SU1401380A1

SU1401380A1 - Способ количественного определени истинного белка в кормовых дрожжах

Info

Publication number: SU1401380A1
Application number: SU864040783A
Authority: SU
Inventors: Татьяна Александровна Худякова; Владимир Михайлович Востоков; Анатолий Петрович Арбатский; Людмила Афанасьевна Мешкова; Валентина Петровна Петрова; Людмила Генриховна Рыбакова
Original assignee: Горьковский политехнический институт им.А.А.Жданова
Priority date: 1986-03-20
Filing date: 1986-03-20
Publication date: 1988-06-07

Abstract

Изобретение относитс к определению содержани истинного белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или бел- ково-витаминных производств или в бел- ково-витаминных концентратах. Цель изобретени - повышение достоверности и со- краш,ение времени. Способ заключаетс в том, что белок в кормовых дрожжах осаждают сульфатом меди в шелочной среде, отдел ют осадок и раствор ют при нагревании в шелочном растворе комплексона III. К полученному раствору после разбавлени его водой добавл ют реактив Фо- лина и осуществл ют фотоколориметрическое определение содержани белка в анализируемой пробе, использу в качестве стандарта раствор альбумина. 3 табл. I сл

Description

со

00

Изобретение относитс к исследованию и анализу материалов, в частности к определению содержани белка в кормовых дрожжах гидролизных производств или в белково-витаминных концентратах, и может быть использовано дл автоматического контрол продукции гидролизно-дрожжевых заводов и заводов БВК микробиологической промышленности.

Цель изобретени - повышение достоверности и сокраш.ение времени определени . 10

Способ заключаетс в том, что сначала отдел ют белок от других компонентов путем осаждени его сульфатом меди в ш,елочной среде, а затем после отделени осадка его раствор ют в щелочном растворе комплексона III при нагревании. Далее раствор разбавл ют дистиллированной водой в 125 раз. К аликвотной части анализируемого раствора добавл ют реактив Фолина с целью получени окрашенного комплекса (реакци Лоури). Полученный окрашен- 20 ный раствор фотометрируют, использу светофильтр , пропускаюш,ий длины волн около 700 нм. Содержание белка рассчитывают с помош,ью предварительно построенного по стандартным растворам альбумина градуи- ровочного графика или путем сравнитель- ного измерени со стандартом.

Продолжительность измерений по предлагаемому способу в 4 раза короче, чем по известному.

15

рованной водой до нормальности, равной единице (раствор Е).

Раствор А приготавливают, раствор 2 г углекислого натри в 100 см 0,1 и. водного раствора едкого натра.

Дл приготовлени раствора В сначала раствор ют 10 г винно-кислого натри -кали в 300 см дистиллированной воды. Добавл ют туда 5 г сернокислой меди (CuSO4 5Н20) и после растворени соли довод т объем до 1 л дистиллированной водой.

Раствор С приготавливают, смешива 49 см раствора А и I см раствора В. Обычно полученный раствор используют в течение суток.

Указанные растворы используют дл выполнени фотометрических определений как с исследуемым раствором белка, так и со стандартными растворами альбумина, приготовленными дл построени градуировочного графика. Этот график зависимости оптической плотности окрашенного раствора (после проведени реакции Лоури) от содержани в нем альбумина стро т вс кий раз, когда заново приготавливаетс реактив Фолина . Следовательно, таким градуировочным графиком можно пользоватьс в течение года.

Непосредственно перед выполнением анализов готов т 12%-ный раствор CuSO4X 5 Н20; 2,5%-ный и 1 н. растворы

Ускоренный перевод белка в раствор в ,р гидрооксида натри , а также 0,25 М раствор

предлагаемом способе достигаетс путем обработки осадка медно-белкового комплекса 0,25 М водным раствором комплексона III и последующим тридцатиминутным кип чении анализируемой смеси в 1 н. щелочи. Высока селективность предлагаемого способа определени истинного белка св зана прежде всего с.использованием высокочувствительной и специфической реакции Лоури, а также с предварительным отделением значительной части мешающих примесей на

30

35

комплексона III. Эти растворы могут быть приготовлены заранее и использованы многократно .

Способ осуществл ют следующим образом .

Берут точную навеску средней пробы дрожжей массой около 0,4 г, помещают ее в стакан вместимостью 200 см, добавл ют 50 см доведенной до кипени дистиллированной воды, 10 см 12%-ного раствора сернокислой меди и по капл м

стадии осаждени медно-белкового комплек- 40 при перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натри . Полученному осадку дают отсто тьс и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двум порци ми (по 20 см) дистиллированной

са.

В отличие от други --- фотометрических реакций на белок, реакци Лоури настолько чувствительна, что позвол ет повысить селективность метода путем разведени анализируемого раствора до предельных концентраций интерферирующих примесей.

Предлагаемый способ определени белка в кормовых дрожжах осуществл ют следующим образом.

Приготавливают все необходимые реактивы и растворы.

Реактив Фолина приготавливают по известным методикам (реактив Фолина можно хранить в темной закрытой скл нке в течение 1 года). Перед использованием реактива Фолина устанавливают его нормальность путем титровани стандартным раствором щелочи, а затем разбавл ют его дистилли45

воды. Фильтрование и промывание осадка

осуществл ют декантацией, после чего фильтр с осадком возвращают в тот же стакан. К осадку добавл ют при перемещивании 20 см 0,25 М раствора комплексона III и 60 см I н. раствора едкого

5Q натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кип щей вод ной бане , периодически перемешива раствор стекл нной палочкой. Затем раствор перенос т в мерную колбу на 500 см, оставл фильтр в стакане. При этом фильтр и стенки

55 стакана промывают небольшими порци ми гор чей воды, слива все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. Содержимое колбы охлаждают до комнатной

0

5

гидрооксида натри , а также 0,25 М раствор

Способ осуществл ют следующим образом .

при перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натри . Полученному осадку дают отсто тьс и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двум порци ми (по 20 см) дистиллированной

ри перемещивании 10 см 2,5%-ного раствора гидрооксида натри . Полученному осадку дают отсто тьс и фильтруют его через бумажный фильтр. Осадок промывают двум порци ми (по 20 см) дистиллированной

воды. Фильтрование и промывание осадка

натра. Содержимое стакана нагревают в течение 30 мин на кип щей вод ной бане , периодически перемешива раствор стекл нной палочкой. Затем раствор перенос т в мерную колбу на 500 см, оставл фильтр в стакане. При этом фильтр и стенки

стакана промывают небольшими порци ми гор чей воды, слива все промывные воды в мерную колбу с анализируемым раствором. Содержимое колбы охлаждают до комнатной

температуры под струей воды, раствор в колбе довод т до метки дистиллированной водой и перемешивают. 100 см полученного раствора перенос т в мерную колбу на 250 см, довод т раствор до метки водой и перемешивают. С целью отделени взвешенных частиц из раствора берут около 20 см анализируемого вещества, фильтруют раствор в сухой стаканчик через фильтр с синей лентой, отбрасыва первую порцию фильтрата. Затем с помошью пипетки отбирают 5 см фильтрата, помещают его в мерную колбу на 25 см , добавл туда 15 см раствора С и осторожно перемешивают в течение 10 мин. После этого добавл ют 1,5 см раствора Е, довод т содержимое до метки дистиллированной водой и перемешивают, после чего оставл ют сто ть 30 мин. Полученный раствор синего цвета фотометрируют в кювете толщиной 1 см при длине волны .690 им на фотоколориметре, пользу сь красным светофильтром . В качестве нулевого раствора обычно используют раствор «холостого опыта, который получают по описанной методике , заменив анализируемый раствор белка (5 см ) соответствующим количеством дистиллированной воды. Оптическа плотность анализируемого раствора измер етс три раза. За истинный результат принимают среднее арифметическое трех параллельных измерений. По величине оптической плотности, пользу сь градуировочным графиком , рассчитывают количество белка в аликвотной части анализируемого (у, мкг), а затем массовую долю истинного белка в кормовых дрожжах по формуле, %:

временно анализ трех параллельных проб, а за истинный результат принимают среднее арифметическое результатов трех параллельных определений.

Обща продолжительность измерени массовой доли истинного белка в кормовых дрожжах составл ет 2-2,5 ч.

В табл. 1 приведены в. качестве примера результаты определений содержани белка по предлагаемому способу в кормовых дрожжах гидролизно-дрожжевых заводов .

Таблица 1

Контроли- руемое предпри тие

Найдено истинного белка (средний результат серии анализов), %

Астраханский ГДЗ

- Волжский ГДЗ

Кировский БХЗ

47,55 45,37 49,12

30,71 30,20

34,04

Б

у 0,025

еу

-()

количество белка в аликвотной части раствора, найденное по градуировочному графику, мкг;

0,025 - коэффициент, учитывающий разбавление , соотношение размерностей и т. д.;

а - масса анализируемой навески дрожжей, г;

W - массова дол влаги в кормовых дрожжах, %.

При необходимости получени более точх результатов анализа провод т одно

В табл. 2 дана сравнительна характеристика известного и предлагаемого способов измерени массовой доли белка в кормовых дрожжах.

Дл сравнени предлагаемого способа со способом Бернштейна готов т модельные

смеси из белка и нуклеиновых кислот. Так как нет надежного способа выделени чистого белка из кормовых дрожжей, модельную смесь готов т из альбумина и ДНК, причем альбумин берут в количестве, отвечаюшем среднему содержанию белка в

навеске 0,4 г кормовых дрожжей, а ДНК-13% от содержани альбумина. Результаты измерени белка приведены в табл. 1 (средние из 3-х определений)

Таблица 2

: В состав кормовых дрожжей, кроме ДНК, входить и другие нуклеотиды. Дл большего приближени модельных смесей к I составу кормовых дрожжей экстрагируют ил них все компоненты, кроме белка, путем обработки навески дрожжей 5%-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Содер- ж|ание нуклеиновых кислот в экстракте о|:редел ют по методу Спирина. В получен0 ,2114

0,0621

0,2089 (-1,18%) 0,244 (+15,49%)

н

Таким образом, при использовании пред- л гаемого способа осаждаемые сол ми меди (белковые азотсодержащие соединени (нуклеиновые кислоты) искажают результаты измерени истинного белка в кормовых д|зожжах в пределах погрешности из- рений, а по способу Бернштейна зна- 1тельно завышают результаты, измерени ;тинного белка.

Claims

Формула изобретени

Способ количественного определени истинного белка в кормовых дрожжах, преном экстракте содержатс нуклеиновые кислоты в количестве 1,24 мг в см. Модельные смеси готов т из навески альбумина, к которой добавл ют 50 см экстракта из кормовых дрожжей. Раствор нейтрализуют до рН 7 и дадее операции провод т по предлагаемому способу и по способу Берн- штейна. Результаты измерений (средние из 3-х определений) приведены в табл. 3.

Таблица 3

дусматриваюш,ий осаждение его сульфатом меди в ш,елочной среде, отделение осадка с последуюш,ей оценкой результатов, отличающийс тем, что, с целью повышени достоверности и сокращени времени определени , после отделени осадка осуществл ют солюбилизацию белка путем выделени его в медно-белковый комплекс и разрушени его при нагревании в течение 30 мин на вод ной бане в 0,25 М растворе комплексона III с последующим разбавлением раствора дистиллированной водой, а оценку результатов осуществл ют спектрофотометрически.