WO2011009432A1 - Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay) - Google Patents

Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay) Download PDF

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Pavel Strohner
Antonia Staatz
Astrid Schäfer
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Bio Tez Berlin-Buch Gmbh Biochemisch-Technologies Zentrum
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N2800/12—Pulmonary diseases
    • G01N2800/122—Chronic or obstructive airway disorders, e.g. asthma COPD

Definitions

  • the invention relates to an immunoassay for the determination of the free target (antigen) in samples against which a therapeutic antibody is directed (free target immunoassay) as a monitoring in the application of the therapeutic antibody as a drug.
  • Areas of application of the invention are medical diagnostics, therapy control and pharmacological research.
  • Immunoassay is a very common technique for the determination of unknown concentrations of analytically or diagnostically relevant substances (analyte)
  • Sample material such as serum, plasma, tissue samples, residue preparations, cell culture supernatants and the like.
  • the immunoassays radioimmunoassays (RIA), enzyme immunoassays (EIA), and others.
  • Luminescence immunoassays and related assay variants
  • an analyte concentration is set as the standard and for this after reaction with an antibody including a labeled compound (a labeled antigen or antibody), the response of the bound labeled antigen or antibody (pulse rate, Extinction, Relative Light Units) is determined.
  • pulse rate Extinction, Relative Light Units
  • the relationship between response and analyte concentration of the standard is described in the form of a standard curve by means of mathematical calibration function or graphically.
  • the analyte concentration of unknown samples is calculated from the response of the unknown sample using the calibration function converted to the analyte concentration, or is read from the graphically generated standard curve.
  • special pre-treatments of the samples eg extractions, addition of additives
  • introduction of the standards into 0-sera, protein additives, etc. are usually carried out to avoid influencing the measurement by foreign substances.
  • Recovery experiments will verify the accuracy of the determinations on the modified assay components or samples.
  • a number of therapeutic antibodies have been developed or are still in development in recent years. They are primarily focused on the treatment of inflammation, autoimmune diseases and cancer. Although many of these therapeutic antibodies are originally produced as monoclonal antibodies, most of them have been genetically engineered into human antibodies to prevent the patient's immune response to the therapeutic antibody. Some of them are chimeras of human and monoclonal antibodies or even just monoclonal antibodies.
  • Table 1 shows a selection of therapeutic antibodies already approved as drugs. These therapeutic antibodies are directed against disease-specific human proteins.
  • the Recovery Immunoassay is based on a common sandwich immunoassay. In a properly determined sandwich immunoassay, in which the therapeutic antibody in labeled form as
  • Detection antibody or capture antibody is used, the presence of the therapeutic antibody in samples causes a systematic reduction in the recovery of the antigen to be determined, which correlates with the concentration of the therapeutic antibody. This correlation is used to determine the unknown concentration of the therapeutic antibody and to determine the free and total antigen concentration. For this reason, this immunoassay can also be referred to as Recovery Immunoassay or Recovery Immunoassay for short (4).
  • the invention aims to improve the monitoring of therapeutic antibodies in the treatment of severe diseases (asthma, rheumatism, cancer).
  • the invention was, regardless of the recovery immunoassay a
  • a sandwich immunoassay is set up to determine only the free target protein that has not been bound by the therapeutic antibody directed against this target (free target immunoassay). Since the aim of the therapy is the elimination of the disease-causing target protein by binding to the therapeutic antibody, the result is that one would like to minimize the concentration of the unbound (free) target protein in the blood to a therapeutically meaningful limit by antibody. This unbound (free) rest of the
  • Target protein is determined by the free target immunoassay. In this way, the effect of the therapeutic antibody can be indirectly controlled.
  • a sandwich immunoassay for the antigen to be detected is constructed as follows:
  • a) capture antibody is the therapeutic antibody that is immobilized on the microtiter plate or biochip surface.
  • the analyte is the target (protein) that is used as standard or patient sample in the
  • Immunoassay is measured and against which the therapeutic antibody is directed and that with a binding epitope on the capture antibody
  • the detection antibody is a second antibody that is radioactive or
  • Markers can be used in all standard immunoassay procedures (with peroxidase, with alkaline phosphatase, with luminescent or fluorescent labels).
  • the assay of the invention works like other common sandwich assays.
  • the special feature lies in the measurement of the samples (patient sera). If a patient has received therapeutic antibodies as part of a treatment, in the assay of the therapeutic antibodies in the sample (eg in serum) competes with the immobilized therapeutic antibody for binding to the target protein. It is essential that the incubation time of sample and standard be kept as short as possible, preferably 15-30 minutes. Furthermore, it must be removed before the addition of the signal antibody of all not bound to the capture antibody excess, preferably by washing. Thereafter, the remaining antigen to be measured can be only the free antigen that was not bound by the therapeutic antibody in the sample. After determining this value, it can be decided whether a higher administration of the therapeutic antibody to the patient for binding the target protein is necessary.
  • Patient serum occur.
  • Microtiter plates biotinylated humanized monoclonal therapeutic antibody Omalizumab (Xolair) (Lot: B188)
  • IgE standard IgE from OEM (compared to WHO standard) in 25% FCS
  • Table 2 shows the experimental setup on the microtiter plate and in Table 3 the result of the experiment.
  • MW-NSB averages of the duplicate determinations of absorbances less nonspecific binding (NSB)
  • the blood donor serum "K” was tested and 500 IU IgE / ml were also added and used neat and in dilutions of 1: 2, 1: 4, 1: 5 and 1:10 in the assay Omalizumab sera 022 and 034 were from patients taking Omalizmab therapy.
  • Serum samples 022 and 034 under omalizumab therapy still showed significant
  • Microtiter plates biotinylated humanized monoclonal therapeutic antibody
  • TNF- ⁇ standard TNF- ⁇ from RCMDT Moscow (compared with WHO standard) in 25% FCS (fetal calf serum)
  • Assay buffer 0.05M PBS, pH 7.2 + 0.01% casein + 0.02% merthiolate
  • Table 5 shows the experimental setup on the microtiter plate and in Table 6 the result of the experiment.
  • MW averages of the duplicate determinations of extinctions.
  • therapeutic antibody omalizumab is evaluated with the assay of Example 1. This results in a value of 123 IU / ml for the free IgE.
  • the aim is a value below 21 IU / ml. It can be deduced that treatment with the therapeutic antibody must be continued until a value below 21 IU / ml is reached.

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Abstract

Die Erfindung hat das Ziel, das Monitoring von therapeutischen Antikörpern bei der Behandlung schwerer Erkrankungen (Asthma, Rheuma, Tumore) zu verbessern. Die Aufgabe der Erfindung bestand darin, unabhängig vom Recovery-Immuno-Assay eine Bestimmungsmethode zu finden, mit der man das Freie Target (Antigen) eines therapeutischen Antikörpers bestimmen kann. Es wird ein Sandwich-Immunassay aufgebaut, mit dem man nur das freie Targetprotein bestimmt, das vom therapeutischen Antikörper, der gegen dieses Target gerichtet ist, nicht gebunden wurde (Free Target Immunoassay). Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.

Description

Immunoassay zur Bestimmung des freien Targets (Antigen) in Proben, gegen das ein therapeutischer Antikörper gerichtet ist (Free Target Immunoassay)
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf einen Immunoassay zur Bestimmung des freien Targets (Antigen) in Proben, gegen das ein therapeutischer Antikörper gerichtet ist (Free Target Immunoassay) als Monitoring bei der Anwendung des therapeutischen Antikörpers als Arzneimittel. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische Diagnostik, die Therapiekontrolle und die pharmakologische Forschung.
Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:
A) Zum Immunoassay
Der Immunoassay ist eine sehr verbreitete Technik zur Bestimmung unbekannter Konzentrationen analytisch oder diagnostisch relevanter Stoffe (Analyt) in
Probenmaterial wie Serum, Plasma, Gewebsproben, Rückstandspräparationen, Überstände von Zellkulturen und ähnlichem.
Die Immunoassays (Radioimmunoassays(RIA), Enzymimmunoassays (EIA),
Lumineszenzimmunoassays(LIA) und damit verwandte Assayvarianten) basieren darauf, dass eine Analytkonzentration als Standard vorgeben wird und für diese nach Reaktion mit einem Antikörper unter Einbeziehung einer markierten Verbindung (eines markierten Antigens oder Antikörpers) die Response des gebundenen markierten Antigens oder Antikörpers (Impulsrate, Extinktion, Relative Light Units) bestimmt wird. Der Zusammenhang zwischen Response und Analytkonzentration des Standards wird in Form einer Standardkurve mittels mathematischer Eichfunktion oder graphisch beschrieben.
Die Analytkonzentration unbekannter Proben wird unter Verwendung der nach der Analytkonzentration umgeformten Eichfunktion aus der Response der unbekannten Probe errechnet oder wird an der graphisch erstellten Standardkurve abgelesen. Bei der Eichung mit Hilfe einer Standardkurve werden gewöhnlich zur Vermeidung der Beeinflussung der Messung durch Fremdstoffe besondere Vorbehandlungen der Proben (z.B. Extraktionen, Zugabe von Zusatzstoffen) oder der Assaykomponenten (Einbringung der Standards in 0-Seren, Proteinzusätze u.a.m.) vorgenommen. Mit Wiederfindeexperimenten wird die Richtigkeit der Bestimmungen an den so modifizierten Assaykomponenten oder Proben geprüft. Softwarepakete an den
Messgeräten (Gamma-Counter, Extinktions-Reader, Lumineszenz-Messgeräte), die die Immunoassay-Auswertung übernehmen, sind Standardausstattung von Immunoassay- Forschungs- und Routinelabors geworden. Darüber hinaus sind Immunoassay-
Laborautomaten verschiedenster Hersteller auf dem Markt, die sowohl die Abarbeitung eines Immunoassays als auch seine Messung und Auswertung in einem Automaten vereinen. Allen diesen Auswerte-Software-Paketen und Labor-Automaten liegt o.g. Eichverfahren zugrunde, wenn auch heute, auf Grund der besseren Beherrschung der Assaytechnik, gespeicherte Eichfunktionen für mehrere Assayläufe oder auf zwei Standardkonzentrationen reduzierte Eichgeraden üblich geworden sind (1 ,2).
B) Therapieantikörper
Es sind in den letzten Jahren eine Reihe von Therapieantikörpern entwickelt worden bzw. befinden sich noch in der Entwicklung. Sie sind vorwiegend auf die Behandlung von Entzündungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs ausgerichtet. Viele dieser Therapieantikörper sind zwar ursprünglich als monoklonale Antikörper erzeugt, die meisten von ihnen sind jedoch zur Vermeidung der Immunabwehr des Patienten gegen den Therapieantikörper gentechnisch in humane Antikörper umgewandelt worden. Einige von ihnen sind Chimeren von humanen und monoklonalen Antikörpern oder sogar nur monoklonale Antikörper.
Tabelle 1 zeigt eine Auswahl von Therapieantikörpern, die bereits als Arzneimittel zugelassen sind. Diese Therapieantikörper sind gegen krankheitsspezifische humane Proteine gerichtet.
C) Recovery-Immunoassay
Um die Wirkungsweise dieser Therapieantikörper zu überprüfen, wurde das Konzept des Recovery-Immunoassay entwickelt. Der Recovery-Immunoassay geht von einem gewöhnlichen Sandwich-Immunoassay aus. In einem richtig bestimmenden Sandwich- Immunoassay, bei dem der Therapieantikörper in markierter Form als
Nachweisantikörper oder Fängerantikörper verwendet wird, bewirkt die Anwesenheit des Therapieantikörpers in Proben eine systematische Verringerung der Wiederfindung des zu bestimmenden Antigen, die mit der Konzentration des Therapieantikörpers korreliert. Diese Korrelation wird zur Bestimmung der unbekannten Konzentration des Therapieantikörpers und zur Bestimmung der freien und totalen Antigenkonzentration genutzt. Aus diesem Grund kann dieser Immunoassay auch kurz Wiederfinde- Immunoassay oder Recovery-Immunoassay genannt werden (4).
Figure imgf000004_0001
Tabelle 1 : Zugelassene therapeutische Antikörper als Arzneimittel in Deutschland [5] Grundprinzip der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, das Monitoring von therapeutischen Antikörpern bei der Behandlung schwerer Erkrankungen (Asthma, Rheuma, Krebs) zu verbessern.
Die Erfindung bestand darin, unabhängig vom Recovery-Immuno-Assay eine
Bestimmungsmethode zu finden, mit der man das Freie Target (Antigen) eines therapeutischen Antikörpers bestimmen kann.
Es wird ein Sandwich-Immunassay aufgebaut, mit dem man nur das freie Targetprotein bestimmt, das vom therapeutischen Antikörper, der gegen dieses Target gerichtet ist, nicht gebunden wurde (Free Target Immunoassay). Da das Ziel der Therapie die Eliminierung des krankheitsverursachenden Targetproteins durch Bindung an den therapeutischen Antikörper ist, resultiert daraus, dass man die Konzentration des ungebunden (freien) Targetproteins im Blut bis zu einem therapeutisch sinnvollem Limit durch Antikörpergabe minimieren möchte. Dieser ungebundene (freie) Rest des
Targetproteins wird durch den Free Target Immunoassay bestimmt. Auf diese Weise kann die Wirkung des therapeutischen Antikörpers indirekt kontrolliert werden.
Um das zu erreichen, wird erfindungsgemäß für das nachzuweisende Antigen ein Sandwichimmunoassay wie folgt aufgebaut:
a) Fängerantikörper ist der therapeutische Antikörper, der an der Mikrotiterplatte oder Biochipoberfläche immobilisiert wird.
b) Der Analyt ist das Target (Protein), das als Standard oder Patientenprobe im
Immunoassay gemessen wird und gegen das der therapeutische Antikörper gerichtet ist und das mit einem Bindungsepitop am Fängerantikörper
(immobilisierter therapeutischer Antikörper) bzw. in der Serumprobe befindlichen therapeutischen Antikörper bindet.
c) Der Nachweisantikörper ist ein zweiter Antikörper, der radioaktiv oder
nichtradioaktiv markiert ist und den Analyten an einem anderen Bindungsepitop als der therapeutische Antikörper bindet (Signalantikörper). Als nichtradioaktive
Markierungen können alle im Immunoassay üblichen Verfahren (mit Peroxydase, mit alkalischer Phosphatase, mit Luminiszenz- oder Fluoreszenzlabeln) benutzt werden.
Bezüglich der Standards arbeitet der erfindungsgemäße Assay wie andere gewöhnliche Sandwichassays. Die Besonderheit liegt in der Messung der Proben (Patientenseren). Falls ein Patient im Rahmen einer Behandlung Therapieantikörper erhalten hat, konkurriert im Assay der Therapieantikörper in der Probe (z. B. im Serum) mit dem immobilisierten Therapieantikörper um die Bindung an das Targetprotein. Es ist wesentlich, dass die Inkubationszeit von Probe und Standard möglichst kurz gehalten wird, vorzugsweise 15-30 Minuten. Ferner muss vor der Zugabe des Signalantikörpers aller nicht am Fängerantikörper gebundene Überschuss entfernt werden, vorzugsweise durch waschen. Danach kann das noch verbleibende, zu messende Antigen nur das freie Antigen sein, dass vom Therapieantikörper in der Probe nicht gebunden wurde. Nach Bestimmung dieses Werts kann entschieden werden, ob eine höhere Gabe des Therapieantikörpers an den Patienten zur Bindung des Targetproteins notwendig ist.
Hamilton R. G. et al. (3) haben ein alternatives Verfahren zur Bestimmung des freien IgE als Target für den Therapieantikörper Omalizumab beschrieben. Dieser Ansatz ist jedoch auf IgE beschränkt, während der beschriebene erfindungsgemäße Free Target Immunoassay für alle Targetproteine von Therapieantikörpern gilt, die im
Patientenserum vorkommen.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist eine Therapiekontrolle bei allen im Blut vorkommenden Targets beispielsweise bei dem Einsatz von Omalizumab bei allergischem Asthma oder Adalimumab bei Rheuma und anderen
Autoimmunerkrankungen sehr einfach durchzuführen.
Nachfolgende 2 Beispiele sollen das Verfahren näher erläutern:
Beispiel 1 :
Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten zur Bestimmung des freien IgE in Patientenseren bei Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper Omalizumab
Material:
1. Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Standard-Biotin-Bindungskapazität (SC-Beschichtung)
2. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin-beschichteten
Mikrotiterplatten: biotinylierter humanisierter monoklonaler Therapieantikörper Omalizumab (Xolair) (Lot: B188)
3. IgE-Standard: IgE von OEM (abgeglichen mit WHO-Standard) in 25 % FKS
(Fötales Kälberserum) 4. Nachweiskonjugat: anti-hlgE-POD (Clone E-411 , Lot: PD06)
5. Assaypuffer: 0.05M PBS, pH=7.2 + 0.1% RSA + 0.02% Merthiolat
6. Waschlösung: 0.01 M PBS, pH=7.2 / 0.1% RSA + 0.1% Tween 20
7. Enzymsubstrat: Tetramethylbenzidin (TMB, Fa. DRG, Lot: HS119)
8. Stopplösung: 5M Schwefelsäure
In Tabelle 2 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte dargestellt und in Tabelle 3 das Ergebnis des Versuchs.
Versuchsablauf:
1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Kavitäten der Mikrotiterplatte.
Zugabe von 100 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml). Inkubation über Nacht, 4° C
2. Am nächsten Tag 2 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
3. IgE-Standardreihe 0 / 15,6 / 31 ,3 / 62,5 / 125 / 250 / 500 /1000 IU/ml (20 μl
Standard + 80 μl 25 % FKS in Assaypuffer. Zugabe entsprechend Tabelle 2
(Spalten 1-2 (Duplikat) und Reihen A-H)
4. Patientenproben (20 μl Serum + 80 μl Assaypuffer). Zugabe entsprechend Tabelle 2 (Spalten 3-4 (Duplikat) und Reihen A-H)
5. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
6. 2 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
7. Zugabe des Nachweiskonjugats (PD06, 500 ng/ml, 100 μl) in alle Kavitäten.
8. Inkubation: 15 Minuten bei Raumtemperatur
9. 3 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
10. Enzymnachweis durch Zugabe von 100 μl Tetramethylbenzidin und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 25 μl Stopplösung
11. Messung der Extinktion im Mikrotiterplattenreader
Figure imgf000008_0001
Tabelle 2: IgE-ELISA: Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte
Figure imgf000008_0002
MW-NSB: Mittelwerte der Doppelbestimmungen der Extinktionen abzüglich der unspezifischen Bindung (NSB)
Tabelle 3: IgE-ELISA, Ergebnis des Versuchs
Die Standardkurve wird mittels nichtlinearer Regression und der Funktion y=ax/(b+x) angepasst, wobei y = Extinktion-NSB und x = IgE-Konzentration in IU/ml,
a, b: Regressionsparameter
Ergebnis: y = 6,014x/(1096,484+x) (Formel 1)
mit einem Bestimmtheitsmaß von 99,999 %.
Mit der Umkehrfunktion von Formel 1.
x = 1096,484y/(6,014-y) (Formel 2)
werden nun die Standards rekalkuliert (aus y berechnet) und die unbekannten Proben aus y bestimmt. Das Auswerteergebnis ist in Tabelle 4 dargestellt.
Figure imgf000009_0001
Tabelle 4: IgE-ELISA: Auswerteergebnis des Versuchs
Erläuterungen:
Es wurde das Blutspenderserum„K" getestet, dem außerdem 500 IU IgE/ml zugesetzt wurde, und das unverdünnt und in Verdünnungen von 1 :2, 1 :4, 1 :5 und 1 :10 im Assay eingesetzt worden ist. Es enthielt kein Omalizumab. Die Seren 022 und 034 waren von Patienten unter Omalizmab-Therapie.
Die Verdünnungsstufen des Serums„K" , aufgestockt mit 500 IU IgE/ml, wurden linear im Assay wiedergefunden.
Die Serumproben 022 und 034 unter Omalizumab-Therapie zeigten noch signifikante
Reste von freiem IgE (42 und 123 IU IgE/ml).
Beispiel 2:
Enzymimmunoassay auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten zur Bestimmung des freien TNF-α in Patientenseren bei Behandlung mit dem therapeutischen
Antikörper Adalimumab
Material:
1. Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten, Beschichtungsverfahren der BioTeZ Berlin-Buch GmbH für Standard-Biotin-Bindungskapazität (SC-Beschichtung)
2. Fängerantikörper zur Immobilisierung an den Streptavidin-beschichteten
Mikrotiterplatten: biotinylierter humanisierter monoklonaler Therapieantikörper
Adalimumab (Humira) (Lot: B381)
3. TNF-α-Standard: TNF-α von RCMDT Moskau (abgeglichen mit WHO-Standard) in 25 % FKS (Fötales Kälberserum)
4. Nachweiskonjugat: anti-TNF-POD (Clone A - 11 , Lot: P228)
5. Assaypuffer: 0.05M PBS, pH=7.2 + 0.01 % Casein + 0.02% Merthiolat
6. Waschlösung: 0.01 M PBS-Puffer, pH=7.2 / 0.1 % RSA + 0.1 % Tween 20
7. Enzymsubstrat: Tetramethylbenzidin (TMB, Fa. DRG1 Lot: HS1 19)
8. Stopplösung: 5M Schwefelsäure
In Tabelle 5 ist der Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte dargestellt und in Tabelle 6 das Ergebnis des Versuchs.
Versuchsablauf:
1. Immobilisierung des Fängerantikörpers in allen Kavitäten der Mikrotiterplatte.
Zugabe vom 100 μl Fängerantikörperlösung (4 μg/ml). Inkubation über Nacht, 4° C 2. Am nächsten Tag 2 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
3. TNFα-Standardreihe 0 / 7,8 / 15,6 / 31 ,3 / 62,5 / 125 / 250 / 500 ng/ml (20 μl Standard + 80 μl 25 % FKS in Assaypuffer). Zugabe entsprechend Tabelle 5 (Spalten 1-2 (Duplikat) und Reihen A-H)
4. Patientenproben (20 μl Serum + 80 μl Assaypuffer). Zugabe entsprechend
Tabelle 5 (Spalten 3-4 (Duplikat) und Reihen A-H)
5. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
6. 2 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well)
7. Zugabe des Nachweiskonjugat (P228, 25 ng/ml, 100 μl) in alle wells.
8. Inkubation: 30 Minuten bei Raumtemperatur
9. 3 x Waschen im MTP-Washer mit Waschlösung (300 μl/well) 10. Enzymnachweis durch Zugabe von 100 μl Tetramethylbenzidin und Abstoppen der Enzymreaktion nach 30 min mit 25 μl Stopplösung
11. Messung der Extinktion im Mikrotiterplattenreader
12.
Figure imgf000011_0001
Tabelle 5: TNFα-ELISA, Versuchsaufbau auf der Mikrotiterplatte
Figure imgf000011_0002
MW = Mittelwerte der Doppelbestimmungen der Extinktionen.
Tabelle 6: TNFα-ELISA, Ergebnis des Versuchs
Die Standardkurve wird mittels nichtlinearer Regression und der Funktion y=ax/(b+x) angepasst, wobei y = Extinktion und x = TNF-α-Konzentration in ng/ml,
a, b: Regressionsparameter
Ergebnis: y = 2,855x/(113,6+x) (Formel 3)
mit einem Bestimmtheitsmaß von 99,7 %.
Mit der Umkehrfunktion von Formel 3.
x = 113,6y/(2,855-y) (Formel 4)
werden nun die unbekannten Proben aus y bestimmt. Das Auswerteergebnis ist in Tabelle 7 dargestellt.
Figure imgf000012_0001
Tabelle 7: TNFα-ELISA, Auswerteergebnis des Versuchs
Erläuterungen:
Die Patienten standen unter Adalimumab-Therapie. Ausnahme sind die Proben C-1464 und C-1468 (Keine Adalimumab-Therapie).
In den Seren C-1345 und C-1359 waren die Spiegel an freiem TNF-α deutlich abgesenkt (nahe der Nachweisgrenze). In den Seren C-1434, C-1442, C-1413 und C- 1421 wurden noch signifikant leicht erhöhte Spiegel an freiem TNF-α gemessen.
Beispiel 3
Die Serumprobe eines Patienten mit allergischem Asthma, der mit dem
therapeutischen Antikörper Omalizumab behandelt wurde, wird mit dem Assay gemäß Beispiel 1 untersucht. Es ergibt sich ein Wert von 123 IU/ml für das freie IgE.
Angestrebt wird ein Wert unter 21 IU/ml. Daraus ist abzuleiten, dass die Behandlung mit dem therapeutischen Antikörper fortgesetzt werden muss, bis ein Wert unter 21 I U/ml erreicht ist.
Literatur
(1) Rodbard D., Ratford P.L., Cooper J. and Ross G.T. (1968). Statistical quality control of radioimmunoassays. J. Clin. Endocrinol. Metab. 29, 352.
(2) Goldberg M.E. and Djavadi-Ohaniance L. (1993). Methods for measurement of antibody/antigen affinity based on ELISA and RIA.
Current Opinion in Immunology 5, 278.
(3) Hamilton R.G., MarcotteG.V., Saini S.S.: Immunological methods for
quantifying free and total serum Ige levels in allergy patients receiving
omalizumab (Xolair) therapy. J. Immunol. Methods. 2005, 303 (1-2):81-91
(4) Strohner, Pavel : Immunoassay zur simultanen immunchemischen Bestimmung eines Analyten (Antigen) und eines gegen den Analyten gerichteten
Therapieantikörpers in Proben (Recovery Immunoassay), WO 2007/06628
(5) Paul-Ehrlich-Institut, www.pei.de

Claims

Patentansprüche
1. Sandwich-Immunoassay zur Bestimmung des freien Antigens (Target) im
Zusammenhang mit der Anwendung von therapeutischen Antikörpern, bei dem
a) als Fängerantikörper der therapeutische Antikörper verwendet wird, immobilisiert an einer Mikrotiterplatte oder Biochipoberfläche,
b) der Analyt das Target (Protein) ist, das als Standard oder Probe im
Immunoassay gemessen wird und gegen das der therapeutische Antikörper gerichtet ist und das mit einem Bindungsepitop am Fängerantikörper
(immobilisierter therapeutischer Antikörper) bzw. in der Serumprobe befindlichen therapeutischen Antikörper bindet,
c) der Nachweisantikörper ein zweiter Antikörper ist, der radioaktiv oder
nichtradioaktiv markiert ist und an einem anderen Bindungsepitop als der therapeutische Antikörper den Analyten bindet (Signalantikörper).
2. Sandwich-Immunoassay nach Anspruch 1 , in dem die nichtradioaktive Markierung mit Peroxydase, mit alkalischer Phosphatase, mit Lumineszenz- oder
Fluoreszenzlabeln erfolgt.
3. Verfahren zur Verwendung des Sandwich-Immunoassays gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationszeit von Probe und Standard kurz gehalten wird, vorzugsweise 15-30 Minuten.
4. Verfahren zur Verwendung des Sandwich-Immunoassays gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass vor der Zugabe des Signalantikörpers der gesamte nicht am Fängerantikörper gebundene Überschuss entfernt wird, vorzugsweise durch
Waschen.
5. Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 1 für therapeutische Antikörper, deren Target im Blut vorkommt und eliminiert werden soll.
6. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Asthma.
7. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Rheuma.
8. Anwendung des Sandwich-Immunoassay gemäß Anspruch 5 für Tumore.
PCT/DE2010/000795 2009-07-24 2010-07-07 Immunoassay zur bestimmung des freien targets (antigen) in proben, gegen das ein therapeutischer antikörper gerichtet ist (free target immunoassay) WO2011009432A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

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