WO2007062628A2 - Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay) - Google Patents

Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay) Download PDF

Info

Publication number
WO2007062628A2
WO2007062628A2 PCT/DE2006/002107 DE2006002107W WO2007062628A2 WO 2007062628 A2 WO2007062628 A2 WO 2007062628A2 DE 2006002107 W DE2006002107 W DE 2006002107W WO 2007062628 A2 WO2007062628 A2 WO 2007062628A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
immunoassay
antibody
antigen
analyte
samples
Prior art date
Application number
PCT/DE2006/002107
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007062628A3 (de
Inventor
Pavel Strohner
Original Assignee
Pavel Strohner
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pavel Strohner filed Critical Pavel Strohner
Priority to US12/095,776 priority Critical patent/US20080280311A1/en
Priority to AT06828568T priority patent/ATE454629T1/de
Priority to CA2640835A priority patent/CA2640835C/en
Priority to DE502006005889T priority patent/DE502006005889D1/de
Priority to JP2008542594A priority patent/JP4918556B2/ja
Priority to EP06828568A priority patent/EP1957980B1/de
Publication of WO2007062628A2 publication Critical patent/WO2007062628A2/de
Publication of WO2007062628A3 publication Critical patent/WO2007062628A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the invention relates to an immunoassay for the simultaneous immunochemical determination of an analyte (antigen) and of a therapeutic antibody directed against the analyte.
  • Areas of application of the invention are medical diagnostics, therapy control and pharmacological research.
  • Immunoassay is a very common technique for the determination of unknown concentrations of analytically or diagnostically relevant substances (analyte) in sample materials such as serum, plasma, tissue samples, residue preparations, cell culture supernatants and the like.
  • Immunoassays Radioimmunoassays (RIA), Enzyme immunoassays (EIA),
  • Luminescence immunoassays are based on specifying an analyte concentration as standard and for this, after reaction with an antibody including a labeled compound (a labeled antigen or antibody), the response of the bound labeled antigen or antibody (pulse rate, Extinction, Relative Light Units) is determined.
  • the relationship between response and analyte concentration of the standard is described in the form of a standard curve by means of mathematical calibration function or graphically.
  • the analyte concentration of unknown samples is calculated from the response of the unknown sample using the calibration function converted to the analyte concentration, or is read from the graphically generated standard curve.
  • a number of therapeutic antibodies have been developed or are still in development in recent years. These are primarily focused on the treatment of inflammation, autoimmune diseases and cancer. Although many of these therapeutic antibodies are originally produced as monoclonal antibodies, most of them have been genetically engineered into human antibodies to prevent the patient's immune response to the therapeutic antibody. Some of them are chimeras of human and monoclonal antibodies or even just monoclonal antibodies.
  • Table 1 shows a selection of therapeutic antibodies that are already approved as drugs or are in the approval:
  • therapeutic antibodies are directed against disease-specific human proteins.
  • disease-specific human proteins concerned can be determined as antigens on the basis of sandwich immunoassays, this determination is falsified by the therapeutic antibodies and are specific
  • the invention has for its object to develop a simple and fast to be performed method with which an antigen and a directed against it
  • Therapeutic antibodies can be determined simultaneously in a solution. It should preferably be usable for a therapy control.
  • the object is achieved according to the claims with a special immunoassay and a method for using this immunoassay.
  • the immunoassay according to the invention comprises: an optionally labeled capture antibody bound to a surface, a labeled therapeutic antibody, or a labeled antibody having the same binding epitope as the therapeutic antibody - an antigen that binds to different epitopes with the capture antibody and the therapeutic antibody, thereby forming an immunochemical sandwich forms a solution of the unlabeled therapeutic antibody of known concentration and - an antigen solution to replenish the samples.
  • the assay is based on a standard sandwich immunoassay. In a properly determined sandwich immunoassay in which the
  • Therapeutic antibody or an antibody that binds to the same binding epitope is used in labeled form as a detection antibody or capture antibody, the presence of the therapeutic antibody in samples causes a systematic reduction in the recovery of the antigen to be determined, which correlates with the concentration of the therapeutic antibody. This correlation can be used to determine the unknown concentration of the therapeutic antibody and to determine the free and total antigen concentration. For this reason, this immunoassay can also be called short recovery immunoassay or recovery immunoassay.
  • This sandwich immunoassay has the following structure: a) A capture antibody immobilized on the microtiter plate or biochip surface. b) The analyte is a protein or other biopolymer that binds to a binding epitope on the capture antibody, which is measured as a standard or sample in the immunoassay. c) The detection antibody is the therapeutic antibody that is radioactively or nonradioactivly labeled and has a binding epitope other than the one
  • Capture antibody binds the analyte.
  • nonradioactive markers all methods customary in immunoassay (with peroxidase, with alkaline phosphatase, with luminescent or fluorescent labels) can be used.
  • Sandwich immunoassays are now carried out with and without addition of 2 to 5 different antibody concentrations of the unlabelled humanized therapeutic antibody. It is essential for the sandwich immunoassay without the unlabeled humanized therapeutic antibody that the assay in the samples to be tested correctly reflects the antigen concentrations.
  • the measured values of the 2 to 6 immunoassays are then analyzed to which extent the addition of the humanized therapeutic antibodies causes a reduction of the measured values and thus the recovery of the antigen concentration in standard curves.
  • the relationship between the reduction of the measured values reduction of the recalculated antigen concentration (standard concentration) and the addition of the humanized therapeutic antibodies is summarized by means of a statistical evaluation in a suitable mathematical function.
  • This function establishes a connection between the recovery of the antigen in the immunoassay and the concentration of the therapeutic antibody.
  • the relationship between the reciprocal of antigen recovery in the immunoassay is and the concentration of the therapeutic antibody a simple linear function.
  • Prerequisite for the validity of this function is that distortions of the measured values due to matrix effects in the samples are excluded. For this reason, the reaction media of the standard solutions and the samples must be comparable.
  • Table 2 shows the experimental setup on the microtiter plate and in Table 3 the result of the experiment.
  • Figure 1 shows the IgE ELISA depending on the E-25 addition.
  • the immunoassay is intended for the determination of unknown antigen concentrations.
  • the measured values are determined by immunoassay as standard curve for standard dilutions of known antigen concentrations.
  • the correlation between the known antigen concentrations and the measured values is recorded for the immunoassay usual mathematical functions with the help of the regression and used for the calculation of the Antigenkonzentrationen of unknown samples from their measured values in the immunoassay.
  • NSB non-specific binding
  • the coefficient of determination for the linear relationship was 99.292%.
  • the evaluation function gives the correlation between measured values and hedgehog concentration to 99.3% correctly; only 0.7% of readings deviate randomly.
  • In (IgE) (5,30775 + Logit (E)) / 0,892 (formula 4) can be used with very little error to calculate unknown samples from the measured values (here extinctions).
  • IgE-lime IgE concentrations determined by the inverse function of the evaluation function.
  • Example 1 only the basic principle of determining the concentrations of the therapeutic antibody E-25- (xoiair) in known samples should be shown. Also, the immunoassays were performed only in buffer solutions.
  • Example 2 will now also be shown that the same method in unknown serum samples, the determination of the E-25 content by simple Heightening experiments in immunoassay is possible.
  • IgE-free sera were generated by immunoaffinity chromatography and the IgE standards were set in these in the immunoassay.
  • IgE standard IgE from OEM 13.
  • POD-labeled detection antibody PD 08/110501 from Hum., MAb E25 labeled with POD, Novartis;
  • Humanized monoclonal therapeutic antibody omalizumab (Xolair) E-25 from
  • Reaction Medium Standard curves (1:10 diluted IgE-free serum in PBS / 0.33% casein + 0.0125% TWEEN 20 )
  • Table 6 and 7 show the experimental setup on the microtiter plate, (1st and 2nd half) and in Table 8 the result of the immunoassay.
  • Table 6 Experimental setup on the microtiter plate, 1st half
  • H Serum 7 1 10 diluted in buffer + 0.25 Increased with 0 / 6.25 / 25 ng / ml IgE ⁇ g / ml E-25
  • Serum 3 had been supplemented with 6.25 and 25 ng / ml IgE. Without addition of E-25, the recovery of added IgE concentrations at a baseline serum level of 12 ng / ml (1:10 diluted) was 108%. This did not deviate significantly from an expected recovery of 100%.
  • Serum 5 had been supplemented with 6.25 and 25 ng / ml IgE. Without the addition of E-25, the recovery of added IgE concentrations at a serum starting level of 15.9 ng / ml (1:10 diluted) was 102%. This did not deviate significantly from an expected recovery of 100%.
  • Serum 6 had been supplemented with 6.25 and 25 ng / ml IgE. Without addition of E-25, the recovery of added IgE concentrations at a baseline serum level of 3.9 ng / ml (1:10 diluted) was 96%. This gave way to an expected
  • Serum 7 had been supplemented with 6.25 and 25 ng / ml IgE. Without addition of E-25, the recovery of added IgE levels at a baseline serum 2.7 ng / ml (1:10 diluted) was 95%. This did not deviate significantly from an expected recovery of 100%.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben (Recovery Immunoassay). Der erfindungsgemäße Immunoassay umfasst einen an einer Oberfläche gebundenen gegebenenfalls markierten Fängerantikörper; einen markierten Therapieantikörper, oder ein markierter Antikörper, der das gleiche Bindungsepitop wie der Therapieantikörper aufweist; ein Antigen, das mit dem Fängerantikörper und dem Therapieantikörper an verschiedenen Epitopen bindet und dadurch einen immunochemischen Sandwich bildet; eine Lösung des unmarkierten Therapieantikörpers bekannter Konzentration und eine Antigenlösung zur Aufstockung der Proben. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.

Description

Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben (Recovery Immunoassay)
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.
Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:
A) Zum Immunoassay
Der Immunoassay ist eine sehr verbreitete Technik zur Bestimmung unbekannter Konzentrationen analytisch oder diagnostisch relevanter Stoffe (Analyt) in Probenrnateriai wie Serum, Plasma, Gewebsproben, Rückstandspräparationen, Überstände von Zellkulturen und ähnlichem. Die Immunoassays (Radioimmunoassays(RIA), Enzym immunoassays (EIA),
Lumineszenzimmunoassays(UA) und damit verwandte Assayvarianten) basieren darauf, dass eine Analytkonzentration als Standard vorgeben wird und für diese nach Reaktion mit einem Antikörper unter Einbeziehung einer markierten Verbindung (eines markierten Antigens oder Antikörpers) die Response des gebundenen markierten Antigens oder Antikörpers (Impulsrate, Extinktion, Relative Light Units) bestimmt wird. Der Zusammenhang zwischen Response und Analytkonzentration des Standards wird in Form einer Standardkurve mittels mathematischer Eichfunktion oder graphisch beschrieben. Die Analytkonzentration unbekannter Proben wird unter Verwendung der nach der Analytkonzentration umgeformten Eichfunktion aus der Response der unbekannten Probe errechnet oder wird an der graphisch erstellten Standardkurve abgelesen. Bei der Eichung mit Hilfe einer Standardkurve werden gewöhnlich zur Vermeidung der Beeinflussung der Messung durch Fremdstoffe besondere Vorbehandlungen der Proben (z.B. Extraktionen, Zugabe von Zusatzstoffen) oder der Assaykomponenten (Einbringung der Standards in 0-Seren, Proteinzusätze u.a.m.) vorgenommen. Mit Wiederfindeexperimenten wird die Richtigkeit der Bestimmungen an den so modifizierten Assaykomponenten oder Proben geprüft. Softwarepakete an den Messgeräten (Gamma-Counter, Extinktions-Reader, Lumineszenz-Messgeräte), die die Immunoassay-Auswertung übernehmen, sind Standardausstattung von Immunoassay-Forschungs- und Routinelabors geworden. Darüber hinaus sind Immunoassay-Laborautomaten verschiedenster Hersteller auf dem Markt, die sowohl die Abarbeitung eines Immunoassays als auch seine Messung und Auswertung in einem Automaten vereinen. Allen diesen Auswerte-Software- Paketen und Labor-Automaten liegt o.g. Eichverfahren zugrunde, wenn auch heute, auf Grund der besseren Beherrschung der Assaytechnik, gespeicherte Eichfunktionen für mehrere Assayläufe oder auf zwei Standardkonzentrationen reduzierte Eichgeraden üblich geworden sind.
B) Therapieantikörper Es sind in den letzten Jahren eine Reihe von Therapieantikörpern entwickelt worden bzw. sind noch in der Entwicklung. Diese sind vorwiegend auf die Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs ausgerichtet. Viele dieser Therapieantikörper sind zwar ursprünglich als monoklonale Antikörper erzeugt, die meisten von ihnen sind jedoch zur Vermeidung der Immunabwehr des Patienten gegen den Therapieantikörper gentechnisch in humane Antikörper umgewandelt worden. Einige von ihnen sind Chimeren von humanen und monoklonalen Antikörpern oder sogar nur monoklonale Antikörper.
Tabelle 1 zeigt eine Auswahl von Therapieantikörpern, die bereits als Arzneimittel zugelassen sind bzw. sich in der Zulassung befinden:
Diese Therapieantikörper sind gegen krankheitsspezifische humane Proteine gerichtet. Zwar sind auf der Grundlage von Sandwich-Immunoassays die betroffenen krankheitsspezifischen humanen Proteine als Antigen bestimmbar, doch wird diese Bestimmung durch die Therapieantikörper verfälscht und es sind spezifische
Assaykonzepte erforderlich (siehe Hamilton, R.G. et.al.), um freies und Gesamtantigen zu bestimmen. Tabelle 1
Figure imgf000004_0001
In der Europäischen Patentschrift EP 0850416B1 vom 01.08.2001 ist mit dem Verfahren zur zweidimensionalen Bestimmung von Proben im Immunoassay eine Methode beschrieben, die den Einfluss von kreuzreaktiven Stoffen und Matrixeffekten analysieren kann und die Antigenkonzentration entsprechend berichtigt.
Bisher gibt es noch kein Verfahren, das die gleichzeitige richtige Bestimmung eines Antigens und des gegen das Antigen gerichteten Therapieantikörpers ermöglicht.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und schnell durchzuführendes Verfahren zu entwickeln, mit dem ein Antigen und ein dagegen gerichteter
Therapieantikörper gleichzeitig in einer Lösung bestimmt werden können. Es soll vorzugsweise für eine Therapiekontrolle einsetzbar sein. Die Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen mit einem speziellen Immunoassay sowie einem Verfahren zur Verwendung dieses Immunoassays gelöst. Der erfindungsgemäße Immunoassay umfasst: einen an einer Oberfläche gebundenen gegebenenfalls markierten Fängerantikörper einen markierten Therapieantikörper, oder ein markierter Antikörper, der das gleiche Bindungsepitop wie der Therapieantikörper aufweist - ein Antigen, das mit dem Fängerantikörper und dem Therapieantikörper an verschiedenen Epitopen bindet und dadurch einen immunochemischen Sandwich bildet eine Lösung des unmarkierten Therapieantikörpers bekannter Konzentration und - eine Antigenlösung zur Aufstockung der Proben.
Grundprinzip der Erfindung
Der Assay geht von einem gewöhnlichen Sandwich-Immunoassay aus. In einem richtig bestimmenden Sandwich-Immunoassay, bei dem der
Therapieantikörper oder ein Antikörper, der am gleichen Bindungsepitop bindet, in markierter Form als Nachweisantikörper oder Fängerantikörper verwendet wird, bewirkt die Anwesenheit des Therapieantikörpers in Proben eine systematische Verringerung der Wiederfindung des zu bestimmenden Antigen, die mit der Konzentration des Therapieantikörpers korreliert. Diese Korrelation kann zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des Therapieantikörpers und zur Bestimmung der freien und totalen Antigenkonzentration genutzt werden. Aus diesem Grunde kann dieses Immunoassay auch kurz Wiederfinde-Immunoassay oder Recovery-Immunoassay genannt werden.
Vorgehensweise:
Es wird für das nachzuweisende Antigen ein gewöhnlicher Sandwichimmunoassay entwickelt. Dieser Sandwich-Immunoassay hat folgenden Aufbau: a) Ein Fängerantikörper, an der Mikrotiterplatten oder Biochipoberfläche immobilisiert. b) Der Analyt ist ein Protein oder ein anderes Biopolymer, das mit einem Bindungsepitop am Fängerantikörper bindet, der als Standard oder Probe im Immunoassay gemessen wird. c) Der Nachweisantikörper ist der Therapieantikörper, der radioaktiv oder nichtradioaktiv markiert ist und an einem anderen Bindungsepitop als der
Fängerantikörper den Analyten bindet. Als nichtradioaktive Markierungen können alle im Immunoassay üblichen Verfahren (mit Peroxydase, mit alkalischer Phosphatase, mit Luminiszenz- oder Fluoreszenzlabeln) benutzt werden.
Es werden nun Sandwich-Immunoassays ohne und mit Zusatz von 2 bis 5 verschiedenen Antikörperkonzentrationen des nichtmarkierten humanisierten Therapieantikörpers durchgeführt. Dabei ist für den Sandwich-Immunoassay ohne den nichtmarkierten humanisierten Therapieantikörpers wesentlich, dass der Assay in den zu untersuchenden Proben die Antigenkonzentrationen richtig wiedergibt. Die Messwerte der 2 bis 6 Immunoassays werden nun daraufhin analysiert, in welchem Maße der Zusatz der humanisierten Therapieantikörper eine Reduktion der Messwerte und damit der Wiederfindung der Antigenkonzentration in Standardkurven bewirkt. Der Zusammenhang zwischen Reduktion der Messwerte = Reduktion der rekalkulierten Antigenkonzentration (Standardkonzentration) und Zusatz der humanisierten Therapieantikörper wird mit Hilfe einer statistischen Auswertung in eine geeignete mathematische Funktion zusammengefasst. Es wird mit dieser Funktion (Wiederfindefunktion) ein Zusammenhang zwischen der Wiederfindung des Antigens im Immunassay und der Konzentration des Therapieantikörpers hergestellt. Bei starkem Überschuß von Fängerantikörper und markierten Therapieantikörper ist die Beziehung zwischen dem Kehrwert der Wiederfϊndung des Antigens im Immunassay und der Konzentration des Therapieantikörpers eine einfache lineare Funktion. Voraussetzung für die Gültigkeit dieser Funktion ist, dass Verfälschungen der Messwerte durch Matrixeffekte in den Proben ausgeschlossen werden. Aus diesem Grunde müssen die Reaktionsmedien der Standardlösungen und der Proben vergleichbar sein.
Unbekannte Proben werden mit 2-3 bekannten Antigenkonzentrationen (Standards) aufgestockt. Es wird nun im Immunoassay festgestellt, wie die Wiederfindung der aufgestockten, bekannten Antigenkonzentrationen in der unbekannten Probe ist. Falls die Wiederfindung um die 100 % beträgt, ist kein Therapieantikörper in der Probe enthalten. Wenn die Wiederfindung kleiner ist, kann mit der o.g. Wiederfindefunktion indirekt auf die Konzentration des Therapieantikörpers in den Proben und auf die tatsächliche totale Konzentration des Antigens geschlossen werden.
Es stehen nur sehr aufwändige Verfahren zur Bestimmung des gesamten und freien IgE zur Verfügung. In der Publikation Hamilton R.G. et al. sind 2 gesonderte Elisas zur Bestimmung erforderlich, wobei eine Bestimmung der wirksamen Antikörperkonzentration nicht erfolgt. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Therapiekontrolle beispielsweise bei dem Einsatz von Omalizumab bei allergischem Asthma und anderen Autoimmunerkrankungen sehr einfach durchzuführen.
Nachfolgende 2 Beispiele sollen das Verfahren näher erläutern:
Beispiel 1:
Auswirkung des Zusatzes des Therapieantikörpers Omalizumab (Xolair=E-25) auf den IgE-Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten im Puffer
Material: 1. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ
Berlin-Buch GmbH für Maximale Biotin-Bindungskapazität (MC-Beschichtung) 2. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin beschichteten
Mikrotiterplatten biotinylierter Antikörper B 216 / 290702; anti-human IgE, mAb E- 411 3. IgE-Standard: IgE von OEM 4. POD-markierter Nachweisantikörper PD 08/110501 von Hum., mAk E25 markiert mit POD, Novartis;
5. Humanisierter monoklonaler Therapieantikörper Omalizumab(Xolair)=E-25 von Novartis 6. Beschichtungspuffer (PBS 0.05M, pH=7,2 mit 0,1% RSA)
7. Reaktionspuffer (PBS/ 0,33 % Casein + 0,0125 % TWEEN 20)
8. Waschlösung (0,9% NaCI/0,1% Tween)
9. Enzymsubstrat: Orthophenylendiamin (OPD)
In Tabelle 2 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte dargestellt und in Tabelle 3 das Ergebnis des Versuchs.
Versuchsablauf:
1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Wells der Mikrotiterplatte. Zugabe vom 200 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml). Inkubation über Nacht bei 4° C 2. Am nächsten Tag 2* Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung
3. Herstellung der IgE-Standardreihe 0 / 3,125 / 6,25 / 12,5 / 25 / 50 / 100/ 200 ng IgE/ml gemäß Versuchsaufbau
4. Herstellung der E-25-Verdünnungen gemäß Versuchsaufbau 0 / 0,0625 / 0,125 / 0,25 / 0,5 / 1 μg/ml 5. Mischen je 50 μl 3. und 4. zu einer Ansatzlösung
6. Mischen der Ansatzlösung (100 μl) mit dem Nachweiskonjugat (PD08, 100 ng/ml, 100 μl)
7. Zugabe von 200 ml Mischung aus Ansatzlösung und Nachweiskonjugat zur Mikrotiterplatte 8. Inkubation der Mischung über 3 Stunden bei Raumtemperatur
9. 2* Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung
10. Enzymnachweis mit OPD (14 mg OPD auf 20 ml Sörensenpuffer+ 80 μl 3% H2O2), Zugabe von 200 μl OPD-Lösung und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 50 μl H2SO4 [5M] Tabelle 2: Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte:
Figure imgf000009_0001
Tabelle 3: Ergebnis des Versuchs Mittelwerte der Doppelbestimmungen als Extinktionen (O. D.: Optical Density)
Figure imgf000009_0002
Abbildung 1. zeigt den IgE-ELISA in Abhängigkeit vom E-25-Zusatz.
Wenn man nun die Messergebnisse (O. D.) der IgE-Standardkurven bei unterschiedlichem E-25-Zusatz auf die IgE-Standardkurve ohne E-25-Zusatz bezieht, ergibt sich folgender sehr einfacher linearer Zusammenhang (Tabelle 4):
Tabelle 4:
Figure imgf000010_0001
Es zeigt sich somit, dass alle Messwerte der IgE-Standardkurven mit E-25-Zusatz stark linear mit der IgE-Standardkurve ohne E-25-Zusatz korreliert sind. Die Wiederfindung der im ELISA eingesetzten IgE-Standardlösungen wird mit zunehmenden E-25-Gehalt systematisch verringert. Es ergibt sich folgender einfacher Zusammenhang zwischen E- 25-Gehalt und Wiederfindung des IgE-Standards:
1 /Wiederfindung = 1 + 2,626 * E-25-Gehalt (Formel 1)
Das Bestimmtheitsmaß des lineare Zusammenhangs des reziproken Wertes der Wiederfindung zu der E-25-Konzentration betrug 0,9907.
Der Immunoassay ist jedoch für die Bestimmung unbekannter Antigenkonzentrationen gedacht. Aus diesem Grunde werden für Standardverdünnungen bekannter Antigenkonzentrationen die Messwerte im Immunoassay als sogenannte Standardkurve ermittelt. Der Zusammenhang zwischen den bekannten Antigenkonzentrationen und den Messwerten wird für den Immunoassay üblichen mathematischen Funktionen mit Hilfe der Regression erfasst und zur Berechnung der Antigenkonzentrationen unbekannter Proben aus ihren Messwerten im Immunoassay genutzt.
Logit(E) = ln((E-NSB)/(Emaχ-E+NSB)) = a + b* In(X) (Formel 2) In: natürlicher Logarithmus E: Extinktion (Messwert im Enzymimmunoassay)
NSB: unspezifische Bindung
Emax : Maximale Extinktion a,; b: Parameter der Regressionsfunktion
Es ergab sich durch lineare Regression folgende Auswertefunktion der Standardkurve: Logit(E) = 0,892*ln(lgE)-5,30775 (Formel 3)
Das Bestimmtheitsmaß für den linearen Zusammenhang war 99,292 %. Die Auswertefunktion gibt den Zusammenhang zwischen Messwerten und Igel- Konzentration zu 99,3 % richtig wieder; nur 0,7 % der Messwerte weichen davon zufällig ab.
Die aus der Auswertefunktion abgeleitete Umkehrfunktion: In(IgE)= (5,30775+Logit(E))/0,892 (Formel 4) kann mit sehr geringem Fehler zur Berechnung unbekannter Proben aus den Messwerten (hier Extinktionen) benutzt werden.
Mit Hilfe dieser Umkehrfunktion wurden nun aus den Messwerten (Extinktionen) die IgE-Konzentrationen in den Standardkurven mit E-25-Zusatz ermittelt (Tabelle 5):
Tabelle 5:
Figure imgf000012_0001
IgE-rekalk.: Durch die Umkehrfunktion der Auswertefunktion bestimmten IgE- Konzentrationen.
Wie bei den Messwerten ergab sich erwartungsgemäß auch hier eine systematische Abnahme der gemessenen IgE-Konzentrationen in Abhängigkeit vom E-25-Gehalt in den Standardproben. Es zeigte sich wie bei den Messwerten ein einfacher lineare Zusammenhang zwischen den IgE-Werten ohne und mit E-25-Zusatz (Alle Bestimmtheitsmaße waren über 98,5 %).
Der Zusammenhang E-25-Gehalt und Wiederfindung der IgE-Konzentrationen in den bekannten Standardkonzentrationen konnte durch eine einfache Funktion wiedergegeben werden (Abbildung 2), wobei 1/WF = 0,9606 + 3,932*X (Formel 5); WF: Wiederfindung; X: E-25-Gehalt in μg/ml; Das Bestimmtheitsmaß für diese Funktion war 98,74 %.
Mit der Umkehrfunktion dieser Funktion kann man aus den Wiederfindewerten somit den E-25-Gehalt in den Proben abschätzen.
In diesem Beispiel 1 sollte nur das Grundprinzip der Bestimmung der Konzentrationen des Therapieantikörpers E-25-(Xoiair) in bekannten Proben gezeigt werden. Auch wurden die Immunoassays nur in Pufferlösungen ausgeführt.
Im Beispiel 2 soll nunmehr auch gezeigt werden, dass nach gleichem Verfahren auch in unbekannten Serumproben die Bestimmung des E-25-Gehalts durch einfache Aufstockungsexperimente im Immunoassay möglich ist. Um die Vergleichbarkeit der Reaktionslösungen von Standards und unbekannten Serumproben zu sichern, wurden durch Immunaffinitätschromatographie IgE-freie Seren erzeugt und in diesen die IgE- Standards im Immunoassay angesetzt.
Beispiel 2:
Auswirkung des Zusatzes des Therapieantikörpers Omalizümab (Xolair=E-25) auf die Wiederfindung unbekannter Serumproben im IgE-Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten und Bestimmung des E-25-Gehalts in unbekannten Serumsproben, die mit E-25 versetzt wurden.
Material: lO. Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Maximale Biotin-Bindungskapazität (MC-Beschichtung)
11. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin beschichteten Mikrotiterplatten biotinylierter Antikörper B 216 / 290702; anti-human IgE, mAb E- 411
12. IgE-Standard: IgE von OEM 13. POD-markierter Nachweisantikörper PD 08/110501 von Hum., mAk E25 markiert mit POD, Novartis; 14. Humanisierter monoklonaler Therapieantikörper Omalizumab(Xolair)=E-25 von
Novartis
15. Beschichtungspuffer (PBS 0,05M, pH=7,2 mit 0,1% RSA) 16. Reaktionsmedium Standardkurven(1 :10-verdünntes IgE-freies Serum in PBS/ 0,33 % Casein + 0,0125 % TWEEN 20)
17. Proben 1 :10 verdünnt in PBS/ 0,33 % Casein + 0,0125 % TWEEN 20
18. Waschlösung (0,9% NaCI/0,1% Tween)
19. Enzymsubstrat: Orthophenylendiamin (OPD)
In Tabelle 6 und 7 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte, (1. und 2. Hälfte) dargestellt und in Tabelle 8 das Ergebnis des Immunoassays. Tabelle 6: Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte, I .Hälfte
Figure imgf000014_0001
Tabelle 7: Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte, 2. Hälfte
Figure imgf000015_0001
Versuchsablauf:
1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Wells der Mikrotiterplatte. Zugabe vom 200 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml) . Inkubation über Nacht bei 4° C
2. Am nächsten Tag 2* Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung
3. Standardreiher)
Für Reihe A-H, Spalte 1-6: 0 / 3,125 / 6,25 / 12,5 / 25 / 50 / 100/ 200 ng IgE/ml und 0 / 0,125 / 0,5 μg/ml E-25 in IgE-freiem Serum 1:10 verdünnt im Reaktionspuffer 4. Proben
Spalte 7-12, A-D Serum 3, 5, 6, 7, 1:10-verdünnt in Aufgestockt mit 0 / 6,25 / 25 ng/ml IgE
Puffer Spalte 7-12, E Serum 3 1:10-verdünnt in Puffer + Aufgestockt mit 0 / 6,25 / 25 ng/ml IgE
0.031 μg/ml E-25 Spalte 7-12, F Serum 5 1:10-verdünnt in Puffer + Aufgestockt mit 0 / 6,25 / 25 ng/ml
0.063 μg/ml E-25 ige. Spalte 7-12, G Serum 6 1:10-verdünnt in Puffer + Aufgestockt mit 0 / 6,25 / 25 ng/ml
0.125 μg/ml E-25 IgE. Spalte 7-12, H Serum 7 1:10-verdünnt in Puffer + 0.25 Aufgestockt mit 0 / 6,25 / 25 ng/ml IgE μg/ml E-25
5. Inkubation der Mischung über 3 Stunden bei Raumtemperatur
6. 2* Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung
7. Enzymnachweis mit OPD (14 mg OPD auf 20 ml Sörensenpuffer+ 80 μl 3% H2O2), Zugabe von 200 μl OPD-Lösung und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 50 μl H2SO4 [5M]
Tabelle 8: Ergebnis des Immunoassays:
a) Standardkurven (Extinktionen)
Figure imgf000017_0001
O.D.: Messwerte des Enzymimmunoassays; Optical Density (Extinktion)
Es zeigten sich erwartungsgemäß auch in den Standardkurven im IgE-freie Serum mit Zusatz von E-25 systematische Erniedrigungen der Wiederfindung der Messwerte.
Der Zusammenhang zwischen den bekannten Antigenkonzentrationen und den
Messwerten in der Standardkurve ohne E-25-Zusatz wurde auch hier mit den für den Immunoassay üblichen Logit-Log-Funktion mit Hilfe der Regression erfasst und zur Berechnung der mit E-25 versetzten IgE-Standards und zur Berechnung der IgE- Konzentrationen unbekannter Proben aus ihren Messwerten im Immunoassay genutzt. Es ergab sich durch Regression
Logit(E) = 0,8984*ln(lgE)-5,9079. (Formel 6)
Mit der Umkehrfunktion dieser Auswertefunktion (In(IgE)= (5,39079+Logit(E))/0,8984) (Formel 7) wurden nun aus den Messwerten der mit E-25 versetzten Standards und der unbekannten Proben die IgE-Konzentrationen errechnet. Es ergaben sich für die Standardkurven mit und ohne E-25-Zusatz folgende IgE- Konzentrationen (Tabelle 9): Tabelle 9:
Figure imgf000018_0001
In den Standardkurven war eine systematische Abnahme der IgE-Konzentrationen im Enzymimmunoassay festzustellen. Der Zusammenhang zwischen E-25-Zugabe und IgE-Wiederfindung konnte mit folgender einfacher linearen Funktion wiedergegeben werden 8 (Abbildung 3), wobei Wf = 0,99 - 2,291 *X (Formel 8); Wf: Wiederfindung der IgE-Konzentration; X: E-25-Zusatz in μg/ml sind. Bestimmtheitsmaß für diesen linearen Zusammenhang war 99,84 %.
Bei den unbekannten Serumproben ergaben sich folgende Ergebnisse im ELISA (Tabelle 10):
Tabelle 10: Anonyme Patientenseren ohne und mit E-25 Zusatz
Figure imgf000019_0001
Erläuterungen:
In dem Assay wurden 4 anonyme Seren von gesunden Blutspendepatienten verwendet. Alle Seren wurden mit bekannten IgE-Konzentrationen 6,25 und 25 ng/ml aufgestockt und vermessen. Bei den gleichen Seren wurden unterschiedliche E-25- Konzentrationen zugefügt, um so Therapieantikörper-haltige Seren zu simulieren. Die Berechnung der jeweiligen IgE-Konzentrationen erfolgt aus den Messwerten mit Hilfe der Umkehrfunktion der für die Standardkurve gültigen Auswertefunktion (In(IgE)= (5,39079+Logit(E))/0,8984). Im Einzelnen zeigten sich folgende Ergebnisse:
1. Serum 3:
Serum 3 war mit 6,25 und 25 ng/ml IgE aufgestockt worden. Ohne Zugabe von E-25 lag die Wiederfindung der zugegebenen IgE-Konzentrationen bei einem Ausgangswert des Serums von 12 ng/ml (1 :10 verdünnt) bei 108 %,. Diese wich von einer erwarteten Wiederfindung von 100 % nicht signifikant ab.
Der Zusatz von 0,031 μg/ml E-25 (Xolair) bewirkte keine signifikante Änderung der Wiederfindung der IgE-Konzentrationen.
2. Serum 5:
Serum 5 war mit 6,25 und 25 ng/ml IgE aufgestockt worden. Ohne Zugabe von E-25 lag die Wiederfindung der zugegebenen IgE-Konzentrationen bei einem Ausgangswert des Serums von 15,9 ng/ml (1:10 verdünnt) bei 102 %,. Diese wich von einer erwarteten Wiederfindung von 100 % nicht signifikant ab.
Der Zusatz von 0,063 μg/ml E-25 (Xolair) bewirkte eine signifikante Erniedrigung der
Wiederfindung der IgE-Konzentrationen auf 72 %. Aus der o.g. aus den Standardkurven gewonnenen Beziehung (Formel 8) konnte somit auf eine E-25-
Konzentration von 0,08 μg/ml geschlossen werden, die in der Nähe der tatsächlich zugegebenen E-25-Konzentration von 0,063 μg/ml lag.
3. Serum 6:
Serum 6 war mit 6,25 und 25 ng/ml IgE aufgestockt worden. Ohne Zugabe von E-25 lag die Wiederfindung der zugegebenen IgE-Konzentrationen bei einem Ausgangswert des Serums von 3,9 ng/ml (1 :10 verdünnt) bei 96 %,. Diese wich von einer erwarteten
Wiederfindung von 100 % nicht signifikant ab.
Der Zusatz von 0,125 μg/ml E-25 (Xolair) bewirkte eine signifikante Erniedrigung der
Wiederfindung der IgE-Konzentrationen auf 50 %. Aus der o.g. aus den Standardkurven gewonnenen Beziehung (Formel 8) konnte somit auf eine E-25- Konzentration von 0,18 μg/ml geschlossen werden, die in der Nähe der tatsächlich zugegebenen E-25-Konzentration von 0,125 μg/ml lag. 4. Serum 7:
Serum 7 war mit 6,25 und 25 ng/ml IgE aufgestockt worden. Ohne Zugabe von E-25 lag die Wiederfindung der zugegebenen IgE-Konzentrationen bei einem Ausgangswert des Serums von 2,7 ng/ml (1 :10 verdünnt) bei 95 %,. Diese wich von einer erwarteten Wiederfindung von 100 % nicht signifikant ab.
Der Zusatz von 0,125 μg/ml E-25 (Xolair) bewirkte eine signifikante Erniedrigung der Wiederfindung der IgE-Konzentrationen auf 40 %. Aus der o.g. aus den Standardkurven gewonnenen Beziehung (Formel 8) konnte somit auf eine E-25- Konzentration von 0,27 μg/ml geschlossen werden, die in der Nähe der tatsächlich zugegebenen E-25-Konzentration von 0,25 μg/ml lag.
Es stehen nur sehr aufwändige Verfahren zur Bestimmung des gesamten und freien IgE zur Verfügung. In der Publikation Hamilton R.G. et al. Sind 2 gesonderte Elisas zur Bestimmung erforderlich, wobei eine Bestimmung der wirksamen Antikörperkonzentration nicht erfolgt. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Therapiekontrolie beispielsweise bei dem Einsatz von Omalizumab bei allergischem Asthma und anderen Autoimmunerkrankungen sehr einfach durchzuführen.
Literatur
Rodbard D., Ratford P.L., Cooper J. and Ross G.T. (1968). Statistical quality control of radioimmunoassays. J. Clin. Endocrinol. Metab. 29, 352. Azimzadeh A., Pellequer J.L. and Van Regenmortel M.H.V. (1992). Operational aspects of antibody affinity constants measured by liquid-phase and solid-phase assays. J. Molecular Recognition. 5, 9.
Goldberg M.E. and Djavadi-Ohaniance L. (1993). Methods for measurement of antibody/antigen affinity based on ELISA and RIA. Current Opinion in Immunology 5, 278.
Hamilton R.G., MarcotteG.V., Saini S.S.: Immunological methods for quantifying free and total serum Ige levels in allergy patients receiving omalizumab (Xolair) therapy. J. Immunol. Methods. 2005, 303 (1-2):81-91 Europäischen Patentschrift EP 0850416B1 vom 01.08.2001

Claims

Patentansprüche
1. Immunoassay zur gleichzeitigen immunochemischen Bestimmung eines Analyten und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers, umfassend
5 - einen an einer Oberfläche gebundenen gegebenenfalls markierten
Fängerantikörper einen markierten Therapieantikörper, oder ein markierter Antikörper, der das gleiche Bindungsepitop wie der Therapieantikörper aufweist ein Antigen, das mit dem Fängerantikörper und dem Therapieantikörper an 0 verschiedenen Epitopen bindet und dadurch einen immunochemischen
Sandwich bildet eine Lösung des unmarkierten Therapieantikörpers bekannter Konzentration und eine Antigenlösung zur Aufstockung der Proben. 5
2. Verfahren zur gleichzeitigen immunochemischen Bestimmung eines Analyten und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers, mit dem Immunoassay gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
Sandwich-Immunoassay-Standardkurven bei 2-5 verschiedenen o Konzentrationen der Therapieantikörpers aufgestellt werden
Der Zusammenhang zwischen der Verringerung der rekalkulierten Antigenkonzentration (Standardkonzentration) durch Zusatz der Therapieantikörper mit Hilfe einer statistischen Auswertung erfasst wird Proben mit unbekannten Antigenkonzentrationen mit 2-3 bekannten 5 Antigenkonzentrationen aufgestockt und die Wiederfindungen gemessen werden mit den ermittelten Wiederfindungswerten in den Proben anhand der der Wiederfindungswerte in den Eichkurven auf die Konzentration des Therapieantikörpers und auf die tatsächliche totale Konzentration des Antigens 0 geschlossen wird.
PCT/DE2006/002107 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay) WO2007062628A2 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/095,776 US20080280311A1 (en) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay for the Simultaneous Immunochemical Determination of an Analyte (Antigen) and a Treatment Antibody Targeting the Analyte in Samples (Recovery Immunoassay)
AT06828568T ATE454629T1 (de) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)
CA2640835A CA2640835C (en) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay for the simultaneous immunochemical determination of an analyte (antigen) and a treatment antibody targeting the analyte in samples (recovery immunoassay)
DE502006005889T DE502006005889D1 (de) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)
JP2008542594A JP4918556B2 (ja) 2005-12-02 2006-11-29 サンプル中の被検体（抗原）および該被検体を標的とする治療用抗体を同時に免疫化学的に測定するためのイムノアッセイ（リカバリー・イムノアッセイ（ＲｅｃｏｖｅｒｙＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））
EP06828568A EP1957980B1 (de) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005057920.5 2005-12-02
DE102005057920A DE102005057920A1 (de) 2005-12-02 2005-12-02 Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten Therapieantikörpers in Proben

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007062628A2 true WO2007062628A2 (de) 2007-06-07
WO2007062628A3 WO2007062628A3 (de) 2007-07-19

Family

ID=37965064

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/DE2006/002107 WO2007062628A2 (de) 2005-12-02 2006-11-29 Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20080280311A1 (de)
EP (1) EP1957980B1 (de)
JP (1) JP4918556B2 (de)
AT (1) ATE454629T1 (de)
CA (1) CA2640835C (de)
DE (2) DE102005057920A1 (de)
WO (1) WO2007062628A2 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011009432A1 (de) * 2009-07-24 2011-01-27 Bio Tez Berlin-Buch Gmbh Biochemisch-Technologies Zentrum Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay)
WO2012059083A3 (de) * 2010-11-03 2012-06-28 Biotez Berlin-Buch Gmbh Recovery immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ621655A (en) 2009-10-26 2015-08-28 Nestec Sa Assays for the detection of anti-tnf drugs and autoantibodies
EP2630495B1 (de) 2010-10-18 2017-02-08 Nestec S.A. Verfahren zur bestimmung von gegen medikamente gerichtete antikörperisotypen
AU2012278802B2 (en) 2011-07-06 2015-11-26 Société des Produits Nestlé S.A. Assays for detecting neutralizing autoantibodies to biologic therapy with TNF alpha
US20130266963A1 (en) * 2011-07-06 2013-10-10 Nestec S.A. Assay for detecting neutralizing autoantibodies to biologic therapy
BR112017011545A2 (pt) 2014-12-05 2018-03-13 Nestec Sa ensaio de desvio de mobilidade homogênea indireto para a detecção de produtos biológicos nas amostras do paciente

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010451A1 (de) * 1991-11-20 1993-05-27 Pavel Strohner Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitätskontrolle von immunoassays aller provenienzen und von rezeptorassays sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens
US6174688B1 (en) * 1998-03-13 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Multiassay method for determining the concentrations of antigens and interferants
EP0850416B1 (de) * 1995-08-24 2001-08-01 STROHNER, Pavel Verfahren zur zweidimensionalen bestimmung von proben in immunoassays

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0772150A (ja) * 1993-09-02 1995-03-17 Tonen Corp ＩｇＥの測定方法
US5945294A (en) * 1996-11-26 1999-08-31 Heska Corporation Method to detect IgE
JP2002350447A (ja) * 2001-05-24 2002-12-04 Wako Pure Chem Ind Ltd 生理活性物質固定化担体及びその製造方法、固定化生理活性物質、試料中の対象成分分析方法、並びに試料中の対象成分分析用キット
GB0509512D0 (en) * 2005-05-10 2005-06-15 Novartis Ag Organic compounds

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993010451A1 (de) * 1991-11-20 1993-05-27 Pavel Strohner Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitätskontrolle von immunoassays aller provenienzen und von rezeptorassays sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens
EP0850416B1 (de) * 1995-08-24 2001-08-01 STROHNER, Pavel Verfahren zur zweidimensionalen bestimmung von proben in immunoassays
US6174688B1 (en) * 1998-03-13 2001-01-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Multiassay method for determining the concentrations of antigens and interferants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEUM P V ET AL: "Three new assays for rituximab based on its immunological activity or antigenic properties: analyses of sera and plasmas of RTX-treated patients with chronic lymphocytic leukemia and other B cell lymphomas" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, Bd. 289, Nr. 1-2, Juni 2004 (2004-06), Seiten 97-109, XP004520883 ISSN: 0022-1759 *
HAMILTON ET AL: "Immunological methods for quantifying free and total serum IgE levels in allergy patients receiving Omalizumab (Xolair) therapy" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, Bd. 303, Nr. 1-2, August 2005 (2005-08), Seiten 81-91, XP005037172 ISSN: 0022-1759 in der Anmeldung erwähnt *
PAGANELLI R ET AL: "STUDIES ON THE IN VITRO EFFECTS OF AUTO-ANTI-IGE. INHIBITION OF TOTAL AND SPECIFIC SERUM IGE DETECTION BY A HUMAN IGG AUTOANTIBODY TO IGE" JOURNAL OF CLINICAL AND LABORATORY IMMUNOLOGY, TREVIOT-KIMPTON PUBLICATIONS, LONDON, GB, Bd. 26, Nr. 3, Juli 1988 (1988-07), Seiten 153-157, XP008078693 ISSN: 0141-2760 *
PATTON ET AL: "An acid dissociation bridging ELISA for detection of antibodies directed against therapeutic proteins in the presence of antigen" JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS B.V.,AMSTERDAM, NL, Bd. 304, Nr. 1-2, September 2005 (2005-09), Seiten 189-195, XP005065150 ISSN: 0022-1759 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011009432A1 (de) * 2009-07-24 2011-01-27 Bio Tez Berlin-Buch Gmbh Biochemisch-Technologies Zentrum Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay)
WO2012059083A3 (de) * 2010-11-03 2012-06-28 Biotez Berlin-Buch Gmbh Recovery immunoassay zur gleichzeitigen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers

Also Published As

Publication number Publication date
DE502006005889D1 (de) 2010-02-25
EP1957980B1 (de) 2010-01-06
JP4918556B2 (ja) 2012-04-18
DE102005057920A1 (de) 2007-06-28
CA2640835C (en) 2014-03-18
EP1957980A2 (de) 2008-08-20
CA2640835A1 (en) 2007-06-07
US20080280311A1 (en) 2008-11-13
ATE454629T1 (de) 2010-01-15
JP2009517667A (ja) 2009-04-30
WO2007062628A3 (de) 2007-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60200615T2 (de) Prozess und mittel für die differentialdiagnose der demenz vom alzheimer typ
EP1957980B1 (de) Immunoassay zur simultanen immunchemischen bestimmung eines analyten (antigen) und eines gegen den analyten gerichteten therapieantikörpers in proben (recovery immunoassay)
DE60033499T2 (de) Verfahren zum differenzieren und überwachen von parathyroid und krankheiten, die mit dem zustand der knochen verbunden sind
WO2004090546A1 (de) Bestimmung eines midregionalen proadrenomedullin-teilpeptids in biologischen flüssigkeiten zu diagnostischen zwecken sowie immunoassays für die durchführung einer solchen bestimmung
EP0143209B1 (de) Verfahren zur immunologischen Bestimmung von extrazellulären Matrixproteinen in Körperflüssigkeiten, unter Verwendung monovalenter Antikörperfragmente
EP0407904B1 (de) Verfahren zur Bestimmung eines Analyten
EP0544869B1 (de) Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von antikörpern in biologischen flüssigkeiten sowie kit zur durchführung des verfahrens
EP1562984B1 (de) Sandwich-immunoassay zur bestimmung von proanp-teilpeptiden
DE19649389A1 (de) Antigenspezifischer IgM-Nachweis
DE102018009721A1 (de) Verfahren zur Diagnose einer Bornavirus-Infektion
WO2003048782A1 (de) Verfahren zur diagnose von sepsis unter bestimmung löslicher cytokeratinfragmente
DE60317070T2 (de) Verfahren zur diagnose von multipler sklerose
DE3942999A1 (de) Verfahren zum nachweis von malignen erkrankungen
AT407580B (de) Indikatorpeptid zur diagnose und/oder vorhersage von cardiovasculären und/oder endothelialen erkrankungen, antikörperzusammensetzung und immunoassay
JP2009517667A5 (de)
EP0974841A2 (de) Entstörung von Immunoassays durch Substanzen, die aus den Framework-Regionen von Antikörpern abgeleitet sind
DE19637418A1 (de) Homogene Nachweisverfahren zur Bestimmung von Subpopulationen eines Analyten
DE69921987T2 (de) IMMUNTEST FÜR HUMAN CHROMOGRANINE A (CgA), ANTIKÖRPER, REAGENZ UND DAZU GEEIGNETER TESTSATZ
WO2011009432A1 (de) Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay)
WO2011009435A1 (de) Verfahren, insbesondere enzyme-linked immunosorbent assay (elisa), zum in vitro nachweis von amyloid beta autoantikörpern, mikrotiterplatte und testkit
DE4429409C1 (de) Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Proteinen und Kit zur Durchführung des Verfahrens
DE102014013571A1 (de) Monoklonaler Antikörper gegen humanes TAU-Protein
DE2638250A1 (de) Verbessertes verfahren zum nachweisen von antikoerpern und antigenen, sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens
DE60026285T2 (de) Verfahren zur abschätzung des individuellen risikos einer irreversiblen nervenschädigung, das schritte zur quantitativen bestimmung der pepsinogen-i (pgi) und vitamin b12 konzentrationen umfasst
DE10236631A1 (de) Verfahren und Vorrichtungen zur direkten Bestimmung des Cyclase-hemmenden Parathormons

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006828568

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008542594

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2640835

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12095776

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006828568

Country of ref document: EP