ES2270459T3 - Composiciones quimioluminiscentes y su uso en la deteccion de peroxido de hidrogeno. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN COMPOSICIONES, PROCEDIMIENTOS Y ESTUCHES DE ENSAYO. LAS COMPOSICIONES INCLUYEN UNA MATRIZ QUE PRESENTA INCORPORADA EN ELLA UN MARCADOR CAPAZ DE SER MODIFICADO POR OXIGENO SINGLETE. SE UNE A LA MATRIZ UN CATALIZADOR CAPAZ DE CATALIZAR LA FORMACION DE OXIGENO SINGLETE, QUE PERMITE LA DIFUSION DE OXIGENO SINGLETE EN SU INTERIOR. LAS COMPOSICIONES PUEDEN UTILIZARSE EN PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR PEROXIDO DE HIDROGENO O UN COMPUESTO CAPAZ DE GENERAR PEROXIDO DE HIDROGENO. SE COMBINA UNA MUESTRA SOSPECHOSA DE CONTENER ESTE COMPUESTO CON UNA COMPOSICION SEGUN LA PRESENTE INVENCION. LA COMBINACION SE SOMETE A CONDICIONES EN LAS CUALES DICHO COMPUESTO GENERA PEROXIDO DE HIDROGENO. SE DETERMINA LA REACCION DEL OXIGENO SINGLETE CON EL MARCADOR, INDICANDO LA REACCION LA PRESENCIA DEL COMPUESTO CAPAZ DE GENERAR PEROXIDO DE HIDROGENO.

Description

Composiciones quimioluminiscentes y su uso en la detección de peróxido de hidrógeno.

Fundamento de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a métodos, composiciones y kits para detectar peróxido de hidrógeno o un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno.

El campo del diagnóstico clínico ha experimentado una amplia expansión en los últimos años, tanto en la variedad de materiales de interés que pueden ser determinados con facilidad y precisión, como en lo que se refiere a los métodos de determinación. Se desean medios cómodos, fiables y no peligrosos para detectar la presencia de bajas concentraciones de materiales en líquidos. En la química clínica, estos materiales pueden estar presentes en los fluidos corporales en concentraciones por debajo de 10^{-12} molar. La dificultad de detectar bajas concentraciones de estos materiales se ve incrementada por los tamaños de muestra relativamente pequeños que pueden utilizarse.

La detección de bajas concentraciones de peróxido de hidrógeno es útil para numerosos procedimientos analíticos, en particular en la química clínica. El peróxido de hidrógeno es producido por células tales como los monocitos y es un indicador de la activación monocítica. Adicionalmente, cualquier material de interés que se convierta o pueda convertirse en un sustrato para una oxidasa tal como xanteno oxidasa, aminoácido oxidasa, NADH oxidasa, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, glicerol fosfato oxidasa, y similares, puede ser detectado por el peróxido de hidrógeno que se produce por la acción de la enzima sobre el sustrato. Pueden llevarse a cabo de forma rutinaria ensayos de glucosa, triglicéridos, d-aminoácidos y colesterol detectando el peróxido de hidrógeno, normalmente por reacción de una peroxidasa y una sustancia cromógena. Los inmunoensayos enzimáticos que utilizan una oxidasa tal como glucosa oxidasa como marcador dependen también de un método sensible de detección para el peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, cuando se usa glucosa oxidasa como marcador, el peróxido de hidrógeno puede ser detectado usando peroxidasa de rábano picante y una sustancia cromógena, o el peróxido de hidrógeno puede ser detectado electroquímicamente.

La detección del peróxido de hidrógeno se está haciendo también más importante en el área de la alimentación. Por ejemplo, en algunos países el peróxido de hidrógeno se usa como agente blanqueante para alimentos. Es importante que los niveles residuales de peróxido de hidrógeno en el alimento después del blanqueo sean sustancialmente cero para evitar riesgos sanitarios.

Un método que sea más sensible, con menos interferencia por la muestra, y que use menos y más estables reactivos, aumentaría la simplicidad y la fiabilidad de los ensayos para la detección del peróxido de hidrógeno, o dependientes de dicha detección.

Con anterioridad se han descrito inmunoensayos homogéneos para moléculas pequeñas. Estos ensayos incluyen el ensayo FRAT® de Syva Company, el ensayo EMIT®, el inmunoensayo de canalización de enzima, y el inmunoensayo de transferencia de energía de fluorescencia (FETI: Fluorescence Energy Transfer Immunoassay); inmunoensayos de inhibidor de enzimas (Hoffman LaRoche y Abbott Laboratories); inmunoensayo de polarización de fluorescencia (Dandlicker), entre otros. Todos estos métodos tienen una sensibilidad limitada, y sólo unos pocos, incluyendo FETI y canalización de enzimas, son adecuados para grandes analitos multiepitópicos.

Los compuestos luminiscentes tales como los compuestos fluorescentes y los compuestos quimioluminiscentes, encuentran amplia aplicación en el campo del análisis gracias a su capacidad para emitir luz. Por esta razón los compuestos luminiscentes han sido utilizados como marcadores en ensayos tales como ensayos de ácidos nucleicos e inmunoensayos. Por ejemplo, un miembro de un par de unión específica se conjuga con un compuesto luminiscente y se emplean varios protocolos. El conjugado de compuesto luminiscente puede ser repartido entre una fase sólida y una fase líquida en relación con la cantidad de analito en una muestra sospechosa de contener el analito. Midiendo la luminiscencia de cualquiera de las fases, se puede relacionar el nivel de luminiscencia observado con la concentración del analito en la muestra.

Se han utilizado partículas tales como liposomas y espectros de eritrocitos como vehículos de materiales solubles en agua encapsulados. Por ejemplo se han empleado liposomas para encapsular material biológicamente activo para una diversidad de empleos, tales como sistemas de suministro de fármacos, en los que un medicamento es atrapado durante la preparación de un liposoma y después es administrado al paciente que se ha de tratar.

También se han utilizado en los ensayos partículas tales como esferas de látex y liposomas. Por ejemplo, en ensayos homogéneos puede atraparse una enzima en la fase acuosa de un liposoma marcado con un anticuerpo o un antígeno. Se hace que los liposomas liberen la enzima en presencia de una muestra y complemento. Los liposomas marcados con anticuerpo o antígeno, que tienen encapsulados colorantes fluorescentes o no fluorescentes solubles en agua en el interior de una vesícula de fase acuosa o colorantes liposolubles disueltos en la bicapa lipídica de un lípido, han sido utilizados también para ensayar los analitos capaces de entrar en una reacción inmunoquímica con el anticuerpo o el antígeno unidos a la superficie. Se han usado detergentes para liberar los colorantes de la fase acuosa de los liposomas.

2. Breve descripción de la técnica relacionada

La patente de EE.UU. nº 5.084.381 (Akimoto et al.) discute un método de ensayo para detectar peróxido de hidrógeno.

Procedimientos y materiales para llevar a cabo ensayos de unión específica se describen en la solicitud de patente WO 86/01899 (Davis et al.).

La patente de EE.UU. nº 5.108.893 (Baret) describe el uso de sistemas de enzima oxidasa en ensayos quimioluminiscentes.

La solicitud de patente europea 0 421 788 A2 (Allen) describe un sistema de ensayo de quimioluminiscencia de haloperoxidasa-ácido-oxidante para determinar la presencia o la cantidad de un analito en una muestra líquida.

La patente de EE.UU. nº 4.315.998 discute catalizadores fotosensibilizantes unidos a polímeros.

Se describen matrices quimioluminiscentes fotoactivables en la solicitud de patente WO 94/03812 (Pease et al.).

La solicitud de patente europea nº 0 515 194 A2 describe métodos de ensayo que utilizan luminiscencia inducida. La patente de EE.UU. nº 5.017.473 (Wagner) describe un inmunoensayo de quimioluminiscencia homogéneo que usa un material que absorbe luz, la solicitud de patente europea nº 0 345 776 (McCapra) describe ensayos de unión específica que utilizan un sensibilizante como marcador, la patente de EE.UU. nº 4.193.983 (Ullman et al.) describe composiciones de partículas de liposomas marcadas e inmunoensayos realizados con las mismas, y la patente de EE.UU. 4.891.324 (Pease et al.) describe una partícula con compuesto luminiscente para ensayos.

El documento WO-A 95/08677 describe una composición en la que uno cualquiera o ambos de un fotosensibilizador y un precursor de indicador fotoactivo puede estar unido covalentemente a partículas, bien sea proporcionando grupos funcionales de enlace en los componentes a unir o bien incorporando el fotosensibilizador o precursor de indicador fotoactivo en un polímero que comprende las partículas.

Sumario de la invención

En su aspecto más amplio, la presente invención concierne a composiciones que comprenden una matriz en la que está incorporada un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete. Un catalizador capaz de catalizar la formación de oxígeno singulete está unido o fijado a la superficie de la matriz, que permite la difusión del oxígeno singulete en la misma.

Otro aspecto de la presente invención es una composición que comprende una matriz elegida entre el grupo que consiste en polímeros de látex y bicapas lipídicas. La matriz tiene incorporada un marcador capaz de ser activado por oxígeno singulete. Una peroxidasa está unida a la superficie de la matriz, que permite la difusión del oxígeno singulete en la misma.

Otro aspecto de la presente invención es un método para detectar peróxido de hidrógeno o un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno. Se proporciona una combinación que comprende (i) una muestra sospechosa de contener peróxido de hidrógeno o dicho compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno, y (ii) una composición que comprende una matriz en la que está incorporado un marcador capaz de ser activado por oxígeno singulete. Un catalizador capaz de catalizar la formación de oxígeno singulete a partir de peróxido de hidrógeno está unido a la superficie de la matriz, que permite la difusión del oxígeno singulete en la misma. La combinación se somete a condiciones en las que tal catalizador genera oxígeno singulete. Se determina la luminiscencia producida por la reacción del oxígeno singulete con el marcador. La reacción del mismo indica la presencia de tal compuesto.

Otro aspecto de la presente invención es un método para detectar peróxido de hidrógeno o una sustancia capaz de generar peróxido de hidrógeno. Se proporciona una combinación que comprende (i) una muestra sospechosa de contener peróxido de hidrógeno o una sustancia capaz de generar peróxido de hidrógeno, y (ii) una composición que comprende una matriz en la que está incorporado un marcador capaz de ser activado por oxígeno singulete. Un catalizador capaz de catalizar la conversión del peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete está unido o fijado a la superficie de la matriz, que permite la difusión del oxígeno singulete en la misma. La combinación se somete a condiciones en las que el peróxido de hidrógeno reacciona con el catalizador para formar oxígeno singulete. Se hace una determinación para observar si el oxígeno singulete ha reaccionado con el marcador. La cuantía de la reacción del mismo indica la presencia o la cantidad de peróxido de hidrógeno o de dicha sustancia en la muestra.

Otra realización de acuerdo con la presente invención es un método para detectar peróxido de hidrógeno o una sustancia capaz de generar peróxido de hidrógeno. Se proporciona una combinación que comprende (i) una muestra sospechosa de contener peróxido de hidrógeno o una sustancia capaz de generar peróxido de hidrógeno, y (ii) una composición que comprende una matriz elegida entre el grupo que consiste en polímeros de látex y bicapas lipídicas. La matriz tiene incorporada una olefina capaz de reaccionar con oxígeno singulete. Una peroxidasa está unida a la superficie de la matriz, que permite la difusión del oxígeno singulete en la misma. La combinación se somete a condiciones en las que el peróxido de hidrógeno reacciona con la peroxidasa para formar oxígeno singulete, y después se hace una determinación para observar si el oxígeno singulete ha reaccionado con la olefina. La reacción del mismo indica la presencia de peróxido de hidrógeno o de la sustancia en la muestra.

Otro aspecto de la presente invención es un método para detectar un analito que es un miembro de un par de unión específica (sbp: specific binding pair). Se proporciona una combinación que comprende (i) una muestra sospechosa de contener el analito, (ii) un miembro de un sbp unido a una oxidasa o bien a una peroxidasa, siendo capaz del miembro del sbp de unirse al analito o a un miembro de un sbp capaz de unirse al analito, (iii) una composición que comprende una matriz en la que está incorporado un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, (iv) el otro de una oxidasa o una peroxidasa unida a la matriz, o unida a un miembro del sbp capaz de unirse a la matriz (es decir, una oxidasa está unida a la matriz si el miembro del sbp de (ii) anterior está unido a una peroxidasa, o una peroxidasa está unida a la matriz si el miembro del sbp de (ii) anterior está unido a una oxidasa), en donde la matriz permite la difusión del oxígeno singulete en la misma, y (v) un sustrato para la oxidasa capaz de generar peróxido de hidrógeno por reacción con la oxidasa. La combinación se incuba en un medio bajo condiciones suficientes para permitir que dichos miembros del sbp se unan y el sustrato para la oxidasa reaccione con la oxidasa. Se determina si el oxígeno singulete ha reaccionado con el marcador. La cuantía de tal reacción está relacionada con la presencia y/o la cantidad de analito en la muestra.

Otra realización de la presente invención es un kit que comprende, en combinación empaquetada (a) una composición que comprende una matriz en la que está incorporado un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, en la que una enzima capaz de catalizar la conversión del peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete está unida a la matriz o, si no está unido así, está unido a un miembro de un sbp que es capaz de unirse a la matriz, y la matriz permite la difusión de oxígeno singulete en la misma, y (b) un sustrato para la enzima distinto del peróxido de hidrógeno.

Otra realización de la presente invención es un kit que comprende, en combinación empaquetada (a) una composición que comprende una matriz y un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, (b) una peroxidasa y (c) una oxidasa. La peroxidasa y la oxidasa están unidas, o pueden unirse, a la matriz.

Descripción de las realizaciones especificas

En un aspecto, la presente invención utiliza la formación de oxígeno singulete a partir de peróxido de hidrógeno para permitir la detección del peróxido de hidrógeno con un mínimo de interferencia a partir de una muestra. Se une un catalizador a la superficie de una matriz que es insoluble en un medio de ensayo y que tiene incorporado a la misma un marcador tal como un material quimioluminiscente. El catalizador es capaz de provocar directa o indirectamente la producción de oxígeno singulete provocando la conversión del peróxido de hidrógeno. La invención encuentra aplicación en la detección de peróxido de hidrógeno, que puede estar presente debido a su adición a un medio o a su formación cono producto de reacción, por ejemplo en la detección de un analito. En este último aspecto, la presente invención encuentra uso en ensayos para la detección y la medida de una amplia variedad de analitos de una manera simple, eficaz y reproducible, que puede emplear inspección visual o un equipo convencional para medir la cantidad de luz producida durante la reacción.

Antes de seguir con una descripción de las realizaciones específicas de la presente invención, se definen varios términos y expresiones y se describen con detalle.

"Marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete": una sustancia que, en presencia de oxígeno singulete, experimenta un cambio detectable tal como, por ejemplo, una reacción con el oxígeno singulete para formar una sustancia diferente tal como una sustancia fluorescente o quimioluminiscente, o un precursor de las mismas. Ejemplos de tales marcadores, a título de ilustración y no de limitación, son olefinas capaces de reaccionar con oxígeno singulete para formar, p. ej., hidroperóxidos o dioxietanos, acetilenos que pueden reaccionar con oxígeno singulete para formar dicetonas, hidrazonas o hidrazidas que pueden formar compuestos azo o azo carbonilos, compuestos aromáticos que pueden formar endoperóxidos, etc. Los marcadores pueden producir cualquier señal detectable al reaccionar con oxígeno singulete, bien sea directamente o por subsiguiente reacción del producto de reacción inicial. La señal normalmente se iniciará y/o se detectará como radiación electromagnética y preferentemente será quimioluminiscencia, fluorescencia o fosforescencia.

Olefinas capaces de reaccionar con oxígeno singulete: una reacción típica de olefinas con oxígeno singulete es la adición 2 + 2 para formar un dioxietano. Estas olefinas incluyen, a título de ilustración y no de limitación, precursores de olefinas quimioluminiscentes y fluorescentes. Los dioxietanos pueden disociarse espontáneamente o por calentamiento con quimioluminiscencia espontánea, o los grupos carbonilo que se forman pueden formarse como parte de un grupo fluorescente o ser capaces de experimentar reacciones subsiguientes que llevan a una molécula fluorescente. Alternativamente, esta reacción de disociación puede llevar a la separación de un grupo de apagado de un grupo fundamentalmente fluorescente, que así recupera su propiedad fluorescente.

En las anteriores reacciones de la olefina la velocidad de rotura de enlaces suele ser mayor si la olefina está sustituida con grupos donadores de electrones tales como éteres, tioéteres, aminas y similares.

Otro tipo de reacción del oxígeno singulete con las olefinas es la cicloadición 4 + 2 con dienos, normalmente compuestos aromáticos tales como naftalenos y naftacenos. Tal reacción conduce inicialmente a un endoperóxido. En algunos casos los endoperóxidos pueden redistribuirse formando ésteres o anhídridos activos que son capaces de reaccionar con un grupo situado adecuadamente para proporcionar una lactona o lactama que puede ser fluorescente. Alternativamente, los endoperóxidos pueden oxidar un precursor de compuesto fluorescente o quimioluminiscente. Los endoperóxidos pueden también disociarse espontáneamente o al calentarlos, con emisión quimioluminiscente.

Otro tipo más de reacción del oxígeno singulete con las olefinas es la reacción "eno" que produce un alilhidroperóxido. Este producto puede reaccionar con un éster activo en la misma molécula para formar una dioxietanona que puede disociarse espontáneamente o por calentamiento, con emisión quimioluminiscente.

Olefina quimioluminiscente (CC): una sustancia olefínica que experimenta una reacción química al reaccionar con oxígeno singulete para formar un producto de reacción metastable, normalmente un dioxietano o endoperóxido, que es capaz de descomponerse con la emisión simultánea o subsiguiente de luz, normalmente dentro del margen de longitudes de onda de 250 nm a 1200 nm. Las CCs que se prefieren en la presente invención son aquellas que reaccionan con oxígeno singulete para formar dioxietanos. Las CCs preferidas son olefinas ricas en electrones. Ejemplos de tales olefinas ricas en electrones son enol éteres, enaminas, 9-alquiliden-N-alquilacridanos, arilviniléteres, 1,4-dioxenos, 1,4-tioxenos, 1,4-oxazinas, arilimidazoles, 9-alquiliden-xantenos y lucigenina.

Las CCs de interés emitirán preferentemente a una longitud de onda por encima de 300 nanómetros, preferentemente por encima de 500 nanómetros, y más preferentemente por encima de 550 nm. Los compuestos que absorben y emiten luz a longitudes de onda más allá de la región en la que los componentes de la muestra contribuyen significativamente a la absorción de luz serán de uso particular en la presente invención. La absorbancia del suero desciende rápidamente por encima de 500 nm y se hace insignificante por encima de 600 nm. Son de particular interés las olefinas quimioluminiscentes que emiten luz por encima de 550 nm. Sin embargo, las olefinas quimioluminiscentes que absorben a longitudes de onda más cortas son útiles cuando está ausente la absorbancia de interferencia de la muestra. Preferentemente, las olefinas quimioluminiscentes absorberán luz a menos de aproximadamente 400 nm para permitir la manipulación cómoda a la luz ambiente sin riesgo de producir inadvertidamente oxígeno singulete por fotosensibilización.

Cuando se desea emisión de longitud de onda larga de la olefina quimioluminiscente, puede usarse un emisor de longitud de onda larga tal como un colorante de oxazina unido a la olefina quimioluminiscente. Alternativamente, puede incluirse una molécula fluorescente en el medio que contiene la olefina quimioluminiscente. Las moléculas fluorescentes preferidas serán excitadas por la olefina quimioluminiscente activada y emitirán a una longitud de onda más larga que la longitud de onda de emisión de la olefina quimioluminiscente, normalmente mayor que 550 nm. Los ejemplos de colorantes útiles incluyen rubreno, bis-feniletinil-antraceno, ftalocianina, bis-(4-dimetilaminofenil)escuareno, dansilo, Eu(fod)_{3}, Eu(TTA)_{3}, etc. En general, estos colorantes actúan como aceptores en procesos de transferencia de energía y preferentemente tienen altos rendimientos cuánticos fluorescentes y no reaccionan rápidamente con oxígeno singulete. Pueden ser incorporados en partículas junto con la olefina quimioluminiscente en las partículas. Las CCs generalmente no contienen grupos NH o CH alílicos químicamente reactivos.

Ejemplos de olefinas quimioluminiscentes ricas en electrones adecuadas se exponen en el documento EP-A-0 653 066. Tales olefinas tienen generalmente un grupo donador de electrones en conjugación con la olefina.

Las olefinas más preferidas son aquellas que dan un dioxetano que se descompone rápidamente a temperatura ambiente (menos de 60 minutos, preferentemente menos de 5 minutos, deseablemente menos de 30 segundos). Los dioxetanos pueden ser luminiscentes solos o en unión con un aceptor de energía fluorescente. Los enol éteres son ejemplos de tales olefinas. Frecuentemente los compuestos enol éter tendrán al menos un grupo arilo unido a los carbonos olefínicos en donde el grupo arilo está sustituido con un grupo donador de electrones en una posición que incrementa la reactividad de la olefina para el oxígeno singulete y/o confiere fluorescencia al producto de disociación del dioxetano resultante. El grupo donador de electrones puede ser, por ejemplo, hidroxilo, alcoxi, amino disustituido, alquiltio, furilo, pirilo, etc. Preferentemente, los enol éteres tienen un grupo donador de electrones unido directamente a un carbono olefínico.

Las enaminas son otro ejemplo de tales olefinas. En general, las enaminas útiles se atendrán a las reglas expuestas anteriormente para los enol éteres.

Otra familia de CCs son los 2,4,5-trifenilimidazoles, con lofina como nombre común para el producto progenitor. Los análogos quimioluminiscentes incluyen sustituyentes para-dimetilamino y -metoxi.

Otras olefinas quimioluminiscentes que satisfacen los requisitos dados anteriormente pueden encontrarse en la solicitud de patente europea nº 0 345 776.

Algunos de los dioxetanos se descomponen espontáneamente y otros mediante calentamiento, con emisión de luz.

Precursor de compuesto fluorescente: se refiere a compuestos que reaccionan con oxígeno singulete para formar un compuesto fluorescente o un compuesto que puede reaccionar con un compuesto auxiliar que a continuación se convierte en un compuesto fluorescente. Hay varios tipos de reacciones de oxígeno singulete que pueden dar compuestos que conducen a un compuesto fluorescente. El tipo de reacción que se emplea y la elección del compuesto fluorescente que se desea proporciona una guía para la estructura de los precursores de compuestos fluorescentes y cualquier compuesto auxiliar usado en la presente invención.

El precursor de compuesto fluorescente experimentará preferentemente una reacción con oxígeno singulete que es muy rápida, normalmente al menos 10^{4} - 10^{6} s^{-1}, preferentemente al menos 10^{6} - 10^{8} s^{-1}, más preferentemente más de 10^{8} s^{-1}. Cuando el producto de reacción inicial es un producto intermedio que reacciona para dar un compuesto fluorescente, el producto intermedio tendrá preferentemente un tiempo de vida corto en relación con el tiempo deseado entre la formación del oxígeno singulete y la detección de la fluorescencia emitida desde el compuesto fluorescente al exponerlo a la luz. Para la generación del oxígeno singulete y la detección de la fluorescencia simultáneas el tiempo de vida es normalmente más corto que el periodo de medida total, preferentemente al menos 10 veces más corto. Cuando la generación de oxígeno singulete y la detección de la fluorescencia son secuenciales, el tiempo de vida es normalmente más corto que el periodo intermedio entre la generación del oxígeno singulete y la detección, preferentemente al menos 10 veces más corto.

Se consiguen mayores velocidades de reacción del oxígeno singulete proporcionando grupos reactivos al oxígeno singulete en el precursor de compuesto fluorescente que son ricos en electrones. Estos grupos serán normalmente una olefina o acetileno, derivados de hidrazina e hidroxilamina, selénidos y telúridos, pero no se limitan a estos grupos. Por ejemplo, se ha encontrado que los alquil telúridos que tienen un átomo de hidrógeno \beta son particularmente útiles porque reaccionan rápidamente con oxígeno singulete para producir una olefina. La velocidad de reacción depende de la disponibilidad de electrones (potencial de oxidación) del teluro. Por ejemplo, los grupos que donan electrones en un sustituyente de anillo de arilo en el átomo de teluro pueden aumentar la velocidad de reacción. El cambio de teluro a selenio (el siguiente calcogenuro inferior) reducirá la velocidad, pero aumentará la estabilidad de la molécula frente a la oxidación espontánea.

Cuando el precursor de compuesto fluorescente contiene una hidrazina o una hidrazida, la reacción con el oxígeno singulete puede producir un doble enlace. Por ejemplo, el oxígeno singulete puede convertir hidrazidas directamente en compuestos fluorescentes como en la conversión de 1,2-indazolin-3-ona en 1,2-indazol-3-ona. El potencial de oxidación de una hidrazina es un importante factor para proporcionar una elevada velocidad de reacción. Los grupos de retirada de electrones tales como el grupo acilo (p. ej. como en una hidrazida) retardan la reacción, aunque las acil hidrazidas y diazil hidrazidas pueden aún usarse como precursores de compuestos fluorescentes en la presente invención.

Otro ejemplo más de reacción de oxígeno singulete útil es la reacción con olefinas ricas en electrones tales como las descritas en la solicitud de patente europea publicada nº 0 515 194. Se describen dos tipos fundamentales de reacciones. Uno de ellos es la reacción "eno" que desplaza la posición de un doble enlace y produce un hidroperóxido. El desplazamiento del doble enlace puede provocar que dos grupos auxocrómicos en el precursor de compuesto fluorescente entren en conjugación y produzcan así un compuesto fluorescente.

Otros precursores de compuesto fluorescente reaccionan con oxígeno singulete para formar hidroperóxidos que pueden reaccionar internamente con un grupo oxidable para dar un compuesto fluorescente. Alternativamente, un hidroperóxido formado por la reacción del oxígeno singulete con un precursor de compuesto fluorescente, tal como 1,3-difenilpropeno, puede servir para oxidar la forma leuco de un colorante que está presente como compuesto auxiliar, para formar un compuesto fluorescente. El hidroperóxido puede también oxigenar un elemento del grupo V en un compuesto auxiliar para hacer que deje de actuar como agente de apagado donador de electrones de un grupo fluorescente asociado. El compuesto auxiliar podría tener alternativamente un átomo de selenio o de teluro que podría reaccionar con un hidroperóxido para producir un producto intermedio que podría experimentar la eliminación subsiguiente para formar un compuesto fluorescente.

La estructura del precursor de compuesto fluorescente dependerá por tanto de la reacción particular del oxígeno singulete que se vaya a emplear y normalmente se diseñará para asegurar que cualquier reacción subsiguiente iniciada por la reacción con el oxígeno singulete que se requiere para producir un compuesto fluorescente tendrá lugar de forma relativamente rápida. Adicionalmente, la estructura del precursor de compuesto fluorescente conducirá a la formación de un compuesto fluorescente que tiene las longitudes de onda de absorción y emisión deseadas y tiene rendimientos de cuanto fluorescente relativamente elevados, preferentemente mayor que 0,1, más preferentemente mayor que 0,4, y un elevado coeficiente de extinción en la longitud de onda de excitación deseada, preferentemente mayor que 1000 M^{-1} cm^{-1}, más preferentemente mayor que 10.000 M^{-1} cm^{-1}.

Dentro de estos compuestos son particularmente preferidos aquellos que contienen teluro.

También pueden usarse otras clases de precursores de compuesto fluorescente en la presente invención. Por ejemplo, compuestos que producen quimioluminiscencia al reaccionar con oxígeno singulete se convierten frecuentemente en productos fluorescentes que pueden servir como compuestos fluorescentes de la presente invención.

Ejemplos de precursores de compuesto fluorescente que pueden ser utilizados en la presente invención son conocidos por los expertos en esta técnica.

Otras clases de precursores de indicador fotoactivo pueden también usarse en la presente invención. Por ejemplo, los compuestos que producen quimioluminiscencia al reaccionar con oxígeno singulete son frecuentemente convertidos en productos fluorescentes que pueden servir como indicadores fotoactivos de la presente invención. Ejemplos de precursores de indicadores fotoactivos y los indicadores fotoactivos producidos al reaccionar con oxígeno singulete son también conocidos por los expertos en esta técnica.

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"Compuesto fluorescente": se refiere a una molécula que, después de la absorción de luz de longitud de onda de 250 a 1100 nm, preferentemente de 300 a 950 nm, emite luz por fluorescencia o fosforescencia, preferentemente por fluorescencia, o trasfiere su energía de excitación a una molécula aceptora que en seguida emite luz por fluorescencia o fosforescencia. Preferentemente el rendimiento cuántico de emisión será elevado, normalmente al menos 0,1, preferentemente al menos 0,4, más preferentemente mayor que 0,7, y el coeficiente de extinción del máximo de absorción será normalmente mayor que 5000 M^{-1} cm^{-1}.

Los compuestos fluorescentes típicos incluyen, por ejemplo, abrillantadores fluorescentes que típicamente absorben luz entre 300 y 400 nanómetros y emiten entre 400 y 500 nanómetros; xantenos tales como rodamina y fluoresceína; bimanos; cumarinas tales como la umbeliferona; aminas aromáticas tales como dansilo; colorantes de escuarato; benzofuranos; cianinas, merocianinas, quelatos de tierras raras, y similares. Los compuestos fosforescentes incluyen porfirinas, ftalocianinas, y compuestos poliaromáticos tales como pireno, antraceno y acenafteno.

"Compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno": cualquier sustancia distinta del oxígeno molecular que sea capaz de producir peróxido de hidrógeno bien sea directamente o a través de la formación de uno o más productos intermedios capaces de producir peróxido de hidrógeno. Los compuestos que pueden ser convertidos en peróxido de hidrógeno, o pueden catalizar la formación de peróxido de hidrógeno, o existen como catalizador para la formación de peróxido de hidrógeno, o pueden ser convertidos en tal catalizador, pueden ser detectados como analitos en el método de la presente invención y se incluyen en la anterior definición de "compuestos capaces de generar peróxido de hidrógeno".

Por ejemplo, la presente invención puede utilizarse para detectar enzimas tales como fosfatasa, amilasa, colinesterasa, creatinina cinasa, y similares, y sustratos para enzimas como glucosa, colesterol, creatinina, ácido úrico y similares. La discusión que sigue ilustra, a título de ejemplo y no de limitación, lo anterior, en donde se produce H_{2}O_{2} bien sea directa o indirectamente, a través de la formación de uno o más productos intermedios en un sistema que al final produce H_{2}O_{2}.

1) La amilasa cataliza la reacción de su sustrato almidón para formar el producto intermedio glucosa, un sustrato para la glucosa oxidasa (1.1.3.4) que, en presencia de oxígeno molecular, cataliza la conversión de glucosa en ácido glucónico, produciéndose también H_{2}O_{2}.

2) La colinesterasa cataliza la reacción de su sustrato acetilcolina para formar el producto intermedio colina, un sustrato para la colina oxidasa (1.1.3.17), que cataliza la conversión de colina en trimetil amonio acetaldehído, en la que también se produce H_{2}O_{2}.

3) La creatinina cinasa cataliza la reacción de su sustrato creatinina en presencia de difosfato de adenosina (ADP) para formar el producto intermedio trifosfato de adenosina (ATP), que en presencia de hexocinasa provoca la conversión de la glucosa en el producto intermedio glucosa-6-fosfato (G-6-P), que a su vez es un sustrato para la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH), en donde el NAD es convertido en el producto intermedio NADH durante la reacción catalítica de la G-6-P con G-6-PDH; se producen H_{2}O_{2} y NAD en la reacción de NADH-FMN oxidorreductasa (1.6.99.3) con NADH.

4) La fosfatasa cataliza la reacción de su sustrato CH_{3}CH_{2}OPO_{3}H_{2} para formar el producto intermedio etanol, que a su vez es un sustrato para la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH), en donde el NAD se convierte en el producto intermedio NADH durante la reacción catalítica del etanol con ADH para formar acetaldehído; el H_{2}O_{2} y NAD se producen en la reacción de NADH-FMN oxidorreductasa (1.6.99.3) con NADH.

5) En la reacción catalítica del lactato deshidrogenasa con su sustrato lactato en presencia de NAD se forma el producto intermedio NADH; el H_{2}O_{2} y el NAD se producen en la reacción de NADH-FMN oxidorreductasa (1.6.99.3) con NADH.

6) La glucosa es un sustrato enzimático para la glucosa oxidasa (1.1.3.4), siendo los productos el ácido glucónico y el H_{2}O_{2}.

7) El colesterol es un sustrato enzimático para la colesterol oxidasa, formándose H_{2}O_{2} durante la reacción.

8) La creatinina es un sustrato enzimático para la creatinina amidinahidrolasa, que produce el producto intermedio sarcosina, que a su vez es un sustrato enzimático para la enzima sarcosina oxidasa (1.5.3.1), siendo los productos formaldehído y H_{2}O_{2}.

9) El ácido úrico es un sustrato enzimático para la uricasa, formándose H_{2}O_{2} durante la reacción catalítica.

El peróxido de hidrógeno es también producido por ciertos tipos de células y, así, la presente invención permite la detección del peróxido de hidrógeno como indicador de la actividad celular.

El peróxido de hidrógeno es también producido por sustratos para enzimas oxidasa en la reacción catalizada del sustrato con oxígeno molecular. En tal reacción se oxida el sustrato y es el donador de hidrógeno, y el oxígeno molecular es el aceptor. Tales sustratos y sus correspondientes oxidasas incluyen, a título de ilustración y no de limitación, los siguientes:

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"Analito": el compuesto o la composición a detectar, que incluye peróxido de hidrógeno o un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno.

El término "analito" incluye también compuestos o composiciones distintos del peróxido de hidrógeno o de un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno, cuya detección implica el uso de un sistema productor de una señal, p. ej. una enzima, en el que se forma peróxido de hidrógeno. El analito puede estar formado por un miembro de un par de unión específica (sbp) y puede ser un ligando, que es monovalente (monoepitópico) o polivalente (poliepitópico), normalmente antigénico o hapténico, y es un compuesto único o una diversidad de compuestos que comparten al menos un sitio epitópico o determinante común. El analito puede ser parte de una célula tal como una bacteria o una célula que lleva un antígeno del grupo sanguíneo tal como A, B, D, etc., o un antígeno HLA o un microorganismo, p. ej. una bacteria, un hongo, un protozoo o un virus.

Los analitos de ligando polivalentes serán normalmente poliaminoácidos, es decir, polipéptidos y proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos y combinaciones de los mismos. Tales combinaciones incluyen componentes de bacterias, virus, cromosomas, genes, mitocondrios, núcleos, membranas celulares y similares.

Para la mayor parte, los analitos de ligando poliepitópico a los que puede aplicarse la presente invención tendrán un peso molecular de al menos aproximadamente 5.000, más habitualmente de al menos aproximadamente 10.000. En la categoría de los poliaminoácidos, los poliaminoácidos de interés serán generalmente de un peso molecular de aproximadamente entre 5.000 y 5.000.000, más normalmente de un peso molecular de aproximadamente 20.000 a 1.000.000; entre las hormonas de interés, los pesos moleculares estarán en el intervalo de aproximadamente 5.000 a 60.000 de peso molecular.

Puede considerarse una amplia variedad de proteínas en cuanto a la familia de proteínas que tienen características estructurales similares, proteínas que tienen funciones biológicas particulares, proteínas relacionadas con microorganismos específicos, en particular microorganismos causantes de enfermedades, etc. Tales proteínas incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas, citocinas, enzimas, hormonas, antígenos del cáncer, marcadores nutricionales, antígenos específicos de tejidos, etc. Tales proteínas incluyen, a título de ilustración y no de limitación, protaminas, histonas, albúminas, globulinas, escleroproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, glicoproteínas, receptores de células T, proteoglicanos, HLA, proteínas no clasificadas, p. ej. somatotropina, prolactina, insulina, pepsina, proteínas que se encuentran en el plasma humano, factores de coagulación sanguínea, hormonas proteicas tales como, p. ej., hormona estimuladora del folículo, hormona luteinizante, luteotropina, prolactina, gonadotropina coriónica, hormonas tisulares, citocinas, antígenos del cáncer tales como, p. ej., PSA, CEA, \alpha-fetoproteína, fosfatasa ácida, CA19.9 y CA125, antígenos específicos de tejidos tales como, p. ej., fosfatasa alcalina, mioglobina, CPK-MB y calcitonina, y hormonas peptídicas. Otros materiales poliméricos de interés son mucopolisacáridos y polisacáridos.

Los analitos de ligando monoepitópicos serán generalmente de aproximadamente 100 a 2.000 de peso molecular, más normalmente de un peso molecular de 125 a 1.000. Los analitos incluyen fármacos o drogas, metabolitos, plaguicidas, contaminantes y similares. Entre las drogas y fármacos de interés están los alcaloides. Entre los alcaloides se incluyen alcaloides de morfina, que incluyen morfina, codeína, heroína, dextrometorfán, sus derivados y sus metabolitos; alcaloides de cocaína que incluyen cocaína y bencil ecgonina, sus derivados y metabolitos; los alcaloides del ergot, que incluyen la dietilamina del ácido lisérgico; alcaloides esteroides; iminazoil alcaloides; alcaloides de quinazolina; alcaloides de isoquinoleína; alcaloides de quinoleína, que incluyen quinina y quinidina; alcaloides de diterpeno, sus derivados y sus metabolitos.

El siguiente grupo de drogas o fármacos incluye esteroides, que incluyen los estrógenos, andrógenos, esteroides androcorticoides, ácidos biliares, glicósidos cardiotónicos y agliconas, que incluyen digoxina y digoxigenina, saponinas y sapogeninas, sus derivados y metabolitos. También se incluyen las sustancias miméticas de los esteroides, tales como dietilestibestrol.

El grupo siguiente de drogas o fármacos son lactamas que tienen de 5 a 6 miembros anulares, que incluyen los barbituratos, p. ej. fenobarbital y secobarbital, difenilhidantoína, primidona, etosuximida y sus metabolitos.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son aminoalquilbencenos, con alquilos de 2 ó 3 átomos de carbono, que incluyen las anfetaminas; catecolaminas que incluyen efedrina, L-dopa, epinefrina; narceína; papaverina; y metabolitos de los anteriores.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son benzoheterocíclicos que incluyen oxazepam, clorpromazina, tegretol, sus derivados y metabolitos, siendo los anillos heterocíclicos azepinas, diazepinas y fenotiazinas.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son purinas, que incluyen teofilina, cafeína, sus metabolitos y derivados.

El siguiente grupo de drogas o fármacos incluye los derivados de la marihuana, que incluyen cannabinol y tetrahidrocannabinol.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son hormonas tales como tiroxina, cortisona, triyodotironina, testosterona, estradiol, estrona, progesterona, polipéptidos tales como angiotensina, LHRH e inmunosupresores tales como ciclosporina, FK506, ácido micofenólico, etc.

El siguiente grupo de drogas o fármacos incluye las vitaminas tales como A, B, p. ej. B12, C, D, E y K, ácido fólico, tiamina.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son prostaglandinas, que difieren en el grado y sitios de hidroxilación e insaturación.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son los antidepresivos tricíclicos, que incluyen imipramina, dimetilimipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, trimipramina, clomipramina, doxepina y desmetildoxepina.

El siguiente grupo de sustancias son anti-neoplásicos, que incluyen metotrexato.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son antibióticos, que incluyen penicilina, cloromicetina, actinomicetina, tetraciclina, terramicina, sus metabolitos y sus derivados.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son nucleósidos y nucleótidos, que incluyen ATP, NAD, FMN, adenosina, guanosina, timidina y citidina con sus sustituyentes de azúcar y fosfato apropiados.

El siguiente grupo de drogas o fármacos son una miscelánea de drogas o fármacos sustancias que incluyen metadona, meprobamato, serotonina, meperidina, lidocaína, procainamida, acetilprocainamida, propanolol, griseofulvina, ácido valproico, butirofenonas, antihistaminas, cloranfenicol, fármacos anticolinérgicos tales como atropina, y sus metabolitos y derivados.

Los metabolitos relacionados con estados patológicos incluyen espermina, galactosa, ácido fenilpirúvico, y porfirina tipo 1.

El siguiente grupo de sustancias son aminoglicósidos tales como gentamicina, kanamicina, tobramicina y amikacina.

Entre los plaguicidas de interés están los bifenilos polihalogenados, ésteres fosfato, tiofosfatos, carbamatos, sulfenamidas polihalogenadas, sus metabolitos y derivados.

Para analitos receptores, los pesos moleculares estarán generalmente en el intervalo de 10.000 a 2 x 10^{8}, más normalmente de 10.000 a 10^{6}. Para las inmunoglobulinas, IgA, IgG, IgE e IgM, los pesos moleculares variarán generalmente entre aproximadamente 160.000 y aproximadamente 10^{6}. Las enzimas estarán normalmente en el intervalo de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 de peso molecular. Los receptores naturales variarán ampliamente, siendo generalmente de al menos 25.000 de peso molecular, y pueden ser de un peso molecular de 10^{6} o mayor, incluyendo materiales como avidina, DNA, RNA, globulina de unión de tiroxina, prealbúmina de unión de tiroxina, transcortina, etc.

El término analito incluye además analitos de polinucleótidos tales como los polinucleótidos que se definen más adelante. Estos incluyen m-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, duples de DNA-RNA, etc. El término analito incluye también receptores que son agentes de unión de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, enzimas de restricción, activadores, represores, nucleasas, polimerasas, histonas, enzimas de reparación, agentes quimioterapéuticos, y similares.

El analito puede ser una molécula que se encuentra directamente en una muestra tal como un tejido biológico, incluyendo fluidos corporales, de un hospedador. La muestra puede ser examinada directamente o puede ser pretratada para hacer al analito más fácilmente detectable. Además, el analito de interés puede ser determinado detectando un agente de prueba del analito de interés, tal como un miembro de un par de unión específica complementario del analito de interés, cuya presencia se detectará solamente cuando al analito de interés esté presente en una muestra. El agente de prueba del analito se convierte en el analito que se detecta en un ensayo. El tejido biológico incluye tejido extirpado de un órgano u otra parte del cuerpo de un hospedador y fluidos corporales, por ejemplo orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputos, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, y similares.

"Catalizador capaz de catalizar la formación de oxígeno singulete": una sustancia que puede catalizar directa o indirectamente la conversión del peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete, normalmente una enzima. Ejemplos de tales catalizadores, a título de ilustración y no de limitación, son enzimas tales como peroxidasas o enzimas que tienen actividad de peroxidasa, tales como lactoperoxidasa, haloperoxidasa, metales tales como platino, y metales de transición tales como las sales wolframato, titanato, vanadato y molibdato, y óxidos de lantánidos, p. ej. óxido de europio, óxido de yterbio, etc.

Ciertas enzimas requieren un sustrato distinto del peróxido de hidrógeno para inducir la formación de oxígeno singulete. En consecuencia, tal sustrato debe ser incluido en un medio de ensayo. Por ejemplo, los iones cloruro o bromuro son sustratos conocidos para haloperoxidasas y lactoperoxidasas y se oxidan enzimáticamente por el peróxido de hidrógeno para dar cloro y bromo, respectivamente. Se sabe que los halógenos resultantes siguen reaccionando con peróxido de hidrógeno para dar oxígeno singulete. En principio pueden usarse otros sustratos de peroxidasa que puedan provocar la formación de oxígeno singulete.

"Matriz": un soporte formado por un material orgánico o inorgánico, sólido o líquido, insoluble en agua, que puede ser transparente o parcialmente transparente. El principal requisito de la matriz es que permita la difusión del oxígeno singulete en la misma, al menos hasta la posición aproximada del marcador incorporado. Es preferible que la matriz también excluya componentes de la muestra que puedan reaccionar con oxígeno singulete o afectar a la señal de la CC del compuesto fluorescente. La matriz puede tener cualquiera entre varias formas, tales como partículas, incluyendo esferas, películas, membranas, tubos, pocillos, tiras, varillas, y similares. La superficie de la matriz es preferentemente hidrófila o capaz de hacerse hidrófila. El cuerpo de la matriz es preferentemente hidrófobo. La matriz puede ser suspendible en el medio en el que se emplea. Ejemplos de matrices suspendibles de acuerdo con la presente invención, a título de ejemplo y no de limitación, son materiales poliméricos tales como látex, bicapas lipídicas, gotículas de aceite, células e hidrogeles. Otras composiciones de matrices incluyen polímeros tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), nilón, poli(butirato de vinilo), etc.; bien sean usados solos o en unión con otros materiales.

La unión del catalizador y, en su caso, los miembros del sbp a la matriz puede ser directa o indirecta, covalente o no covalente, y puede realizarse por técnicas bien conocidas, disponibles comúnmente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245: 3059 (1970).

La superficie de la matriz será normalmente polifuncional o capaz de ser polifuncionalizada, o capaz de unirse a un catalizador, un miembro de un sbp, o similares, mediante interacciones no específicas covalentes o no covalentes. Tal unión es indirecta cuando se usan interacciones no covalentes específicas y es directa cuando se usan interacciones covalentes. Son disponibles o pueden ser incorporados una amplia variedad de grupos funcionales. Los grupos funcionales incluyen ácidos carboxílicos, aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos hidroxilo, grupos mercapto y similares. La manera de unir una amplia variedad de compuestos a superficies es bien conocida y está ampliamente ilustrada en la bibliografía (véase anteriormente). La longitud de un grupo de unión al oligonucleótido o miembro del sbp puede variar ampliamente dependiendo de la naturaleza del compuesto que se está uniendo, el efecto de la distancia entre el compuesto que se está uniendo y la superficie en las propiedades de unión específica, y similares.

La cantidad de catalizador unido a la superficie de la matriz depende de varios factores, incluyendo la naturaleza del catalizador y el uso que se pretende de la composición. El catalizador está presente en la matriz en una cantidad elegida empíricamente para proporcionar la señal más alta respecto al fondo en un ensayo. Como el marcador puede tener una señal de fondo, puede ser deseable tener una elevada relación de catalizador a compuesto marcador, en particular cuando se usa un precursor de compuesto fluorescente. Las cantidades de catalizador relativamente elevadas incrementan también la velocidad/sensibilidad del ensayo, pero los costes y las propiedades de superficie indeseables pueden proporcionar límites con algunos catalizadores. La densidad de superficie del catalizador en la matriz está generalmente en el intervalo de aproximadamente 10^{8} a 10^{14} moléculas por centímetro cuadrado, normalmente 10^{9} a 10^{12} moléculas por centímetro cuadrado.

Como se mencionó anteriormente, en la matriz se incorpora un marcador. El marcador puede incorporarse a la matriz bien sea durante la preparación de la misma o bien después de ella. El marcador se elige normalmente para disolverse en la matriz pero puede unirse a la matriz covalentemente. Los compuestos marcadores son normalmente hidrófobos para reducir su capacidad de disociarse de la matriz. En general la composición de la matriz se elige para que favorezca la asociación del marcador con la matriz. La cantidad de marcador incorporado a la matriz en las composiciones de la presente invención depende de varios factores tales como la naturaleza del marcador y la matriz y el uso pretendido de la composición. El marcador está presente en la matriz en cantidad necesaria para maximizar la señal producida de acuerdo con la invención, es decir, para proporcionar la señal más alta respecto al fondo en un ensayo. Generalmente, la cantidad de marcador se determina empíricamente y normalmente es de aproximadamente 10^{-8} a 5M, preferentemente de 10^{-5} a 10^{-2}M, más preferentemente de 10^{-3} a 10^{-1}M.

La densidad de superficie del miembro del sbp en la matriz está generalmente en el intervalo de aproximadamente 10^{8} a 10^{14} moléculas por centímetro cuadrado, normalmente de 10^{9} a 10^{12} moléculas por centímetro cuadrado. La cantidad particular de miembro del sbp depende también de varios factores y normalmente lo mejor es determinarla empíricamente.

"Partículas": partículas de al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 micrómetros, normalmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de aproximadamente 10 micrómetros, preferentemente de aproximadamente 0,10 a 2,0 micrómetros de diámetro, que tienen normalmente un volumen inferior a un picolitro. La partícula puede tener cualquier densidad, pero preferentemente es de una densidad próxima a la del agua, generalmente de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 1,5 g/ml. Las partículas pueden tener o no carga, y, cuando están cargadas, son preferentemente negativas. Las partículas pueden ser sólidas (p. ej., estar formadas por polímeros orgánicos e inorgánicos, o látex), gotículas de aceite (p. ej. hidrocarburo, fluorocarburo, fluido de silicona), o vesículas (p. ej. sintéticas tales como fosfolípidos, o naturales tales como células y orgánulos).

Las partículas sólidas son normalmente polímeros, sean polímeros de adición o de condensación, que sean fácilmente dispersables en el medio de ensayo. Las partículas sólidas serán también adsorbentes o funcionalizables para unir o fijar a su superficie, bien sea directa o indirectamente, un miembro del sbp y para incorporar en su volumen un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, tal como una olefina quimioluminiscente.

Las partículas sólidas pueden estar formadas por poliestireno, poliacrilamida, homopolímeros y copolímeros de derivados de acrilato y metacrilato, en particular ésteres y amidas, siliconas y similares.

Las partículas se unen o se fijan normalmente a un catalizador y, en algunos casos, a un miembro del sbp como se describió antes.

"Gotículas de aceite": son partículas de líquido inmiscibles con agua formadas por un compuesto lipófilo recubierto y estabilizado con un emulsionante que es una molécula anfifílica tal como, por ejemplo, fosfolípidos, esfingomielina, albúmina y similares, que existen como suspensión en una solución acuosa, es decir, una emulsión.

Los fosfolípidos se basan en ésteres de ácidos carboxílicos alifáticos de polioles alifáticos, en los que al menos un grupo hidroxílico está sustituido con un éster de ácido carboxílico de aproximadamente 8 a 36, más habitualmente de aproximadamente 10 a 20 átomos de carbono, que pueden tener de 0 a 3, más habitualmente 0 ó 1 sitio de insaturación etilénica y al menos 1, normalmente solamente 1, grupo hidroxilo sustituido con fosfato para formar un éster fosfato. El grupo fosfato puede sustituirse más con pequeños compuestos alifáticos que son difuncionales o de funcionalidad superior, generalmente que tienen grupos hidroxilo o amino.

Las emulsiones que comprenden gotículas de aceite pueden prepararse de acuerdo con procedimientos convencionales combinando los compuestos lipófilos apropiados con un agente tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico, en donde el agente tensioactivo está presente en aproximadamente de 0,1 a 5, más habitualmente de aproximadamente 0,1 a 2 por ciento en peso de la mezcla, y sometiendo la mezcla, en un medio acuoso, a agitación tal como tratamiento con ultrasonidos o agitación en vórtice. Los compuestos lipófilos ilustrativos incluyen aceites de hidrocarburo, halocarburos incluyendo fluorocarburos, ftalatos de alquilo, fosfatos de trialquilo, triglicéridos, etc.

Normalmente se adsorberá un catalizador en la superficie de la gotícula de aceite o se unirá directa o indirectamente a un componente de la superficie de la gotícula de aceite.

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Lo que sigue es una lista, a título de ilustración y no de limitación, de compuestos anfifílicos que pueden ser utilizados para estabilizar las gotículas de aceite: fosfatidil etanolamina, fosfatidil colina, fosfatidil serina, dimiristoilfosfatidil colina, fosfatidil colina de huevo, dipalmitoilfosfatidil colina, ácido fosfatídico, cardiolipina, lecitina, galactocerebrósido, esfingomielina, dicetilfosfato, fosfatidil inositol, 2-triehexadecilamonioetilamina, 1,3-bis(fosfato de octadecilo)-propanol, fosfato de estearoiloxietileno, fosfolípidos, dialquilfosfatos, dodecilsulfato sódico, detergentes catiónicos, detergentes aniónicos, proteínas tales como albúmina, detergentes no iónicos, etc.

También pueden usarse otros compuestos que tienen grupos lipófilos y que han sido descritos anteriormente. Para la mayor parte, estos compuestos tienen un componente lipófilo tal como un alquilbenceno, que tiene grupos alquilo de 6 a 20 átomos de carbono, normalmente mezclas de grupos alquilo, que pueden ser de cadena lineal o ramificada, y un componente hidrófilo tal como un grupo carboxilo, un grupo hidroxílico, un grupo polioxi alquileno (alquileno de 2 ó 3 átomos de carbono), un grupo ácido sulfónico, o un grupo amino. Pueden usarse ácidos grasos alifáticos que normalmente serán de aproximadamente 10 a 36, más normalmente de aproximadamente 12 a 20 átomo de carbono. También pueden encontrar uso alcoholes grasos que tienen los límites de carbono indicados para los ácidos grasos, aminas grasas o limitaciones de carbonos similares, y varios esteroides.

Las gotículas de aceite pueden comprender un aceite de fluorocarburo o un aceite de silicona (partícula de silicona). Tales gotículas son descritas por Glaever en las patentes de EE.UU. números 4.634.681 y 4.619.904. Estas gotículas se forman dispersando un aceite de fluorocarburo o aceite de silicona en una fase acuosa. Las gotículas se preparan poniendo en un recipiente una pequeña cantidad del aceite elegido (generalmente tales aceites están disponibles en el mercado) con una cantidad mayor de la fase acuosa. El sistema líquido se somete a agitación para llevar a cabo el emulsionamiento, y después se centrifuga. La fase homogénea se elimina y las gotas residuales se resuspenden en un medio acuoso tamponado. Las anteriores etapas de centrifugación y decantación, pueden repetirse una o más veces antes de utilizar las gotículas.

El catalizador y los miembros del sbp pueden ser unidos a las gotículas de diversas formas. Como se describe en Glaever, supra, el miembro del sbp particular, p. ej. un miembro del spb proteináceo, puede ser aplicado como recubrimiento en las gotículas introduciendo un exceso del miembro del sbp en el medio acuoso antes o después de la etapa de emulsionamiento. Son deseables etapas de lavado para eliminar el exceso de miembro del sbp. La funcionalización del aceite introduce funcionalidades descritas anteriormente para la unión a miembros del
sbp.

La olefina quimioluminiscente como marcador se elige frecuentemente de forma que sea soluble en la fase oleosa de la gotícula de aceite. Cuando el aceite es un fluorocarburo, una olefina quimioluminiscente fluorada es frecuentemente más soluble que la correspondiente derivación no fluorada.

Otras gotículas de aceite descritas por Glaever encuentran también uso en la presente invención.

"Liposomas": microvesículas formadas por una o más bicapas lipídicas que tienen forma aproximadamente esférica, y uno de los materiales preferidos para ser usados en la presente invención. Los liposomas tienen un diámetro que es al menos aproximadamente 20 nm y no más de aproximadamente 20 micrómetros, normalmente al menos aproximadamente 40 nm y menos de aproximadamente 10 micrómetros. Preferentemente, el diámetro de los liposomas será menor que aproximadamente dos micrómetros para limitar la sedimentación o la flotación.

La capa externa de un liposoma consiste en una bicapa anfifílica que encierra un volumen de agua o una solución acuosa. Los liposomas con más de una bicapa se denominan vesículas multilamelares. Los liposomas con solamente una bicapa se denominan vesículas unilamelares. Las vesículas multilamelares se prefieren en la presente invención cuando se usa una olefina quimioluminiscente lipófila, a causa de su capacidad para incorporar mayores cantidades de este material que con vesículas unilamelares. La bicapa anfifílica está formada frecuentemente por fosfolípidos. Los fosfolípidos empleados para preparar partículas utilizables en la presente invención pueden ser cualquier fosfolípido o mezcla de fosfolípidos encontrada en membranas naturales incluyendo lecitina, o diésteres gliceril fosfato sintéticos de ácidos grasos lineales de 12 carbonos o de 24 carbonos, saturados o insaturados, en los que el fosfato puede estar presente como monoéster, o como un éster de un alcohol polar tal como etanolamina, colina, inositol, serina, glicerol y similares. Los fosfolípidos particularmente preferidos incluyen L-a-palmitoil oleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoil oleoil-fosfatidil-glicerol (POPG), L-a-dioleoil-fosfatidilglicerol, L-a-(dioleoil)-fosfatidil-etanolamina (DOPE), y L-a-dioleoil-fosfatidil-(4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxiamido)etano (DOPE-MCC).

Los fosfolípidos de la bicapa pueden ser suplementados con colesterol y pueden ser reemplazados con otros compuestos anfifílicos que tienen un grupo de cabeza polar, normalmente cargado, y una porción hidrófoba formada normalmente por dos cadenas de hidrocarburo lineales. Los ejemplos de tales sustituyentes incluyen dialquilfosfato, dialcoxipropilfosfatos en los que los grupos alquilo tienen cadenas lineales de 12 a 20 átomos de carbono, cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)-octadeceniloxi)-prop-1-il-N,N,N-trimetil-amonio (DOTMA), esfingomielina, cardiolipina, y

\hbox{similares.}

Los liposomas utilizados en la presente invención tienen preferentemente una elevada densidad de carga negativa para estabilizar la suspensión y para prevenir la agregación espontánea.

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Para su uso en la presente invención, los liposomas deben ser capaces de unirse a un catalizador y ser capaces de tener un marcador tal como una olefina quimioluminiscente asociado bien sea con la fase acuosa o bien con la fase no acuosa.

Los liposomas pueden ser producidos por una diversidad de métodos, incluyendo hidratación y dispersión mecánica del fosfolípido seco, o sustituto del fosfolípido, en una solución acuosa. Los liposomas preparados de esta manera tienen una diversidad de dimensiones, composiciones y comportamientos. Un método para reducir la heterogeneidad y la inconsistencia del comportamiento de los liposomas dispersados mecánicamente es mediante tratamiento con ultrasonidos. Tal método hace disminuir el tamaño medio de los liposomas. Alternativamente, la extrusión es utilizable como etapa final durante la producción de los liposomas. La patente de EE.UU. nº 4.529.561 describe un método de extruir liposomas bajo presión a través de una membrana de tamaño de poros uniforme, para mejorar la uniformidad del tamaño.

La preparación de liposomas que contienen una olefina quimioluminiscente disuelta en la bicapa lipídica puede llevarse a cabo por diversos métodos, incluyendo un método descrito por Olsen et al., Biochemica et Biophysica Acta, 557 (9), 1979. De forma abreviada, una mezcla de lípidos que contiene la olefina quimioluminiscente apropiada y un disolvente orgánico tal como cloroformo se seca formando una película delgada en las paredes de un recipiente de vidrio. La película líquida se hidrata en un tampón apropiado agitando en sacudidora o en vórtice. A continuación, la suspensión lipídica se extruye a través de una serie de membranas filtrantes de policarbonato que tienen tamaños de poros sucesivamente más pequeños. Por ejemplo, 2,0, 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 y 0,2 micrómetros. La repetida filtración a través de cualquiera de los filtros, y en particular a través del filtro más pequeño, es deseable. Los liposomas pueden ser purificados, por ejemplo, mediante filtración en gel, como es a través de una columna de Sephacryl S-100. La columna puede ser eluida con tampón y recogerse los liposomas. El almacenamiento en frío prolonga la vida útil de los liposomas producidos por este método. Alternativamente, la olefina quimioluminiscente puede ser añadida a la suspensión líquida después de la preparación de los liposomas.

Los liposomas y las gotículas de aceite tendrán frecuentemente, por ejemplo, grupos tiol o maleimida o biotina en las moléculas que comprenden la bicapa lipídica. Las moléculas de catalizador y miembros del sbp pueden después unirse a la superficie por reacción de las partículas con uno de estos materiales que está unido a una sustancia reaccionante reactiva de sulfhidrilo, un grupo sulfhidrilo, o avidina, respectivamente. Los grupos reactivos de sulfhidrilo incluyen, entre otros, disulfuros activados tales como disulfuros de 2-piridilo y reactivos de alquilación tales como bromoacetamida y maleimida.

Las moléculas de catalizador y los miembros del sbp pueden ser atraídos a la superficie de las partículas del liposoma por interacciones hidrófobas débiles, si bien tales interacciones no son generalmente suficientes para resistir la fuerza de cizalladura que se encuentra durante la incubación y el lavado. Es preferible unir covalentemente las moléculas de catalizador y los miembros del sbp a una partícula de liposoma que ha sido funcionalizada, por ejemplo mediante el uso de DOPE-MCC, como se mostró anteriormente, combinando el liposoma con el catalizador o miembro del sbp elegido funcionalizado con un grupo mercaptano. Por ejemplo, si el miembro del sbp es un anticuerpo, puede hacérsele reaccionar con anhídrido S-acetil-mercaptosuccínico (SAMSA) e hidrolizarlo para proporcionar un anticuerpo modificado con sulfhidrilo. Otros ejemplos incluyen el N-hidroxisuccinimida éster de grupos carboxilo de la superficie, que se ponen después en contacto con un enlazador que tiene grupos amino que reaccionarán con los grupos éster o directamente con un catalizador o un miembro del sbp que tiene un grupo amino. El enlazador se elegirá normalmente para reducir la unión no específica de los componentes del ensayo a la superficie de la partícula y preferentemente proporcionará una funcionalidad adecuada tanto para la unión a la partícula como a la unión del catalizador o miembro del sbp. Los materiales adecuados incluyen aminodextrano maleimidado (MAD), polilisina, aminosacáridos y similares. El MAD puede prepararse como se describe en Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (7), 3143, 1978.

"Partículas de látex": "látex" significa un material polimérico en partículas insoluble en agua y suspendible en agua, que normalmente tiene dimensiones de partícula de 20 nm a 20 \mum, más preferentemente de 100 a 1000 nm de diámetro. El látex es frecuentemente un polietileno sustituido tal como copolímeros de poliestireno y butadieno, poliacrilamida y poliestireno, poliestireno con grupos amino, poli-ácido acrílico, poli-ácido metacrílico, acrilonitrilo y butadieno, copolímeros de estireno, poli(acetato de vinilo)-acrilato, polivinil piridina, cloruro de vinilo acrilato y similares. Se prefieren los polímeros no entrecruzados de estireno y estireno carboxilado o estireno funcionalizado con otros grupos activos tales como amino, hidroxilo, halo y similares. Frecuentemente se usarán copolímeros de estirenos sustituidos, con dienos tales como butadieno.

La asociación del marcador con partículas de látex utilizadas en la presente invención puede implicar la incorporación durante la formación de las partículas mediante polimerización, pero normalmente implicará la incorporación en partículas preformadas, normalmente mediante disolución no covalente en las partículas. Normalmente se empleará una solución del marcador, en particular cuando el marcador es una olefina quimioluminiscente. Los disolventes que pueden utilizarse incluyen alcoholes, incluyendo etanol, etilenglicol y alcohol bencílico; amidas tales como dimetilformamida, formamida, acetamida y tetrametilurea, y similares; sulfóxidos tales como dimetil sulfóxido y sulfolano; y éteres tales como carbitol, etil carbitol, dimetoxietano y similares, y agua. El uso de disolventes que tienen puntos de ebullición elevados en los que las partículas son insolubles permite el uso de temperaturas elevadas para facilitar la disolución de los compuestos marcadores en las partículas, y son particularmente adecuados. Los disolventes pueden ser usados solos o en combinación.

Para incorporar olefinas quimioluminiscentes en partículas, pueden usarse cosolventes que quedan permanentemente en las partículas. Estos disolventes sirven de plastificantes y se usan para mejorar la luminiscencia. Frecuentemente se usan cosolventes aromáticos que incluyen dibutilftalato, naftonitrilo, dioctiltereftalato, decildiclorobenceno, difeniléter, dibutoxibenceno, etc.; estos cosolventes se usan a concentraciones suficientemente bajas para evitar la disolución de las partículas, pero a concentraciones suficientes para hinchar las partículas.

Generalmente la temperatura empleada durante el procedimiento se elegirá para maximizar la formación de oxígeno singulete y el rendimiento cuántico de la olefina quimioluminiscente asociada con las partículas, con la condición de que las partículas no deben fundirse ni agregarse a la temperatura elegida. Normalmente se emplean temperaturas elevadas. Las temperaturas para el procedimiento estarán generalmente en el intervalo entre 20ºC y 200ºC, más habitualmente entre 70ºC y 130ºC. Se ha observado que algunos compuestos que son casi insolubles a temperatura ambiente son solubles, por ejemplo, en alcoholes de bajo peso molecular, tales como etanol y etoxietanol, y similares, a temperaturas elevadas. Se ha demostrado que las partículas de látex modificado carboxilado toleran alcoholes de bajo peso molecular a tales temperaturas.

Un catalizador o un miembro de un sbp pueden ser adsorbidos físicamente en la superficie de la partícula de látex, o pueden ser unidos covalentemente o fijados a la partícula de manera similar a la discutida anteriormente con respecto a otras matrices.

``Miembro de un par de unión específica ("miembro de un sbp"; spb: Specific Binding Pair)'': una de dos moléculas diferentes que tienen un área en la superficie o en una cavidad que se une específicamente, y por ello se define como complementaria con ella, a una organización especial y polar particular de la otra molécula. Los miembros del par de unión específica se denominan ligando y receptor (antiligando). Normalmente serán miembros de un par inmunológico tal como antígeno-anticuerpo, aunque otros pares de unión específica tales como biotina-avidina, hormonas-receptores de hormonas, duples de ácidos nucleicos, IgG-proteína A, pares de nucleótidos tales como DNA-DNA, DNA-RNA y similares, no son pares inmunológicos pero están incluidos en la invención y en la definición de miembro de un sbp.

"Polinucleótido": un compuesto o composición que es un nucleótido polimérico que tiene en estado natural aproximadamente de 50 a 500.000 o más nucleótidos y que tiene en estado aislado aproximadamente de 15 a 50.000 o más nucleótidos, normalmente aproximadamente de 15 a 20.000 nucleótidos, más frecuentemente de 15 a 10.000 nucleótidos. El polinucleótido incluye ácidos nucleicos de cualquier origen en forma purificada o no purificada, de origen natural o producidos sintéticamente, incluyendo DNA (dsDNA y ssDNA) y RNA, normalmente DNA, y puede ser t-RNA, m-RNA, r-RNA, DNA y RNA mitocondrial, DNA y RNA del cloroplasto, híbridos de DNA-RNA o mezclas de los mismos, genes, cromosomas, plásmidos, los genomas de material biológico tal como microorganismos, p. ej. bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, y fragmentos de todos ellos, y similares.

"Ligando": cualquier compuesto orgánico para el que existe un receptor natural, o puede ser preparado.

"Análogo de ligando": un ligando modificado, un radical orgánico o análogo de analito, habitualmente de un peso molecular mayor que 100, que puede competir con el ligando análogo por un receptor, proporcionando la modificación medios para unir un análogo de ligando a otra molécula. El análogo de ligando diferirá normalmente del ligando en más que el reemplazo de un hidrógeno con un enlace que une el análogo de ligando a un eje o marcador, pero no necesariamente. El análogo de ligando puede unirse al receptor de manera similar al ligando. El análogo podría ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra el idiotipo de un anticuerpo contra el ligando.

"Receptor" ("antiligando"): cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, p. ej. un sitio epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen receptores de origen natural, p. ej. globulina de unión de tiroxina, anticuerpos, enzimas, fragmentos Fab, lectinas, ácidos nucleicos, proteína A, componente del complemento C1q, y similares.

"Unión específica": el reconocimiento específico de una de dos moléculas diferentes para la otra en comparación con el reconocimiento sustancialmente menor de otras moléculas. Generalmente, las moléculas tienen áreas en su superficie o en cavidades que dan lugar al reconocimiento específico entre las dos moléculas. Son ejemplos de unión específica las interacciones anticuerpo-antígeno, las interacciones enzima-sustrato, las interacciones entre polinucleótidos, etc.

"Unión no específica": unión no covalente entre moléculas que es relativamente independiente de las estructuras de la superficie específicas. La unión no específica puede resultar de varios factores, incluyendo interacciones hidrófobas entre moléculas.

"Anticuerpo": una inmunoglobulina que se une específicamente, y por ello se define como complementaria de ella, a una organización espacial y polar particular de otra molécula. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal y puede prepararse por técnicas que son bien conocidas en este campo, tales como la inmunización de un hospedador y la recogida de sueros (policlonal) o preparando líneas celulares híbridas continuas y recogiendo la proteína segregada (monoclonal), o clonando y expresando secuencias de nucleótidos o versiones mutagenizadas de las mismas que codifican al menos las secuencias de aminoácidos requeridas para la unión específica de anticuerpos naturales. Los anticuerpos pueden incluir una inmunoglobulina completa o un fragmento de la misma, las cuales inmunoglobulinas incluyen las diversas clases e isotipos, tales como IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3, IgM, etc. Los fragmentos de la misma pueden incluir Fab, Fv y F(ab')_{2}, Fab' y similares. Además, pueden usarse agregados, polímeros y conjugados de inmunoglobulinas o sus fragmentos en caso apropiado, siempre y cuando se mantenga la afinidad de unión por una molécula particular.

El antisuero que contiene anticuerpos (policlonales) se obtiene por técnicas bien establecidas que implican la inmunización de un animal, tal como un conejo, cobaya o cabra, con un inmunógeno apropiado, y obtener antisueros de la sangre del animal inmunizado después de un periodo de espera apropiado. Se proporcionan revisiones del estado de la técnica en Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, N. J. U.S., 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7: 1-24 (1975); Broughton and Strong, Clin. Chem. 22: 726-732 (1976); y Playfair, et al., Br. Med. Bull. 30: 24-31 (1974).

También pueden obtenerse anticuerpos por técnicas de hibridación de células somáticas, siendo tales anticuerpos denominados comúnmente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse de acuerdo con las técnicas estándar de Köhler y Milstein, Nature 265: 495-497, 1975. Se encuentran revisiones de técnicas de anticuerpos monoclonales en Lymphocyte Hybridomas, ed. Melchers et al., Springer Verlag (Nueva York, 1978), Nature 266: 495 (1977), Science 208: 692 (1980), y Methods of Enzymology 73 (Parte B): 3-46 (1981). Muestras de un preparado inmunógeno apropiado se inyectan en un animal tal como un ratón y, después de un tiempo suficiente, el animal es sacrificado y se obtienen células esplénicas. Alternativamente, las células esplénicas de un animal no inmunizado pueden ser sensibilizadas contra el inmunógeno in vitro. Los cromosomas de las células esplénicas que codifican las secuencias de base para las inmunoglobulinas deseadas pueden comprimirse fusionando las células esplénicas, generalmente en presencia de un detergente no iónico, por ejemplo polietilenglicol, con una línea de células de mieloma. Las células resultantes, que incluyen hibridomas fusionados, se dejan crecer en un medio selectivo, tal como medio HAT, y las células inmortalizadas supervivientes se desarrollan en tal medio usando condiciones de dilución limitantes. Las células se desarrollan en un recipiente apropiado, p. ej. pocillos de microtítulo, y el sobrenadante se selecciona por cribado en relación con los anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad deseada.

Existen varias técnicas para mejorar los rendimientos de anticuerpos monoclonales, tales como la inyección de las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador mamífero, que acepte las células, y recoger el líquido ascítico. Cuando se recoge una cantidad insuficiente de anticuerpo monoclonal en el líquido ascítico, el anticuerpo se recoge de la sangre del hospedador. Alternativamente, la célula que produce el anticuerpo deseado puede desarrollarse en un dispositivo de fibras huecas para cultivo de células o un dispositivo de frasco rotatorio, ambos bien conocidos en la técnica. Existen varias formas convencionales para el aislamiento y la purificación de los anticuerpos monoclonales de otras proteínas y otros contaminantes (véase Köhler y Milstein, supra).

En otro planteamiento para la preparación de anticuerpos, la secuencia que codifica los sitios de unión de anticuerpo puede ser replicada del cDNA e insertada en un vector de clonación que puede ser expresado en bacterias para producir proteínas recombinantes que tienen los correspondientes sitios de unión de anticuerpos.

En general, los anticuerpos pueden ser purificados por técnicas conocidas tales como cromatografía, p. ej. cromatografía DEAE, cromatografía Abx, y similares, filtración, etc.

"Alquilo": un radical monovalente ramificado o no ramificado derivado de un hidrocarburo alifático por eliminación de un átomo de H; incluye tanto alquilo inferior como alquilo superior.

"Alquilo inferior": alquilo que contiene de 1 a 5 átomos de carbono, tal como p. ej. metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, isobutilo, pentilo, isopentilo, etc.

"Alquilo superior": alquilo que contiene más de 6 átomos de carbono, normalmente de 6 a 20 átomos de carbono, tal como, p. ej., hexilo, heptilo, octilo, etc.

"Alquilideno": un radical orgánico divalente derivado de un hidrocarburo alifático, tal como, por ejemplo, etilideno, en el que se toman 2 átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono.

"Arilo": un radical orgánico derivado de un hidrocarburo aromático mediante la eliminación de un átomo y que contiene uno o más anillos aromáticos, normalmente de uno a cuatro anillos aromáticos, tal como, p. ej., fenilo (del benceno), naftilo (del naftaleno), etc.

"Aralquilo": un radical orgánico que tiene un grupo alquilo al que está unido un grupo arilo, p. ej. bencilo, fenetilo, 3-fenilpropilo, 1-naftiletilo, etc.

"Alcoxi": un radical alquilo unido al resto de una molécula por un átomo de oxígeno, p. ej. metoxi, etoxi, etc.

"Ariloxi": un radical arilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, p. ej. fenoxi, naftoxi, etc.

"Aralcoxi": un radical aralquilo unido al resto de una molécula mediante un átomo de oxígeno, p. ej. benzoxi,
1-naftiletoxi, etc.

"Sustituido": significa que un átomo de hidrógeno de una molécula ha sido reemplazado por otro átomo, que puede ser un solo átomo tal como un halógeno, etc., o parte de un grupo de átomos que forman una funcionalidad tal como un sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos(distinto de los átomos de hidrógeno requeridos que se necesitan para satisfacer las valencias de tales átomos), los cuales átomos se eligen independientemente entre el grupo consistente en carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre, halógeno (cloro, bromo, yodo, flúor) y fósforo, y que pueden estar unidos o no a uno o más átomos de metal.

"Alquiltio": un radical alquilo unido al resto de una molécula por un átomo de azufre, p. ej. metiltio, etiltio, etc.

"Ariltio": un radical arilo unido al resto de una molécula por un átomo de azufre, p. ej. feniltio, naftiltio, etc.

"Grupo donador de electrones": un sustituyente que, cuando se une a una molécula, es capaz de polarizar la molécula de forma que el grupo donador de electrones se convierte en pobre en electrones y cargado positivamente en relación con otra posición de la molécula, es decir, tiene una densidad electrónica reducida. Tales grupos incluyen, a título de ilustración y no de limitación, aminas, éteres, tioéteres, fosfinas, hidroxi, oxianiones, mercaptanos y sus aniones, sulfuros, etc.

"Un sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos (distinto de los átomos de hidrógeno requeridos que se necesitan para satisfacer las valencias de tales átomos), los cuales átomos se eligen independientemente entre el grupo consistente en carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre, halógeno y fósforo": un radical orgánico; el radical orgánico tiene de 1 a 50 átomos distinto del número requerido de átomos de hidrógeno que se necesitan para satisfacer las valencias de los átomos en el radical. Generalmente, el átomo predominante es carbono (C) pero puede ser también oxígeno (O), nitrógeno (N), azufre (S), fósforo (P), en donde el O, N, S o P, si están presentes, están unidos al carbono o uno o más de los otros o a hidrógeno o un átomo de metal, para formar varios grupos funcionales tales como, por ejemplo, grupos carboxilo (ácidos carboxílicos), grupos hidroxilo (alcoholes), grupos mercapto (tioles), carboxamidas, carbamatos, ésteres de ácido carboxílico, ácidos sulfónicos, ésteres de ácido sulfónico, ácidos fosfóricos, ésteres de ácido fosfórico, ureas, carbamatos, fosforamidas, sulfonamidas, éteres, sulfuros, tioéteres, olefinas, acetilenos, aminas, cetonas, aldehídos y nitrilos, y alquilo, alquilideno, arilo, aralquilo, y alquilo, arilo, y aralquilo sustituido con uno o más de los grupos funcionales antes mencionados, p. ej. fenilo, naftilo, fenantrilo, m-metoxifenilo, dimetilamino, tritilo, metoxi, N-morfoleno y pueden tomarse juntos para formar un anillo tal como, por ejemplo, adamantilo, N-metilacridanilida, xantanilidina, 1-(3,4-benzo-5-hidrofurilideno), y similares.

"Grupo de unión": un grupo implicado en la unión covalente entre moléculas. El grupo de unión variará dependiendo de la naturaleza de las moléculas, es decir, marcador, matriz, catalizador, miembro de un sbp o molécula asociada con la partícula que se une, o parte de la misma. Los grupos funcionales que están normalmente presentes o están introducidos en una matriz, catalizador, o miembro de un sbp, se emplearán para unir estos materiales.

Para la mayor parte, las funcionalidades carbonilo encontrarán uso, tanto las oxocarbonilo, p. ej. carboxi y aldehído, como las no oxocarbonilo (incluyendo análogos de nitrógeno y azufre), p. ej. amidina, amidato, tiocarboxi y tionocarboxi.

Las funcionalidades alternativas incluyen halógeno activo, diazo, mercapto, olefina, en particular olefina activada, amino, ésteres fosfato y similares. Una descripción de los grupos de unión puede encontrarse en la patente de EE.UU. nº 3.817.837.

Los grupos de unión pueden variar desde un enlace con una cadena de 1 a 100 átomos, normalmente de aproximadamente 1 a 70 átomos, preferentemente de 1 a 50 átomos, más preferentemente de 1 a 20 átomos, elegidos cada uno de ellos independientemente entre el grupo que consiste normalmente en carbono, azufre, nitrógeno, halógeno y fósforo. El número de heteroátomos en los grupos de unión variará normalmente entre aproximadamente 0 y 20, normalmente entre aproximadamente 1 a 15, más preferentemente de 2 a 6. Los átomos de la cadena pueden estar sustituidos con átomos distintos del hidrógeno de manera similar a la descrita antes para el sustituyente que tiene de 1 a 50 átomos. Por regla general, la longitud de un grupo de unión particular puede elegirse arbitrariamente para facilitar la síntesis y la incorporación de cualquier grupo que se desee tal como un aceptor de energía, un fluoróforo, un grupo para catálisis de cruce intersistema tal como un metal pesado, y similares. Los grupos de unión pueden ser alifáticos o aromáticos, aunque con los grupos diazo habitualmente estarán implicados los grupos aromáticos.

Cuando están presentes heteroátomos, el oxígeno estará normalmente como oxo u oxi, unido a carbono, azufre, nitrógeno o fósforo, el nitrógeno estará normalmente presente como nitro, nitroso o amino, normalmente unido a carbono, oxígeno, azufre o fósforo; el azufre sería análogo al oxígeno; mientras que el fósforo estará unido a carbono, azufre, oxígeno o nitrógeno, normalmente como fosfonato y mono- o di-éster fosfato.

Las funcionalidades comunes en la formación de un enlace covalente entre el grupo de unión y la molécula a conjugar son alquilamina, amidina, tioamida, éter, urea, tiourea, guanidina, azo, tioéter y carboxilato, sulfonato y ésteres fosfato, amidas y tioésteres.

Para la mayor parte, cuando un grupo de unión tenga un grupo no carboxilo que incluye análogos de nitrógeno y azufre, un grupo fosfato, un grupo amino, un agente de alquilación tal como halo o tosilalquilo, oxi(hidroxilo o el análogo de azufre, mercapto), oxocarbonilo (p. ej. aldehído o cetona), u olefina activa tal como una vinil sulfona o éster a,b-insaturado. Estas funcionalidades estarán unidas a grupos amina, grupos carboxilo, olefinas activas, agentes de alquilación, p. e. bromoacetilo. Cuando una amina y ácido carboxílico o su derivado de nitrógeno o ácido fosfórico se unen, se formarán amidas, amidinas y fosforamidas. Cuando se unen mercaptano y olefina activada, se formarán tioéteres. Cuando se unen un mercaptano y un agente de alquilación, se formarán tioéteres. Cuando se unen aldehído y una amina bajo condiciones reductoras, se formará una alquilamina. Cuando se unen un ácido carboxílico o un fosfato ácido y un alcohol, se formarán ésteres.

"Grupo o funcionalidad que confiere hidrofilicidad o solubilidad en agua": es una funcionalidad hidrófila que incrementa la humectabilidad de los sólidos con agua y la solubilidad en agua de los compuestos a los que está unida. Tal grupo funcional o funcionalidad puede tener un sustituyente que tiene de 1 a 50 o más átomos y puede incluir un grupo que tiene un sulfonato, sulfato, fosfato, amidina, fosfonato, carboxilato, hidroxilo en particular polioles, amina, éter, amida y similares. Grupos funcionales ilustrativos son carboxialquilo, sulfonoxialquilo, CONHOCH_{2}COOH, CO-(glucosamina), azúcares, dextrano, ciclodextrina, SO_{2}NHCH_{2}COOH, SO_{3}H, CONHCH_{2}CH_{2}SO_{3}H, PO_{3}H_{2}, OPO_{3}H_{2}, hidroxilo, carboxilo, cetona, y combinaciones de los mismos. La mayor parte de las funcionalidades anteriores pueden también ser utilizadas como grupos de unión que permiten la unión de un catalizador, un miembro de un sbp o similares a una composición en partículas formada por el marcador.

"Grupo o funcionalidad que confiere lipofilicidad o solubilidad en lípidos": es una funcionalidad lipófila que reduce la humectabilidad por el agua de las superficies y la solubilidad en agua de los compuestos a los que está unido. Tal grupo funcional o funcionalidad puede contener de 1 a 50 o más átomos, normalmente átomos de carbono, sustituidos con hidrógeno o halógeno y puede incluir alquilo, alquilideno, arilo y aralquilo. El grupo o funcionalidad lipófila tendrá normalmente de uno a seis grupos alifáticos de cadena lineal o ramificada de al menos 6 átomos de carbono, más normalmente al menos 10 átomos de carbono, y preferentemente al menos 12 átomos de carbono, habitualmente no más de 30 átomos de carbono. El grupo alifático puede estar unido a anillos de 5 ó 6 miembros, que puede ser alicíclico, heterocíclico o aromático. Los grupos lipóficlos pueden estar unidos a un marcador u otra sustancia para aumentar su estabilidad en una matriz no acuosa.

"Aceptor de energía": llamado también en el presente texto aceptor de energía fluorescente. Un cromóforo que tiene una absorción sustancial mayor que 310 nm, normalmente mayor que 350 nm, y preferentemente mayor que aproximadamente 400 nm. La elección del aceptor de energía estará también gobernada por la CC particular. El aceptor de energía debe ser capaz de absorber luz emitida por la CC. Preferentemente, el máximo de absorción del aceptor de energía debe ser a una longitud de onda similar a la del máximo de emisión de la olefina quimioluminiscente. Es deseable un coeficiente de extinción elevado, normalmente por encima de 10, preferentemente por encima de 10^{3}, y preferido de forma particular por encima de 10^{4}. El aceptor de energía ha de ser fluorescente y preferentemente tendrá un elevado rendimiento cuántico de fluorescencia, normalmente al menos 0,1, preferentemente mayor que 0,4. El aceptor de energía sirve simplemente para desplazar la longitud de onda de emisión y se incorpora en partículas que contienen la CC. Los aceptores de energía útiles son cualquier molécula fluorescente que emita a longitudes de onda largas, preferentemente compuestos hidrófobos, p. ej. ftalocianinas, escuarenos, porfirinas, poliacetilenos, naftacenos, bisfeniletinilantraceno, cumarinas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, etc.

Varias moléculas diferentes útiles como aceptor de energía son descritas por Ullman et al. en las patentes de EE.UU. números 4.261.968, 4.174.384, 4.199.559 y 3.996.345, en las columnas 8 y 9.

Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tienen un grupo amino en posición alfa o beta, normalmente en posición alfa. Entre los compuestos naftilamino están 1-dimetilaminonaftaleno, 1-anilino-8-naftaleno y 2-p-toluidinil-6-naftaleno.

El marcador y el aceptor de energía, cuando se emplea uno, están asociados con la matriz de la presente invención como se describió anteriormente. Como se usa en el presente texto, la expresión "asociado con" incluye lo siguiente: la asociación puede ser mediante unión covalente o no covalente o mediante incorporación en la matriz como partícula. En general, una partícula suspendible en la que se incorpora el marcador tendrá un catalizador unido a ella antes del ensayo o en el curso del mismo.

"Materiales auxiliares": frecuentemente se emplearán en el ensayo varios materiales auxiliares de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, normalmente estarán presentes tampones en el medio de ensayo, así como estabilizantes para el medio de ensayo y los componentes del ensayo. Frecuentemente, además de estos aditivos pueden incluirse proteínas tales como albúminas; disolventes orgánicos tales como formamida; sales de amonio cuaternario; polianiones tales como sulfato de dextrano; agentes tensioactivos, en particular agentes tensioactivos no iónicos; potenciadores de enlace, p. ej. polialquilenglicoles; o similares.

"Secuencialmente de forma total o parcial": cuando la muestra y varios agentes utilizados en la presente invención se combinan de forma distinta a concomitantemente (simultáneamente), uno o más pueden combinarse con uno o más de los agentes restantes para formar una subcombinación. Cada subcombinación puede entonces ser sometida a una o más etapas del presente método. Así, cada una de las subcombinaciones puede incubarse bajo condiciones tales que se consigan uno o más de los resultados deseados.

Como se mencionó anteriormente, las presentes combinaciones encuentran aplicación en métodos para detectar peróxido de hidrógeno o un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno. Normalmente el ensayo se lleva a cabo poniendo en contacto la composición con el medio de ensayo sospechoso de contener peróxido de hidrógeno o el compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno. Cuando se produce peróxido de hidrógeno por una reacción de un analito, todos los reactivos necesarios requeridos para hacer que la reacción tenga lugar se incluyen también en el medio de ensayo. Las composiciones comprenden una matriz, preferentemente en forma de partículas. La matriz tiene un marcador incorporado en la misma y un catalizador unido, o que se une, a su superficie. El peróxido de hidrógeno reacciona con el catalizador formándose oxígeno singulete, que puede difundir en la matriz y reaccionar con el marcador. En el caso de una olefina quimioluminiscente, se genera una señal quimioluminiscente que está relacionada con la cantidad de peróxido de hidrógeno en el medio.

El ensayo se lleva a cabo habitualmente en un medio acuoso tamponado, a un pH moderado, que generalmente proporciona una óptima sensibilidad al ensayo. El medio acuoso puede ser solamente agua o puede incluir de 0,01 a 80 o más por ciento en volumen de un cosolvente. El pH del medio estará generalmente en el intervalo de aproximadamente 4 a 13, más habitualmente en el intervalo de aproximadamente 5 a 10, y preferentemente en el intervalo de aproximadamente 5 a 9, más preferentemente de 6 a 8. El pH se elige generalmente para conseguir una óptima sensibilidad y especificidad del ensayo. Entre los factores que han de considerarse están la dependencia con el pH de las velocidades de reacciones que producen peróxido de hidrógeno, la eficiencia de formación de oxígeno singulete a partir de peróxido de hidrógeno, la unión de miembros de unión, y la minimización de la unión no específica.

Pueden usarse varios tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los tampones ilustrativos incluyen acetato, borato, fosfato, carbonato, TRIS, barbital y similares. El tampón empleado en particular no es crítico para esta invención, pero en un ensayo concreto puede preferir un tampón u otro.

Normalmente se emplean temperaturas moderadas para llevar a cabo el ensayo, y normalmente se emplea temperatura constante, preferentemente la temperatura ambiente, durante el periodo de la medida. Las temperaturas de incubación estarán normalmente en el intervalo entre aproximadamente 5ºC y 99ºC, normalmente entre aproximadamente 15ºC y 70ºC, más normalmente entre 20ºC y 45ºC. Las temperaturas durante las medidas estarán normalmente en el intervalo entre aproximadamente 10ºC y 70ºC, más normalmente entre aproximadamente 20 y 45ºC, más normalmente entre 20ºC y 25ºC.

En algunos casos la CC activada puede requerir calentar para producir luminiscencia a causa de su relativa estabilidad a temperatura ambiente. Pueden formarse dioxietanos relativamente estables, por ejemplo, por reacción de oxígeno singulete con adamantilidenos (véase, p. ej. McCapra, supra) y endoperóxidos relativamente estables por reacción de oxígeno singulete con naftacenos 1,4-disustituidos (véase, p. ej., Wilson, J., J. Am. Chem. Soc. (1969) 91: 2387). En las dos circunstancias anteriores, los materiales estables experimentarán descomposición al calentarlos, normalmente a una temperatura inferior a 200ºC, preferentemente aproximadamente de 50 a 100ºC. Tal calentamiento puede provocar la rápida descomposición del aducto oxígeno singulete/olefina y, así, la emisión de luz puede tener lugar a lo largo de un periodo de tiempo corto. El uso de este método puede ser deseable cuando se detectan concentraciones muy bajas de peróxido de hidrógeno y se discute con más detalle más adelante en el presente texto.

La concentración de compuesto a detectar variará generalmente entre aproximadamente 10^{-5} y 10^{-17} M, más habitualmente de aproximadamente 10^{-6} a 10^{-14} M. Consideraciones tales como si el ensayo es cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo, la técnica de detección concreta y la naturaleza y concentración del compuesto de interés, determinarán normalmente las concentraciones de los diversos reactivos.

Mientras que las concentraciones de los diversos reactivos en el medio de ensayo se determinarán generalmente por el intervalo de concentración de interés del compuesto a detectar, la concentración final de cada uno de los reactivos se determinará empíricamente para optimizar la sensibilidad del ensayo en el intervalo. Esto es, una variación importante de la concentración del compuesto a detectar debe proporcionar una diferencia de señal medible con precisión.

Aunque el orden de adición puede variarse ampliamente, habrá ciertas preferencias dependiendo de la naturaleza del ensayo. El orden de adición más simple es añadir todos los materiales simultáneamente. Alternativamente, los reactivos pueden combinarse de forma total o parcialmente secuencial. Pueden intervenir una o más etapas de incubación después de combinarse los reactivos, que varían generalmente entre aproximadamente 5 segundos y 1 hora, más habitualmente entre aproximadamente 20 segundos y 10 minutos.

Es deseable que el producto de reacción del oxígeno singulete con la olefina quimioluminiscente se descomponga rápidamente. El producto formado por la activación de la CC con oxígeno singulete preferentemente se descompone de forma espontánea con emisión de luz, normalmente con un tiempo de vida de 10 microsegundos a 10 horas, preferentemente de 100 microsegundos a 10 minutos, más preferentemente de 300 microsegundos a 30 segundos.

Uno de los factores que permiten el control del tiempo para la luminiscencia es la estructura de la CC. Las características estructurales que contribuyen a un retardo de la luminiscencia son complejas y previsibles solamente en parte. Schapp, supra, y McCapra, supra, discuten algunos de los principios implicados.

Otro factor que permite el control del tiempo para la luminiscencia es la composición de la partícula. En general, cuando la partícula está compuesta de un material no polar en el que la CC está disuelta, los tiempos de descomposición y la eficiencia cuántica aumentan en relación con los materiales polares.

Otro factor que puede usarse para controlar el tiempo para la luminiscencia es la temperatura. En general, el aumento de la temperatura reducirá el tiempo de descomposición.

Otro factor en el control de tiempo para la luminiscencia es la presencia de activadores que aumentan la velocidad de descomposición de los dioxietanos producidos en la reacción. Tales activadores incluyen disolventes polarizables tales como halocarburos, compuestos polares tales como ésteres, nitrilos, compuestos organometálicos y similares. El activador está normalmente presente en la matriz en una cantidad suficiente para conseguir el retardo deseado en el tiempo para la luminiscencia. Esta cantidad depende de la naturaleza del activador y generalmente es de aproximadamente 10^{-5} a 10^{-1}M.

La quimioluminiscencia o luz producida como resultado de lo anterior puede medirse visualmente, fotográficamente, actinométricamente, espectrofotométricamente o por cualquier otro medio conveniente para determinar su cantidad, que está relacionada con la cantidad de compuesto en el medio. Normalmente, la luz emitida desde el material quimioluminiscente se mide mientras el material quimioluminiscente está en contacto con el medio de ensayo, por ejemplo por medio de un luminómetro o un material fotosensible. Cuando se forma un aducto de oxígeno singulete/olefina de vida corta, es decir, el producto de la reacción del oxígeno singulete con una CC, la intensidad luminosa será casi proporcional a la concentración de peróxido de hidrógeno en el medio. Cuando se está formando un compuesto tal como peróxido de hidrógeno como resultado de una reacción de un analito con reactivos de ensayo, la intensidad luminosa aumentará a medida que aumenta la concentración de peróxido de hidrógeno.

Como se mencionó anteriormente, para detectar cantidades muy pequeñas de peróxido de hidrógeno se emplea un material quimioluminiscente que no experimenta más que una lenta descomposición quimioluminiscente a temperatura ambiente después de la reacción con oxígeno singulete. Generalmente, para concentraciones de peróxido de hidrógeno muy bajas, la matriz recubierta con catalizador se incuba con el medio de ensayo durante un tiempo suficiente para permitir que la mayor parte del peróxido de hidrógeno reaccione con el catalizador para formar oxígeno singulete, que reacciona con la CC que está incorporada en la matriz. Durante este periodo hay poca o nula emisión quimioluminiscente. Después de la incubación, la matriz que contiene el material quimioluminiscente se calienta para provocar la descomposición quimioluminiscente del aducto de oxígeno singulete. El calentamiento de la matriz puede llevarse a cabo mientras está en contacto con el medio de reacción, o la matriz puede opcionalmente separarse del medio de reacción. Como se mencionó anteriormente, en esta circunstancia el calentamiento es normalmente a una temperatura inferior a 200ºC, preferentemente aproximadamente de 50 a 120ºC. El calentamiento produce la rápida descomposición del aducto de oxígeno singulete/olefina y, así, la emisión tiene lugar durante un corto periodo de tiempo. Dado que una breve explosión de luz de alta intensidad se detecta más fácilmente que un resplandor prolongado de baja intensidad que produce el mismo número de cuantos de luz, este método proporciona una detección más sensible del peróxido de hidrógeno. Otro método es usar un precursor de compuesto fluorescente y examinar la fluorescencia en la matriz.

Una aplicación particular de los métodos y composiciones de la invención es un método para determinar un analito que es un miembro de un par de unión específica (sbp: Specific Binding Pair). Se proporciona una combinación que comprende (i) una muestra sospechosa de contener el analito; (ii) un primer miembro del sbp unido a una de las enzimas de una pareja de enzimas que consiste en una oxidasa o una peroxidasa, siendo capaz dicho primer miembro del sbp de unirse al analito o a otro miembro del sbp capaz de unirse al analito, (iii) un sustrato para la oxidasa capaz de generar peróxido de hidrógeno al reaccionar con la oxidasa, y (iv) una composición que comprende una matriz que permite la difusión de oxígeno singulete en la misma. La matriz tiene incorporado un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete y, en su superficie, (1) un segundo miembro del sbp capaz de unirse al primer miembro del sbp en una cantidad que depende de la presencia del analito y opcionalmente (2) el otro miembro del par enzimático. Cuando el otro miembro del par enzimático no está unido a la matriz, se incluye en la combinación de ensayo unido a un miembro del sbp que es capaz de unirse a la matriz. La combinación se incuba en un medio bajo condiciones suficientes para permitir que los miembros del sbp se unan y que el sustrato para la oxidasa reaccione con la oxidasa. Se determina si el oxígeno singulete ha reaccionado con el marcador. La magnitud de tal reacción se relaciona con la presencia y/o la cantidad de analito en la muestra.

El método y las composiciones de la invención pueden adaptarse a la mayoría de los ensayos que implican a miembros de un sbp tales como reacciones ligando-receptor, p. ej. antígeno-anticuerpo, ensayos de unión de polinucleótidos, etc. Los ensayos son normalmente homogéneos o heterogéneos, preferentemente homogéneos, incluyendo el tipo competitivo y sándwich. En un ensayo de unión específica, la muestra puede ser pretratada, si es necesario, para eliminar materiales no deseados.

Como se mencionó anteriormente, el primer miembro del sbp anterior es capaz de unirse al analito o a un miembro de sbp capaz de unirse al analito. Cuando el segundo miembro del sbp es también capaz de unirse al analito, puede resultar un protocolo de ensayo tipo sándwich. La reacción inmunológica para un ensayo tipo sándwich implica normalmente un miembro de un sbp, p. ej. un anticuerpo, que es también complementario para el analito y se une a la matriz en partículas, y la muestra de interés.

Uno de los miembros del sbp puede ser alternativamente análogo al analito, en cuyo caso puede resultar un protocolo de análisis competitivo. La reacción inmunológica para un protocolo competitivo implica normalmente un miembro de un sbp que es complementario para el analito y un miembro de un sbp que es un análogo del analito, normalmente un derivado del mismo. Uno de estos miembros de un sbp estará asociado con la matriz.

En un tipo de ensayo, una muestra sospechosa de contener un analito, que es un miembro de un sbp y los otros componentes del ensayo que comprenden una enzima unida a un miembro de un sbp y un sustrato, se combinan con una matriz en partículas de la presente invención. Después se examina el medio para observar la presencia de emisión quimioluminiscente, normalmente midiendo la cantidad de luz emitida, que está relacionada con la cantidad de analito en la muestra. Este método es un ensayo homogéneo en el que no se emplea una etapa de separación. Alternativamente, puede usarse una matriz en partículas o no en partículas que, después de combinar los componentes del ensayo, puede ser separada de la fase líquida, y después la fase sólida o bien la fase líquida pueden ser examinadas en cuanto a la presencia de emisión quimioluminiscente.

Un ensayo para el analito se llevará a cabo normalmente en un medio acuoso tamponado, a un pH moderado, que generalmente proporciona una óptima sensibilidad del ensayo. En general, los parámetros expuestos anteriormente para el medio de ensayo, pH, temperatura, etc., son válidos para el ensayo de un analito de acuerdo con la presente invención.

Las composiciones preferidas de acuerdo con la presente invención son partículas de látex o liposomas en los que están incorporados una olefina quimioluminiscente que reacciona con el oxígeno singulete. Una peroxidasa, tal como una lactoperoxidasa o una haloperoxidasa, está unida a la superficie de la partícula de látex o del liposoma.

Las composiciones y ensayos que siguen se proporcionan a título de ilustración y no de limitación, para permitir que un experto en la técnica aprecie el alcance de la presente invención y lleve a la práctica la invención sin una excesiva experimentación. Se entenderá que la elección de analitos, marcadores, catalizadores, partículas, otros reactivos y condiciones de reacción les vendrán indicados a los expertos en la técnica a la vista de la descripción del presente texto y de los ejemplos que siguen.

En un ensayo para la detección de peróxido de hidrógeno, una muestra sospechosa de contener peróxido de hidrógeno se combina en 1 mL de un tampón de fosfato 50 mM (pH) con esferas de látex de 300 nm en las que está incorporado el marcador 4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)-benzal acridano (preparado como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.340.716 en la columna 51, líneas 3-15, y en la columna 48, líneas 24-44) a una concentración de 5% peso/peso (p/p). Las esferas de látex tienen lactoperoxidasa (LP) unida a su superficie (1000 moléculas de LP por esfera). El medio, que contiene bromuro sódico 10 mM se mantiene a 25ºC durante 1 minuto y se mide la luz emitida por el medio. La cantidad de luz emitida por el medio está relacionada directamente con la cantidad de peróxido de hidrógeno en la muestra.

En un ensayo para la medida de glucosa, se combina una muestra (10 \mul) en 1 mL de tampón de fosfato (pH aproximadamente 8) con 200 \muL de glucosa oxidasa (2,6 \mug/mL) y liposomas multilamelares en cuyas bicapas está incorporado 2-metoxivinilpireno y que tienen unida a su superficie una cloroperoxidasa. El medio tamponado incluye también cloruro sódico 0,1 M. El medio se mantiene a 37ºC durante 5 minutos y la intensidad de luminiscencia se mide mediante un luminómetro. La cantidad de luminiscencia está relacionada directamente con la cantidad de glucosa en la muestra.

En un ensayo para la medida del colesterol, se combina una muestra (10 \mul) en 1 mL de tampón de fosfato (pH aproximadamente 8) con 200 \muL de colesterol oxidasa (0,2 \mug/mL) y gotículas de aceite formadas por dodecilnaftaleno en las que está incorporado 9-(benzal-9H-xanteno) al 8% p/p. Las gotículas de aceite tienen asociadas con su superficie una cloroperoxidasa a la que está unido naftaleno por medio de un espaciador de dodecametileno. El medio tamponado incluye también cloruro sódico 0,1 M. El medio se mantiene a 25ºC durante 30 minutos y después se mide la fluorescencia fotométricamente por medio de un fluorómetro. En este ejemplo, el oxígeno singulete producido de acuerdo con la presente invención reacciona con el xanteno para dar una xantona, que es fluorescente. La cantidad de fluorescencia está relacionada directamente con la cantidad de colesterol en la muestra.

Como se expuso antes, el método de ensayo de la presente invención puede ser aplicado a la detección de analitos distintos del peróxido de hidrógeno y compuestos capaces de producir peróxido de hidrógeno. Un ejemplo, a título de ilustración y no de limitación, es un ensayo para la detección de teofilina en una muestra de suero sospechosa de contener teofilina. La muestra de suero (2 \muL) se combina con un medio de ensayo que comprende 1 mL de un tampón de fosfato 50 mM y 20-40 \mug de esferas de látex de 300 nm en las que está incorporado el marcador 4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)-benzal acridano (preparado como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.340.716 en la columna 51, líneas 3-15, y en la columna 48, líneas 24-44) a una concentración de 5% peso/peso (p/p). Unidos a la superficie de las esferas de ensayo hay lactoperoxidasa (LP) (1000 moléculas de LP por esfera) y anticuerpo anti-teofilina (10 \mug de anticuerpo por mg de esferas). El medio de ensayo contiene también (i) un conjugado de teofilina unido covalentemente a la enzima galactosa oxidasa (la concentración se optimiza en el intervalo de 3,2 x 10^{-12} a 3,2 x 10^{-10} moles) y (ii) \beta-D-galactosidasa como sustrato para la galactosa oxidasa (1,0 mM) y (iii) bromuro sódico 50 mM como sustrato para la LP. El medio de ensayo se incuba a una temperatura de 37ºC durante un periodo de 15 minutos y la cantidad de luz emitida por el medio se relaciona directamente con la cantidad de teofilina en la muestra.

El ensayo anterior funciona de la manera siguiente: el conjugado de teofilina-galactosa oxidasa y la teofilina de la muestra compiten por los sitios de unión en el anticuerpo anti-teofilina. El conjugado que se une al anticuerpo hace que la enzima oxidasa entre en estrecha proximidad con la LP en las partículas de látex. La LP actúa sobre el peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno singulete, que se forma en la superficie de la partícula de látex, y se difunde en la misma, donde reacciona con el marcador 4-(N,N-dioctadecilcarboxamidometoxi)-benzal acridano provocando la producción de luz. En el ensayo anterior el peróxido de hidrógeno se produce como parte de un sistema productor de señal implicado en la detección del analito teofilina. En presencia de la teofilina de la muestra se obtiene menos luz porque la teofilina de la muestra compite con el conjugado por los sitios de unión en el anticuerpo anti-teofilina. Cuanto mayor es la cantidad de teofilina en la muestra, tanto menor es la cantidad de conjugado que se une a las partículas de látex, tanto menor es la cantidad de peróxido de hidrógeno que se forma en la proximidades de la LP en el látex, y tanto menor es la cantidad de oxígeno singulete que difunde en las partículas de látex para reaccionar con el marcador de acridano.

Otro ejemplo, a título de ilustración y no de limitación, del uso de la presente invención en la detección de un analito es un ensayo para la detección de gonadotropina coriónica humana (HCG, por sus siglas en inglés) en una muestra de orina sospechosa de contener HCG. La muestra (100 \mul) se combina con un medio de ensayo que comprende 1 mL de un tampón de fosfato 50 mM y liposomas multilamelares de 300 nm en cuyas bicapas está incorporado 2-metoxivinilpireno y que tienen unida a su superficie (i) una cloroperoxidasa (CLP) (1000 moléculas de CLP por esfera) y (ii) anticuerpo contra la subunidad \beta de la HCG. El medio de ensayo contiene también (i) cloruro sódico 0,1 M y (ii) partículas de platino en las que hay unidos anticuerpos contra la subunidad \alpha de la HCG (producidas como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.384.265) y (iii) hidrazina 50 mM. El medio de ensayo se incuba a una temperatura de 37ºC durante un periodo de 15 minutos y la intensidad de luminiscencia se mide mediante un luminómetro. La cantidad de luminiscencia está relacionada directamente con la cantidad de HCG en la muestra.

El ensayo anterior funciona de la manera siguiente: Los anticuerpos de HCG se unen a cualquiera de las moléculas de HCG en la muestra, lo que hace que las partículas de platino entren en estrecha proximidad con los liposomas. El platino cataliza la oxidación de la hidrazina con producción de peróxido de hidrógeno, que a su vez tiene por resultado la producción de oxígeno singulete cerca de la superficie de los liposomas en virtud de la CLP en la superficie de los liposomas. El oxígeno singulete difunde a los liposomas, donde reacciona con el marcador 2-metoxivinilpireno provocando la producción de luminiscencia. En el anterior ensayo, se produce el peróxido de hidrógeno como parte de un sistema productor de señal implicado en la detección del analito HCG.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a kits útiles para realizar cómodamente un método de ensayo de la invención para determinar la presencia o la cantidad de un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno, o de un analito en una muestra sospechosa de contener tal compuesto o analito. Para mejorar la versatilidad de la presente invención, los reactivos pueden ser suministrados en una combinación empaquetada, en el mismo recipiente o en recipientes distintos, de forma que la relación de los reactivos proporciona una optimización sustancial del método de ensayo. Los reactivos pueden estar en recipientes separados o pueden reunirse varios reactivos en uno o más recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos. Los kits comprenden en combinación empaquetada (a) una composición que comprende una matriz en la que está incorporado un marcador capaz de ser modificado por el oxígeno singulete, en donde una enzima capaz de catalizar la conversión de peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete está unida a la matriz o, si no es así, está unida a un miembro de un sbp que es capaz de unirse a la matriz y la matriz permite la difusión en ella de oxígeno singulete. El kit incluye también un sustrato para la enzima distinto del peróxido de hidrógeno. El kit puede incluir además otros reactivos empaquetados por separado para realizar un ensayo tal como un aceptor de energía incorporado en la matriz o unido a un miembro de un sbp, miembros de sbp adicionales, reactivos auxiliares tales como un sustrato enzimático auxiliar, etc. Alternativamente, el kit puede comprender en combinación empaquetada (a) una composición que comprende una matriz y un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, (b) una peroxidasa y (c) una oxidasa en la que la oxidasa puede ser una enzima u otro catalizador capaz de producir peróxido de hidrógeno. La peroxidasa y la oxidasa están unidas a la matriz, o pueden llegar a estarlo.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos de los kits pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que optimicen sustancialmente las reacciones que es necesario que tengan lugar durante el presente método y además para optimizar sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Bajo circunstancias apropiadas pueden proporcionarse uno o más de los reactivos del kit en forma de polvo seco, normalmente liofilizado, que incluye los excipientes, que al disolverse proporcionarán una solución de reactivos que tiene las concentraciones apropiadas para llevar a cabo un método o ensayo de acuerdo con la presente invención. El kit puede incluir además una descripción escrita de un método de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente.

Ejemplos

La invención se muestra con más detalle mediante los siguientes ejemplo ilustrativos. Las partes y los porcentajes mencionados en el presente texto son en peso a menos que se especifique otra cosa. Las temperaturas son en grados centígrados (ºC).

Abreviaturas y Materiales

s: segundos

h: horas

min: minutos

RLU: unidades relativas de luz

rpm: revoluciones por minuto

EDTA: ácido etilendiaminatetraacético

MES: ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

CMO: hemihidrocloruro de carboximetoxilamina

NaOAc: acetato sódico

DMF: dimetilformamida

Dextrano T-500 de Pharmacia, nº de catálogo 17-0320-02.

Hidróxido sódico de Mallinckrodt AR (lote 7707 KMRT)

Agua (desionizada) procedente de una unidad Millipore Filtration Unit.

Minikros Lab System (Microgon Inc. nº de cat. SYLS 121 01N) y módulos de flujo tangencial Minikros (M25S 300 01N, M25S 600 01N, M21M-300-01N), ambos de Microgon Inc. Laguna Hills, CA.

Sal disódica del ácido etilendiaminatetracético, EDTA Na_{2} de Sigma (nº de cat. E4884).

Albúmina de suero bovino (BSA) de Sigma (nº de cat. A7888).

Sulfato de gentamicina de GIBCO (nº de cat. 15750-011).

Kathon de Rohm and Haas, pieza nº 5A033, lote C1.

NaOH (pellas), NaOH 0,1 N, HCl (conc.), H_{2}SO_{4} (conc.) y HCl 0,1 N, todos ellos de Mallinckrodt (calidad AR).

Etanol (200 proof, EtOH) de Quantum.

p-Dimetilamino benzaldehído de Sigma (nº de cat. D-2004)

Estreptavidina de Aaston, Inc. (nº de cat. STA-1G-D) o Boehringer Mannheim (nº de cat. 1520679103).

Tween-20 (Surfact-Amps 20) de Pierce Chemical Company.

El tamaño de las partículas se determinó mediante dispersión dinámica de luz en un Nicomp (modelo 370).

TRIS: Tris(hidroximetil)aminometano.HCl (una solución 10X) de Bio Whittaker, Walkersville, MD, o de J. T. Baker (nº de cat. 4099-02).

Tampón A: tampón de acetato 0,1 M, pH 5,0; solución 0,2 M de acetato sódico (16,4 g) disuelto en 2,0 L de agua, combinada con ácido acético 0,2 M a pH 5,0; diluida con igual volumen de agua para dar tampón de acetato 0,1 M a pH 5,0.

Tampón B: tampón libre de proteína para el lavado de las esferas recubiertas con estreptavidina; 121,1 g de TRIS, 175,3 g de NaCl, 93,0 g de EDTA Na_{2}\cdot2H_{2}O y 10,0 g de dextrano T-500 en 10,0 L de agua; ajustado a pH 8,3 con HCl concentrado.

Tampón C: 121,1 g de TRIS (0,1 M), 175,3 g de NaCl (0,3 M), 93,0 g de EDTA Na_{2}\cdot2H_{2}O (25 mM), 10,0 g de dextrano T-500 (0,1%); 31,25 ml de HBR-1 (de Scantibodies Laboratory Inc., Los Angeles, CA) (1/320), 10,0 g de BSA calidad para RIA (0,1%), 5 mL de Kathon (0,05%) y 20 mL de sulfato de gentamicina (0,01%) en 10,0 L de agua; ajustado a pH 8,3 con HCl concentrado.

Ejemplo 1 Preparación de partículas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa

A. Se preparó C-28 tioxeno de la forma siguiente: A una solución de 4-bromoanilina (30 g, 174 mmoles) en DMF seco (200 mL) se añadió 1-bromotetradecano (89,3 mL, 366 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (62,2 mL, 357 mmoles). La solución de reacción se calentó a 90ºC durante 16 h bajo argón antes de ser enfriada a temperatura ambiente. A esta solución de reacción de añadió de nuevo 1-bromotetradecano (45 mL, 184 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (31 mL, 178 mmoles) y la mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante otras 15 h. Después de enfriar, la solución de reacción se concentró bajo vacío y el residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (400 mL). La solución en CH_{2}Cl_{2} se lavó con solución acuosa de NaOH 1 N (2x), agua y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró bajo vacío para dar un aceite marrón oscuro (aproximadamente 110 g). La cromatografía en columna preparativa en gel de sílice mediante un sistema Waters 500 Prep LC eluyendo con hexano proporcionó un aceite amarillo que contenía principalmente el producto (4-bromo-N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilina) junto con un componente minoritario 1-bromotetradecano. Este último compuesto se eliminó de la mezcla mediante destilación bajo vacío (p. eb. 105-110ºC, 0,6 mm) para dejar 50,2 g del producto (51%) en forma de un aceite marrón. A una mezcla de virutas de magnesio (9,60 g, 395 mmoles) en THF seco (30 mL) bajo argón, se añadió gota a gota una solución del anterior producto de anilina sustituido (44,7 g, 79 mmoles) en THF (250 mL). Se añadieron unos pocos cristales de yodo para iniciar la formación del reactivo de Grignard. Cuando la mezcla de reacción se calentó y comenzó el reflujo, la velocidad de adición se reguló para mantener un reflujo suave. Una vez completa la adición, la mezcla se calentó a reflujo durante una hora más. La solución sobrenadante enfriada se transfirió mediante una cánula a un embudo de adición y se añadió gota a gota (a lo largo de 2,5 h) a una solución de fenilglioxal (11,7 g, 87 mmoles) en THF (300 mL) a -30ºC bajo argón. La mezcla de reacción se calentó gradualmente a 0ºC a lo largo de 1 h y se agitó durante otros 30 min. La mezcla resultante se vertió en una mezcla de hielo fundente (800 mL) y acetato de etilo (250 mL). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3x). Las fases orgánicas reunidas se lavaron con H_{2}O (2x) y salmuera y se secaron sobre MgSO_{4}. La evaporación del disolvente dio 48,8 g del producto crudo en forma de un líquido oleoso verde oscuro. La cromatografía en columna rápida de este líquido (gradiente de elución con hexano, 1,5:98,5; 3:97; 5:95 de acetato de etilo:hexano) proporcionó 24,7 g (50%) del producto de benzoína (MS (C_{42}H_{69}NO_{2}): [M-H]^{+} 618,6. El espectro ^{1}H NMR (250 MHz, CDCl_{3}) fue consistente con el producto de benzoína esperado. A una solución del producto de benzoína de antes (24,7 g, 40 mmoles) en tolueno seco (500 mL) se añadió secuencialmente 2-mercaptoetanol (25 g, 320 mmoles) y TMSCl (100 mL, 788 mmoles). La solución de reacción se calentó a reflujo durante 23 h bajo argón antes de enfriarla a temperatura ambiente. A esta se añadió más TMSCl (50 mL, 394 mmoles) y la solución de reacción se calentó a reflujo durante otras 3 h. La solución resultante se enfrió, se alcalinizó con solución acuosa de NaOH 2,5 N y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3x). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} (2x) y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron bajo vacío para dar un líquido oleoso de color marrón. La cromatografía en columna preparativa en gel de sílice usando un sistema Waters 500 Prep LC (gradiente de elución con hexano, 1:99, 2:98 de acetato de etilo:hexano) proporcionó 15,5 g (60%) del tioxeno C-28 en forma de un aceite de color amarillo anaranjado (MS (C_{44}H_{71}NOS: [M-H]^{+} 661,6. El espectro ^{1}H NMR (250 MHz, CDCl_{3}) fue consistente con el producto de tioxeno C-28 esperado 2-(4-(N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilino)-3-fenil tioxeno.

B. Se prepararon esferas de material quimioluminiscente de la forma siguiente: Las esferas de partida eran de látex modificado con carboxilato, adquiridas en Seradyn Particle Technology, Indianápolis, IN. Las esferas contenían Eu(TTA)_{3}DPP preparado de la forma siguiente: se preparó DPP/Eu(TTA)_{3} combinando 8,69 g de Eu(TTA)_{3}\cdot3H_{2}O (10 mmoles, Kodak Chemical Company, Rochester NY) y 1,8 g de 1,10-fenantrolina (10 mmoles, Aldrich) en 50 ml de tolueno seco y calentando a 95ºC en un baño de aceite durante una hora. El tolueno se eliminó bajo presión reducida. El sólido de color ceniza se cristalizó en 10 mL de tolueno para dar 10 gramos de DPP/Eu(TTA)_{3}. Espectro de absorción: 270 nm (20.000), 340 nm (60.000) (tolueno) 1.R (KBr): cm^{-1}: 3440 (s), 1600 (s), 1540 (s), 1400 (s), 1300 (s). Cuatro mL de una suspensión al 20% (400 mg) de látex modificado con carboxilato de 175 nm lavado se diluyeron con 3 mL de etoxietanol en un matraz de fondo redondo (R.B.: Round Bottom) de 25 mL con una varilla de agitación. El matraz de R.B. se puso después en un baño de aceite a 105ºC y se agitó durante 10 min. Después se añadieron tioxeno C-28 3,3 mM y Eu(TTA)_{3}DPP 15,5 mM; las esferas se agitaron durante 5 min más. En este punto, se añadió lentamente a lo largo de 5 min 1,0 mL de NaOH 0,1 N. Durante todas las adiciones la temperatura del baño de aceite se mantuvo a 105ºC. Se dejó descender lentamente la temperatura del baño de aceite hasta la temperatura ambiente a lo largo de 2 h. Después de enfriar, la mezcla se diluyó con 20 mL de etanol y se centrífugo (12.500 rpm, 30 min). Los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos se resuspendieron en etanol mediante tratamiento con ultrasonidos. La centrifugación se repitió y el sedimento se resuspendió en agua, y se repitió la centrifugación. El sedimento se resuspendió en 5 mL de etanol acuoso hasta un volumen final de 40 mL.

C. Se prepararon esferas de agente quimioluminiscente recubiertas con estreptavidina de la manera siguiente:

La estreptavidina de Aaston era un polvo blanco liofilizado que contiene estreptavidina, fosfato potásico, cloruro sódico y lactosa. La lactosa se eliminó mediante diálisis frente a Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} a pH 7,0. Se preparó una solución de estreptavidina a 10-12 mg/mL (75-62,5 mL) en Tampón A (pH 5,0, 0,2 M).

Se introdujeron grupos aldehído en la superficie de esferas de agente quimioluminiscente preparadas como se describió anteriormente, para dar esferas de aldehído-agente quimioluminiscente. Véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.264.766, en particular en la columna 7, líneas 18 a 42, y en la columna 8, línea 63 a la columna 9, línea 25, y la patente de EE.UU. nº 4.801.504 en particular en la columna 6, líneas 42 a 50.

Se preparó una solución de 20 mg/mL de esferas de aldehído-agente quimioluminiscente que contienen Tween 20 (75 mL). La solución que contiene las esferas se añadió lentamente con agitación suave a la solución de estreptavidina, preparada anteriormente, contenida en un frasco de vidrio de 250 mL. Se preparó una solución fresca de NaCNBH_{3} en agua y se añadió a la mezcla de reacción. La concentración final de la mezcla de reacción era 10 mg/mL en esferas, 5 mg/mL en estraptavidina, 1,0 mg/mL en NaCNBH_{3} y 0,1% en Tween-20. El pH de la mezcla de reacción se ajustó en 5,0. El frasco se protegió de la luz y se agitó a 100-150 rpm a 37ºC durante 48 a 60 horas. Las esferas resultantes se trataron para bloquear los grupos aldehído libres que quedaban. Véase, por ejemplo, Margel, S., J. Chromatogr. (1989) 462: 177-189.

Las esferas se sometieron después a ultrafiltración en el Microgon (poro de 0,05 \mum, 1188 cm^{2}), primero con tampón B para eliminar la proteína y después con tampón C. El tamaño de las esferas se determinó en el Nicomp y era aproximadamente 280 nm (pesado en intensidad) en tampón C.

D. Preparación de esferas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa:

Esferas de agente quimioluminiscente recubiertas con estreptavidina (30 mgs) preparadas como se describió anteriormente, en 1,0 ml de tampón de MES 10 mM, pH 6,0, fueron sometidas a ultrasonidos. A la anterior solución se añadió 1,0 ml de lactoperoxidasa marcada con biotina a 1,0 mg/ml (Sigma L - 8257; 108 unidades/mg de proteína; 6 biotinis/enzima) en tampón de MES 10 mM, pH 6,0. La mezcla de reacción se agitó en vórtice y se incubó a temperatura ambiente durante 90 min. Las esferas de agente quimioluminiscente se centrifugaron y se lavaron tres veces con 10 ml de tampón de MES 10 mM, pH 6,0. Las esferas de agente quimioluminiscente se resuspendieron finalmente a razón de 1,0 mg/ml en tampón de MES 10 mM, pH 6,0 con 1,0 mg/ml de BSA. Las partículas se usaron para el ensayo.

Ejemplo 2 Efecto del pH sobre la señal quimioluminiscente de la lactoperoxidasa unida a partículas de agente quimioluminiscente

Se preparó una solución que contiene peróxido de hidrógeno 0,1 mM en tampones diferentes (pH 4,2 y pH 5,0, acetato 0,1 M y pH 6,0, pH 7,0, pH 7,4 y pH 8,0, fosfato 0,1 M). A 1,0 ml de la anterior solución en un tubo de vidrio (12 x 75 mm) se añadieron 0,01 ml de bromuro sódico 1,0 M en agua desionizada y 0,01 ml de partículas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa (1 mg/ml en tampón de MES 10 mM, pH 6,0). La solución se mezcló de inmediato y el tubo se introdujo en un quimioluminómetro. La quimioluminiscencia se integró durante 30 s. Los resultados se resumen en la Tabla 1.

TABLA 1

Tampón	pH	RLU (30 s) (media de 3 lecturas)
Acetato	4,2	19000
Acetato	5,0	34000
Fosfato	6,0	65400
Fosfato	7,0	42000
Fosfato	7,4	26000
Fosfato	8,0	20000

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Ejemplo 3 Efecto de la concentración de bromuro sódico sobre la señal quimioluminiscente de la lactoperoxidasa unida a partículas de agente quimioluminiscente

Se preparó una solución que contiene peróxido de hidrógeno 0,1 mM en tampón de fosfato 0,1 M pH 6,0. A 1,0 ml de la anterior solución en un tubo de vidrio (12 x 75 mm) se añadieron de 0,0003 ml a 0,06 ml de bromuro sódico 1,0 M en agua desionizada y 0,05 ml de partículas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa (1 mg/ml en tampón de MES 10 mM, pH 6,0). La solución se mezcló de inmediato y el tubo se introdujo en un quimioluminómetro. La quimioluminiscencia se integró durante 30 s. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

	Bromuro sódico (mM)	RLU (30 s) (media de 3 lecturas)
	0	6122
	3	659000
	6	1070000
	10	1280000
	15	1160000
	20	1100000
	30	914000
	60	717000

Ejemplo 4 Determinación de peróxido de hidrógeno

Se preparó una muestra de calibrador que contiene peróxido de hidrógeno en tampón de fosfato potásico 0,1 M (concentración final) a pH 6,0. A 1 ml de esta solución en un tubo de vidrio (12 x 75 mm) se añadieron de 0,02 ml de bromuro sódico 1,0 M en agua desionizada y 0,01 ml del reactivo incluido que contiene una suspensión de partículas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa en tampón de MES 10 mM, pH 6,0. La solución se mezcló de inmediato y el tubo se introdujo en un quimioluminómetro. La señal quimioluminiscente se integró durante 5 s. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

TABLA 3

	Peróxido de hidrógeno (mM)	RLU (5 s) (media de 3 lecturas)
	0,0	100
	0,5	250
	1,0	400
	2,0	760
	4,0	1400
	6,0	2060
	8,0	2800

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Ejemplo 5 Determinación de glucosa

Se preparó una muestra de calibrador que contiene glucosa en tampón de fosfato potásico 0,1 M (concentración final) a pH 6,0 y se añadieron 0,02 ml de glucosa oxidasa (1 mg/ml). Después de mezclar, la solución se incubó durante 5 min.

A 1 ml de esta solución en un tubo de vidrio (12 x 75 mm) se añadieron de 0,02 ml de bromuro sódico 1,0 M en agua desionizada y 0,01 ml del reactivo incluido que contiene una suspensión de partículas de agente quimioluminiscente recubiertas con lactoperoxidasa en tampón de MES 10 mM, pH 6,0. La solución se mezcló de inmediato y el tubo se introdujo en un quimioluminómetro. La señal quimioluminiscente se integró durante 5 s. Los resultados se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4

	Glucosa (\mug/ml)	RLU (5 s) (media de 3 lecturas)
	tampón^{*}	40
	0	110
	1	314
	2	658
	3	962
	5	1800
	10	4200
		\hskip2,6cm 12422 (10 min, 1ª etapa)
		\hskip2,6cm 20298 (20 min, 1ª etapa)
	\hskip2cm^{*} sin esferas de agente quimioluminiscente

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La anterior discusión incluye ciertas teorías en cuanto a mecanismos implicados en la presente invención. Estas teorías no deben considerarse como limitantes de la presente invención en modo alguno, ya que se ha demostrado que la presente invención consigue los resultados descritos.

Aunque la invención precedente ha sido descrito con algún detalle a título de ilustración y ejemplo con fines de obtener mayor claridad y comprensión, será obvio que pueden llevarse a la prácticas ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (47)

1. Una composición que comprende una matriz que tiene incorporado un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, en la que un catalizador capaz de catalizar la formación de oxígeno singulete a partir de peróxido de hidrógeno está unido a la superficie de dicha matriz, permitiendo dicha matriz la difusión de oxígeno singulete en la misma.

2. La composición según la reivindicación 1ª, en la que dicha matriz se elige entre el grupo que consiste en materiales poliméricos, bicapas lipídicas, gotículas de aceite y células.

3. La composición según la reivindicación 1ª, en la que dicho marcador se vuelve fluorescente o quimioluminiscente al reaccionar con oxígeno singulete.

4. La composición según la reivindicación 1ª, en la que dicho marcador es una olefina.

5. La composición según la reivindicación 1ª, en la que dicho catalizador es una enzima.

6. La composición según la reivindicación 1ª, en la que dicha matriz se elige entre el grupo que consiste en polímeros de látex y bicapas lipídicas, y en la que dicho catalizador es una peroxidasa.

7. La composición según la reivindicación 6ª, en la que dicha matriz es una partícula de látex.

8. La composición según la reivindicación 6ª, en la que dicha matriz es un liposoma.

9. La composición según la reivindicación 6ª, en la que dicho marcador es una olefina capaz de reaccionar con oxígeno singulete para producir quimioluminiscencia.

10. La composición según la reivindicación 6ª, en la que dicho marcador es capaz de reaccionar con oxígeno singulete para formar un producto fluorescente.

11. La composición según la reivindicación 6ª, en la que dicha peroxidasa es una lactoperoxidasa o una haloperoxidasa.

12. Un método para detectar peróxido de hidrógeno o un compuesto capaz de generar peróxido de hidrógeno, comprendiendo dicho método:

(a)

proporcionar en combinación

(i)

una muestra sospechosa de contener peróxido de hidrógeno o dicho compuesto, y

(ii)

la composición según la reivindicación 1ª.

(b)

someter dicha combinación a condiciones en las que dicho catalizador genera oxígeno singulete, y

(c)

determinar si el oxígeno singulete ha reaccionado con dicho marcador, indicando la cuantía de reacción del mismo la presencia o la cantidad de dicho compuesto o peróxido de hidrógeno.

13. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicha matriz se elige entre el grupo consistente en materiales poliméricos, bicapas lipídicas, gotículas de aceite y células.

14. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho marcador es una olefina quimioluminiscente capaz de reaccionar con oxígeno singulete para formar un dioxietano.

15. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho catalizador es una enzima.

16. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho catalizador en una peroxidasa.

17. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicha determinación de la etapa (c) se lleva a cabo detectando la luz emitida por el producto de la reacción de un precursor de compuesto luminiscente con oxígeno singulete.

18. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicha determinación de la etapa (c) se lleva a cabo detectando la luz emitida por el producto de la reacción de dicho marcador con oxígeno singulete.

19. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho compuesto es un sustrato para una oxidasa.

20. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho marcador es un telúrido capaz de reaccionar con oxígeno singulete para formar una olefina fluorescente.

21. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho catalizador es una enzima.

22. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicha determinación de la etapa (c) se lleva a cabo detectando la luz emitida por el producto de reacción de dicho marcador con oxígeno singulete.

23. El método según la reivindicación 12ª, en el que dicho catalizador es una peroxidasa y en el que dicho material polimérico se elige entre el grupo consistente en polímeros de látex y bicapas lipídicas, y en el que dicho marcador es una olefina.

24. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicho compuesto se elige entre el grupo consistente en células, sustratos para una oxidasa y precursores de un sustrato para una oxidasa.

25. El método según la reivindicación 24ª, en el que dicho sustrato para una oxidasa se elige entre el grupo que consiste en sacáridos, alcoholes aminas, NADH, xanteno, ácido úrico y colesterol.

26. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicha matriz es una partícula polímera de látex.

27. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicha matriz es un liposoma.

28. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicha olefina es capaz de reaccionar con oxígeno singulete para formar un dioxietano.

29. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicha peroxidasa es una lactoperoxidasa o una haloperoxidasa.

30. El método según la reivindicación 23ª, en el que dicha determinación de la etapa (c) se lleva a cabo detectando la luz emitida por el producto de reacción de dicha olefina con oxígeno singulete.

31. Un método para detectar un analito, siendo dicho analito un miembro de un par de unión específica (sbp, por sus siglas en inglés), comprendiendo dicho método:

(a)

proporcionar en combinación en un medio:

(i)

una muestra sospechosa de contener dicho analito,

(ii)

un primer miembro de un sbp unido a una oxidasa o a una peroxidasa, siendo capaz dicho primer miembro de sbp de unirse a dicho analito o a otro miembro de sbp capaz de unirse a dicho analito,

(iii)

una composición que comprende una matriz que tiene incorporado a la misma un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, permitiendo dicha matriz la difusión de oxígeno singulete en la misma,

(iv)

el otro de dicha oxidasa o de dicha peroxidasa y un segundo miembro de sbp unido a dicha matriz, o el otro de dicha oxidasa o de dicha peroxidasa unido a dicho segundo miembro de sbp que es capaz de unirse a dicho primer miembro de sbp en una cantidad que depende de la presencia de analito, y

(v)

un sustrato para dicha oxidasa capaz de generar peróxido de hidrógeno por reacción con dicha oxidasa, y

(b)

incubar dicho medio bajo condiciones suficientes para permitir que dichos miembros de sbp se unan y dicho sustrato para dicha oxidasa reaccione con dicha oxidasa, y

(c)

determinar si el oxígeno singulete ha reaccionado con dicho marcador, estando relacionada la cuantía de reacción del mismo con la presencia y/o la cantidad de dicho analito en dicha muestra.

32. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicho analito se elige entre el grupo consistente en antígenos de superficie de la célula, compuestos orgánicos pequeños, poliaminoácidos y polinucleótidos.

33. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicho sustrato para una oxidasa es un sacárido.

34. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicha matriz es una partícula de látex.

35. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicha matriz es un liposoma.

36. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicho marcador es capaz de reaccionar con oxígeno singulete para producir quimioluminiscencia.

37. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicho marcador es capaz de reaccionar con oxígeno singulete para formar un producto fluorescente.

38. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicha peroxidasa es una lactoperoxidasa o una haloperoxidasa.

39. El método según la reivindicación 31ª, en el que dicha peroxidasa se une a dicha matriz.

40. Un kit que comprende, en combinación empaquetada:

(a)

una composición que comprende una matriz que tiene incorporado a la misma un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete, en la que una enzima capaz de catalizar la conversión del peróxido de hidrógeno en oxígeno singulete está unido a dicha matriz o a un miembro de un sbp que es capaz de unirse a dicha matriz, permitiendo dicha matriz la difusión de oxígeno singulete en la misma, y

(b)

un sustrato para dicha enzima distinto del peróxido de hidrógeno.

41. El kit según la reivindicación 40ª, que comprende además una oxidasa.

42. El kit según la reivindicación 41ª, en el que dicha matriz se elige entre el grupo consistente en polímeros orgánicos y bicapas lipídicas y en el que dicha oxidasa está unida a un miembro de un sbp.

43. El kit según la reivindicación 40ª, en el que dicho marcador es una olefina quimioluminiscente capaz de reaccionar con oxígeno singulete.

44. El kit según la reivindicación 40ª, en el que dicha enzima es una peroxidasa.

45. Un kit que comprende en combinación empaquetada:

(a)

una composición que comprende una matriz que tiene incorporado a la misma un marcador capaz de ser modificado por oxígeno singulete,

(b)

una peroxidasa, y

(c)

una oxidasa,

en el que dicha peroxidasa o dicha oxidasa está unida o es capaz de unirse a dicha matriz, y

en el que uno o los dos de dichas oxidasa y peroxidasa están unidos a un miembro de un sbp que puede unirse a un analito.

46. El kit según la reivindicación 45ª, en el que dicha peroxidasa está unida a un miembro de un par de unión específica.

47. El kit según la reivindicación 45ª, en el que dicha peroxidasa y dicha oxidasa están unidas por separado a un miembro de un par de unión específica.