im Allgemeinen durch den interessierenden Konzentrationsbereich der nachzuweisenden Verbindung bestimmt werden, wird die endgültige Konzentration einer jeden der Reagenzien normalerweise anhand von Erfahrungswerten bestimmt, um die Empfindlichkeit des Assays über den Bereich hinweg zu optimieren. Das heißt, eine signifikante Veränderung der Konzentration der nachzuweisenden Verbindung sollte eine präzise messbare Signaldifferenz erbringen.
Obgleich die Reihenfolge der Beigabe in einem weiten Bereich variiert werden kann, gibt es bestimmte Präferenzen in Abhängigkeit von der Art des Assays. Die einfachste Reihenfolge der Beigabe ist, alle Materialien gleichzeitig beizugeben. Alternativ können die Reagenzien vollständig oder teilweise sequenziell kombiniert werden. Ein oder mehrere Inkubationsschritte können folgen, nachdem die Reagenzien kombiniert wurden, im Allgemeinen im Bereich von etwa 5 Sekunden bis 1 Stunde, häufiger von etwa 20 Sekunden bis 10 Minuten.
Es ist wünschenswert, dass das Produkt der Reaktion von Singulettsauerstoff mit dem chemilumineszenten Olefin rasch zerfällt. Das Produkt, das durch die Aktivierung des CC mit Singulettsauerstoff entsteht, zersetzt sich bevorzugt spontan unter Abstrahlung von Licht, gewöhnlich mit einer Lebensdauer von 10 Mikrosekunden bis 10 Stunden, bevorzugt 100 Mikrosekunden bis 10 Minuten, besonders bevorzugt 300 Mikrosekunden bis 30 Sekunden.
Einer der Faktoren, die die Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz gestatten, ist die Struktur der CC. Die strukturellen Merkmale, die zu einer Verzögerung der Lumineszenz beitragen, sind komplex und nur teilweise vorhersagbar. Schaap, siehe oben, und McCapra, siehe oben, besprechen einige der beteiligten Prinzipien.
Ein weiterer Faktor, der die Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz gestattet, ist die Zusammensetzung des Partikels. Wenn der Partikel aus einem nicht-polaren Material besteht, in dem das CC aufgelöst ist, so erhöhen sich im Allgemeinen die Zerfallszeiten und Quanteneffizienzen im Vergleich zu polaren Materialien.
Ein weiterer Faktor, der zum Steuern der Zeit bis zur Lumineszenz verwendet werden kann, ist die Temperatur. Im Allgemeinen verkürzt ein Erhöhen der Temperatur die Zerfallszeit.
Ein weiterer Faktor in der Steuerung der Zeit bis zur Lumineszenz ist das Vorhandensein von Aktivatoren, die die Rate der Zersetzung der Dioxetane, die bei der Reaktion entstehen, erhöhen. Zu solchen Aktivatoren gehören polarisierbare Lösemittel, wie zum Beispiel Halogenkohlenwasserstoffe, polare Verbindungen wie zum Beispiel Ester, Nitrile, organometallische Verbindungen und dergleichen. Der Aktivator liegt gewöhnlich in der Matrix in einer Menge vor, die ausreicht, um die gewünschten Verzögerung der Zeit bis zur Lumineszenz zu erreichen. Diese Menge richtet sich nach der Art des Aktivators und beträgt im Allgemeinen etwa 10^–5 bis 10^–1 M.
Die Chemilumineszenz oder das Licht, die bzw. das infolge des oben Dargelegten entsteht, kann visuell, fotografisch, aktinometrisch, spektrofotometrisch oder durch jedes beliebige andere zweckmäßige Mittel zum Bestimmen ihrer bzw. seiner Menge gemessen werden, die zu der Menge der Verbindung in dem Medium in Beziehung steht. Gewöhnlich wird Licht, das von dem chemilumineszenten Material abgegeben wird, gemessen, während sich das chemilumineszente Material in Kontakt mit dem Assaymedium befindet, zum Beispiel mit Hilfe eines Luminometers oder eines lichtempfindlichen Materials. Wenn ein kurzlebiges Singulettsauerstoff/Olefin-Addukt, d. h. das Produkt der Reaktion von Singulettsauerstoff mit einem CC, gebildet wird, so ist die Lichtintensität nahezu proportional zur Konzentration von Wasserstoffperoxid in dem Medium. Wo die Verbindung, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid, im Ergebnis einer Reaktion eines Analyten mit Assay-Reagenzien entsteht, so nimmt die Lichtintensität mit zunehmender Wasserstoffperoxidkonzentration zu.
Wie oben angesprochen, wird zum Nachweis sehr kleiner Mengen Wasserstoffperoxid ein chemilumineszentes Material verwendet, das nach der Reaktion mit Singulettsauerstoff nur einen langsamen Chemilumineszenzzerfall bei Umgebungstemperatur erfährt. Im Allgemeinen wird für sehr geringe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid die mit Katalysator beschichtete Matrix über einen ausreichenden Zeitraum mit dem Assaymedium inkubiert, damit der größte Teil des Wasserstoffperoxids mit dem Katalysator zu Singulettsauerstoff reagieren kann, der mit dem in die Matrix eingearbeiteten CC reagiert. Während dieses Zeitraums erfolgt allenfalls eine geringe chemilumineszente Abstrahlung. Nach der Inkubation wird die Matrix, die das chemilumineszente Material enthält, erwärmt, um die chemilumineszente Zersetzung der Singulettsauerstoff-Addukts zu bewirken. Das Erwärmen der Matrix kann erfolgen, während sie mit dem Reaktionsmedium in Kontakt ist, oder die Matrix kann optional von dem Reaktionsmedium getrennt sein. Wie oben angesprochen, erfolgt das Erwärmen in diesem Fall gewöhnlich bei einer Temperatur von weniger als 200°C, bevorzugt etwa 50 bis 120°C. Das Erwärmen bewirkt eine rapide Zersetzung des Singulettsauerstoff/Olefin-Addukts, weshalb die Abstrahlung über einen kurzen Zeitraum erfolgt. Weil ein kurzer Lichtausbruch von hoher Intensität leichter erkannt wird als ein langes Glimmen von geringer Intensität, das die gleiche Anzahl von Lichtquanten erzeugt, ermöglicht diese Vorgehensweise einen empfindlicheren Nachweis von Wasserstoffperoxid. Eine weitere Vorgehensweise ist die Verwendung eines Fluoreszenzverbindungsvorläufers und die Überprüfung der Matrix auf Fluoreszenz.
Eine besondere Anwendung des Verfahrens und der Zusammensetzungen der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, der ein Partner eines spezifischen Bindungspaares (sBP) ist. Es wird eine Kombination bereitgestellt, die Folgendes umfasst: (i) eine Probe, in der der Analyt vermutet wird, (ii) einen ersten sBP-Partner, der an einen Partner aus einem Enzym-Paar, das aus einer Oxidase und einer 'Peroxidase besteht, gebunden ist, wobei der sBP-Partner in der Lage ist, sich an den Analyten oder an einen weiteren sBP-Partner zu binden, der in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden, (iii) ein Substrat für die Oxidase, das bei Reaktion mit der Oxidase Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, und (iv) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, die das Diffundieren von Singulettsauerstoff darin gestattet. In die Matrix ist ein Marker eingearbeitet, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, und die Matrix hat auf ihrer Oberfläche (1) einen zweiten sBP-Partner, der in der Lage ist, den ersten sBP-Partner in einer Menge zu binden, der von dem Vorhandensein des Analyten abhängt, und optional (2) den anderen Partner des Enzym-Paares. Wenn der andere Partner des Enzym-Paares nicht an die Matrix gebunden ist, so ist er in der Assay-Kombination enthalten und an einen sBP-Partner gebunden, der in der Lage ist, sich an die Matrix zu binden. Die Kombination wird in einem Medium unter Bedingungen inkubiert, die ausreichen, damit sich die sBP-Partner binden können und das Substrat für die Oxidase mit der Oxidase reagieren kann. Es wird festgestellt, ob Singulettsauerstoff mit dem Marker reagiert hat. Das Ausmaß einer solchen Reaktion wird zu dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt.
Das Verfahren und die Zusammensetzungen der Erfindung können an die meisten Assays angepasst werden, an denen sBP-Partner beteiligt sind, wie zum Beispiel Ligand-Rezeptor, beispielsweise Antigen-Antikörper-Reaktionen, Polynukleotidbindungsassays und so weiter. Die Assays sind gewöhnlich homogen oder heterogen, bevorzugt homogen, einschließlich kompetitiv und Sandwich. In einem spezifischen Bindungs-Assay kann die Probe erforderlichenfalls vorbehandelt werden, um unerwünschte Materialien zu entfernen.
Wie zuvor angesprochen, ist der erste sBP-Partner in der Lage ist, sich an den Analyten oder an einen sBP-Partner zu binden, der in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden. Wenn der zweite sBP-Partner ebenfalls in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden, so kann ein Sandwichassayprotokoll die Folge sein. Die immunologische Reaktion für einen Sandwichassay beinhaltet gewöhnlich einen sBP-Partner, zum Beispiel einen Antikörper, der zu dem Analyten komplementär ist, einen zweiten sBP-Partner, zum Beispiel einen Antikörper, der ebenfalls zu dem Analyten komplementär ist und an die teilchenförmige Matrix und die interessierende Probe gebunden ist.
Einer der sBP-Partner kann alternativ zu dem Analyten analog sein, wobei in dem Fall ein kompetitives Assayprotokoll die Folge sein kann. Die immunologische Reaktion für ein kompetitives Protokoll beinhaltet gewöhnlich einen sBP-Partner, der zu dem Analyten komplementär ist, und einen sBP-Partner, der zu dem Analyten analog ist und gewöhnlich ein Derivat des Analyten ist. Einer dieser sBP-Partner ist mit der Matrix assoziiert.
Bei einem Assaytyp werden eine Probe, in der ein Analyt vermutet wird, der ein sBP-Partner ist, und die anderen Assay-Bestandteile, die ein Enzym umfassen, das an einen sBP-Partner und ein Substrat gebunden ist, mit einer teilchenförmigen Matrix der vorliegenden Erfindung kombiniert. Das Medium wird dann auf das Vorhandensein von chemilumineszenter Abstrahlung untersucht, gewöhnlich durch Messen der abgegebenen Lichtmenge, die zu der Analytmenge in der Probe in Beziehung steht. Diese Vorgehensweise ist ein homogener Assay, wo kein Trennungsschritt stattfindet. Alternativ kann eine teilchenförmige oder nicht-teilchenförmige Matrix verwendet werden, die nach dem Kombinieren der Assay-Bestandteile von der flüssigen Phase getrennt werden kann, woraufhin entweder die feste Phase oder die flüssige Phase auf das Vorhandensein von chemilumineszenter Abstrahlung untersucht werden kann.
Ein Assay für den Analyten wird normalerweise in einem wässrigen gepufferten Medium bei einem mittleren pH ausgeführt, im Allgemeinen jenem, der zu einer optimalen Assay-Empfindlichkeit führt. Im Allgemeinen gelten die oben dargelegten Parameter für Assaymedium, pH, Temperatur und so weiter für den Assay für einen Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind Latex-Partikel oder Liposome, in die ein chemilumineszentes Olefin eingearbeitet ist, das mit Singulettsauerstoff reagiert. Eine Peroxidase, wie zum Beispiel eine Lactoperoxidase oder eine Haloperoxidase, ist an die Oberfläche des Latex-Partikels oder Liposoms gebunden.
Die folgenden Zusammensetzungen und Assays werden – lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung – bereitgestellt, damit ein Fachmann den Umfang der vorliegenden Erfindung ermessen und die Erfindung ohne unnötiges Experimentieren ausführen kann. Es versteht sich, dass die Wahl der Analyten, Marker, Katalysatoren, Partikel, sonstigen Reagenzien und Reaktionsbedingungen dem Fachmann vor dem Hintergrund der hier gegebenen Offenbarung und der folgenden Beispiele vorgeschlagen wird.
In einem Assay für den Nachweis von Wasserstoffperoxid wird eine Probe, in der Wasserstoffperoxid vermutet wird, in 1 ml eines Phosphatpuffers (50 mM, pH) mit 300 nm-Latexkügelchen, in die der Marker 4-(N,N-dioctadecylcarboxamidomethoxy)-benzalacridan (hergestellt gemäß Beschreibung in US-Patent Nr. 5,340,716 in Spalte 51, Zeilen 3-15, und Spalte 48, Zeilen 24-44) eingearbeitet ist, in einer Menge von 5 Gewicht in Gewicht kombiniert. An die Oberflächen der Latexkügelchen ist Lactoperoxidase (LP) gebunden (1000 Moleküle LP/Kügelchen). Das Medium, das Natriumbromid (10 mM) enthält, wird für 1 Minute bei 25°C gehalten, und das von dem Medium abgestrahlte Licht wird gemessen. Die von dem Medium abgestrahlte Lichtmenge steht in direkter Beziehung zu der Menge an Wasserstoffperoxid in der Probe.
In einem Assay zur Messung von Glucose wird eine Probe (10 μl) in 1 ml Phosphatpuffer (pH etwa 8) mit 200 μl Glucoseoxidase (2,6 μg/ml) und multilamellaren Liposomen, in deren Doppelschichten 2-Methoxyvinylpyren eingearbeitet ist und an deren Oberfläche eine Chlorperoxidase gebunden ist, kombiniert. Das gepufferte Medium enthält außerdem Natriumchlorid (0,1 M). Das Medium wird für 5 Minuten bei 37°C gehalten, und die Lumineszenzintensität wird mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Die Menge an Lumineszenz steht in direkter Beziehung zu der Menge an Glucose in der Probe.
In einem Assay zur Messung von Cholesterin wird eine Probe (10 μl) in 1 ml Phosphatpuffer (pH etwa 8) mit 200 μl Cholesterinoxidase (0,2 μg/ml) und Öltröpfchen, die aus Dodecylnaphthalen bestehen, in das 8% Gewicht in Gewicht 9-(Benzal-9H-xanthen) eingearbeitet ist, kombiniert. Mit der Oberfläche der Öltröpfchen ist eine Chlorperoxidase assoziiert, an die über einen Dodecamethylen-Spacer Naphthalen gebunden ist. Das gepufferte Medium enthält außerdem Natriumchlorid (0,1 M). Das Medium wird für 30 Minuten bei 25°C gehalten, und die Fluoreszenz wird dann fotometrisch mit Hilfe eines Fluorometers gemessen. In diesem Beispiel reagiert der Singulettsauerstoff, der gemäß der vorliegenden Erfindung entsteht, mit dem Xanthen zu einem Xanthon, das fluoreszent ist. Die Menge an Fluoreszenz steht in direkter Beziehung zu der Menge an Cholesterin in der Probe.
Wie oben erläutert, kann das Assayverfahren der vorliegenden Erfindung auf den Nachweis von anderen Analyten als Wasserstoffperoxid und Verbindungen, die in der Lage sind, Wasserstoffperoxid hervorzubringen, angewendet werden. Eine Beispiel – lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung – ist ein Assay für den Nachweis von Theophyllin in einer Serumprobe, in der Theophyllin vermutet wird. Die Serumprobe (2 μl) wird mit einem Assaymedium, das 1 ml eines Phosphatpuffers (50 mM) und 20-40 μg Latexkügelchen (300 nm), in die der Marker 4-(N,N-dioctadecylcarboxamidomethoxy)-benzalacridan (hergestellt gemäß Beschreibung in US-Patent Nr. 5,340,716 in Spalte 51, Zeilen 3-15, und Spalte 48, Zeilen 24-44) eingearbeitet ist, umfasst, in einer Menge von 5% Gewicht in Gewicht kombiniert. An die Oberflächen der Latexkügelchen sind Lactoperoxidase (LP) (1000 Moleküle LP/Kügelchen) und Antitheophyllin-Antikörper (10 μg Antikörper je mg Kügelchen) gebunden. Das Assaymedium enthält außerdem (i) ein Konjugat aus Theophyllin, das kovalent an das Enzym Galactoseoxidase gebunden ist (die Konzentration ist im Bereich von 3,2 × 10^–12 bis 3,2 × 10^–10 Mol optimiert), und (ii) β-D-Galactose als ein Substrat für die Galactoseoxidase (1,0 mM) und (iii) Natriumbromid (50 mM) als ein Substrat für LP. Das Assaymedium wird für einen Zeitraum von 15 Minuten bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, und die durch das Medium abgestrahlte Lichtmenge steht in direkter Beziehung zu der Menge an Theophyllin in der Probe.
Der oben dargelegte Assay funktioniert in der folgenden Weise: Das Theophyllin-Galactoseoxidase-Konjugat und das Proben-Theophyllin konkurrieren um die Bindungsstellen an dem Antitheophyllin-Antikörper. Konjugat, das sich an den Antikörper bindet, bewirkt, dass das Oxidase-Enzym in die unmittelbare Nähe der LP auf dem Latex-Partikel kommt. Die Galactoseoxidase wirkt so auf ihr Substrat β-D-Galactose ein, dass Wasserstoffperoxid und D-galactono-δ-lacton entstehen. Die LP wirkt so auf das Wasserstoffperoxid ein, dass Singulettsauerstoff entsteht, der an der Oberfläche der Latex-Partikel gebildet wird und in die Latex-Partikel diffundiert, wo er mit dem Marker 4-(N,N-dioctadecylcarboxamidomethoxy)-benzalacridan reagiert, wodurch Licht entsteht. In dem oben angesprochenen Assay entsteht das Wasserstoffperoxid als Teil eines signalerzeugenden Systems, das an dem Nachweis des Theophyllin-Analyten beteiligt ist. In Gegenwart von Proben-Theophyllin erhält man weniger Licht, weil das Proben-Theophyllin mit dem Konjugat um die Bindungsstellen auf dem Antitheophyllin-Antikörper konkurriert. Je größer die Menge Theophyllin in der Probe, desto geringer die Menge an Konjugat, das sich an die Latex-Partikel bindet, desto geringer die Menge an Wasserstoffperoxid, die in der Nähe der LP auf dem Latex entsteht, und desto geringer die Menge an Singulettsauerstoff, der in den Latex-Partikel diffundiert, um mit dem Acridan-Marker zu reagieren.
Ein weiteres Beispiel – lediglich zur Veranschaulichung und ohne Einschränkung – der Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Nachweis eines Analyten ist ein Assay für den Nachweis von menschlichem chorionischen Gonadatropin (HCG) in einer Urinprobe, in der HCG vermutet wird. Die Probe (100 μl) wird mit einem Assaymedium kombiniert, das 1 ml eines Phosphatpuffers (50 mM) und multilamellare Liposome (300 nm) umfasst, in deren Doppelschichten 2-Methoxyvinylpyren eingearbeitet ist und an deren Oberfläche (i) eine Chlorperoxidase (CLP) (1000 Moleküle CLP/Kügelchen) und (ii) ein Antikörper zu der (3-Untereinheit von HCG gebunden sind. Das Assaymedium enthält außerdem (i) Natriumchlorid (0,1 M) und (ii) Platinpartikel, an die Antikörper zu der α-Untereinheit von HCG gebunden sind (hergestellt gemäß Beschreibung in US-Patent Nr. 5,384,265) und (iii) Hydrazin (50 mM). Das Assaymedium wird für einen Zeitraum von 15 Minuten bei einer Temperatur von 37°C inkubiert, und die Lumineszenzintensität wird mit Hilfe eines Luminometers gemessen. Die Menge an Lumineszenz steht in direkter Beziehung zu der Menge an HCG in der Probe.
Der oben angesprochene Assay funktioniert in der folgenden Weise: Die HCG-Antikörper binden sich an alle HCG-Moleküle in der Probe, das bewirkt, dass die Platin-Partikel in unmittelbare Nähe zu den Liposomen gelangen. Platin katalysiert die Oxidation von Hydrazin unter Entstehung von Wasserstoffperoxid, was kraft der CLP auf der Oberfläche der Liposome wiederum zur Entstehung von Singulettsauerstoff nahe der Oberfläche der Liposome führt. Der Singulettsauerstoff diffundiert in die Liposome, wo er mit dem Marker 2-Methoxyvinylpyren reagiert, wodurch Lumineszenz entsteht. In dem oben angesprochenen Assay entsteht das Wasserstoffperoxid als Teil eines signalerzeugenden Systems, das an dem Nachweis des HCG-Analyten beteiligt ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Kits, die sich für die bequeme Ausführung eines Assayverfahrens der Erfindung zum Bestimmen des Vorhandenseins oder der Menge einer Verbindung, die Wasserstoffperoxid zu erzeugen vermag, oder eines Analyten in einer Probe, in der man eine solche Verbindung oder einen solchen Analyten vermutet, eignen. Zum Erhöhen der Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung können die Reagenzien in abgepackter Kombination, im selben oder in separaten Behältern, vorgesehen sein, so dass das Verhältnis der Reagenzien für eine wesentliche Optimierung des Verfahrens und des Assays sorgt. Die Reagenzien können sich jeweils in separaten Behältern befinden, oder verschiedene Reagenzien können in einem oder mehreren Behältern, je nach der Kreuzreaktionenfreudigkeit und Stabilität der Reagenzien, kombiniert sein. Die Kits umfassen in abgepackter Kombination (a) eine Zusammensetzung, die eine Matrix umfasst, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, wobei ein Enzym, das in der Lage ist, die Umwandlung von Wasserstoffperoxid zu Singulettsauerstoff zu katalysieren, an die Matrix gebunden ist oder, wenn es nicht an die Matrix gebunden ist, an einen sBP-Partner gebunden ist, der in der Lage ist, sich an die Matrix zu binden, und die Matrix das Diffundieren von Singulettsauerstoff darin gestattet. Das Kit enthält außerdem ein Substrat für das Enzym, bei dem es sich nicht um Wasserstoffperoxid handelt. Das Kit kann des Weiteren noch andere separat abgepackte Reagenzien zum Durchführen eines Assay enthalten, wie zum Beispiel einen Energieakzeptor, der in die Matrix eingearbeitet oder an einen sBP-Partner gebunden ist, zusätzliche sBP-Partner, Hilfsreagenzien wie zum Beispiel ein Hilfsenzymsubstrat, und so weiter. Alternativ kann das Kit in abgepackter Kombination umfassen: (a) eine Zusammensetzung, die eine Matrix und einen Marker umfasst, der durch Singulettsauerstoff modifiziert werden kann, (b) eine Peroxidase und (c) eine Oxidase, wobei die Oxidase ein Enzym oder ein anderer Katalysator sein kann, der in der Lage ist, Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Die Peroxidase und die Oxidase sind an die Matrix gebunden oder können an die Matrix gebunden werden.
Die relativen Mengen der verschiedenen Reagenzien in den Kits können in einem weiten Bereich variiert werden, um Konzentrationen der Reagenzien bereitzustellen, die wesentlich die Reaktionen optimieren, die während des vorliegenden Verfahrens stattfinden müssen, und um des Weiteren die Empfindlichkeit des Assays wesentlich zu erhöhen. Unter entsprechenden Umständen können ein oder mehrere der Reagenzien in dem Kit als ein Trockenpulver bereitgestellt werden, gewöhnlich lyophilisiert, einschließlich Bindemitteln, die beim Auflösen eine Reagenslösung ergeben, die die entsprechenden Konzentrationen zum Durchführen eines Verfahrens oder Assays gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist. Das Kit kann des Weiteren eine schriftliche Beschreibung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, enthalten.
BEISPIELE
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden veranschaulichenden Beispiele weiter aufgezeigt. Teile und Prozentangaben, die hier genannt sind, beziehen sich auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Temperaturangaben sind in Grad Celsius (°C).
Abkürzungen und Materialien

s:

Sekunden

h:

Stunden

min:

Minuten

RLE:

relative Lichteinheiten

U/min:

Umdrehungen pro Minute

EDTS:

Ethylendiamintetraessigsäure

MES:

2-[N-morpholino]ethansulfonsäure

CMO:

Carboxymethoxylaminhemihydrochlorid

NaOAc:

Natriumacetat

DMF:

Dimethylformamaid
- Dextran T-500 von Pharmacia, Katalognummer 17-0320-02
- Natriumhydroxid von Mallinckrodt AR (Charge 7707 KMRT)
- Wasser (entionisiert) von einer Millipore-Filtrationseinheit
- Minikros Lab System (Microgon, Inc., Katalognummer SYLS 121 01N), und Minikros-Tangentialströmungsmodule (M25S 300 01N, M25S 600 01N, M21M-300-01N), beide von Microgon, Inc., Laguna Hills, Kalifornien
- Dinatriumethylendiamintetraessigsäure, EDTS Na₂ von Sigma (Katalognummer E4884)
- Rinderserumalbumin (RSA) von Sigma (Katalognummer A7888).
- Gentamicinsulfat von GIBCO (Katalognummer 15750-011) Kathon von Rohm & Haas, Artikelnummer 5A033, Charge Cl.
- NaOH (Pellets), 0,1 N NaOH, HCl (Konz.), H₂SO₄ (Konz.) und 0,1 N HCl, alle von Mallinckrodt (AR-Güte)
- Borsäure (H₃BO₃, körnig), Essigsäure (Eisessig, AcOH) und Natriumacetat (NaOAc), alle von Mallinckrodt (AR-Güte).
- Ethanol (200 Proof, EtOH) von Quantum
- p-Dimethylaminobenzaldehyd von Sigma (Katalognummer D-2004)
- Streptavidin von Aaston, Inc., (Katalognummer 1 STA-1G-D), oder Boehringer Mannheim (Katalognummer 1520679103)
- Tween-20 (Surfact-Amps 20) von Pierce Chemical Company

Die Partikelgröße wurde mittels dynamischer Lichtstreuung in einem Nicomp (Modell 370) bestimmt.
TRIS: Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl (eine 10-fache Lösung) von BioWhittaker, Walkersville, Maryland, oder von J. T. Baker (Katalognummer 4099-02)
Puffer A: Acetatpuffer 0,1 M, pH 5,0; Lösung (0,2 M) aus Natriumacetat (16,4 g), aufgelöst in 2,0 1 Wasser, mit Essigsäure (0,2 M) zu pH 5,0 kombiniert; mit einem gleichen Volumen Wasser zu Acetatpuffer (0,1 M) mit pH 5,0 verdünnt
Puffer B: proteinfreier Puffer zum Waschen von Streptavidin-beschichteten Kügelchen; 121,1 g TRIS, 175,3 g NaCl, 93,0 g EDTS Na₂·2H₂O und 10,0 g Dextran T-500 in 10,0 1 Wasser; eingestellt auf einen pH von 8,3 mit konzentrierter HCl
Puffer C: 121,1 g TRIS (0,1 M), 175,3 g NaCl (0,3 M), 93,0 g EDTS Na₂·2H₂O (25 mM), 10,0 g Dextran T-500 (0,1%), 31,25 ml HBR-1 (von Scantibodies Laboratory, Inc., Los Angeles, Kalifornien) (1/320), 10,0 g RSA mit RIA-Güte (0,1%), 5 ml Kathon (0,05%) und 20 ml Gentamicinsulfat (0,01%) in 10,0 1 Wasser; eingestellt auf einen pH von 8,3 mit konzentrierter HCl
Beispiel 1
Herstellung von Lactoperoxidase-beschichteten Chemilumineszenzer-Partikeln
A. Thioxen C-28 wurde folgendermaßen hergestellt:
Zu einer Lösung aus 4-Bromanilin (30 g, 174 mmol) in trockenem DMF (200 ml) wurden 1-Bromtetradecan (89,3 ml, 366 mmol) und N,N-diisopropylethylamin (62,2 ml, 357 mmol) gegeben. Die Reaktionslösung wurde 16 h lang bei 90°C unter Argon erwärmt und anschließend auf Raumtemperatur gekühlt. Zu dieser Reaktionslösung wurden erneut 1-Bromtetradecan (45 ml, 184 mmol) und N,N-diisopropylethylamin (31 ml, 178 mmol) gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei 90°C weitere 15 h erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionslösung im Vakuum konzentriert, und der Rest wurde mit CH₂Cl₂ (400 ml) verdünnt. Die CH₂Cl₂-Lösung wurde mit 1 N wässriger NaOH (2-fach), H₂O und Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, so dass ein dunkelbraunes Öl (etwa 110 g) entstand. Präparative Säulenchromatografie auf Kieselgel mit einem Waters 500 Prep LC-System und Eluierung mit Hexan erbrachte ein gelbes Öl, das überwiegend das Produkt (4-Brom-N,N-di-(C₁₄H₂₉) -anilin), zusammen mit einer geringen Komponente 1-Bromtetradecan, enthielt. Die letztgenannte Verbindung wurde durch Vakuumdestillation (Siedepunkt 105-110°C, 0,6 mm) aus dem Gemisch entfernt, woraufhin 50,2 g (51%) des Produkts als ein braunes Öl zurückblieben. Zu einem Gemisch aus Magnesium-Drehspänen (9,60 g, 395 mmol) in trockenem THF (30 ml) unter Argon wurde eine Lösung des oben erwähnten substituierten Anilinprodukts (44,7 g, 79 mmol) in THF (250 ml) zugetropft. Es wurden ein paar Iodkristalle hinzugegeben, um die Entstehung des Grignard-Reagens zu initiieren. Als das Reaktionsgemisch warm wurde und rückzufließen begann, wurde die Beigaberate so reguliert, dass ein sanfter Rückfluss beibehalten wurde. Nach vollendeter Beigabe wurde das Gemisch eine weitere Stunde am Rückfluss gekocht. Die abgekühlte Überstandslösung wurde mittels einer Kanüle in einen Zugabetrichter verbracht und über 2,5 h hinweg zu einer Lösung aus Phenylglyoxal (11,7 g, 87 mmol) in THF (300 ml) bei –30°C unter Argon hinzugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde allmählich über 1 h hinweg auf 0°C erwärmt und weitere 30 min gerührt. Das resultierende Gemisch wurde in ein Gemisch aus Eiswasser (800 ml) und Ethylacetat (250 ml) gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (3-fach) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit H₂O (2-fach) und Sole gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösemittels blieben 48,8 g des Rohprodukts als eine dunkelgrüne ölige Flüssigkeit zurück. Flashsäulenchromatografie dieser Flüssigkeit (Gradientelution mit Hexan, 1,5:98,5, 3:97, 5:95 Ethylacetat:Hexan) ergab 24,7 g (50%) des Benzoin-Produkts (MS(C₄₂H₆₉NO₂):[M – H]⁺ 618,6, ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) entsprach dem erwarteten Benzoin-Produkt. Zu einer Lösung aus dem oben erwähnten Benzoin-Produkt (24,7 g, 40 mmol) in trockenem Toluen (500 ml) wurden der Reihe nach 2-Mercaptoethanol (25 g, 320 mmol) und TMSCI (100 ml, 788 mmol) beigegeben. Die Reaktionslösung wurde 23 h lang unter Argon am Rückfluss gekocht und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Dazu wurde weiteres TMSCI (50 ml, 394 mmol) gegeben, und die Reaktionslösung wurde weitere 3 h am Rückfluss gekocht. Die resultierende Lösung wurde abgekühlt, mit kaltem wässrigen NaOH (2,5 N) basisch gestellt und mit CH₂Cl₂ (3-fach) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃ (2-fach) und Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch eine braune ölige Flüssigkeit entstand. Präparative Säulenchromatografie auf Kieselgel mittels eines Waters 500 Prep LC-Systems (Gradientelution mit Hexan, 1:99, 2:98 Ethylacetat:Hexan) ergab 15,5 g (60%) des Thioxens C- 28 als ein orange-gelbes Öl (MS(C₄₄H₇₁NOS):[M – H)b⁺ 661,6, ¹H NMR (250 MHz, CDCl₃) entsprach dem erwarteten Thioxen C-28-Produkt 2-(4-(N,N-di-(C₁₄H₂₉)-anilino)-3-phenylthioxen.
B. Chemilumineszenzer-Kügelchen wurden folgendermaßen hergestellt:
Die Ausgangskügelchen bestanden aus carboxylatmodifiziertem Latex, das bei Seradyn Particle Technology, Indianapolis, Indiana, bezogen wurde. Die Kügelchen enthielten Eu(TTA)₃DPP, das folgendermaßen hergestellt wurde: Durch Kombinieren von 8,69 g Eu(TTA)₃·3H₂O (10 mMol, Kodak Chemical Company, Rochester New York) und 1,8 g 1,10-Phenanthrolin (10 mMol, Aldrich) in 50 ml trockenem Toluen und einstündiges Erwärmen auf 95°C in einem Ölbad wurde DPP/Eu(TTA)₃ hergestellt. Toluen wurde unter verringertem Druck abgezogen. Der aschefarbene Feststoff wurde aus 10 ml Toluen kristallisiert, wodurch 10 Gramm DPP/Eu(TTA)₃ entstanden. Absorptionsspektrum: 270 nm (20.000), 340 nm (60.000) (Toluen) 1.R(KBr): cm^–1: 3440 (s), 1600 (s), 1540 (s), 1400(s), 1300(s). Vier ml 20%iger Suspension (400 mg) aus gewaschenem carboxylatmodifiziertem Latex (175 nm) wurden mit 3 ml Ethoxyethanol in einem 25-ml-Rundkolben mit einem Rührstab verdünnt. Der Rundkolben wurde dann bei 105°C in ein Ölbad gestellt und 10 min gerührt. Dann wurden Thioxen C-28 (3,3 mM) und Eu(TTA)₃DPP (15,5 mM) hinzugegeben, und die Kügelchen wurden weitere 5 min gerührt. An diesem Punkt wurden 1,0 ml NaOH (0,1 N) langsam über einen Zeitraum von 5 min beigegeben. Während all dieser Beigaben wurde die Ölbadtemperatur auf 105°C gehalten. Die Ölbadtemperatur ließ man über einen Zeitraum von 2 h langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch mit 20 ml Ethanol verdünnt und zentrifugiert (12.500 U/min, 30 min). Die Überstände wurden entsorgt, und die Pellets wurden durch Beschallung in Ethanol resuspendiert. Die Zentrifugierung wurde wiederholt, und das Pellet wurde in Wasser resuspendiert. Dann wurde die Zentrifugierung wiederholt. Das Pellet wurde in 5 ml wässrigem Ethanol auf ein Endvolumen von 40 ml resuspendiert.
C. Streptavidin-beschichtete Chemilumineszenzer-Kügelchen wurden folgendermaßen hergestellt:
Streptavidin von Aaston war eine lyophilisiertes weißes Pulver, das Streptavidin, Kaliumphosphat, Natriumchlorid und Lactose enthielt. Die Lactose wurde durch Dialyse gegen Na₂HPO₄/NaH₂PO₄(10 mM, pH 7,0) entfernt. Eine Lösung aus Streptavidin mit 10-12 mg/ml (75-62,5 ml) wurde in Puffer A (pH 5,0, 0,2 M) hergestellt.
Aldehyd-Gruppen wurden an die Oberfläche von Chemilumineszenzer-Kügelchen, die wie oben beschrieben hergestellt waren, angeheftet, so dass Aldehyd-Chemilumineszenzer-Kügelchen entstanden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,264,766, insbesondere Spalte 7, Zeilen 18-42, und Spalte 8, Zeile 63, bis Spalte 9, Zeile 25, und US-Patent Nr. 4,801,504, insbesondere Spalte 6, Zeilen 42-50.
Es wurde eine Lösung aus Aldehyd-Chemilumineszenzer-Kügelchen (20 mg/ml), die Tween-20 (75 ml) enthielt, hergestellt. Die Lösung, die die Kügelchen enthielt, wurde langsam unter vorsichtigem Rühren zu der oben hergestellten Streptavidin-Lösung, die in einer 250-ml-Glasflasche enthalten war, beigegeben. Eine frische Lösung NaCNBH₃ in Wasser wurde hergestellt und dem Reaktionsgemisch beigegeben. Die endgültige Konzentration des Reaktionsgemischs war 10 mg/ml in Kügelchen, 5 mg/ml in Streptavidin, 1,0 mg/ml in NaCNBH₃ und 0,1% in Tween-20. Der pH des Reaktionsgemischs wurde auf 5,0 eingestellt. Die Flasche wurde vor Licht abgeschirmt und bei 100-150 U/min bei 37°C 48-60 h lang geschüttelt. Die resultierenden Kügelchen wurden behandelt, um verbliebene freie Aldehyd-Gruppen zu blockieren. Siehe zum Beispiel Margel, S., J. Chromatogr. (1989) 46: 177-189.
Die Kügelchen wurden dann mit dem Microgon (0,05 μ Porengröße, 1188 cm²) ultrafiltriert, erst mit Puffer B, um Protein zu entfernen, und dann mit Puffer C. Die Größe der Kügelchen wurde mit dem Nicomp bestimmt und betrug ungefähr 280 nm (intensitätsgewichtet) in Puffer C.
D. Herstellung von Lactoperoxidase-beschichteten Chemilumineszenzer-Kügelchen Strepavidin-beschichtete Chemilumineszenzer-Kügelchen (30 mg), die wie oben beschrieben hergestellt waren, in MES-Puffer (1,0 ml, pH 6,0, 10 mM) wurden beschallt. 1,0 ml Biotin-markierte Lactoperoxidase (1,0 mg/ml) (Sigma L-8257; 108 Einheiten/mg Protein; 6 Biotinis/Enzym) in MES-Puffer (pH 6,0, 10 mM) wurden zu der obigen Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde verwirbelt und 90 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Chemilumineszenzer-Kügelchen wurden zentrifugiert und dreimal mit MES-Puffer (10 ml, pH 6,0, 10 mM) gewaschen. Die Chemilumineszenzer-Kügelchen wurden abschließend in MES-Puffer (1,0 mg/ml, pH 6,0, 10 mM) mit 1,0 mg/ml RSA resuspendiert. Die Partikel wurden für den Assay verwendet.
Beispiel 2
Auswirkung des pH auf das Chemilumineszenzsignal von Lactoperoxidase, die an Chemilumineszenzer-Partikel gebunden ist
Es wurde eine Lösung hergestellt, die Wasserstoffperoxid (0,1 mM) in verschiedenen Puffern enthielt (Acetat, pH 4,2, pH 5,0, 0,1 M, und Phosphat, pH 6,0, pH 7,0, pH 7,4 und pH 8,0, 0,1 M). Zu 1,0 ml der obigen Lösung in einem Reagenzglas (12 × 75 mm) wurden 0,01 ml Natriumbromid (1,0 M) in entionisiertem Wasser und 0,01 ml Lactoperoxidase-beschichtete Chemilumineszenzer- Partikel (1 mg/ml in MES-Puffer, 10 mM, pH 6,0) gegeben. Die Lösung wurde sofort vermischt und das Reagenzglas in ein Chemiluminometer eingebracht. Die Chemilumineszenz wurde 30 s integriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
TABELLE 1
Beispiel 3
Auswirkung der Natriumbromid-Konzentration auf das Chemilumineszenzsignal von Lactoperoxidase, die an Chemilumineszenzer-Partikel gebunden ist
Es wurde eine Lösung, die Wasserstoffperoxid (0,1 mM) in Phosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 M) enthielt, hergestellt. Zu 1,0 ml der obigen Lösung in einem Reagenzglas (12 × 75 mm) wurden 0,0003 ml bis 0,06 ml Natriumbromid (1,0 M) in entionisiertem Wasser und 0,05 ml Lactoperoxidase-beschichtete Chemilumineszenzer-Partikel (1 mg/ml in MES-Puffer, 10 mM, pH 6,0) gegeben. Die Lösung wurde sofort vermischt und das Reagenzglas in ein Chemiluminometer eingebracht. Die Chemilumineszenz wurde 30 s integriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
TABELLE 2
Beispiel 4
Bestimmung von Wasserstoffperoxid
Eine Probe oder ein Kalibrator, der Wasserstoffperoxid enthielt, wurde in Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 M) (endgültige Konzentration) hergestellt. Zu 1 ml dieser Lösung in einem Reagenzglas (12 × 75 mm) wurden 0,02 ml Natriumbromid (1,0 M) in entionisiertem Wasser und 0,01 ml des eingeschlossenen Reagens', das eine Suspension aus 1 mg/ml Lactoperoxidase-beschichteten Chemilumineszenzer-Partikeln in MES-Puffer (pH 6,0) enthält, gegeben. Die Lösung wurde sofort vermischt und das Reagenzglas in ein Chemiluminometer eingebracht. Das Chemilumineszenzsignal wurde 5 s integriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
TABELLE 3
Beispiel 5
Bestimmung von Glucose
Eine Probe oder ein Kalibrator, der Glucose enthielt, wurde in Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0, 0,1 M) (endgültige Konzentration) hergestellt, und 0,02 ml Glucoseoxidase (1 mg/ml) wurde beigegeben. Nach dem Mischen wurde die Lösung 5 min inkubiert.
Zu 1 ml dieser Lösung in einem Reagenzglas (12 × 75 mm) wurden 0,02 ml Natriumbromid (1,0 M) in entionisiertem Wasser und 0,01 ml des eingeschlossenen Reagens', das eine Suspension aus 1 mg/ml Lactoperoxidasebeschichteten Chemilumineszenzer-Partikeln in MES-Puffer (pH 6,0) enthält, gegeben. Die Lösung wurde sofort vermischt und das Reagenzglas in ein Chemiluminometer eingebracht. Das Chemilumineszenzsignal wurde 5 s integriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst. TABELLE 4

*keine Chemilumineszenzer-Kügelchen

Die obige Besprechung enthält bestimmte Theorien bezüglich der Mechanismen, die an der vorliegenden Erfindung beteiligt sind. Diese Theorien sind nicht so auszulegen, dass sie die vorliegende Erfindung in irgend einer Weise einschränken, weil aufgezeigt wurde, dass die vorliegende Erfindung die beschriebenen Ergebnisse erreicht.
Obgleich die oben dargelegte Erfindung im Interesse der Klarheit und des Verständnisses veranschaulichend und beispielhaft in einiger Detailliertheit beschrieben wurde, ist klar, dass bestimmte Änderungen innerhalb des Geltungsbereichs der angehängten Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

Zusammensetzung, enthaltend eine Matrix, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulet-Sauerstoff modifiziert werden kann, wobei ein Katalysator, der dazu in der Lage ist, die Bildung von Singulet-Sauerstoff aus Wasserstoffperoxyd zu katalysieren, an die Oberfläche dieser Matrix gebunden ist und die Matrix die Diffusion von Singulet-Sauerstoff in sie hinein gestattet.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der aus polymeren Materialien, Lipiddoppelschichten, Öltröpfchen und Zellen bestehenden Gruppe.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Marker bei der Reaktion mit Singulet-Sauerstoff fluoresziert oder chemieluminesziert.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Marker um ein Olefin handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Katalysator um ein Enzym handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der aus Latexpolymeren und Lipiddoppelschichten bestehenden Gruppe und wobei es sich bei dem Katalysator um eine Peroxidase handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Matrix um ein Latexpartikel handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Matrix um ein Liposom handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Marker um ein Olefin handelt, das dazu in der Lage ist, mit Singulet-sauerstoff unter Bewirkung von Chemilumineszenz zu reagieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei der Marker dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bildung. eines fluoreszenten Produkts zu reagieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Peroxidase um eine Lactoperoxidase oder eine Haloperoxidase handelt.
Verfahren zum Nachweis von Wasserstoffperoxyd oder einer zur Erzeugung von wasserstoffperoxydfähigen Verbindung, bei dem man: (a) in einer Kombination (i) eine Probe, von der angenommen wird, daß sie Wasserstoffperoxyd oder die besagte Verbindung enthält, und (ii) die Zusammensetzung nach Anspruch 1 bereitstellt, (b) die Kombination Bedingungen aussetzt, bei denen der Katalysator Singulet-Sauerstoff erzeugt, und (c) bestimmt, ob Singulet-Sauerstoff mit dem Marker reagiert hat, wobei das Ausmaß der Reaktion davon das Vorhandensein bzw. die Menge an dieser Verbindung bzw. Wasserstoffperoxyd angibt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der aus polymeren Materialien, Lipiddoppelschichten, Öltröpfchen und Zellen bestehenden Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Marker um ein chemilumineszentes Olefin handelt, das dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bildung eines Dioxetans zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Katalysator um ein Enzym handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Katalysator um eine Peroxidase handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Bestimmung in Schritt (c) durchgeführt wird, indem man Licht nachweist, das von dem Produkt der Umsetzung der Vorstufe einer lumineszenten Verbindung mit Singulet-Sauerstoff immitiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Bestimmung in Schritt (c) durchgeführt wird, indem man Licht nachweist, das von dem Produkt der Umsetzung des Markers mit Singulet-Sauerstoff immiteirt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei der Verbindung um ein Substrat für eine Oxidase handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Marker um ein Telorid handelt, das dazu fähig ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bildung eines fluoreszenten Olefins zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Katalysator um ein Enzym handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Bestimmung in Schritt (c) durchgeführt wird, indem man Licht nachweist, daß von dem Produkt der Umsetzung des Markers mit Singulet-Sauerstoff immitiert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Katalysator um eine Peroxidase handelt und wobei das polymere Material ausgewählt ist aus der aus Latexpolymeren und Lipiddoppelschichten bestehenden Gruppe und wobei es sich bei dem Marker um ein Olefin handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Verbindung aus der aus Zellen, Substraten für eine Oxidase und Vorstufen eines Substrats für eine Oxidase bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Substrat für eine Oxidase ausgewählt ist aus der aus Sacchariden, Alkoholaminen, NADH, Xanten, Harnsäure und Cholesterin bestehenden Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Matrix um ein Latexpolimerpartikel handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Matrix um ein Liposom handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Olefin dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bildung eines Dioxetans zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei es sich bei der Peroxidase um eine Laktoperoxidase oder eine Haloperoxidase handelt.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Bestimmung in Schritt (c) durchgeführt wird, indem man Licht nachweist, das von dem Produkt der Umsetzung des Olefins mit Singulet-Sauerstoff immitiert wird.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten, wobei es sich bei dem Analyten um ein Teil eines spezifisch bindenden Paares (SBP) handelt, bei dem man: (a) in Kombination in einem Medium (i) eine Probe, von der angenommen wird, daß sie en Analyten enthält, (ii) ein erstes SBP-Teil gebunden an Element einer Gruppe bestehend aus einer Oxidase und einer Peroxidase, wobei das SBP-Teil dazu fähig ist, sich an den Analyten oder an ein anderes SBP-Teil, das dazu in der Lage ist, sich an den Analyten zu binden, zu binden, (iii) eine Zusammensetzung enthaltend eine Matrix, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singult-Sauerstoff modifiziert werden kann, wobei die Matrix die Diffusion von Singulet-Sauerstoff in sie hinein gestattet, (iv) das andere Element der aus einer Oxidase und einer Peroxidase bestehenden Gruppe und ein zweiten SBP-Teil gebunden an die Matrix, oder das andere Element der aus der Oxidase und der Peroxidase bestehenden Gruppe gebunden an das zweite SBP-Teil, das dazu in der Lage ist, an die Matrix zu binden, wobei das zweite SBP-Teil dazu in der Lage ist, sich in einer vom Vorhandensein des Analyten abhängigen Menge an das erste SBP-Teil zu binden, und (v) ein Substrat für die Oxidase, das bei der Reaktion mit der Oxidase Wasserstoffperoxyd bereitstellen kann, bereitstellt, und (b) das Medium unter Bedingungen inkubiert, die ausreichen, um eine Bindung des SBP-Teils und eine Reaktion des Substrats für die Oxidase mit der Oxidase zu ermöglichen und (c) bestimmt, ob Singulet-Sauerstoff mit dem Marker reagiert hat, wobei das Ausmaß der Umsetzung davon von dem Vorhandensein und/oder der Menge des Analyten in der Probe abhängt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Analyt ausgewählt ist aus der aus Zelloberflächenantigenen, kleinen organischen Molekülen, Poly(aminosäuren) und Polynukleotiden bestehenden Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei dem Substrat für eine Oxidase um ein Saccharid handelt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei der Matrix um ein Latexpartikel handelt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei der Matrix um ein Liposom handelt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Marker dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bewirkung von Chemilumineszenz zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der Marker dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff unter Bildung eines fluoreszenten Produktes zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich bei der Peroxidase um eine Lactoperoxidase oder eine Haloperoxidase handelt.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Peroxidase an die Matrix gebunden ist.
Kit, enthaltend in einer verpackten Kombination: (a) eine Zusammensetzung umfassend eine Matrix, in die ein Marker eingearbeitet ist, der durch Singulet-Sauerstoff modifiziert werden kann, wobei ein Enzym, das dazu in der Lage ist, die Umwandlung von Wasserstoffperoxyd in Singulet-Sauerstoff zu katalysieren, an die Matrix oder an ein SBP-Teil, das dazu in der Lage ist, an die Matrix zu binden, gebunden ist, wobei die Matrix die Diffusion von Singulet-sdauerstoff in sie hinein gestattet, und (b) ein Substrat für das Enzym, bei dem es sich nicht um Wasserstoffperoxyd handelt.
Kit nach Anspruch 40, weiterhin enthaltend eine Oxidase.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Matrix ausgewählt ist aus der aus organischen Polymeren und Lipiddoppelschichten bestehenden Gruppe und wobei die Oxidase an ein SBP-Teil gebunden ist.
Kit nach Anspruch 40, wobei es sich bei dem Marker um ein chemilumineszentes Olefin handelt, das dazu in der Lage ist, mit Singulet-Sauerstoff zu reagieren.
Kit nach Anspruch 40, wobei es sich bei dem Enzym um eine Peroxidase handelt.
Kit, enthaltend in einer verpackten Kombination: (a) eine Zusammensetzung umfassend eine Matrix, in die ein Marker eingearbeitet ist, der mit Singulet-Sauerstoff reagieren kann, (b) eine Peroxidase und (c) eine Oxidase, wobei die Peroxidase bzw, die Oxidase an die Matrix gebunden ist oder dazu in der Lage ist, an die Matrix gebunden zu werden, und wobei Oxidase und/oder Peroxidase an ein SBP-Teil gebunden sind, das einen Analyten binden kann.
Kit nach Anspruch 45, wobei die Peroxidase an ein Teil eines spezifischen Bindungspaars gebunden ist.
Kit nach Anspruch 45, wobei sowohl die Peroxidase als auch die Oxidase jeweils getrennt an ein Teil eines spezifischen Bindungspaars gebunden isnd.