WO2006037521A1 - Bestimmung von gastrokine 1 (gkn1) als biomarker für entzündungen und infektionen - Google Patents

Bestimmung von gastrokine 1 (gkn1) als biomarker für entzündungen und infektionen Download PDF

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WO2006037521A1
WO2006037521A1 PCT/EP2005/010438 EP2005010438W WO2006037521A1 WO 2006037521 A1 WO2006037521 A1 WO 2006037521A1 EP 2005010438 W EP2005010438 W EP 2005010438W WO 2006037521 A1 WO2006037521 A1 WO 2006037521A1
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sepsis
gkn1
gknl
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PCT/EP2005/010438
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Andreas Bergmann
Joachim Struck
Monika ÜHLEIN
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B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

Definitions

  • Gastrokine ⁇ 1 (GKNl) as a biomarker of inflammation and infection
  • the present invention relates to methods for the diagnostic detection and for the prognosis of the progress and the course and therapy control of inflammations and infections with the participation of the gastrointestinal tract, in particular of the intestine, in which one is indicated for the indica ⁇ indicated tion of novel biomarkers.
  • the invention relates to methods of the type mentioned in which the diagnosed inflammations and infections are part of the complex course of a septic disease (systemic inflammations of infectious etiology, sepsis), or the inflammations part of the course of one of the chronic inflammatory bowel diseases Crohn's disease or ulcerative colitis.
  • inflammations inflammations
  • Injuries burns, allergens, infections by microorganisms such as bacteria and fungi and viruses, on foreign tissues triggering rejection reactions, or on certain inflammatory endogenous conditions of the body, e.g. in autoimmune diseases and cancer.
  • inflammation is part of a misdirected body response to certain endogenous processes, such as e.g. If autoimmune diseases are and / or are of a chronic nature, or if they reach systemic proportions, such as the systemic inflammatory syndrome (SIRS) or severe sepsis due to infectious causes, the inflammations may become the actual disease which, when the physiological processes typical of inflammatory reactions go out of control, such as in SIRS and sepsis, can even become an acute life threat.
  • SIRS systemic inflammatory syndrome
  • sepsis in a comprehensive sense, which in particular includes sepsis, severe sepsis and septic shock, is based on the definitions, as can be seen from the cited publications, for severely ill septic diseases Patients used in intensive care units.
  • PCT procalcitonin
  • Sepsis systemic inflammation of infectious aetiology
  • High levels of procalcitonin are also achieved at a relatively early stage of sepsis, so the determination of procalcitonin is also useful for the early detection of sepsis and the early distinction of infectious sepsis from severe inflammation based on other causes .
  • the determination of procalcitonin as a sepsis marker is the subject of the publication M.Assicot, et al.
  • the present application is the result of another fruitful, purely experimental approach for the search for further sepsis-specific biomolecules. This is based on the fact that by administering an endotoxin or by infection with bacteria in primates (baboons) triggers a disease state as artificial sepsis aus ⁇ and then by comparing the gel electrophoresis protein totespotmuster of endotoxin treated and unbehandel ⁇ th baboons endogenous substances of peptic or proteic nature, which are found only in the "septic" babies and therefore represent potential sepsisspezi ⁇ fische biomarkers.
  • the primate model was chosen because of the very similarities in the physiology of primates and humans and the high cross-reactivity with many therapeutic and diagnostic human reagents.
  • the present invention is based on the fact that in an investigation of the type described using the entire soluble protein of small intestine extracts of baboons infected with the gram-positive bacteria S. pyogenes, one occurs only in the extracts of the infected baboons, However, in healthy babies missing substance was isolated, which - as explained in more detail in the experimental part - as "Gastrokine 1" (GKNl) identified could be.
  • the present invention in its broadest sense relates according to claim 1, the use of Gastrokine 1 Gastrointestinal tract.
  • the claims 4 to 10 relate to preferred method for sepsis diagnosis and 'for the diagnosis of inflammatory bowel diseases and their preferred embodiments.
  • GKNl Gastrokine 1
  • the primary translation product of the GKN1 gene is 185 amino acids (Martin TE et al., A novel mitogenic protein that is highly expressed in cells of the gastric antrum mucosa, J J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003; 285: G332-43).
  • the first 20 N-terminal amino acids apparently represent the signal sequence for the secretion. Deviating from this, it has been postulated by other authors that the trans lation of GKN1 mRNA begins earlier, so that the primary .
  • Translational product would comprise 199 amino acids (Shiozaki K et al., Human stomach-specific gene, CAIl, is down-regulatory). Ted in gastric cancer.
  • BRICHOS a conserved domain in proteins associated with dementia, respiratory distress and cancer, Trends Biochem., 2002, 27: 329-312.
  • ARDS acute respiratory distress syndrome
  • GKNl epithelial cells have been demonstrated to stimulate cell growth and division by GKNl.
  • GKNl apparently acts as a growth factor in the gastric mucosa (Martin TE et al., 2003, supra).
  • Sufficient for this activity is an area of only 21 amino acids from the center of the molecule (Toback FG, et al., Peptide fragments of AMP-18, a novel secreted gastric antrum mucosal protein, are mitogenic and motogenic.)
  • WO 02/092758 and WO 02/078640 and the patent US 6,734,289 B2 relate to therapeutic applications of GKN1, its fragments or inhibitors.
  • WO 00 / 61623A1 lists cDNA sequences of 62 as secreted postulated proteins; one of these cDNAs can be assigned to GKNl.
  • WO 00 / 00610A2 lists a large number of signal sequence peptides, among which GKNl is found.
  • WO 01/93983 relates to antibodies against i.a. GKNl and the tumor detection by measuring the expression level in Zel ⁇ len.
  • WO 02/00690 relates to antibodies to u.a. GKNl.
  • a connection between GKN1 and infections / inflammations or sepsis is not produced in any of the cited patent applications.
  • GKNl is a protein with a signal sequence that allows its secretion into the extracellular space. GKNl is therefore found extracellularly in the gastric mucosa. However, it is to be expected that in inflammation / sepsis GKN1 or pathophysiologically occurring GKN1 fragments, splicing variants and / or post-translationally modified forms of GKN1 with GKN1 immunoreactivity can also be detected in body fluids, in particular also in the circulation.
  • the present invention is directed to the determination of GKNl or fragments pathophysiologically occurring, splicing variants and / or post-translationally modified forms of GKNl with GKNl immunoreactivity as a humoral biomarker, which in particular also in serum and / or plasma is determinable.
  • GKN1 protein spot identified as GKN1 was only found in the small intestinal extracts of those baboons that had been infected with gram-positive bacteria (S. pyogenes) but not in those infected with LPS E.coli. It may be possible that the presence of GKN1 is specific for infections with gram-positive bacteria, and the detection of GKN1 can therefore be used for differential diagnostic purposes (as an indication of the type of sepsis-triggering infection).
  • the determination of GKN1 in the biological fluids preferably takes place with the aid of immunodiagnostic determination methods (ligand binding assays, immunoassays).
  • any ligand binding assays / immunoassays operating according to known principles can be used for the quantitative or semiquantitative determination of GKN1 in biological fluids, in particular those from circulation such as serum or plasma ,
  • the method is carried out as a heterogeneous sandwich immunoassay, in which a first GKN1-binding antibody to any Fest ⁇ phase, for example, the walls of coated test tubes (eg, polystyrene, "Coated Tubes", CT) or to microtiter terplatten , for example polystyrene, or is immobilized on particles, for example magnetic particles, while another antibody specific for GKN1 carries a residue which constitutes a directly detectable label or allows selective linkage with a label and serves to detect the sandwich structures formed. Also a delayed or subsequent immobilization using suitable solid phases is possible.
  • a first GKN1-binding antibody to any Fest ⁇ phase for example, the walls of coated test tubes (eg, polystyrene, "Coated Tubes", CT) or to microtiter terplatten , for example polystyrene, or is immobilized on particles, for example magnetic particles, while another antibody specific for GKN1 carries a residue which constitutes
  • the method for the determination of GKN1 can, for example, also be carried out using a homogeneous detection method in which sandwich complexes formed from two antibodies and the GKNI to be detected remain suspended in the liquid phase.
  • a homogeneous detection method in which sandwich complexes formed from two antibodies and the GKNI to be detected remain suspended in the liquid phase.
  • Such techniques can be designed in particular as fluorescence amplification or fluorescence extinction detection methods.
  • a particularly preferred method of this type relates to the use of detection reagents to be used in pairs, as described, for example, in US Pat. No. 4,822,733, EP-Bl-180 492 or EP-B1- 539 477 and the state cited therein Technology.
  • the occurrence is - i.S. a detectable expression - coupled from GKNl in cytoplasmic small intestine extracts to a preceding "sepsis" -auslös ⁇ the endotoxin stimulus or a preceding infection gekop ⁇ pelt.
  • a detectable expression - coupled from GKNl in cytoplasmic small intestine extracts to a preceding "sepsis" -auslös ⁇ the endotoxin stimulus or a preceding infection gekop ⁇ pelt.
  • GKN1 therefore represents a potential sepsis marker, and this marker, on the basis of its infection-specific occurrence, which has hitherto only been detected in small intestine cells, suggests, if it can be detected in septic patients, that the infection / inflammation / sepsis is due to the infection gastrointestinal tract, especially the intestine.
  • GKN1 as a bowel-specific inflammatory marker can also be used in chronic inflammatory bowel diseases (inflammatory bowel diseases) or acute episodes of such diseases and can be used for diagnostic purposes or, in particular, for course and therapy control.
  • FIG. 1 shows an enlarged detail of two 2D electrophoresis gels, which compare the spot pattern of cytoplasmic small intestine proteins of a healthy baboon (A) with the baboon small intestine proteins 6 h after injection of Gram-positive bacteria (S. pyogenes) induced sepsis (B).
  • the arrow indicates the position of the sepsis-specific product of the present invention identified as GKN1. It is highlighted by a circle in illustration (B).
  • samples 1.5 g each of the individual frozen tissue were subjected to nitrogen cooling with 3 ml buffer A (50 mM HEPES, pH 7.1, 50 mM NaCl, 20% glycerol, 250 ⁇ M leupeptin, 100 ⁇ M amastatin, 1 mM Pefabloc ) and powdered into a flour in a porcelain mortar (see J. Klose, "Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and Human for 2-D Electrophoresis", Methods in Molecular Biology, Vol. 112: 2-D Proteome Analysis Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ).
  • buffer A 50 mM HEPES, pH 7.1, 50 mM NaCl, 20% glycerol, 250 ⁇ M leupeptin, 100 ⁇ M amastatin, 1 mM Pefabloc
  • the samples were treated 6 x water bath for 10 seconds in an ultrasonic, and the suspension for 40 min at 100,000 g and centrifuged +4 0 C.
  • the resulting first cytosolic supernatant was removed, the remaining pellet resuspended in buffer A and as described above again sonicated and centrifuged.
  • the resulting second supernatant was combined with the first supernatant and stored at -80 ° C. until further processing.
  • Cytoplasmic small intestine protein extracts from on the one hand healthy baboons (control infused with NaCl) and, on the other hand, baboons injected with LPS E. coli or S. pyogenes were used in a proteome analysis.
  • small intestine extract containing 100 ⁇ g of protein was adjusted to 9M urea, 70 mM DTT, 2% ampholyte, pH 2-4 and then fractionated by analytical 2D gel electrophoresis, as described in J. Klose , et al.
  • the protein spot patterns of the controls were compared with the protein spot patterns resulting from tissue from sepsis-induced animals.
  • FIG. 1 shows a comparison of the 2D region for a control sample (A) and a sample of a treated animal (B), wherein the additional protein spot in (B) corresponds to the GKN1 protein, its position in the gel being indicated by an arrow and a circle - is lifted.
  • the protein spots preselected for further analysis were excised from the gel using the method described in A. Otto, et al., "Identification of human myocardial proteins separated by two-dimensional electrophoresis using an effective sample preparation for mass spec - trometry ", Electrophoresis 1996, 17, 1643-1650; cleaved with trypsin, and the generated peptides were analyzed by mass spectrometry, using mass spectrometry studies, such as. Neubauer, et al., "Mass spectrometry and EST-databased searching allows characterization of the multi-protein spliceosomal complex", in: Nature Genetics Vol. 20, 1998, 46-50; J.
  • the trypsin-digested samples were subjected to tandem mass spectrometry by means of ESI (Electrospray Ionization).
  • ESI Electronization
  • a Dionex Nano-LC system was used in combination with a QSTAR ESI-MS / MS mass spectrometer the company Applied Biosystems ABI. It was worked according to the instructions of the device manufacturer.
  • This protein was analyzed by mass spectrometry as described above after tryptic digestion.
  • a database search of the measured peptides in the NCBInr database 20031016 mammalian sequences, using the software Mascot http: //www.matrixscience. com / search_form_select .html could be assigned to the found protein.
  • the database search supplies a suggestion list of the proteins found with evaluation numbers (score list, probability based mowse score). Peptides whose individual score is> 50 are with a probability of p ⁇ 0.05, i. 95%, considered to be unequivocally identified.
  • CAIl Gastrokine 1
  • Human GKN1 whose complete sequence is known (SEQ ID NO: 1), after deduction of the signal sequence has a theoretical pI of 5.3, which is significantly more acidic than experimentally observed for the baboon protein.
  • the complete The amino acid sequence for the baboon protein is not known in the literature, so that the theoretical value for it can not be calculated.
  • porcine GKN1 (Swiss-Prot No. Q8HYA9) - an evolutionarily close relative of human and baboon - has a theoretical pI of 8.3 having.
  • the peptide fragment GLMYSVNPNKVDDLSK (SEQ ID NO: 3) is therefore to be regarded as unequivocally identified. Since, according to the database research, it only resides in proteins which correspond to the human GKN1, it can be assumed that the baboon protein found only in the infected animals is the protein corresponding to the human GKN1, which has an identical sequence at least in the identified sequence part , Owing to the high similarity of the pathophysiological reactions of baboons and humans, which has repeatedly been demonstrated in numerous of the Applicant's numerous studies discussed above, which are based on the results of an artificially induced sepsis in baboons, it can be assumed that that in infected or septic human patients substantially identical conditions occur as in the described baboon animal model.

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Abstract

Verwendung von Gastrokine 1 (GKN1; SEQ ID NO:1) als humo­raler Biomarker zum diagnostischen Nachweis und für die Ver­laufsprognose sowie die Verlaufs- und Therapiekontrolle von Entzündungen und Infektionen.

Description

Bestimmung von Gastrokine ■ 1 (GKNl) als Biomarker für Entzündungen und Infektionen
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum diagnosti¬ schen Nachweis und für die Verlaufsprognose sowie die Ver¬ laufs- und Therapiekontrolle von Entzündungen und Infek¬ tionen unter Beteiligung des Magen-Darm-Trakts, insbesondere des Darms, bei denen man einen für die angegebenen Indika¬ tionen neuartigen Biomarker bestimmt. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren der genannten Art, bei denen die diagnostizierten Entzündungen und Infektionen Teil des komplexen Verlaufs eines septischen Krankheitsgeschehens (systemischer Entzündungen infektiöser Ätiologie; Sepsis) sind, oder die Entzündungen Teil des Verlaufs einer der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel diseases) Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa sind.
In der folgenden Beschreibung werden dabei Begriffe wie "Diagnostik" oder "diagnostisch" grundsätzlich als verein¬ fachende Oberbegriffe verwendet, die, wenn sich aus dem Zusammenhang nichts anderes ergibt, auch speziellere Diffe- renzialdiagnostik und Anwendungen zur Prognostik/Frühprogno¬ stik und Verlaufs- und Therapiekontrolle der diskutierten Erkrankungen einschließen sollen. Die vorliegende Erfindung hat ihren Ausgangspunkt in inten¬ siven Forschungsarbeiten der Anmelderin im Zusammenhang mit weiteren Verbesserungen der Diagnose und Therapie von Sep¬ sis .
Zwischen Sepsis und Entzündungen besteht ein wissenschaft¬ licher Sach- und Definitions-Zusammenhang. Als Entzündungen (Inflammationen) werden ganz allgemein bestimmte physiologi¬ sche Schutzreaktionen eines Organismus auf verschiedenartige äußere Einwirkungen wie z.B. Verletzungen, Verbrennungen, Allergene, Infektionen durch Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze und Viren, auf Fremdgewebe, die Abstoßungsreaktio¬ nen auslösen, oder auf bestimmte entzündungsauslösende endo¬ gene Zustände des Körpers, z.B. bei Autoimmunerkrankungen und Krebs, bezeichnet.
Wenn Entzündungen Teil einer fehlgeleiteten Reaktion des Körpers auf bestimmte endogene Vorgänge wie z.B. bei Auto¬ immunerkrankungen sind und/oder chronischer Natur sind, oder wenn sie systemische Ausmaße erreichen, wie beim systemi¬ schen InflammationsSyndrom (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) oder bei einer auf infektiöse Ursachen zurückzuführenden schweren Sepsis, können die Entzündungen zum eigentlichen Krankheitsgeschehen werden, die dann, wenn die für Entzündungsreaktionen typischen physiologischen Vorgänge außer Kontrolle geraten, wie bei SIRS und Sepsis, sogar zu einer akuten Lebensbedrohung werden können.
Bei systemischen Entzündungen wie im Falle einer Sepsis bzw. des septischen Schocks weiten sich die entzündungsspezifi¬ schen Reaktionskaskaden unkontrolliert auf den gesamten Körper aus und werden dabei, im Sinne einer überschießenden Immunantwort, lebensbedrohlich. Zu den gegenwärtigen Kennt¬ nissen über das Auftreten und die mögliche Rolle einzelner Gruppen endogener entzündungsspezifischer Substanzen wird beispielsweise verwiesen auf A.Beishuizen, et al . , "Endoge- nous Mediators in Sepsis and Septic Shock" , Advances in Clinical Chemistry, Vol.33, 1999, 55-131; und C.Gabay, et al . , "Acute Phase Proteins and Other Systemic Responses to Inflammation" , The New England Journal of Medicine, Vol.340, No.6, 1999, 448-454. Da sich das Verständnis von Sepsis, und damit auch die anerkannten Definitionen, in den letzten Jahren gewandelt haben und verfeinert wurden, wird außerdem verwiesen auf K.Reinhart, et al . , "Sepsis und septischer Schock", in: Intensivmedizin, Georg Thieme Verlag, Stutt¬ gart.New York, 2001, 756-760; wo eine moderne Definition des Sepsis-Begriffes gegeben wird, sowie insbesondere auch auf Mitchell M. Levy et al . , "2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definition Conference", in: Crit Gare Med 2003, Vol. 31, No.4, 1250-1256. Zur Bedeutung des Krank¬ heitsbilds "schwere Sepsis" wird ferner verwiesen auf Niels C. Riedemann et al . , The enigma of sepsis, J.Clin. Invest. 112:460-467 (2003) . Eine jüngere Zusammenfassung der Krite¬ rien und Definitionen für eine Sepsis und eng verwandte Krankheitsbilder findet sich auch unter http://www.tales¬ sin,de/scripte/medizin/sepsisl .html . Im Rahmen der vorlie¬ genden Anmeldung wird der Begriff Sepsis in einem umfassen¬ den Sinne, der insbesondere Sepsis, schwere Sepsis und Septischen Schock umfaßt, in Anlehnung an die Definitionen, wie sie den genannten Veröffentlichungen entnommen werden können, für septische Krankheitsbilder von schwer erkrankten Patienten auf Intensivstationen verwendet.
Während wenigstens im europäischen Raum die durch eine positive Blutkultur nachweisbare systemische bakterielle Infektion lange den Sepsisbegriff prägte, wird die Sepsis heute in erster Linie als systemische Entzündung verstanden, die infektiöse Ursachen hat, als Krankheitsgeschehen jedoch große Ähnlichkeiten mit systemischen Entzündungen aufweist, die durch andere Ursachen ausgelöst werden.
Dem genannten Wandel des Sepsis-Verständnisses entsprechen Veränderungen der diagnostischen Ansätze. So wurde der direkte Nachweis bakterieller Erreger durch komplexe Über- wachungen von Laborparametern und hämodynamisehen Parametern unter Anwendung computergestützter sog. Score-Systeme (z.B. APACHE II SCORE; APACHE steht für "Acute Physiology and Chronic Health- Evaluation" ; vgl. G.Pilz et al . , Kranken¬ pflege-Journal 29 (1991), S.483-492 oder die Einleitung des Patents DE 42 27 454 Cl) sowie in jüngerer Zeit insbesondere auch durch den Nachweis bestimmter am Sepsisgeschehen bzw. am Entzündungsgeschehen beteiligter endogener Substanzen, d.h. spezifischer "Biomarker", ersetzt bzw. ergänzt.
Von der großen Zahl von Mediatoren und Akutphasenproteinen eignen sich dabei für diagnostische Zwecke insbesondere solche, deren Auftreten sehr spezifisch für Sepsis bzw. bestimmte Phasen einer Sepsis ist, deren Konzentrationen sich drastisch und diagnostisch signifikant verändern und die außerdem die für Routinebestimmungen erforderlichen Stabilitäten aufweisen und hohe Konzentrationswerte errei¬ chen. Für diagnostische Zwecke steht dabei die zuverlässige Korrelation von Krankheitsgeschehen (Sepsis) mit dem jewei¬ ligen Biomarker im Vordergrund, ohne dass dessen Rolle in der komplexen Kaskade der am Sepsisgeschehen beteiligten endogenen Substanzen stets im einzelnen bekannt, sein muss. Es besteht jedoch ein zunehmendes Interesse daran, neue besondere Biomarker zu ermitteln, die im Sinne einer "Stra- tifizierung" (auch) eine Zuordnung der Sepsispatienten zu Gruppen mit verwandten Krankheitsursachen oder einem ähn¬ lichen zu erwarteten Krankheitsverlauf ermöglichen, so dass aus denii Spektrum der möglichen therapeutischen Maßnahmen die geeignetsten zur Anwendung gebracht werden können. Es kann in diesem Zusammenhang ergänzend verwiesen werden auf John C. Marshall et al . , Grit Care Med 2003, VoI 31, No.5, 1560- 1567.
Eine etablierte, als Sepsis-Biomarker besonders geeignete endogene Substanz ist Procalcitonin (PCT) . Procalcitonin ist ein Prohormon, -dessen Serum-Konzentrationen unter den Bedin¬ gungen einer systemischen Entzündung infektiöser Ätiologie (Sepsis) sehr hohe Werte erreichen, während es bei Gesunden so gut wie nicht nachweisbar ist. Hohe Werte an Procalcito- nin werden außerdem in einem relativ frühen Stadium einer Sepsis erreicht, so dass sich die Bestimmung von Procal- citonin auch zur Früherkennung einer Sepsis und zur frühen Unterscheidung einer infektiös bedingten Sepsis von schweren Entzündungen, die auf anderen Ursachen beruhen, eignet. Die Bestimmung von Procalcitonin als Sepsismarker ist Gegenstand der Veröffentlichung M.Assicot, et al . , "High serum procal¬ citonin concentrations in patients with sepsis and infec- tion", The Lancet, vol.341, No.8844, 1993, 515-518; und der Patente DE 42 27 454 C2 bzw. EP 0 656 121 Bl bzw. US 5,639,617. Auf die genannten Patente und in der genannten Veröffentlichung angeführten frühen Literaturstellen wird zur Ergänzung der vorliegenden Beschreibung ausdrücklich Bezug genommen.
Eine aktuelle Diskussion der Verwendung von Biomarkern, einschließlich des Biomarkers PCT, im Rahmen der Sepsisdia¬ gnose findet sich auch in dem Review von Shawn D. Carrigan et al . , "Toward Resolving the Challenges of Sepsis Diagno- sis" in: Clinical .Chemistry 50:8, August 2004, 1301-14.
Die Verfügbarkeit des Sepsismarkers Procalcitonin hat der Sepsisforschung starke Impulse gegeben, und es werden gegen¬ wärtig intensive Anstrengungen unternommen, weitere Biomar- ker zu finden, die die Procalcitonin-Bestimmung ergänzen können und/oder zusätzliche Informationen für Zwecke der Feindiagnostik bzw. Differentialdiagnostik bzw. Stratifizie- rung zu liefern vermögen.
Erschwert wird die Suche nach potentiellen neuen Sepsis- Biomarkern allerdings dadurch, dass häufig noch sehr wenig oder nichts über die genaue Funktion bzw. über die genauen Gründe für das Auftreten bestimmter endogener Substanzen, die am Sepsisgeschehen beteiligt sind, bekannt ist. Erste Ergebnisse der experimentellen Überprüfung eines fruchtbaren rein hypothetischen Ansatzes zur Ermittlung weiterer potentieller Sepsismarker finden sich in DE 198 47 690 Al bzw. WO 00/22439 der Anmelderin. Dort wird gezeigt, dass bei Sepsis nicht nur die Konzentration des Prohormons Procal.citonin erhöht ist, sondern auch für andere Substanzen, die zu den Peptid-Prohormonen gerechnet werden können oder die Fragmente solcher Prohormone darstellen und eine für solche Prohormone typische Immunreaktivität auf¬ weisen, signifikant erhöhte Konzentrationen beobachtet werden können.
Die vorliegende Anmeldung ist Ergebnis eines anderen frucht¬ baren, rein experimentellen Ansatzes für die Suche nach weiteren sepsisspezifischen Biomolekülen. Dieser beruht darauf, dass man durch Verabreichung eines Endotoxins oder durch Infektion mit Bakterien bei Primaten (Pavianen) einen als künstliche Sepsis bezeichenbaren Krankheitszustand aus¬ löst und dann durch Vergleich der Gelelektrophorese-Pro¬ teinspotmuster von endotoxinbehandelten und von unbehandel¬ ten Pavianen endogene Substanzen von peptischer bzw. protei¬ nischer Natur ermittelt, die nur bei den "septischen" Pavia¬ nen gefunden werden und die daher potentielle sepsisspezi¬ fische Biomarker darstellen. Das Primatenmodell wurde dabei aufgrund der sehr großen Ähnlichkeit der Physiologie von Primaten und Menschen und der hohen Kreuzreaktivität mit vielen therapeutischen und diagnostischen humanen Reagenzien gewählt .
Wie im experimentellen Teil älterer Patentanmeldungen der Anmelderin genauer ausgeführt wird, wird dabei nach experi¬ menteller Auslösung einer künstlichen Sepsis in Pavianen durch Endotoxinverabreichung (LPS aus Salmonella Typhimuri- um; in der nachfolgend beschriebenen Untersuchungen wird auch S.pyogenes und LPS.E. coli verwendet) und 2D-gelektro- phoretischer Aufarbeitung von Gewebe der behandelten Tiere eine Anzahl von nur bei den behandelten Tieren identifizier- baren Proteinspots gefunden. Die den Spots entsprechenden proteinischen Produkte werden aus dem Elektrophoresegel isoliert und massenspektrometrisch (v.a. mittels Tandem-Mas- senspektrometrie) untersucht.
Nach dem genannten Verfahren wurden, wie in älteren deut¬ schen und europäischen Patentanmeldungen der Anmelderin erstmals beschrieben wurde, neben bereits in der Literatur diskutierten Sepsismarkern als neuartige Sepsismarker u.a. die Proteine "Inflammin" (WO 02/085937) , CHP (WO 03/005035) , lösliche Cytokeratin-1-Fragmente (sCYlF; WO 03/002600) , das Proteine LASP-I (WO 03/089934) sowie Enzyme wie Aldose-1- Epimerase (Mutarotase; WO 03/048780) , Glycin-N-Acyl-Trans- ferase (GNAT; WO 03/048781) und lösliche Carbamoylphosphat Synthetase 1 (CPS 1; WO 03/089933) identifiziert. Eine Diskussion des angewandten Verfahrens der Proteomanalyse und der Ergebnisse, die für einen unter Heranziehung des Verfah¬ rens etablierten Sepsismarker erhalten wurden, der in Form eines midregionalen Fragments des Vorläufers des Hormons ANP (atrial-natriuretisches Peptid) bestimmbar ist, ist ver¬ öffentlicht in J. Struck et al . , Immuno-analyse & biologie specialisee 19 (2004) 131-137.
Der Inhalt der genannten älteren Anmeldungen der Anmelderin und der genannten einschlägigen Veröffentlichngen ist durch die ausdrückliche Bezugnahme auf diese Anmeldungen und Veröffentlichungen als ergänzender Teil der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung anzusehen.
Die vorliegende Erfindung beruht darauf, dass bei einer Untersuchung der beschriebenen Art unter Verwendung des gesamten löslichen Proteins von Dünndarmextrakten von Pavia¬ nen, die mit den gram positiven Bakterien S. pyogenes infi¬ ziert wurden, eine nur in den Extrakten der infizierten Paviane vorkommende, jedoch bei gesunden Pavianen fehlende Substanz isoliert wurde, die - wie im experimentellen Teil näher erläutert - als "Gastrokine 1" (GKNl) identifiziert werden konnte.
Demgemäß betrifft 'die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 1 im weitesten Sinne die Verwendung von Gastrokine 1 (GKNl; SEQ ID NO: 1) als humoraler Biomarker zum diagnostischen Nachweis und für die Verlaufsprognose "sowie die Verlaufs¬ und Therapiekontrolle von Entzündungen und Infektionen unter Beteiligung des Magen-Darm-Trakts .
Zwei bevorzugte diagnostische Verwendungen sind in den Ansprüchen 2 und 3 wiedergegeben.
Die Ansprüche 4 bis 10 betreffen bevorzugte Verfahren zur Sepsisdiagnose und 'zur Diagnose chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen und deren bevorzugte Ausgestaltungen.
Wie im experimentellen Teil näher beschrieben wird, wurde bei Untersuchungen der Anmelderin eine peptidische Substanz identifiziert, die in der_ frühen wissenschaftlichen Litera¬ tur als AMP-18, CAIl oder FOV (Foveolin) bezeichnet wurde und der das Human Gene Nomenclature Committee seit November 2003 die Bezeichnung Gastrokine 1 (GKNl) zugeordnet hat (Karin A Oien et al . , Gastrokine is abundantly and specifi- cally expressed in superficial gastric epithelium, down- regulated in gastric Carcinoma, and shows high evolutionary conservation, J Pathol 2004; 203:789-797) . GKNl wird von einem sechs Exons enthaltenden Gen auf Chromosom 2 kodiert . Das primäre Translationsprodukt des GKNl-Gens umfaßt 185 Aminosäuren (Martin TE et al . , A novel mitogenic protein that is highly expressed in cells of the gastric antrum mucosa. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003; 285 :G332-43) . Die ersten 20 N-terminalen Aminosäuren stellen offenbar die Signalsequenz für die Sekretion dar. Abweichend hierzu wurde von anderen Autoren postuliert, daß die Trans¬ lation der GKNl-mRNA früher beginnt, so daß das primäre. Translationsprodukt 199 Aminosäuren umfassen würde (Shiozaki K et al . , Human stomach-specific gene, CAIl, is down-regula- ted in gastric Cancer. Int J Oncol 2001; 19 : 701-7; Yoshikawa Y. et al . , Isolation of two novel genes, down-regulated in gastric Cancer. Jpn J Cancer Res 2000; 91 :459-63) . Nach Abspaltung der Signalsequenz resultiert jedenfalls ein reifes, 165 Aminosäuren umfassendes GKNl. Auffällig an der Sequenz von GKNl ist das Vorhandensein einer sogenannten BRICHOS-Domäne (Pos. 54-150) . Diese Domäne ist in verschie¬ denen Proteinen gefunden worden, die eine Rolle bei Demen¬ zen, Krebs, ARDS (acute respiratory distress Syndrome) spielen (Sanchez-Pulido L, Devos D, Valencia A., BRICHOS: a conserved domain in proteins associated with dementia, respiratory distress and cancer. Trends Biochem Sei 2002,-27: 329-32) . Die molekulare Funktion der BRICHOS Domäne ist unbekannt .
Untersuchungen zur Gewebespezifität der Expression von GKNl in Mäusen zeigten, daß das Peptid ausschließlich in der Magenschleimhaut exprimiert wird (Martin TE, et al . , 2003; a.a.O.; Karin A Oien, 2004, a.a.O.) . Dort wird es in Mucin- enthaltenden „secretory granules" gelagert.
An Epithelzellen wurde dargelegt, daß GKNl Zellwachstum und -teilung stimuliert. Somit fungiert GKNl offenbar als Wachs¬ tumsfaktor in der Magenschleimhaut (Martin TE et al . , 2003; a.a.O.) . Hinreichend für diese Aktivität ist ein nur 21 Aminosäuren umfassender Bereich aus der Mitte des Moleküls (Toback FG, et al . , Peptide fragments of AMP-18, a novel secreted gastric antrum mucosal protein, are mitogenic and motogenic . Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003; .285 :G344-53) . Immunhistochemische Untersuchungen zeigten, daß die Expression von GKNl bei Magenkrebs stark vermindert ist (Shiozaki K, 2001, a.a.O.; Yoshikawa Y, et al . , 2000; a.a.O.) . Eine plausible Erklärung für den offensichtlichen Widerspruch - GKNl wirkt als Mitogen, ist jedoch gleich¬ zeitig herunterreguliert bei Krebs - .wurde noch nicht gege¬ ben. Als Patentanmeldungen und Patente mit einer - z.T. sehr lockeren - Beziehung zu GKNl können die folgenden genannt werden:
WO 02/092758 bzw. WO 02/078640 und das Patent US 6,734,289 B2 beziehen sich auf therapeutische Anwendungen von GKNl, seinen Fragmenten oder Inhibitoren.
WO 00/61623A1 listet cDNA Sequenzen von 62 als sekretiert postulierten Proteinen auf; eine dieser cDNAs kann GKNl zugeordnet werden.
WO 00/00610A2 listet eine große Zahl von Peptiden mit Signal Sequenz auf, unter denen sich GKNl findet.
WO 01/93983 betrifft Antikörper gegen u.a. GKNl und den Tumornachweis durch Messung des Expressionsniveaus in Zel¬ len.
WO 02/00690 betrifft Antikörper gegen u.a. GKNl. Ein Zu¬ sammenhang zwischen GKNl und Infektionen/Entzündungen bzw. Sepsis wird in keiner der genannten Patentanmeldungen herge¬ stellt.
GKNl ist ein Protein mit einer Signalsequenz, die seine Sekretion in den extrazellulären Raum ermöglicht. GKNl wird daher extrazellulär in der Magenschleimhaut' gefunden. Es ist aber zu erwarten, dass bei Entzündungen/Sepsis GKNl bzw. pathophysiologisch auftretende GKNl-Fragmente, Splicingva- rianten und/oder posttranslational modifizierte Formen von GKNl mit GKNl-Immunreaktivität auch in Körperflüssigkeiten, insbesondere auch in der Zirkulation, nachweisbar sind.' Die vorliegende Erfindung richtet sich daher auf die Bestimmung von GKNl bzw. pathophysiologisch auftretenden Fragmenten, Splicingvarianten und/oder posttranslational modifizierten Formen von GKNl mit GKNl-Immunreaktivität als humoraler Biomarker, der insbesondere auch in Serum und/oder Plasma bestimmbar ist.
Da, wenigstens unter den angewandten Testbedingungen, der als GKNl identifizierte Proteinspot nur in den Dünndarm¬ extrakten von solchen Pavianen gefunden wurde, die mit gram positiven Bakterien infiziert worden waren (S. pyogenes) , dagegen nicht bei den mit LPS E.coli infizierten, erscheint es möglich, dass das Auftreten von GKNl für Infektionen mit gram positiven Bakterien spezifisch ist, und der Nachweis von GKNl daher für differentialdiagnostische Zwecke (als Hinweis auf die Art der sepsisauslösenden Infektion) genutzt werden kann.
Die Bestimmung von GKNl in den biologischen Flüssigkeiten erfolgt vorzugsweise mit Hilfe immundiagnostischer Bestim¬ mungsverfahren (Ligandenbindungsassays; Immunoassays) .
Es versteht sich dabei, dass, die erforderliche Spezifität und Empfindlichkeit vorausgesetzt, irgendwelche nach bekann¬ ten Prinzipien arbeitenden Ligandenbindungsassays/Immuno- assays zur quantitativen oder semiquantitativen Bestimmung von GKNl in biologischen Flüssigkeiten, insbesondere solchen aus der Zirkulation wie Serum oder Plasma, eingesetzt werden können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren als heterogener Sandwich-Immunoassay durchgeführt, bei dem ein erster GKNl bindender Antikörper an eine beliebige Fest¬ phase, beispielsweise die Wände beschichteter Teströhrchen (z.B. aus Polystyrol; "Coated Tubes" ; CT) oder an Mikroti- terplatten, zum Beispiel aus Polystyrol, oder an Partikel, beispielsweise Magnetpartikel immobilisiert ist, während ein weiterer für GKNl spezifischer Antikörper einen Rest trägt, der ein direkt nachweisbares Label darstellt oder eine selektive Verknüpfung mit einem Label ermöglicht und der Detektion der gebildeten Sandwich-Strukturen dient. Auch eine zeitlich verzögerte bzw. nachträgliche Immobilisierung unter Verwendung geeigneter Festphasen ist möglich.
Grundsätzlich können alle in Assays der beschriebenen Art verwendbaren Markierungstechniken angewandt werden, zu denen Markierungen mit Radioisotopen, Enzymen, Fluoreszenz-, Chemolumineszenz- oder Biolumineszenz-Labeln und direkt optisch detektierbaren Farbmarkierungen, wie beispielsweise Goldatomen und Farbstoffteilchen, wie sie insbesondere für sog. Point-of-Care (POC) oder Schnelltests verwendet werden, gehören. Es liegt somit im Rahmen der vorliegenden Erfin¬ dung, das erfindungsgemäße Verfahren auch als Schnelltest auszugestalten.
Das Verfahren zur Bestimmung von GKNl kann beispielsweise auch unter Anwendung eines homogenen Nachweisverfahrens durchgeführt werden, bei dem aus zwei Antikörpern und dem nachzuweisenden GKNl gebildete Sandwichkomplexe in der flüssigen Phase suspendiert bleiben. In einem solchen Fall ist es bevorzugt, beide Antikörper mit Teilen eines Nach¬ weissystems zu markieren, das dann, wenn beide Antikörper in einen einzigen Sandwich integriert werden, eine Signalerzeu¬ gung oder Signalauslösung ermöglicht. Derartige Techniken sind insbesondere als Fluoreszenzverstärkungs- oder Fluo- reszenzlöschungs-Nachweisverfahren ausgestaltbar. Ein beson¬ deres bevorzugtes derartiges Verfahren betrifft die Ver¬ wendung von paarweise einzusetzenden Nachweisreagenzien, wie sie beispielsweise beschrieben sind in US-A-4 822 733, EP- Bl-180 492 oder EP-Bl-539 477 und dem darin zitierten Stand der Technik. Sie ermöglichen eine Messung, die selektiv nur Reaktionsprodukte erfaßt, die beide Markierungskomponenten in einem einzigen Immunkomplex enthalten, direkt in der Reaktionsmischung. Als Beispiel ist auf die unter den Marken TRACE® (Time Resolved Amplified Cryptate Emission) bzw. KRYPTOR® angebotene Technologie zu verweisen, die die Lehren der o.g. Anmeldungen umsetzt.
Zwei für GKNl spezifische Antikörper können aber auch im Falle heterogener Sandwich-Immunoassays Teile eines Nach¬ weissystems der soeben im Zusammenhang mit homogenen Assays beschriebenen Art aufweisen.
Wie nachfolgend gezeigt wird, ist das Auftreten - i.S. einer nachweisbaren Expression - von GKNl in cytoplasmatischen Dünndarmextrakten an einen vorausgehenden "Sepsis"-auslösen¬ den Endotoxin-Reiz bzw. eine vorausgehende Infektion gekop¬ pelt. Bei unbehandelten Kontrollen ist, im Einklang mit der eingangs zitierten Literatur, kein GKNl-Nachweis in Dünn¬ darm-Zellen möglich. Damit stellt GKNl einerseits einen potentiellen Sepsismarker dar, und dieser Marker legt auf¬ grund seines bisher nur in Dünndarmzellen nachgewiesenen infektionsspezifischen Auftretens dann, wenn er bei septi¬ schen Patienten nachweisbar ist, den Schluss nahe, dass die Infektion/Entzündung/Sepsis sich auf den gastrointestinalen Trakt, insbesondere den Darm, erstreckt.
Es ist ferner zu erwarten, dass GKNl als darmspezifischer Entzündungsmarker auch bei chronisch entzündlichen Darm¬ erkrankungen (inflammatory bowel diseases) bzw. akuten Schüben derartiger Erkrankungen nachweisbar und für diagno¬ stische Zwecke bzw. insbesondere auch für eine Verlaufs- und Therapiekontrolle nutzbar ist.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf eine Figur noch näher erläutert.
Die Figur (Fig. 1) zeigt einen vergrösserten Ausschnitt von zwei 2D-Elektrophoresegelen, die einen Vergleich der Spotmu¬ ster von cytoplasmatischen Dünndarmproteinen eines gesunden Pavians (A) mit den Dünndarmproteinen eines Pavians 6h nach einer durch Injektion von gram-positiven Bakterien (S. pyogenes) induzierten Sepsis (B) ermöglichen. Der Pfeil zeigt die Position des erfindungsgemässen sepsisspezifischen Produkts an, das als GKNl identifiziert wurde. Es ist in Darstellung (B) durch einen Kreis hervorgehoben. Versuchsergebnisse:
1. Infektionssimmulation durch Endotoxinverabreichung im Tiermodell (Paviane)
In Anlehnung an die mit Pavianen durchgeführten Versuche zur Stimulierung der Procalcitonin-Ausschüttung durch Endotoxin- injektionen (vgl. H. Redl, et al . , "Procalcitonin release patterns in a baboon model of trauma and sepsis : Relations- hip to cytokines and neopterin" , Grit Gare Med 2000, Vol. 28. No.11, 3659-3663 ; H. Redl, et al . , "Non-Human Primate Models of Sepsis", in : Sepsis 1998 ; 2 : 243-253) und zur Identifizierung neuer Sepsismarker gemäß den o.g. älteren Patentanmeldungen und Patenten der Anmelderin wurden männ¬ lichen Pavianen (papio ursinus)1, 29 bis 35 kg schwer, über zwei Stunden jeweils 300 ml physiologische NaCl-Lösung (Kon¬ trollgruppe) bzw. 1-2 x 108 cfu/kg S.pyogenes (gram positive Infektion) bzw. 100 μg/kg LPS E.coli 026:B6 (gram negative Infektion) infundiert. Sechs Stunden nach Versuchsbeginn, d.h. vier Stunden nach Ende der Infusion, wurden die Tiere mit einer gesättigten KCl-Lösung getötet, die Gewebeproben entnommen und diese sofort in flüssigem Stickstoff gefroren.
Bei der weiteren Verarbeitung wurden Proben (je 1.5 g) _der einzelnen tiefgefrorenen Gewebe unter Stickstoffkühlung mit 3 ml Puffer A (5OmM HEPES, pH 7,1, 5OmMNaCl, 20% Glycerol, 250 μM Leupeptin, 100 μ.M Amastatin, 1 mM Pefabloc) .versetzt und in einem Porzellanmörser zu einem Mehl pulverisiert (vgl. J. Klose, "Fractionated Extraction of Total Tissue Proteins from Mouse and Human for 2-D Electrophoresis" , in : Methods in Molecular Biology, Vol. 112 : 2-D Proteome Analy- sis Protocols, Humana Press Inc., Totowa, NJ) . Anschliessend wurden die Proben 6 x für 10 Sekunden in einem Ultraschall- wasserbad behandelt und die Suspension für 40 min bei 100.000 g und +40 C zentrifugiert . Der erhaltene erste cytosolische Überstand wurde entnommen, das verbleibende Pellet in Puffer A resuspendiert und wie oben beschrieben erneut Ultraschall behandelt und zentrifugiert . Der daraus resultierende zweite Überstand wurde mit dem ersten Über¬ stand vereint und bis zur weiteren Verarbeitung bei -80° C gelagert .
2. Vergleichende Proteomanalyse unter Verwendung cytoplasma- tischer Dünndarmzellproteine von Pavianen.
Cytoplasmatische Dünndarmproteinextrakte von einerseits gesunden Pavianen (Kontrolle infundiert mit NaCl) und ande¬ rerseits Pavianen, denen LPS E. coli bzw. S. pyogenes injiziert worden war, wurden im Rahmen einer Proteomanalyse verwendet. Bei der einleitenden analytischen 2D-Gelelek- trophorese wurde Dünndarmextrakt, 100 μg Protein enthaltend, auf 9M Harnstoff, 70 mM DTT, 2% Ampholyte, pH 2-4 einge¬ stellt und dann mittels analytischer 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt, wie in J. Klose, et al . , "Two-dimensional elec- trophoresis of proteins : An updated protocol and implica- tions for a functional analysis of the genome", Electropho- resis 1995,16,1034-1059 ; beschrieben ist. Die Sichtbarma¬ chung der Proteine im 2D-GeI erfolgte mittels Silberfärbung (vgl. J. Heukeshoven, et al . , "Improved silver staining procedure for fast staining in Phast-System Development Unit . I. Staining of sodium dodecyl gels", Electrophoresis 1988, 9,28-32) .'
Zur Auswertung wurden die Proteinspotmuster der Kontrollen mit den Proteinspotmustern verglichen, die aus Gewebe von Sepsis-induzierten Tieren resultierten.
Substanzen, die bei keiner Kontrollprobe, aber bei allen behandelten Tieren zusätzlich auftraten, wurden für weitere analytische Untersuchungen selektiert. Fig.l zeigt einen Vergleich der 2D-GeIe für eine Kontrollprobe (A) und eine Probe eines behandelten Tieres (B) , wobei der zusätzliche Proteinspot in (B) dem GKNl Protein entspricht, dessen Position im Gel durch einen Pfeil und einen Kreis hervor- gehoben ist .
Zur Identifizierung der im Proteinspotmuster der analyti¬ schen 2D-Gelelektrophorese detektierten neuen spezifischen Proteine wurde anschliessend eine präparative 2D-Gelelek- trophorese unter Einsatz von 450 μg Protein durchgeführt. Bei der präparativen 2D-Gelelektrophorese erfolgte die Färbung der Proteine mittels Coomassie Brilliant Blue G250 (vgl. V. Neuhoff, et al . , "Improved staining of proteins in Polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250", Electrophoresis 1988,9,255- 262) .
Die für die weitere Analyse vorselektierten Proteinspots wurden aus dem Gel ausgeschnitten, unter Anwendung der Methode, die in A. Otto, et al ., "Identification of human myocardial proteins separated by two-dimensional electropho¬ resis using an effective sample preparation for mass spec- trometry" , Electrophoresis 1996,17,1643-1650; beschrieben ist, mit Trypsin gespalten, und die generierten Peptide wurden massenspektrometrisch analysiert, und zwar unter Anwendung massenspektrometrischer Untersuchungen, wie sie z. B. in G. Neubauer, et al.,"Mass spectrometry and EST-databa- se searching allows characterization of the multi-protein spliceosome complex" , in: Nature Genetics Vol. 20,1998,46- 50; J. Lingner, et al., "Reverse Transcriptase Motifs in the Catalytic Subunit of Telomerse", in: Science, Vol. 276,1997,561-567 ; M. Mann, et al . , "Use of mass spectrome- try-derived data to annotate nucleotide and protein sequence databases", in: TRENDS in Biochemical Sciences, Vol. 26,1,2001,54-61; beschrieben und diskutiert werden.
Dabei wurden die trypsinverdauten Proben mittels ESI (Elec- trospray Ionization) einer Tandem-Massenspektrometrie unter¬ zogen. Verwendet wurde ein Nano-LC System der Firma Dionex in Kombination mit einem QSTAR ESI-MS/MS Massenspektrometer der Firma Applied Biosystems ABI . Dabei wurde entsprechend der Arbeitsanleitung des Geräteherstellers gearbeitet.
3. Identifizierung von Gastrokine 1 (GKNl)
Wie in den Figuren 1 (A) und 1 (B) gezeigt ist, findet sich in Dünndarmzeilextrakten von Pavianen, denen eine S. pyogenes - Injektion verabreicht worden war, u. a. ein neues Protein, für das aufgrund der Gelektrophoresedaten im Vergleich mit Markersubstanzen mit bekanntem Molekulargewicht ein Moleku¬ largewicht von ca. 19000 Dalton abgeschätzt wurde, während aus der relativen Position des Proteins aus der ersten Dimension ein isoelektrischer Punkt von ca. 8.6 bis 8.8 abgeschätzt wurde.
Dieses Protein wurde wie oben beschrieben nach tryptischem Verdau massenspektrometrisch analysiert. Bei einer Daten¬ banksuche der gemessenen Peptide in der NCBInr-Datenbank 20031016, Säugetier-Sequenzen, unter Verwendung der Software Mascot http://www.matrixscience. com/search_form_select .html konnte das gefundene Protein zugeordnet werden. Die Daten¬ banksuche liefert eine Vorschlagliste der gefundenen Protei¬ ne mit Bewertungszahlen (Score-Liste; Probability Based Mowse Score) . Peptide, deren individueller Score >50 be¬ trägt, sind mit einer Wahrscheinlichkeit von p<0.05, d.h. 95%, als zweifelsfrei identifiziert anzusehen. Innerhalb dieses signifikanten Bereichs konnten 2 Peptide (jeweils doppelt; nichtoxidiert und oxidiert) identifiziert werden, die nur in den Proteinen gemäß Datenbankeintrag gil7366998 (CAIl) bzw. gil36429 (18 kDa antrum mucosa protein; AMP-18) vorkamen (Score von 120) . CAIl bzw. AMP-18 sind Synonyme für Gastrokine 1 (GKNl) .
Humanes GKNl, dessen vollständige Sequenz bekannt ist (SEQ ID NO: 1) , weist nach Abzug der Signalsequenz einen theore¬ tischen pl von 5.3 auf, was deutlich saurer ist als expe¬ rimentell für das Pavian Protein beobachtet. Die vollständi- ge Aminosäuresequenz für das Pavian-Protein ist nicht lite¬ raturbekannt, so daß der theoretische pl Wert dafür nicht berechnet werden kann. Unplausibel erscheint der pl-Unter¬ schied zwischen dem humanem und dem Pavian-Protein jedoch nicht, wenn man berücksichtigt, daß GKNl vom Schwein (Swiss- Prot Nr. Q8HYA9) - einem evolutionär nahen Verwandten von Mensch und Pavian - einen theoretischen pl von 8.3 aufweist.
Mittels MS/MS konnte von zwei Peptiden des tryptischen Verdaus die Aminosäuresequenzen ermittelt werden als GLMYSVNPNK (SEQ ID NO:2) und GLMYSVNPNKVDDLSK (SEQ ID NO:3) . Diese Peptide entsprechen den Aminosäuren 118-127 bzw. 118- 133 der Sequenz des humanen GNKl (vgl. SEQ ID NO: 1) . Von den der längeren Sequenz (SEQ ID NO:3 ; errechnete monoisoto- pishce Masse des neutralen .Peptids (Mr) : 1794,88) zuorden- baren gemessenen intensiveren Ionenpeaks finden sich 29 in einer Tabelle der theoretisch bei einer Fragmentierung dieses Peptids möglichen 158 Ionen der b- und y-Serien in verschiedenen Ladungszuständen wieder.
Das Peptidfragment GLMYSVNPNKVDDLSK (SEQ ID NO:3) ist daher als zweifelsfrei identifiziert anzusehen. Da es sich gemäß der Datenbankrecherche nur in Proteinen wiederfindet, die dem humanen GKNl entsprechen, kann davon ausgegangen werden, dass das nur bei den infizierten Tieren gefundene Pavian- Protein das dem humanen GKNl entsprechende Protein ist, das wenigstens im identifizierten Sequenzteil eine identische Sequenz aufweist. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit der patho- physiologischen Reaktionen von Pavianen und Menschen, die sich auch gerade in den zahlreichen oben diskutierten Unter¬ suchungen der Anmelderin immer wieder gezeigt hat, die auf den Ergebnissen einer künstlich induzierten Sepsis bei Pavianane aufbauen, kann davon ausgegangen werden, dass bei infizierten bzw. septischen menschlichen Patienten im we¬ sentlichen identische Verhältnisse auftreten wie im be¬ schriebenen Pavian-Tiermodell.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Gastrokine 1 (GKNl; SEQ ID NO:1) als humoraler Biomarker zum diagnostischen Nachweis und für die Verlaufsprognose sowie die Verlaufs- und Therapiekontrolle von Entzündungen und- Infektionen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 im Rahmen der differential¬ diagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Bestimmung des Schweregrads und für die Verlaufs- und Therapiekontrolle von Sepsis und schweren Infektionen durch Bestimmung des Auftretens und/oder der Menge von GKN 1 und/oder von patho- physiologisch auftretenden Fragmenten, Splicingvarianten und posttranslational modifizierten Formen von GKNl mit GKNl- Immunreaktivität in einer biologischen, Flüssigkeit, ins¬ besondere Serum oder Plasma, eines Patienten.
3. Verwendung nach Anspruch 1 im Rahmen der differential- diagnostischen Früherkennung und Erkennung, zur Bestimmung des Schweregrads und für die Verlaufs- und Therapiekontrolle der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn oder Colitis ulceros durch Bestimmung des Auftretens und/- oder der Menge von GKNl und/oder von pathophysiologisch auftretenden Fragmenten, Splicingvarianten und posttrans¬ lational modifizierten Formen von GKNl mit GKNl-Immunre¬ aktivität in einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere Serum oder Plasma, eines Patienten.
4. Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung und Erkennung, für die Verlaufsprognose und die Beurteilung des Schweregrads und zur Verlaufs- und Therapiekontrolle von Sepsis und schweren Infektionen, insbesondere sepsisähn- lichen systemischen Infektionen, unter Beteiligung des Magen-Darm-Trakts, sowie der chronisch-entzündlichen Darm- erkrankungen Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa, dadurch gekennzeichnet, dass man die Anwesenheit und/oder Menge von Gastrokine 1 (GKNl) und/oder von pathophysiologisch auf¬ tretenden Fragmenten, Splicingvarianten und posttranslatio- nal modifizierten Formen von GKNl mit GKNl-Immunreaktiyität in einer biologischen Flüssigkeit eines Patienten bestimmt und aus dem Nachweis und/oder der Menge der GKNl-Immunreak¬ tivität Schlüsse hinsichtlich des Vorliegens, des zu erwar¬ tenden Verlaufs, des Schweregrads oder des Erfolgs eines Therapie einer Sepsis oder Infektion•oder chronisch-entzünd¬ lichen Darmerkrankung zieht .
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein immundiagnostisches Bestimmungsverfahren ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es ein heterogenes oder homogenes immundiagnostisches Be¬ stimmungsverfahren in Form eines Sandwich-Assays ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass es im Rahmen einer Multiparameter-Be- stimmung durchgeführt wird, bei der gleichzeitig mindestens ein weiterer Sepsisparameter bestimmt wird und ein Mess¬ ergebnis in Form eines Satzes von mindestens zwei Messgrößen gewonnen wird, der zur Sepsis-Feindiagnostik und zur Patien- ten-Stratifizierung ausgewertet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass im Rahmen der Multiparameter-Bestimmung neben GKNl-Immunre- aktivität wenigstens ein weiterer Parameter bestimmt wird, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Procalci- tonin, CA 19-9, CA 125, SlOOB, SlOOA-Proteinen, löslichen Cytokeratin-Fragmenten, insbesondere CYFRA 21, TPS und/oder löslichen Cytokeratin-1-Fragmenten (sCYlF) , den Enzymen Aldose-1-Epimerase, Glycin-N-Acyl-Transferase (GNAT) , Cu/Zn- SOD, Carbamoylphosphat-Synthetase (CPS) und Fragmenten der genannten Enzyme, den Peptiden Inflammin, CHP, LASP-I sowie Immunreaktivität, die sich ableitet Vorläufern von vasoakti¬ ven Peptiden, insbesondere von Pro-ANP, Pro-Endothelin, Pro- Vasopressin und Pro-Adrenomedullin sowie Cytokinen, Inter- leukinen, TNF und dem C-reaktiven Protein (CRP) .
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich¬ net, dass die Multiparameter-Bestimmung als Simultanbestim¬ mung mittels einer Chiptechnologie-Messvorrichtung oder einer immunchromatographisehen MessVorrichtung erfolgt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung des mit der Messvorrichtung gewonnenen kom¬ plexen Messergebnisses mit Hilfe eines Computerprogramms erfolgt .
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