DE69930404T2

DE69930404T2 - Methode zum nachweis von analyten

Info

Publication number: DE69930404T2
Application number: DE69930404T
Authority: DE
Inventors: B. Harshvardhan Fremont MEHTA; Nurith Palo Alto KURN
Original assignee: Dade Behring Marburg GmbH
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1998-05-29
Filing date: 1999-05-24
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2019-05-25
Also published as: EP1082613A1; WO1999063345A1; EP1082613B1; DE69930404D1; US6303325B1; JP2002517728A

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die folgende Erfindung betrifft den Nachweis von Analyten in einer Probe unter Verwendung eines Immuntests. Insbesondere betrifft die Erfindung den Nachweis von Analyten in einer Probe unter Verwendung einer Methode, bei der kein Transferschritt anfällt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verfahren, die den Nachweis oder die Quantifizierung von Substanzen, die in sehr geringen Konzentrationen in einer Probe vorliegen, ermöglichen, sind wichtige Werkzeuge in vielen Analysebereichen. Zu derartigen Verfahren zählen Methoden zur Messung geringer Konzentrationen von Analyten in einer klinischen Probe biologischer Flüssigkeiten, wie beispielsweise Urin und Blut, sowie zum Nachweis geringer Mengen an Arzneistoffen und Restspuren von Chemikalien, wie beispielsweise Pestiziden und Herbiziden, in einer Probe.
Methoden zur Bestimmung geringer Niveaus von Substanzen in Flüssigproben müssen, um geeignet zu sein, hochempfindlich und genau sein. Beispielhaft für solche Methoden sind Tests auf Rezeptorbasis, wie etwa Immuntests, die gegenwärtig zum Nachweis von Substanzen mit sehr geringen Konzentrationen in klinischen Proben biologischer Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut und Urin, verwendet werden. Diese Substanzen werden in Immuntests durch Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch mit der zu testenden Substanz reagiert (z.B. eines primären Antikörpers), nachgewiesen.
Der Nachweis von Antikörpern ist ein geeignetes Werkzeug bei der Diagnose von durch Antigene verursachten Krankheiten. In ähnlicher Weise eignet sich der Nachweis von Autoantikörpern bei der Bestimmung des Risikos für einen Patienten, eine Krankheit zu entwickeln. So wurden beispielsweise für Forschungsprojekte im Zusammenhang mit dem Nachweis von Autoantikörpern als Risikofaktor für Patienten dahingehend, daß diese einen insulinabhängigen Diabetes mellitus (Insulin Dependent Diabetes mellitus, „IDDM") entwickeln, durchgeführt. Es gibt zahlreiche Autoantikörper, von denen man annimmt, daß sie IDDM, der auch als Typ-I-Diabetes oder „Juvenile Diabetes" bekannt ist, anzeigen. Dazu zählen Insulin-Autoantikörper, pankreatische Inselzellen-Antigen-Autoantikörper und seit neuestem Autoantikörper gegen die 65 kd große Isoform der Glutaminsäure-Decarboxylase („GAD65").
Es wurde vorgeschlagen, daß Autoantikörper gegen GAD65 einen der frühesten Marker für die Entwicklung von IDDM darstellen. Diese Autoantikörper sind mehrere Jahre vor dem klinischen Ausbruch von IDDM bereits vorhanden, wobei zu diesem Zeitpunkt eingreifende Schritte unternommen werden könnten, um das Fortschreiten der Krankheit zu verhindern.
Spezifische Antikörper lassen sich nur durch Nachweisen einer Bindung an ihr Antigen oder ein Imitat davon messen. Obwohl bestimmte Klassen von Immunglobulinen, die die interessierenden Antikörper enthalten, in einigen Fällen von der Probe vor dem Test getrennt werden können (Decker, et al., EP 0,168,689 A2 ), wird in allen Tests zumindest ein gewisser Anteil der Probenimmunglobuline mit Antigen in Kontakt gebracht. So kann beispielsweise in Tests für spezifisches IgM ein Anteil des gesamten IgM an eine Oberfläche adsorbiert und die Probe abgetrennt werden, bevor das spezifische IgM durch Inkontaktbringen mit Antigen nachgewiesen wird. Die Bindung wird dann durch Nachweis des gebundenen Antikörpers, Nachweis des gebundenen Antigens oder Nachweis des freien Antigens gemessen.
Zum Nachweis von gebundenem Antikörper, läßt man normalerweise ein markiertes Anti-Mensch-Immunglobulin oder markiertes Antigen Antikörper binden, die spezifisch aus der Probe an eine mit dem Antigen beschichtete Oberfläche adsorbiert wurden, Bolz, et al., US-Patent Nr. 4,020,151. Überschüssiges Reagens wird weggewaschen und die an der Oberfläche gebunden gebliebene Markierung nachgewiesen. Dies ist die Vorgehensweise, wie sie in den am häufigsten verwendeten Tests, beispielsweise für Hepatitis und menschliches Immunschwächevirus sowie für zahlreiche immunhistochemische Tests, verwendet wird, Nakamura, et al., Arch. Pathol. Lab. Med. 112:869–877 (1988). Obwohl diese Methode relativ empfindlich ist, unterliegt sie Störungen von nichtspezifischer Bindung an die Oberfläche durch nichtspezifische Immunglobuline, die sich von den spezifischen Immunglobulinen nicht unterscheiden lassen.
Eine weitere Methode zum Nachweis gebundener Antikörper beinhaltet das Zusammengeben der Probe und eines konkurrierenden markierten Antikörpers, wobei ein Antigen an einen Träger gebunden ist, Schuurs, et al., US-Patent Nr. 3,654,090. Diese Methode hat ihre Grenzen, da Antikörper in Seren zahlreiche Epitope binden, was die Kompetierung ineffizient macht.
Zum Nachweis von gebundenem Antigen kann das Antigen im Überschuß gegenüber der maximalen Menge an Antikörper, die in der Probe vorhanden ist, oder in einer geringeren Menge als die Antikörpermenge verwendet werden. So wurden beispielsweise Radioimmunpräzipitationstests („RIP"-Tests) für GAD-Autoantikörper entwickelt und werden gegenwärtig benutzt, Atkinson, et al., Lancet 335:1357–1360 (1990). Allerdings waren Versuche, diesen Test in ein „ELISA"-(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)-Format umzuwandeln, nicht erfolgreich. Der RIP-Test beruht auf der Präzipitation von Immunglobulinen in menschlichen Seren und führte zur Entwicklung eines Radioimmuntests (Radioimmunoassay, „RIA") für GAD-Autoantikörper. Sowohl im RIP als auch im RIA wird das Antigen im Überschuß zugegeben, wobei der gebundene Antigen/Antikörper-Komplex mit Protein-A-Sepharose präzipitiert wird. Der Komplex wird dann gewaschen oder weiter über Elektrophorese getrennt und das Antigen im Komplex nachgewiesen. Weitere Methoden zum Nachweis von gebundenem Antigen sind bei Masson, et al., US-Patent Nr. 4,062,935; Soeldner, et al., US-Patent Nr. 4,855,242; Ito, et al., EP 0,410,893 A2 ; Cambiaso, et al., US-Patent Nr. 4,184,849 und Uchida, et al., EP 0,070,527 A1 beschrieben.
Viele Forschungsprojekte wurden im Bereich der Bewertung geeigneter Marker für die Bestimmung des Risikofaktors für Patienten hinsichtlich der Entwicklung von Krankheiten, wie beispielsweise IDDM, durchgeführt. Zu den zum Nachweis von IDDM verwendeten Markern gehören beispielsweise Insulin-Autoantikörper, Soeldner, et al., Supra sowie im Kreislauf vorhandene Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase („GAD"), Atkinson, et al., WO/9007117 (PCT/US89/05570) und Tobin, et al., WO/9205446 (PCT/US91/06872). Darüber hinaus werden von Rabin, et al., US-Patent Nr. 5,200,318 zahlreiche Testformate zum Nachweis von GAD- und pankreatischen Inselzellen-Antigen-Autoantikörpern beschrieben. GAD-Autoantikörper sind von besonderer diagnostischer Wichtigkeit, da sie in vorklinischen Stadien der Erkrankung auftreten, wodurch ein therapeutischer Eingriff ermöglicht werden kann. Allerdings wurde bislang die Verwendung von GAD-Autoantikörpern als diagnostischer Marker durch das Fehlen eines zweckmäßigen, nichtisotopen Tests behindert.
Eine Testmethode beinhaltet die Inkubation eines trägergebundenen Antigens mit der Probe und anschließender Zugabe eines markierten Anti-Mensch- Immunglobulins. Dies bildet die Grundlage für zahlreiche kommerziell erhältliche Testkits für Antikörper, wie beispielsweise den Syn^elisa-Kit, mit dem man auf Autoantikörper gegen GAD65 testet und der in der Produktliteratur mit dem Titel „Syn^elisa GAD II-Antibodies" (Elias USA, Inc.) beschrieben ist. Die Probe muß hierbei beträchtlich verdünnt werden, da die Methode hohen Hintergrundsignalen von der Adsorption nichtspezifischer menschlicher Immunglobuline an dem Träger ausgesetzt ist.
Viele der oben beschriebenen Tests beinhalten den Nachweis von Antikörper, der an ein immobilisiertes Antigen gebunden wird. Dies kann aufgrund der Schwierigkeit, zwischen spezifischen Immunglobulinen und anderen Immunglobulinen in der Probe, die nichtspezifisch an das immobilisierte Antigen binden, zu unterscheiden, eine negative Auswirkung auf die Empfindlichkeit des Tests haben. Es besteht nicht nur ein Bedarf dafür, einen Test zu entwickeln, bei dem der nichtspezifische Nachweis von Immunglobulinen vermieden wird, sondern auch der Bedarf für eine verbesserte Methode zum Nachweis von Antikörpern, die den Empfindlichkeitsvorteil von Immunpräzipitationstests mit einer vereinfachten Vorschrift kombiniert. Schließlich sind Tests, die bei der Beurteilung des Risikos der Entwicklung von Krankheiten, wie z.B. IDDM, behilflich sein können, medizinisch und ökonomisch sehr wichtig. Die genannten Bedarfspunkte werden von der folgenden Erfindung angegangen.
In Immuntests wird die Reihenfolge der Bindungsreaktionen üblicherweise durch die Reihenfolge der Zugabe testspezifischer Reagentien bestimmt. In bevorzugten Testvorschriften ist die Anzahl der Testschritte, wie beispielsweise Zugabe von Reagens, Waschschritte sowie Überführungen des Testgemischs von einem Behälter in einen anderen, minimiert. Die frühe Zugabe von Reagentien, die für eine Reaktion in späteren Phasen des Testverfahrens vorgesehen sind, kann erforderliche Bindungswechselwirkungen verlangsamen oder verhindern. Dabei ist es insbesondere wünschenswert, eine vorzeitige Bindung an Oberflächen zu vermeiden, da Reaktionen an Oberflächen häufig unter ungünstigen Bindungskinetiken leiden. Es wäre sinnvoll, ein Mittel zur Durchführung der Bindungsschritte in einem Testgemisch zur Verfügung zu haben, das mit einer spezifisch aktivierten Oberfläche in Kontakt steht, ohne daß dabei eine vorzeitige Bindung des erhaltenen Immunkomplexes an die Oberfläche stattfindet. Es wäre sinnvoll, die Notwendigkeit für eine Übertragung des Testgemischs von einem inerten Behälter, in dem die Bindung stattfindet, in einen oberflächenaktivierten Behälter, wo die Bindung des Komplexes an die Oberfläche dessen Trennung erleichtert, zu beseitigen.
Es wurde von uns ein Verfahren entwickelt, das den Nachweis von Autoantikörpern, wie beispielsweise GAD, vereinfacht. Im US-Patent Nr. 5,561,049 ist ein DELISA (Depletion ELISA)-Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern beschrieben. Dabei wird in der Erfindung die Probe mit einem Antigen, das die Antikörper in der Probe bindet, unter Ausbildung eines Antigen/Antikörper-Komplexes kombiniert. In einem Beispiel dieser Methode wird Protein A dazu verwendet, den Komplex zu binden und nicht das Antigen, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist. Zur selektiven Bindung des Antigens relativ zur Bindung des Komplexes, wenn der Komplex an das Protein A gebunden ist, wird Streptavidin verwendet. Dabei kann Protein A an ein lösliches Polymer oder an eine suspendierbare feste Phase gebunden sein. Das Streptavidin kann an eine feste Phase gebunden sein. Anstelle von Streptavidin kann ein aus zwei Rezeptoren, die das Antigen binden, bestehendes Molekül verwendet werden, wobei jeder Rezeptor jeweils an ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems gebunden ist. So bindet beispielsweise ein Biotin-GAD-Konjugat, wenn es mit einer Serumprobe zusammengegeben wird, an jeden in der Probe vorhandenen GAD-Autoantikörper. Anschließend wird ein Protein-A-Dextran-Konjugat zugegeben, das alle Immunglobuline in der Probe, einschließlich den GAD-Autoantikörper, bindet. Nach Überführung dieser Lösung in eine mit Streptavidin beschichtete Vertiefung kann nur freies Biotin-GAD-Konjugat, das nicht an den Autoantikörper gebunden ist, an die Oberfläche binden. Nach Entfernen der Lösung aus der Vertiefung wird das freie Konjugat durch Messen der Menge eines enzymmarkierten Anti-GAD-Antikörpers, der an die Oberfläche binden kann, nachgewiesen. Bei dieser Methode muß das Testgemisch von der mit Streptavidin beschichteten Oberfläche getrennt gehalten werden, bis die Bindungsreaktionen vollständig abgelaufen sind, um den Nachweis von Konjugat, das ansonsten an Autoantikörper gebunden hätte, zu vermeiden. Es wäre sinnvoll, einen Test zur Verfügung zu haben, bei dem die Notwendigkeit für eine Überführung des Testgemischs auf die mit Streptavidin beschichtete Oberfläche wegfällt.
In der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 322 813 ist ein Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch aktiven Substanz beschrieben, wobei wenigstens zwei unterschiedliche Rezeptoren, R1 und R2, verwendet werden, die in Lösung in einer flüssigen Phase vorhanden sind und von denen wenigstens einer an die immunologisch aktive Substanz gebunden werden kann, und wobei der zweite Rezeptor R2 eine Markierung trägt. Durch Trennung des so gebildeten Komplexes von der Lösung durch Bindung an eine feste Phasen sowie durch Messen der Markierung in einer der Phase wird ein erster Rezeptor R1, der an eine erste Substanz S1, die spezifisch gebunden werden kann, gebunden ist, verwendet, die zu bestimmende immunologisch aktive Substanz wird mit den Rezeptoren in Gegenwart einer Matrix, an die eine zweite Substanz S2, die spezifisch gebunden werden kann, gebunden ist, inkubiert. Nach der Inkubation wird eine Komponente, die wenigstens eine spezifische Bindungsstelle jeweils für S1 und S2 aufweist, zur Immobilisierung des Komplexes zugegeben, und anschließend werden die Phasen getrennt.
Zusätzlich zur Verwendung von Immuntests in einer klinischen Umgebung eignen sich Immuntests bei anderen Anwendungen. Beispielsweise besteht im Hinblick auf die weitverbreitete Verwendung von Chemikalien in der Umwelt, in Form von Pestiziden und Herbiziden, ein Bedarf für eine einfache, quantitative und genaue Methode zur Messung der Niveaus dieser Chemikalien, die in geringen Konzentrationen im Erdboden, in Lebensmittelprodukten und in Wasserproben vorhanden sein können.
Es ist daher wünschenswert, eine Methode zur Bestimmung von Analytenkonzentrationen in Flüssigproben zur Verfügung zu haben, die einfach und schnell ist. Ein solcher Test sollte sich für alle Proben eignen, die zu einem flüssigen Medium homogenisiert werden können. Wünschenswert ist vor allem, Analyte in biologischen oder anderen Proben bestimmen zu können. Es ist ferner wünschenswert, eine Methode zur Verfügung zu haben, bei der keine Toxine oder teuren Reagentien eingesetzt werden. Ebenso ist es sehr wünschenswert, eine Methode zur Verfügung zu haben, bei der kein Trenn- oder Sammelschritt erforderlich ist.
Es wäre sinnvoll, ein Immuntestverfahren zur Verfügung zu haben, das einfacher und schneller zu verwenden ist. Es wäre sinnvoll, einen Test zur Verfügung zu haben, der die Anzahl von Überführungsschritten minimiert und die Durchführung der Bindungsreaktionen, einschließlich Bindung an die Oberfläche, in der gleichen Vertiefung gestattet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Biotin und andere kleine Molekülmarkierungen werden häufig in Bindungstests an einen Liganden oder ein Rezeptorreagens gebunden, um die Trennung zu erleichtern, ohne daß dabei Bindungskinetiken negativ beeinflußt werden. Die vorliegende Methode gestattet das Durchführen spezifischer Bindungsreaktionen in homogener Lösung, wo die Diffusion schnell abläuft. Nach Stattfinden der Reaktion wird das Gemisch mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht, die mit einem Fängerrezeptor für die Markierung beschichtet ist. Nach Bindung des Immunkomplexes an die Oberfläche wird dieser von den anderen Testkomponenten getrennt und nachgewiesen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, wobei die Methode die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Zusammenbringen: (i) der Probe, (ii) mindestens eines spezifischen Binders für den Analyten, (iii) eines ersten, entweder an (1) exogenen Analyten oder (2) an den spezifischen Binder für den Analyten gekoppelten Bindungsmittels, (iv) eines ein zweites Bindungsmittel umfassenden Trägers in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines Gemischs;
(b) Versetzen des Gemischs mit einem Aktivator, wobei der Aktivator das erste Bindungsmittel sowie das zweite Bindungsmittel des Trägers bindet, so daß das erste Bindungsmittel immobilisiert wird;
(c) Bestimmen der Menge des Analyten in der Probe durch Nachweisen des immobilisierten ersten Bindungsmittels, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht.

In gewissen Ausführungsformen der Methode sind das erste Bindungsmittel und das zweite Bindungsmittel identisch. In diesen Ausführungsformen kann es sich bei dem Aktivator um ein multivalentes Molekül handeln. In bevorzugten Ausführungsformen, bei denen das erste und das zweite Bindungsmittel jeweils Biotin umfassen, umfaßt der Aktivator Avidin, Streptavidin oder Antibiotin-Antikörper. Vorzugsweise ist die Summe der Bindungsstellen auf dem Aktivator, zum Beispiel Avidin oder Streptavidin, kleiner oder gleich der Gesamtzahl der an den Träger und das Antigen gebundenen Äquivalente des ersten und des zweiten Bindungsmittels, zum Beispiel Biotin. Besonders bevorzugt beträgt die Anzahl der Bindungsstellen auf dem Aktivator die Hälfte der Gesamtzahl an das erste und das zweite Bindungsmittel umfassenden Biotinäquivalenten.
Falls das erste Bindungsmittel und das zweite Bindungsmittel verschieden sind, handelt es sich bei dem Aktivator um ein heterofunktionelles Molekül mit einer ersten Bindungsstelle, die das erste Bindungsmittel bindet, und einer zweiten Bindungsstelle, die das zweite Bindungsmittel bindet.
In gewissen Ausführungsformen handelt es sich bei dem ersten Bindungsmittel um einen Rezeptor, wobei der Aktivator einen multivalenten Liganden dafür umfaßt. In einem Beispiel für einen derartigen Test umfaßt das erste Bindungsmittel Folat-Bindungsprotein und der Aktivator ein Folat-Dextran-Konjugat.
Der Bestimmungsschritt der Methode umfaßt das Bereitstellen eines oder mehrerer Mitglieder eines signalproduzierenden Systems sowie das Messen des von den Mitgliedern des signalproduzierenden Systems produzierten Signals, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht. Vorzugsweise ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Vorzugsweise umfaßt der Träger die Oberfläche eines Behälters, Kügelchen, Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und magnetische Partikel, z.B. Magnetit.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein modifiziertes DELISA-Testformat, bei dem der Analyt einen Antikörper umfaßt, es sich bei dem Molekül, das den Analyten bindet, um ein Antigen gegen den Antikörper handelt und das erste Bindungsmittel an exogenes Antigen gekoppelt ist. Bei einem solchen Test bindet im Reaktionsgemisch der Antikörper das exogene Antigen unter Bildung eines erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplexes.
Zwischen den obigen Schritten (a) und (b) wird mit einer maskierenden Verbindung versetzt, die den Komplex bindet und das Antigen nicht bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist. Bei diesen Tests bindet der Aktivator selektiv das an das Antigen gekoppelte unmaskierte erste Bindungsmittel relativ zur Bindung des maskierten Komplexes und bindet ebenso das zweite Bindungsmittel. Zur Messung der Menge oder des Vorhandenseins des Analyten wird eine an einen zweiten spezifischen Binder an den Analyten im Komplex gebundene Markierung zugegeben. Die Menge der Markierung wird nachgewiesen.
Zu den Beispielen für eine maskierende Verbindung gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper gegen Immunglobuline, Komplementfaktor C1q, rheumatoider Faktor, Protein G und Protein A. Vorzugsweise ist die maskierende Verbindung an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebunden. Bei einer suspendierbaren Festphase handelt es sich beispielsweise um ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Keramik und Glas, umfassendes Partikel. Ist die maskierende Verbindung an ein lösliches Polymer gebunden, so weisen bevorzugte Polymere ein Molekulargewicht über 250 000 auf. Ein besonders bevorzugtes Polymer umfaßt Dextran.
Der Bestimmungsschritt dieses Tests beinhaltet den Nachweis von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorption. In einigen Ausführungsformen ist das Antigen an ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems gebunden. In anderen Ausführungsformen wird ein zweiter spezifischer Binder hinzugefügt, der das Antigen bindet, wobei der Rezeptor direkt oder indirekt an eine Markierung gebunden ist. In gewissen Ausführungsformen wird der Träger vom Gemisch getrennt und mit einem zweiten spezifischen Binder für das Antigen in Kontakt gebracht.
Die modifizierte DELISA-Testmethode der vorliegenden Erfindung eignet sich vor allem zum Nachweis eines Autoantikörpers gegen Glutaminsäure-Decarboxylase oder Insulin.
In gewissen Ausführungsformen umfaßt der Bestimmungsschritt das Inkontaktbringen des immobilisierten Antigens mit einem oder mehreren Mitgliedern eines signalproduzierenden Systems sowie das Messen des von den Mitgliedern des signalproduzierenden Systems produzierten Signals, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge der Antikörper in der Probe in Beziehung steht. Vorzugsweise ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Die Erfindung betrifft ferner kompetitive Tests, wobei entweder der spezifische Binder oder der exogene Analyt nachweisbar ist und das erste Bindungsmittel an exogenen Analyten gekoppelt ist, und wobei der Bestimmungsschritt das Nachweisen des nachweisbaren spezifischen Binders oder exogenen Analyten umfaßt. Bei einigen kompetitiven Tests konkurriert der Analyt in der Probe mit dem Analyten, der an das erste Bindungsmittel gekoppelt ist, um die Bindung mit dem spezifischen Binder, wobei der an das erste Bindungsmittel gekoppelte Analyt einen Komplex mit dem spezifischen Binder in einer Menge ausbildet, die zur Menge an Analyt in der Probe proportional ist. Bei diesen Tests bindet der Aktivator das erste Bindungsmittel im Komplex sowie das zweite Bindungsmittel. Bei derartigen Tests umfaßt der nachweisbare Analyt ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems, wobei der Bestimmungsschritt das Messen des von dem signalproduzierenden System produzierten Signals, dessen Vorhandensein oder Menge mit dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht, umfaßt. Vorzugsweise ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Die Erfindung betrifft ferner Sandwich-Tests, bei denen das Gemisch aus Schritt (a) zwei spezifische Binder für den Analyten umfaßt, nämlich einen ersten und zweiten spezifischen Binder, wobei der erste spezifische Binder an das erste Bindungsmittel gekoppelt ist und der zweite spezifische Binder nachweisbar ist. Dabei ist das Vorhandensein von oder die Menge an Markierung direkt proportional zur in der Probe vorhandenen Analytmenge. In bestimmten dieser Tests umfaßt der nachweisbare spezifische Binder ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems, wobei der Bestimmungsschritt das Messen des von dem signalproduzierenden System produzierten Signals, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht, umfaßt. Vorzugsweise ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Die Erfindung betrifft ferner Kits zum Nachweisen des Vorhandenseins oder zur Bestimmung der Menge eines Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend: (1) mindestens einen spezifischen Binder für den Analyten; (2) ein entweder an (a) exogenen Analyten oder (b) den spezifischen Binder für den Analyten gekoppeltes erstes Bindungsmittel; (3) einen ein zweites Bindungsmittel umfassenden Träger und (4) einen Aktivator, der das erste Bindungsmittel sowie das zweite Bindungsmittel des Trägers bindet, so daß das erste Bindungsmittel immobilisiert wird.
Im erfindungsgemäßen Kit zur Durchführung eines DELISA-Tests umfaßt der Analyt einen Antikörper, handelt es sich bei dem spezifischen Binder um ein Antigen zu dem Antikörper, handelt es sich bei dem ersten Bindungsmittel um Biotin, das an Antigen gekoppelt ist, umfaßt das zweite Bindungsmittel Biotin, das an die Wände eines Behälters gebunden ist, und umfaßt der Aktivator Streptavidin.
Der Kit zur Durchführung eines modifizierten DELISA-Tests umfaßt ferner eine an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebundene maskierende Verbindung. Bei der suspendierbaren Festphase handelt es sich vorzugsweise um ein ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Keramik und Glas, umfassendes Partikel. Zu bevorzugten maskierenden Verbindungen zählen Antikörper gegen Immunglobuline, Komplementfaktor C1q, rheumatoider Faktor, Protein G und Protein A, die je nach den zu testenden Analyten ausgewählt werden können.
Gewisse Kits der vorliegenden Erfindung umfassen ferner wenigstens ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems. Dabei ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Die Methoden der vorliegenden Erfindung sind insbesondere anwendbar auf Systeme, in denen das Gemisch durch Kapillarkräfte von einer inerten Stelle zu einer Stelle, die ein zweites Bindungsmittel aufweist, bewegt wird. Eine Eignung besteht auch für Methoden, bei denen die feste Oberfläche zu dem Gemisch hinzugefügt werden kann, wie beispielsweise, wenn Latexpartikel verwendet werden, Im Unterschied dazu, daß man das Gemisch in einen zweiten Behälter, der einen Fängerrezeptor auf seiner Oberfläche aufweist, überführen muß. Ebenso besteht eine Eignung, wenn die Oberfläche des Behälters für das Testgemisch das zweite Bindungsmittel aufweist, da das Testgemisch von einem nichtbeschichteten Behälter in einen beschichteten Behälter überführt werden muß.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine Verbesserung gegenüber Fängermethoden, wie sie beispielhaft z.B. in den US-Patenten Nr. 4,271,140 und 4,935,339 dargestellt sind, dar, indem die Bindungsreaktion in Gegenwart der aktivierten Oberfläche durchgeführt und ein Aktivator, wie z.B. Streptavidin, hinzugefügt wird, um die Bindung an die Oberfläche nach Bindung des Analyten an seinen spezifischen Bindungspartner zu starten. In einer Ausführungsform stellt die Methode eine Verbesserung gegenüber der DELISA-Methode von US-Patent 5,561,049 zum Nachweis von Autoantikörpern dar.
Ein zusätzlicher Vorteil der reduzierten Testkomplexität, wie sie durch die folgende Erfindung erreicht wird, ist die erhöhte Genauigkeit aufgrund der Verringerung der Schritte, die jeweils zur Testvariabilität beitragen.
Die Erfindung wird durch die Ansprüche definiert.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird im Zusammenhang mit dem Nachweis von Autoantikörpern gegen das pankreatische Autoantigen, Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) sowie einem spezifischen ELISA-Format veranschaulicht. Allerdings läßt sich die Erfindung breit auf eine große Vielfalt von Analyten und Testformaten, beispielsweise kompetitive und Sandwich-Tests, anwenden und ist nicht auf Antikörper und das ELISA-Format beschränkt.
Es wurde bereits von uns über die DELISA, ein neuartiges ELISA-Format zur Messung von GAD-Autoantikörpern in Serum, berichtet (US-Patent Nr. 5,561,049 und Mehta, H.B., et al., Clin. Chem., 42, 263 (1996)). Kurz gesagt, beinhaltet die DELISA-Vorschrift eine Reaktion zwischen Serum und bGAD in einer Polypropylen-Mikrotiterplatte. Es wird dann genügend lösliches PrA-Dextran-Konjugat zugegeben, um die Immunglobuline in der Probe, einschließlich GAD-Autoantikörper, an die GAD gebunden ist, zu binden. Das Gemisch wird von einer Polypropylenplatte auf eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte, an der freies bGAD gebunden wird, überführt. Nichtgebundene Komponenten des Reaktionsgemischs werden dann weggewaschen, und Streptavidin-gebundenes bGAD wird spezifisch nachgewiesen, indem Peroxidase-GAD-MAb-Konjugat umgesetzt wird. Anschließend wird überschüssiges Konjugat durch Waschen abgetrennt und die Farbe durch Umsetzung mit Peroxidasesubstraten entwickelt. Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt und die Absorption bei 450 nm abgelesen. Diese Methode überwindet das Problem der mit herkömmlichen ELISAs verbundenen schwachen Empfindlichkeit und Spezifität, und ihr Leistungsvermögen ist mit der von RBAs vergleichbar (Mehta, H.B., et al., Clin. Chem. 42, 263 (1996)). Allerdings benötigt die Methode zwei Platten, einen Überführungsschritt des Reaktionsgemischs von Platte zu Platte, das Waschen der mit Streptavidin beschichteten Platte unmittelbar vor Verwendung im Test sowie eine Gesamttestzeit von etwa 5,5 h.
Bevor mit der Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, soll zunächst eine Reihe von Begriffen definiert werden.
Analyt: Das Molekül in der Probe, welches durch die Tests der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wird, einschließlich kleine Moleküle, Antikörper, Antigene, Liganden und Antiliganden. Die Methode der vorliegenden Erfindung eignet sich zur Messung aller interessierenden Analyte. Die Methode der vorliegenden Erfindung eignet sich vor allem zur Messung von kleinen Liganden oder Haptenen. Nachfolgend ist eine Teilliste von Substanzen in Vollserum, auf die sich dieser Test anwenden ließe, aufgeführt: Acetaminophen, N-Acetylprocainamid, Amikacin, Amitriptylin, Amobarbital, Butabarbital, Koffein, Carbamazepin, Cocain, Codein, Cortisol, Diazepam, Digitoxin, Digoxin, Ethosuximid, Gentamicin, Glutethimid, Hexobarbital, Ibuprofen, Kanamycin, Lidocain, Methsuximid, Morphin, Netilmicin, Nortriptylin, Oxycodon, Pentobarbital, Phencyclidin, Phenobarbital, Phenytoin, Primidon, Procainamid, Propoxyphen, Chinidin, Salicylsäure, Secobarbital, Theophyllin, Thyroxin, Tobramycin, Valproinsäure und Vancomycin. Die Tests der vorliegenden Erfindung eignen sich zum Nachweis von Krebsantigenen, wie beispielsweise Cathepsin D, EGF-Rezeptor (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFr), c-erbB-2-Protein, Cytokeratin, Alphafetoprotein (AFP), CEA (Carcinoembryonic Antigen), UGP (Urinary Gonadotropin Peptide) sowie weiteren Krebsmarkerproteinen, sowie Virusantigenen, vor allem denjenigen, die mit Krebs assoziiert sind, wie beispielsweise HPV(Human Papilloma Virus)-Antigene, Hormone, wie beispielsweise Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) und Steroid- sowie Thyroidhormone; Viren, Allergenen, Bakterien und Toxinen. Dieser Test eignet sich auch zum Nachweis des Vorhandenseins größerer Proteine, wie beispielsweise HCG (Human Chorionic Gonadotrophin). Ferritin, C-reaktivem Protein (CRP), Apolipoproteinen, Hepatitis Antigen und Immunglobulinen. Zu den Antikörpern gehören beispielsweise vollständige Immunglobuline oder Fragmente davon sowie die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie z.B. IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 und IgM.
Die Tests der vorliegenden Erfindung eignen sich auch zum Nachweisen und Messen geringer Mengen an Substanzen in Proben, bei denen es sich nicht um biologische Flüssigkeiten handelt. Beispielsweise eignet sich dieser Test beim Nachweis und der Bestimmung von geringen Niveaus an Verunreinigungen in Umweltproben aus dem Erdboden, Wasser und Lebensmittelprodukten. Nachfolgend ist eine Teilliste von Beispielen für Herbizide, Pestizide und andere Verunreinigungen, für die sich dieser Test eignen würde aufgeführt: Atrazin, Chlordan, Chlorneb (und andere chlorinierte Pestizide), DDT, Demeton, Diazinon (und andere Organophosphor- Pestizide), Diethylphthalat (und andere Phthalsäureester), Dimethoat, Dimethylphthalat, Dimethoat, Etridiazol, Hexachlorbenzol, Malathion, Methylparathion, Molinat, Naphthalon, Phorat, Propachlor, Simazin, Triflurilin und 2,4-D (und andere Phenoxysäure-Herbizide).
Die obigen Listen sollen als beispielhaft und nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung verstanden werden.
Antigen: eine Verbindung, gegen die Antikörper produziert werden können und die zur Bindung an einen Antikörper unter Bildung spezifischer Antikörper/Antigen-Komplexe fähig ist. Das Antigen wird von dem Antikörperanalyten, üblicherweise einem aus Säugern, Viren oder mikrobiologischen Organismen stammendem Biomolekül oder einem Imitat davon, oder anderen Molekülen synthetischen oder natürlichen Ursprungs, die in der Umwelt vorhanden sind, wie beispielsweise Arzneistoffen, Pestiziden, Umweltschadstoffen und dergleichen, gebunden. Dabei kann das Antigen in Tests in seiner natürlichen Form verwendet werden, oder es kann modifiziert werden, vorausgesetzt, daß die Modifikation seine Antigenität nicht stört. Zu typischen Modifikationen gehören die kovalente oder nicht kovalente Bindung eines Mitglieds eines spezifischen Bindungspaars und/oder einer nachweisbaren Markierung, die jeweils für sich allein oder beide den Nachweis des Antigens erleichtern können, an das Antigen.
Als Antikörper sind bei den Methoden der vorliegenden Erfindung monoklonale oder polyklonale Antikörper geeignet, die sich mit im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken herstellen lassen, wie beispielsweise Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren, von denen das Immunglobulin mit bekannten Techniken getrennt werden kann (polyklonale Antikörper), durch Herstellen kontinuierlicher Hybridzellinien und Sammeln des sezernierten Proteins (monoklonale Antikörper), wie von Milstrein und Köhler, Nature 256:495–7 (1975) beschrieben, oder durch Klonieren und Exprimieren von Nukleotidsequenzen oder mutagenisierten Versionen davon, die wenigstens für die zur spezifischen Bindung natürlicher Antikörper benötigten Aminosäuresequenzen codieren. Antikörper können das vollständige Immunglobulin oder ein Fragment davon sowie die verschiedenen Klassen und Isotypen, wie beispielsweise IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3 und IgM, umfassen. Fragmente können Fab, Fv, F(ab')2 und Fab umfassen.
Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält: eine beliebige Probe, von der realistisch vermutet wird, daß sie den interessierenden Analyten enthält, läßt sich mit den Methoden der vorliegenden Erfindung analysieren. Bei der Probe handelt es sich typischerweise um eine wäßrige Lösung, wie beispielsweise eine Körperflüssigkeit aus einem Wirt, zum Beispiel Urin, Vollblut, Plasma, Serum, Speichel, Samenflüssigkeit, Stuhl, Sputum, Liquor, Tränenflüssigkeit, Schleim oder dergleichen, jedoch bevorzugt um Plasma oder Serum. Oder es kann sich bei der Probe, wie oben beschrieben, um Proben aus Wasser, Erdboden oder Lebensmittelprodukten handeln. Die Probe kann wie unten beschrieben vorbehandelt und in einem beliebigen zweckmäßigen Medium, das den Test nicht stört, präpariert werden. Dabei ist ein wäßriges Medium bevorzugt.
Mitglied eines spezifischen Bindungspaars („sbp"-Mitglied): eines von zwei unterschiedlichen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einer Höhlung, der spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Anordnung des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär dazu definiert ist. Die sbp-Mitglieder können als Ligand und Rezeptor bezeichnet werden, wie beispielsweise Mitglieder eines immunologischen Paars, z.B. Antigen-Antikörper. Der Begriff „Ligand", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine beliebige organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlicherweise existiert oder hergestellt werden kann, und der Begriff „Rezeptor" bezieht sich auf eine beliebige Verbindung oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Anordnung eines Moleküls, d.h. eine Epitop- oder Determinanten-Stelle, erkennen kann. Komplementäre sbp-Mitglieder binden aneinander, wie beispielsweise ein Ligand und sein komplementärer Rezeptor. Bei sbp-Mitgliedern kann es sich um immunologische Paare, wie beispielsweise Antigen und Antikörper, oder um nicht immunologische Paare, wie beispielsweise Avidin und Biotin oder die komplementären Stränge eines Oligonukleotids, handeln. Ebenso kann es sich bei sbp-Mitgliedern um kleine Moleküle oder Reste von kleinen Molekülen und deren Rezeptoren handeln. Kleine Moleküle weisen ein Molekulargewicht von 100–2000, vorzugsweise 150–1000, auf, wobei ein Rezeptor für das kleine Molekül entweder existiert oder hergestellt werden kann. Zu kleinen Molekülen gehören beispielsweise Derivate von Biotin, Lysergsäure, Fluoreszein oder ein Fluoreszeinderivat, sowie Vitamin B12, wobei es sich bei den entsprechenden Rezeptoren um Avidin oder Streptavidin, Antilysergsäure, Anti-Fluoreszein bzw. intrinsischen Faktor handelt. Kleine Moleküle werden häufig kovalent an andere sbp-Mitglieder unter Ausbildung eines Konjugats gebunden, das wenigstens ein und häufig 2–20 kleine Moleküle aufweist. Das Binden des kleinen Moleküls an das sbp-Mitglied kann durch chemische Reaktionen erfolgen, die zum Austausch eines Wasserstoffatoms des kleinen Moleküls gegen eine Bindung an das sbp-Mitglied führen, oder über eine Verknüpfungsgruppe zwischen dem kleinen Molekül und dem sbp-Mitglied, wobei die Verknüpfungsgruppe eine beliebige Größe aufweisen kann, vorzugsweise jedoch nicht größer als notwendig ist, um die Bindung des Konjugats sowohl eines Rezeptors für das kleine Molekül als auch des sbp-Mitglieds zu gestatten. Antikörper gegen kleine Moleküle lassen sich durch Immunisierung von Tieren mit einem durch Verknüpfen des kleinen Moleküls mit einem immunogenen Träger hergestellten Immunogen herstellen.
Spezifischer Binder: bedeutet ein Molekül oder eine Verbindung, das bzw. die spezifisch den interessierenden Analyten bindet, und umfaßt Antikörper, Antigene, Liganden, Rezeptoren oder Fragmente oder Analoge davon.
Träger oder Oberfläche: Bei der Festphase handelt es sich typischerweise um einen Träger oder eine Oberfläche, bei dem bzw. der es sich um ein poröses oder nichtporöses wasserunlösliches Material handelt, das in einer Anzahl von Formen, wie beispielsweise Streifen, Stäbchen, Partikel, einschließlich Kügelchen, und dergleichen vorliegen kann. Geeignete Materialien sind im Fachgebiet allgemein bekannt und beispielsweise im US-Patent Nr. 5,185,243, US-Patent Nr. 4,868,104 und US-Patent Nr. 4,959,303 beschrieben. Zu allgemein bekannten Trägern gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Dem Fachmann sind viele andere geeignete feste Träger zur Bindung des zweiten Bindungsmittels bekannt oder werden ihm mittels Routineexperimenten ersichtlich. Die Bindung von Liganden und Rezeptoren an den Träger bzw. die Oberfläche läßt sich mit allgemein bekannten Techniken, die in der Literatur allgemein zugänglich sind, bewerkstelligen. Siehe beispielsweise „Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245:3059 (1970). Welche Art von festem Träger auch verwendet wird, so muß dieser so behandelt werden, als ob an seiner Oberfläche ein zweites Bindungsmittel gebunden ist. Zu typischen Bindungsmitteln gehören, wie unten weiter beschrieben, Liganden, wie beispielsweise Biotin, Antikörper, intrinsischer Faktor, spezifisch reaktive Chemikalien, wie z.B. Sulfhydrylgruppen, die mit einer Gruppe auf dem Antigen reagieren können, und dergleichen. So kann Biotin beispielsweise kovalent an kugelförmige Glaskügelchen mit 0,5–1,5 mm gebunden und zum Einfangen eines Aktivators verwendet werden.
Signalproduzierendes System („sps"): Eine oder mehrere Komponenten, wobei es sich bei wenigstens einer Komponente um eine Markierung handelt, die ein nachweisbares Signal erzeugt, das zu der Menge an gebundener und/oder nichtgebundener Markierung, d.h. der Menge an die nachgewiesene Verbindung gebundener oder nichtgebundener Markierung, in Beziehung steht. Bei der Markierung handelt es sich um ein beliebiges Molekül, das ein Signal produziert oder zur Produktion eines Signals veranlaßt werden kann, wie beispielsweise ein Fluoreszenzmolekül, Enzym, Chemilumineszenzmolekül oder Photosensibilisator. Somit wird das Signal durch Nachweisen von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorption nachgewiesen und/oder gemessen.
Zu geeigneten Markierungen gehören als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung Enzyme, wie z.B. alkalische Phosphatase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase („G6PDH") und Meerrettichperoxidase (Horseradish Peroxidase, HRP); Ribozym; ein Sustrat für eine Replikase, wie z.B. Q-Beta-Replikase; Promotoren; Farbstoffe; Fluoreszenzmoleküle, wie z.B. Fluoreszein, Isothiocyanat, Rhodaminverbindungen, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin; Chemilumineszenzmoleküle, wie z.B. Isoluminol; Sensibilisatoren; Coenzyme; Enzymsubstrate; Photosensibilisatoren; Partikel, wie z.B. Latex- oder Kohlenstoffpartikel; suspendierbare Partikel; Metallsol; Kristallit; Liposomen; Zellen, usw., die ferner mit einem Farbstoff, Katalysator oder einer anderen nachweisbaren Gruppe markiert sein können. Geeignete Enzyme und Coenzyme sind in Litman, et al., US-Patent Nr. 4,275,149, Spalte 19–28, und Boguslaski, et al., US-Patent Nr. 4,318,980, Spalte 10–14, offenbart; geeignete Fluoreszenzmoleküle und Chemilumineszenzmoleküle sind in Litman, et al., US-Patent Nr. 4,275,149 in Spalte 30 und 31, offenbart. Vorzugsweise ist wenigstens ein sps-Mitglied ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Die Markierung kann direkt ein Signal produzieren, und daher sind zur Produktion eines Signals keine zusätzlichen Komponenten erforderlich. Zahlreiche organische Moleküle, beispielsweise Fluoreszenzmoleküle, sind dazu in der Lage, ultraviolettes und sichtbares Licht zu absorbieren, wobei durch die Lichtabsorption Energie auf diese Moleküle übertragen wird, wodurch diese auf einen angeregten Energiezustand angehoben werden. Diese absorbierte Energie wird dann durch Emission von Licht bei einer zweiten Wellenlänge abgegeben. Zu weiteren Markierungen, die ein Signal direkt produzieren, gehören radioaktive Isotopen und Farbstoffe.
Andererseits kann die Markierung andere Komponenten zur Produktion eines Signals benötigen, wobei das sps in diesem Fall alle zur Produktion eines meßbaren Signals erforderlichen Komponenten enthalten würde, zu denen Substrate, Coenzyme, Enhancer, zusätzliche Enzyme, Substanzen, die mit enzymatischen Produkten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren, Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger-Moleküle, Metallionen, zur Bindung signalerzeugender Substanzen erforderliche spezifische Bindungssubstanz und dergleichen gehören können. Eine ausführliche Diskussion geeigneter signalproduzierender Systeme findet sich bei Ullmann, et al., US-Patent Nr. 5,185,243, Spalte 11–13.
Die Markierung ist an ein sbp-Mitglied gebunden, bei dem es sich um den Analyten handelt oder das zur direkten oder indirekten Bindung des Analyten fähig ist oder bei dem es sich um einen Rezeptor für den Analyten handelt und das, ohne darauf beschränkt zu sein, den Analyten; einen Liganden für einen an den Analyten gebundenen Rezeptor; einen Rezeptor für einen an den Analyten gebundenen Liganden; einen Antikörper, der den Analyten bindet; einen Rezeptor für einen Antikörper, der den Analyten bindet; einen Rezeptor für ein Molekül, das mit einem Antikörper gegen den Analyten konjugiert ist; einen Analytersatzstoff, der zur Bindung eines Rezeptors für den Analyten fähig ist; einen Liganden, der den Analyten bindet, usw., umfaßt. Das Binden der Markierung an das sbp-Mitglied kann mittels nichtkovalentem Binden, wie beispielsweise durch Ausbildung eines Komplexes der Markierung mit einem Antikörper gegen die Markierung, oder mittels kovalentem Binden, wie beispielsweise durch chemische Reaktionen, die zum Austausch eines Wasserstoffatoms der Markierung gegen eine Bindung an das sbp-Mitglied führen oder die eine Verknüpfungsgruppe zwischen der Markierung und dem sbp-Mitglied beinhalten, bewerkstelligt werden. Solche Konjugationsmethoden sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Siehe beispielsweise Rubenstein, et al., US-Patent Nr. 3,817,837. Andere sps-Mitglieder können auch kovalent an sbp-Mitglieder gebunden werden. So lassen sich beispielsweise bei Ullman, et al., US-Patent Nr. 3,996,345 zwei sps-Mitglieder, wie beispielsweise ein Fluoreszenzmolekül und ein Quencher-Molekül, jeweils an zwei sbp-Mitglieder binden, die beide den Analyten binden, so daß ein Fluoreszenzmolekül-sbp1:Analyt:sbp2-Quencher-Komplex gebildet wird. Durch die Ausbildung des Komplexes werden das Fluoreszenzmolekül und das Quencher-Molekül in enge Nachbarschaft zueinander gebracht, womit dem Quencher-Molekül die Wechselwirkung mit dem Fluoreszenzmolekül gestattet wird, so daß ein Signal produziert wird. Hierbei handelt es sich um einen Fluoreszenzexitationstransfer-Immuntest. Ein weiteres Konzept ist bei Ullman, et al., EP 0,515,194 A2 beschrieben, bei dem eine Chemilumineszenzverbindung sowie ein Photosensibilisator als sps-Mitglieder verwendet werden. Dies wird als „Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay" bezeichnet.
Hilfsmaterialien: Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig in den Methoden im Sinne der vorliegenden Erfindung eingesetzt. So sind beispielsweise im Testmedium normalerweise Puffer ebenso wie Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten vorhanden. Zusätzlich zu diesen Zusatzstoffen können häufig Proteine, wie z.B. Albumine, organische Lösungsmittel, wie z.B. Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polycationen, wie z.B. Dextransulfat, oder Tenside, insbesondere nichtionische Tenside, Bindungsverstärker, z.B. Polyalkylenglycole, oder dergleichen enthalten sein.
Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung Methoden zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Menge von Analyt in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält. Diese Methoden kombinieren den Empfindlichkeitsvorteil von Immunpräzipitationstests mit einer vereinfachten Vorschrift.
Bei einer erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich um eine Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, wobei die Methode die folgenden Schritte umfaßt: (a) Zusammenbringen: (i) der Probe; (ii) mindestens eines spezifischen Binders für den Analyten; (iii) eines ersten, entweder an (1) exogenen Analyten oder (2) an den spezifischen Binder für den Analyten gekoppelten Bindungsmittels; (iv) eines ein zweites Bindungsmittel umfassenden Trägers; in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines Gemischs; (b) Versetzen des Gemischs mit einem Aktivator, wobei der Aktivator das erste Bindungsmittel sowie das zweite Bindungsmittel des Trägers bindet, so daß das erste Bindungsmittel immobilisiert wird; und (c) Bestimmen der Menge des Analyten in der Probe durch Nachweisen des immobilisierten ersten Bindungsmittels, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht.
Ein kritisches Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß der spezifische Binder für den Analyten, das erste Bindungsmittel und die Probe in der Lage sind, in Gegenwart des zweiten Bindungsmittels vor Zugabe des Aktivators, der das erste Bindungsmittel an das zweite Bindungsmittel, welches auf dem festen Träger immobilisiert ist, bindet, zu reagieren. Sobald der Aktivator zugegeben worden ist, läßt sich die Menge oder das Vorhandensein des ersten Bindungsmittels bestimmen und dann zu der Menge bzw. dem Vorhandensein des Analyten in der Probe in Beziehung setzen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Durchführung der Bindungsschritte in einem Testgemisch in Gegenwart einer spezifisch aktivierten Oberfläche ohne vorzeitige Bindung des erhaltenen Immunkomplexes an die Oberfläche.
Eine Art von Test der vorliegenden Erfindung umfaßt eine „Ein-Platten"-DELISA-Vorschrift, bei der der Bedarf für zwei Platten, einen Übertragungsschritt, einen Vorwaschschritt der Platte unmittelbar vor Gebrauch wegfällt. Die Gesamttestzeit wird verkürzt, beispielsweise auf 3,5 Stunden.
In der Standard-DELISA-Vorschrift muß die primäre Reaktion zwischen dem Antikörper in der Probe und dem Antigen, z.B. bGAD, ebenso wie die anschließende Inkubation mit der maskierenden Verbindung, z.B. Protein-A-konjugiertes Dextran (PAD), in einer inerten Platte durchgeführt und dann auf eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte übertragen werden, um Bindung an die Platte zu erhalten. In den Methoden der vorliegenden Erfindung werden andererseits Mikrotiterplatten verwendet, die mit einem ersten Bindungsmittel beschichtet sind, wodurch es gestattet ist, den gesamten Test in der gleichen Vertiefung durchzuführen. Nur wenn ein Aktivator in die Vertiefung gegeben wird, kann das Antigen, d.h. bGAD, auf eine spezifische Weise binden. Der Aktivator, z.B. Streptavidin, mit vier Biotinbindungsstellen, dient als Brücke zur Bindung von löslichem freien bGAD an oberflächenimmobilisierte zweite Bindungsmittel, z.B. bBSA. Durch diese Modifikation fällt die Notwendigkeit für zwei Platten sowie einen Übertragungsschritt für das Reaktionsgemisch weg.
Bei dem modifizierten DELISA-Testformat der vorliegenden Erfindung umfaßt der Analyt einen Antikörper, handelt es sich bei dem den Analyten bindenden Molekül um ein Antigen gegen den Antikörper und ist die erste Bindung an exogenes Antigen gekoppelt. Im Reaktionsgemisch bindet der Antikörper das exogene Antigen unter Ausbildung eines erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplexes. Zwischen den obigen Schritten (a) und (b) wird eine maskierende Verbindung, die den Komplex bindet und das Antigen nicht bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist, zugegeben. Bei diesen Tests bindet der Aktivator selektiv das an das Antigen gekoppelte erste Bindungsmittel, welches nicht von dem Maskierungsmittel maskiert ist, relativ zur Bindung des maskierten Komplexes. Der Aktivator bindet ebenso das zweite Bindungsmittel. Zur Messung der Menge oder des Vorhandenseins des Analyten wird eine an einen zweiten spezifischen Binder an den Analyten im Komplex gebundene Markierung zugegeben. Anschließend wird die Menge an Markierung nachgewiesen.
Die maskierende Verbindung verhindert die Bindung des erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplexes an den Aktivator und daher die Bindung des Komplexes an das zweite Bindungsmittel, welches an den festen Träger gekoppelt ist.
Der Begriff „bindet selektiv", wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß der Aktivator die Fähigkeit besitzt, vorzugsweise an das an das Antigen gekoppelte erste Bindungsmittel relativ zur Bindung des maskierten erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplexes zu binden. Die Affinität des Aktivators für das an das Antigen gekoppelte erste Bindungsmittel beträgt wenigstens das Fünffache und vorzugsweise wenigstens das Zehnfache seiner Affinität für den maskierten Komplex. Diese bevorzugte Bindung kann kinetisch oder thermodynamisch sein und ist üblicherweise ein Ergebnis von Ladungsabstoßung und/oder sterischer Hinderung. Beispielsweise kann die maskierende Verbindung, wenn sie an den Komplex gebunden ist, eine derartige Masse aufweisen, daß der Aktivator nicht in der Lage ist, das im Komplex vorhandene erste Bindungsmittel in einem signifikanten Ausmaß zu binden. Daher wird Aktivator lediglich an das an das Antigen gekoppelte erste Bindungsmittel gebunden, welches dann wiederum an das zweite Bindungsmittel auf dem festen Träger bindet.
Bei dem spezifischen Binder und den maskierenden Verbindungen handelt es sich um sbp-Mitglieder, wobei sich die Bindung des Aktivators an den maskierten erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplex besser verhindern läßt, wenn die maskierende Verbindung an ein lösliches Polymer oder eine suspendierbare Festphase gebunden ist. Dies bringt den zusätzlichen Vorteil mit sich, daß das an den Komplex gebundene Maskierungsmittel vor Zugabe des Aktivators nicht vom Medium getrennt werden muß, da das Maskierungsmittel und der Komplex die Messung von freiem Antigen nicht stören.
Das sbp-Mitglied, das die maskierende Verbindung bildet, wird so ausgewählt, daß es den erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplex bindet und nicht das Antigen, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist, d.h. die maskierende Verbindung bindet auf keine signifikante Weise an irgendein im Medium vorhandenes freies oder an das erste Bindungsmittel gebundenes Antigen. Das sbp-Mitglied kann auch andere in der Probe vorhandene Substanzen binden, beispielsweise Nicht-Analyt-Antikörper. Dies ist akzeptierbar, vorausgesetzt, daß die maskierende Verbindung kein Antigen bindet, außer, wenn das Antigen im Komplex gebunden ist.
Zu als maskierende Verbindungen geeigneten sbp-Mitgliedern gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Antikörper gegen Immunglobuline; Komplementfaktor, C1q; rheumatoider Faktor; Protein G und/oder Protein A. Einige dieser Materialien binden nicht selektiv gewisse Immunglobuline, beispielsweise Antikörper und Protein A, und einige binden selektiv Immunkomplexe, beispielsweise C1q und rheumatoider Faktor. Wie oben angemerkt, ist es zur Verhinderung der Bindung des Aktivators an den erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplex bevorzugt, obwohl nicht notwendig, daß die maskierende Verbindung ferner eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer umfaßt, d.h. das die maskierende Verbindung an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebunden ist.
Geeignete lösliche Polymere sind linear oder vorzugsweise verzweigt und umfassen zur Veranschaulichung und ohne darauf beschränkt zu sein, Polysaccharide, wie z.B. Dextran und Heparin; Polyacrylate, Polyacryloylglucosamin, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen. Die Polymere weisen üblicherweise ein Molekulargewicht von wenigstens 10 000 auf, wobei die das erste Bindungsmittel umfassenden löslichen Polymere vorzugsweise Molekulargewichte über 250 000 aufweisen. Ein bevorzugtes Polymer umfaßt Dextran.
Zu geeigneten suspendierbaren Festphasen gehören zur Veranschaulichung und ohne darauf beschränkt zu sein, Latex, Glaspartikel, insbesondere poröse Glaspartikel, Polyacrylamidpartikel, Agarose, SEPHADEX^® (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) ebenso wie andere partikuläre Phasen, die nicht im engeren Sinne als Feststoffe gelten, wie z.B. Liposomen, Öltröpfchen und so weiter. Zahlreiche der oben aufgeführten löslichen Polymere lassen sich quervernetzen, so daß suspendierbare Festphasenmaterialien erhalten werden. Diese Materialien sind üblicherweise partikulär und weisen eine Größe im Bereich von 10 nm bis 100 nm, vorzugsweise von 100 nm bis 10 nm, auf.
Bei dem ersten Bindungsmittel handelt es sich um ein sbp-Mitglied, das zur Bindung an sbp auf dem Aktivator fähig ist, beispielsweise kann es sich bei dem ersten Bindungsmittel um einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, gegen den Aktivator oder einen Teil davon handeln. Das erste Bindungsmittel kann ein Rezeptor sein, wobei der Aktivator oder ein Teil davon einen Liganden umfaßt, der spezifisch für diesen Rezeptor ist. Das erste Bindungsmittel kann ein Ligand sein, an den der Aktivator bindet. In einem solchen Fall würde der Aktivator einen Antikörper gegen den Liganden umfassen. Zu bevorzugten ersten Bindungsmitteln gehören beispielsweise Biotin, Folat-Bindungsprotein, Fluoreszein, Haptene (z.B. Digoxigenin, Dinitrophenol, usw.), Kohlenhydrate, Rezeptoren usw. Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten Bindungsmittel um Biotin, so umfaßt der Aktivator ein Element, das spezifisch das Biotin bindet, beispielsweise ein sbp-Mitglied, wie z.B. Avidin, Streptavidin oder Antikörper gegen Biotin. Als Alternative kann es sich bei dem ersten Bindungsmittel um eine chemisch reaktive Gruppe handeln, die spezifisch mit Gruppen auf dem Aktivator reagiert. Beispielsweise könnte das erste Bindungsmittel Bromacetamidgruppen aufweisen, die spezifisch mit Sulfhydrylgruppen auf dem Aktivator eine Bindung eingehen können.
Bei dem zweiten Bindungsmittel handelt es sich ebenso um ein wie oben beschriebenes sbp für das erste Bindungspaar, das zur Bindung an sbp auf dem Aktivator fähig ist. Das zweite Bindungsmittel kann mit dem ersten Bindungspaar identisch oder davon verschieden sein.
Falls das zweite Bindungsmittel mit dem ersten Bindungsmittel identisch ist, muß der Aktivator in der Lage sein, sowohl das erste als auch das zweite Bindungsmittel zu binden. Das heißt, der Aktivator muß wenigstens bivalent und vorzugsweise multivalent sein. Zu multivalenten Molekülen gehören beispielsweise, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Streptavidin und Anti-Biotin-Antikörper IgG und IgM. Dem Durchschnittsfachmann ist es leicht möglich, geeignete multivalente Moleküle zur Verwendung als Aktivatoren auf der Grundlage der hier vorliegenden Lehren auszuwählen. Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten und bei dem zweiten Bindungsmittel um Biotin, so ist der Aktivator vorzugsweise ein Molekül wie z.B. Streptavidin, Anti-Biotin-IgG oder -IgM. In einem weiteren Beispiel, wobei es sich bei dem ersten und dem zweiten Bindungsmittel jeweils um ein Hapten (z.B. Flurescein, Digoxigenin, Dinitrophenol oder andere) handelt, kann der Aktivator einen multivalenten Anti-Hapten-Antikörper, vorzugsweise IgM, umfassen. Handelt es sich bei dem ersten und dem zweiten Bindungsmittel um Kohlenhydrate, so kann der Aktivator ein Lectin sein, das zur Bindung beider Bindungsmittel fähig ist. Wenn es sich bei dem ersten und dem zweiten Bindungs mittel um Rezeptoren handelt, so ist der Aktivator vorzugsweise ein multimeres synthetisches Peptid. Siehe z.B. Wallace, A., et al., Pept. Res., 7(1), 27–31 (1994). Falls der Aktivator nicht natürlicherweise multivalent ist, z.B. Streptavidin, so läßt sich ein multivalentes Molekül leicht vom Durchschnittsfachmann herstellen. Siehe z.B. Holliger, WO 9413804 A1 und Libyh, M., et al., Fr. Blood, (1997), 90(10), 3978–3983. Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten und zweiten Bindungsmittel um Folat-Bindungsprotein, so kann ein Folat-Dextran-Konjugat hergestellt werden, das mehrere Kopien von an Dextran gebundenem Folat umfaßt. Dieses Konjugat ist zur Bindung des Folat-Bindungsproteins sowohl des ersten als auch des zweiten Bindungsmittels fähig.
In Tests, bei denen sich das erste Bindungsmittel vom zweiten Bindungsmittel unterscheidet, handelt es sich bei dem Aktivator um eine heterofunktionelle Verbindung, die zur Bindung sowohl des ersten als auch des zweiten Bindungsmittels fähig ist. Handelt es sich beispielsweise bei dem ersten Bindungsmittel um Folat-Bindungsprotein und bei dem zweiten Bindungsmittel um Fluoreszein, so ist der Aktivator ein Hybridkonjugat, das an einem Ende ein Folat und am anderen Ende einen Antikörper gegen Fluoreszein umfaßt. In einem weiteren Beispiel umfaßt der Aktivator ein Anti-Fluoreszein-Streptavidin-Konjugat, falls es sich bei einem Bindungsmittel um Fluoreszein und bei dem anderen um Biotin handelt. In Tests, bei denen das erste Bindungsmittel ein erstes Hapten, Hapten A, und das zweite Bindungsmittel ein zweites Hapten, Hapten B, umfaßt, handelt es sich bei dem Aktivator um einen bifunktionellen Anti-A-, Anti-B-Antikörper. Ein solcher bifunktioneller Antikörper läßt sich entweder gentechnisch konstruieren oder über chemische Konjugation der beiden Antikörper herstellen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Anti-A- und Anti-B-Antikörpern um monoklonale Antikörper oder Fragmente davon. Dem Durchschnittsfachmann ist es leicht möglich, Konjugate und heterofunktionelle Verbindungen herzustellen, die das erste und das zweite Bindungsmittel quervernetzen. Siehe z.B. US-Patente Nr. 3,817,837; 3,996,345; 5,696,264. Siehe auch Cho, B.K., et al., Bio Conjugate Chem. (1997) 8(3), 338–346 und Huang, W., et al., Anal. Chem., (1996) 68(9), 1646–1650.
Das zweite Bindungsmittel ist an ein lösliches Polymer oder an eine suspendierbare oder nicht suspendierbare Festphase gebunden. Zu den löslichen Polymeren und suspendierbaren Trägern gehören Polymere, wie beispielsweise Nukleinsäuren, Proteine, Dextrane und Polyacrylate; Aggregate, wie beispielsweise Immunkomplexe; Partikel, wie beispielsweise Latex, Agarose, SEPHADEX^®, Farbstoffkristallite, Liposomen, Öltröpfchen, Metallsole und dergleichen. Zu den nicht suspendierbaren Festphasen gehören feuchtigkeitsaufnehmende Materialien, wie beispielsweise Glas oder Zellulosepapier; Kunststoffe, wie beispielsweise Polystyrol, Nylon, Polymethacrylat usw.; Siliziumverbindungen, Metalle, wie beispielsweise Gold und Indium und dergleichen.
Das zweite Bindungsmittel kann an den festen Träger auf vielerlei Arten, die der Fachkraft bekannt sind, angebracht werden. So kann beispielsweise, wenn es sich bei dem zweiten Bindungsmittel um Biotin handelt, dieses an den Träger, z.B. eine Mikrotiterplatte oder Kügelchen, gebunden werden. Dies wird bewerkstelligt, indem man eine Biotin-BSA-Konjugatlösung in einer Vertiefung einer Kunststoffmikrotiterplatte inkubiert (siehe z.B. USP 5,378,608). Vorzugsweise wird Biotin-BSA wie unten beschrieben verwendet. Vorzugsweise erzeugt die Methode der Konjugation des zweiten Bindungsmittels an den festen Träger eine Bindung, die stark genug ist, um das Ablösen des zweiten Bindungsmittels von dem Träger zu verhindern.
Nach Zugabe des Aktivators wird das an das zweite Bindungsmittel gebundene erste Bindungsmittel nachgewiesen, wobei sein Vorhandensein oder seine Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht. Im modifizierten DELISA-Test ist diese Beziehung umgekehrt proportional, da die Menge an freiem Antigen, d.h. die Menge an Antigen, die an das zweite Bindungsmittel gebunden wird, desto geringer ist, je höher die Konzentration von in der Probe vorhandenen Antikörpern ist.
Im oben beschriebenen modifizierten DELISA-Test ist das antigengebundene erste Bindungsmittel vorzugsweise in einer Menge vorhanden, die geringer ist als die erwartete Menge an nachzuweisendem Antikörper. So beträgt beispielsweise in einem Test zur Bestimmung der Menge eines Antikörpers in einer Serumprobe die molare Menge an an Antigen konjugiertem Bindungsmittel (Bindungsmittel/Antigen-Komplex), die in das die Probe enthaltene Medium gegeben wird, vorzugsweise und üblicherweise weniger als 1 μM, häufig weniger als 1 nM und bevorzugt weniger als 0,1 nM, und wird in einer Menge zugegeben, die die größte erwartete Menge an Antikörpern in der Probe nicht überschreiten soll. Die Messung von nach der Bindung an die Antikörper verbliebenem freiem Bindungsmittel/Antigen-Komplex gestattet einen außerordentlich empfindlichen Nachweis der Antikörper.
Vorzugsweise wird eine geringe Konzentration des Bindungsmittel/Antigen-Komplexes verwendet. Obwohl es sich bei der geringsten praktischen Konzentration des Komplexes um die geringste Konzentration handelt, die nachgewiesen werden kann, falls die Probe keinen Antikörper aufweist, ist es normalerweise wünschenswert, das bis zu 1000fache dieser minimalen nachweisbaren Konzentration, vorzugsweise nicht mehr als das 100fache der minimalen nachweisbaren Konzentra tion, zu verwenden. Im allgemeinen gilt, daß je mehr Komplex eingesetzt wird, desto größer ist der Bereich von Antikörperkonzentrationen, die sich genau messen lassen und desto geringer ist die Empfindlichkeit des Tests. Ein Fachmann ist leicht in der Lage, die geeigneten zu verwendenden Konzentrationen auf Grundlage der hier enthaltenen Lehren zu bestimmen. Siehe z.B. US-Patent Nr. 5,561,049.
Durch die vorliegende Erfindung entfällt der Übertragungsschritt des im US-Patent Nr. 5,561,049 offenbarten DELISA-Tests, wobei gestattet ist, die Bindungsreaktionen, einschließlich der Bindung an den festen Träger, im gleichen Reaktionsansatz durchzuführen, d.h. in der gleichen Vertiefung einer Mikrotiterplatte oder im gleichen Teströhrchen. So wird beispielsweise in einem Test zur Messung von GAD-Antikörpern in einer Blutprobe Biotin als erstes und als zweites Bindungsmittel und Streptavidin als Aktivator verwendet. In einem derartigen Test wird Biotin (d.h. das erste Bindungsmittel) an exogenes GAD-Antigen gekoppelt und Biotin (d.h. das zweite Bindungsmittel) an die Oberfläche des Trägers gebunden. Die Probe wird mit dem Biotin-GAD-Konjugat gemischt, wobei für die Bindung an Autoantikörper durch Inkubation Zeit zur Verfügung gestellt wird. Die maskierende Verbindung, z.B. Protein-A-Dextran, wird dann zur Bindung aller Immunglobuline zugegeben. Anschließend wird jedoch, anstatt das Gemisch in eine neue, mit Streptavidin beschichtete Vertiefung zu überführen, das Gemisch mit Streptavidin versetzt. Da Streptavidin multivalent ist (vier Bindungsstellen), ist es in der Lage, gleichzeitig sowohl das freie Biotin-GAD-Konjugat als auch die biotinylierte Oberfläche zu binden, wodurch eine Bindung des freien Biotin-GAD-Konjugats an die Oberfläche stattfindet. Die Platte wird gewaschen. Die auf der Oberfläche vorhandene Menge an Konjugat wird dann wie zuvor bestimmt, beispielsweise durch Messen des von einem signalproduzierenden System produzierten Signals. Geeignete Markierungen umfassen Verbindungen, die den Analyten spezifisch binden, d.h. einen spezifischen Binder. Beispielsweise wird ein an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierter monoklonaler Antikörper zugegeben. Nach einem zweiten Waschschritt wird ein chromogenes Substrat für HRP, z.B. TMB, zugegeben und die sich entwickelnde Farbmenge mit bekannten Methoden, beispielsweise visueller Beobachtung, spektrophotometrischer Analyse usw., bestimmt. Dabei ist die Absorption umgekehrt proportional zur Menge an Serum-GAD-Autoantikörper.
Wie zuvor gesagt, fällt bei den Methoden der vorliegenden Erfindung der bei anderen Methoden erforderliche Übertragungsschritt weg, da alle Reaktionen in einer Vertiefung bzw. einem Röhrchen stattfinden. Darüber hinaus verringert sich die benötigte Menge an Aktivator, z.B. Streptavidin, da der feste Träger mit dem zweiten Bindungsmittel, z.B. Biotin, beschichtet ist. Dies ist bei Verwendung von Streptavidin, das sehr teuer ist, ein wichtiger wirtschaftlicher Vorteil.
Vorzugsweise beträgt die Menge an Aktivator, die dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird, weniger als das gesamte an der Oberfläche und im Konjugat gebundene Biotin. Besonders bevorzugt sollten weniger als halb so viele Aktivatoräquivalente wie die Gesamtzahl an ersten Bindungsmittelmolekülen verwendet werden.
Wie oben beschrieben kann bei bestimmten Methoden der vorliegenden Erfindung die Probe nach Zugabe der Mitglieder des signalproduzierenden Systems, z.B. nach Zugabe eines an HRP konjugierten monoklonalen Antikörpers, und vor Zugabe des Enzymsubstrats gewaschen werden. Bei anderen Methoden der vorliegenden Erfindung fällt jedoch dieser Waschschritt weg. Solche Methoden verwenden signalproduzierende Systeme, die ein nachweisbares Signal in einem homogenen Format produzieren, d.h. die diese Waschschritte nicht benötigen. So benötigt beispielsweise der SPA-Test (Scintillation Proximity Assay) keinen Trennschritt. Siehe Linace, P., et al., Methodol. Surv. Biochem. Anal., (1992) 22 (Bioanal. Approaches Drugs, Inc. Anti-Ashtmatics Metab.), 325–6. Diese Methode beinhaltet die Verwendung eines SPA-Reagens, das aus Yttriumsilikat hergestellte Kügelchen, die mit einer fluoreszenzfähigen Substanz (fluor) beschichtet sind, umfaßt. Ein weiteres Mitglied des Signalproduktionssystems umfaßt einen radioaktiv markierten Liganden, der β-Partikel emittiert, wenn er sich in enger Nachbarschaft zum fluor befindet, wobei Licht produziert wird, das sich in einem Szintillationszähler nachweisen läßt. Somit produziert der Radioligand bei Bindung an der festen Oberfläche ein nachweisbares Signal, das die Menge an Analyt in der Probe anzeigt. Nicht am festen Träger gebundener Radioligand ist zu weit vom fluor entfernt, um ein Signal zu produzieren. In einem weiteren Beispiel lassen sich elektrochemilumineszente organometallische Verbindungen zum Nachweis und zur Quantifizierung von Analyten in homogenen Bindungstests verwenden. Siehe US-Patent Nr. 5,731,147. Weitere geeignete signalproduzierende Systeme stehen dem Durchschnittsfachmann leicht zur Verfügung.
Die Erfindung betrifft ferner kompetitive Tests. In einem kompetitiven Testformat ist entweder der spezifische Binder oder der exogene Analyt nachweisbar, wobei das erste Bindungsmittel an exogenen Analyten gekoppelt ist. Der Bestimmungsschritt umfaßt das Nachweisen des nachweisbaren spezifischen Binders oder exogenen Analyten. So handelt es sich beispielsweise in einem bestimmten Test bei dem interessierenden Analyten um ein Antigen, z.B. Digoxin, und bei dem spezifischen Binder an den Analyten um ein Molekül, das das Antigen spezifisch bindet, vorzugsweise einen Anti-Digoxin-Antikörper oder ein Fragment davon. Der spezifische Binder umfaßt eine Komponente eines signalproduzieren den Systems, wie beispielsweise ein Enzym oder eine andere geeignete Markierung. In dieser Art von Test wird das erste Bindungsmittel an exogenes Antigen gekoppelt. So würde beispielsweise Biotin, ein erstes Bindungsmittel, mit im Fachgebiet bekannten Methoden an Digoxin gekoppelt. Konjugate, die ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems, das erste Bindungsmittel, z.B. Biotin sowie Antigen umfassen, lassen sich mit im Fachgebiet bekannten Methoden herstellen, z.B. USP 4.506.009. Der markierte spezifische Binder wird zu der Probe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, gegeben, wobei entweder gleichzeitig oder nachfolgend das erste Bindungsmittel ebenso zugegeben wird. Der Analyt in der Probe konkurriert mit dem Analyten, der an das erste Bindungsmittel gekoppelt ist, um die Bindung mit dem spezifischen Binder, wobei der an das erste Bindungsmittel gekoppelte Analyt einen Komplex mit dem spezifischen Binder in einer Menge bildet, die der Menge an Analyt in der Probe proportional ist. Diese Reaktion findet in Gegenwart des auf einem festen Träger immobilisierten zweiten Bindungsmittels statt. Wie oben beschrieben, kann es sich bei dem zweiten Mitglied um eine beliebige Art von Ligand, Rezeptor, Antigen oder Antikörper handeln, vorausgesetzt, daß es nicht das erste Bindungsmittel oder den Analyten vor der Aktivierung bindet. In einem bevorzugten kompetitiven Test handelt es sich bei dem zweiten Bindungsmittel um Biotin.
Bei diesem Test wird dann ein Aktivator zugegeben, der das erste Bindungsmittel im Komplex sowie das zweite Bindungsmittel bindet. Wie oben beschrieben, kann der Aktivator viele Formen einnehmen, je nach Beschaffenheit des ersten und des zweiten Bindungsmittels. Im obigen Beispiel, in dem sowohl das erste als auch das zweite Bindungsmittel Biotin umfaßt, handelt es sich bei dem Aktivator vorzugsweise um eine multivalente Verbindung, die Biotin an mehr als einer Stelle binden kann. Zu bevorzugten Aktivatoren gehören Avidin, Streptavidin, Anti-Biotin-Antikörper. Der Aktivator bindet das an das Antigen gebundene erste Bindungsmittel, z.B. Biotin, das mit dem Probenantigen um die Bindung mit dem spezifischen Binder, z.B. Antikörper, konkurrierte, sowie das an die feste Oberfläche gebundene zweite Bindungsmittel. Somit braucht das Reaktionsgemisch nicht in eine andere Vertiefung oder ein anderes Teströhrchen vor der Kopplung an den festen Träger überführt werden. Durch die Methoden der vorliegenden Erfindung wird ermöglicht, daß die obige Reaktion in einem Röhrchen oder einer Reaktionsvertiefung stattfinden kann.
In einem bevorzugten kompetitiven Test wird die Probe, von der vermutet wird, daß sie ein Antigen enthält, mit an ein Enzym gebundenem Anti-Antigen (einem Anti-Antigen-Enzym-Konjugat) in einer mit dem zweiten Bindungsmittel, z.B. Biotin, beschichteten Vertiefung gemischt. Die Reaktion wird über den benötigten Zeitraum inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird dann mit an das erste Bindungsmittel, z.B. Biotin, gekoppeltem Antigen versetzt. Man läßt die Reaktion über einen Zeitraum, der vom Durchschnittsfachmann leicht ermittelt werden kann, inkubieren. Nach der benötigten Inkubation wird der Aktivator, z.B. Streptavidin, zugegeben. Die Menge an zugegebenem Streptavidin wird durch die Menge an Biotin, mit dem die feste Oberfläche beschichtet ist, sowie die Menge an zugegebenem Biotin-markiertem Antigen bestimmt. Das Reaktionsgemisch wird abgetrennt und die Mikrotitervertiefung gegebenenfalls gewaschen. Enzymsubstrat wird zugegeben und das Enzymprodukt nachgewiesen. Die Menge an an der festen Oberfläche gebundener Markierung läßt sich direkt messen, oder die Menge an Antigen auf der Oberfläche kann indirekt über die Bindung eines nachweisbar markierten Antikörpers gegen den Analyten gemessen werden. Dabei ist die Enzymaktivität proportional zum gebundenen Anti-Antigen-Antikörper und somit umgekehrt proportional zur Menge an Antigen in der Probe.
In diesem Beispiel können die Probe, markierter oder nicht markierter biotinylierter Analyt und der Antikörper gegen den Analyten in einer biotinylierten Vertiefung inkubiert werden, wonach die Zugabe von Streptavidin erfolgt, so daß der freie biotinylierte Analyt an die Oberfläche bindet. Der biotinylierte Analyt bindet vorzugsweise nicht gleichzeitig an den Antikörper und an Streptavidin.
Im Fall von kompetitiven Tests weist der spezifische Binder vorzugsweise die gleiche Affinität für das exogene Antigen, das an das erste Bindungsmittel gebunden ist, wie für das Antigen in der Probe auf. Wenn die Affinität des spezifischen Binders, d.h. Antikörpers, zum Probenantigen gleich der für das an das erste Bindungsmittel gebundene Antigen ist, so liegt eine echte Kompetition vor. Bei bestimmten Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, einen kompetitiven Test zur Verfügung zu haben, bei dem es sich um einen Verdrängungstest handelt. In einer solchen Ausführungsform weist der spezifische Binder eine größere Affinität für das Probenantigen als für das Antigen, das an das erste Bindungsmittel gekoppelt ist, auf. Bei dieser Art von Test kann der spezifische Binder mit dem an das erste Bindungsmittel gekoppelten Antigen komplexiert werden, bevor dieser Komplex zu der Probe gegeben wird. Das Antigen in der Probe würde dann das an das erste Bindungsmittel gebundene exogene Antigen relativ zur Menge an in der Probe vorhandenem Antigen verdrängen.
Vorzugsweise ist der spezifische Binder, beispielsweise Antikörper gegen den interessierenden Analyten, für eine bestimmte Stelle auf dem Antigen spezifisch, bei der es sich um die gleiche Stelle sowohl auf dem Probenantigen als auch auf dem an das erste Bindungsmittel gekoppelten exogenen Antigen handelt. Zu bevorzugten spezifischen Bindern gehören Antikörper, besonders bevorzugt monoklonale Antikörper, oder Fragmente davon, gegen das interessierende Antigen. Andere bevorzugte spezifische Binder umfassen Rezeptoren gegen das Antigen. Die Kopplung des ersten Bindungsmittels an das exogene Antigen sollte die Bindung des spezifischen Binders nicht stören, und die Bindung des spezifischen Binders an das exogene Antigen sollte die Bindung des ersten Bindungsmittels an den Aktivator nicht stören.
In der obigen Beschreibung wird der Begriff „Antigen" in bezug auf den interessierenden Analyten verwendet. Es ist jedoch ersichtlich, daß jeder interessierende Analyt, beispielsweise Liganden oder andere Moleküle, die an einen spezifischen Rezeptor binden, wie beispielsweise etwa Folat oder Rezeptoren, auf diese Weise bestimmt werden kann.
Bei den Tests vom kompetitiven Typ ist das an exogenes Antigen gebundene erste Bindungsmittel vorzugsweise in einer Menge vorhanden, die die Kapazität der Bindungsstellen auf den festen Träger nicht übersteigt. Der spezifische Binder ist vorzugsweise in einer Menge vorhanden, die die Fähigkeit zur Bindung des erstes-Bindungsmittel/Antigen-Komplexes nicht übersteigt. Das Antigen ist vorzugsweise nicht im Überschuß vorhanden, da dies die Empfindlichkeit des Tests verringern kann.
Ebenso liegen im Umfang der Erfindung Immuntests vom Sandwich-Typ, bei denen ein erster und ein zweiter spezifischer Binder zum Analyten, beispielsweise Antikörper, mit der Probe unter Bildung eines spezifischer-Binder:Analyt:spezifischer-Binder-Komplexes zusammengegeben werden, wobei einer der spezifischen Binder an ein erstes Bindungsmittel konjugiert und der andere mit einer nachweisbaren Markierung in Form eines Mitglieds eines signalproduzierenden Systems versehen ist. Nach der Bindungsreaktion wird der Aktivator zugegeben, wodurch der Komplex dazu gebracht wird, an die Oberfläche der Reaktionsvertiefung, die zuvor mit einem zweiten Bindungsmittel beschichtet wurde, zu binden. Anschließend wird die Menge an an der Oberfläche gebundener nachweisbarer Markierung gemessen. Die Menge an Markierung ist direkt zur Menge an Antigen in der Probe proportional. Bei diesen Tests binden der erste und der zweite spezifische Binder vorzugsweise an zwei unterschiedliche Epitope auf dem Analyten, so daß sie nicht um die gleiche Bindungsstelle konkurrieren. Die Zugabe der beiden spezifischen Binder zur Probe kann nacheinander oder gleichzeitig erfolgen. Dabei kann es wünschenswert sein, das die spezifischen Binder und die Probe enthaltene Reaktionsgemisch über einen Zeitraum inkubieren zu lassen, um die vollständige Bindung des Analyten durch die beiden spezifischen Binder zu gestatten, bevor der Aktivator zugegeben wird. Nach Zugabe des Aktivators läßt man diesen reagieren, und anschließend kann die Lösung zur Abtrennung von nicht gebundener Markierung gewaschen werden. Geeignete Waschtechniken sind dem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt. Handelt es sich bei der Markierung um ein Enzym, so kann dann das Substrat für das Enzym zugegeben und das Signal gemessen werden.
Die erfindungsgemäßen Tests vom Sandwich-Typ eignen sich zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines jeden Analyten, der sich mit gegenwärtig bekannten Sandwich-Tests bestimmen läßt. Dazu gehören beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, knochenspezifische alkalische Phosphatase, Haptene, Proteine, Polypeptide, Hormone, wie beispielsweise Insulin und menschliches Thyroid-stimulierendes Hormon (Human Thyroid Stimulating Hormone, HTSH), Gamma-Globuline, Allergene, Viren, Virusuntereinheiten, Bakterien, Toxine, wie z.B. solche, die mit Tetanus und mit tierischen Giften assoziiert sind, sowie selbst einige Arzneistoffe. Unter den spezifischen Antigenen, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung getestet werden können, seien das CEA (Carcinoembryonic Antigen), Hepatitis A und B, Hepatitis Non-A/Non-B, IgE sowie Alphafetoprotein genannt. Antikörper gegen diese Analyten stehen entweder im Fachgebiet zur Verfügung oder können vom Durchschnittsfachmann leicht erhalten werden. Siehe z.B. US-Patente Nr. 5,525,473 und 5,589,574.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen Kit zum Nachweis des Vorhandenseins von oder zur Bestimmung der Menge an Analyt in einer flüssigen Probe. Die Reagentien der Methoden der vorliegenden Erfindung sind über lange Lagerzeiten stabil und kostengünstig herzustellen und zu verwenden. Daher sind diese Reagentien einer Kit-Formulierung zugänglich. Ein Kit der vorliegenden Erfindung umfaßt die zur Durchführung der Methoden der vorliegenden Erfindung notwendigen Komponenten in abgepackter Kombination. Ein Kit der vorliegenden Erfindung umfaßt (1) mindestens einen spezifischen Binder für den Analyten; (2) ein entweder an (a) exogenen Analyten oder (b) den spezifischen Binder für den Analyten gekoppeltes erstes Bindungsmittel; (3) einen ein zweites Bindungsmittel umfassenden Träger und (4) einen Aktivator, der das erste Bindungsmittel sowie das zweite Bindungsmittel des Trägers bindet, so daß das erste Bindungsmittel immobilisiert wird.
Die spezifischen Komponenten des Kits können vom Durchschnittsfachmann entsprechend der Art des durchzuführenden Tests ausgewählt werden. Beispielsweise ist in einem Kit zur Durchführung eines DELISA-Tests, wo es sich bei dem Analyten um einen Antikörper handelt, der spezifische Binder ein Antigen gegen den Antikörper, das erste Bindungsmittel ist Biotin, das an Antigen gekoppelt ist, das zweite Bindungsmittel umfaßt Biotin, das an die Wände eines Behälters gebunden ist und der Aktivator umfaßt Streptavidin.
In einem Kit zur Durchführung eines modifizierten DELISA-Tests umfaßt der Kit ferner eine an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebundene maskierende Verbindung. Bei der suspendierbaren Festphase handelt es sich vorzugsweise um ein Partikel, das ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Keramik und Glas, umfaßt. Zu bevorzugten maskierenden Verbindungen gehören Antikörper gegen Immunglobuline, Komplementfaktor C1q, rheumatoider Faktor, Protein G und Protein A, die je nach dem zu testenden Analyten ausgewählt werden können.
Die Kits der vorliegenden Erfindung können auch, falls gewünscht, wenigstens ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems enthalten. Dabei ist wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln und läßt sich wie oben beschrieben auswählen.
Ein bevorzugter Kit im Sinne der vorliegenden Erfindung, der sich zum Nachweis von GAD-Autoantikörpern eignet, umfaßt an Biotin als erstem Bindungsmittel gebundenes GAD-Antigen. Der Kit umfaßt ebenso einen festen Träger, wie beispielsweise eine Mikrotiterplatte, die mit BSA-Biotin als zweites Bindungsmittel beschichtet ist. Als Maskierungsmittel wäre an ein lösliches Polymer, wie z.B. Dextran, gebundenes Protein-A enthalten. Als Aktivator wäre Streptavidin enthalten. Ein Anti-GAD-monoklonaler-Ak-HRP-Konjugat ist enthalten.
Die Mengen der einzelnen Komponenten würden jeweils vom interessierenden Analyten ebenso wie von der Beschaffenheit der zu messenden Probe abhängen. Der Fachmann ist in der Lage, eine solche Bestimmung auf der Grundlage von im Fachgebiet bekannten Methoden und der hier enthaltenen Offenbarung vorzunehmen. Es versteht sich im Fachgebiet, daß Komponenten und Reagentien bereitgestellt werden können, um in Kits gemäß einem Format aus einer Reihe unterschiedlicher Formate verwendet zu werden.
Unter geeigneten Umständen können eines oder mehrere der Reagentien im Kit in Lösung oder als Trockenpulver, üblicherweise lyophilisiert, unter Einschluß von Hilfsstoffen, die nach Auflösung für eine Reagenzlösung mit den entsprechenden Konzentrationen zur Durchführung einer Methode oder eines Tests im Sinne der vorliegenden Erfindung sorgen, bereitgestellt werden. Dabei ist der Kit nicht aufgrund der Form der Komponenten, d.h. Pulver, Flüssigkeit oder Tablette, beschränkt. Um die Vielseitigkeit der vorliegenden Erfindung zu verbessern, können die Reagentien in abgepackter Kombination im selben Behälter oder in getrennten Behältern bereitgestellt werden, so daß das Verhältnis der Reagentien für eine weitgehende Optimierung der Methode und des Tests sorgt. Die Reagentien können jeweils in getrennten Behältern vorliegen, oder es können verschiedene Reagentien in einem oder mehreren Behältern je nach der Kreuzreaktivität und Stabilität der Reagentien zusammengegeben werden. Zweckmäßigerweise können die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Reagentien in vorbestimmten Mengen bereitgestellt werden. Der Kit kann auch schriftliche Anweisungen darüber enthalten, wie man die Reagentien verwendet und/oder wie man einen bestimmten Test durchführt, beispielsweise in Form eines Beipackzettels.
Zur Durchführung der Methoden im Sinne der vorliegenden Erfindung werden entsprechende Reaktionsbedingungen gewählt. Die folgende Beschreibung legt geeignete Bedingungen dar, die vom Fachmann je nach den spezifischen Reagentien und der für eine bestimmte Anwendung gewählten Testvorschrift modifiziert werden können. So lassen sich beispielsweise die Methoden der vorliegenden Erfindung auf zahlreiche Arten von Tests, wie beispielsweise heterogene oder homogene Tests, anwenden, wobei die verwendeten Bedingungen und Reagentien entsprechend ausgewählt werden.
Die Probe läßt sich, vorzugsweise in einem geeigneten Medium, entweder direkt untersuchen oder kann vorbehandelt werden, bevor sie in das Testmedium gegeben wird. Eine Vorbehandlung kann dazu führen, daß der interessierende Analyt leichter für eines oder mehrere der Testreagentien zugänglich oder leichter nachweisbar ist, indem eine Störung des Tests durch Entfernen eventuell vorhandener unerwünschter Materialien verringert wird. Dabei kann die Probe vorbehandelt werden, um Zellen zu trennen oder zu lysieren; Proteine zu präzipitieren, hydrolysieren oder denaturieren; Lipide zu hydrolysieren; oder dergleichen. Eine solche Vorbehandlung kann, ohne darauf beschränkt zu sein, beinhalten: Zentrifugation: Behandlung der Probe mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise einem Alkohol, vorzugsweise einem Alkohol mit weniger als etwa 7 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methanol; und Behandlung mit Detergentien.
Die Konzentration der zu testenden Analyten variiert im allgemeinen von etwa 0 bis etwa 10^–17 M, üblicher von etwa 0 bis etwa 10^–14 M und am üblichsten von etwa 10^–5 bis etwa 10^–14 M. Die relativen Mengen der verschiedenen im Test verwendeten und in den unten beschriebenen Kits abgepackten Reagentien können stark variieren, um für Konzentrationen der Reagentien zu sorgen, die die Reaktionen, die während der vorliegenden Methode ablaufen müssen, weitgehend optimieren, und um die Empfindlichkeit eines jeden durchgeführten Assays weiter wesentlich zu optimieren. So bestimmen beispielsweise Überlegungen, wie z.B. das Ausbalancieren zwischen Empfindlichkeit und Testbereich, die jeweilige Nachweistechnik sowie die Konzentration des Analyten, die Konzentration des verwendeten Antigens, wie oben erläutert, und normalerweise auch die Konzentration der anderen Reagentien. Darüber hinaus wird die Endkonzentration für jedes der Reagentien normalerweise empirisch bestimmt, um die Empfindlichkeit des Tests über den interessierenden Bereich zu optimieren.
Bei der Durchführung der Methode der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise ein wäßriges gepuffertes Medium bei einem gemäßigten pH-Wert eingesetzt, wobei letzterer im allgemeinen für eine optimale Testempfindlichkeit sorgt. Bei dem wäßrigen Medium kann es sich lediglich um Wasser handeln, oder es kann ein Colösungmittel, wie z.B. ein oxygeniertes organisches Lösungsmittel mit 1–6, üblicher mit 1–4, Kohlenstoffatomen, einschließlich Alkohole, Ether und dergleichen, enthalten. Üblicherweise liegt das Colösungsmittel mit weniger als etwa 70 Gewichtsprozent, üblicher mit weniger als etwa 30 Gewichtsprozent, vor.
In Tests im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt der pH-Wert für das Medium üblicherweise im Bereich von etwa 5–10, vorzugsweise im Bereich von etwa 7–9. Der pH-Wert wird so gewählt, daß ein signifikantes Bindungsniveau zwischen sbp-Mitgliedern aufrechterhalten wird, während die Signalproduktionsleistung optimiert wird. In einigen Fällen wird zwischen diesen beiden Überlegungen eine Kompromißlösung gefunden.
Zur Erzielung des gewünschten pH-Werts und Beibehaltung des pH-Werts während der Bestimmung können verschiedene Puffer verwendet werden. Zu beispielhaften Puffern gehören Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweilige verwendete Puffer ist für diese Erfindung nicht kritisch, doch kann bei einzelnen Tests ein Puffer gegenüber einem anderen bevorzugt sein.
Zur Durchführung der Methode werden normalerweise gemäßigte Temperaturen verwendet, wobei während des Meßzeitraums, insbesondere bei Geschwindigkeitsbestimmungen, üblicherweise konstante Temperaturen verwendet werden. Die Temperatur kann mit dem durchgeführten Schritt variieren, wobei die Temperaturen im Bereich von 5 °–50 °C, üblicherweise von etwa 15 °–40 °C, liegen. Inkubationstemperaturen liegen normalerweise im Bereich von 5 °–45 °C, üblicher von 15 °–40 °C. Die Temperaturen liegen während Messungen im allgemeinen im Bereich von 10 °–50 °C, üblicher von 15 °–40 °C.
Während die Reihenfolge der Zugabe der verschiedenen Reagentien von der Art des verwendeten Testformats abhängen kann, können durch Verwendung verschiedener Techniken für eine zeitabhängige Freisetzung von Reagentien zahlreiche Vorschriften ausgearbeitet werden. Falls derartige Verfahrensweisen nicht verwendet werden, ist es üblicherweise vorzuziehen, die Probe und das erste Bindungsmittel vor oder fast gleichzeitig mit dem spezifischen Binder für den Analyten zusammenzugeben. In den Fällen, in denen der Aktivator den Antigen:Antikörper-Komplex ohne Bindung der nicht komplexierten Immunglobuline binden kann, ist die Reihenfolge der Zugabe dieser Reagentien unerheblich. Die Zugabe des Aktivators muß nach den ersten beiden Zugaben erfolgen, außer wenn ein Mittel zur zeitabhängigen Freisetzung dieses Mittels bereitgestellt wird. Andere zur Bindung des Antigens fähige Reagentien können jederzeit zugegeben werden, werden jedoch vorzugsweise fast gleichzeitig mit oder nach Zugabe des Aktivators zugegeben. Der Zeitpunkt der Zugabe anderer Reagentien kann stark schwanken.
Gegebenenfalls können nach jeder Reagentienzugabe ein oder mehrere Inkubationsschritte vorgesehen sein, die im allgemeinen etwa 30 Sekunden bis 6 Stunden, üblicher etwa 2 Minuten bis 1 Stunde, dauern. Darüber hinaus kann der Test, je nach Bedarf, einen oder mehrere Waschschritte beinhalten.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die erfindungsgemäßen Aspekte deutlicher zu veranschaulichen, und sollen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen. Die Beispiele stellen lediglich eine Veranschaulichung der qualitativen, halbquantitativen und quantitativen Testvorschriften dar, in denen die Methode der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge von Antikörpern in einer Probe verwendet werden kann. Das in diesen Methoden nachgewiesene Signal wird mit einem Standard oder einer Kontrolle verglichen, der bzw. die eine bekannte Konzentration von Antikörpern aufweist.
BEISPIELE:
Beispiel 1: Bestimmung von Anti-GAD-Autoantikörper in IDDM (Insulin Dependent Diabetes mellitus)-Seren
Das folgende Beispiel beschreibt eine vereinfachte Vorschrift für den bereits beschriebenen DELISA-Test zum Nachweis von GAD-Autoantikörper in Serum (US-Patent Nr. 5,561,049). Die vereinfachte, auf Abreicherung basierende Testvorschrift, wie beschrieben, bietet die folgenden Vorteile: A. die Notwendigkeit für eine Inkubation in zwei Vertiefungen fällt weg; B. ein Waschschritt fällt weg; C. kürzere Gesamttestzeit; und D. es wird eine Oberflächenmodifikation bereitgestellt, die stabil ist und somit keinen Waschschritt vor dem Start des Tests benötigt (ein solcher Waschschritt wird bei der zuvor beschriebenen Verfahrensweise zum Abtrennen von Binder, der sich bei der Lagerung von der festen Oberfläche ablöst, benötigt).
Die folgenden Materialien und Gerätschaften wurden in den unten beschriebenen Beispielen verwendet.

Nunc U8 Maxisorp 96-Loch-Mikrotiterplatte/-streifen mit Rundboden, Kat.-Nr. 475078, Batch# 012758.
Costar High Binding Flat Bottom 96-Loch-Mikrotiterplatte, Kat.-Nr. 9018, Lot# B23C4064.
Biotinyliertes BSA von Pierce Chemical Co., Rockford, Il., USA. Kat.-Nr. 29130, Lot# 95062965, 25 mg als gefriergetrocknetes Pulver mit 8 mol Biotin pro Mol BSA.
Streptavidin: eine Lösung mit 21,8 mg/ml wurde portioniert und bei –20 °C gelagert.
DELISA-Reagentien wurden wie im US-Patent Nr. 5,561,049 beschrieben hergestellt.
Protein A, gekoppelt an Dextran-Aldehyd (PrA-DxA1) (hauseigene Synthese), Lot# 950062 (wie im US-Patent Nr. 5,561,049 beschrieben).
Universal Reagent Kits (URK) von DBI Productions, Cupertino, CA, USA.
BSA (Protease-freie Fraktion V) von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, Kat.-Nr. 3294, Lot# 73H0391.
Pefabloc SC von PentapharmAG, Basel, Schweiz, Lot# 1619/399.
Aprotinin (Lösung mit 229 500 KIU/ml) von PentapharmAG, Basel, Schweiz, Lot# 5420/073.
Gentamicin (5 %ige Lösung) von Gibco/BRL, Gaithersburg, MD, USA, Kat.-Nr. 15750-011, Lot#15K3452.
MicroTrak (Dade Behring Inc., Syva Product Group) Plate Washer und Reader
Single oder Multichannel Programmable Proline Pipettes von Biohit

Herstellung einer mit bBSA beschichteten Platte:
In ein Fläschchen mit lyophilisiertem Pulver von biotinyliertem Rinderserumalbumin (bBSA) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers 14,5 ml destilliertes Wasser gegeben und durch Rotation auf einem Schüttler 15–30 Minuten oder bis zum Klarwerden der Lösung bei 4 °C (2–8 °C) gelöst. Die Proteinkonzentration wurde mit der BCA-Methode (Pierce BCA-Kit, Kat.-Nr. 23225) mit BSA als Standard gemessen. Die Konzentration der Lösung wurde mit 1,7 mg/ml bestimmt, und die Lösung wurde in kleinen (1,0 ml) Volumina portioniert und zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.
Biotinylierte BSA-Lösung wurde in drei aufeinanderfolgenden Schritten jeweils 1:10 in 0,1 M Kaliumphosphat (KPi)-Puffer, pH 8,1, verdünnt (d.h. eine 1000fache Gesamtverdünnung), so daß 1,7 μg/ml erhalten wurden. Unmittelbar vor Beschichtung der Nunc-Platten wurden 7,05 ml des verdünnten bBSA (1,7 μg/ml) zu 112,95 ml KPi-Puffer gegeben und unter Vermeidung von Schaumentwicklung vorsichtig gemischt.
Diese Arbeitslösung liegt bei 100 ng/ml und reicht zur Beschichtung von 10 Platten aus.
Mit einer Multikanalpipette wurde jeweils 0,1 ml bBSA-Arbeitslösung in die Vertiefungen einer Nunc-Mikrotiterplatte gegeben. Die Platten wurden mit einem Deckel abgedeckt und in einem luftbefeuchteten Brutschrank 3 h bei 37+2 °C inkubiert. Anschließend wurden die Platten auf dem MicroTrak-Waschgerät mit MicroTrak-Waschpuffer gewaschen (300 μl pro Vertiefung, 5mal).
Die Platten wurden bei 30–37 °C in einem Vakuumofen (SP/Baxter, Modell-Nr. N7595-1), der an das Hausvakuum angeschlossen war, getrocknet. Zur Absorption von Feuchtigkeit befand sich im Ofen ein Becherglas mit Phosphorpentoxid (Mallinckrodt, Kat.-Nr. 6612, Lot# 6612KMSL). Nach 30.–40minütigem Trocknen wurden die Platten entfernt, verpackt und jeweils einzeln in einem Aluminiumbeutel zusammen mit DRYRITE^TM-Päckchen eingeschlossen. Die Platten wurden typischerweise, wenn nicht anders angegeben, bei 2–8 °C gelagert.
Herstellung eines Streptavidin-Arbeitsreagens:
Ein Verdünnungsmittel für das Streptavidin (Sav)-Arbeitsreagens wurde mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
20 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, mit 150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 mM Pefabloc
0,1 % Triton-X-100
0,1 % Gentamicin (d.h. Endkonzentration: 50 μg/ml)
0,0033 TIU/ml Aprotinin-Lösung
1 mg/ml BSA
Sav (21,8 mg/ml, 363,3 μM) wurde 1:1000 verdünnt, so daß eine Konzentration von 0,363 μM erhalten wurde. 246 ml Sav-Verdünnungsmittel wurden mit 4,132 ml 0,363 μM Sav versetzt und vorsichtig gemischt, so daß eine Sav-Endkonzentration von 6 nM im Arbeitsreagens erhalten wurde. Ein 25 μl-Aliquot enthält 0,15 pmol Sav/Vertiefung. Dieses Reagens wurde portioniert und bei 2–8 °C gelagert.
Zwei-Platten-Standard-DELISA
Es wurden Vertiefungen in 96-Loch-Mikrotiterplatte aus Polypropylen für Doppel-/Dreifachbestimmungen eingerichtet. In jede Vertiefung wurden jeweils 25 μl Kalibrator oder Testprobe gegeben.
Ein Verdünnungsmittel für die Stammlösung von biotinylierter Glutaminsäure-Decarboxylase, GAD65 (bGAD), wurde gemäß der Lehre des US-Patents Nr. 5,551,049 hergestellt. Die bGAD-Arbeitslösung wurde in einem Einweg-Reagensreservoir hergestellt, indem 3,15 ml bGAD-Stammlösungsverdünnungsmittel in die Schale gegeben und anschließend 0,35 ml bGAD-Stammlösung zugegeben wurden. Diese Lösung wurde durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette gründlich gemischt. Diese Volumina gelten für eine volle Platte und können proportional für einen kleinen oder einen großen Test geändert werden.
Mit einer Multikanalpipette wurden 25 μl bGAD-Lösung auf den Boden der Vertiefung gegeben und durch vorsichtiges zweimaliges Aufziehen und Entleeren mit der Multikanalpipette mit Seren gemischt. Dabei wurden die Pipettenspitzen nach jedem Mischen gewechselt. Die Mikrotiterplatte wurde mit Mylar-Abdichtband abgedeckt und 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) (22–24 °C) inkubiert.
Mit einer Multikanalpipette wurden 50 μl ProteinA-konjugiertes Dextran-Reagens (PAD) aus einem Reagensreservoir zu Serum/bGAD am Boden der Vertiefung gegeben und wie in Schritt 3 gemischt. Die Pipettenspitzen wurden nach jedem Mischen gewechselt. Die Platten wurden mit Mylar-Band abgedeckt und 1 Stunde bei RT inkubiert.
Eine mit Streptavidin beschichtete Platte wurde ihrer Tasche entnommen und mit einem Durchlauf auf dem Syva MicroTrak-Plattenwaschgerät (5 × 300 μl) vorgewaschen.
Mit einer Multikanalpipette wurden 80 μl des Reaktionsansatzes (bGAD/Serum/PAD) von der ersten Polypropylenplatte (Schritt 4) in die vorgewaschene, mit Streptavidin beschichtete Platte überführt. Die Pipettenspitzen wurden nach jeder Überführung gewechselt. Die Platte wurde mit dem Plastikdeckel abgedeckt. Die abgedeckte Platte wurde 1 Std. bei RT unter leichtem Schütteln auf einem Mikrotiterplattenschüttler inkubiert.
Die Mikrotiterplatte wurde wie oben gewaschen. Mit einer Multikanalpipette wurden 100 μl MAb-HRP-Konjugat-Lösung aus einem Reagensreservoir zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde unter Schütteln bei RT inkubiert.
Die Mikrotiterplatte wurde wie oben gewaschen. Jeweils 6 ml TMB- und H₂O₂-Lösung (HRP-Substrate von KPL- oder URK-Kit) wurden in einem Reagensreservoir gut gemischt. Mit einer Multikanalpipette wurden jeweils 100 μl des Gemischs aus einem Reagensreservoir in jede Vertiefung gegeben. Man ließ die Farbe 30 min bei RT entwickeln und stoppte danach mit 100 μl Stopp-Lösung (1 N H₂SO₄ von Fisher) ab.
Die Farbe wurde bei 450 nm auf dem Syva MicroTrak-Plattenablesegerät (mit 630 nm als Referenzwellenlänge) abgelesen.
Ein-Platten-DELISA-Vorschrift
Vertiefungen für Doppel-/Dreifachbestimmungen wurden in einer mit bBSA beschichteten Nunc U8 Maxisorp 96-Loch-Mikrotiterplatte eingerichtet. In jede Vertiefung wurden jeweils 25 μl Kalibrator oder Testprobe gegeben.
Die bGAD-Arbeitslösung wurde ineinem Einweg-Reagensreservoir hergestellt, indem 3,15 ml bGAD-Stammlösungsverdünnungsmittel in die Schale gegeben und anschließend 0,35 ml bGAD-Stammlösung zugegeben wurden.
Diese Lösung wurde durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5-ml-Pipette gründlich gemischt. Diese Volumina gelten für eine volle Platte und können proportional für einen kleinen oder einen großen Test geändert werden.
Mit einer Multikanalpipette wurden 25 μl bGAD-Lösung auf den Boden der Vertiefung gegeben und durch vorsichtiges zweimaliges Aufziehen und Entleeren mit der Multikanalpipette mit Seren gemischt. Dabei wurden die Pipettenspitzen nach jedem Mischen gewechselt. Die Mikrotiterplatte wurde mit einem Deckel abgedeckt und 2 Std. (oder die für ein spezifisches Experiment angegebene Zeit) bei RT (22–24 °C) inkubiert.
Mit einer Multikanalpipette wurden 25 μl ProteinA-Reagens (PAD) aus einem Reagensreservoir zu Serum/bGAD am Boden der Vertiefung gegeben und wie in Schritt 3 gemischt. Die Pipettenspitzen wurden nach jedem Mischen gewechselt. Die Platte wurde mit einem Deckel abgedeckt und 1 Stunde bei RT inkubiert.
Mit einer Multikanalpipette wurden 25 μl Sav-Arbeitsreagens aus einem Reagensreservoir auf den Boden der Serum/bGAD/PAD enthaltenden Vertiefung gegeben und wie in Schritt 3 gemischt. Die Pipettenspitzen wurden nach jedem Mischen gewechselt. Die Platte wurde mit einem Deckel abgedeckt und 1 Stunde bei RT unter Schütteln auf einem Plattformschüttler inkubiert.
Die Mikrotiterplatte wurde gewaschen (5 Mal 300 μl). Mit einer Multikanalpipette wurden 100 μl MAb-HRP-Konjugat-Lösung aus einem Reagensreservoir zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Schütteln bei RT inkubiert.
Die Mikrotiterplatte wurde wie im vorhergehenden Schritt gewaschen. Jeweils 6,0 ml TMB- und H₂O₂-Lösung (HRP-Substrate von KPL- oder URK-Kit) wurden in einem Reagensreservoir gut gemischt. Mit einer Multikanalpipette wurden jeweils 100 μl des Gemischs aus einem Reagensreservoir in jede Vertiefung gegeben. Man ließ die Farbe 30 min bei RT entwickeln und stoppte danach mit 100 μl Stopp-Lösung (1 N H₂SO₄ von Fisher) ab.
Die Platte wurde bei 450 nm auf dem Syva MicroTrak-Plattenablesegerät (mit 630 nm als Referenzwellenlänge) abgelesen.
Optimierung der bBSA-Beschichtung:
Mit Sav beschichtete Platten wurden von der Firma Syva hergestellt und geliefert. Diese Platten wurden mit Sav mit 500 ng/Vertiefung/0,1 ml DPBS 4 Tage bei 2–8 °C beschichtet. Die Platten wurden dann mit entionisiertem Wasser gewaschen, 5 min bei 50 ± 5 °C getrocknet, in einen Folienbeutel mit einem Päckchen Dryrite gelegt, verschlossen und bei 2–8 °C gelagert. Da unter dieser Bedingung passiv adsorbiertes Sav „abblättert", ist es notwendig, die Platte unmittelbar vor Gebrauch im Test auf dem MikroTrak-Waschgerät vorzuwaschen. Die Verwendung einer ungewaschenen Platte reduzierte das Signal um nicht akzeptierbare 80–90 % (Tabelle 1A).
96-Loch-Mikrotiterplatten mit hoher Proteinbindung von Nunc, Nr. 475078 U8 Maxisorp, sowie Costar-Platten, Nr. 9018, wurden durch Beschichten mit bBSA bei 250 ng/Vertiefung und 10 ng/Vertiefung hergestellt. Die gelagerten Platten wurden entweder unmittelbar vor Gebrauch im Test gewaschen oder ungewaschen verwendet. Die Ein-Platten-DELISA-Verfahrensweise verläuft ähnlich wie die Standard-DELISA-Vorschrift, außer daß mit bBSA beschichtete Platten verwendet werden und anstelle des Überführungsschritts lösliches Sav zum Reaktionsgemisch gegeben wird.
Falls kein Verlust an passiv beschichtetem bBSA nach der Herstellung und Lagerung der Platte aufgetreten ist, bleiben dann das Testsignal und die Modulation in den gewaschenen und ungewaschenen Platten vergleichbar. Bei den mit bBSA bei 250 ng/Vertiefung beschichteten Platten (Nunc, Tabelle 1B und Costar, Tabelle 1D) beträgt das Signalverhältnis (ungewaschen/gewaschen) 0,3–0,4, was auf eine etwa 60–70 %ige Reduktion hindeutet. Dies bedeutet, daß „abgeblättertes" bBSA Sav-bGAD bindet und der ternäre Komplex im nächsten Schritt weggewaschen wird, was zum reduzierten Signal führt.
Bei den mit 10 ng/Vertiefung beschichteten Platten (Nunc, Tabelle 1C und Costar, Tabelle 1E) beträgt das Verhältnis 1,0, was darauf hindeutet, daß kein Signalverlust aufgetreten ist. Bei der niedrigen Beschichtungskonzentration wird das gesamte eingetragene bBSA gut auf der Oberfläche verankert und ergibt eine stabile Schicht. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden für zukünftige Experimente Nunc-Platten mit 10 ng/Vertiefung beschichtet.
Tabelle 1 A Zwei-Platten-DELISA (Nunc-Platte, beschichtet mit Sav in Cupertino, Platte Lot# 8K718.G1)
TABELLE 1 B Ein-Platten-DELISA (Nunc Nr. 475078, U8 Maxisorp, mit bBSA beschichtet, Platte Lot# 12996, bBSA (Pierce) bei 250 ng/Vertiefung/0,1 ml, Sav (Art.-Nr. 3617-24) bei 220 fmol/Vertiefung)
TABELLE 1 C (bBSA (Pierce) bei 10 ng/Vertiefung/0,1 ml)
TABELLE 1 D (Costar Nr. 9018, mit bBSA beschichtet, Platte Lot# 12996. bBSA (Pierce) bei 250 ng/Vertiefung/0,1 ml)
TABELLE 1 E (bBSA (Pierce) bei 10 ng/Vertiefung/0,1 ml)
Vergleich der Ein-Platten- und Zwei-Platten-DELISA-Verfahrensweisen:
Mit bBSA beschichtete Nunc-Platten wurden ungewaschen zum Vergleich der Leistung im DELISA, bei dem Serumkalibratoren sowie 19 Seren eingesetzt wurden, verwendet (Tabelle 2, A und B). Die Ergebnisse zeigen eine guten Korrelation zwischen den beiden Methoden, bei denen die gleichen Reagentien eingesetzt werden. Die Ergebnisse zeigen auch eine Reproduzierbarkeit der beiden Methoden. Tabelle 2A zeigt einen Vergleich der Ergebnisse mit der Ein-Platten-Methode (keine Überführung) und der Zwei-Platten-Methode (mit Überführung). Der DELISA wurde mit Serumkalibratoren, Kontroll- und diabetischen Seren durchgeführt. Die Testzeit für die Standard-DELISA-Vorschrift betrug 5,5 h.
TABELLE 2A

SC = Serumkalibratoren
CS = Patientenseren
PBB = Peninsula Blood Bank, Kontrollseren
KH = Kontrollserum

Tabelle 2B zeigt einen Vergleich der Ergebnisse mit der Ein-Platten-Methode (keine Überführung) & der Zwei-Platten-Methode (mit Überführung). DELISA durchgeführt mit Serumkalibratoren, Kontroll- und diabetischen Seren. Reagentien: bGAD, bGAD-Verdünnungsmittel, Serumkalibratoren, bei –70 °C gelagert, Sav-Platte (Lot #895), PAD, DxA1 (Lot #950062), Konjugat (Lot #295), bBSA-Platte (Lot #2896) bei 4 °C, Substrat- & Stopplösungen (Syva, URK Lot #8K209UL) bei 4 °C. Die Testzeit für die Standard-DELISA-Vorschrift betrug 5,5 h.
TABELLE 2B

Bestimmung der optimalen Sav-Konzentration:
Sav mit vier Biotin-Bindungsstellen wirkt wie eine Brücke, um auf eine stabile Weise freies bGAD und oberflächenimmobilisiertes bBSA zusammenzubringen. Daher ist es wichtig, die gewünschte, im Test zuzugebende Sav-Konzentration zu bestimmen, da zu hohe oder zu niedrige Konzentrationen das Signal aus offensichtlichen Gründen negativ beeinflussen könnten. Ein Kontrollserum-Pool (GADAb-negativ) wurde zunächst mit bGAD und anschließend mit PAD inkubiert. Sav wurde in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben und 1 h unter Schütteln bei RT reagieren gelassen. Die Platte wurde gewaschen, GAD-Mab-Peroxidase-Konjugat gebunden und die Farbe gemäß der Standard-DELISA-Vorschrift entwickelt. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß das Signal aufgrund der bGAD-Bindung vom Vorhandensein von Sav abhängt, wobei der optimale Bereich für den Test bei 0,08–0,2 pmol/Vertiefung liegt.
TABELLE 3
Bestimmung der optimalen Sav-Konz. für den „Ein-Platten-DELISA". Ein-Platten-DELISA auf Nunc-bBSA-Platte. Ungewaschen, bei 4 °C gelagert. Ein negatives Pool-Serum wurde mit bGAD, PAD und Konjugat verwendet. Es wurde der DELISA-Vorschrift gefolgt, außer daß Sav mit der angegebenen Konz. in 25 μl zugegeben wurde.
Experiment Nr. 1
Experiment Nr. 2
Vergleich des optimierten „Ein-Platten"-Formats mit dem „Zwei-Platten"-DELISA unter Verwendung von Serumkalibratoren und Patientenseren:
Es wurde eine optimierte Einzelplatten-Vorschrift gewählt. In Kürze: Serum und bGAD werden 1,75 h, PAD 0,25 h, Sav 0,75 h, Konjugat 0,25 h und Substrate 0,5 h umgesetzt. Zum Vergleich wurde die „Zwei-Platten"(Standard-)DELISA-Vorschrift verwendet. Die Untersuchungen wurden 3mal wiederholt (Tabelle 4, A, B und C).
TABELLE 4A Vergleich der Ergebnisse mit der Ein-Platten-Methode (keine Überführung) & Zwei-Platten-Methode (mit Überführung). DELISA mit Serumkalibratoren, Kontroll- und diabetischen Seren
Experiment Nr. 3

CW = Patientenseren

TABELLE 4B Vergleich der Ergebnisse mit der Ein-Platten-Methode (keine Überführung) & Zwei-Platten-Methode (mit Überführung). DELISA mit Serumkalibratoren, Kontroll- und diabetischen Seren Experiment Nr. 2
Experiment Nr. 2

CW = Patientenseren

TABELLE 4C Vergleich der Ergebnisse mit der Ein-Platten-Methode (keine Überführung) & Zwei-Platten-Methode (mit Überführung). DELISA mit Serumkalibratoren, Kontroll- und diabetischen Seren Experiment Nr. 3

CW = Patientenseren

Die folgenden Korrelationen wurden aus den Ergebnissen berechnet:
I. Korrelation zwischen Ergebnissen aus „Ein-Platten"- und „Zwei-Platten"-DELISA.
II. Korrelation zwischen „Ein-Platten"-DELISA, 3mal wiederholt.
III. Korrelation zwischen „Zwei-Platten"-DELISA, 3mal wiederholt.
Eine gute Korrelation (0,93) wurde in allen 3 Experimenten zwischen den beiden Methoden erzielt. Die Reproduzierbarkeit der Methoden war jeweils ebenfalls gut.
Beispiel 2: Kompetitiver Test zur Bestimmung von Digoxin in Serumproben
Mikrotitervertiefungen werden mit Biotin-BSA-Konjugat beschichtet, wie oben im Beispiel des Anti-GAD-Autoantikörpertests beschrieben. Monoklonaler-Antidigoxin-Antikörper-HRP-Konjugat wird gemäß Dafforn, A., et al., Clinical Chemistry, Bd. 36, S. 1312–1316, 1990, hergestellt. Biotin-Digoxin-Konjugat wird gemäß US-Patent 5,340,716 hergestellt.
Testverfahren:
Eine Serumprobe wird zur Bestimmung von Digoxin wie benötigt in üblicherweise für EIA (Enzyme Immunoassay) verwendetem Puffer verdünnt. Die Probe wird in die Mikrotitervertiefung gegeben und mit monoklonaler-Antidigoxin-Antikörper-HRP gemischt. Das Gemisch wird unter Schütteln über einen erforderlichen Zeitraum inkubiert. Das Gemisch wird mit einer Biotin-Digoxin-Konjugat enthaltenden Lösung versetzt und der Reaktionsansatz weiter unter Schütteln inkubiert. Am Ende dieser Inkubationszeit wird eine streptavidinhaltige Lösung zugegeben und das Gemisch weiter unter Schütteln inkubiert. Die Menge an zugegebenem Streptavidin hängt von dem gesamten Biotin im Reaktionsansatz, und zwar sowohl dem Biotin-Digoxin-Konjugat als auch dem oberflächengebundenen Biotin, ab, wie oben beschrieben.
Der Reaktionsansatz wird dann aus der Mikrotitervertiefung entfernt und die Vertiefung mit einer üblicherweise im Mikrotiterplatten-EIA verwendeten Pufferlösung gewaschen. Anschließend wird eine Lösung des HRP-Substrats TMB in die gewaschene Vertiefung gegeben, und die Enzymreaktion läuft über den benötigten Zeitraum ab. Die Reaktion wird durch Zugabe von Säure gestoppt (wie im vorhergehenden Beispiel), und die Farbentwicklung wird unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Ablesegeräts bestimmt (wie in einem vorhergehenden Beispiel).
Das Ausmaß der Farbentwicklung ist umgekehrt proportional zur Menge an Digoxin in der Probe. Die Quantifizierung von Digoxin in der Probe erfolgt, indem man die Farbentwicklung der Probe mit der durch einen bekannten Standard produzierten Farbentwicklung vergleicht, d.h. eine durch Bestimmung von mit bekannten Digoxinstandards versetztem Normalserum produzierte Standardkurve verwendet.
Beispiel 3: Zwei-Stellen-(Sandwich)-Immuntests zur Bestimmung von knochenspezifischer alkalischer Phosphatase in Serum:
Monoklonale Antikörper A und B gegen menschliche knochenspezifische alkalische Phosphatase (Bone Specific Alkaline Phosphatase, BALP) wurden wie zuvor bei Kurn, N., et al., J. Bone & Mineral Research, Bd. 9, Sup 1, S. S403, beschrieben hergestellt. Die monoklonalen A und B erkennen zwei nicht verwandte BALP-Epitope, wie zuvor gezeigt wurde. HRP-Anti-BALP-monoklonaler-Antikörper-A-Konjugat wird gemäß Dafforn, A., et al., Clinical Chemistry, Bd. 36, S. 1312–1316, 1990, hergestellt. Biotin-anti-BALP-monoklonaler-B wird gemäß Ullman, E.F., et al., PNAS, Bd. 91, S. 5426–5430, 1994, hergestellt. Mikrotitervertiefungen werden mit Biotin-BSA-Konjugat wie beim Anti-GAD-Autoantikörpertest beschrieben beschichtet.
Testverfahren:
Ein Aliquot Serumprobe wird in die Mikrotitervertiefung gegeben. Zu der Probe gibt man eine HRP-monoklonaler-A-Konjugat und Biotin-monoklonaler-B-Konjugat enthaltende Lösung und inkubiert den Ansatz unter Schütteln über den benötigten Zeitraum.
Am Ende der ersten Inkubationszeit wird eine streptavidinhaltige Lösung in die Vertiefung gegeben und der Ansatz weiter unter Schütteln inkubiert. Die Menge an zugegebenem Streptavidin hängt vom Gesamtbiotingehalt im Reaktionsansatz, einschließlich dem mit Biotin markierten monoklonalen B und dem oberflächenimmobilisierten Biotin, ab, wie zuvor beschrieben.
Das Reaktionsgemisch wird entfernt und die Vertiefung mit einer üblicherweise im EIA auf Mikrotiterbasis verwendeten Pufferlösung gewaschen.
In die Vertiefung wird eine Lösung des HRP-Substrats TMB gegeben. Man läßt die Enzymreaktion über den benötigten Zeitraum ablaufen und stoppt sie durch Zugabe von Säure, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben.
Die Farbentwicklung wird unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Ablesegeräts wie im vorhergehenden Beispiel bestimmt.
Das Ausmaß der Enzymaktivität ist zur Menge an BALP in der Probe direkt proportional. Eine Reihe von aus bekannten Mengen an BALP bestehenden Standards, mit denen Serum versetzt wurde, wird zur Konstruktion einer Standardkurve zur Quantifizierung von BALP in der Probe verwendet.

Claims

Methode zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Antikörpers in einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Antikörper enthält, wobei die Methode die folgenden Schritte umfaßt: (a) Zusammenbringen: (i) einer Probe, von der vermutet wird, daß sie den Antikörper enthält, (ii) mindestens eines Antigens zum Antikörper, (iii) eines ersten, an exogenes Antigen gekoppelten Bindungsmittels, wobei der Antikörper das exogene Antigen unter Bildung eines erstes-Bindungsmittel/Antigen/Antikörper-Komplexes bindet, (iv) eines ein zweites Bindungsmittel umfassenden Trägers in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines Gemischs; (b) Versetzen des Gemischs mit einer maskierenden Verbindung, die den Komplex bindet und das Antigen nicht bindet, wenn das Antigen nicht Teil des Komplexes ist; (c) Versetzen des Gemischs mit einem Aktivator, wobei der Aktivator das erste Bindungsmittel bindet, wenn das erste Bindungsmittel nicht Teil des Komplexes ist, sowie das zweite Bindungsmittel des Trägers bindet, so daß das erste Bindungsmittel immobilisiert wird; (d) Bestimmen der Menge des Antikörpers in der Probe durch Nachweisen des immobilisierten ersten Bindungsmittels, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Antikörpers in der Probe in Beziehung steht.
Methode nach Anspruch 1, wobei das erste Bindungsmittel und das zweite Bindungsmittel identisch sind.
Methode nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Aktivator um ein multivalentes Molekül handelt.
Methode nach Anspruch 3, wobei das multivalente Molekül ausgewählt ist aus Avidin, Streptavidin, Antibiotin (-IgG oder -IgM), Lectin, einem multimeren synthetischen Peptid und Folat-Dextran-Konjugat.
Methode nach Anspruch 1, wobei das erste Bindungsmittel und das zweite Bindungsmittel verschieden sind und es sich bei dem Aktivator um ein heterofunktionelles Molekül mit einer ersten Bindungsstelle, die das erste Bindungsmittel bindet, und einer zweiten Bindungsstelle, die das zweite Bindungsmittel bindet, handelt.
Methode nach Anspruch 1, wobei das erste und das zweite Bindungsmittel jeweils ausgewählt sind aus Biotin, Fluoreszein, Folsäure-Bindungsprotein, Haptenen, Kohlenhydraten oder Rezeptoren.
Methode nach Anspruch 3, wobei das erste und das zweite Bindungsmittel jeweils Biotin umfassen und der Aktivator Avidin, Streptavidin oder Antibiotin-Antikörper umfaßt.
Methode nach Anspruch 7, wobei die Summe der Bindungsstellen auf Avidin oder Streptavidin kleiner oder gleich der Gesamtzahl der an den Träger und das Antigen gebundenen Biotinäquivalente ist.
Methode nach Anspruch 5, wobei die Anzahl der Bindungsstellen auf Avidin oder Streptavidin die Hälfte der Gesamtzahl an das erste und das zweite Bindungsmittel umfassenden Biotinäquivalenten beträgt.
Methode nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem ersten Bindungsmittel um einen Rezeptor handelt und der Aktivator einen multivalenten Liganden dafür umfaßt.
Methode nach Anspruch 10, wobei das erste Bindungsmittel Folat-Bindungsprotein und der Aktivator ein Folat-Dextran-Konjugat umfaßt.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Oberfläche eines Behälters, Kügelchen, Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürlichen und modifizierten Cellulosen, Polyacrylamiden, Agarose und Magnetit.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Bestimmungsschritt das Bereitstellen eines oder mehrerer Mitglieder eines signalproduzierenden Systems sowie das Messen des von den Mitgliedern des signalproduzierenden Systems produzierten Signals, dessen Vorhandensein oder Menge zu dem Vorhandensein bzw. der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht, umfaßt.
Methode nach Anspruch 13, wobei wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.
Methode nach Anspruch 1, wobei der Aktivator in Schritt c (1) das an das Antigen gekoppelte erste Bindungsmittel, das sich nicht in dem maskierten Komplex befindet, relativ zur Bindung des maskierten Komplexes selektiv bindet und (2) das zweite Bindungsmittel bindet.
Methode nach Anspruch 15, die ferner zwischen den Schritten (c) und (d) den Schritt des Hinzufügens eines an einen zweiten spezifischen Binder gebundenen Mitglieds eines signalproduzierenden Systems zu dem Analyten im Komplex umfaßt, wobei Schritt (d) ferner das Nachweisen des Signals umfaßt.
Methode nach Anspruch 16, wobei die maskierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor C1q, rheumatoidem Faktor, Protein G und Protein A.
Methode nach Anspruch 17, wobei die maskierende Verbindung an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebunden ist.
Methode nach Anspruch 18, wobei es sich bei der suspendierbaren Festphase um ein ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Keramik und Glas, umfassendes Partikel handelt.
Methode nach Anspruch 18, wobei das lösliche Polymer ein Molekulargewicht über 250000 aufweist.
Methode nach Anspruch 14, wobei der Bestimmungsschritt den Nachweis von Enzymaktivität, Lumineszenz oder Lichtabsorption beinhaltet.
Methode nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Antikörper um einen Autoantikörper gegen Glutaminsäure-Decarboxylase oder Insulin handelt.
Methode nach Anspruch 14, wobei der Träger die Oberfläche eines Behälters umfaßt.
Kit zum Nachweisen des Vorhandenseins oder zur Bestimmung der Menge eines Antikörpers in einer flüssigen Probe, umfassend: (1) mindestens ein Antigen zu dem Antikörper, (2) antigengekoppeltes Biotin, (3) einen an die Wände eines Behälters gebundenes Biotin umfassenden Träger, (4) Streptavidin und (5) eine an eine suspendierbare Festphase oder ein lösliches Polymer gebundene maskierende Verbindung.
Kit nach Anspruch 24, wobei es sich bei der suspendierbaren Festphase um ein ein Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Keramik und Glas, umfassendes Partikel handelt.
Kit nach Anspruch 24, wobei die maskierende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern gegen Immunglobuline, Komplementfaktor C1q, rheumatoidem Faktor, Protein G und Protein A.
Kit nach Anspruch 24, ferner umfassend ein Mitglied eines signalproduzierenden Systems.
Kit nach Anspruch 27, wobei wenigstens eines der Mitglieder des signalproduzierenden Systems ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenzmolekülen, Enzymen, Chemilumineszenzmolekülen, Photosensibilisatoren und suspendierbaren Partikeln.