DE10226011A1

DE10226011A1 - HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen c-reaktivem Protein und an C-reaktives Protein bindenden Komponenten

Info

Publication number: DE10226011A1
Application number: DE10226011A
Authority: DE
Inventors: Aimo Dr. Kannt; Antje Pommereau
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 2002-06-12
Filing date: 2002-06-12
Publication date: 2004-01-08
Also published as: CA2489021A1; MXPA04012232A; EP1516187A2; BR0311709A; WO2003107000A3; NO20050037L; TW200411179A; RU2005100042A; JP2005529348A; CN1745300A; AU2003250344A1; AR040259A1; WO2003107000A2; ZA200409199B

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein (CRP) bzw. C1q und an CRP bzw. C1q bindenden Komponenten, zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung sowie zur Ermittlung von Substanzen, die die Interaktion von CRP bzw. C1q und an diese bindende Komponenten, insbesondere die Wechselwirkung zwischen DRP und C1q, beeinflussen.

Description

HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein und an C-reaktives Protein bindenden Komponenten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein HTS-fähiges Verfahren und Testsystem zur Ermittlung der Wechselwirkung zwischen C-reaktivem Protein (CRP) bzw. C1q und an CRP bzw. C1q bindenden Komponenten, zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung sowie zur Ermittlung von Substanzen, die die Interaktion von CRP bzw. C1q und an dieses bindende Komponenten beeinflussen.
Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein akute-Phase-Plasmaprotein, dessen Konzentration im Serum nach einer Infektion oder Gewebsverletzung schnell und in hohem Maße ansteigt (Volanakis (2001), Molecular Immunology 38, 189–197). In Gegenwart von Ca²⁺-Ionen bindet CRP an Phosphocholin (PCh). Letzteres ist weit verbreitet in Polysacchariden pathogener Organismen und in Zellmembranen beschädigter und nekrotischer Zellen. An PCh gebundenes CRP kann durch Bindung an das Protein C1q die klassische Komplementkaskade aktivieren.
Das Komplement ist Teil des Immunsystems und hauptsächlich an der Antikörpervermittelten Immunabwehr beteiligt. Die drei physiologischen Funktionen des Komplements sind die Abwehr bakterieller Infektionen, die Verbindung von angeborener und erworbener Immunität und die Beseitigung von Immunkomplexen und apoptischen Zellen. Es werden die klassische, die alternative und die Mannose-Lectin-Komplementkaskade unterschieden (Walport (2001), N Engl J Med 344, 1058– 1066). Die klassische Komplementkaskade führt zur Lyse bakterieller Zellen und beginnt mit der Assoziation von C1q an einen an die Zelloberfläche bindenden Antikörper oder an PCh gebundenes CRP.
C-reaktives Protein wird als Marker und darüber hinaus als Prädikator für die koronare Herzkrankheit, der häufigsten Todesursache in Industrieländern, verwendet (Rifai und Ridker (2001), Clinical Chemistry 47, 403–411).
Aufgrund neuer Untersuchungen (Jialal et al (2001), Circulation 103, 1933–1935) wird angenommen, daß eine Senkung des CRP-Spiegels oder eine Blockierung der CRP-vermittelten Effektorfunktionen, beispielsweise der Komplementaktivierung durch Bindung an C1q, von Nutzen für die Vermeidung und Behandlung der koronaren Herzkrankheit sein kann.
Es ist daher wünschenswert, zum einen ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt, die Konzentration von CRP und/oder C1q in Blutplasma auf einfache Weise zu bestimmen und das es desweiteren erlaubt, Substanzen zu identifizieren, die modulatorisch – aktivierend oder inhibierend – auf die Wechselwirkung von CRP und/oder C1q mit anderen Komponenten, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen CRP und C1q, einwirken.
Verfahren zur Bestimmung der Bindung von CRP an C1q wurden beispielsweise von Jiang et al. (1991), J. Immunol. 146, 2324–2330 und Agrawal et al. (2001), J. Immunol. 166, 3998–4004 beschrieben. In beiden Publikationen kommt hierbei ein ELISA-Verfahren zum Einsatz. Es handelt es sich hierbei um sehr zeit- und materialaufwendige, mehrstufige inhomogene Verfahren. So muß zur Durchführung des Verfahrens stets einer der Reaktanten zunächst an einer festen Phase immobilisiert werden. Zudem sind zahlreiche Waschschritte notwendig.
Lebdue et al. (1998), Ann Clin Biochem 35, 745–753 beschreiben ein Verfahren zum immunonephelometrischen Nachweis von CRP. Hierzu wird die Probe mit Antikörper gegen CRP inkubiert, die mit Polystyrol-Partikel beladen sind. Ein entscheidender Nachteil dieses Verfahrens ist, daß man zur Durchführung ein Nephelometer zur Verfügung haben und eine relativ große Probenmenge einsetzen muß.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das es erlaubt, die Konzentration von CRP oder C1q in Blutplasma auf einfache Weise zu bestimmen und das es des weiteren erlaubt, Substanzen zu identifizieren, die modulierend, aktivierend oder inhibierend auf die Wechselwirkung von CRP oder C1q mit anderen Komponenten, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen C1q und CRP, einwirken, wobei sich das Verfahren vorteilhaft gegenüber dem Stand der Technik auszeichnet, indem es sensitiver, kostengünstiger, materialsparender, einfacher und/oder schneller durchführbar ist als die bisher beschriebenen Verfahren.
Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder mehr Komponenten an CRP bzw. C1q bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend:

(a) Vorlage einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung,
(b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der CRP bzw. C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle,
(e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignis.

Bei der emittierten elektromagnetischen Strahlung gemäß (c) handelt es sich hierbei vorzugsweise um Fluoreszenz-Strahlung. Bei der Lichtquelle gemäß (d) kann es sich beispielsweise um einen Laser oder um eine Lampe, beispielsweise eine Helium- oder Halogenlampe, handeln. Die Detektion der elektromagnetischen Strahlung gemäß (e) kann beispielsweise mit Hilfe eines Photomultipliers erfolgen.
Die erfindungsgemäß einzusetzenden Komponenten sind oder umfassen vorzugsweise Polypeptide. In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen Antikörper. Bei dem Antikörper kann es sich hierbei um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handeln.
Wird eine Gruppe von Komponenten eingesetzt, so sind diese vorzugsweise dazu in der Lage, räumlich aufeinanderfolgend an CRP bzw. C1q bzw. aneinander zu binden. Die Bindung erfolgt hierbei in Form einer Bindungskaskade, wie sie beispielsweise durch die aufeinanderfolgende Bindung von Antikörpern (Primär-Antikörper, Sekundär-Antikörper etc.) realisiert wird. Bei den gemäß (b) und gemäß (c) direkt an CRP bzw. C1q bindenden Komponenten handelt es sich hierbei bevorzugt um Komponenten, die jeweils an eine bestimmte Bindungsregion bzw. an ein bestimmtes Epitop des CRP bzw. C1q binden, wobei die an CRP bzw. C1q bindende Komponente gemäß (b) an einen andere Bindungsstelle bindet als die an CRP bzw. C1q bindende Komponente gemäß (c).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei einer der direkt an CRP bzw. C1q bindenden Komponente um einen natürlicherweise vorkommenden Bindungspartner des CRP bzw. C1q. Im Falle des CRP handelt es sich hierbei besonders bevorzugt um C1q und umgekehrt. Wird die Donor- oder Akzeptorkomponente direkt an CRP bzw. C1q gebunden, so handelt es sich in diesem Fall ensprechend entweder bei der Donor- oder bei der Akzeptorkomponente um C1q bzw. CRP, umfassend eine Donor- oder Akzeptorgruppe. Wird eine Gruppe von Komponenten eingesetzt, die eine Bindungskaskade ausbilden können, so handelt es sich bei C1q oder CRP entsprechend um die erste an CRP bzw. C1q bindende Komponente, über die entweder die Donor- oder die Akzeptorkomponente an CRP bzw. C1q gebunden werden kann. Bei den übrigen Komponenten der Gruppe von Komponenten handelt es sich besonders bevorzugt um Antikörper-Moleküle.
Wird also beispielsweise eine CRP-haltige Lösung vorgelegt, so umfaßt in dieser Ausführungsform dann vorzugsweise entweder die Donor- oder die Akzeptorkomponente selbst C1q oder die Donor- oder Akzeptorkomponente wird über C1q an CRP gebunden. Die Donor- oder Akzeptorkomponente kann dann einen Anti-C1q-Antikörper umfassen oder einen Sekundärantikörper, der an den Anti-C1q-Antikörper binden kann. Entsprechend umfaßt dann die jeweils andere Komponente (Akzeptor- oder Donorkomponente) einen Anti-CRP-Antikörper oder einen Antikörper, der an den Anti-CRP-Antikörper binden kann oder einen gegen letzteren gerichteten Tertiärantikörper.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) und/oder gemäß (c) (Akzeptorgruppe) auf Partikeln lokalisiert, wobei der gemittelte Durchmesser der Partikel vorzugsweise zwischen 150 und 250 nm, besonders bevorzugt bei etwa 200 nm liegt. Die Partikel werden dann entsprechend von den Donor- bzw. Akzeptorkomponenten umfaßt. Die Partikel können hierbei aus einem polymeren Material gefertigt sein.
Bei dem enindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein HTS (high throughput screening)-fähiges Verfahren, das homogen in Form eines Ein-Schritt-Verfahrens durchgeführt werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren nach dem „mix and measure"-Prinzip durchgeführt, was zu erheblicher Zeitersparnis und höherer Genauigkeit der Meßwerte führt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Messung der Bindung von CRP an C1q, und damit die Identifizierung von Substanzen, die diese Bindung beeinflussen, sowie die Messung der Konzentration von CRP oder C1q in komplexen Medien in weniger als 10 Prozent der Zeit, die bei Verwendung bisher beschriebener, inhomogener Methoden aufgewendet werden mußte.
Ein besonderes Charakteristikum des neuen Verfahrens ist, daß sich die Bindung zwischen den beiden Proteinen in Lösung verfolgen läßt, da keiner der Reaktanten an einer festen Phase immobilisiert werden muß. Die Messung kann zudem direkt mit den aus biologischen Quellen gewonnenen Proteinen durchgeführt werden, ohne daß eine Modifikation von CRP oder C1q, beispielsweise durch Bindung eines Fluorophors, durchgeführt werden müßte. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens ist daher, daß das Protein in nativem Zustand dem Test unterworfen werden kann und die Gefahr der Denaturierung, die bei einer Immobilisierung und/oder Modifikation des Proteins bestehen würde, entfällt.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß das Probenvolumen des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erheblich reduziert ist. So können Volumina von kleiner 10 μl eingesetzt werden, was den Materialaufwand minimiert. Zudem können hoch verdünnte Lösungen mit Konzentrationen an CRP oder C1q von kleiner als 1 nM, sogar kleiner als 100 pM eingesetzt werden. Es handelt sich also zudem um ein sehr sensitives Verfahren. Ferner handelt es sich aufgrund des zuvor Gesagten um die erste Methode, die ein Hochdurchsatz-Screening nach Substanzen, die die Komplementaktivierung durch Bindung von CRP an C1q beeinflussen, ermöglicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) durch Singulett-Sauerstoff.
Hierbei umfaßt die Donorgruppe vorzugsweise eine Verbindung, die nach Anregung durch einen Laser Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln kann und die Akzeptorgruppe umfaßt mindestens eine erste Verbindung, die durch Singulett-Sauerstoff angeregt werden kann, und eine zweite Verbindung, die die von der durch Singulett-Sauerstoff anregbaren Gruppe aufgenommene Energie emissionslos aufnehmen und in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren kann.
Der gebildete Singulett-Sauerstoff kann von der Donorgruppe zu der Akzeptorgruppe diffundieren und mit den sich dort befindlichen chemiluminiszenten Substanzen reagieren. Die dabei frei werdende Energie wird auf die Fluorophore übertragen, welche die Energie schließlich in Form von Fluoreszenz-Strahlung abstrahlen, die mit einem Photomultiplier detektiert werden kann. Voraussetzung für ein detektierbares Signal ist die räumliche Nähe von Donor- und Akzeptorbeads, da der Singulettsauerstoff instabil ist und in wässriger Lösung zerfällt. Die einzusetzenden bindenden Komponenten werden bei diesem Verfahren deshalb so gewählt, daß bei Eintreten des Bindungsereignisses der Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorgruppen vorzugsweise weniger als 200 nm beträgt, da bei größerem Abstand ein effektiver Energietransfer mittels Singulett-Sauerstoff, aufgrund der Zerfallszeit des Singulett-Sauerstoffs, nicht möglich ist.
Besonders bevorzugt sind bei dieser Ausführungsform Donorgruppe und Akzeptorgruppe auf Partikel lokalisiert, wobei die Partikel vorzugsweise einen gemittelten Durchmesser von zwischen 150 und 250 nm, besonders bevorzugt von etwa 200 nm besitzen. Die Partikel werden hierbei vorzugsweise so eingesetzt, daß sich eine finale Konzentration an Donorgruppe tragenden Partikel von 1–40 μg/ml und eine finale Konzentration an Akzeptorgruppe tragenden Partikeln von 1–80 μg/ml einstellt. Die Bindekapazität der Partikel kann beispielsweise bei etwa 0.1 nM bis 1 nM pro μg/ml Partikel liegen.
Besonders bevorzugt werden für das Verfahren als Partikel Alpha-Screen-Beads von Perkin-Elmer Life Sciences verwendet. Bei dieser Ausführungsform erfolgt Anregung der Donorgruppe durch Bestrahlung mit einem Laser bei einer Wellenlänge von 680 nm und die durch die Akzeptorgruppe emittieren Strahlung kann bei einer Wellenlänge zwischen 520 und 600 nm detektiert werden.
Das Verfahren kann dann entsprechend so durchgeführt werden, daß Donor- und Akzeptorbeads, die Donor- und Akzeptorgruppen tragen, vorgelegt werden. An die Donor- und Akzeptorbeads werden nun Komponenten gebunden, die dazu in der Lage sind entweder selbst oder über weitere Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden. Bei diesen Komponenten kann es sich wie bereits zuvor ennrähnt entweder um C1q bzw. CRP oder um einen Anti-CRP- bzw. Anti-C1q-Antikörper oder aber um einen gegen den Anti-CRP- bzw. Anti-C1q-Antikörper gerichteten Sekundärantikörper handeln.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) durch emissionslosen Energietransfer, besonders bevorzugt durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer.
Das Verfahren kann hierbei beispielsweise so ausgeführt werden, daß die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe) eine Europiumsalz-haltige Verbindung und die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Akzeptorgruppe) Allophycocyanin umfaßt (Grepin et al. (2000), Drug Discovery Today 5, 212). Oder es kann sich bei Donor- und Akzeptorgruppe um Farbstoffe handeln, die für den emissionslosen Energietransfer geeignet sind. Es können desweiteren alle dem Fachmann bekannten Verbindungen verwendet werden, die für den emissionslosen Energietransfer, inbesondere für den Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer geeignet sind (s. bspw. Pope et al. (1999), Drug Discovery Today 4, 350).
Die einzusetzenden bindenden Komponenten werden bei dieser Ausführungsform vorzugsweise so gewählt, daß der Abstand zwischen den Donor- und Akzeptorgruppen nach Bindung weniger als 10 nm beträgt, da bei größerem Abstand ein effektiver emissionsloser Energietransfer nicht möglich ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform zur Konzentrationsbestimmung einer CRP- bzw. C1q-haltigen Lösung unbekannten CRP- bzw. C1q-Gehalts verwendet, wobei es sich bei dieser Lösung vorzugsweise um Blutplasma oder Blutserum handelt oder um mittels eines geeigneten physiologischen Puffers oder mittels Wasser verdünntes Blutplasma oder Blutserum. Dieses Verfahren kann beispielsweise für diagnostische Zwecke zum Einsatz kommen, insbesondere zur Ermittlung des Entzündungszustandes eines Organismus und/oder zur Ermittlung der Gefahr eines Herzinfarkts und/oder eines Schlaganfalls.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines Bindungsereignisses zwischen CRP bzw. C1q und einer an CRP bzw. C1q bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend:

(a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann, und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden.

Das HTS-fähige Testsystem umfaßt hierbei vorzugsweise folgende weitere Komponenten:

(c) Blutserum oder Blutplasma oder mittels physiologischem Puffer oder mittels Wasser verdünntes Blut,
(d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Strahlung gemäß (b).

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt (d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis hat. Auf diese Weise können Substanzen ermittelt werden, die modulierend, inhibierend oder aktivierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP bzw. C1q und einem Binder, insbesondere auf die Wechselwirkung zwischen CRP und C1q einwirken. Vorzugsweise wird hierzu eine Bibliothek von Testsubstanzen im HTS-Verfahren gescreent, um eine Substanz mit den gewünschten Eigenschaften zu ermitteln.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein HTS-fähiges Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP bzw. C1q und einer an CRP bzw. C1q bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend:

(a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann, und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP bzw. C1q zu binden,
(c) mindestens eine Testverbindung.

Dieses HTS-fähige Testsystem umfaßt hierbei vorzugsweise folgende weitere Komponenten:

(d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a),
(e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b),
(f) eine CRP- bzw. C1q-haltige Lösung.

Die erfindungsgemäßen HTS-fähigen Testsysteme werden hierbei vorzugsweise zur Durchführung der zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Besondere Ausführungsformen der Bestandteile und Komponenten der Testsysteme entsprechen daher den zuvor genannten besonderen Ausführungsformen, die in den erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen.
Im Schema 1 ist das im Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren schematisch dargestellt. Hierbei wurde als Donorkomponente ein Anti-C1q-Antikörper verwendet, wobei die Donorgruppe auf Partikel lokalisiert ist, die an den Anti-C1q-Antikörper gebunden sind. Die Donorkomponente kann im vorliegenden Fall über C1q an das CRP binden. Bei der Akzeptorkomponente handelt es sich im vorliegenden Fall um einen Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, wobei die Akzeptorgruppe auf Partikel lokalisiert ist, die an den Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper gebunden ist. Die Akzeptorkomponente kann im vorliegenden Fall über einen Anti-CRP-Antikörper aus Kaninchen an das CRP binden. Schema 1
Ausführungsbeispiel: Bindungsassay zur Ermittlung der Bindung von CRP an C1q
Zur Versuchsdurchführung wurde der Alphascreen Detection Kit von Packard Bioscience verwendet. Dieser umfaßt Donor- und Akzeptorbeads, wobei die Donorbeads Verbindungen umfassen, die nach Anregung bei einer definierten Wellenlänge Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln können, und wobei die Akzeptorbeads Verbindungen umfassen, die durch Singulett-Sauerstoff angeregt werden können, sowie Verbindungen, die von den angeregten Verbindungen Energie in Form eines emissionslosen Energietransfers übernehmen und anschließend in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren können. Die genannten Verbindungen sind hierbei jeweils in eine Hydrogelmatrix eingebettet. Die eingesetzten Beads waren vom Hersteller bereits vorbeschichtet, und zwar die Donorbeads mit Streptavidin und die Akzeptorbeads mit Anti-Kaninchen-Antikörper.
Tabelle 1: Übersicht über die eingesetzten Materialien
Herstellung des Reaktionspuffers
Folgender Reaktionspuffer kam in dem Alpha-Screen-System zur Anwendung: 20 mM Tris-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 1 mM Phosphorylcholin, 0.1 BSA. Zur Herstellung einer Stammlösung an Tris-NaCl-Puffer wurden 3.15 g Tris-HCl und 8.77 g NaCl in H₂O gelöst, mittels 1 M NaOH ein pH-Wert von 7.2 eingestellt und anschließend mit H₂O auf 1 l aufgefüllt. Der Puffer wird bei Raumtemperatur aufbewahrt. Der Reaktionspuffer wurde hergestellt, indem 36.7 mg CaCl₂, 12.9 mg Phosphorylcholin und 50 mg BSA zu 50 ml Tris-NaCl-Puffer hinzugegeben wurden.
Biotinylierung des Anti-C1q-Antikörpers
Um eine Bindung des Anti-C1q-Antikörpers an die Streptavidin-beschichteten Donorbeads zu ermöglichen, mußte dieser zunächst biotinyliert werden. Hierzu wurden 100 μl Anti-C1q polyklonales Serum zweimal für eine Stunde bei Raumtemperatur gegen 200 ml PBS dialysiert. Nach Zugabe von 20 μl 1.5 mM Sulfo-NHS-Lösung (in Milli-Q-Wasser) wurde die Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschließend wieder zweimal gegen PBS dialysiert, um überschüssiges Biotinylierungsreagens zu entfernen.
Durchführung des Assays
Zur Durchführung des Assays wurden 2 μl Donorbead/Anti-CRP-Lösung vorgelegt, anschließend 2 μl C1q, 2 μl CRP und 2 μl Akzeptorbead/Anti-CRP hinzugegeben. Es wurden hierdurch folgende finale Konzentrationen eingestellt: CRP: 1 nM; C1q: 10 nM; Anti-CRP: 7.3 nM; Anti-C1q: 1:1500; Donorbeads: 20 μg/ml; Akzeptorbeads: 40 μg/ml. Als Negativkontrolle wurden anstelle der CRP-Lösung, anstelle der C1q-Lösung oder anstelle dieser beiden Lösungen Reaktionspuffer eingesetzt. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Daten mittels eines AlphaQuest-Readers ausgelesen.
Ergebnisse
Bei einer CRP-Konzentration von 1 nM und einer C1q-Konzentration von 10 nM wurden folgende Intensitäten der emittierten Strahlung gemessen (angegeben sind die Counts des Photomultipliers):
In Abwesenheit von CRP und Abwesenheit von C1q: 952
In Gegenwart von CRP und Abwesenheit von C1q: 1255
In Abwesenheit von CRP und Gegenwart von C1q: 1114
In Gegenwart von CRP und Gegenwart von C1q: 80376
Wie zu erkennen ist, liefern die Negativkontrollen kein positives Ergebnis, während bei Zusammengeben von C1q- und CRP-haltiger Lösung ein starkes Signal zu erkennen ist.

Claims

Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder weitere Komponenten an CRP bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend: (a) Vorlage einer CRP-haltigen Lösung, (b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der CRP-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der CRP-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle, (e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignisses.
Verfahren zur Ermittlung eines Bindungsereignisses von zwei direkt oder über eine oder weitere Komponenten an C1q bindenden Komponenten, folgende Schritte umfassend: (a) Vorlage einer C1q-haltigen Lösung, (b) Zugabe von mindestens einer Donorkomponente oder von einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, zu der C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden, (c) Zugabe von mindestens einer Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, zu der C1q-haltigen Lösung, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden, (d) Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) durch eine Lichtquelle, (e) Detektion der von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) emittierten elektromagnetischen Strahlung zum Nachweis des Bindungsereignisses.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der elektromagnetischen Strahlung um Fluoreszenz-Strahlung handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Lichtquelle gemäß (d) um einen Laser oder um eine Lampe handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion gemäß (e) mit Hilfe eines Photomultipliers erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten der Gruppe von Komponenten gemäß (b) und/oder (c) räumlich aufeinanderfolgend an CRP bzw. aneinander binden können.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten der Gruppe von Komponenten gemäß (b) und/oder (c) räumlich aufeinanderfolgend an C1q bzw. aneinander binden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Komponenten um Polypeptide handelt oder diese ein Polypeptid umfassen.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen oder polyklonalen Antikörper handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen natürlichen Bindungspartner des CRP handelt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem natürlichen Bindungspartner des CRP um C1q handelt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe von Komponenten gemäß Anspruch 1(a) oder Anspruch 1(b) C1q und einen Anti-C1q-Antikörper umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei mindestens einer der Komponenten um einen natürlichen Bindungspartner des C1q handelt.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem natürlichen Bindungspartner um CRP handelt.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Gruppe von Komponenten gemäß Anspruch 2(a) oder Anspruch 2(b) CRP und einen Anti-CRP-Antikörper umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalübertragung von der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) (Donorgruppe) auf die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (c) (Akzeptorgruppe) durch emissionslosen Energietransfer erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem emissionslosen Engergietransfer um einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalübertragung durch Singulett-Sauerstoff erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß Anspruch 1(b) oder 2(b) (Donorgruppe) eine Verbindung umfaßt, die nach Anregung durch einen Laser Triplett-Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff umwandeln kann und die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß Anspruch 1(b) oder 2(b) (Akzeptorgruppe) mindestens eine erste Verbindung umfaßt, die durch Singulett-Sauerstoff angeregt werden kann, und mindestens eine zweite Verbindung umfaßt, die die von der durch Singulett-Sauerstoff anregbaren Verbindung aufgenommene Energie emissionslos aufnehmen und in Form von Fluoreszenzstrahlung emittieren kann.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Donorgruppe und/oder die Akzeptorgruppe auf Partikeln lokalisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Partikel einen mittleren Durchmesser von etwa 200 nm aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Konzentrationsbestimmung einer CRP-haltigen Lösung unbekannten CRP-Gehalts verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Konzentrationsbestimmung einer C1q-haltigen Lösung unbekannten C1q-Gehalts verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Lösung um Blutserum, Blutplasma oder mittels eines physiologischen Puffers oder mittels Wasser verdünntes Blutserum oder Blutplasma handelt.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein diagnostisches Verfahren zur Ermittlung des Entzündungszustandes eines Organismus und/oder zur Ermittlung der Herzinfarkt- und/oder Schlaganfallgefahr handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein HTS-fähiges homogenes Verfahren handelt, das als Ein-Schritt-Verfahren durchgeführt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, als zusätzlichen Schritt umfassend, daß vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt (d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben wird, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis zwischen CRP und an CRP bindender Komponente hat.
Verfahren nach Anspruch 2, als zusätzlichen Schritt umfassend, daß vor Schritt (a) und/oder vor Schritt (b) und/oder vor Schritt (c) und/oder vor Schritt (d) mindestens eine Testsubstanz hinzugegeben wird, um zu beobachten, ob diese einen Einfluß auf das Bindungsereignis zwischen C1q und an C1q bindender Komponente hat.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren verwendet wird, um Substanzen zu ermitteln, die modulierend, inhibierend oder aktivierend auf das Bindungsereignis einwirken.
HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines Bindungsereignisses zwischen CRP und einer an CRP bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden.
HTS-fähiges, diagnostisches Testsystem zur Ermittlung eines Bindungsereignisses zwischen C1q und einer an C1q bindenden Komponente, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder einer Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden.
HTS-fähiges Testsystem nach Anspruch 31 oder 32, folgende weitere Komponenten umfassend: (c) Blutserum oder Blutplasma oder in physiologischem Puffer oder mittels Wasser verdünntes Blutserum oder Blutplasma, (d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe), (e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b).
HTS-fähiges Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen CRP und einer an CRP bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) ausgesendete Signal zu empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abzugeben, wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an CRP zu binden, (c) mindestens eine Testverbindung.
HTS-fähiges Testsystem zur Ermittlung von Wirkstoffen, die modulierend auf die Wechselwirkung zwischen C1q und einer an C1q bindenden Komponente einwirken, folgende Komponenten umfassend: (a) mindestens eine Donorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Donorkomponente enthält, wobei es sich bei der Donorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die nach Anregung durch eine Lichtquelle ein Signal aussenden kann (Donorgruppe), und wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) ausgesendete Signal zu empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abzugeben, wobei die Donorkomponente dazu in der Lage ist, direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden, (b) mindestens eine Akzeptorkomponente oder eine Gruppe von Komponenten, die mindestens eine Akzeptorkomponente enthält, wobei es sich bei der Akzeptorkomponente um eine Komponente handelt, die mindestens eine Verbindung oder Gruppe von Verbindungen umfaßt, die das von der Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (b) ausgesendete Signal empfangen und in Form von elektromagnetischer Strahlung abgeben kann (Akzeptorgruppe), und wobei die Akzeptorkomponente dazu in der Lage ist, entweder direkt oder über eine oder mehrere Komponenten aus der genannten Gruppe von Komponenten an C1q zu binden, (c) mindestens eine Testverbindung.
HTS-fähiges Testsystem nach Anspruch 34 oder 35, folgende weitere Komponenten umfassend: (d) eine Lichtquelle zur Anregung der mindestens einen Verbindung oder Gruppe von Verbindungen gemäß (a) (Donorgruppe), (e) ein Detektionssystem zur Detektion der emittierten elektromagnetischen Stahlung gemäß (b).