【発明の詳細な説明】
前処理試薬およびそれを使用する方法本発明の分野
臨床診断分野は、容易にそして正確に測定し得る物質（検体）および測定方法
に関して近年広い拡大が見られる。液体中の物質の低濃度の存在を検出するため
の信頼性ある方法が望まれる。臨床化学において、これらの物質は１０-13モル
以下の濃度において体液中に存在し得る。これら物質の低濃度の検出の困難性は
、利用できる比較的小さいサンプルサイズにより、そしてある種の検体はサンプ
ル中の他の成分と会合しそして正確に検出することが困難であるという事実によ
って増進される。
生物学的サンプル中の治療薬物のような薬物のレベルのモニタリングは、その
ような薬物を投与されている患者の適切な処置に有用である。毒性投与量レベル
または治療上有効でないレベルを避けるためには薬物レベルをモニターすること
が重要である。患者サンプル中の薬物レベルを定量的に決定するための多数の技
術が開発されている。そのような技術は一般にラジオイムノアッセイ、酵素イム
ノアッセイ、凝集イムノアッセイ、螢光分極イムノアッセイ等のような免疫反応
を含んでいる。
あるアッセイの開発においては多数の配慮がある。一配慮は検体濃度の変化に
対する信号応答である。第二の配慮はアッセイのためのプロトコールが実施でき
る容易性である。第三の配慮はサンプルからサンプルへの妨害の変動である。試
薬調製および精製の容易さ
、設備の入手可能性、オートメーションの容易性、およびサンプル成分と関心あ
る物質の相互作用も有用なアッセイの開発においていくつかの追加の配慮である
。例えば、ある種の検体は、タンパク、細胞および他の細胞物質のようなサンプ
ルの他の成分と会合し、それらの検出を困難または不可能にしている。生体は自
己と非自己とを区別するための複雑な免疫応答システムに依存している。適正な
免疫システムの機能は生体の長期間健康のために決定的である。不全な免疫応答
は自己を非自己物から保護する生体の不能性へ導き得る。過剰の免疫応答はさも
なければ無害物に対する生体の過剰反応へ導き得る。
時には、生体の免疫システムは不足した応答を増強するかまたは過剰の応答を
抑制するように制御されなければならない。例えば、腎臓、心臓、心肺臓、骨髄
および肝臓のような器官がヒトに移植される時、生体は同種移植片拒絶と呼ばれ
るプロセスによって移植した器官をしばしば拒絶するであろう。
同種移植拒絶を処置するためには、免疫システムは薬物療法によって制御され
た態様においてしばしば抑制される。免疫抑制薬物が非自己組織の同種移植片拒
絶防止を助けるために移植受領者へ注意深く投与される。
米国および他の国において免疫抑制剤として使用されるそのような薬物の一つ
はシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（米国特許Ｎｏｓ．４，１１７，１１８（１９７
８）および４，３９６，５４２（１９８３））である。ＣｓＡは抗生物質、抗関
節炎および抗炎症活性のような他の有用な性質を有し、糖尿病、マラリアおよび
自己免疫病のような他の疾状の処置にも用途がある。
ＣｓＡが高度に有用な免疫抑制薬物であっても、その使用は注意深く管理され
なければならない。何故ならば有効投与量範囲は狭く、そして過剰投与は重大な
副作用を招き得るからである。腎機能不全、高血圧、心脈管痙れん、粗毛症、座
瘡、振せん、痙れん、頭痛、歯肉過形成、下痢、嘔吐、肝毒性、腹腔不快、知覚
異常、潮虹、白血病、リンパ腫、静脈洞炎および乳房肥大がＣｓＡ処置を受けて
いる腎臓、心臓または肝臓移植患者に観察されている。
ＣｓＡ投与の管理は患者に存在する薬物レベルの注意深い制御を含んでいる。
ＣｓＡの分布および代謝は患者間で大きく変動するため、そして副作用の広い範
囲および重篤度のため、薬物レベルの正確なモニタリングが必須と考えられてい
る。ＣｓＡは全血サンプル中に存在する物質と会合し、このため正確なアッセイ
はこれらの他の物質からＣｓＡを抽出することを必要とする。
本発明の方法および組成物は、関心ある検体、特にサンプル中に他の物質と会
合して存在する検体を含有すると推定されるサンプルを前処理するめたの試薬に
関する。
全部を引用して文献がこの開示中に引用される。これら文献は技術の状態に関
し、各文献はここに参照として取り入れられる。関連技術の簡単な説明
ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．２８３，８０１（１９８８）（Ｗａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ．）およびその優先権書類米国特許Ｎｏ．５ｐ２３９，０５７はシクロスポリ
ンＡおよび代謝物の螢光分極アッセイ、および関係する免疫原および抗体を記載
する。
Ｑｕｅｎｉａｕｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ（１９８７）２４（１１）：１１５９−１１６８，
はシクロスポリンに対するモノクローナル抗体の特異性および交差反応性を記載
する。
Ｂａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，は、Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４（２）
：２５７−２５０において血中のシクロスポリンをモニタリングするためのモノ
クローナル抗体による特異性ラジオイムノアッセイを論ずる。
ＭｃＢｒｉｄｅ，ｅｔ ａｌ．，はＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８９）３５（
８）：１７２６−１７３０において、特異性モノクローナル抗体によるラジオイ
ムノアッセイおよびＨＰＬＣを比較して、種々の移植を有する患者からの血漿中
のシクロスポリンの測定を記載する。
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）３４（１）：３４−３９には、血液、胆汁
および尿中のシクロスポリンＡおよびその代謝物の液体クロマトグラフィ-測定
が論じられている。
Ｂｏｗｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，はＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ（１９８６）ＸＶＩＩＩ（６）：１３７−１４３において、シク
ロスポリン血中レベル、分析、臨床上の有用性、薬力学、代謝物および慢性薬理
学を開示する。
米国特許Ｎｏ．５，１３５，８７５（Ｍｅｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．）は、グリ
コール、短鎖脂肪族アルコールおよび亜鉛を使用する、タンパク沈澱試薬を論ず
る。
ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．０４７１２９３Ａ２（Ｍｅｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．
）は生物学的テストサンプルのための可溶化試薬を開示する。
ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．０４７３９６１Ａ２（Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ，ｅｔ ａｌ．）はシクロスポリン測定のためイムノアッセイ試薬および方法
を開示する。
米国特許Ｎｏ．４，９５９，３０３（Ｍｉｌｂｕｒｎ，ｅｔ ａｌ．）はタン
パクおよび非イオン性バインダーを含まない固相支持体へ免疫複合体を結合する
ことによる抗原のアッセイを記載する。
シクロスポリンのためのアッセイおよび前処理試薬に関する先行技術の広汎な
教示にもかかわらず、サンプルの他の成分と会合した検体の検出を容易にする前
処理処方物であって、前処理処方物の個々の成分が単独でまたは組合せてアッセ
イ媒体および後の検出を妨害しない処方物の開発は先行技術によって教示または
示唆されていない。本発明の概要
このため本発明は、会合した検体の存在および／または量についてアッセイさ
れるサンプルを処理するための新規な前処理組成物を提供する。この前処理組成
物は、前処理なしでは慣用のアッセイ条件のもとで検体の検出を妨害するであろ
うサンプルの他の成分と会合した検体の検出を容易化する。本発明によれば、サ
ンプルは、会合した検体を一以上のアッセイ試薬に対し一層容易に提供可能とす
るように前処理される。本発明の前処理組成物は、サンプル中に存在する細胞を
溶解し、存在し得るタンパクを沈澱し、そして関心ある検体を可溶化し、検体を
一層容易に検出可能とする。
本発明の一面は、約３０％ないし約４０％重量／体積（ｗ／ｖ）の量の低級ア
ルキルアルコールと、約２０％ないし約４０％ｗ／ｖの量のグリコールと、そし
て約２０ｍＭないし約３０ｍＭの金属塩
を含む水性成分の少なくとも約３０％ｗ／ｖを含む組成物に関する。
本発明の他の一具体例は、約３０％ないし約４０％ｗ／ｖの量のメタノールと
、約２０％ないし約４０％ｗ／ｖの量のプロピレングリコールまたはエチレング
リコールとそして水性成分約３０％ないし４０％ｗ／ｖを含み、該水性成分は約
２０ｍＭないし約３０ｍＭの銅塩と、約０．５ｍＭないし約２０ｍＭの緩衝剤と
、そして約０．００５ないし約０．１％ｗ／ｖの非イオン界面活性剤とを水性成
分が約３．０ないし約４．６のｐＨを有するように含んでいる組成物に関する。
本発明の他の一面は、会合した検体の含有を推測されるサンプル中の会合した
検体の測定のためのアッセイの改良に関する。このアッセイは、会合した検体の
含有を推測されるサンプルを前処理試薬と接触させることと、サンプルを検体の
検出のためのアッセイ試薬と接触させることを含む。改良は上の組成物の一つを
前処理試薬として使用することよりなる。
本発明の他の一面は、包装した組合せにおいて、（ａ）会合した検体の測定を
実施するための一種以上の試薬と、（ｂ）上の組成物の一つを含むキットである
。
本発明の他の面は、薬物の含有を推測されるサンプル中の免疫抑制薬物の測定
のためのアッセイの改良である。このアッセイは、サンプルを該薬物のための特
異的結合メンバーと接触させること、および薬物に対する特異的結合メンバーの
結合を検出することよりなる。改良はサンプルを接触ステップの前またはそれと
組合せて上の組成物と接触させることよりなる。
本発明の他の一具体例は、薬物の含有を推測されるサンプル中の免疫抑制薬物
の測定のためのアッセイの改良にある。このアッセイはサンプルを該薬物に対す
る抗体と、そして標識と該抗体により認識される化合物との接合体と接触させる
こと、そして標識接合体と抗体との免疫複合体を検出することを含む。改良はサ
ンプルをアッセイの最初のステップの前またはそれと組合せてサンプルを上の組
成物の一つの接触させることである。
これらおよび他の目的および具体例は、以下の詳細な説明に記載され、または
自明であろう。図面の簡単な説明
図１は、本発明の前処理組成物の使用対メタノール単独による、タクロリムス
（ＦＫ５０６）のためのアッセイの結果のグラフ表示である。詳細な説明
本発明は、会合した検体の測定を容易にするためサンプルを前処理するための
組成物およびキットを提供する。本発明によれば、サンプルは会合した検体を一
種以上のアッセイ試薬に対し一層利用可能とするように前処理される。分析すべ
きサンプルは細胞を溶解し、タンパクを沈澱し、分析すべきサンプル中に存在し
得るシクロスポリンを可溶化するように前処理される。前処理組成物は、それら
が既知の前処理物質のあるものよりも低い揮発性を示すことを特徴とする。この
ことは、前処理したサンプルをより大きいサンプル安定性とオペレーターに対す
る減少したリスクを持って環境へ開放されたサンプルカップを使用する分析機に
よりアッセイすることを許容する。
特定の具体例の説明へ進む前に、いくつかの術語が定義される。
サンプルは生物学的材料、通常生物学的流体であり、これはヒト、動物または
人工サンプルを含むことができる。典型的には、サンプルは、例えば尿、全血、
血清、血漿、精液、髄液、唾液等またはその水溶液もしくは抽出液のような天然
流体である。
会合した検体は、例えば細胞物質、リン脂質、タンパク等のようなサンプル中
の他の成分へ会合、例えば複合体化して存在する検体である。そのような検体は
免疫抑制薬物、例えばシクロスポリン、マイコフェノール酸、ＦＫ−５０６、ラ
パマイシン、アザチオプリンおよびステロイドのような治療薬物を含む。
シクロスポリンは、移植後臓器拒絶へ導く望まない免疫応答を抑制するための
免疫抑制薬物として使用される、天然もしくは合成ウンデカペプチドである。特
定のシクロスポリンの正確な構成は一つから次へと少しづつ変化し得る。シクロ
スポリンはシクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＣ、シクロス
ポリンＤ、シクロスポリンＥ、シクロスポリンＦ、シクロスポリンＧ、シクロス
ポリンＨ、シクロスポリンＩ、アティオシクロスポリンなどを含む。シクロスポ
リンの語には、例えば主要な代謝物ＡＭ９（Ｍ１）、ＡＭ１９（Ｍ８）、ＡＭＩ
（Ｍ１７）およびＡＭ４Ｎ（Ｍ２１）のようなウンデカペプチド環を保持するシ
クロスポリンの代謝物、およびＭ９、Ｍ１９、Ｍ１６およびＭ１８のような他の
代謝物も含まれる。
低級アルキルアルコールは、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、
ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ペ
ンタノール、イソペンタノール等、およびそれらの混合物のような、炭素原子１
ないし５を含んでいる分岐または直鎖アルキルコールであり、好ましくはメタノ
ールである。
術語脂肪族は、非環状炭化水素に関し、脂肪族炭化水素は開いた鎖を持つ炭素
と水素の化合物である。
ポリヒドロキシ脂肪族化合物は、例えばアルキレンポリオール、例えばグリコ
ール、グリセロール等およびそれらの混合物のような２以上のヒドロキシル基を
含んでいる脂肪族化合物であり、好ましくはグリコール、さらに好ましくはプロ
ピレングリコールである。
グリコールは、例えばエタンジオール（エチレングリコール）、プロパンジオ
ール（プロピレングリコール）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ
コールなどのような、二つのヒドロキシル基を含んでいる脂肪族化合物である。
グリセロール（グリセリン）は、一種のアルキレンポリオール、すなわち１，
２，３−プロパントリオールである。
金属塩は、金属イオンと非金属カウンターイオンを含んでいる化合物である。
金属イオンは、分析すべきサンプル中のヘモグロビン（ヘム）、血漿タンパク、
および他の妨害物質の沈澱を提供する金属イオンである。好ましい金属イオンは
、銅、鉄、コバルトおよびモリブデンのイオンを含み、もっと好ましくは銅イオ
ンである。使用される特定の金属イオンは、一部は会合した検体のためのアッセ
イで得られた信号の測定の波長の妨害を回避するように決定される。非金属陰イ
オンは、例示のためそして限定でなく、硫酸、クロライド、ブロマイド等のよう
なハライド、アセテートなどである。
緩衝剤は、一般に約４．５ないし約８．５のｐＫａを有する緩衝剤である。緩
衝剤は、水性成分、そしてそのため本発明の組成物のための所望のｐＨ値範囲の
安定なｐＨが得られるように選択される。緩衝剤は本組成物の成分の安定性に最
小の効果を持つべきであり、そして会合した検体のためのアッセイに使用される
試薬に対し、または一般にアッセイ測定もしくは結果に対して有害な効果を持っ
てはならない。適当な緩衝剤は、ホモピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−エタン
スルホン酸、酢酸塩、クエン酸塩、トリス−ＨＣｌなどである。
本開示の環境において界面活性剤なる術語は、赤血球を破壊することができる
界面活性剤をいう。非イオン界面活性剤は、例えばポリオキシプロピレン（ＢＡ
ＳＦ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，ＮＪからＰｌｕｒｏｎｉ
ｃ ２５Ｒ２として入手し得る）、サポニン、ジギドニン、ポリオキシエチレン
アルコール（例えばＢｒｉｊシリーズおよびＬｕｂｒｏｌ），ポリオキシエチレ
ンｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，Ｔｒｉｔｏ
ｎ Ｘ−１１４およびＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、ポリオキシエチレンソルビ
タンの脂肪酸エステル（例えばＴｗｅｅｎ−２０）、β−Ｄ−オクチルグルコシ
ド、β−Ｄ−ドデシルマルトシド、およびアルキル−Ｎ−メチルグルカミド（す
べてＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
ＯまたはＦｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，スイスまたはＲｏｎｋ
ｏｎｋｏｍａ，ＮＹまたはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ
，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手可能）などのような非イオン性界面活性剤
である。
アニオン性界面活性剤は、例えばアルキル−、アルキルエーテルジアルキルエ
ステル−、アルキルアリール−、およびα−オレフィン−硫酸エステル、スルホ
ン酸、スルホン酸塩、スルホサクシネート、スルホコハク酸、重合アルキルナフ
タレンスルホン酸塩、リン酸エステル、複合リン酸エステルの遊離酸、脂肪族ヒ
ドロキシル化リン酸エステル、硫酸化脂肪酸エステル、ヒマシ油、鯨油、大豆油
、グリセロールトリオレエート、牛脚油、牛脂およびオレイン酸のような硫酸化
油、ｎ−ラウロイル、ｎ−ココイル、ｎ−水素化タロイル、ｎ−混合脂肪酸アシ
ルのようなｎ−脂肪酸グルタメート、カルボキシル化高分子電解質、不均化樹脂
などのようなアニオン界面活性剤である。ありふれたアニオン界面活性剤は、ド
デシル硫酸アトリウムおよびドデシルサルコシンナトリウムを含む。
術語アルキレンは不飽和脂肪族炭化水素例えばエチレンから誘導された有機基
をいう。
抗体は、他の分子へ特異性に結合し、それ故他の分子の特定の立体的および極
性組織に対して相補的であると定義される免疫グロブリンである。抗体はポリク
ローナルまたはモノクローナルであることができ、そして宿主の免疫化、そして
それから採取した血清から既知の技術による免疫グロブリンの分離（ポリクロー
ナル）による、連続ハイブリッド細胞ラインの調製および分泌されたタンパクの
採取（モノクローナル）による、またはクローニングおよび天然抗体の特異的結
合のために必要なアミノ酸配列を少なくともコードするヌクレオチド配列もしく
はその変異体の発現によるような、この分野でよく知られた技術によって製造す
ることができる。抗体は完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含むこ
とができ、Ｉ
ｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ，ＩｇＧ３，ＩｇＭ
等のような種々のクラスおよびイソタイプを含む。それらのフラグメントはＦａ
ｂ，ＦｖおよびＦ（ａｂ’）2，Ｆａｂ’などを含み得る。
抗体を含んでいる抗血清（ポリクローナル）は、ウサギ、モルモットまたはヤ
ギのようなを動物を適切な免疫原で免疫化し、そして適切な待機期間後免疫動物
から抗血清を得ることを含む、良く確立された技術によって得られる。技術の状
態の評論は、Ｐａｒｋｅｒ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｕｒｄｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−
Ｈａｌｌ（Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．，１９７６
）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７：１−２４（１９７５；
Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｎｇ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２：７２
６−７３２（１９７６）；Ｐｌａｙｆａｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂ
ｕｌｌ．３０：２４−３１（１９７４）によって提供される。
抗体は体細胞ハイブリダイゼーション技術によっても得ることができ、そのよ
うな抗体は一般にモノクローナル抗体と呼ばれている。モノクローナル抗体はＫ
ｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２６５：４９５−４９
７の標準的技術によって製造することができる。モノクローナル抗体の評論は、
Ｌｉｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄａｍａｓ，ｅｄ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７８），Ｎａ
ｔｕｒｅ ２６６；４９５（１９７７），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０８：６９２（１
９８０），Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ７３（ＰａｒｔＢ）：３−４６（１９８１）に見られる。適
切な免疫原のサンプルがマウスのような動物に注射され、そして十分な時間の後
、動物がと殺され、膵臓細胞が採取される。代わりに、非免疫動物の脾臓細胞を
インビトロで免疫原に対し感作させることができる。所望の免疫グロブリンのた
めの塩基配列をコードする脾臓細胞染色体は、一般に非イオン界面活性剤例えば
ポリエチレングリコールの存在下ミエローマ細胞ラインと脾臓細胞を融合するこ
とによって圧縮することができる。融合したハイブリドーマを含む生成した細胞
はＨＡＴ培地のような選択培地中で生育することが許容され、生存する死滅しな
い細胞は制限希釈条件を用いてそのような培地内で生育される。細胞は適当な容
器、例えばマイクロタイターウエル中で生育され、そして上清が所望の特異性を
有するモノクローナル抗体についてスクリーニングされる。
ハイブリドーマ細胞をそれらを受入れる哺乳類宿主の腹腔中に注入し、そして
腹水を収穫するような種々の技術がモノクローナル抗体の収量を増加するために
存在する。モノクローナル抗体の不十分な量しか腹水に集まらない場合、抗体は
宿主の血液から収穫される。代わりに、所望の抗体を生産する細胞は中空繊維細
胞培養装置または回転フラスコ装置中で生育させることができ、両者はこの分野
で良く知られている。モノクローナル抗体を他のタンパクおよび他の夾雑物から
単離および精製するための種々の慣用方法が存在する（前出のＫｏｈｌｅｒ ａ
ｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ参照）。
抗体製造のための他のアプローチにおいては、抗体結合部位をコードする配列
を染色体ＤＮＡから切り取り、そして対応する抗体結合部位を有する組み換えタ
ンパクを製造するためのバクテリア中で
発現できるクローニングベクター中へ挿入することができる。
一般に抗体はクロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥクロマトグラフィー、ＡＢ
ｘクロマトグラフィー、濾過などのような既知の技術によって精製することがで
きる。
会合した検体の測定を実施するための試薬はここでは会合した検体のためのア
ッセイに使用される試薬とも呼ばれる。そのような試薬はそのアッセイの性格、
例えばアッセイが不均質かまたは均質かに、結合反応および利用される信号発生
システムの性格、例えば酵素イムノアッセイ、螢光イムノアッセイ、化学ルミネ
ッセンスイムノアッセイ、凝集アッセイなどに依存する。一般に、そのような試
薬は会合した検体の存在および／または量のために実施される正確な測定を許容
する試薬である。
例えば、イムノアッセイのためのそのような試薬は、標識と特異結合ペアメン
バーの一つ、例えば抗体もしくはハプテンとの接合体と、標識がその一部である
信号発生システムの他のメンバー、他の特異結合ペアメンバー、補助材料などを
含むことができる。
標識は、信号を発生する、または発生を誘発し得る任意の分子である。標識は
検体または抗体のような特異結合ペアの一メンバーで、または受容体もしくはリ
ガンド、特にハプテンのような受容体へ結合し得る分子のような他の分子へ接合
することができる。標識は、以下に定義するように、信号発生手段を含んでいる
信号発生システムの一メンバーであることができる。標識は、アイソトープまた
は非アイソトープでよく、非アイソトープが好ましい。例示のためそして限定で
なく、標識は酵素、酵素フラグメント、酵素基質、酵素インヒビター、補酵素、
もしくは触媒のような触媒反応系の一部
が、発螢光団、染料、ケミルミネセンサー、ルミネセンサー、または増感剤のよ
うな発色団の一部、非磁性もしくは磁性であることができる分散し得る粒子、固
相支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテンなどであることができる。
採用することができる多種類の非酵素触媒は米国特許Ｎｏ．４，１６０，６４５
（１９７２）に見られ、その適切な部分をここに参照として取り入れる。そのよ
うな生産物を提供するための多数の酵素および補酵素は、米国特許Ｎｏ．４，２
７５，１４９、カラム１０−２３，および米国特許Ｎｏ．４，３１８，９８０、
カラム１０−１４に指示されており、それらの開示をここに参照として取り入れ
る。多数の酵素組合せは米国特許Ｎｏ．４，２７５，１４９、カラム２３−２８
に記載されており、これら組合せは本発明に使用できる。この開示をここに参照
として取り入れる。
例示的な酵素は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼのようなデヒドロゲナーゼを含
む。オキシダーゼのうちグルコースオキシダーゼがその例である。ペルオキシダ
ーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼが例である。ヒドロラーゼはアルカリ性フォ
スファターゼ、β−グルコキシダーゼおよびリゾチームが例である。
接合体は、単一構造を形成するように、二つ以上のサブユニットが場合により
連結基を介して結合した分子である。結合はサブユニット間の直接の結合（例え
ば化学結合）により、また連結基の使用によって形成することができる化学的相
互作用である。接合は二つのサブユニットが接合体を形成するように連結する任
意のプロセスである。接合プロセスは任意の数のステップからなることができる
。
受容体は、ある分子の特定の立体的および極性組織を認識することができる任
意の化合物または組成物である。分子のこのような組織された区域はエピトープ
もしくは決定子部位と呼ばれる。例示的な天然に存在する受容体は、抗体、酵素
、ＦＡｂフラグメント、ポリ（核酸）、補体成分、すなわちチロキシン結合グロ
ブリン、レクチン、タンパクＡなどを含む。受容体は抗リガンドとも呼ばれる。
シクロスポリンへ特異的に結合する天然受容体も存在する。
リガンドは、その天然受容体が存在するかまたは製造することができる任意の
有機分子である。
特異結合ペアのメンバー（ｓｂｐメンバー）は、他の分子の特定の立体的およ
び極性組織へ特異的に結合する、そしてそのため相補的であると定義される領域
を有する、二つの異なる分子の一方である。特異結合ペアの二つのメンバーはリ
ガンドおよび受容体（抗リガンド）と呼ばれる。これらは通常抗原−抗体のよう
な免疫学的ペアのメンバーであるが、ビオチン−アビジン，ホルモン−ホルモン
受容体、核酸重複体、ＩｇＧ−タンパクＡ，ＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−ＲＮＡな
どは免疫学的ペアではないが、しかし特異結合ペアである。
支持体または表面は、多孔質または非多孔質水溶性材料である。支持体は親水
性であるかまたは親水性にすることができ、シリカ、硫酸マグネシウムおよびア
ルミナのような無機粉；天然ポリマー材料、特に繊維含有紙、例えば濾紙、クロ
マトグラフィー紙等のようなセルロース材料およびセルロースから誘導された材
料；ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド
、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ
（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）などのよう
な合成または修飾天然ポリマー自体またはそれらと他の材料の組合せ；バイオグ
ラスとして入手できるガラス、セラミック、金属などを含む。リポソーム、リン
脂質小胞および細胞のような天然もしくは合成アセンブリも使用することができ
る。使用できる他の材料は前の免疫原キャリア粒子の定義中に記載され、そして
後の信号発生システムの定義中に記載されている。
ｓｂｐメンバーの支持体または表面への結合は、文献に普通に見られる、また
は上の免疫原キャリア粒子の定義中に記載した良く知られた技術によって達成で
きる。表面はストリップ、ロッド、ビーズを含む粒子などの多数の形の一つを持
つことができる。
信号発生システムの機能は、結合したおよび／または結合しない標識の量に関
係した検出し得る信号を提供する生産物を生成することである。信号発生システ
ムは少なくとも一成分が標識である一種以上の成分を持つことができる。信号発
生システムは、標識と信号を発生するように相互作用することができる信号発生
手段を含んでいる、測定できる信号を発生するために要する試薬の全部を含んで
いる。
信号発生システムは、外部手段により、通常電磁線の測定により、望ましくは
肉眼検査により検出できる信号を提供する。一アプローチにおいて、信号発生シ
ステムは発色団基質および酵素を含み、そこでは発色団基質は紫外または可視領
域の光を吸収する染料、発
リン光団または発螢光団へ酵素的に変換される。
信号発生手段は、標識と検出可能な信号を発生するように相互作用することが
できる。そのような手段は、例えば電磁放射線、熱、化学試薬などを含む。化学
試薬を使用する場合、化学試薬のあるものは発色剤溶液の一部として含めること
ができる。化学試薬は、基質、補酵素、エンハンサー、第２の酵素、アクチベー
ター、助因子、インヒビター、スキャベンジャー、金属イオン、信号発生物質の
結合に要する特異結合物質等を含むことができる。補酵素、酵素製品と反応する
物質、他の酵素および触媒のような化学試薬のいくつかは他の分子へ、または支
持体へ結合することができる。
標識を含んでいる信号発生システムは、少なくとも約５０ｎｍで約２５ミクロ
ン以下の、通常少なくとも約１００ｎｍで約２５ミクロン以下の、好ましくは約
０．２ないし５ミクロンの直径の不溶性粒子である一種以上の粒子を含むことが
できる。粒子は有機または無機の、多孔質または非多孔質の、好ましくは大体水
に等しい密度の、一般に約０．７ないし約１．５ｇ／ｍＬの、そして透明の不透
明の、特に透明の材料からなることができる。
さらに、本発明によるアッセイにおいては補助材料をしばしば使用することが
できる。例えば、緩衝剤、それに安定剤、保存剤および／またはアッセイ媒体お
よびアッセイ成分のための抗微生物がアッセイ媒体中にしばしば存在するであろ
う。
会合した検体の測定のための定量的、半定量的および定性的方法は、そのよう
な検体の量の測定方法であると考えられる。例えば、検体を含有することが疑わ
れるサンプル中のそのような検体の存在または不存在を検出する方法は、上の語
句の範囲に含まれると考え
られる。この語句の言及と同じ意味で、会合した検体の量の測定は、会合した検
体の検出または測定、会合した検体の存在の検出または測定、およびそのような
検体の量の検出または測定を含む、以下の非限定的言及である。
本発明の一面は、低級アルコール、ポリヒドロキシ脂肪族化合物、および金属
塩を含んでいる水性成分を含む組成物に関する。本組成物中のアルコールの種類
および量は多数の配慮によって支配される。アルコールは、会合した検体のため
のアッセイに使用される特異結合試薬の結合に対して最小の影響を持たなければ
ならない。また、アルコールは例えば酵素等のような標識のようなアッセイを実
施するための他の試薬の活性に対して最小の影響を持たなければならない。アル
コールの量は、他のサンプル成分からの会合した検体の実質的な抽出を提供する
のに少なくとも十分な量である。アルコールの量は、金属塩の実質な部分、好ま
しくは全部が組成物の溶液中に留まるように十分に低くなければならない。アル
コールの量は、本発明に従ってサンプルを前処理するために用いた時本組成物に
許容できない蒸発速度をもたらす程、または本前処理の間生成する不溶化された
妨害物質の許容できない完全性を生ずるほど大きくない。一般に、不溶化された
妨害物質は本前処理の途中期間でペレットを生成する。ペレットの完全性は、サ
ンプル溶液をペレットから分離する時、妨害物質の有意量が除去されることを許
容しないようでなければならない。一般に、組成物中のアルコールの量は約３０
％ないし約４０％，好ましくは約３３％ないし約３７％，さらに好ましくは約３
５％ｗ／ｖである。好ましくは具体例においては、アルコールはメタノールであ
り、それは約３３％ないし約３５％ｗ／
ｖの量で存在する。
ポリヒドロキシ脂肪族化合物は、本組成物のサンプルとの速い混合を提供し、
最小の全体取扱い時間が実現されるような量で存在しなければならない。望まし
くは、ポリヒドロキシ脂肪族化合物の量は、本組成物の粘度が前処理されるサン
プルの粘度付近とするのに十分である。サンプルが全血の場合、本発明の組成物
の粘度は理想的には全血の粘度付近でなければならない。この方法において、サ
ンプルおよび組成物は速かにそして容易に混合される。ポリヒドロキシ脂肪族化
合物の量は、抽出される検体と一所にヘモグロビンまたは他の妨害物質の抽出を
生ずるのに十分に大きくはならない。通常、ポリヒドロキシ脂肪族化合物は、約
２０％ないし約４０％，好ましくは約２７％ないし約３３．３％，もっと好まし
くは約３０％ないし３３．３％ｗ／ｖの量で存在する。好ましい具体例において
は、ポリヒドロキシ脂肪族化合物はプロピレングリコールであり、約３０％ない
し３３．３％ｗ／ｖの量で存在する。
水性成分の量は、一般にアルコールおよびポリヒドロキシ脂肪族化合物に基づ
く不足量によって決定される。水性成分の量は、本発明組成物中の金属塩の沈澱
を最小にするために少なくとも必要な量である。通常、水性成分は少なくとも３
０％，好ましくは約３０％ないし約４０％，もっと好ましくは約３３％ないし約
３８％，さらに好ましくは約３３．３％ないし約３６％ｗ／ｖの量で存在する。
水性成分中に存在する金属塩の量は、分析すべきサンプル中のヘモグロビンおよ
び他の妨害物質の実質部分を沈澱するのに少なくとも十分である。しかしながら
金属塩の量は分析に使用されるアッセイ試薬の活性に対して有意な影響を生ずる
のに十分なほど多くてはな
らない。特に、金属イオン濃度は、信号発生システムの一部として使用される標
識例えば酵素の活性に対して有害な効果を有するほど大きくてはならない。一般
に銅塩は、約２０ｍＭないし約３０ｍＭ，好ましくは約２３ｍＭないし約２７ｍ
Ｍ，さらに好ましくは約２５ｍＭの濃度である。
水性組成物は緩衝剤または非イオンもしくはアニオン界面活性剤のような一種
以上の他の試薬を含むことができる。緩衝剤の濃度は重要ではない。一般に、本
発明の最終組成物のための望ましいｐＨを得る最低濃度が選択される。緩衝剤の
濃度は、抽出したサンプルをアッセイ実施のため他の試薬と混合した時、会合し
た検体のためのアッセイに使用されるそのような他の試薬のために必要とするｐ
Ｈを相殺するほど高くてはならない。緩衝剤の量は、水性成分のための、それ故
本発明の組成物のための望ましい範囲内の安定したｐＨが得られるように選択さ
れる。緩衝剤の濃度は本発明組成物の成分の安定性に最小の影響を持つべきであ
り、そして会合した検体のためのアッセイにおいて使用される試薬に対して、ま
たは一般にアッセイ測定または結果に対して有害な効果を持ってはならない。緩
衝剤は通常約０．５ｍＭないし約２０ｍＭ，好ましくは約０．８ｍＭないし約１
９ｍＭ，もっと好ましくは約１ないし１８．５ｍＭの量で存在する。
界面活性剤濃度は、会合した検体の実質的抽出を実現し、そして分析すべきサ
ンプル中に存在する細胞の実質的破裂を生ずるように十分でなければならない。
さらに、界面活性剤の性質およびその濃度は、会合した検体のためのアッセイに
おいて得られる結果の一貫性を提供しなければならない。通常、界面活性剤は約
０．００５％
ないし約０．２％，好ましくは約０．０１％ないし約０．１％，もっと好ましく
は約０．０１％ｗ／ｖの量で存在する。
組成物の最終ｐＨは、会合した検体のアッセイに使用される試薬に有害な効果
を持つほど低くてはならず、またｐＨは金属イオンの有意な沈澱を発生するほど
高くてはならない。組成物のｐＨは主として水性成分のｐＨに依存する。通常、
水性組成物のｐＨは約２．０ないし約４．６，好ましくは約３．０ないし４．６
，もっと好ましくは約４．０ないし約４．４，さらに好ましくは約４．３である
。緩衝剤の量およびそのｐＫａは一般に最終ｐＨを決定するが、しかしこの点に
関して組成物の他の成分も考慮に入れなければならない。水性成分をアルコール
およびポリヒドロキシ脂肪族化合物と合併する時、組成物全体のｐＨに僅かにｐ
Ｈ変化があるであろう。一般に、混合物のｐＨは大体０．１ないし0.3，通常０
．１ないし０．２ｐＨ単位だけ水性成分のpHから低下するであろう。
本発明組成物への保存剤、抗微生物剤またはキレート剤の添加は必要ないが、
このような剤は本発明組成物の機能を妨害することなしに前処理組成物へ含めて
もよい。本組成物へ含めることができるような補助剤の例は、アジ化ナトリウム
、ＥＤＴＡおよびストレプトマイシンを含むがこれらに限らない。
本発明の組成物は、通常使用の便利のため単一容器に包装される。しかしなが
ら組成物の成分は別々の容器に提供してもよい。この点に関し、低級アルキルア
ルコール、ポリヒドロキシ脂肪族化合物および水性成分は、それぞれ別の容器に
包装することができ、またはこれら成分の二つを残りの成分と別に合併して包装
してもよい。さらに本発明の組成物は、適切な混合および使用のための指示書を
添付して一つ以上の容器に包装することができる。
本発明の組成物の好ましい具体例は、約３０％ないし約４０％ｗ／ｖの量のメ
タノールと、約２０％ないし約４０％ｗ／ｖのプロピレングリコールもしくはエ
チレングリコールと、そして水性成分約３０％ないし約４０％ｗ／ｖを含み、水
性成分は銅塩約２０ｍＭないし約３０ｍＭと、緩衝剤約０．５ｍＭないし約２０
ｍＭと、非イオン界面活性剤約０．００５％ないし約０．１％ｗ／ｖを含み、ｐ
Ｈ３．０ないし約４．６を有する。
本発明の他の一面は、会合した検体の含有する疑いのあるサンプル中の、免疫
抑制剤例えばシクロスポリンのような会合した検体の測定のためのアッセイの改
良である。このアッセイは、会合した検体を含有する疑いのあるサンプルを前処
理試薬と接触させることと、サンプルを検体の測定のための試薬と接触させるこ
とと、そして測定結果を解析することよりなる。改良は、前処理試薬として上の
組成物の一つを使用することである。本発明組成物は、前処理組成物中の金属と
して銅イオンの使用のため、特にＥＭＩＴTMアッセイフォーマットと両立可能で
ある。銅の使用はＥＭＩＴTMアッセイシステムと特に両立し得るが、他の金属イ
オンはＥＭＩＴTMアッセイによる検体の検出を妨害する傾向があることが驚くべ
きことに観察された。ＥＭＩＴTMアッセイシステムは、シクロスポリンを含むが
それに限定されない種々の検体の検出のために使用し得る。ＥＭＩＴTMアッセイ
フォーマットまたは酵素増幅イムノアッセイ技術は、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ
．Ｅ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｒ．Ｓ．，Ｕｌｌｍａｎ，Ｅ．Ｆ．”Ｈｏｍｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ”酵素イノムアッセイにより紹介された均質競合酵素イムノアッセ
イである、新
しい免疫化学技術である。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
ｕｎ．４７：８４６，１９７２参照。この技術は、抗体へ結合した標識抗原を未
結合標識抗原から分離することを回避する。それは抗体が酵素標識抗原もしくは
接合体へ結合した時、特異性酵素活性の変化に依存する。分離しないアッセイ混
合物の活性は抗体が結合した接合体の量に比例する。
アッセイ実施のための技術の一つの広いカテゴリーは、検体のための受容体の
使用を含んでいる。受容体による結合の観察される効果は使用される標識に依存
するであろう。ある場合には、受容体の結合は単に結合および未結合標識リガン
ド間に分子量における差別を提供する。他の場合においては、受容体の結合は遊
離標識リガンドから結合標識リガンドの分離を容易化するか、または信号が標識
リガンドへ結合した受容体の量に応じて変化するように標識から得られる信号の
性質に影響し得る。別の変法は、受容体が二つの標識で標識され、それにより標
識が近接接近にある時相互作用し、そして存在するリガンドの量は受容体の標識
が相互作用し得る程度に影響する方法である。測定結果の分析は、その時標識の
性質に基づいている。従って酵素標識については、酵素活性が測定され、螢光ラ
ベルについては螢光の量が測定される等々である。
受容体を含んでいるアッセイの一特定具体例は、受容体が抗体のような免疫反
応剤であり、そして免疫複合体がサンプル中の存在する検体の存在または量に関
連して生成される。測定結果の分析は一般に免疫複合体の検出を含んでいる。免
疫複合体は、例えば使用される抗体のような免疫試薬が標識へ接合している場合
、直接検出することができる。免疫複合体は、信号発生システムに対する免疫複
合体生成の影響を調べることにより、またはアッセイに使用される免疫試薬に対
し特異結合する標識受容体の使用により、間接的に検出される。
本発明のアッセイは、会合した検体のためのすべてのイムノアッセイに対し適
用し得る。このアッセイはアッセイ成分または生成物の分離なし（均質）または
分離あり（不均質）のどちらにも実施することができる。不均質アッセイの例は
、酵素連結免疫吸着体アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような酵素連結イムノアッセイ
である。Ｅｄｗａｒｄ Ｔ．Ｍａｇｇｉｏ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃｏｒｐ
ｒａｔａｔｅ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９８０による”Ｅｎ
ｚｙｍｅ−Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”を見よ。均質イムノアッセイは、酵素増幅
イムノアッイセ技術（例えば米国特許Ｎｏ．３，８１７，８３７を見よ）、米国
特許Ｎｏ．３，９９３，３４５に開示されているような免疫螢光法、米国特許Ｎ
ｏ．４，２３３，４０２に開示されているような酵素チャンネリング技術、およ
び前出Ｍａｇｇｉｏで論じている他の酵素イムノアッセイが例である。上の特許
の開示を、言及した特定のアッセイの説明としてそれらの全体を参照としてここ
に取り入れる。
分析すべきサンプルは本発明組成物で処理される。それ故サンプルは本発明に
よる組成物と混合される。通常、サンプルは本組成物の過剰、通常サンプル１０
０ｍＬあたり組成物約１００ないし５００ｍＬ，好ましくは約２００ないし４０
０ｍＬ，もっと好ましくは約２５０ないし３５０ｍＬと混合される。前処理は約
１５ないし３０℃，好ましくは約２０ないし２５℃の温度、もっと好ましくは環
境温度において実施される。サンプルおよび本組成物は約１０秒な
いし約５分、好ましくは約０．５ないし３分、もっと好ましくは約１ないし３分
間インキュベートされる。一般に前処理はアッセイ実施のための試薬の添加前に
実施される。しかしながら、アッセイ実施のための一種以上の試薬が、試薬の性
質またはアッセイが許容する場合、前処理組成物と共存する状況があり得る。次
に、処理したサンプルは通常環境温度において媒体中の固体が塊を形成するのに
十分でありそしてそれを強制する期間、通常約２分ないし６分間１０，０００な
いし２５，０００の相対的遠心力において遠心へかけられる。媒体は次に固体塊
から分離される。
サンプルを本発明による前処理をした後またはそれと同時に、会合した検体の
ためのアッセイが実施される。一種以上の試薬が前処理したサンプルを含む水性
媒体へ添加される。検体のためのアッセイは通常緩和なｐＨ，一般に最適アッセ
イ感度を提供するｐＨに緩衝化した水性媒体中で実施される。水性アッセイ媒体
は水だけ、または０ないし４０体積％の共溶媒を含んでもよい。媒体のｐＨは通
常約４ないし１１，もっと普通には約５ないし１０，好ましくは約６．５ないし
９．５の範囲内であろう。ｐＨは通常特異結合ペアの結合メンバーの最適結合と
、そして信号発生システムのメンバーのようなアッセイの他のメンバーのための
最適ｐＨの間の妥協である。
所望のｐＨを達成しそして測定中アッセイ媒体のｐＨを維持するため種々の緩
衝剤を使用することができる。例示的緩衝剤はホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ト
リス、バルビタール等である。使用する特定の緩衝剤は本発明にとって重要でな
く、個々のアッセイにおいて一つまたは他の一つが好ましいである。
通常アッセイを実施するため緩和な温度が、そして率測定のためには測定期間
中コンスタントな温度が使用される。インキュベーション温度は通常約１５ない
し４５℃，もっと普通には約１５ないし４０℃の範囲内であろう。測定中の温度
は一般に約１０ないし５０℃，もっと普通には約１５ないし４０℃であろう。
アッセイし得る検体の濃度は、一般に約１０-5ないし１０-13Ｍ，もっと普通
には約１０-6ないし１０-8Ｍを変動するであろう。アッセイが定性的か、半定量
的かまたは定量的（サンプル中に存在するシクロスポリンの量に関して）のよう
な配慮、特定の検出技術および検体の濃度が通常種々の試薬の濃度を決定するで
あろう。さらに、キットは随意に好適な混合および使用のための指示書を含むこ
とができる。
アッセイ媒体中の種々の試薬の濃度は一般に検体の関心ある濃度範囲によって
決定されるであろうが、各試薬の最終濃度は通常その範囲についてアッセイの感
度を最適化するため実験的に決定されるであろう。すなわち、検体濃度の有意な
変動は正確に測定可能な信号差を提供しなければならない。
アッセイを実施するための試薬の添加順序は大幅に変化することができるが、
アッセイの性質に応じて一定の優先性が存在するであろう。添加の最も簡単な順
序はすべてのアッセイ試薬を同時に添加し、そして均質アッセイのようにアッセ
イ媒体が信号に対して有する効果を測定することによって結果について分析する
ことである。代わりに、試薬は逐次的に混合することができる。場合により、イ
ンキュベーションステップを各添加の後に、一般に約３０秒ないし６時間、もっ
と普通には約１分ないし１時間含めることができる。
本発明の他の一面は、薬物含有の疑いあるサンプル中の免疫抑制薬物の測定の
ためのアッセイにおける改良である。このアッセイは、サンプルを特異結合メン
バーの一つと接触させることと、そして特異結合メンバーの薬物への結合を測定
することよりなる。本改良は、サンプルを前記接触ステップの前または同時に、
上の組成物の一つと接触させることよりなる。
本発明の他の一面は、薬物含有の疑いあるサンプル中の免疫抑制薬物の測定の
ためのアッセイにおける改良である。このアッセイは、サンプルを該薬物に対す
る抗体、および標識と該抗体により認識される化合物との接合体と接触させるこ
とと、標識接合体と抗体と免疫複合体を検出することよりなる。改良は、サンプ
ルを本発明に従った組成物と接触させることよりなる。
本発明の他の一面は、包装した組合せにおいて、（ａ）会合した検体の測定を
実施するための一種以上の試薬と、そして（ｂ）本発明に従った組成物よりなる
キットである。本発明の融通性を高めるため、試薬は包装した組合せ中に、試薬
の量比が方法およびアッセイの実質的最適化を提供するように、同じまたは別々
の容器中に提供されることができる。試薬は各自別々の容器内でもよく、または
種々の試薬は試薬の交差反応性および安定性に応じて一つ以上の容器に合併する
ことができる。
キット中の種々の試薬の相対量は、本方法の間発生することを要する反応を実
質上最適化する試薬の濃度を提供するため、そしてアッセイの感度を実質上最適
化するため、広く変化することができる。適切な状況下、キット中の一種以上の
試薬は、溶解した時本発明
に従った方法またはアッセイを実施するための適切な濃度を有する試薬溶液を提
供する補助剤を含んでいる乾燥粉末、通常凍結乾燥品として提供することができ
る。キットはさらに、上に記載した本発明に従った方法の説明書を含むことがで
きる。
実施例
本発明は以下の例証実施例によってさらに説明される。部および％は特記しな
い限り重量／体積（ｗ／ｖ）による。温度は特記しない限り摂氏である。試薬
メタノールおよびエチレングリコール−Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｎｉｓ，ＭＯ
プロピレングリコール−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗ
ａｕｋｅｅ，ＷＩ
ＨｏｍｏｐｉｐｅｓTM緩衝剤−ホモピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス−２−エタンス
ルホン酸、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ
，ＯＨ
硫酸銅５水塩およびトリス−ＨＣｌ−Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ，ＲｏｎｋｏｎＲｏｍａ，ＮＹ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ２５Ｒ２TM−ＢＡＳＦ Ｃｈｅｎｒｉｃａｌｓ，Ｍｏｕｎｔ
Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ
実施例１ シクロスポリンのアッセイ
Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃ
ａｌｉｆｏｒｕｉａによって製造されたＥＭＩＴTMシクロポリン特異的アッセイ
キットと、試薬ＡおよびＢを含んでいるＰａｒｔ Ｎｏ．６Ｒ０１９ＵＬを使用
して、シクロスポリンのた
めのアッセイが実施された。使用した較正液はＢｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｉｎｉａによって製造
されたＰａｒｔ Ｎｏ．６Ｒ１１９ＵＬであった。製造者の指示を追従した。ア
ッセイはＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ分析機で実施された。
アッセイ実施前に、サンプルは本発明に従って前処理された。従って、全血サ
ンプル１００μＬと、６較正液が各自以下の前処理組成物３００μＬで別々に処
理された。
メタノール（３５％）、プロヒレングリコール（２９％）、１ｍＭ Ｈｏｍｏ
ｐｉｐｅｓTM生物学的緩衝剤（ｐＫａ＝４．６），２５．０ｍＭ硫酸銅（５水塩
）および０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ２５Ｒ２TM非イオン界面活性剤，ｐＨ＝
４．３を含んでいる水性成分（３６％）
各サンプルまたは較正液と前処理組成物は混合して５００ないし１０００ｒｐ
ｍにおいて環境温度で１０秒以上の期間渦によって処理された。上の処理の後、
混合物環境温度において２分以上インキュベートされ、次に混合物は２分以上相
対的遠心力（ｒｃｆ）２０，８００において遠心された。分析機上で、得られた
前処理サンプル２７．５μＬを上のＥＭＩＴアッセイキットの試薬Ａと７５秒間
インキュベートした。その後ＥＭＩＴアッセイキットの試薬Ｂ７５μＬを加えた
。１７５秒インキュベーション後、酵素活性（薬物濃度の関数）を３４０ｎｍに
おいて１００秒間ＮＡＤＨの生成を分光光度的に追跡することによってモニター
した。
合計６０サンプルおよび６較正液をＥＭＩＴアッセイキットを使用して上に記
載したように前処理し、アッセイした。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ 分析機上のアッセイパラメーター
アッセイ温度 ３７℃
波長 ３４０ｎｍ
前処理したサンプルの体積 ３７．５μＬ
希釈液体積（水） ４７．５μＬ
試薬Ａ体積 １５５μＬ
インキュベーション時間（サンプル＋試薬液） ７５秒
試薬Ｂ体積 ７５μＬ
遅延時間（サンプル＋試薬Ａ＋試薬Ｂ） １７５秒
読取り時間 １００秒
アッセイ標準曲線範囲は５００ｎｇ／ｍＬまで延長された。この曲線範囲内の
分析回収率は９０から１００％まで変動した。３レベルの対照での作業内精度は
３．２ないし３．９％ＣＶの範囲であった。
結果を以下の表に要約する。 ＊ 調整した正味吸光度；抽出率は標本から抽出された検体の量に関係する吸光
度の変化を表わす。
＊ 本発明に従って前処理、メタノール抽出カーブから定量化、抽出率は抽出さ
れた検体の量である。
対照として、上のアッセイ方法をメタノール前処理を用いて繰り返した。全血
サンプル１００μＬと６較正液は各自別々にメタノール２００μＬと渦巻き混合
された。インキュベーションおよび遠心は前のとおり。上清をアッセイの残りを
実施するための前処理したサンプルとして使用した。アッセイ標準曲線は５００
ｎｇ／ｍＬま
で延長された。この曲線範囲の分析回収率は８９から１０２．５％まで変動した
。３レベル対照での作業内精度は２．８から７．５％ＣＶの範囲であった。同じ
対照による作業間精度は５．３から１５．８％ＣＶの範囲であった。
実施例２ Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６）のアッセイ
Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓのアッセイをシクロスポリンのための実施例１に記載し
た方法と同様な方法を用いて実施した。
Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓサンプルは、メタノール中のｔａｃｒｏｌｉｍｕｓのス
トック溶液を添加した２５ないし４００ｎｇ／ｍＬ血液溶血物に調製した。各サ
ンプルの混合後、部分標本を採取し、抽出へかけた。加えて、ｔａｃｒｏｌｉｍ
ｕｓ較正液は、メタノール中のｔａｃｒｏｌｉｍｕｓストック溶液を直接添加し
、メタノールを用いて（溶血物なし）６．２５ないし１００ｎｇ／ｍＬ（上と同
じ濃度プラス適応する希釈係数）に調製した。
アッセイを実施する前に、ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ添加サンプルを本発明に従っ
て前処理した。従ってｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ添加溶血物１００μＬと６較正液は
各自別々に以下の前処理組成物で処理された。
メタノール（３５％），プロピレングリコール（３９％）、１ｍＭ Ｈｏｍｏ
ｐｉｐｅｓTM生物学的緩衝剤（ｐＫａ＝４．６）、２５．０ｍＭ硫酸銅（５水塩
）および０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ２５Ｒ２TM，ｐＨ＝４．３を含む水性成分
（３６％）
加えて、メタノールを用いて参照抽出を実施した。従って、ｔａｃｒｏｌｉｍ
ｕｓ添加溶血物１００μＬは各自別々にメタノール３００μＬで処理された。ア
ッセイの残りは実施例１に記載したよう
に実施した。酵素結合体は、その適切な記載を参照としてここに取り入れる米国
特許Ｎｏ．４，７２７，０２２に記載されている方法と同様に調製した。使用し
た抗体は標準的なハイブリッド細胞技術（前出Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓ
ｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅを見よ）によって調製したｔａｃｒｏｌｉｍｕｓに対す
るモノクローナル抗体であった。結果を以下の表に要約する。
＊ 調節した正味吸光度；抽出率は標本から抽出された検体の量に関係する吸光
度の変化を表わす。
＊ 本発明に従って前処理，メタノール抽出曲線から定量化
このｔａｃｒｏｌｉｍｕｓに対する結果を図１にグラフとして示す。
実施例３ シクロスポリンのアッセイ
前に記載したＥＭＩＴTMシクロスポリン特異アッセイキットを使用してシクロ
スポリンのアッセイを実施した。
アッセイを実施する前に、サンプルを本発明に従って前処理した。従って、全
血サンプル１００μＬと６較正液は各自別々に以下の前処理組成物３００ｍＬで
処理された。
メタノール（３３．３％），エチレングリコール（３３．３％）、および１８
．３ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＫａ＝７．８），２５．０ｍＭ硫酸銅（５水塩）、
０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ２５Ｒ２TM，０．３３ｍＭ ＥＤＴＡ，アジ化ナ
トリウム（０．０３３％）、ストレプトマイシン（０．００１７％），ｐＨ＝４
．５を含んでいる水性成分（３３．３％）
各サンプルまたは較正液は前処理組成物と混合し環境温度で１０秒以上の期間
５００ないし１０００ｒｐｍにおいて渦混合された。上の処理後、混合物を環境
温度で２秒以上インキュベートし、次に混合物を２０，８００相対遠心力（ｒｃ
ｆ）において２秒以上遠心した。分析機上で、生成する前処理サンプル２７．５
μＬを上のＥＭＩＴアッセイキットの試薬Ａ１５５μＬと７５秒間インキュベー
トした。その後ＥＭＩＴアッセイキットの試薬Ｂ ７５μＬを加えた。１７５秒
インキュベーション後、酵素活性（薬物濃度の関係）を３４０ｎｍにおいて１０
０秒間ＮＡＤＨの生成を分光光度的に追従することによってモニターした。
６較正液から各自誘導された合計１０曲線を本発明および参照としてメタノー
ルについて発生させた。これらサンプルはＥＭＩＴアッセイを用いて上に記載し
たように前処理され、アッセイされた。ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ 分析機上のアッセイパラメーター
アッセイ温度 ３７℃
波長 ３４０ｎｍ
前処理サンプル体積 ２７．５μＬ
希釈液体積（水） ４７．５μＬ
試薬Ａ体積 １５５μＬ
インキュベーション時間（サンプル＋試薬Ａ） ７５秒
試薬Ｂ体積 ７５μＬ
遅延時間（サンプル＋試薬Ａ＋試薬Ｂ） １７５秒
読取り時間 １００秒
結果を以下の表に要約する。
＊ 調節した正味吸光度、抽出率は標本から抽出された検体の量に関係する吸光
度の変化を表わす。
対照として、上のアッセイ方法をメタノール前処理を用いてくり返した。全血
サンプル１００μＬと、６較正液は各自別々にメタノール２００μＬと渦混合さ
れた。インキュベーションおよび遠心は上と同じ。上清をアッセイの残りを実施
するための前処理したサンプルとに用いた。アッセイ標準曲線範囲は５００ｎｇ
／ｍＬまで延長された。この曲線範囲内の分析回収は１１２から１２８％まで変
動した。３レベルの対照についての作業内精度は２．８ないし７．５ＣＶの範囲
内であった。同じ対照による作業間精度は５．３ないし１５．８％ＣＶであった
。
実施例４ Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ（ＦＫ５０６）のアッセイ
シクロスポリンのための実施例３に記載した方法と同様な方法を用いてｔａｃ
ｒｏｌｉｍｕｓのアッセイを実施した。
Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓサンプルは、メタノール中のｔａｃｒｏｌｉｍｕｓのス
トック溶液を添加した２５ないし４００ｎｇ／ｍＬ血液溶血物に調製した。各サ
ンプルの混合後、部分標本を採取し、抽出へかけた。加えて、ｔａｃｒｏｌｉｍ
ｕｓ較正液は、メタノール中のｔａｃｒｏｌｉｍｕｓストック溶液を直接添加し
、メタノールを用いて（溶血物なし）６．２５ないし１００ｎｇ／ｍＬ（上と同
じ濃度プラス適応する希釈係数）に調製した。
アッセイを実施する前に、ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ添加サンプルを本発明に従っ
て前処理した。従ってｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ添加溶血
物１００μＬと６較正液は各自別々に以下の前処理組成物で処理された。
メタノール（３３．３％），エチレングリコール（３３．３％）、および１８
．３ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＫａ＝７．８），２５．０ｍＭ硫酸銅（５水塩）、
０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ２５Ｒ２TM，０．３３ｍＭ ＥＤＴＡ，アジ化ナ
トリウム（０．０３３％）、ストレプトマイシン（０．００１７％），ｐＨ＝４
．５を含んでいる水性成分（３３．３％）
加えて、メタノールを用いて参照抽出を実施した。従って、ｔａｃｒｏｌｉｍ
ｕｓ添加溶血物１００μＬは各自別々にメタノール３００μＬで処理された。ア
ッセイの残りは実施例１に記載したように実施した。酵素結合体は、その適切な
記載を参照としてここに取り入れる米国特許Ｎｏ．４，７２７，０２２に記載さ
れている方法と同様に調製した。使用した抗体は標準的なハイブリッド細胞技術
（前出Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅを見よ）によっ
て調製したｔａｃｒｏｌｉｍｕｓに対するモノクローナル抗体であった。結果を
以下の表に要約する。
＊ 調節した正味吸光度；抽出率は標本から抽出された検体の量に関係する吸光
度の変化を表わす。
＊ 本発明に従って前処理，メタノール抽出曲線から定量化、抽出率を抽出され
た検体の量である。
本発明をその特定具体例に関して記載したが、本発明の真の精神および範囲か
ら逸脱することなく種々の変更を加え、均等物で置換
できることは当業者により理解され、そして自明であろう。加えて本発明の目的
、精神および範囲に対し、特定の状況、材料、組成物、プロセスステップル適応
するための多数の修飾を加えることができる。すべてのそのような修飾は請求の
範囲内であることが意図される。
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(72)発明者 プファイファー，マチアス
ドイツ連邦共和国デー82541、ミュージン
ク−アンバッハ、ワルデマール−ボンゼル
スウエッグ11
(72)発明者 ロス，スチーブン エイチ
アメリカ合衆国95020カリフォルニア、ギ
ルロイ、ジョージタウンプレース745
(72)発明者 ジエオング，ヘンリー
アメリカ合衆国94306カリフォルニア、パ
ロアルト、ミドルフィールドロード3396