JP6388861B2 - 検体総濃度の特定 - Google Patents
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Description
ここに記載した原則と一致する例は、内因性干渉物質を含有している可能性がある未知の試料において、検体の総量を正確に測定することを目指している。試料は、未知の試料において存在し得る検体をあらゆる内因性結合物質から置換する置換剤で処理することができるものの、内因性干渉物質(例えば未知の試料内に存在しうる不特定の干渉性タンパク質)は、イムノアッセイ成分に結合し、未知の試料における検体濃度の特定が不正確になり得る。さらに、多くの未知の試料は、アッセイシグナルと干渉する内因性物質を有さない。しかしながら、このような物質を含有しないこれらの未知の試料については、このような内因性干渉物質の量は、試料によって異なる。ここに記載した原則に従って、真の検体濃度は、内因性干渉物質(例えば不特定の干渉性タンパク質)の存在下で、未知の試料において測定できる。
アッセイ測定結果を特定するためには、前述のようにあらゆる適切なアッセイが使用できる。アッセイは試料の一部で、前述のように置換剤でその一部を処理する工程に直ちに連続して行うことができるか、又はアッセイはその後の時点で行うことができる。アッセイは各試料の一部を、試料における検体の量を特定するための試薬と合することによって行う。試薬の性質は、行うべきアッセイの特定の種類に依存する。アッセイは一般的に、試料における検体の量を特定するための方法である。アッセイは、イムノアッセイ、又は非イムノアッセイであり得る。様々なアッセイ法を以下で説明するが、これらの例に限られることはない。
各試料の一部でアッセイするために使用可能なアッセイの特別な態様を、以下で単に説明のために論じるが、これにより免疫抑制剤の検体が何らかの形で制限されることはない。
ここに記載する原則に従った、イムノアッセイを用いる方法は、検体用抗体(抗検体抗体)を含有する複合体の量に関して各アッセイ媒体を試験する工程を有する。この測定は、各アッセイ媒体についてそれぞれ行い、その後、使用する特定のアッセイに従ったアッセイ媒体のインキュベートが続く。試料の部分量の場合、測定結果は、試料中の抗−検体抗体に対して遊離した検体(つまり、内因性結合物質によって結合されていない試料における検体)の量を反映し、抗−検体抗体を含有する複合体を形成する。第二の試料の部分量の場合、測定は検体(試料中における遊離検体と、置換剤を抗検体抗体に添加することにより放出される試料における検体の双方)の量を表す検体の量を反映し、抗−検体抗体を含有する複合体が形成される。
特定のアッセイを行うための試薬は、検体を特定するためのアッセイを慣用的に行うために有用なキット内に存在していてよい。1つの態様においてキットは、内因性結合物質から検体を置換する試薬、検体用の抗体、及びアッセイを行うための他の試薬を、パッケージ化された組み合わせで含有し、これらの性質は、特定のアッセイフォーマットによる。試薬は、個別の容器内にあるか、又は逆反応や試薬の安定性に応じて、様々な試薬を1つ以上の容器内で組み合わせることができる。キットはさらに、アッセイを行うために、その他の別個にパッケージ化された試薬を含むことができ、その例は例えば、付加的なsbpメンバー、補助的な試薬、例えば補助的な酵素基質などである。
前述のように、ここに記載する原則に従った方法は、方法工程を実施するためのアッセイ装置を用いて自動化することができる。本発明に従った方法は、コンピュータ制御下で行うことができる。これはすなわち、コンピュータの助けを借りて、アッセイ装置と関連付け可能だということである。コンピュータは例えば、パーソナルコンピュータ(PC)であってよい。コンピュータはソフトウェアによって稼働させ、これは特に、上記等式を用いた計算を含む、ここに記載した方法である。
全ての化学物質は、特に記載が無ければ、Sigma- Aldrich Company(米国ミズーリ州St. Louis在)から購入できる。タクロリムスは、米国イリノイ州Deerfield在、Astellas Pharma US. Inc.から得られる。シロリムスは、米国ニューヨーク州New York在、Pfizer Inc.から得られる。
既知の試料を用いた、タクロリムスアッセイのための補助係数の決定
抗タクロリムス抗体−β−ガラクトシダーゼ共役体の作製:単クローン性の抗タクロリムス抗体(クローン1H6、例えば米国特許第7,078,495号明細書参照)を、公知の技術従って標準的なヘテロ二官能性SMCC(スクシンイミジルトランス−4−(N−マレイミジルメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート)リンカーによって、β−ガラクトシダーゼに共役させる。抗体共役体溶液は、抗タクロリムス抗体−β−ガラクトシダーゼ共役体を約7.5μg/mL、プロテアーゼ不含のウシ血清アルブミンを30mg/mL、MgCl2を0.126mg/mL、エチレングリコールを0.03mL/mL、PIPES1.5ナトリウム塩を35.14mg/mL、NaClを50mg/mL、及びβ−ガルムテイン(不活性化されたβ−ガラクトシダーゼ)を含有し、pHは6.5である。
Claims (8)
- 内因性干渉物質の存在下、タクロリムス若しくはシロリムスの含有が疑われる試料中のタクロリムス若しくはシロリムスの総量を特定する方法であって、以下の工程(a)〜(c):
(a)内因性結合物質によって結合されるタクロリムス若しくはシロリムスの部分量[Y]を測定する工程、ここで当該[Y]は、以下の工程(a’)〜(c’):
(a’)タクロリムス若しくはシロリムスを内因性結合物質から置換可能な試薬の存在下、試料の一部でアッセイを行うことによって、タクロリムス若しくはシロリムスの量[V]を特定する工程、
(b’)タクロリムス若しくはシロリムスを内因性結合物質から置換可能な試薬の不在下、試料の一部でアッセイを行うことによって、タクロリムス若しくはシロリムスの量[W]を特定する工程、及び
(c’)前記[V]から前記[W]を引く工程
によって測定され、
(b)内因性結合物質によって結合されないタクロリムス若しくはシロリムスの量[Z]を、下記式:
[Z]=a[Y]+b
によって特定する工程、ここで前記式中、「a」及び「b」は、既知のタクロリムス若しくはシロリムス量は含有するが、内因性干渉物質を実質的に含有しない試料でアッセイを行うことにより予め特定され、前記「a」が、内因性結合物質によって結合されないタクロリムス若しくはシロリムスと、内因性結合物質によって結合されるタクロリムス若しくはシロリムスとの回帰直線の勾配であり、前記「b」が、回帰直線の切片であり、
(c)前記[Y]と前記[Z]を合計することにより、タクロリムス若しくはシロリムスの総量[X]を特定する工程
を有し、
前記アッセイが、以下の工程(i)及び(ii):
(i)前記工程(a’)の試料の一部を含有する媒体、及び前記工程(b’)の試料の一部を含有する媒体に、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬を添加する工程、ここで前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬は、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を少なくとも1種含有し、
(ii)前記工程(a’)において、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を含有する複合体の量を測定する工程、ここで当該複合体の量は、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量と関連し、及び前記工程(b’)において、タクロリムス用若しくはシロリムス用の結合対象を含有する複合体の量を測定する工程、ここで当該複合体の量は、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量と関連する、
前記方法。 - 前記試料が、哺乳類の体からの排出物、哺乳類の体からの吸引物、哺乳類の体からの切除物、又は哺乳類の体からの抽出物である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(i)における試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬がさらに、試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬である、タクロリムス類似体若しくはシロリムス類似体を含有し、試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬である、タクロリムス用若しくはシロリムス用の抗体又は前記類似体が、標識を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(i)において第二の抗体を前記媒体に添加し、ここで前記第二の抗体が、タクロリムス用若しくはシロリムス用抗体を含有する複合体に結合する、請求項1に記載の方法。
- 前記タクロリムス用若しくはシロリムス用の抗体、又は前記第二の抗体が、標識を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち1種が標識を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち1種が粒子を含有する、請求項1に記載の方法。
- 前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち1種が酵素標識を含有し、前記試料中におけるタクロリムス量若しくはシロリムス量を特定するための試薬のうち1種が磁性粒子を含有する、請求項1に記載の方法。
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