KR101962252B1

KR101962252B1 - 전체 분석물 농도의 결정

Info

Publication number: KR101962252B1
Application number: KR1020147034328A
Authority: KR
Inventors: 티 큐. 웨이
Original assignee: 지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크.
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2019-03-26
Also published as: JP6388861B2; ES2704404T3; US9658218B2; WO2013169689A1; US20130295592A1; EP2847588A4; EP2847588B1; EP2847588A1; JP2015516576A; KR20150034687A

Abstract

내생성 방해 물질들의 존재 하에 분석물을 함유할 것으로 의심되는 미지 샘플에서 분석물의 전체 양을 결정하기 위한 방법 및 시약이 기재된다. 본 방법은 분석물을 위한 검정을 이용하여 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물 부분의 양 [Y]를 측정하는 것을 포함한다. 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물의 양 [Z]는 식 [Z] = a[Y] + b에 의해 결정되며, 상기 식에서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플에 대해 검정을 수행함으로써 사전결정된다. [Y]와 [Z]를 더하여, 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]를 산출한다.

Description

전체 분석물 농도의 결정{DETERMINATION OF TOTAL ANALYTE CONCENTRATION}

본 발명은 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플(sample)에서 분석물의 농도를 결정하기 위한 방법 및 키트(kit)에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 통상적인 면역검정의 포맷(format)에서 오신호(false signal)들의 발생에 참여하는 방해 물질들의 존재 하에 미지 샘플들에서 분석물 농도를 결정하는 것에 관한 것이다.

신체(body)는 자신(self)과 비-자신(non-self)을 구별하기 위해 복잡한 면역 반응 시스템(immune response system)에 의존한다. 때로는, 신체의 면역 시스템은 부족한 반응을 증가시키거나 과도한 반응을 억제하기 위하여 제어되어야 한다. 예를 들어, 신장, 심장, 심장-폐, 골수 및 간과 같은 장기들이 인간에서 이식될 때에, 신체는 종종 동종이식 거부(allograft rejection)로서 지칭되는 공정에 의해 이식된 조직을 거부할 것이다.

동종이식 거부를 치료하기 위하여, 면역 시스템은 흔히 약물 요법과 함께 제어된 방식으로 억제된다. 면역억제 약물들은 비-자기 조직의 동종이식 거부를 막는데 도움을 주기 위해 이식 수용체들에 조심스럽게 투여된다. 이식 환자들의 장기 거부를 방지하기 위한 가장 일반적으로 투여되는 두 가지 면역억제 약물들에는 사이클로스포린(Cyclosporine)(CSA) 및 FK-506(FK 또는 타크로리무스(tacrolimus))이 있다. 미국 및 다른 국가들에서 면역억제제로서의 사용이 확인된 다른 약물에는 시롤리무스(sirolimus)가 있는데, 이는 또한 라파마이신(rapamycin)으로서 알려져 있다. 시롤리무스의 유도체들이 또한, 면역억제제로서 유용하다고 한다. 이러한 유도체들은 예를 들어, 에베롤리무스(Everolimus), 등을 포함한다.

일부 면역억제 약물들과 관련한 부작용들은 환자에게 존재하는 약물의 수준을 조심스럽게 조절함으로써 어느 정도는 조절될 수 있다. 혈액 중의 면역억제 약물들 및 관련된 약물들의 농도의 치료학적 모니터링(monitoring)은 최소 독성과 함께 최대 면역억제를 확보하도록 투약 요법(dosing regime)을 최적화하기 위해 요구된다. 면역억제 약물들이 고도로 효과적인 면역억제제이지만, 효과적인 투약 범위가 종종 좁고 과도한 투여량이 심각한 부작용을 초래할 수 있기 때문에, 이들의 사용은 조심스럽게 관리되어야 한다. 다른 한편으로, 면역억제제의 투여량이 너무 적은 경우에는 조직 거부를 야기시킬 수 있다. 면역억제 약물의 분포 및 대사가 환자들 간에 크게 달라질 수 있기 때문에 그리고 광범위한 부작용(adverse reaction) 및 이의 중증도(severity)로 인하여, 약물 수준의 정확한 모니터링이 필수적이다.

치료 약물 모니터링 분야에서, 모 약물의 대사물에 대해 모 약물(parent drug)을 선택적으로 검출하는 것은 종종 면역검정을 디자인하기(designing) 위한 중요한 목적이다. 이는 특히 면역억제 약물에 대해서 그러하다. 이러한 이유로, HPLC 탠뎀(tandem) MS 검정은 모 약물을 선택적으로 측정하는 이들의 능력으로 인하여, 시롤리무스, 타크로리무스 및 다른 면역억제 약물들을 측정하기 위한 표준 방법들이 된다. 그러나, 상기 방법들은 고가이고 시간-소비적이고, 종종 초기 결정으로서 실험실에서 사용되는 것 보다 다른 검정 방법에 의해 얻어진 긍정적인 결과들을 확인하기 위해 이용된다.

면역억제 약물들에 대한 여러 전혈 검정들은 혈액 성분들로부터 약물을 추출하기 위하여 시약들을 사용하는 수작업 단계(manual step)를 필요로 한다. 약물 분자들 및 약물 대사물 분자들은 내생성 결합 단백질들로부터 분리되고, 비교적 깨끗한 용액으로 추출되는데, 여기서 혈장 단백질들 및 지질단백질 입자들, 뿐만 아니라 대부분의 다른 분자들이 제거된다. 대개 침전 기술들이 사용되기 때문에, 추출된 샘플(sample)에는 기본적으로 면역검정 성분들에 대한 결합 단백질 및 검정 신호를 방해할 수 있는 다른 물질 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 대부분의 혈액 거대분자들이 존재하지 않는다. 이에 따라, 추출된 샘플들에서, 모 약물 및 이의 대사물은 결합되지 않은 개개 분자들로서 용해되고, 면역반응 혼합물에서 검정 항체와의 반응을 위해 서로 경쟁한다. 약물에 대한 검정 항체의 결합은 이러한 검정에서 대부분의 내생성 결합 물질들의 부재 하에 일어난다. 약물 대사물의 교차-반응성은 이러한 검정에서 이의 항체 결합 친화력에 거의 의존적이다.

혈액 성분들로부터 약물의 수작업 추출 또는 분리가 존재하지 않는 면역억제 약물에 대한 균일 검정(homogeneous assay)에서, 면역억제 약물에 대한 항체는 대부분 또는 모든 혈액 성분들의 존재 하에 약물을 검출해야 하는데, 이의 존재는 예를 들어 면역억제 약물에 대한 항체에 의한 것과 같이, 검정 결과에 개입할 것이고, 이에 따라 틀린 검정 결과를 초래하거나 혈액 샘플 중의 실제 약물 농도의 측정을 방해할 것이다.

이에 따라, 환자로부터 취해진 샘플들에서 분석물들의 수준을 측정하는 빠르고 정확한 진단 방법들을 개발하는 것이 지속적으로 요구되고 있다. 이러한 방법들은 완전 자동화 가능하고 심지어 다양한 방해 물질들을 갖는 샘플들에 대해 수행될 때에도 정확하여야 한다. 이러한 검정은 샘플 중에 존재하는, 방해 물질들, 특히 비-특이적 방해 물질들로부터 초래되는 부정확성을 최소화하면서, 샘플 중의 분석물의 양의 정확한 측정을 제공하여야 한다.

본원에 기술된 원리들에 따른 일부 예는 미지 샘플에 잠재적으로 존재하는 내생성 방해 물질들의 존재 하에 분석물을 함유할 것으로 의심되는 미지 샘플에서 분석물의 전체 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 분석물에 대한 검정을 이용하여 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물 부분(결합된 분석물)의 양 [Y]를 측정하는 것을 포함한다. 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 미지 분석물(자유 분석물)의 양 [Z]는 식 [Z] = a[Y] + b (여기서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플들에 대해 검정을 수행함으로써 사전결정됨)에 의해 결정된다. [Y] (결합된 분석물)와 [Z] (자유 분석물)를 더하여, 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]을 산출한다.

본원에 기술된 원리들에 따른 일부 예는 미지 샘플에 잠재적으로 존재하는 내생성 방해 물질들의 존재 하에 타크로리무스를 함유할 것으로 의심되는 미지 샘플에서 타크로리무스의 전체 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 타크로리무스 부분의 양 [Y]는 내생성 결합 물질들로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 존재 하에 샘플의 일부에 대해 수행된 검정을 이용하여 타크로리무스의 양 [V]를 결정하고, 내생성 결합 물질들로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 부재 하에 샘플의 일부에 대해 수행된 검정을 이용하여 타크로리무스의 양 [W]를 결정하고, [V]에서 [W]를 차감함으로써 측정된다. 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 타크로리무스의 양 [Z]는 식 [Z] = a[Y] + b (여기서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 타크로리무스 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플들에 대한 검정을 수행함으로써 사전결정됨)에 의해 결정된다. 상기 방정식에서, "a"는 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물과 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물 간의 회귀(regression)의 기울기이며, "b"는 이러한 회귀의 절편이다. 미지 샘플 중의 타크로리무스의 전체 양 [X]는 [Y]와 [Z]를 더함으로써 결정된다.

도 1은 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 타크로리무스의 농도에 대한 자유 타크로리무스 농도의 플롯(plot)이다.

일반적인 논의

본원에 기술된 원리들에 따른 예는 내생성 방해 물질들을 잠재적으로 함유한 미지 샘플에서 분석물의 전체 양의 정확한 측정에 관한 것이다. 샘플들이 존재할 수 있는 임의의 내생성 결합 물질들로부터 미지 샘플 중의 분석물을 대체하기 위해 대체제(displacing agent)로 처리될 수 있지만, 예를 들어 미지 샘플 중에 존재할 수 있는 비-특이적 방해 단백질들과 같은 내생성 방해 물질들은 면역검정 성분들에 결합하고, 미지 샘플 중의 분석물 농도의 부정확한 결정을 야기시킨다. 또한, 여러 미지 샘플들은 검정 신호를 방해하는 내생성 물질들을 가지지 않는다. 그러나, 이러한 물질들을 갖는 이러한 미지 샘플들에 대하여, 이러한 내생성 방해 물질들의 양은 샘플 간에 다르다. 본원에 기술된 원리들에 따르면, 실제 분석물 농도는 예를 들어 비-특이적 방해 단백질들과 같은 내생성 방해 물질들의 존재 하에 미지 샘플들에서 측정될 수 있다.

본원에 기술된 원리들에 따르면, 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 공지된 샘플에서 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물(하기에서 "결합된 분석물"로서 지칭됨)과 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물(하기에서 "자유 분석물"로서 지칭됨) 간의 관계는 한 세트(set)의 계수를 결정하기 위해 수립되는데, 이는 이후에 샘플 중에 존재할 수 있는 내생성 방해 물질들의 존재 하에 미지 샘플들 중의 실제 분석물 농도를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어 결합 단백질과 같은, 공지된 양의, 실질적으로 내생성 방해 물질들이 존재하지 않는 분석물을 함유한 샘플들은 결합된 분석물과 자유 분석물 간의 관계를 결정하기 위해 분석물에 대한 검정으로 처리되며, 얻어진 데이타(data)는 회귀 분석으로 처리된다. 자유 분석물의 양은, 미지 양의 분석물을 함유하고 잠재적으로 내생성 방해 물질들을 함유하는 샘플에 대하여, 미지 샘플 중의 분석물의 실제 전체 양을 계산하기 위하여 이용될 수 있는 계수들을 얻기 위해 공지된 샘플에 대한 결합된 분석물의 양에 대해 플롯팅된다(plotted). 공지된 농도의 샘플들을 사용하여 특정 검정 및 시약들에 대해 수립된 자유 분석물과 결합된 분석물 간의 관계는, 비록 이러한 샘플들이 예를 들어 비-특이적 방해 단백질들과 같은 내생성 방해 물질들을 함유할 수 있지만, 미지 분석물 농도의 샘플들에 대한 실제 분석물 농도를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

시험될 샘플은 비-생물학적 샘플 또는 생물학적 샘플일 수 있다. "비-생물학적 샘플들"은 생물학적 재료와 관련이 없는 샘플로서, 예를 들어 토양 샘플, 물 샘플, 공기 샘플, 다른 가스의 샘플 및 미네랄(mineral) 샘플을 포함한다. 구 "생물학적 샘플"은 예를 들어 체액, 신체 조직, 신체 화합물 및 배양 배지와 같은 임의의 생물학적 재료를 지칭한다. 이러한 샘플은 임의의 공급원으로부터의 고체, 반-고체 또는 유체 (액체 또는 기체)일 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 신체 배출물, 신체 흡입물, 신체 적출물 또는 신체 추출물일 수 있다. 신체는 대개 포유동물의 신체이며, 일부 구체예에서, 신체는 인간 신체이다. 신체 배출물은 예를 들어, 소변, 배설물, 대변, 질점액, 정액, 눈물, 입김(breath), 땀, 수포액(blister fluid), 및 염증 삼출액과 같은 신체로부터 분비되는 물질이다(이러한 것들은 또한 적출 또는 추출에 의해 얻어질 수 있음). 신체 적출물은 예를 들어, 피부, 헤어(hair) 및 장기 및 다른 신체 부분들로부터의 생검들을 포함하는 조직 샘플들과 같은 신체로부터 적출된 물질들이다. 신체 흡입물은 예를 들어, 점액, 타액 및 객담(sputum)과 같은 신체로부터 흡입되는 물질들이다. 신체 추출물은 예를 들어, 전혈, 혈장, 혈청, 척수액, 뇌 척수액, 림프액(lymphatic fluid), 관절 낭액(synovial fluid), 및 복막액(peritoneal fluid)과 같은 신체로부터 추출된 물질이다.

분석물은 고려되는 물질 또는 검출되고/거나 정량화될 화합물 또는 조성물이다. 분석물은 일 예로서 그리고 비제한적으로, 예를 들어 치료 약물, 남용 약물, 대사물, 살충제, 휘발성 유기 화합물, 반-휘발성 유기 화합물, 비-휘발성 유기 화합물, 단백질, 다당류, 오염물, 톡신(toxin), 지질 및 핵산, (DNA, RNA)을 포함한다.

본원에 기술된 원리들에 따른 예는 분석물에 결합하는 내생성 물질들을 함유한 샘플 중에 존재하는 분석물들에 대한 특정 적용을 갖는다. 이러한 내생성 결합 물질들은 이의 공급원으로부터 취해진 샘플 중에 존재하는 것이다. 내생성 결합 물질들의 특성은 예를 들어 샘플의 특성, 샘플 공급원의 특성, 분석물의 특성, 및 분석물을 포함하는 분자 복합물의 특성 중 하나 이상에 의존적이다. 내생성 결합 물질들은 내생성 결합물질들과 내생성 방해 물질들 둘 모두일 수 있다.

내생성 결합 물질들은 이로부터 분석물이 하기에서 논의되는 바와 같이 대체제에 의해 대체될 수 있는 물질이다. 내생성 결합 물질들은 내생성 특이적 결합 물질 및 내생성 비-특이적 결합 물질 둘 모두를 포함한다. 특이적 결합 물질은 표면 상에 또는 공동에 구역을 갖는 물질로서, 이는 분석물에 특이적으로 결합하고, 분석물의 특정 공간 및 극성 조직(organization)과 상보적으로 한정되거나 또는 그 반대이다. 특이적 결합은 비-특이적 결합과 구별되는데, 왜냐하면 특이적 결합은 다른 분자들의 실질적으로 보다 낮은 인식과 비교하여 두 개의 상이한 분자들 중 하나를 다른 분자들에 대해 특별히 인식하는 것을 포함하기 때문이다. 비-특이적 결합 물질은 일반적으로 특정 표면 구조에 비교적 독립적인 분자들 간의 비-공유 결합에 의해, 분석물에 결합하는 물질이다. 분석물에 대한 내생성 결합 물질은 예를 들어 항-분석물 항체 및 수용체 (예를 들어, 면역글로불린(immunoglobulin))와 같은 분석물에 특이적으로 결합하는 단백질, 및 주요 (예를 들어, CsA를 결합하는 사이클로필린(cyclophilin), 타크로리무스 및 시롤리무스를 결합하는 FK-결합 단백질) 및 소수의 카테고리들(categories)로 이루어진 이뮤노필린(immunophilin)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 소수의 카테고리는 두 그룹(group) (하나의 그룹은 펩티딜프롤릴 시스/트랜스 이소머라제(peptidylprolyl cis/trans isomerase) 활성을 가지며(12, 25 및 56-50 kDa), 다른 하나는 펩티딜프롤릴 시스/트랜스 이소머라제 활성을 가지지 않음(14, 37, 및 52 kDa)), 라파마이신의 타겟(target)(TOR); α1 산 글리코단백질(acid glycoprotein), 지질단백질, 알부민(albumin) 및 글로불린(globulin); 예를 들어 또는 상기 기술된 것들 중 둘 이상의 조합물을 함유한다.

방해 물질은 검정에서 신호의 형성을 방해하는 임의의 물질을 포함한다. 방해(interference)는 검정의 하나 이상의 구성성분들에 방해 물질의 결합으로부터 생길 수 있다. 이러한 검정 구성성분들은 예를 들어, 검정 항체, 신호 효소, 링커(linker), 단백질 또는 고체 지지체 상에 존재하는 다른 시약들, 및 검정 시약 기질을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 방해 물질은 예를 들어 비-특이적 결합 단백질일 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 상술된 바와 같이, 비-특이적 결합은 특정 표면 구조에 비교적 독립적인 분자들 간의 비-공유 결합을 지칭한다. 비-특이적 결합과 같은 방해는 분자들 간의 소수성 상호작용을 포함하는 여러 인자들로부터 생길 수 있다. 검정에서 비-특이적 결합과 같은 방해를 초래하는 분자 또는 분자들의 특성은 예를 들어 샘플의 특성 및 면역검정 구성성분들의 특성 중 하나 이상에 의존적이다. 방해 물질, 예를 들어 비-특이적 결합 단백질은 이로부터 분석물이 하기에서 논의되는 바와 같이 대체제에 의해 대체되지 않는 단백질이다.

일부 예에서, 방해 물질은 단백질 물질, 예를 들어 비-특이적 면역글로불린, 시약 응집(reagent agglutination)을 일으킬 수 있는 물질; 검정에서 신호 효소 또는 신호 분자의 활성을 증가시키거나 감소시킬 수 있는 물질, 예를 들어 신호-형성 효소에 결합하는 물질, 예를 들어 항체(예를 들어, 효소 기질, 예를 들어 클로로페놀 레드(chlorophenol red) (CPR)에서 착색된 생성물, 예를 들어 클로로페놀 레드-ß-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-ß-D-galactopyranoside)(CPRG)로의 전환); 고체 지지체 상에 존재하는 분석물 유사체에 결합하는 검정 항체를 감소시키거나 증가시킬 수 있는 물질; 예를 들어 항체 및 효소의 콘주게이트(conjugate)(효소-항체 콘주게이트)와 같은 신호 콘주게이트 시약에 결합하는 물질로서, 효소-항체 콘주게이트의 하나 이상의 성분 부분들, 예를 들어 항체 및 효소를 연결하는 연결기, 항체 자체, 효소 자체, 또는 이들의 하나 이상의 조합에 결합하는 물질을 포함하는 물질; 분석물에 대한 항체의 결합을 감소시키거나 증가시킬 수 있는 물질; 기질의 검정 신호의 형성을 위한 생성물로의 효소적 전환을 변경시킬 수 있는 물질들, 예를 들어, 친유성 재료, 예를 들어 지질단백질 (예를 들어, 콜레스테롤(cholesterol) 및 트리글리세라이드(triglyceride)), 지질 이중층 및 원형질 막; 세포, 예를 들어 적혈구; 예를 들어, 또는 상술된 것들 중 둘 이상의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.

면역억제 약물은 내생성 결합 물질들에 의해 결합되기 쉬운 분석물들의 한 그룹이다. 상술된 바와 같이, 면역억제 약물은 비-자기 조직의 동종이식 거부를 막는데 도움을 주기 위하여 이식 수용체들에 투여되는 치료 약물이다. 면역억제 약물은 네 개의 그룹으로 분류될 수 있다: 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 세포증식 억제제, 항체, 이뮤노필린(immunophilin) 상에서 작용하는 약물, 및 다른 약물, 예를 들어 인터페론(interferon), 아편제 INF 결합 단백질, 미코페놀레이트(mycophenolate), FTY720 등. 특정 부류의 면역억제 약물은 이뮤노필린 상에서 작용하는 약물을 포함한다. 이뮤노필린은 생리학적 유의성을 갖는 높은-친화력, 특이적 결합 단백질의 일 예이다. 이뮤노필린의 두 개의 별개의 패밀리(family), 즉 사이클로필린 및 마크로필린(macrophilin)이 현재 알려져 있으며, 후자는 예를 들어 타크로리무스 또는 시롤리무스를 특이적으로 결합시킨다. 이뮤노필린 상에서 작용하는 면역억제 약물은 예를 들어, 사이클로스포린 (사이클로스포린 A, 사이클로스포린 B, 사이클로스포린 C, 사이클로스포린 D, 사이클로스포린 E, 사이클로스포린 F, 사이클로스포린 G, 사이클로스포린 H, 사이클로스포린 I를 포함), 타크로리무스 (FK506, PROGRAF^®), 시롤리무스 (라파마이신, RAPAMUNE^®), 및 에베롤리무스 (RAD, CERTICAN^®)를 포함한다.

상술된 바와 같이, 본원에 기술된 원리들에 따른 일부 예는 내생성 방해 물질들의 존재 하에 분석물을 함유할 것으로 의심되는 미지 샘플 중의 분석물의 실제 전체 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 검정 및 검정 시약이 먼저 특정 계수들을 결정하기 위해 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 공지된 샘플에 대해 사용된다. 이후에, 간단하게 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 미지 샘플 중의 분석물의 양을 결정하고 방정식을 이용하여, 내생성 방해 물질들의 존재 하에, 미지 샘플들 중의 전체 분석물 양을 계산하기 위하여 이러한 계수들을 이용하는 방정식이 사용될 수 있다. 상술된 바와 같이, 검정은 다르지만 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플들 각각에 대해 자유 분석물의 양 및 결합된 분석물의 양을 결정하기 위하여 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플에 대해 수행된다. 자유 분석물 및 결합된 분석물의 측정으로부터의 데이타의 플롯의 회귀 분석으로부터, 내생성 방해 물질들의 존재와는 무관하게 미지 양의 분석물을 함유한 샘플들 중의 전체 분석물 농도를 계산하기 위해 방정식에서 사용될 수 있는 계수들이 결정된다.

상술된 바와 같이, 이러한 계수들은 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플들에 대해 검정을 수행하고 얻어진 데이타를 플롯팅(plotting)함으로써 결정된다. 샘플들에는 실질적으로 내생성 방해 물질들이 존재하지 않는다. 공지된 샘플 중의 분석물의 농도는 미지 샘플들 중의 고려되는 분석물의 의심되는 농도 범위를 포괄할 것이다. 공지된 샘플들은 보정물(calibrator)의 제조와 유사하게 공지된 양의 분석물을 생물학적 샘플 또는 비-생물학적 샘플에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 다른 한편으로, 샘플들은 특정 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 것으로 알려진 것으로부터 선택될 수 있다. 어떠한 방법에서나, 계수를 결정하기 위한 공지된 분석물 농도가 차이가 나는 샘플의 수는 예를 들어, 분석물의 특성, 샘플의 특성, 내생성 결합 물질의 특성, 및 검정 시약 또는 구성성분의 특성 중 하나 이상에 의존적이다. 본원에 기술된 원리들에 따른 예에서, 결정을 위한 공지된 분석물 농도가 차이가 나는 샘플의 수는 예를 들어, 약 2 내지 약 10개, 또는 약 3 내지 약 10개, 또는 약 4 내지 약 10개, 또는 약 4 내지 약 8개, 또는 약 4 내지 약 6개, 또는 약 4 내지 약 5개, 또는 약 5 내지 약 7개일 것이다. 분석물의 공지된 양은 하나의 샘플과 다른 샘플 간에 예를 들어 약 1% 내지 약 10,000%, 또는 약 10% 내지 약 1,000%, 또는 약 50% 내지 약 300%로 다를 것이며, 0 양의 분석물에서 두번째로 가장 높은 양 간의 차이는 예를 들어, 적어도 약 30 ng/mL, 또는 적어도 약 50 ng/mL, 또는 적어도 약 75 ng/mL이다. 일부 예에서, 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플들은 샘플을 요망되는 양의 분석물과 섞음으로써 제조된다.

상술된 바와 같이, 공지된 샘플들에는 방해 물질이 실질적으로 존재하지 않을 것이다. 구 "방해 물질이 실질적으로 존재하지 않는"은 공지된 샘플들이 측정 결과에 영향을 미치는 양의 물질을 약 10% 초과, 또는 약 5% 초과, 또는 약 3% 초과, 또는 1% 초과하게 함유하지 않는 것을 의미한다. 본원에 기술된 원리들에 따른 일부 예에서, 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플들은 샘플들을 액체 크로마토그래피(chromatography), 질량 분광법, 또는 이들의 조합, 예를 들어 액체 크로마토그래피-탠뎀 질량 분광법, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)-텐뎀(tandem) 질량 분광법(LCMS²)과 같은(그러나 이로 제한되지 않음) 방법에 의해 분석하고 방해 물질에 대해 음성인 샘플들을 선택함으로써 얻어질 수 있다. 다른 방법은 샘플에 대해 고려되는 검정을 수행하고 분석물과 관련하여 실질적으로 어떠한 신호도 제공하지 않는 샘플을 선택하는 것을 포함한다. 구 "신호가 실질적으로 분석물과 관련되지 않는"다는 것은 검정에서 측정된 신호가 검출 가능하지 않거나, 전체 분석물에 대한 결합된 분석물의 비율([Y]/[X])이 약 5% 초과, 약 60% 초과, 또는 약 70% 초과, 또는 약 80% 초과, 또는 약 90% 초과, 또는 약 95% 초과, 또는 약 99% 초과이거나, 약 50% 내지 약 99.99% 또는 약 60% 내지 약 99.99%, 또는 약 70% 내지 약 99.99% 또는 약 80% 내지 약 99.99%, 또는 약 90% 내지 약 99.99%의 범위임을 의미한다.

공지된 샘플에 대한 검정은 미지 샘플에 대해 사용되는 검정이다. 계수들의 결정은 미지 샘플에 대한 검정을 수행하기 위해 사용되는 검정 방법 및 검정 시약을 위한 것이다. 검정은 대체제의 존재 하(결합된 분석물의 양 및 자유 분석물의 양을 측정하기 위함) 그리고 대체제의 부재 하(자유 분석물의 양을 측정하기 위함) 둘 모두에서 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플들에 대해 수행된다. 다양한 샘플들에 대해 측정되는 검정 신호는 샘플 중의 자유 분석물 플러스(plus) 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물의 양에 대한 수치로(대체제의 첨가와 함께 검정이 수행됨) 그리고 샘플 중의 단지 자유 분석물의 양에 대한 수치(대체제의 부재 하에 검정이 수행됨)로 전환된다. 전자의 수치에서 후자의 수치의 차감은 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 샘플 중의 분석물의 양을 산출한다. 그 결과는 회귀 분석으로 처리되며, 여기서 샘플 중의 자유 분석물의 양은 샘플 중의 결합된 분석물의 양에 대해 플롯팅된다. 하나의 계수는 변수로서, 회귀의 기울기에 해당하며, 하나의 계수는 상수로서, 회귀의 절편에 해당한다. 변수 (의존적) 계수 및 상수 (독립적) 계수의 수치는 하기에서 보다 충분히 설명되는 바와 같이, 이후에 미지 양의 분석물을 함유하고 잠재적으로 내생성 방해 물질들을 함유하는 샘플 중의 분석물의 전체 양을 계산하기 위해 사용될 수 있다.

미지 샘플 중의 전체 분석물 양을 결정하는 방법들은 분석물에 대한 검정을 이용하여 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물(결합된 분석물)을 나타내는 미지 샘플 중의 분석물의 양 [Y]을 측정하는 것을 포함한다. 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 미지 샘플 중의 분석물(자유 분석물)의 양 [Z]는 식 [Z] = a[Y] + b (여기서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 방해 물질이 실질적으로 존재하지 않는 샘플에 대해 수행되는 검정에 대해 상기에서 언급된 계수임)에 의해 결정된다. [Y]와 [Z]를 더하여, 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]을 산출하는데, 이는 미지 샘플 중의 내생성 방해 물질들의 존재 하에 결정되는 것이다. 계수 "a"는 의존적 계수이며, 계수 "b"는 독립적 계수이다. 상술된 바와 같이, 계수 "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유한 샘플에 대해 검정을 수행하고 얻어진 데이타를 플롯팅함으로써 결정된다. "a" 및 "b"의 수치들은 이후에 방해 물질들의 존재 하에 미지 양의 분석물을 함유한 샘플 중의 분석물의 전체 양을 계산하기 위해 사용될 수 있다.

하기 논의의 특정 양태는 공지된 샘플 및 미지 샘플 둘 모두에 대한 검정에 적용한다. 하기에서 보다 충분히 논의되는 바와 같이, 임의의 검정이 이용될 수 있다. 검정은 샘플을 포함하는 매질에 샘플 중의 분석물의 농도를 결정하기 위한 시약들을 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 검정은 면역검정이며, 시약은 분석물에 대한 적어도 하나의 항체를 포함한다. 분석물에 대한 항체를 포함하는 복합물의 양이 측정된다. 단지 자유 분석물에 의해 발생되는 신호 및 자유 분석물과 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물에 의해 발생된 신호의 수준의 측정은 검정을 이용하여 수행된다. 샘플 부분들에 대해 수행된 검정은 별도의 반응 용기에서 순차적으로 또는 부수적으로, 또는 각 샘플 부분에 대해 동일한 반응 용기에서 순차적으로 수행될 수 있다. 구 "분석물에 대한 항체를 포함하는 복합물"은 분석물에 대한 항체가 샘플 중의 분석물에 복합체화된 복합물을 지칭한다.

결합된 분석물의 양은 샘플의 일부를 검정으로 처리함으로써 측정되는데, 여기서 검정 이전에 또는 검정 동안에, 샘플은 내생성 결합 물질들로부터 결합된 분석물을 대체하는 제제로 처리된다. 대체제는 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물을 대체한다. 이러한 방식으로, 측정되는 분석물의 양은 내생성 결합 물질들에 의해 결합되었지만 현재 대체되는 분석물의 양 및 자유 분석물(즉, 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물)의 양의 합이다. 자유 분석물의 양을 측정하기 위하여, 샘플의 다른 일부는 검정으로 처리되는데, 여기서 샘플은 이러한 대체제로 처리되지 않는다. 전자에서 후자의 차감은 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물의 양 [Y]를 산출한다. 내생성 결합 물질들로부터 분석물을 대체하는 제제는 본원에서 대체제로서 지칭된다. 대체제의 특성은 예를 들어 분석물의 특성, 및 보다 낮은 정도로, 내생성 결합 물질들의 특성 중 하나 이상에 의존적이다.

상술된 바와 같이, 분석물의 측정은 대체제로 처리된 샘플, 및 대체제로 처리되지 않은 샘플에 대해 수행되어, 결합된 분석물과 자유 분석물의 양의 합, 및 단지 자유 분석물의 양을 각각 결정한다. 전자에서 후자의 차감은 샘플 중의 결합된 분석물의 양을 산출한다. 상기에서 언급된 바와 같이, 샘플의 일부는 결합된 분석물의 양을 결정하기 위해 검정을 수행하는데 이용된다. 측정을 위하여, 샘플 부분은 검정을 방해하지 않는 임의의 통상적인 매질에서 제조될 수 있다. 수성 매질이 일반적으로 이용된다. 샘플 부분의 크기는 예를 들어, 분석물의 특성, 검정의 특성, 검정을 수행하기 위한 다양한 시약들의 특성, 및 분석물을 포함하는 복합물의 특성 중 하나 이상에 의존적이다. 샘플 부분의 크기는 두 측정에 대해 실질적으로 동일할 것이다. 일부 구체예에서, 샘플 부분의 부피는 예를 들어, 약 1 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 2 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 5 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 100 ㎕, 또는 약 1 ㎕ 내지 약 80 ㎕, 또는 약 1 ㎕ 내지 약 60 ㎕, 또는 약 1 ㎕ 내지 약 40 ㎕, 또는 약 1 ㎕ 내지 약 20 ㎕, 또는 약 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕, 또는 약 10 ㎕ 내지 약 50 ㎕이다.

내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물의 측정치를 얻기 위해 검정을 수행하기 위한 샘플의 부분은 상기에서 논의된 바와 같이 샘플을 대체제로 처리하는 것을 포함한다. 샘플에 첨가되는 대체제의 양은 샘플에 대한 검정에서 얻어진 신호가 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물의 양 및 샘플 중의 자유 분석물의 양 둘 모두를 나타내도록 내생성 결합 물질들로부터 실질적으로 모든 분석물을 대체하는데 충분한 양이다. 본원에 기술된 원리들에 따르면, 구 "내생성 결합 물질들에 의해 결합된 실질적으로 모든 분석물을 대체하는"은 분석물이 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.5%, 또는 적어도 99.9% 또는 100%가 내생성 결합 물질들로부터 대체되거나 검정 동안에 검출을 위해 이용 가능하다는 것을 의미한다.

대체제를 첨가한 후에, 샘플은 내생성 결합 물질들로부터 실질적으로 모든 분석물을 대체하기 위한 조건 하에서 소정 기간 동안 인큐베이션된다(incubated). 인큐베이션(incubation)의 길이 및 조건은 예를 들어, 대체제의 특성, 분석물의 특성, 및 분석물의 예상되는 농도 중 하나 이상에 의존적이다. 일부 구체예에서, 이러한 단계를 위한 인큐베이션 온도는 예를 들어, 약 5℃ 내지 약 99℃, 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃일 수 있다. 인큐베이션을 위한 시간은 예를 들어 약 0.2 초 내지 약 24 시간, 또는 약 1 초 내지 약 6 시간, 또는 약 2 초 내지 약 1 시간, 또는 약 1 내지 약 15 분이다. 인큐베이션은 편리를 위하여, 본원에서 논의된 바와 같이 검정 매질일 수 있는 배지에서 수행될 수 있지만, 이러한 검정 매질일 필요는 없다.

샘플 중의 자유로운 분석물의 양을 결정하기 위하여, 동일한 샘플의 부분은 대체제로 처리하지 않는 검정으로 처리된다. 검정은 대체제로 처리된 샘플에 대해 상술된 바와 같이 수행된다. 자유 분석물의 양은 상기에서 논의된 바와 같은 자유 분석물 및 결합된 분석물 둘 모두의 양에서 차감되어 단지 결합된 분석물의 양을 얻는다. 미지 샘플에 대하여, 결합된 분석물의 이러한 양은 샘플 중의 분석물의 전체 양을 계산하기 위해 이용된다. 결합된 분석물의 양은 상기 식에서 [Y]로 표현된다. 공지된 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질이 실질적으로 존재하지 않는 샘플을 이용하여 특정 검정 및 검정 시약 세트에 대해 "a" 및 "b"에 대한 이전에 결정된 수치를 고려하여, 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질에 의해 결합되지 않은 분석물(자유 분석물)의 양 [Z]는 식 [Z] = a[Y] + b에 의해 결정된다. [Y] 및 [Z]를 더하여 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]를 산출하는데, 이는 미지 샘플 중의 방해 물질들의 존재 하에 결정되는 것이다.

대체제는 임의의 모이어티(moiety), 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물 중 어느 하나일 수 있는데, 이는 예를 들어 검정 항체와 같은 검정 시약들에 유의미한 결합을 갖지 않으면서 내생성 결합 물질들로부터 분석물의 대체의 요망되는 결과를 달성한다. 일부 예에서, 대체제는 내생성 결합 물질로부터 분석물, 및 요망되는 경우에 이의 대사물을 대체하여 분석물, 및 예를 들어 분석물에 대한 항체와 같은 분석물에 대한 결합 파트너(binding partner)에 실질적으로 접근 가능한 대사물 둘 모두를 제공한다.

일부 구체예에서, 대체제는 분석물의 구조 유사체를 포함하는 유사체이다. 분석물 유사체는 결합 물질로부터 유사한 분석물을 대체할 수 있지만 분석물에 대한 항체와 같은 수용체에 대해 임의의 실질적인 정도로 경쟁적이지 않는 개질된 분석물이다. 이러한 개질은 분석물 유사체를 다른 분자에 연결시키기 위한 수단을 제공할 수 있다. 분석물 유사체는 대개, 수소를 허브(hub) 또는 라벨(label)에 분석물 유사체를 연결시키는 결합으로 대체시킴으로써 분석물과 다를 것이지만, 이러한 것은 필수적인 것은 아니다. 분석물 유사체는 예를 들어, 분석물과 구조적으로 관련된 분자, 및 예를 들어 연결기를 통해 다른 분자에 콘주게이션된(conjugated) 분석물일 수 있다. 하이드록실 또는 카복실산 작용성을 포함하는 분석물에 대하여, 대체제는 분석물의 에스테르일 수 있는데, 이는 검출될 분석물에 대해 내생성 결합 물질을 위한 높은 결합 친화력을 가지고, 분석물에 대한 항체에 대한 상당한 결합 친화력을 가지지 않는다. 구조적 유사체는 구조적 유사체가 내생성 결합 물질로부터 분석물을 대체 시에 분석물의 유사체와 동일하거나 유사한 결과를 달성하는 분석물과 동일하거나 유사한 구조적 또는 공간적 특징을 갖는 모이어티이다. 구조적 유사체는 예를 들어 분석물과 관련된 다른 화합물일 수 있다.

면역억제 약물의 경우에, 구조적 유사체는 예를 들어 면역억제 약물과 관련된 다른 화합물일 수 있다. 일 예로서 그리고 비제한적으로서, 타크로리무스에 대한 결정을 위한 대체제의 예에서, 타크로리무스의 에스테르(예를 들어, FK506)가 상기 요건들을 충족하는 한 대체제로서 이용될 수 있다. 다른 예에서, 시롤리무스에 대한 결정에서, 타크로리무스의 에스테르는 대체제로서 이용될 수 있다. 이러한 에스테르는 예를 들어, 카바메이트, 카보네이트, C1 내지 C6 카복실산의 에스테르일 수 있다[참조, 예를 들어 미국특허번호 제7,186,518호, 이의 관련 문헌은 본원에 참고로 포함됨]. 대체제의 다른 예는 예를 들어, 사이클로스포린 A에 대하여 [Thr2, Leu5, D-Hiv8, Leu10]-사이클로스포린 A, 시롤리무스에 대하여 FK506, 및 FK506에 대하여 시롤리무스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다[참조, 예를 들어 미국특허번호 제6,187,547호, 이의 관련 문헌은 본원에 참고로 포함됨].

매질 중에서의 대체제의 농도는 분석물, 및 요망되는 경우에 상기에서 논의된 바와 같이 분석물에 대한 항체에 결합하기 위해 접근 가능한 대사물을 제공하기 위해 내생성 결합 물질로부터 실질적으로 모든 분석물, 및 일부 경우에 분석물의 대사물을 대체하는 요망되는 결과를 달성하기에 충분한 농도이다. 이용되는 대체제의 양 또는 농도는 예를 들어, 샘플의 특성, 분석물의 특성, 분석물 대사물의 특성, 다른 시약 성분의 특성, 및 반응 조건 중 하나 이상에 의존적이다. 일부 구체예에서, 대체제의 양은 약 0.000001% 내지 약 0.5%, 약 0.0001% 내지 약 0.4%, 약 0.001% 내지 약 0.3%, 약 0.01% 내지 약 0.2%, 약 0.1% 내지 약 0.3%, 약 0.2% 내지 약 0.5%, 약 0.1% 내지 약 0.2%, 등(퍼센트(percent)는 중량/부피임)이다.

대체제를 첨가한 후에, 제2 샘플 부분은 실질적으로 분석물을 방출하기 위한 조건 하에서 소정 기간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션의 길이 및 조건은 예를 들어, 대체제의 특성, 분석물의 특성, 분석물의 예상되는 농도, 항체 친화력 및 결합활성 및 항체 단편화 중 하나 이상에 의존적이다. 일부 구체예에서, 이러한 단계를 위한 인큐베이션 온도는 예를 들어 약 5℃ 내지 약 99℃, 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃일 수 있다. 인큐베이션을 위한 시간은 예를 들어, 약 0.2 초 내지 약 24 시간, 또는 약 1 초 내지 약 6 시간, 또는 약 2 초 내지 약 1 시간, 또는 약 1 내지 약 15 분이다. 인큐베이션은 대개 매질에서 수행되는데, 이는 편의를 위하여 본원에서 논의되는 바와 같이 검정 매질일 수 있지만, 검정 매질일 필요는 없다.

일부 구체예에서, 용혈제(hemolytic agent)가 이용되는데, 이는 분석물을 가둘 수 있는 세포막을 파괴시키는 제제이다. 예를 들어, 적혈구 내에 가둬지는 분석물은 용혈제를 이용함으로써 적혈구로부터 방출될 수 있다. 용혈제는 적혈구의 막의 보존성을 파괴하여 이에 의해 세포 및 특히 적혈구의 세포내 함유물을 대체시키는 화합물 또는 화합물들의 혼합물이다. 여러 용혈제들이 당해 분야에 알려져 있다. 용혈제는 예를 들어, 비이온성 세제, 음이온성 세제, 양쪽성 세제, 낮은 이온 농도의 수용액(저장액), 박테리아제(bacterial agent), 보체 의존 용해(complement dependent lysis)를 야기시키는 항체, 등을 포함한다.

용혈제로서 이용될 수 있는 비-이온성 세제는 합성 세제 및 천연 세제 둘 모두를 포함한다. 합성 세제의 예는 TRITON™ X-100, TRITON™ N-101, TRITON™ X-114, TRITON™ X-405, TRITON™ SP-135, TWEEN® 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), TWEEN® 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레이트), DOWFAX®, ZONYL®, 펜타에리스리틸 팔미테이트, ADOGEN® 464, ALKANOL® 6112 계면활성제, 알릴 알코올 1,2-부톡실레이트-블록-에톡실레이트 HLB 6, BRIJ®, 에틸렌디아민 테트라키스(에톡실레이트-블록-프로폭실레이트) 테트롤, IGEPAL®, MERPOL®, 폴리(에틸렌 글리콜), 2-[에틸[(헵타데카플루오로옥틸)설포닐]아미노] 에틸 에테르, 폴리에틸렌-블록-폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 테트라올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 헥사올레이트, TERGITOL® NP-9, GAFAC® (RHODAFAC®, 알킬 폴리옥시에틸렌 글리콜 포스페이트 에스테르, 예를 들어, 알파-도데실-오메가-하이드록시폴리(옥시-1,2-에탄디일) 포스페이트), 및 EP110® 등을 포함한다. 용혈제로서 이용될 수 있는 천연 발생 세제는 예를 들어, 사포닌(saponin), 소듐 또는 칼륨 중화된 지방산, 중화된 인지질, 디아실글리세롤, 중화된 포스파티딜 세린, 포스파티데이트, 중화된 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜콜린, 담즙산염, 비에스테르화된 콜레스테롤, 중화된 스핀고신(sphingosine), 세라미드(ceramide), 등을 포함한다. 하나 이상의 합성 세제 또는 하나 이상의 천연 발생 세제의 조합, 및 합성 세제 및 천연 발생 세제의 조합이 또한 이용될 수 있다.

본 구체예에서 이용될 수 있는 다른 제제들은 용해성 시약(solubility reagent), 예를 들어 소량의 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 메톡시 프로판올 및 디메틸설폭사이드(DMSO); 및 단백질 소화를 수행하기 위한 제제, 예를 들어 단백질분해효소, 트립신(trypsin), 펩신(pepsin), 및 펩티다제(peptidase)를 포함한다.

분석물에 대한 검정의 일반적인 설명

임의의 적합한 검정은 상기에서 논의된 바와 같이, 검정 측정 결과를 결정하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 검정은 상기에서 논의된 바와 같이 샘플 부분의 대체제로의 즉각적인 연속 처리로서 샘플 부분에 대해 수행될 수 있거나, 검정은 이후 소정의 포인트(point)에서 수행될 수 있다. 검정은 샘플 중의 분석물의 양을 결정하기 위한 시약과 개개 샘플 부분을 조합함으로써 수행된다. 시약의 특성은 수행될 검정의 특정 타입(type)에 의존적이다. 일반적으로, 검정은 샘플 중의 분석물 양의 결정을 위한 방법이다. 검정은 면역검정 또는 비-면역검정일 수 있다. 다양한 검정 방법은 일 예로서 그리고 비제한적으로 하기에서 논의된다.

여러 구체예에서, 시약은 분석물에 대한 적어도 하나의 항체를 포함하며, 검정은 일반적으로 비-면역검정으로서 지칭되는, 항체를 사용하지 않는 검정과는 구별되는 면역 검정으로서 지칭된다. 구 "분석물에 대한 항체"는 분석물에 (그리고 요망되는 경우에 분석물의 대사물에) 특이적으로 결합하고 분석물에 대한 분석을 왜곡시키는 다른 물질들에 임의의 상당한 정도로 결합하지 않는 항체를 의미한다.

이용될 수 있는 면역검정의 하나의 일반적인 그룹은 제한된 농도의 항체를 사용하는 면역검정을 포함한다. 면역검정의 다른 그룹은 과량의 하나 이상의 주요 시약, 예를 들어 과량의 분석물에 대한 항체의 사용을 포함한다. 면역검정의 다른 그룹은 라벨링된(labeled) 시약이 분석물-항체 결합 반응 시에 라벨 신호를 조절하는 무분리 균일 검정이다. 다른 검정 그룹은 문제가 있는 라벨링된 합텐(hapten)의 사용을 피하는 분석물에 대한 라벨링된 항체 시약 제한 경쟁적 검정을 포함한다. 이러한 타입의 검정에서, 고체상 고정화된 분석물은 일정한, 제한된 양으로 존재한다. 고정화된 분석물과 비-고정화된 분석물 간에 라벨의 분할은 샘플 중의 분석물의 농도에 의존적이다.

면역검정에서 사용하기 위한 분석물에 대해 특이적인 항체는 모노클론성(monoclonal) 또는 폴리클론성(polyclonal)일 수 있다. 이러한 항체는 당해 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어 숙주의 면역화 및 혈청(폴리클론성)의 수집에 의해 또는 연속 하이브리드(hybrid) 세포주를 제조하고 분비된 단백질(모노클론성)을 수집함으로써, 또는 천연 항체의 특이적 결합을 위해 요구되는 적어도 아미노산 서열에 대해 코딩(coding)하는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열 또는 이의 돌연변이화된 형태를 클로닝(cloning)하고 발현시킴으로써 제조될 수 있다.

항체는 완전한 면역글로불린 또는 이의 단편을 포함할 수 있으며, 이러한 면역글로불린은 다양한 클래스(class) 및 동형, 예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3, IgM, 등을 포함한다. 이의 단편은 예를 들어, Fab, Fv 및 F(ab')₂, 및 Fab'를 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 또는 이들의 단편의 응집물, 폴리머(polymer), 및 콘주게이트는 적절한 경우에 특정 분자에 대한 결합 친화력이 유지되는 한 사용될 수 있다.

상기에서 논의된 바와 같이, 예를 들어 분석물에 대한 면역검정에서 사용하기 위해 선택된 항체는 다른 리간드(ligand), 예를 들어 다른 대사물 또는 관련 물질에 비해 분석물 (및 필요하거나 요망되는 경우에, 이의 약제학적 활성 대사물)을 특이적이고 우선적으로 결합할 것이다.

다른 시약은 수행될 검정의 특성에 따라 검정 매질에 포함된다. 이러한 검정은 대개 분석물과 같은 결합 파트너와 상응하는 항체 간의 반응, 또는 항체와 제1 항체에 결합하는 제2 항체와 같은 상응하는 결합 파트너 간의 결합을 포함한다. 이에 따라, 결합 파트너는 단백질일 수 있는데, 이는 항체 또는 항원일 수 있다. 결합 파트너는 다른 분자에 특이적으로 결합하고 이에 의해 다른 분자의 특정 공간 및 극성 조직화와 상보적인 것으로 규정되는 공동에 또는 표면 상에 구역을 갖는 두 개의 상이한 분자들 중 하나인 특정 결합 쌍의 구성원("sbp 구성원")일 수 있다. 특이적 결합 쌍의 구성원은 대개 항원-항체와 같은 면역학적 쌍의 구성원일 것이지만, 다른 특정 결합 쌍, 예를 들어 바이오틴-아비딘(biotin-avidin), 호르몬-호르몬 수용체(hormones-hormone receptor), 효소-기질, 핵산 듀플렉스(nucleic acid duplex), IgG-단백질 A, 및 폴리뉴클레오티드 쌍(polynucleotide pair), 예를 들어 DNA-DNA, DNA-RNA는 면역학적 쌍이 아니지만, 용어 "sbp 구성원"의 범위내에 포함된다.

상기에서 논의된 바와 같이, 특이적 결합은 다른 분자의 실질적으로 보다 낮은 인식과 비교하여 두 개의 상이한 분자들 중 하나의 다른 분자에 대한 특이적 인식을 포함한다. 다른 한편으로, 비-특이적 결합은 특정 표면 구조에 비교적 독립적인 분자들 간에 비-공유 결합을 포함한다. 비-특이적 결합은 분자들 간의 소수성 상호작용을 포함하는 여러 인자들로부터 형성될 수 있다. 여러 검정 구체예에서, 바람직한 결합 파트너는 항체이며, 검정은 면역검정으로서 지칭된다.

면역검정은 라벨링되거나 비-라벨링된 시약을 포함할 수 있다. 비-라벨링된 시약을 포함하는 면역검정은 대개 하나 이상의 항체를 포함하는 비교적 큰 복합물의 형성을 포함한다. 이러한 검정은, 예를 들어 항체 복합물의 검출을 위한, 면역 침강(immunoprecipitin) 및 응집 방법 및 상응하는 광산란 기술, 예를 들어 혼탁법 및 비탁법을 포함한다. 라벨링된 면역검정은 예를 들어, 효소 면역검정, 형광 분극 면역검정, 방사 면역 검정, 억제 검정, 유도된 발광, 및 형광 산소 채널링 검정을 포함한다.

일부 구체예에서, 균일 면역검정이 이용될 수 있는데, 이러한 검정은 또한 본질적으로 무분할 면역검정(partition-free immunoassay)으로 지칭될 수 있다. 본 방법은 검정 이전에 분석물 대사물을 포함하는 샘플의 다른 구성성분으로부터 분석물이 추출되거나 분리되지 않는 완전 자동화돤 균일 검정에 적용한다. "비-수작업 추출" 검정에서, 예를 들어 유기 용매 중에서 추출을 필요로 하지 않는 전혈 샘플과 같은 샘플은 적합한 매질 중에서 분석물에 대한 검정을 수행하기 위해 시약과 조합되며, 검정 방법이 수행된다. 본 방법은 또한 수작업 추출 검정에 대한 적용을 발견한다.

검정은 임의의 검정 성분 또는 생성물의 분리 없이(균일) 또는 분리와 함께(불균일) 수행될 수 있다. 균일 면역검정은 EMIT® 검정(Syva Company, San Jose, CA; 미국특허번호 제3,817,837호(Rubenstein, 등), 컬럼(column) 3, 6줄에서 컬럼 6, 64줄에 기술됨); 면역형광 방법, 예를 들어 문헌[미국특허번호 제3,996,345호(Ullman, 등), 컬럼 17, 59줄에서 컬럼 23, 25줄]에 기술된 방법; 효소 채널링 면역검정(enzyme channeling immunoassays)("ECIA"), 예를 들어 문헌[미국특허번호 제4,233,402호(Maggio, 등) 컬럼 6, 25줄에서 컬럼 9, 63줄]에 기술된 방법; 형광 분극 면역검정(fluorescence polarization immunoassay)("FPIA")[다른 것들 중에서 예를 들어 미국특허번호 제5,354,693호에 기술됨] 등에 의해 예시된다.

다른 효소 면역검정에는 문헌[Ngo and Lenhoff, FEBS Lett. (1980) 116:285-288]에 의해 논의된 효소 조절 매개된 면역검정(enzyme modulate mediated immunoassay) ("EMMIA"); 문헌[Oellerich, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1984) 22:895-904]에 의해 개시된 기질 라벨링된 형광 면역검정(substrate labeled fluorescence immunoassay)("SLFIA"); 문헌[Khanna, 등, Clin. Chem. Acta (1989) 185:231-240]에 의해 개시된 조합된 효소 공여체 면역검정(combined enzyme donor immunoassays)("CEDIA"); 균일 입자 라벨링된 면역검정(homogeneous particle labeled immunoassay), 예를 들어 입자 강화 비탁 억제 면역검정(particle enhanced turbidimetric inhibition immunoassay)("PETINIA"), 입자 강화 비탁 면역검정(particle enhanced turbidimetric immunoassay)("PETIA"), 등이 있다.

다른 검정은 졸 입자 면역검정(sol particle immunoassay) ("SPIA"), 분산 염료 면역검정(disperse dye immunoassay)("DIA"); 메탈로면역검정(metalloimmunoassay) ("MIA"); 효소 멤브레인 면역검정(enzyme membrane immunoassay) ("EMIA"); 루미노면역검정(luminoimmunoassay)("LIA"); 고체상으로서 파라자성 입자를 이용한 아크리디늄 에스테르 라벨 면역검정(acridinium ester label immunoassay) (ADVIA Centaur 면역검정); 등을 포함한다. 검정의 다른 타입은 소수성 약물의 결합 시에 항체-고정화된 표면의 광학적, 음향적 및 전기적 성질의 변화를 모니터링하는 것을 포함하는 면역센서(immunosensor) 검정을 포함한다. 이러한 검정은 예를 들어, 광학적 면역센서 검정, 음향적 면역센서 검정, 반도체 면역센서 검정, 전기화학적 변환기 면역센서 검정, 전위차 면역센서 검정, 전류 전극 검정, 등을 포함한다.

분석물의 결정을 위한 본원에서 논의된 여러 검정에서, 라벨이 사용되는데, 라벨은 대개 신호 형성 시스템("sps")의 일부이다. 라벨의 특성은 특정 검정 포맷에 의존적이다. sps는 대개 하나 이상의 성분을 포함하는데, 이러한 적어도 하나의 성분은 검출 가능한 라벨로서, 이는 결합되고/거나 결합되지 않은 라벨의 양, 즉 검출될 분석물에 또는 검출될 분석물의 양을 반영하는 제제에 결합되거나 결합되지 않은 라벨의 양과 관련된 검출 가능한 신호를 발생시킨다. 라벨은 신호를 형성시키거나 신호를 형성시키기 위해 유도될 수 있는 임의의 분자이고, 예를 들어 형광물질, 방사성 라벨, 효소, 화학발광제 또는 감광제일 수 있다. 이에 따라, 신호는 라벨의 특성에 따라 효소 활성, 발광, 흡광도 또는 방사능을 검출함으로써 검출되고/거나 측정된다.

적합한 라벨은 일 예로서 그리고 비제한적으로, 효소, 예를 들어 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소(glucose-6-phosphate dehydrogenase) ("G6PDH"), β-갈락토시다제(β-galatosidase), 및 서양고추냉이 퍼옥시다제; 리보자임(ribozyme); QB 레플리카제(QB replicase)와 같은 레플리카제에 대한 기질; 프로모터(promoter); 염료; 형광제, 예를 들어 플루오레세인(fluorescein), 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine) 화합물, 피코에리스린(phycoerythrin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프탈알데하이드(o-phthaldehyde), 및 플루오레카민(fluorescamine); 복합물, 예를 들어 양자점으로서 알려진 반도체 나노결정에 존재하는 CdSe 및 ZnS로부터 제조된 복합물; 화학발광제, 예를 들어 이소루미놀(isoluminol), 및 아크리디늄 에스테르; 감광제; 조효소; 효소 기질; 방사성 라벨, 예를 들어 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁴C, ³H, ⁵⁷Co 및 ⁷⁵Se; 입자, 예를 들어 라텍스(latex) 입자, 카본 입자, 자성 입자를 포함한 금속 입자, 예를 들어 크롬 디옥사이드 (CrO₂) 입자, 등; 금속 졸(metal sol); 결정질; 리포좀(liposome); 세포 등을 포함하는데, 이는 염료, 촉매 또는 다른 검출 가능한 기로 추가로 라벨링될 수 있다. 적합한 효소 및 조효소는 문헌[Litman, 등, 미국특허번호 제4,275,149호, 컬럼 19-28, 및 Boguslaski, 등, 미국특허번호 제4,318,980, 컬럼 10-14]에 기술되어 있으며, 적합한 형광체 및 화학 발광체는 문헌[Litman, 등, 미국특허번호 제4,275,149, 컬럼 30 및 31]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

라벨은 신호를 직접적으로 형성할 수 있으며, 이에 따라 신호를 형성시키기 위하여 추가 성분들이 필요치 않다. 여러 유기 분자들, 예를 들어 형광 물질은 자외선 및 가시광을 흡수할 수 있으며, 여기서 광흡수는 에너지(energy)를 이러한 분자로 전달하고, 이러한 분자들을 여기된(excited) 에너지 상태로 상승시킨다. 이러한 흡수된 에너지는 이후에, 제2 파장에서 광의 방출에 의해 소멸된다. 신호를 직접적으로 형성시키는 다른 라벨은 방사성 동형 및 염료를 포함한다.

대안적으로, 라벨은 신호를 형성시키기 위해 다른 성분을 필요로 할 수 있으며, 신호 형성 시스템은 이후에 측정 가능한 신호를 형성하기 위해 요구되는 모든 성분들을 포함할 것이다. 이러한 다른 성분들은 기질, 조효소, 인헨서(enhancer), 추가 효소, 효소 산물과 반응하는 물질, 촉매, 활성화제, 공동인자, 억제제, 스캐빈져(scavenger), 금속 이온, 및 신호 발생 물질을 결합하기 위해 요구되는 특정 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 신호 형성 시스템의 상세한 논의는 미국특허번호 제5,185,243호(Ullman, 등), 컬럼 11-13에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

라벨 또는 다른 sps 구성원은 지지체에 결합될 수 있다. 분석물 또는 분석물 유사체는 당해 분야에 공지된 임의의 방식으로 고체 지지체에 결합될 수 있으며, 단 결합은 항체와 결합하는 분석물 또는 유사체의 능력을 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 구체예에서, 분석물 또는 분석물 유사체가 코팅되거나(coated) 고체상에 직접적으로 공유 결합될 수 있거나, 하나 이상의 담체 분자의 층, 예를 들어 혈청 알부민(serum albumin) 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 또는 다당류 (탄수화물), 예를 들어 덱스트란(dextran) 또는 덱스트란 유도체를 포함하는 폴리(아미노산)을 가질 수 있다. 연결 기는 또한, 고체 지지체 및 분석물을 공유 결합하기 위해 사용될 수 있다. 분석물을 결합하는 다른 방법이 또한 가능하다. 예를 들어, 고체 지지체는 예를 들어 아비딘, 항체 등과 같은 소분자, 및 예를 들어 바이오틴, 합텐 등과 같은 소분자에 대한 결합제의 코팅(coating)을 가질 수 있거나, 분석물에 결합될 수 있거나, 그 역으로도 가능하다. 지지체의 표면에 대한 성분의 결합은 직접 또는 간접적일 수 있고, 공유 또는 비-공유적일 수 있고, 통상적으로 문헌에서 입수 가능한 널리 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다[참조, 예를 들어, "Immobilized Enzymes," Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) and Cautrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970)].

지지체는 유기 또는 무기, 고체 또는 유체, 수불용성 물질로 이루어질 수 있으며, 이는 투명하거나 일부 투명할 수 있다. 지지체는 임의의 여러 형상, 예를 들어 비드(bead)를 포함하는 입자, 필름(film), 막, 튜브(tube), 벽, 스트립(strip), 로드(rod), 평면 (예를 들어, 플레이트(plate), 및 페이퍼(paper)), 및 섬유를 가질 수 있다. 검정의 타입에 따라, 지지체는 이용되는 매질에서 현탁 가능할 수 있거나 가능하지 않을 수 있다. 현탁 가능한 지지체의 예는 예를 들어 폴리머 물질, 예를 들어 라텍스, 지질 이중층 또는 리포좀, 오일(oil) 점적, 세포 및 하이드로겔(hydrogel), 및 자성 입자이다. 다른 지지체 조성물은 폴리머, 예를 들어 니트로셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 및 폴리(비닐 부티레이트)를 포함하는데, 그 자체로 또는 다른 물질과 함께 사용된다.

지지체는 입자일 수 있다. 입자는 적어도 약 0.02 마이크론(micron) 및 약 100 마이크론 이하의 평균 직경을 가질 것이다. 일부 구체예에서, 입자는 약 0.05 마이크론 내지 약 20 마이크론, 또는 약 0.3 마이크론 내지 약 10 마이크론의 평균 직경을 갖는다. 입자는 유기 또는 무기, 팽윤 가능하거나 비-팽윤 가능한, 다공성 또는 비-다공성, 바람직하게 물과 유사한 밀도, 일반적으로 약 0.7 g/mL 내지 약 1.5 g/mL의 밀도일 수 있고 투명하거나, 일부 투명하거나 불투명할 수 있는 물질로 이루어질 수 있다. 입자는 생물학적 물질, 예를 들어 세포 및 미생물, 예를 들어 적혈구, 백혈구, 림프구(lymphocyte), 하이브리도마(hybridoma), 스트렙토코쿠스(streptococcus), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균, 바이러스(virus), 등일 수 있다. 입자는 또한 유기 및 무기 폴리머로 이루어진 입자, 리포좀, 라텍스 입자, 자성 또는 비-자성 입자, 인지질 소포, 카일로미크론(chylomicron), 지질단백질, 등일 수 있다. 일부 구체예에서, 입자는 크롬 디옥사이드 (크롬(chrome)) 입자 또는 라텍스 입자이다.

폴리머 입자는 부가 또는 축합 폴리머로 형성될 수 있다. 입자는 수성 매질에서 용이하게 분산 가능할 것이고 연결 기를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 분석물에 콘주게이션(conjugation)시키기 위하여 흡착성이거나 작용화 가능할 수 있다. 입자는 또한 천연 발생 물질, 합성적으로 개질된 천연 발생 물질, 및 합성 물질로부터 유도될 수 있다. 특정의 고려되는 유기 폴리머들 중에는 예를 들어, 다당류, 특히 가교된 다당류, 예를 들어 SEPHAROSE®로서 입수 가능한 아가로즈(agarose), SEPHADEX® 및 SEPHACRYL®로서 입수 가능한 덱스트란, 셀룰로오즈, 전분, 등; 부가 폴리머, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 아크릴레이트 및 메타크릴레이트의 유도체, 특히 자유 하이드록실 작용성을 갖는 에스테르 및 아미드의 호모폴리머 및 코폴리머가 있다.

라벨 및/또는 다른 sps 구성원은 sbp 구성원 또는 다른 분자에 결합될 수 있다. 예를 들어, 라벨은 sbp 구성원, 예를 들어 항체, 항체에 대한 수용체, 항체에 콘주게이트된 소분자에 결합할 수 있는 수용체, 또는 분석물 유사체에 공유 결합될 수 있다. sbp 구성원에 대한 라벨의 결합은 라벨의 수소 원자를 sbp 구성원에 대한 결합으로 대체하는 화학 반응에 의해 달성될 수 있거나, 라벨과 sbp 구성원 사이에 연결 기를 포함할 수 있다. 다른 sps 구성원은 또한 sbp 구성원에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 두 개의 sps 구성원, 예를 들어 형광 물질 및 켄처(quencher)는 각각 분석물을 갖는 특정 복합물을 형성하는 상이한 항체에 결합될 수 있다. 복합물의 형성은 형광 물질 및 켄처를 매우 근접하게 하며, 이에 따라 켄처를 형광 물질과 상호작용하게 하여 신호를 형성시킨다. 콘주게이션 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있다[참조, 예를 들어 Rubenstein, 등, 미국특허번호 제3,817,837호, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함됨].

라벨 단백질로서 특별히 고려되는 효소는 레독스(redox) 효소, 특히 탈수소효소, 예를 들어 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소, 및 락테이트 탈수소효소, 및 과산화수소의 생산 및 염료 전구체를 염료로 산화시키기 위한 과산화수소의 사용을 수반하는 효소이다. 특정 조합은 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 즉 퍼옥시다제(peroxidase), 예를 들어 서양고추냉이 퍼옥시다제(horse radish peroxidase), 락토퍼옥시다제(lactoperoxidase), 또는 마이크로퍼옥시다제(microperoxidase)와 커플링된(coupled), 사카라이드 옥시다제(saccharide oxidase), 예를 들어 글루코즈(glucose) 및 갈락토즈 옥시다제(galactose oxidase), 또는 헤테로사이클릭 옥시다제(heterocyclic oxidase), 예를 들어 우리카제(uricase) 및 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase)를 포함한다. 추가 효소 조합은 당해 분야에 공지되어 있다. 단일 효소가 라벨로서 사용될 때에, 다른 효소, 하이드롤라제(hydrolases), 트랜스퍼라제(transferases), 및 산화환원효소, 바람직하게 하이드롤라제, 예를 들어 알칼리 포스파타제 및 베타-갈락토시다제가 사용될 수 있다. 대안적으로, 루시페라제(luciferases), 예를 들어 파이어플라이(firefly) 루시페라제 및 박테리아 루시페라제(bacterial luciferase)가 사용될 수 있다.

사용되는 예시적인 조효소는 NAD[H], NADP[H], 피리독살 포스페이트(pyridoxal phosphate), FAD[H], FMN[H], 등, 대개 사이클링(cycling) 반응을 수반하는 조효소를 포함한다[참조, 예를 들어, 미국특허번호 제4,318,980호, 이의 문헌은 본원에 참고로 포함됨].

예를 들어 효소와 같은 라벨 단백질과 관련하여, 분자량 범위는 약 10,000 내지 약 600,000, 또는 약 10,000 내지 약 300,000 분자량일 것이다. 예를 들어, 대개 약 200,000 분자량 당 적어도 약 1 분석물, 또는 약 150,000 분자량 당 적어도 약 1, 또는 약 100,000 분자량 당 적어도 약 1, 또는 약 50,000 분자량 당 적어도 약 1 분석물이 존재한다. 효소의 경우에, 분석물 유사체 기의 수는 예를 들어 1 내지 약 20, 약 2 내지 약 15, 약 3 내지 약 12, 또는 약 6 내지 약 10이다.

용어 "비-폴리(아미노산) 라벨"은 단백질이 아닌(예를 들어, 효소) 라벨을 포함한다. 비-폴리(아미노산) 라벨은 직접적으로 검출될 수 있거나, 검출 가능한 신호를 형성시키는 특정 결합 반응을 통해 검출 가능하다. 비-폴리(아미노산) 라벨은 예를 들어 방사성 동위원소, 발광 화합물, 지지체, 예를 들어 입자, 플레이트, 비드, 등, 폴리뉴클레오티드, 등을 포함한다. 보다 특히, 비-폴리(아미노산) 라벨은 동위원소 또는 비-동위원소, 대개 비-동위원소일 수 있고, 촉매, 프로모터, 염료, 조효소, 효소 기질, 방사성 기, 유기 소분자(예를 들어, 바이오틴, 형광 분자, 화학발광 분자, 등을 포함), 증폭 가능한 폴리뉴클레오티드 서열, 지지체, 예를 들어 입자, 예를 들어 라텍스 또는 카본 입자 또는 크롬 디옥사이드 (크롬) 입자, 금속 졸, 결정질, 리포좀, 또는 세포를 위해 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 이는 예를 들어, 염료, 촉매 또는 다른 검출 가능한 기로 추가로 라벨링될 수 있거나 라벨링되지 않을 수 있다.

일 구체예에서, 검정은 유도된 발광 면역검정이며, 이는 미국특허번호 제5,340,716호[Ullman, 등, 발명의 명칭 "Assay Method Utilizing Photoactivated Chemiluminescent Label" ("유도 발광 검정"), 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함됨]에 기재되어 있다. 한 방법에서, 검정은 감광제를 도입하는 입자 및 화학발광 화합물을 도입하는 라벨 입자를 사용한다. 라벨 입자는 sbp 구성원, 예를 들어 복합물을 형성하기 위해 분석물에 결합할 수 있는 분석물에 대한 항체에, 또는 분석물의 양에 대해, 복합물을 형성하기 위해 제2 sbp 구성원에 콘주게이션된다. 분석물이 존재하는 경우에, 감광제 및 화학발광 화합물은 아주 근접한 상태가 된다. 감광제는 싱글렛 산소(singlet oxygen)를 발생시키고, 두 개의 라벨들이 아주 근접하게 되었을 때 화학발광 화합물을 활성화시킨다. 활성화된 화학발광 화합물은 후속하여 광을 형성시킨다. 형성된 광의 양은 형성된 복합물의 양과 관련이 있으며, 이는 분석물에 대한 항체를 포함한다.

추가 예시로서, 화학발광 입자가 이용되는데, 이는 예를 이에 도입 또는 이에 대한 부착에 의한 것과 같이 이와 결합된 화학발광 화합물을 포함한다. 예를 들어 분석물에 대한 항체와 같은 분석물에 결합하는 sbp 구성원은 다당류에 결합되어 입자를 코팅한다. 분석물에 결합하는 제2 sbp 구성원은 바이오틴 콘주게이트의 일부이다. 스트렙타비딘(Streptavidin)은 이와 결합된 감광제를 갖는 제2 세트의 입자에 콘주게이션된다. 이러한 제2 세트의 입자(감광제 입자)에 스트렙타비딘의 결합은 입자 상에 다당류를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 화학발광 입자는 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플의 개개 부분과 및 감광제 입자와 혼합된다. 샘플의 제1 부분과 관련하여, 반응 매질은 입자들을 샘플 중의 분석물 이외의 물질들 또는 성분들에 결합할 수 있도록 인큐베이션된다. 샘플의 제2 부분과 관련하여, 반응 매질은 분석물에 대한 sbp 구성원의 결합에 의하여 입자들을 분석물에 결합할 수 있도록 인큐베이션된다. 이후에, 매질은 감광제를 여기시키기 위해 광으로 조사되는데, 이는 이의 여기된 상태에서 산소를 싱글렛 상태로 활성화시킬 수 있다. 입자 세트들 중 하나의 화학발광 화합물이 분석물의 존재에 의하여 감광제에 매우 근접하여 있기 때문에, 이는 싱글렛 산소에 의해 활성화되고 발광을 방출한다. 매질은 이후에 발광 또는 방출되는 광에 대해 시험되는데, 이의 존재는 분석물의 양과 관련이 있다.

분석물의 결정을 위해 이용될 수 있는 검정의 다른 특정 예는 미국특허번호 제5,616,719호(Davalian, 등)에서 논의되어 있는데, 이러한 문헌에는 형광 산소 채널링 면역검정이 기재되어 있다.

상기에서 논의된 검정은 일반적으로 최적의 검정 민감성을 제공하는 중간 pH에서 수성 완충된 매질에서 대개 수행된다. 검정 매질에 대한 pH는 대개 약 4 내지 약 11의 범위, 또는 약 5 내지 약 10의 범위, 또는 약 6.5 내지 약 9.5의 범위일 것이다. pH는 대개 예를 들어 임의의 특정 결합 쌍의 결합 구성원의 최적의 결합과 신호 형성 시스템의 구성원과 같은 검정의 다른 시약에 대해 최적의 pH 간에 절충될 것이다. 다양한 완충제는 인큐베이션 기간 동안에 요망되는 pH를 달성하고 pH를 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적 완충제는 보레이트, 포스페이트, 카보네이트, 트리스(Tris), 바르비탈(barbital), PIPES, HEPES, MES, ACES, MOPS, BICINE, 등을 포함한다. 매질은 또한 혈전의 형성을 방지하기 위한 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 에틸렌디아민 테트라아세테이트(EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세테이트 (EGTA), 시트레이트, 헤파린(heparin) 등을 포함한다. 다양한 보조 물질은 검정 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 완충제 및 보존제 이외에, 매질은 매질 및 이용되는 시약에 대한 안정화제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 이러한 첨가제 이외에, 단백질, 예를 들어 알부민; 4차 암모늄 염; 폴리음이온, 예를 들어 덱스트란 설페이트; 및 결합 인헨서가 포함될 수 있다. 상기 물질들 모두는 요망되는 효과 또는 기능을 달성하기에 충분한 농도 또는 양으로 존재한다.

하나 이상의 인큐베이션 기간은 상술된 다양한 시약들의 첨가 간의 임의의 간격을 포함하는 하나 이상의 간격으로 매질에 적용될 수 있다. 매질은 대개 시약의 다양한 성분의 결합이 일어나기에 충분한 시간 동안 및 온도에서 인큐베이션된다. 중간 온도, 및 대개 측정 기간 동안에 일정한 온도, 바람직하게 실온은 대개 방법을 수행하기 위해 이용된다. 인큐베이션 온도는 대개 예를 들어 약 5℃ 내지 약 99℃, 또는 약 15℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃ 범위이다. 인큐베이션 기간은 예를 들어, 약 0.2 초 내지 약 24 시간, 또는 약 1 초 내지 약 6 시간, 또는 약 2 초 내지 약 1 시간, 또는 약 1 내지 약 15 분이다. 이러한 기간은 매질의 온도, 및 다양한 시약의 결합 속도에 의존적이다. 측정 동안의 온도는 일반적으로 약 10℃ 내지 약 50℃, 또는 약 15℃ 내지 약 40℃의 범위일 것이다.

검정될 수 있는 분석물의 농도는 일반적으로 약 10^-5 내지 약 10^-17 M, 또는 약 10^-6 내지 약 10^-14 M에서 다양하다. 예를 들어 검정이 정성적, 반-정량적, 또는 정량적인지를 고려하여(샘플 중에 존재하는 친적혈구성(erythrocytophilic) 약물 분석물의 양에 대해), 특정 검출 기술 및 분석물의 농도는 대개 다양한 시약의 농도를 결정한다.

검정 매질 중의 다양한 시약의 농도는 일반적으로 예를 들어 고려되는 분석물의 농도 범위, 검정 특성, 항체 친화력 및 결합활성 및 항체 단편화에 의해 결정될 것이다. 그러나, 각 시약의 최종 농도는 대개 범위에 따른 검정의 민감성을 최적화하기 위해 경험적으로 결정된다. 즉, 유의성을 갖는 분석물의 농도의 편차는 정확하게 측정 가능한 신호 차이를 제공할 것이다. 신호 형성 시스템의 특성 및 분석물의 특성과 같은 고려사항은 대개 다양한 시약의 농도를 결정한다.

첨가 순서가 널리 다양해질 수 있지만, 검정의 특성에 따라 특정의 선호성이 존재할 것이다. 가장 단순한 첨가 순서는 모든 물질들을 동시에 첨가하고, 검정 매질이 균일 검정에서와 같이 신호에 대한 효과를 결정한다. 대안적으로, 시약은 순차적으로 조합될 수 있다. 임의적으로, 인큐베이션 단계는 상기에서 논의된 바와 같이 각 첨가에 후속하여 수반될 수 있다. 인큐베이션 기간의 길이는 요망되는 기능을 달성하기에 충분한 길이이다.

특정의 면역억제 분석물에 대한 검정의 특정 구체예

개개 샘플 부분을 검정하기 위해 이용될 수 있는 검정의 특정 구체예는 하기에서 면역 억제 분석물에 대해 일 예로서 그러고 비제한적으로 논의된다.

균일 검정에서, 모든 시약을 조합한 후에, 신호가 결정되고 샘플 중의 분석물의 양과 관련이 있다. 예를 들어, 분석물에 대한 EMIT® 검정에서, 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플은 수성 매질에 분석물의 효소 콘주게이트, 즉 분석물의 유사체, 및 분석물을 인식할 수 있는 항체와 동시에 또는 순차적으로 조합된다. 일반적으로, 효소에 대한 기질이 첨가되며, 이는 효소 촉매화된 반응 시에 색소생산(chromogenic) 또는 형광원(fluorogenic) 생성물을 형성시킨다. 바람직한 효소는 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소 및 알칼리 포스파타제이지만, 다른 효소가 이용될 수 있다. 분석물 및 효소 콘주게이트의 모이어티는 항체 상의 결합 사이트(site)에 대해 경쟁적이다. 매질 중의 효소 활성은 이후에 대개 분광학적 수단에 의해 측정된다.

상술된 검정은 효소 콘주게이트의 효소로서 뮤턴트(mutant) 글루코즈-6-포스페이트 탈수소효소를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 뮤턴트 효소는 미국특허번호 제6,090,567호 및 제6,033,890호에 기재되어 있으며, 이의 관련 내용은 본원에 참고로 포함된다. 또한, 검정은 분석물에 대한 항체를 사용하고 미국특허번호 제5,328,828호 및 제5,135,863호에 기술된 바와 같은 절차를 사용하여 수행될 수 있으며, 이러한 문헌의 관련 내용은 본원에 참고로 포함된다.

불균일 검정은 대개 하나 이상의 분리 단계를 포함하고, 경쟁적이거나 비경쟁적일 수 있다. 다양한 경쟁적 및 비경쟁적 검정 포맷은 미국특허번호 제5,089,390호(Davalian, 등), 컬럼 14, 25줄에서 컬럼 15, 9줄에 기재되어 있으며, 이러한 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 한 타입의 경쟁 검정에서, 본원에 논의된 바와 같은 이에 결합된 분석물에 대한 항체를 갖는 지지체는 샘플을 함유한 매질 및 분석물의 적절한 효소 콘주게이트와 접촉된다. 지지체 및 매질을 분리한 후에, 지지체 또는 매질의 효소 활성은 측정 결과를 결정하기 위해 통상적인 기술에 의해 결정된다.

특정 구체예에서, 제2 효소는 효소 콘주게이트의 효소에 추가하여 이용될 수 있다. 한 쌍의 효소의 효소들은 제1 효소의 산물이 제2 효소에 대한 기질로서 제공하는 것과 관련이 있다.

검정 포맷의 다른 구체예는 캡쳐(capture) 검정이다. 이러한 검정 포맷에서, 분석물에 대한 항체는 자성 입자에 공유 결합된다. 샘플은 이러한 입자들과 인큐베이션되어, 분석물에 대한 항체를 분석물에 결합시킬 수 있다. 후속하여, 분석물 또는 공유적으로 부착된 분석물의 유도체를 갖는 효소는 자성 입자와 함께 인큐베이션된다. 세척 후에, 자성 입자에 결합된 효소의 양이 측정되고 분석물에 대한 항체를 포함하는 복합물의 양과 역으로 관련이 있다.

하기 검정 설명은 본 실시예의 범위의 예시이지만, 이로 제한되지 않는다. 면역억제 약물로서 타크로리무스 또는 시롤리무스의 선택은 또한 본 발명이 특히 면역억제 약물, 및 일반적으로 다른 분석물의 검출에 대한 일반적인 적용을 갖는 것으로 예시되지만 이로 제한되지 않는다.

일 구체예에서, 샘플 부분은 타크로리무스 콘주게이트, 즉 예를 들어 바이오틴에 부착된 타크로리무스의 유사체와 혼합된다. 분석될 샘플의 부분에 따라, 샘플 부분은 분석물 이외의 샘플 중의 물질들의 결합을 타크로리무스에 대한 항체에 결합시키거나 이러한 물질 및 샘플의 타크로리무스의 결합을 항체 타크로리무스 또는 타크로리무스의 유사체에 결합시킬 수 있는 타크로리무스의 유사체와 경쟁적인 타크로리무스에 대한 항체에 결합할 수 있게 하기 위해 인큐베이션된다. 적절한 세척 완충제로 세정한 후에, 효소에 콘주게이트된 스트렙타비딘 또는 아비딘, 형광 또는 화학발광 분자 또는 방사선 활성 모이어티로 이루어진 검색 분자(detection molecule)가 매질에 첨가될 수 있으며, 이는 이후에 신호의 양에 대해 시험된다. 신호의 양은 샘플 중의 타크로리무스의 양에 관한 것이다.

일 구체예에서, 이용되는 검정은 상술된 바와 같이 유도된 발광 검정이다. 일 예로서 그리고 비제한적으로 유도된 발광 검정의 일부 구체예에서, 시약은 두 개의 라텍스 비드 시약 및 바이오틴화된 항-타크로리무스 마우스(mouse) 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 제1 비드 시약은 타크로리무스 또는 타크로리무스 유사체로 코팅되고 화학발광 염료를 함유한다. 제2 비드 시약은 스트렙타비딘으로 코팅되고 감광제 염료를 함유한다. 타크로리무스를 함유할 것으로 의심되는 샘플의 부분은 상술된 바와 같이 처리된다. 한 샘플 부분은 대체제로의 처리 없이 타크로리무스에 대한 항체로 처리된다. 샘플 부분은 타크로리무스에 대한 바이오틴화된 항체와 함께 인큐베이션되며, 이는 샘플 중의 타크로리무스를 바이오틴화된 항체에 결합시킬 수 있다. 제2 단계에서, 제1 비드 시약이 첨가되고 분석물에 결합하지 않는 소정 분율의 바이오틴화된 항체를 갖는 비드/바이오틴화된 항체 면역복합물을 형성시킨다. 제2 비드 시약은 이후에 첨가되고 바이오틴에 결합하여 비드 쌍 면역복합물을 형성한다. 680 nm의 광에 의해 비춰질 때에, 제2 비드 시약은 반응 용액 중의 용해된 산소를 보다 높은 에너지를 갖는 싱글렛 산소 형태로 전환시킨다. 비드 쌍에서, 싱글렛 산소는 제1 비드 시약으로 확산되고, 이에 의해 화학발광 반응을 촉발시킨다. 얻어진 화학발광 신호는 612 nm에서 측정되고, 타크로리무스 항체에 결합하는 샘플 중의 타크로리무스 이외의 물질의 농도의 역함수이다. 이러한 신호의 양은 샘플 중의 이러한 물질의 양과 관련이 있다.

동일한 검정은 또한, 다른 샘플 부분에 대해 수행되는데, 이는 FK506으로 처리되어 샘플 중의 내생성 결합 물질로부터 타크로리무스를 방출시킨다. 검정을 수행한 후에, 얻어진 화학발광 신호는 612 nm에서 측정되고,타크로리무스 항체에 결합하는 샘플 (내생성 결합 물질에 결합된 타크로리무스 및 자유 타크로리무스 둘 모두) 중의 타크로리무스의 농도의 역함수이다. 자유 타크로리무스의 양 및 대체된 것의 양으로부터 자유 타크로리무스의 양의 차감은 샘플 중의 결합된 아크로리무스의 양을 제공하며, 이러한 수치는 내생성 방해 물질의 존재 하에 샘플 중의 타크로리무스의 전체 양을 계산하기 위해 상술된 방정식에서 사용될 수 있다.

일 예로서 그리고 비제한적으로, 다른 검정 포맷의 일 예는 ACMIA (Affinity Chromium dioxide Mediated Immuno Assay)이다. ACMIA 검정 포맷에 대하여, 시롤리무스 또는 시롤리무스 유사체로 코팅된 크롬 입자는 제1 성분으로서 이용된다. 제2 성분은 시롤리무스에 대한 항체이다. 수용체 효소(예를 들어, β-갈락토시다제)에 가교된 이러한 항체는 반응 용기에 과량으로, 즉 샘플 중에 존재할 수 있는 시롤리무스 분석물 모두를 결합하기 위해 요구되는 것 보다 많은 양으로 첨가된다. 시롤리무스를 함유할 것으로 의심된 샘플은 동일한 부분으로 나누어진다. 대체제로 처리되지 않은 한 샘플 부분은 시롤리무스에 대한 항체로 처리되는데, 이는 자유 시롤리무스에 결합하지만, 검정에서 이용되는 다른 시약에 결합하지 않거나 샘플 중의 방해 물질에 결합하지 않는다. 항체-효소 콘주게이트는 시롤리무스 분석물을 항체에 결합하기 위하여 샘플과 혼합된다. 다음으로, 크롬 입자 시약이 첨가되어 임의의 과량의 항체-효소 콘주게이트를 결합한다. 이후에, 자석이 적용되는데, 이는 현탁액으로부터 크롬 입자 및 과량의 항체-효소를 끌어당기며, 상청액은 최종 반응 용기로 옮겨진다. 수용체 효소의 기질은 최종 반응 용기에 첨가되며, 효소 활성은 시간에 따른 흡광도의 변화로서 분광학적으로 측정된다. 이러한 신호의 양은 샘플 중의 자유 시롤리무스의 양과 관련이 있다.

동일한 검정은 또한 다른 샘플 부분에 대해 수행되는데, 이는 샘플 중의 내생성 결합 물질로부터 시롤리무스를 방출하기 위하여 대체제로서 타크로로리무스 에스테르로 처리된 것이다. 검정을 수행한 후에, 얻어진 효소 활성이 측정되고, 내생성 결합 물질로부터 대체된 시롤리무스 및 자유 시롤리무스 둘 모두의 양과 관련이 있다. 제2 샘플 부분으로부터 얻어진 효소 활성으로부터 제1 샘플 부분으로부터 얻어진 효소 활성의 차감은 샘플 중의 내생성 결합 물질에 의해 결합된 샘플 중의 시롤리무스의 양에 기여하는 효소 활성의 양을 제공하는데, 이는 결합된 시롤리무스의 양과 관련이 있다. 이러한 수치는 내생성 방해 물질의 존재 하에 샘플 중의 시롤리무스의 전체 양을 계산하기 위해 상술된 방정식에서 사용될 수 있다.

측정 단계

본원에 기술된 원리들에 따른 면역 검정이 사용되는 방법은 분석물에 대한 항체(항-분석물 항체)를 포함하는 복합물의 양에 대한 각 개개 검정 매질을 시험하는 것을 포함한다. 이러한 측정은 각 검정 매질에 대해 개별적으로 수행되고 이후에 이용되는 특정 검정에 따라 검정 매질을 인큐베이션한다. 하나의 샘플 부분의 경우에, 측정은 항-분석물 항체를 포함하는 복합물을 형성하기 위하여 항-분석물 항체에 대한 샘플 중의 자유 분석물(즉, 내생성 결합 물질에 의해 결합되지 않은 샘플 중의 분석물)의 양을 반영한다. 제2 샘플 부분의 경우에, 측정은 샘플 중의 자유 분석물 뿐만 아니라 항-분석물 항체를 포함하는 복합물을 형성하기 위해 항-분석물 항체에 대체제를 첨가함으로써 방출되는 샘플 중의 분석물 둘 모두인 분석물의 양을 나타내는 분석물의 양을 반영한다.

구 "분석물의 양을 측정하는"은 분석물의 정성적, 반-정량적 및 정량적 결정을 지칭한다. 정성적, 반-정량적, 및 정량적인 방법, 뿐만 아니라 분석물을 결정하는 다른 방법은 분석물의 양을 측정하는 방법인 것으로 여겨진다. 예를 들어, 단지 분석물을 함유할 것으로 의심되는 샘플 중의 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 방법은 본 구체예의 범위 내에 포함되는 것으로 여겨진다. 용어 "검출하는" 및 "결정하는" 뿐만 아니라 측정하기 위한 다른 일반적인 동의어는 본 구체예의 범위 내에서 고려된다.

여러 구체예에서, 매질의 시험은 매질로부터 신호의 검색을 포함한다. 신호의 양은 샘플 중의 분석물의 양과 관련이 있다. 특정 검색 모드(mode)는 신호 형성 시스템의 특성에 의존적이다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 요망되는 경우에 시각적 시험에 의해 sps의 라벨이 외부 수단에 의해 검색 가능한 신호를 형성시킬 수 있는 여러 방법이 존재하고, 예를 들어 전자기 방사선, 전기화학, 열, 방사능 검색, 및 화학적 시약을 포함한다.

신호 형성 시스템의 활성화는 신호 형성 시스템 구성원의 특성에 의존적이다. 광으로 활성화되는 신호 형성 시스템의 구성원에 대하여, 구성원은 광으로 조사된다. 입자의 표면 상에 존재하는 신호 형성 시스템의 구성원에 대하여, 염기의 첨가는 활성화를 초래할 수 있다. 다른 활성화 방법은 본원의 내용의 측면에서 당업자에게 제안될 것이다. 일부 신호 형성 시스템에 대하여, 활성화를 위한 제제, 예를 들어 방사성 라벨, 효소 등인 라벨을 포함하는 시스템이 필수적인 것은 아니다. 효소 시스템에 대하여, 기질 및/또는 공동 인자의 첨가가 필수적일 수 있다.

신호의 양에 대한 시험은 또한 신호의 검색을 포함하는데, 이는 일반적으로 단지 신호를 판독하는 단계이다. 신호는 대개 기기를 사용하여 판독되는데, 이의 특성은 신호의 특성에 의존적이다. 기기는 예를 들어 분광기, 형광기, 흡수 분광기, 발광기, 화학발광기, 광량계, 또는 사진 기기일 수 있다. 검색된 신호의 양은 샘플 중에 존재하는 분석물의 양과 관련이 있다. 측정 동안의 온도는 일반적으로 예를 들어 약 10℃ 내지 약 70℃, 또는 약 20℃ 내지 약 45℃, 또는 약 20℃ 내지 약 25℃의 범위이다. 한 방법에서 표준 곡선은 스크리닝될(screened) 분석물의 공지된 농도를 이용하여 형성된다. 본원에서 논의되는 바와 같이, 보정물 및 다른 컨트롤(control)이 또한 사용될 수 있다.

샘플 부분에 대한 검정을 수행하기 위한 키트

특정 검정을 수행하기 위한 시약은 분석물의 결정을 위한 검정을 편리하게 수행하는데 유용한 키트에 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 키트는 내생성 결합 물질로부터 분석물을 대체하기 위한 패키징된(packaged) 조합 시약, 분석물에 대한 항체 및 검정을 수행하기 위한 다른 시약을 포함하는데, 이의 특성은 특정 검정 포맷에 의존적이다. 시약 각각은 별도의 용기에 존재할 수 있거나, 다양한 시약은 시약의 교차 반응성 및 안정성에 따라 하나 이상의 용기에서 조합될 수 있다. 키트는 검정을 수행하기 위한 다른 별도로 패키징된 시약, 예를 들어 추가 sbp 구성원, 보조 시약, 예를 들어 보조 효소 기질, 등을 추가로 포함할 수 있다.

키트에서 다양한 시약의 상대적인 양은 본 방법 동안에 일어나고 검정의 민감성을 실질적으로 최적화하는데 필요한 반응을 실질적으로 최적화하는 시약의 농도를 제공하기 위해 넓게 달라질 수 있다. 적절한 상황 하에서, 키트에서의 하나 이상의 시약은 부형제를 포함하는 건조 분말로서 제공될 수 있으며, 대개 동결건조될 수 있는데, 이는 용해 시에 방법 또는 검정을 수행하기 위한 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 것이다. 키트는 상술된 바와 같이 본 구체예에 따른 방법의 기술된 설명을 추가로 포함할 수 있다.

샘플 부분에 대한 검정을 수행하기 위한 장치

상술된 바와 같이, 본원에 기술된 원리들에 따른 방법은 방법 단계들을 수행하기 위해 검정 장치를 사용하여 자동화될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 컴퓨터(computer) 제어 하에서, 즉 검정 장치와 결합될 수 있는 컴퓨터의 도움으로 수행될 수 있다. 컴퓨터는 예를 들어, 개인용 컴퓨터(PC)일 수 있다. 컴퓨터는 특히 상술된 방정식을 이용한 계산을 포함하는 본원에 기술된 방법을 위한 소프트웨어(software)에 의해 구동된다.

이러한 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 소프트웨어는 예를 들어, 사용자-기록 기능 및 템플릿(template)을 통해 적합하게 확장되고 필수적인 경우에 다른 기능을 수행하는 독립형 프로그램(stand-alone program)에 연결된 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 또는 마이크로소프트 액세스(Microsoft Access)일 수 있다. 본 방법을 수행하는데 도움을 주는데 사용되는 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램의 예는 예를 들어 C, C++, 또는 Visual basic으로 기록될 수 있다. 본원에서 사용되는 상기 컴퓨터 정보 및 소프트웨어가 일 예로서 그러나 비제한적인 것으로 이해될 것이다. 본 방법은 다른 컴퓨터 및 소프트웨어로 구성될 수 있다.

컴퓨터 프로그램은 상기 방법 단계들을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 (i) 분석물에 대한 검정을 이용하여 내생성 결합 물질에 의해 결합된 미지 샘플 중의 분석물의 일부의 양 [Y]을 측정하고, (ii) 화학식 [Z] = a[Y] + b (여기서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 실질적으로 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 샘플에 대한 검정을 수행함으로써 결정됨)에 의해 내생성 결합 물질에 의해 결합되지 않은 미지 샘플 중의 분석물의 양 [Z]를 결정하고, (c) [Y]와 [Z]를 더하여 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]을 얻는 것을 제공한다.

기술된 원리에 따른 일부 예에서, 컴퓨터 프로그램은 (i) 하기 (a') 내지 (c')에 의해 내생성 결합 물질에 의해 결합된 타크로리무스의 부분의 양 [Y]을 측정하되, (a') 내생성 결합 물질로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 존재 하에 샘플의 일부에 대해 수행되는 검정에 의해 타크로리무스의 양 [V]를 측정하고, (b') 내생성 결합 물질로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 부재 하에 샘플의 일부에 대해 수행된 검정에 의해 타크로리무스의 양 [W]를 결정하고, (c') [V]에서 [W]를 차감하고, (ii) 식 [Z] = a[Y] + b (여기서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 실질적으로 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 샘플에 대한 검정을 수행함으로써 사전결정됨)에 의해 내생성 결합 물질에 의해 결합되지 않는 타크로리무스의 양 [Z]를 결정하고, (c) [Y]와 [Z]를 더하여 샘플 중의 타크로리무스의 전체 양 [X]를 결정하는 것을 제공한다.

컴퓨터 프로그램은 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능한 저장 장치를 포함하고 프로그래밍 가능한 프로세서(programmable processor)에 로딩될(loaded) 때에 본 발명의 방법을 수행하기 위해 요구되는 절차를 실행하도록 장치의 프로세서로 명령을 제공하는 프로그램 제품 상에서 수행될 수 있다. 컴퓨터 판독 가능한 저장 장치는 광학적, 자기적, 또는 고체 상태 메모리(memory)일 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 휴대 가능하거나 고정될 수 있다. 본원에 기술된 원리들에 따른 일부 예는 컴퓨터에 로딩될 때에 상술된 방법을 수행하는 컴퓨터 프로그램이 저장된 컴퓨터 판독 가능한 저장 장치를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다.

본 명세서에서 인용된 모든 공개문 및 특허 출원은 각 개개 공개문 또는 특허 출원이 참고문헌으로 포함되도록 상세하게 그리고 개별적으로 명시되는 것 처럼 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용되는 구 "적어도"는 명시된 항목들의 수가 기술된 수와 동일하거나 그 보다 많을 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 구 "약"은 기술된 수는 플러스(plus) 또는 마이너스(minus) 10% 차이가 날 수 있으며, 예를 들어, "약 5"는 4.5 내지 5.5의 범위를 의미한다.

하기 실시예는 일 예로서 그러나 비제한적으로 본 발명의 특정 구체예를 추가로 기술하고, 본 발명의 범위를 기술하는 것이지 이를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기술된 부 및 백분율은 달리 명시하지 않는 한 부피 기준이다.

실시예

모든 화학물질은 달리 주지하지 않는 한 Sigma-Aldrich Company (St. Louis MO)로부터 구입될 수 있다. 타크로리무스는 Astellas Pharma US. Inc.(Deerfield IL)로부터 획득될 수 있다. 시롤리무스는 Pfizer Inc.(New York NY)로부터 획득될 수 있다.

시험을 Siemens Healthcare Diagnostics Inc.(Newark DE)로부터 입수 가능한 DIMENSION^® RxL 분석기를 이용하여 수행하였다. 기기를 ACMIA 면역검정 기술을 사용하여 이용하였다. ACMIA 검정 방법은 미국특허번호 7,186,518, 5,147,529, 5,128,103, 5,158,871, 4,661,408, 5,151,348, 5,302,532, 5,422,284, 5,447,870, 및 5,434,051호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본원에 포함된다. 본원에서 사용되고 하기에 보다 상세히 논의되는 ACMIA 방법의 구체예에서, 크롬 입자 상의 타크로리무스 유사체와 효소에 콘주게이트된 타크로리무스에 대한 항체에 대한 환자 샘플 중의 타크로리무스("콘주게이트") 간의 경쟁을 사용하여 환자 샘플 중의 타크로리무스의 양을 결정하였다. 크롬 입자 상의 타크로리무스 유사체에 결합하는 콘주게이트를 자기적 분리로 제거하였다. 상청액에 잔류하는 콘주게이트로부터의 효소 활성을 측정하였고, 이는 환자 샘플 중의 타크로리무스의 양에 직접적으로 비례한다. 이용되는 ACMIA 검정 포맷에서, 타크로리무스를 함유하지 않는 샘플을 시험할 때 관찰되는 효소 활성은 활성 항체에 결합되지 않는 (즉, 크롬 입자 상에 타크로리무스를 결합하지 못하는) 효소 활성의 양을 나타낸다. 크롬 입자가 존재하지 않을 때 관찰되는 효소 활성은 콘주게이트 중의 효소 활성의 전체 양을 나타낸다. 이러한 수치들을 사용하여 활성 항체에 결합된 효소 활성의 백분율을 추정할 수 있다.

상술된 ACMIA 검정을 수행함으로써 타크로리무스-부재 전혈 풀(whole blood pool)을 스크리닝하여 실질적으로 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 전혈 풀을 확인하였다. 개개 타크로리무스-부재 전혈 샘플에 대한 풀의 타크로리무스의 회수의 농도를 시험함으로써 스크리닝을 수행하였다. 풀이 타크로리무스-부재 보정물로서 사용될 때에 대부분의 타크로리무스-부재 전혈 샘플의 회수가 검정의 낮은 민감성 내에 있는 경우에, 풀은 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 매트릭스(matrix)로서 허용된다. 이후에 풀을 사용하여, 풀에 상이한 양의 순수한 타크로리무스를 섞음으로써 타크로리무스 보정물 (또는 표준물)을 제조하였다. 이후에, 보정물 (내생성 방해 물질이 실질적으로 존재하지 않음)을 이용하여 방법 보정 동안에 [Z] = a[Y] + b의 관계를 형성시켰으며, 이는 대체제 (시롤리무스)의 존재 및 부재 하에 보정물을 시험함으로써 달성하였다. [Z] 및 [Y] 둘 모두를 보정으로부터 발생하였다. 대체제의 부재 하에 (자유 약물을 나타냄) 보정물을 수행함으로써 보정물의 [Z] 수치를 발생시키고, 대체제의 존재 하에 (결합된 약물을 나타냄) 측정된 전체 약물에서 [Z] 수치를 차감함으로써 보정물의 [Y] 수치를 발생시켰다. 실질적으로 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 전혈 풀로부터 제조된 보정물을 하기 실험에서 사용하기 위해 선택하였다.

실시예 1.

공지된 샘플을 사용하여 타크로리무스 검정을 위한 계수의 결정

항-타크로리무스 항체-β-갈락토시다제 콘주게이트의 제조. 모노클로날 항-타크로리무스 항체 (클론 1H6, 참조, 예를 들어 미국특허번호 제7,078,495호)를 공지된 기술에 따라 표준 헤테로이작용성(heterobifunctional) SMCC (숙신이미딜 트랜스-4-(N-말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트) 링커를 사용하여 β-갈락토시다제에 콘주게이션하였다. 항체 콘주게이트 용액은 대략 7.5 μg/mL 항-타크로리무스 항체-β-갈락토시다제 콘주게이트, 30 mg/mL 프로테아제(protease) 자유 소혈청 알부민, 0.126 mg/mL MgCl₂, 0.03 mL/mL의 에틸렌 글리콜, 35.14 mg/mL PIPES 1.5 소듐 염, 50 mg/mL NaCl 및 베타-갈 무테인(beta-gal mutein) (비활성화된 β-갈락토시다제), pH 6.5를 함유한다.

자기 크롬 입자 제조. 글루타르알데하이드를 통해 크롬 디옥사이드 입자 상에 고정된 항-플루오레세인 항체를 예비-데코레이션(pre-decorate)하기 위해 사용되는, 플루오레세인에 타크로리무스-C22 옥심 (미국특허번호 제7,078,495호에 기술된 것과 유사한 방식으로 제조됨)을 콘주게이션시킴으로써 타크로리무스 크롬 입자 (면역검정 고체상)를 제조하였다. 크롬 입자 시약은 대략 2.5 mg/mL 타크로리무스 크롬 입자 슬러리(slurry), 60.8 mg/mL 트레할로즈(trehalose) 이수화물 및 7.2 mg/mL CARBOWAX®를 함유한다.

샘플의 제조. 상기에서 확인된 실질적으로 내생성 방해 물질이 존재하지 않는 전혈 풀을 사용하였다. 전혈 풀의 분취액 (100 mL)을 다양한 양의 타크로리무스와 섞어서, 전형 샘플 중의 타크로리무스의 얻어진 농도를 0, 2.8, 6.0, 11.9 및 31.3 ng/mL (샘플 I-V)가 되게 하였다.

자유 타크로리무스 분석물 플러스 결합된 타크로리무스 분석물의 농도의 결정. 한 세트의 샘플 I-V를 하기와 같이 처리하였다. 내생성 결합 단백질로부터 샘플 중의 타크로리무스를 대체하기 위하여 각 샘플에 시롤리무스 (SIRO) 대체제를 첨가하였다. SIRO 대체 용액에 대한 포뮬레이션(formulation)은 표 1에 보다 상세히 기술된다.

표 1

샘플을 내생성 결합 물질로부터 타크로리무스를 대체하기 위해 대체제의 존재 하에 37℃에서 140분의 시간 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 각 샘플을 상술된 검정으로 처리하고, 신호 (mAU)를 측정하였으며, 이는 샘플 중의 자유 분석물(내생성 결합 물질에 의해 결합되지 않은 분석물 플러스 내생성 결합 물질로부터 대체된 분석물)의 양을 나타내는 분석물의 농도에 관한 것이다.

검정. 타크로리무스에 대한 ACMIA 검정은 하기와 같다: 15 ㎕의 상기로부터의 전혈 샘플 I-V (내생성 방해 물질이 실질적으로 존재하지 않고 타크로리무스와 섞임)를 DIMENSION® RxL 분석기 상의 용기에서 SIRO 대체 용액(표 1)과 혼합하였다. 먼저 혈액을 초음파 샘플 프로브(probe)와 혼합함으로써 표준 컵으로부터 전혈을 샘플링하였다. 전혈 샘플과 SIRO 대체 용액의 혼합은 SIRO 분자가 존재할 때에 이들의 결합 사이트로부터 결합된 타크로리무스 분자의 대체를 확보한다. 결과적으로, 이러한 검정으로부터 발생된 신호는 샘플 중의 자유 타크로리무스 분석물의 양 플러스 대체된 타크로리무스 분석물(결합된 분석물)의 양에 관한 것이다.

항-타크로리무스 항체-β-갈락토시다제 콘주게이트 (50 ㎕)를 다음으로 각 반응 용기에 첨가하고, 혼합물을 소정 시간(10 내지 15분) 동안 그리고 43℃의 온도에서 유지시켜 존재하는 경우에 타크로리무스를 항체 시약과 반응시켰다. 고정화된 타크로리무스-CMO-DA10-Dexal을 갖는 크롬 입자(50 ㎕)를 각 반응 용기에 첨가하고, 결합되지 않은 콘주게이트를 결합시켰다. 타크로리무스-결합된 항-타크로리무스 항체-β-갈락토시다제 콘주게이트는 크롬 입자에 결합하지 않지만, 크롬 입자로부터 용액을 분리하기 위해 자기장이 상기 반응 혼합물에 인가될 때에 상청액에 존재한다. 성청액을 각 반응 용기에서 광도계 큐벳(photometric cuvette)으로 옮기고 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드 (CPRG)의 존재 하에 콘주게이트의 효소 비율(enzymatic rate)을 측정함으로써 타크로리무스-결합된 콘주게이트를 검출하였다. 각 반응 용기에 대한 비율을 577 및 700 nm에서 이중 염색성으로(bichromatically) 측정하였다.

자유 타크로리무스 분석물의 농도 결정. 한 세트의 샘플 I-V를 표 1의 포뮬레이션이 SIRO를 함유하지 않는 것을 제외하고 상기와 같이 처리하고 검정하였다. 결과적으로, 이러한 검정으로부터 발생된 신호는 샘플 중의 단지 자유 타크로리무스 분석물의 양에 대한 것이다.

결합된 타크로리무스 분석물의 농도 결정. 각 샘플에 대하여 자유 타크로리무스 분석물 플러스 결합된 타크로리무스 분석물의 농도로부터 자유 타크로리무스 분석물의 농도를 차감하여 결합된 타크로리무스 분석물의 농도를 결정하였다. 그 결과는 표 2에 요약되었다.

표 2

자유 분석물의 농도를 도 1에 도시된 바와 같이 결합된 분석물의 농도에 대해 플롯팅하였다. 회귀의 기울기 및 절편은 각각 0.218 및 0.0981로서, 이는 상기에서 논의된 바와 같이 식 [Z] = a[Y] + b에서 계수 "a" 및 "b"에 해당하는 것이다.

이후에, 상기 ACMIA 검정을 내생성 방해 물질을 함유하는 것으로 알려진 미지 생물에 대해 수행하였다. 여러 병원으로부터 샘플을 획득하고, 하기 표 3의 제1 컬럼에 기술된 바와 같이 확인하였다. 결합된 타크로리무스의 농도 [Y]를 상술된 바와 같이 결정하였다. 방정식 [Z] = 0.218[Y] + 0.0981 ("a" 및 "b"에 대한 수치는 이러한 ACMIA 검정에 대해 상기에서 논의된 바와 같이 결정함)를 이용하여 샘플 중의 자유 타크로리무스의 농도 [Z]를 결정하였다. [Y]와 [Z]를 더함으로써 각 샘플 중의 타크로리무스의 추정된 전체 농도 [X]를 결정하였다. 그 결과는 표 3에 요약되어 있다.

표 3

본 명세서에서 인용된 모든 공개문 및 특허 출원은 각 개별적인 공개문 또는 특허 출원이 참고로 포함되도록 상세하고 개별적으로 명시되는 것처럼 본원에 참고로 포함된다.

상기 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 실시예로서 보다 상세하게 기술되었지만, 본 발명의 교시의 측면에서 특정 변형 및 개질이 첨부된 특허청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 또한, 설명을 목적으로, 상기 설명은 본 발명의 충분한 이해를 제공하기 위해 특정 명명법을 사용하였다. 그러나, 특정한 세부사항이 본 발명의 실행하기 위해 요구되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 이에 따라, 본 발명의 특정 구체예의 상기 설명은 예시 및 설명의 목적으로 위해 제시된 것으로서, 이러한 것은 완전하거나 본 발명을 기술된 정확한 형태로 한정하도록 의도되지 않는다. 여러 개질 및 변형은 상기 교시를 고려하여 가능하다. 본 발명의 원리 및 이의 실행 적용을 설명하기 위해 그리고 이에 의해 당업자가 본 발명의 이용할 수 있게 하기 위해 구체예들이 선택되고 기술되었다.

Claims

내생성 방해 물질(endogeneous interfering substance)들의 존재 하에 분석물을 함유할 것으로 의심되는 미지 샘플(sample)에서 분석물의 전체 양을 결정하는 방법으로서,
(a) 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물의 양 [Y]를 측정하는 단계로서, [Y]는
(A) 대체제(displacing agent)의 존재 하에 샘플의 일부에 대해 검정을 수행하는 단계로서, 상기 검정은 샘플 내의 분석물의 양을 결정하기 위한 시약들을 샘플의 일부를 포함하는 매질에 첨가하여 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물과 자유 분석물 모두를 포함하는 샘플 내의 분석물의 양 [V]를 결정하는 것을 포함하고, 상기 시약들은 분석물에 대한 적어도 하나의 결합 파트너를 포함하는 단계,
(B) 대체제의 부재 하에 샘플의 다른 일부에 대해 검정을 수행하여 샘플 내의 자유 분석물의 양 [W]를 결정하는 단계, 및
(C) [V]에서 [W]를 차감하는 단계로써 측정되는, 단계,
(b) 하기 식에 의해 미지 샘플 중의 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물의 양 [Z]를 결정하는 단계:
[Z] = a[Y] + b,
[상기 식에서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플들에 대한 검정을 수행함으로써 사전결정됨], 및
(c) [Y]와 [Z]를 더함으로써 미지 샘플 중의 분석물의 전체 양 [X]를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, "a"가 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물과 내생성 결합 물질들에 의해 결합되는 분석물 간의 회귀(regression)의 기울기이며, "b"가 이러한 회귀의 절편인 방법.
제1항에 있어서, 샘플이 신체 배출물(body excretion), 신체 흡입물(body aspirant), 신체 적출물(body excisant) 또는 신체 추출물(body extractant)인 방법.
제1항에 있어서, 검정이
단계 (A)에서 분석물에 대한 결합 파트너를 포함하는 복합물의 양을 측정하되, 복합물의 양이 샘플 중의 분석물의 양과 관련이 있으며, 단계 (B)에서 분석물에 대한 결합 파트너를 포함하는 복합물의 양을 측정하되, 복합물의 양이 샘플 중의 분석물의 양과 관련이 있는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시약들이 분석물의 유사체(analog)를 추가로 포함하며, 유사체가 라벨(label)을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시약들이 제2 결합 파트너를 추가로 포함하고, 여기에서 제2 결합 파트너가 분석물에 대한 결합 파트너를 포함하는 복합물에 결합하는 방법.
제6항에 있어서, 적어도 분석물에 대한 결합 파트너 또는 제2 결합 파트너가 라벨을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시약들 중 하나가 라벨을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시약들 중 하나가 입자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 시약들 중 하나가 효소 라벨을 포함하며, 시약들 중 하나가 자성 입자를 포함하는 방법.
내생성 방해 물질들의 존재 하에, 타크로리무스(tacrolimus)를 함유할 것으로 의심되는 샘플에서 타크로리무스의 전체 양을 결정하는 방법으로서,
(a) 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 타크로리무스의 양 [Y]를 측정하는 단계로서, [Y]가
(a') 내생성 결합 물질들로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 존재 하에 샘플의 일부에 대해 검정을 수행하여 타크로리무스의 양 [V]를 결정하는 단계,
(b') 내생성 결합 물질들로부터 타크로리무스를 대체할 수 있는 제제의 부재 하에 샘플의 일부에 대해 검정을 수행하여 타크로리무스의 양 [W]를 결정하는 단계, 및
(c') [V]에서 [W]를 차감하는 단계로써 측정되는 단계;
(b) 하기 식에 의해 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 타크로리무스의 양 [Z]를 결정하는 단계:
[Z] = a[Y] + b,
[상기 식에서, "a" 및 "b"는 공지된 양의 분석물을 함유하지만 내생성 방해 물질들이 실질적으로 존재하지 않는 샘플들에 대해 검정을 수행함으로써 사전결정되며, "a"는 내생성 결합 물질들에 의해 결합되지 않은 분석물과 내생성 결합 물질들에 의해 결합된 분석물 간의 회귀의 기울기이며, "b"는 이러한 회귀의 절편임], 및
(c) [Y]와 [Z]를 더함으로써 타크로리무스의 전체 양 [X]를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 샘플이 신체 배출물, 신체 흡입물, 신체 적출물 또는 신체 추출물인 방법.
제11항에 있어서, 검정 방법이 균일 검정 방법(homogeneous assay method)인 방법.
제11항에 있어서, 검정이
(i) 샘플 중의 타크로리무스의 양을 결정하기 위한 시약들을 단계 (a')의 샘플의 일부를 포함하는 매질에 그리고 단계 (b')의 샘플의 일부를 포함하는 매질에 첨가하되, 시약들이 타크로리무스에 대한 하나 이상의 결합 파트너를 포함하는 단계, 및
(ii) 단계 (a')에서 타크로리무스에 대한 결합 파트너를 포함하는 복합물의 양을 측정하되, 복합물의 양이 샘플 중의 타크로리무스의 양과 관련이 있으며, 단계 (b')에서 타크로리무스에 대한 결합 파트너를 포함하는 복합물의 양을 측정하되, 복합물의 양이 샘플 중의 타크로리무스의 양과 관련이 있는 단계를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 (i)에서의 시약들이 타크로리무스의 유사체를 추가로 포함하며, 타크로리무스에 대한 항체 또는 유사체가 라벨을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 단계 (i)에서 제2 항체가 매질에 첨가되며, 여기에서 제2 항체가 타크로리무스에 대한 항체를 포함하는 복합물에 결합하는 방법.
제16항에 있어서, 타크로리무스에 대한 항체 또는 제2 항체가 라벨을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 시약들 중 하나가 라벨을 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 시약들 중 하나가 입자를 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 시약들 중 하나가 효소 라벨을 포함하며, 시약들 중 하나가 자성 입자를 포함하는 방법.
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