DE102005056839A1

DE102005056839A1 - Verfahren zur Diagnose von Sepsis mit Transthyretin

Info

Publication number: DE102005056839A1
Application number: DE102005056839A
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Rußwurm; Konrad Prof. Reinhart
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2007-06-14

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, wobei man in einer Probe eines Patienten den Gehalt an Transthyretin und/oder davon abgeleiteten Derivaten bestimmt und erfasst, ob der Wert, bezogen auf eine Kontrollgruppe, höher oder niedriger liegt, um auf das Vorliegen einer Sepsis, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro Verfahren zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung von Transthyretin (TTR) als Biomarker gemäß Anspruch 1, die Verwendung von TTR für die Erzeugung von Antikörpern für diagnostische und therapeutische Zwecke gemäß Anspruch 12, einen Kit zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung von Komponenten, welche eine Bestimmung von TTR ermöglichen, gemäß Anspruch 13.
Die Erfindung betrifft Transthyretin, inbesondere einen Transthyretin-Precursor und davon abgeleitete Derivative. Der aus Gründen der Lesbarkeit verwendete Begriff TTR steht stellvertretend für Transthyretin, den Transthyretin-Precursor sowie abgeleitete Derivative und Mutationen und stellt keine Einschränkung der Erfindung dar.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung des Proteins gemäß SEQ-ID 1 als Biomarker.
Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS (systemic inflammatory response syndrome) und Sepsis, definiert entsprechend der ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 [1], bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [2-3]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20 % bei SIRS, ca. 40 % bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70-80 % an [4-6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Auf molekularer Ebene wird als Sepsis ein Krankheitsbild bezeichnet, welches durch pathogene Mikroorganismen verursacht wird. Auf dem Boden der Erschöpfung Infektionsort-naher, molekularer Kontroll- und Regulationsmöglichkeiten entwickelt sich eine generalisierte, den ganzen Organismus umfassende Entzündungsreaktion, die für die vom Arzt nachgewiesenen klinischen Symptome/Diagnosekriterien/SIRS-Kriterien nach [1] verantwortlich ist. Dieser generalisierte, inflammatorische Zustand (als Sepsis nach [1] definiert) geht mit Zeichen der Aktivierung verschiedener Zellsysteme (endotheliale Zellen, aber auch aller leukozytären Zellsysteme und vor allem des Monozyten/Makrophagensystems) einher. Schließlich schädigen molekulare Mechanismen, die eigentlich den Wirt gegen invasive Mikroorganismen schützen sollen, dessen eigene Organe/Gewebe und tragen so entscheidend zur Entwicklung der vom Kliniker gefürchteten Organdysfunktionen bei [8-11].
Der Sepsisbegriff hat im Laufe der Zeit einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [1]. Entsprechend dieser Kriterien [1] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „Sepsis", „severe Sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber > 38°C oder Hypothermie < 36°C, eine Leukozytose > 12G/l oder eine Leukopenie < 4G/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe > 20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) < 4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen.
Sepsis ist das klinische Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrunde liegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [12]. Gleichfalls bestehen auf Grund der mangelnden Spezifität der heutigen Sepsis- und SIRS-Diagnose beim Kliniker große Unsicherheiten, ab welchem Zeitpunkt ein Patient einer spezialisierten Therapie, beispielsweise mit Antibiotika, die ihrerseits beträchtliche Nebenwirkungen haben können, zugeführt werden soll [12].
Bahnbrechende Entdeckungen in Molekularbiologie und Immunologie während der letzten zwei Jahrzehnte ließen ein vertieftes, mehr an den grundlegenden Mechanismen orientiertes Verständnis der Sepsis entstehen. Das dadurch entstandene Wissen um relevante Targets bildete wiederum die Basis für die Entwicklung gezielter und adjuvanter Therapiekonzepte, welche hauptsächlich auf der Neutralisierung wesentlicher Sepsismediatoren beruhen [13-16]. Eine Ursache für das Scheitern fast aller immunmodulatorischer Therapieansätze in klinischen Studien – trotz Effektivität im Tierexperiment – wird in der nur schlechten Korrelation zwischen den klinischen, eher symptomatisch orientierten Diagnosekriterien und den grundlegenden Mechanismen einer generalisierten Immunantwort gesehen [12, 17-18].
Rückblickend erstaunt dies nicht, da bereits gesunde Menschen bei alltäglichen Verrichtungen Veränderungen der Herz- bzw. Atemfrequenz aufweisen können, welche per Definition bereits die Diagnose eines SIRS zuließen. Bei Berücksichtigung unserer heutigen biomedizinischen Möglichkeiten muss es als Anachronismus erscheinen, dass jährlich 751.000 Patienten in den USA anhand o.g. ACCP/SCCM Kriterien diagnostiziert, klassifiziert und behandelt werden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach einem „magic bullet" der Sepsistherapie aufgewendet wurden [19]. Auch fordern kürzlich publizierte Expertenmeinungen, dass zu einem besseren pathophysiologischen Verständnis der Sepsis eine Modifizierung der Konsensuskriterien nach [1] erforderlich ist [20-21]. Außerdem besteht unter vielen Medizinern Einigung darüber, dass die Konsensuskriterien nach [1] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Aufgrund der oben genannten Probleme mit der Anwendung der Konsensuskriterien nach [1] werden unter Intensivmedizinern Vorschläge für eine sensitivere und spezifische Definitionen der verschiedenen Schweregrade der Sepsis diskutiert [2, 23]. Neu ist dabei vor allem, dass molekulare Veränderungen direkt in die Beurteilung der Schwere einer Sepsis, aber auch den Einschluss in innovative Behandlungsverfahren der Sepsis (wie z.B. die Therapie mit aktiviertem rekombinanten Protein C) einbezogen werden sollen. Dieser Konsensusprozess [23], der gegenwärtig von fünf internationalen Fachgesellschaften getragen wird, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch längst nicht abgeschlossen. Ziel ist die Etablierung eines Systems zur Schweregradbeurteilung der Sepsis, das es ermöglicht, Patienten anhand ihrer individuellen Patientenreaktion auf der Basis ihrer prädisponierenden Bedingungen, der Art und des Ausmaßes der Infektion, der Art und der Schwere der Wirtsantwort sowie des Grads der begleitenden Organdysfunktionen zu klassifizieren. Das beschriebene System wird mit PIRO, abkürzt nach den englischen Begriffen für „Predisposition", „Insult Infection", „Response" und „Organ dysfunction", bezeichnet.
Zur Vereinheitlichung der Definitionen der häufigsten Infektionen auf Intensivstationen wurden kürzlich Ergebnisse der Consensus Conference des Internationalen Sepsis Forums veröffentlicht [24]. Durch Anwendung dieser einheitlicher Definitionen wird es zukünftig möglich sein, die Auswahl der Patienten für klinische Studien anhand prospektiv definierter Infektionskategorien zu stratifizieren und somit die Variabilität zwischen den verschiedenen Patientengruppen zu reduzieren.
Verglichen mit den Konsensuskriterien nach [1] sollen in der Zukunft zusätzliche molekulare Parameter in die Diagnosestellung einbezogen werden [23], um so eine verbesserte Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis zu ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose abzuleiten. Nach solchen molekularen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen und kommerziellen Gruppen intensiv gesucht [25]. Bisherige Parameter wie z.B. die Bestimmung des C-reaktiven Proteins oder des Procalcitonin (PCT) werden nicht allen klinischen Anforderungen gerecht werden und sind beispielsweise nicht in der Lage den Ausbruch einer Sepsis nach Operationen oder Polytrauma frühzeitig anzuzeigen [26].
Aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensivität der Konsensuskriterien nach [1], der unzureichenden diagnostischen Eignung bisheriger Biomarker für die Beschreibung des Immun-/Entzündungsstatus von Sepsispatienten und des mangelhaften oder verspäteten Nachweises der Ursache der Infektion besteht daher ein dringender Bedarf für neue diagnostische Verfahren, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, den Krankheitsverlauf bei Sepsis frühzeitig vorherzusagen, im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
Transthyretin, auch bekannt als Prä-Albumin, ist ein Akut-Phase-Protein, dessen Expression durch IL 6 und/oder IL1 negativ reguliert wird [27, 28].
TTR ist ein Tetramer mit einem Molekulargewicht von etwa 15kDa und hat eine Halbwertzeit von 2-3 Tagen [29]. Transthyretin wird hauptsächlich in der Leber und im Plexus choroideus synthetisiert und anschließend im Serum bzw. dem Liquor cerebrospinalis sezerniert wird. TTR ist am Transport von Schilddrüsenhormonen beteiligt und bindet sehr stark Thyroxin [30]. Ebenfalls ist aus Afolabi et al. bekannt, dass TTR in Verbindung mit Albumin, Retinol-bindenen Protein sowie Apolipoprotein A1 als Nährstoff-Transportprotein dient [31]. Von Means et al. und Clark et al. ist TTR als Marken für den Nährstoffgehalt beschrieben [32, 33]. Weiterhin wurde TTR im Zusammenhang mit Amyloidose [34] und Alzheimer [35] beschrieben.
Obwohl in verschiedene Studien Korrelationen zwischen der Konzentration von TTR und verschiedenen pathologischen Zuständen beschrieben wurden, ist aus dem Stand der Technik kein Hinweis gegeben, der eine Messung des TTR-Gehalts im Plasma zur in vitro Diagnose einer Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen gezeigt oder nahe legt hat.
In US 2004 009 581 ist TTR als diagnostischer Marker für die Permeabilität der Blut- Schranken (Blut-Hirn-Schranke, Blutschranke zur Zerebrospinalflüssigkeit) beschrieben [36].
Aus Pinella et al. ist bekannt, dass das Verhältnis von C-reaktiven Protein zu TTR mit der Schwere von Multiorganversagen korreliert [37]. Erniedrigte Konzentrationen von TTR wurden in verschiedenen Publikationen beschrieben. So haben Cynober und Kollegen reduzierte Werte von TTR in Verbrennungspatienten gefunden [38]. In der gleichen Studie konnte gezeigt werden, dass sich die TTR-Konzentrationen zwischen Überlebenden und Nicht-Überlebenden unterscheiden. So konnten hier erniedrigte Werte bei den überlebenden Verbrenungspatienten mit Sepsis gemessen werden. Diese Beobachtungen stehen jedoch im Widerspruch zu der Studie von Rogy et al., in der keine signifikanten Unterschiede zwischen Überlebenden und Nicht-Überlebenden Patienten gefunden wurde [39]. Ebenfalls erniedrigte Werte von Transthyretin konnten postoperativen Verlauf bei Kindern mit bzw. ohne infektiöse Komplikationen [40], bei Neonatensepsis [41] bzw. bei Patienten mit septischen Komplikationen im Vergleich zu komplikationslosen Patienten und Kontrollen [42] gezeigt werden.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarte Erfindung ist die in systematischer Forschung nach neuen geeigneten Biomarkern für die Diagnose von Sepsis gewonnene Erkenntnis, dass der Gehalt an TTR in Plasma von Patienten mit Sepsis signifikant erhöht ist, im Vergleich zu Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung (SIRS). Die Bestimmung der Konzentration an TTR lassen es somit zu, auf das Vorliegen, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen. Diese Unterscheidung ist mit den bisher zur Diagnose verwendeten Proteinmarkern (z.B. Procalcitonin (PCT) oder C-Reaktives Protein (CRP)) klinischen Parametern nicht möglich, aber für die Einleitung einer spezialisierten intensivmedizinischen Therapie und damit für das Verbessern der individuellen Prognose für das Überleben sehr bedeutungsvoll.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe der gewonnenen Erkenntnisse Verfahren für die in vitro Diagnose einer generalisierten akuten Entzündung oder Sepsis zur Verfügung zu stellen und somit die o.g. unzureichenden Diagnosemöglichkeiten bedeutend zu verbessern. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur in vitro Diagnose einer generalisierten akuten Entzündung oder Sepsis zur Verfügung zu stellen, welche die in vitro Bestimmung der Konzentration von TTR in der biologischen Proben eines Patienten ermöglichen. Ebenso werden mit der Erfindung Verfahren ermöglicht, neue Detektionsmöglichkeiten basierend auf der Verwendung von TTR zu entwickeln. Außerdem bildet die Erfindung die Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe.
Verfahrenstechnisch wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.
Im Hinblick auf eine Verwendung, wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 12 gelöst.
Ein Kit gemäß Anspruch 13 löst die Aufgabe ebenfalls.
Insbesondere beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer biologischen Probe eines Menschen den Gehalt von TTR und davon abgeleitete Derivaten bestimmt und aufgrund des Ergebnisses auf das Vorliegen, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung, schließt.
In einem bevorzugten Verfahren kann auf eine Sepsiserkrankung geschlossen werden, falls der Gehalt an TTR oder davon abgeleiteten Derivaten bei Patienten mit Sepsis signifikant erhöht ist gegenüber dem Gehalt von TTR bei SIRS-Patienten.
In einem weiteren bevorzugten Verfahren hat das TTR die Aminosäuresequenz gemäß Seq-ID #1.
Es ist dem Fachmann klar, dass unter dem Begriff Derivate jegliche Mutationen, Modifikationen des TTR, oder Peptide oder Nukleinsäuren, welche vom TTR abgeleitet werden können, verstanden werden. Solche Modikfikationen können beispielweise prä- oder posttranslationalen Charakters sein, z.B. Glykosylierung, Proteolytische Spaltung von Proteinen, Methylierung, Phosphorylierung, Sulfatierung, Prenylierung.
Der Gehalt des TTR wird aus Vollblut, Blutbestandteilen oder der Leber bestimmt. Eine bevorzugtes Verfahren ist die Bestimmung des TTR-Gehalts aus dem Plasma oder Serum der Patienten.
Für die meßtechnische Bestimmung des TTR kommen verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren zum Einsatz. Bevorzugt werden dabei immundiagnostische Verfahren eingesetzt. Hierbei kommen üblicherweise Antiköper-Assays zum Einsatz, welche gegen das TTR gerichtete Antikörper beinhalten. Beispiele solcher Messverfahren sind ELISA, Western Blot, Immunopräzipitation oder FACS-Analysen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Verfahren eingesetzt, die neben der Bestimmung von TTR auch parallel die Bestimmung weiterer Biomarker zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von SIRS oder Sepsis ermöglichen. Solche weiteren Biomarker können beispielsweise Protein- und/oder Genaktivitätsmarker darstellen, welche mit Proteinchips oder immunchromatographischen Messvorrichtungen bestimmt werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können mit dem Fachmann bekannten computer-gestützten Auswerteeinheiten ausgewertet werden. Hierbei können die Messwerte der TTR-Konzentration direkt oder über ein umgewandeltes Signal als Input für die Auswerteeinheit dienen, darin verarbeitete werden und über eine graphische oder sonstiges Darstellung zur Auswertung dargestellt werden.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des TTR für die Gewinnung von gegen TTR gerichteten Antikörpern und/oder davon abgeleitete Derivate. Solche abgeleiteten Derivate sind beispielsweise (mono,bi,tri) Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, SFv-(Single Chain Antikörper), Di-, Tri-, oder Tetrabodies sein. Die Antikörper können mono- oder polyklonale Antiköper sein. Solche Antikörper und/oder davon abgeleitete Derivate können über verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren, wie z.B. die Hybridom-Technologie oder rekombinante Verfahren wie die Phagen-Display-Technolgie, gewonnen werden. Die auf dieser Basis gewonnenen Antikörper können in diagnostischen Testsystemen oder zur therapeutischen Nutzung eingesetzt werden. Eine solche therapeutische Nutzung kann beispielsweise durch Einsatz solcher Antikörper und/oder davon abgeleitete Derivate in therapeutischen Impfungen, Injektion oder Gentherapie erfolgen.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des TTR oder davon abgeleiteten Derivaten für den therapeutischen Einsatz bei Entzündungserkrankungen. Ein solcher therapeutischer Einsatz kann z.B.
durch direkte Zugabe von TTR oder durch kontrollierte Gentherapie als TET-ON/TET-OFF System erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Kits zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen. Solche Kits können TTR und/oder dessen Derivate und/oder Komponenten enthalten, welche TTR und/oder dessen Derivate spezifisch erkennen. Solche Komponenten können beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente, Nukleinsäuren, Peptidonukleotide oder Aptamere sein. Weiterhin können solche Kits Reagenzien enthalten, welche zur Probenvorbereitung oder Detektion benötigt werden. Solche Reagenzien sind z.B. Farbstoffe, Enzyme, Primer, radioaktive Substanzen, Puffer oder Trägermaterialien sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kit Bestandteil einer Vorrichtung, welche verschiedene Schritte der Bestimmung und/oder Auswertung der TTR-Konzentration semi- oder vollautomatisch ausführt.

Weitere Vorteile und Merkmal der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigt:

1 detaillierte Charakteristika der Patientengruppen.

Ausführungsbeispiel

Das Ausführungsbeispiel beschreibt ein Verfahren zur in vitro Bestimmung von TTR bei Sepsispatienten und die Eignung von TTR zur Unterscheidung zwischen Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung und einer Sepsis.

Für die Untersuchungen wurden die Plasmaproben von folgenden zwei Patientenkollektiven untersucht:
Kontrollgruppe: Diese Gruppe umfasste 31 Patienten, welche im Laufe ihrer intensivmedizinischen Behandlung niemals Zeichen einer Infektion aufwiesen und bei denen Procalcitonin (PCT)-Konzentrationen nur im Normbereich (≤ 0.3 ng/ml) gemessen wurden. Die Plasmaproben sämtlicher Patienten dieser Patientengruppe wurden vereinigt und ein 8 ml-Aliquot entnommen.
Sepsis-Patienten: Diese Gruppe umfasste 44 intensivmedizinisch behandelte Patienten mit unterschiedlichen Schweregraden an Sepsis und Organdysfunktionen und signifikant erhöhten PCT-Konzentration (≥ 0.3 ng/ml). Die Plasmaproben sämtlicher Patienten dieser Patientengruppe wurden ebenfalls vereinigt und ein 8 ml-Aliquot entnommen.

Detaillierte Charakteristika der Patientengruppen sind in 1 dargestellt. 1 zeigt eine Box-Plot Darstellung ausgewählter klinischer Parameter der untersuchten Patientengruppen. Für den statistischen Vergleich wurde ein geeigneter globaler Test angewandt (vgl. Legende unterhalb der x Achse). Für Vergleiche mit p < 0.05 wurde zusätzlich der multiple t-Test post hoc durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede (p < 0.05) sind hervorgehoben Das Ausführungsbeispiel beschreibt ein Verfahren zur in vitro Bestimmung von TTR bei Sepsispatienten und die Eignung von TTR zur Unterscheidung zwischen Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung (SIRS) und einer Sepsis.

Probenvorbereitung

Ammoniumsulfat-Präzipitation: Jeweils 8 ml der vereinigten Plasma der Kontroll- und Sepsispatienten (ca. 560 mg Gesamtprotein) wurden bei 0° C mit Ammoniumsulfat (40% Endkonzentration) gefällt.
Die Pellets wurden mit 40 mM Na-Phosphatpuffer gelöst und anschließend gegen 3 × 4 l 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 dialysiert.

Entfernung der Immunglobuline: Eine ProteinG-Säule mit jeweils 5 ml Protein G-Sepharose (Kapazität > 25 mg/ml) wurden für die Entfernung von Immunglobulinen (IgG) eingesetzt. Die Chromatographie der Plasmaproben wurde in Gegenwart von 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 durchgeführt.

Nach der Abreicherung von Albumin und Immunglobulinen waren noch ca. 100 mg Gesamtprotein in den beiden Probenansätzen vorhanden. Vor der Anionenaustausch Chromatographie wurden die beiden Ansätze gegen Tris-HCL, pH 8,0 dialysiert.

Fraktionierung der Proteine: Für die Fraktionierung der Proteine der Plasmaproben wurde eine Anionenaustausch-Chromatographie mittels ÄKTA-Purifier (Amersham Biosciences) durchgeführt. Es wurde eine Resource Q [Polystyrol/Divinylbenzol-Säulenmaterial mit quarternären Ammoniumgruppen] 6ml Anionenaustauscher-Säule verwendet. Die Ansätze wurden zuvor auf 1 mM DTT eingestellt und durch einen 0,2 μm Filter (Millipore) filtriert. Die Anionenaustausch-Chromatographie wurde mit folgenden Puffer betrieben:
Puffer A: Tris-HCL, pH 8,0; 0,5 mM DTT.
Puffer B: Tris-HCL, pH 8,0; 1 M NaCl; 0,5 mM DTT.

Die Bindung der Probe an die äquilibrierte Säule und das Auswaschen nichtbindender Proteine erfolgte mit 100% Puffer A. Die Elution (Fraktionierung) wurde durch Verwendung eines programmierten Stufengradienten mit 5, 10, 15, 20, 30, 60, und 100 % Puffer B durchgeführt. Dabei sind jeweils 7 Fraktionen mit 50, 100, 150, 200, 300, 600 und 1000 mM NaCl entstanden. Die Fraktionen wurden lyophilisiert und das Lyophilisat mit ddH₂O gelöst.

Die gelösten Proteine wurden vor der Analyse zur Entsalzung gegen 20 mM Tris-HCl dialysiert.

Analyse der Proteinfraktionen

Für die Analyse wurden die Proteinfraktionen zunächst einer isoeletrischen Fokussierung mittels 2D-Polyacrylgelelektrophorese (2D-PAGE) unterzogen. Nach anschließender Anfärbung mit Silber wurden die Spotintensitäten der 2D-Gele kalkuliert und die Werte für die Kontrollpatienten mit denen der Sepsispatienten verglichen. Nach Auswahl der Spots, die signifikante Unterschiede der Spotintensitäten zwischen Kontroll- und Sepsispatienten aufwiesen, wurden diese Spots massenspektrometrisch mittels MALDI Peptide Mass Fingerprint (MALDI-PMF) identifiziert.

Detaillierte Beschreibung der Spotanalyse

Für die vergleichende Analyse wurden aus den entsprechenden Fraktionen jeweils 500 μg Protein entnommen und mit Methanol und Chloroform gefällt. Die Pellets wurden mit IEF-Lysis Puffer aufgenommen und resolubilisiert. Nach der Vervollständigung des IEF-Puffers wurden die Proben einer isoelektrischen Fokussierung in 17cm IEF-Strips (pH 5-8) unterzogen (Bio-Rad).

IEF Programm:

Temperatur 20 °C
Aktive Rehydrierung (50 V; 16 h; Pause nach Rehydrierung)

Programmschritte:

S 01: 200 V; rapid slope; 2 h
S 02: 400 V; rapid slope; 2 h
S 03: 600 V; rapid slope; 2 h
S 04: 1000 V; rapid slope; 2 h
S 05: 2000 V; rapid slope; 2 h
S 06: 3500 V; 40.000-60.000 V/h; 11 bis 17 min
S 07: 250 V; 24 h

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Elektrophorese (SDS-PAGE) erfolgte bei 15° C unter Kühlung. Für die Kühlung wird ein geschlossener Kühlkreislauf verwendet (Lauda WK 1400). Die Elektrophorese wurde nach folgendem Schema durchgeführt:

Programmschritte:

50 V; 1 h
80 V; 1 h
100 V; 1 h
300 V; 4,5 h

Die fertigen SDS-PAGE-Gele wurden entweder mit Coomassie Brilliant Blue G250 angefärbt, oder nach der Methode von Shevchenko mit Silber gefärbt [43].

Die Auswertung der Spotmuster erfolgte mit der 2D Gel-Auswertesoftware PD-Quest (BIO-RAD). Für die Normalisierung der entsprechenden Gele wurde eine globale Normalisierungsmethode über die Gesamtintensität aller validen Spots angewandt. Die Normalisierten Gele wurden in einem „Matchset" zusammengefasst und die übereinstimmenden Proteinspots einander zugeordnet. Die normalisierten Spotintensitäten wurden verglichen und Spots mit relativen Spotintensitäten > 2 bzw. < 0.5 wurden markiert. Die markierten Proteinspots, d.h. Spots, die auf eine differentielle Plasma-Konzentration einer spezifischen Proteinspezies hinweisen, wurden ausgeschnitten und mit Hilfe des MALDI-Peptide Mass Fingerprint (MALDI-PMF) Verfahrens bzw. mit MS/MS und dem Abgleich der Ergebnisse mit der Datenbank SwissProt-Datenbank (Swiss Institute of Bioinformtics, http://www.swissprot.com) identifiziert.

Ergebnisse

Die 2D-Gele zeigten bei einer Beladung von ca. 500μg eine ausreichende Trennung im Bereich unterhalb ca. 50 kDa. Die Auswertung der mit Silber angefärbten 2D-Gele wies 44 Spots mit signifikant unterschiedlicher Spotintensität nach. Durch die massenspektrometrische Analyse der Spots und dem anschließenden Abgleich dieser Ergebnisse mit der Sequenzdatenbank Swissprot wurde das Protein TTR eindeutig identifiziert. Dabei wurde festegestellt, dass die Spotintensität bei Sepsispatienten (SI = 568,1) gegenüber der Spotintensität bei den Kontrollpatienten (SI = 23,0) ca. 25-fach signifikant erhöht war.

Die Ergebnisse belegen damit eindeutig, dass ein erhöhter Gehalt von TTR in Intensivpatienten auf das Vorliegen einer Sepsis schließen lässt. Damit ist das Verfahren für die Erfindung anwendbar.

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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Probe eines Patienten den Gehalt von Transthyretin und/oder davon abgeleiteten Derivaten bestimmt und erfasst, ob der Wert, bezogen auf eine Kontrollgruppe höher oder niedriger liegt, um auf das Vorliegen einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Transthyretin und/oder davon abgeleiteten Derivaten bei Patienten mit Sepsis signifikant erhöht ist gegenüber dem Gehalt an Transthyretin in Patienten, welche an einer generalisierten akuten Entzündung erkrankt sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Transthyretin eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID #1 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass dass unter Derivaten Mutationen, Modifikationen, Peptide oder Nukleinsäuren verstanden werden, welche vom Transthyretin abgeleitet sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus dem Vollblut, Blutbestandteilen oder der Leber stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Serum oder Plasma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Transthyretin mittels eines Immunoassays erfaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoassay mittels eines gegen Transthyretin gerichteten Antikörpern durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Transthyretin parallel mit anderen Proteinen im Rahmen einer Multiparameterbestimmung zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Multiparameter-Bestimmung mittels eines Proteinchips oder einer immunchromatographischen Messvorrichtung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Messergebnisse computergestützt ausgewertet werden.
Verwendung von Transthyretin zur Herstellung von Antikörpern zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 und/oder zur therapeutischen Nutzung bei Sepsis.
Kit zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit Komponenten enthält, welche Transthyretin oder dessen Derivative spezifisch erkennen.
Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten ausgewählt werden aus einer Gruppe von Antikörpern, Nukleinsäuren, Peptidonukleotiden,
Kit nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten in ein semi-automatiserten oder automatisierten Vorrichtung integriert sind.