DE112021006226T5

DE112021006226T5 - Neuartiger biomarker zur diagnose von alzheimer-krankheit, der in einem aus blut gewonnenen exosom entdeckt wurde, und verfahren zum diagnostizieren von alzheimer-krankheit unter verwendung desselben

Info

Publication number: DE112021006226T5
Application number: DE112021006226.3T
Authority: DE
Inventors: So Youn Kim; Gunjoo Park
Original assignee: PCL Inc
Current assignee: PCL Inc
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2024-02-22
Also published as: WO2022114920A1; GB202309912D0; KR20220076406A; JP2023551327A; US20240053365A1; CN117222893A; GB2616796A; WO2022114920A9

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Exosom-abgeleiteten Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, eine Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, die den Biomarker beinhaltet, ein Kit zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, das die Zusammensetzung enthält, und ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit unter Verwendung des Biomarkers, der Zusammensetzung oder des Kits. Der Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann weitgehend für eine effektive Diagnose von Alzheimer-Krankheit und weiter zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit verwendet werden, da nicht nur die Diagnoserate von Alzheimer-Krankheit erhöht werden kann, sondern auch die Exaktheit, Empfindlichkeit und Spezifität durch unterteilte Diagnose den Krankheitsstadien (gesund, MCI und AD) von Alzheimer-Krankheit entsprechend unter Verwendung des Biomarkers erhöht werden können.

Description

[Technisches Gebiet]
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuartigen Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, der in einem aus Blut gewonnenen Exosom entdeckt wurde, und ein Verfahren zum Diagnostizieren von Alzheimer-Krankheit unter Verwendung desselben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen neuartigen Exosom-abgeleiteten Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, eine Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, die den Biomarker beinhaltet, ein Kit zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, das die Zusammensetzung enthält, und ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit unter Verwendung des Biomarkers, der Zusammensetzung oder des Kits.
[Allgemeiner Stand der Technik]
Alzheimer-Krankheit, eine degenerative Hirnerkrankung, die 60% bis 70% von Demenz ausmacht, ist die repräsentativste Krankheit bei älteren Menschen. Alzheimer-Krankheit tritt bei 10% von Menschen im Alter von 65 bis 74, 19% von Menschen im Alter von 75 bis 84, und 47% von Menschen im Alter von 85 oder älter auf und ihre Ausbruchsrate steigt jedes Jahr und die Krankheit ist als ein wesentliches soziales Problem in Erscheinung getreten.
Die bestehenden Produkte sind enzymgebundene Immunabsorptionstest-(ELISA) Kits für Amyloid β-Peptid und Gesamt-Tau- und phosphorylierte Tau-Proteine, die in Studien zur Alzheimer-Krankheit bisher identifiziert wurden, die nur Informationen über die Proteine liefern und in der Diagnose nicht sehr hilfreich sind.
Der Markanteil und der Bekanntheitsgrad führender Produkte von Kits zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit sind unwesentlich, ein Biomarker bietet geringe Exaktheit der Diagnose von Alzheimer-Krankheit und es ist notwendig, die Diagnoserate durch Erstellen eines Biomarker-Panels zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit zu erhöhen.
Übrigens zeigen Exosom-abgeleitete Extrakte eine klarere Beziehung zwischen Krankheiten und Biomarkern als allgemeine Plasmaextrakte und können hoch gereinigt sein, und Studien zum Entdecken von Biomarkern aus Exosom-abgeleiteten Extrakten werden derzeit aktiv durchgeführt.
[Offenbarung]
[Technisches Problem]
Die gegenwärtigen Erfinder haben einen neuartigen Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit anhand von zuverlässigeren, aus Blut gewonnenen Exosomen entdeckt und ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, die zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit erforderlich sind, unter Verwendung des Biomarkers entwickelt.
[Technische Lösung]
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen eines neuartigen Biomarkers zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, der in einem aus Blut gewonnenen Exosomen entdeckt wurde.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen eines Verfahrens zum Bereitstellen von Informationen, die zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit erforderlich sind, unter Verwendung des Biomarkers, einer Zusammensetzung oder eines Kits.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen einer Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, die ein Mittel zum Messen eines Expressionswerts des Biomarkers beinhaltet.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen eines Kits zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, das die Zusammensetzung enthält.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen eines Verfahrens zum Bereitstellen von Informationen, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, unter Verwendung des Biomarkers, der Zusammensetzung oder des Kits.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen einer Verwendung des Biomarkers zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit für die Zubereitung einer Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist Bereitstellen einer Verwendung der Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, um Alzheimer-Krankheit zu diagnostizieren.
[Vorteilhafte Wirkungen]
Der Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann weitreichend für eine wirksame Diagnose von Alzheimer-Krankheit und weiter zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit benutzt werden, da nicht nur die Diagnoserate von Alzheimer-Krankheit erhöht werden kann, sondern auch die Exaktheit, Empfindlichkeit und Spezifität durch unterteilte Diagnose den Krankheitsstadien (gesund, MCI und AD) von Alzheimer-Krankheit entsprechend unter Verwendung des Biomarkers erhöht werden kann.
[Kurze Beschreibung der Zeichnungen]

1 ist eine schematische Darstellung, die ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen veranschaulicht, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird;
2A und 2B sind Diagramme, die die Ergebnisse einer ersten und zweiten Analyse von Exosomprobenproteomik veranschaulichen, unterteilt in zunehmende und abnehmende Marker;
3 veranschaulicht sechs Biomarker (MYH9, TSP1, TERA, APOM, APOC3 und APOA4), deren Zunahme- und Abnahmemuster in Folge der ersten und zweiten Proteomikanalyse weitgehend überlappen;
4A ist ein Mustersatz mit Kandidaten, die eine steigende Tendenz in der Reihenfolge einer leichten kognitiven Beeinträchtigung und Alzheimer-Krankheit zeigen, mit dem niedrigsten Unterschied in Expression in einer gesunden Kontrollgruppe;
4B ist ein Mustersatz mit Kandidaten, die eine spezifische steigende Tendenz bei leichter kognitiver Beeinträchtigung zeigen;
4C ist ein Mustersatz mit Kandidaten, die eine spezifische steigende Tendenz bei Alzheimer-Krankheit zeigen;
4D ist ein Mustersatz mit Kandidaten, die die höchste Expression in einer gesunden Kontrollgruppe zeigen;
5 ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Auswählen eines Übergangs eines Zielpeptids zusammenfasst;
6 ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Optimieren eines Übergangs eines Ziel-SIS-Peptids zusammenfasst;
7 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Durchführung einer MRM-Analyse unter Verwendung eines endgültigen optimierten SIS-Peptids veranschaulicht;
8A ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Bestätigung und Validierung des Übergangsexpressionsunterschieds AD-spezifischer Proben durch AuDIT-Analyse veranschaulicht;
8B ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Bestätigung und Validierung des Übergangsexpressionsunterschieds MCI-spezifischer Proben durch AuDIT-Analyse veranschaulicht;
9 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Analyse einzelner Proben in einem Trainingssatz veranschaulicht;
10 veranschaulicht ROC-Kurven von Biomarker-Kandidaten 1 und 5, die durch Analyse einzelner Proben erhalten wurden;
11 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Analyse der Expressionswerte von drei Biomarkern (ITGB3, APOA4 und CRP) den Krankheitsstadien von Alzheimer-Krankheit entsprechend veranschaulicht;
12 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Durchführung eines Paartests an acht geklonten Antikörpern durch Sandwich-ELISA veranschaulicht;
13 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Paartests an acht geklonten Antikörpern durch Sandwich-ELISA veranschaulicht;
14A ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Messen von Antigen-Antikörper-Affinität veranschaulicht;
14B veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 1 für ein Antigen;
14C veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 3 für ein Antigen;
14D veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 6 für ein Antigen;
15 ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Entwickeln eines Alzheimer-Krankheit-Diagnosekits und Testen der Leistung des Kits veranschaulicht;
16 ist eine schematische Darstellung, die eine Biomarker-Kombination veranschaulicht, die in einem Alzheimer-Krankheit-Diagnosekit enthalten ist;
17 ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Aufbringen eines Biomarkers und dann Durchführen eines Tests veranschaulicht, wenn ein Kit, der mit einem Marker Tau, der mit Alzheimer-Krankheit verknüpft ist, als ein Beispiel konstruiert wird;
18 ist eine schematische Darstellung, die die Spotting-Reihenfolge von drei Biomarkern veranschaulicht;
19 ist eine Fotografie, die einen Prozess zum Erstellen einer Bedingung für die Form eines Spots gemäß einem Konzentrationsunterschied eines aufzubringenden Antikörpers veranschaulicht;
20A ist eine Fotografie, die die Ergebnisse eines Versuchs, APOA4-Spotting-Bedingungen zu finden, veranschaulicht;
20B veranschaulicht die Ergebnisse einer Durchführung eines Tests an Niedertiter-, Mitteltiter- und Hochtiter-Proben unter Bedingungen, die als am geeignetsten angesehen werden, unter den APOA4-Spotting-Zusammensetzungen;
21 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung eines ITGB3-Screeningtests veranschaulicht;
22 ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Spotting-Tests an einem CRP-Marker veranschaulicht;
23 ist ein Diagramm, das spezifische Spotting-Zusammensetzungen für APOA4, CRP und ITGB3 veranschaulicht;
24 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von Testbedingungen zum Stabilisieren gespotteter Antikörper nach Spotting von drei Markern veranschaulicht;
25 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Blockierungstests an gespotteten Antikörpern nach Spotting von drei Markern veranschaulicht;
26 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Trocknungstests an gespotteten Antikörpern nach Spotting von drei Markern veranschaulicht;
27 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von Testbedingungen eines Probenverdünnungsmittels veranschaulicht;
28 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von Testbedingungen eines Konjugatverdünnungsmittels veranschaulicht;
29A ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an ITGB3 veranschaulichen;
29B ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an APOA4 veranschaulichen;
29C ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an CRP veranschaulichen;
30 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Analyse einer tatsächlichen Probe unter Verwendung eines fertig konstruierten Kits veranschaulicht;
31 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Korrelationsanalyse für einen ITGB3-Marker veranschaulicht; und
32 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Korrelationsanalyse für einen APOA4-Marker veranschaulicht.

[Beste Form zur Ausführung der Erfindung]
Zur Lösung der oben beschriebenen Aufgaben stellt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit, der ein Protein enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon.
Durch die SG Cap-Technologie, die Kerntechnologie der gegenwärtigen Antragsteller, wurde ein Multi-Biomarker-Diagnosekit entwickelt, das gleichzeitig einen bestehenden Marker und einen neu entdeckten Marker anstelle eines einzigen Biomarkers detektieren kann, und es wird erwartet, dass die Exaktheit, Empfindlichkeit und Spezifität einer Diagnose, die in bestehenden Kits mit einem einzigen Biomarker fehlten, erhöht werden können. Der Inhalt der Kerntechnologie ist in den Koreanischen Patenten Nr. 10-1274765 , 10-0784437 und 10-1547643 beschrieben.
Um ein Verfahren zur objektiven Evaluierung und Diagnose des Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit zu entwickeln, haben die gegenwärtigen Erfinder verschiedene Studien durchgeführt, um Proteinmarker zu entdecken, deren Expressionswerte sich in Abhängigkeit vom Ausbruch der Alzheimer-Krankheit unter den Proteinen im Serum ändern. Infolgedessen haben die gegenwärtigen Erfinder bestätigt, dass sich die Expressionswerte von APOA4 und ITGB3 in Abhängigkeit vom Ausbruch der Alzheimer-Krankheit ändern und APOA4 und ITGB3 als Marker entdeckt.
Der Begriff „Diagnose“ der vorliegenden Erfindung enthält einen Vorgang zum Bestimmen der Anfälligkeit eines Probanden für eine bestimmte Krankheit oder Störung, einen Vorgang zum Bestimmen, ob ein Proband gegenwärtig an einer bestimmten Krankheit oder Störung leidet, einen Vorgang zum Bestimmen der Prognose eines Probanden, der an einer bestimmten Krankheit oder Störung leidet, oder Therametrik (zum Beispiel einen Vorgang zum Überwachen des Zustands eines Probanden, um Informationen über die Wirksamkeit der Behandlung zu erhalten).
In der vorliegenden Erfindung kann die Diagnose von Alzheimer-Krankheit als ein Vorgang zum objektiven Bestimmen des Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit bei einem Zielpatienten oder des Krankheitsstadiums von Alzheimer-Krankheit, wenn die Krankheit entwickelt wurde, interpretiert werden.
Der Begriff „APOA4 (Apolipoprotein A-IV)“ der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Art von Plasmaprotein, das durch das APOA4-Gen exprimiert wird und als apoA-IV, apoAIV oder apoA4 bezeichnet werden kann. Nach Expression eines Proteins, das aus 396 Aminosäuren besteht, von dem Gen, APOA4, wird ein Glycoprotein, das aus 376 Aminosäuren besteht, durch einen Reifungsprozess exprimiert. Bei den meisten Säugetieren ist bekannt, dass APOA4 im Darm exprimiert und in das Kreislaufsystem sezerniert wird. Die Informationen über die spezifische Aminosäuresequenz von APOA4 oder die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Protein codiert, ist in einer Datenbank wie NCBI angeführt. Zum Beispiel ist die Sequenz als GenBank Zugriffsnr. NP_031494, NM_007468, NM_000482 und dergleichen angeführt.
Der Begriff „ITGB3 (Integrin β3)“ der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Peptid, das Integrin, eines der Zelloberflächenproteine, bildet, und es ist bekannt, dass das Integrin an der Zelladhäsion und zelloberflächenvermittelten Signalweiterleitung beteiligt ist. Die Informationen über die spezifische Aminosäuresequenz von ITGB3 oder die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Protein codiert, ist in einer Datenbank wie NCBI angeführt. Zum Beispiel ist die Sequenz als GenBank Zugriffsnr. NM_000212, NM_016780, NP_000203, NP_058060 und dergleichen angeführt.
Der Biomarker zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann weiter CRP enthalten.
Der Begriff „CRP (C-reaktives Protein)“ der vorliegenden Erfindung ist ein ringförmiges Pentamer-Protein, das im menschlichen Plasma vorkommt, in der Leber synthetisiert wird und häufig als Testinstrument verwendet wird, um zu bestimmen, ob sich der menschliche Körper in einem Entzündungszustand befindet, da die Konzentration von CRP im Blut ansteigt, wenn sich der menschliche Körper in einem Entzündungszustand befindet. Die Informationen über die spezifische Aminosäuresequenz von CRP oder die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Protein codiert, ist in einer Datenbank wie NCBI angeführt. Zum Beispiel ist die Sequenz als GenBank Zugriffsnr. NM_007768, NP_031794 und dergleichen angeführt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, die zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit erforderlich sind, unter Verwendung des Biomarkers, einer Zusammensetzung oder eines Kits bereit.
Insbesondere enthält das Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, die zum Bestimmen des Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit erforderlich sind, der vorliegenden Erfindung (a) quantitatives Analysieren eines Expressionswerts eines Markerproteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon, in einer Serumprobe eines Probanden, der kein Mensch ist, mit Verdacht auf Alzheimer-Krankheit; und (b) Verknüpften des quantitativ analysierten Werts des Markerproteins mit Bestimmung eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit.
Der Begriff „Proband“ der vorliegenden Erfindung kann ohne Einschränkung Säugetiere, enthaltend Mäuse, Nutztiere, Menschen und dergleichen, Zuchtfische und dergleichen, enthalten, die Alzheimer-Krankheit haben oder wahrscheinlich entwickeln werden.
In der vorliegenden Erfindung kann jedes dem Fachmann bekannte Verfahren im Schritt zum quantitativen Analysieren des Proteinexpressionswertes verwendet werden. Als spezifische Beispiele können PCR, Ligasekettenreaktions- (LCR), Transkriptionsamplifikations-, autonome Sequenzreplikations- und Nukleinsäurebasierte Sequenzamplifikations- (NASBA) Verfahren und dergleichen verwendet werden, wobei das Verfahren nicht darauf beschränkt ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die Aminosäuresequenz des Markerproteins zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit gemäß der vorliegenden Erfindung oder die Nukleotidsequenz des Gens, das für das Protein kodiert, in einer Datenbank wie NCBI bekannt und der Fachmann kann ein geeignetes Mittel verwenden, das zum Messen des Proteinexpressionswerts notwendig ist.
Die quantitativ analysierten Werte der jeweiligen Proteine variieren je nach Zustand des Patienten, daher ist es nicht einfach, nur den quantitativ analysierten Wert eines der Proteine zum Bestimmen des Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit zu verwenden, und die quantitativ analysierten Werte der jeweiligen Proteine können kombiniert und analysiert werden, um den Ausbruch von Alzheimer-Krankheit zu bestimmen.
Als Beispiel für das Verfahren zum Kombinieren und Analysieren der jeweiligen quantitativen Analyseergebnisse für die Proteine kann ein Verfahren angenommen werden, bei dem der Ausbruch von Alzheimer-Krankheit unter Verwendung des quantitativen Analysenwerts jedes Proteins, der von einer Serumprobe gemessen wird, einzeln oder in Kombination bestimmt wird.
Als weiteres Beispiel für ein Verfahren zum Kombinieren und Analysieren der jeweiligen quantitativen Analyseergebnisse für die Proteine kann ein herkömmliches statistisches Analyseverfahren angenommen werden. Dabei ist das statistische Analyseverfahren, das verwendet werden kann, nicht besonders eingeschränkt, sondern es können beispielsweise ein lineares oder nichtlineares Regressionsanalyseverfahren; ein lineares oder nichtlineares Klassifikationsanalyseverfahren; ANOVA; ein neuronales Netzwerkanalyseverfahren; ein genetisches Analyseverfahren; ein Support-Vector-Machine-Analyseverfahren; ein hierarchisches Analyse- oder Clustering-Analyseverfahren; ein Analyseverfahren mit hierarchischem Algorithmus mit Entscheidungsbäumen oder Kernel-Hauptkomponenten; ein Markov Blanket-Analyseverfahren; ein rekursives Merkmalseliminierungs- oder entropiebasiertes rekursives Merkmalseliminierungsanalyseverfahren; ein Forward-Floating-Search- oder Backward-Floating-Search-Analyseverfahren; und dergleichen einzeln oder in Kombination verwendet werden.
Die Kombination der quantitativen Analyseergebnisse kann mit Hilfe eines Computeralgorithmus durchgeführt werden, der in der Lage ist, das statistische Verfahren automatisch durchzuführen.
Das Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, die zum Bestimmen des Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit erforderlich sind, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann weiter einen Schritt zum quantitativen Analysieren des Expressionswerts von CRP-Protein in Schritt (a) enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit, die ein Mittel zum Messen des Expressionswerts der Biomarker enthält.
Der Begriff „Mittel zum Messen des Expressionswerts“ der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Mittel, das imstande ist, spezifisch an das Protein oder mRNA, die für das Protein codiert, zu binden oder diese(s) zu erkennen oder die miRNA zu amplifizieren. Spezifische Beispiele hierfür enthalten, ohne aber darauf beschränkt zu sein, einen Antikörper, der spezifisch an das Protein bindet, ein Primer oder eine Sonde, die spezifisch an die miRNA bindet, und Fachleute werden imstande sein, ein geeignetes Mittel für den Zweck der Erfindung auszuwählen.
Das Mittel kann direkt oder indirekt markiert sein, um den Expressionswert des Proteins oder der mRNA zu messen. Als Marker können insbesondere Liganden, Beads, Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzstoffe, chemilumineszente Materialien, magnetische Partikel, Haptene, Farbstoffe und dergleichen verwendet werden, wobei die Marker nicht darauf beschränkt ist. Als spezifische Beispiele enthalten Liganden Biotin, Avidin, Streptavidin und dergleichen, die Enzyme enthalten Luciferase, Peroxidase, beta-Galactosidase und dergleichen und die Fluoreszenzstoffe enthalten Fluorescein, Cumarin, Rhodamin, Phycoerythrin, Sulforhodamsäurechlorid (Texas Red) und dergleichen, aber der Marker ist nicht darauf beschränkt. Die meisten bekannten Marker können als solche nachweisbaren Marker verwendet werden, und der Fachmann wird in der Lage sein, je nach Zweck der Erfindung geeignete Marker auszuwählen.
Der Begriff „Antikörper“ der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein proteinartiges Molekül, das in der Lage ist, spezifisch an eine antigene Stelle eines Protein- oder Peptidmoleküls zu binden, und ein solcher Antikörper kann durch Klonierung jedes Gens in einen Expressionsvektor nach einem konventionellen Verfahren hergestellt werden, um ein durch das Markergen kodiertes Protein zu erhalten und das erhaltene Protein durch ein konventionelles Verfahren zum Antikörper zu formen. Die Form des Antikörpers ist nicht besonders eingeschränkt und jeder polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper oder ein Teil davon mit Antigen-bindenden Eigenschaften ist ebenfalls in dem Antikörper der vorliegenden Erfindung enthalten und kann nicht nur alle Immunglobulin-Antikörper, sondern auch spezielle Antikörper wie humanisierte Antikörper enthalten. Der Antikörper enthält sowohl funktionelle Fragmente des Antikörper-Moleküls als auch vollständige Formen mit zwei leichten Ketten in voller Länge und zwei schweren Ketten in voller Länge. Ein funktionelles Fragment eines Antikörper-Moleküls bezieht sich auf ein Fragment mit mindestens einer Antigen-bindenden Funktion und kann Fab, F(ab'), F(ab')2 und Fv umfassen.
Der Begriff „Primer“ der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleotidsequenz mit einer kurzen freien 3'-terminalen Hydroxylgruppe und bezieht sich auf eine kurze Sequenz, die imstande ist, Basenpaare mit einem komplementären Template zu bilden und als Ausgangspunkt für das Kopieren des Templatenstrangs zu dienen. In der vorliegenden Erfindung kann der für die miRNA-Amplifikation verwendete Primer ein einzelsträngiges Oligonukleotid sein, das unter geeigneten Bedingungen (z. B. vier verschiedene Nukleosidtriphosphate und polymerisierende Agenzien wie DNA, RNA-Polymerase oder reverse Transkriptase) in einem geeigneten Puffer bei einer geeigneten Temperatur als Ausgangspunkt für die Template-gesteuerte DNA-Synthese dienen kann, wobei die geeignete Länge des Primers je nach Verwendungszweck variieren kann. Die Primersequenz muss nicht vollständig komplementär zum Polynukleotid der miRNA des Gens oder dessen komplementärem Polynukleotid sein und es kann jeder Primer verwendet werden, solange seine Sequenz für die Hybridisierung ausreichend komplementär ist.
Der Begriff „Sonde“ der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein markiertes Nukleinsäurefragment oder Peptid, das imstande ist, spezifisch an miRNA zu binden. Als spezifisches Beispiel kann die Sonde in Form von Oligonukleotid-Sonden, einzelsträngigen DNA-Sonden, doppelsträngigen DNA-Sonden, RNA-Sonden, Oligonukleotid-Peptid-Sonden oder Polypeptid-Sonden hergestellt werden.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Kit zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit, das eine Quantifizierungsvorrichtung zum Messen des Expressionswerts des Biomarkers enthält.
Die Quantifizierungsvorrichtung, die in dem Diagnosekit der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kann den Expressionswert des Markerproteins messen. Als ein spezifisches Beispiel kann das Kit ein RT-PCR Kit oder ein ELISA Kit sein, ist aber nicht darauf beschränkt, solange der Expressionswert von miRNA oder Protein gemessen werden kann.
In diesem Fall kann es sich bei dem RT-PCR-Kit um ein Kit handeln, das wesentliche Elemente enthält, die zur Durchführung der RT-PCR erforderlich sind. Zum Beispiel kann das RT-PCR Kit Reagenzgläser oder andere geeignete Gefäße, Reaktionspuffer (mit verschiedenen pH-Werten und Magnesiumkonzentrationen), Desoxynukleotide (dNTPs), Didesoxynukleotide (ddNTPs), Enzyme wie Taq-Polymerase und Reverse Transkriptase, DNase, RNAse-Inhibitoren, DEPC-Wasser, steriles Wasser und dergleichen zusätzlich zu jedem Primer, der für das Gen spezifisch ist, enthalten. Ein für ein Gen spezifisches Primerpaar, das als Quantifizierungskontrolle verwendet wird, kann ebenfalls enthalten sein.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen von Informationen bereit, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit unter Verwendung des Biomarkers, der Zusammensetzung oder des Kits zu bestätigen.
Insbesondere enthält das Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, der vorliegenden Erfindung (a) quantitatives Analysieren eines Expressionswerts eines Markerproteins, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon, in einer Serumprobe eines Probanden, der kein Mensch ist, mit Verdacht auf Alzheimer-Krankheit; und (b) Verknüpften des quantitativ analysierten Werts des Markerproteins mit Bestimmung eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit.
In dem Verfahren sind „Proband“, „quantitative Analyse von Proteinexpressionswert“, „Kombination quantitativer Analyseergebnisse“ und dergleichen wie oben beschrieben.
Das Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, kann weiter einen Schritt zum quantitativen Analysieren des Expressionswerts von CRP-Protein in Schritt (a) enthalten.
In dem Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, sind die Krankheitsstadien von Alzheimer-Krankheit gesunde Kontrolle (HC) - leichte kognitive Beeinträchtigung (MCI) - Alzheimer-Krankheit (AD), die in Stufen mit zunehmender Schwere diagnostiziert werden können. Als ein Beispiel kann APOA4 als ein MCI-spezifischer Marker zum separaten Diagnostizieren von HC, AD und MCI verwendet werden und ITGB3 kann zum separaten Diagnostizieren von HC und AD verwendet werden (1).
1 ist eine schematische Darstellung, die das Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, um das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, veranschaulicht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Verwendung des Biomarkers zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit für die Herstellung einer Zusammensetzung oder eines Kits zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Verwendung der Zusammensetzung oder des Kits zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bereit, um Alzheimer-Krankheit zu diagnostizieren.
[Form zur Ausführung der Erfindung]
In der Folge wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen ausführlicher beschrieben. Diese Beispiele sind jedoch zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung gedacht und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: Biomarker-Screening
Für die Suche nach Kandidaten für Biomarker, die Alzheimer-Krankheit vorhersagen, wurden Exosome aus dem Blut einer gesunden Kontrollgruppe, einer Patientengruppe mit leichter kognitiver Beeinträchtigung und einer Alzheimer-Krankheit-Patientengruppe extrahiert und dieselben Proben wurden durch Proteomik einer ersten und zweiten Analyse unterzogen. In Folge der ersten und zweiten Analysen wurden dann jeweils 50 Biomarker mit auffälliger Proteinzunahme und - abnahme in der gesunden Kontrollgruppe, der Patientengruppe mit leichter kognitiver Beeinträchtigung und der Patientengruppe mit Alzheimer-Krankheit für jede der ersten und zweiten Analyse ausgewählt. Schließlich wurden Biomarker mit auffällig überlappenden Zu- und Abnahmetypen in der ersten und zweiten Analyse zusammengefasst (2A, 2B und 3).
2A und 2B sind Diagramme, die die Ergebnisse einer ersten und zweiten Analyse einer Exosomprobenproteomik veranschaulichen, unterteilt in zunehmende und abnehmende Marker, und 3 veranschaulicht sechs Biomarker (MYH9, TSP1, TERA, APOM, APOC3 und APOA4), deren Zunahme- und Abnahmetypen in Folge der ersten und zweiten Proteomikanalyse weitgehend überlappen.
Beispiel 2: Validierung von Relevanz von Biomarkern, die in Beispiel 1 ausgewählt wurden, für Alzheimer-Krankheit
Zur Entdeckung von Biomarkern zur Frühdiagnose von Alzheimer-Krankheit, die durch Beispiel 1 erlangt wurden, wurden Exosome aus Plasmaproben von Personen mit Alzheimer-Krankheit (AD), Personen mit leichter kognitiver Beeinträchtigung (MCI) und gesunden Personen, die aus der Schweiz (Universite de Geneve, Neurix) erhalten worden waren, extrahiert und es wurden Studien durchgeführt, um Biomarker für die Vorhersage von Alzheimer-Krankheit und leichter kognitiver Beeinträchtigung zu entdecken und zu validieren.
Beispiel 2-1: Sortieren einer Expression ausgewählter Proteinkandidaten nach Muster vor Biomarkervalidierung
Insgesamt wurden vier Expressionsmuster durch Vergleichen der Unterschiede in Expression der ausgewählten Proteinkandidaten zwischen den Patientengruppen mit Alzheimer-Krankheit und leichter kognitiver Beeinträchtigung erstellt (4A bis 4D).
4A ist ein Mustersatz mit den Kandidaten, die eine zunehmende Tendenz in der Reihenfolge leichte kognitive Beeinträchtigung und Alzheimer-Krankheit zeigen, mit dem geringsten Expressionsunterschied in der gesunden Kontrollgruppe; 4B ist ein Mustersatz mit den Kandidaten, die eine spezifische zunehmende Tendenz bei der leichten kognitiven Beeinträchtigung zeigen; 4C ist ein Mustersatz mit den Kandidaten, die eine spezifische zunehmende Tendenz bei der Alzheimer-Krankheit zeigen; und 4D ist ein Mustersatz mit den Kandidaten, die die höchste Expression in der gesunden Kontrollgruppe zeigen.
Beispiel 2-2: Auswahl repräsentativer Zielpeptide und Übergänge für MRM-Validierung von Biomarker-Kandidaten
Zur MRM-Validierung für ausgewählte Kandidaten für Biomarker, die Alzheimer-Krankheit und leichte kognitive Beeinträchtigung vorhersagen, wurden Zielpeptide ausgewählt, die spezifisch jedes Protein darstellen konnten. Für eine Wirksamkeit der Detektion wurden Peptide, die 6 bis 20 Aminosäuren beinhalteten und Sequenzen beinhalteten, die nicht durch eine post-translationale Proteinmodifikation oder Trypsin fragmentiert waren, ausgeschlossen. Bei der MRM-Analyse wurde der Übergang, der eine Kombination von Vorläufer-Ion (Q1) und Produkt-Ion (Q3) war, die quantitative Werte exprimierte, auch im Bereich von 50 m/z bis 1350 mlz laut Agilent eingestellt, ein Instrument, das im Labor verwendet wird, und es wurden mindestens drei Übergänge pro Peptid ausgewählt (5).
5 ist eine schematische Darstellung, die einen Prozess zum Auswählen der Übergänge eines Zielpeptids zusammenfasst.
Beispiel 2-3: Optimierungsprozess für SIS-Peptidübergang
Mindestens drei Zielpeptide für jedes Zielprotein wurden mit Hilfe einer Online-Bibliothek (SRMAtlas, National Cancer Institute of Cancer Clinical Proteomics, PeptideAtlas) ausgewählt. Ein SIS-Peptid, das die gleiche Sequenz wie das Zielpeptid hatte, aber mit Isotopen (¹³C und ¹⁵N) an Kohlenstoff und Stickstoff von Lysin und Arginin markiert war, wurde bevorzugt synthetisiert und konstruiert. Daraufhin wurde das SIS-Peptid analysiert und eine Übergangsoptimierung durchgeführt (6).
6 ist eine schematische Darstellung, die den Prozess zum Optimieren des Übergangs eines Ziel-SIS-Peptids zusammenfasst.
Der durch das SIS-Peptid optimierte Übergang wurde in Proben, die für die jeweiligen Gruppen von Kontrolle, leichter kognitiver Beeinträchtigung und Alzheimer-Krankheit gepoolt waren, gespikt und gleichzeitig wurde eine MRM-Analyse durchgeführt. Durch die gleichzeitige Analyse von SIS-Peptiden und gepoolten Proben ist es möglich, die genaue Elutionszeit zu bestimmen und die absolute Quantifizierung zu standardisieren. Der detektierte Übergang wurde durch die analytische Reproduzierbarkeit (Variationskoeffizient, CV<20%) und den statistischen Referenzwert (p-Wert<0,05) des AuDIT-Programms (Automated Detection of Inaccurate and Imprecise Transition) als zuverlässiger Übergang bei der Quantifizierung revalidiert (7).
7 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Durchführung einer MRM-Analyse unter Verwendung des endgültigen optimierten SIS-Peptids veranschaulicht.
Infolge der AuDIT-Analyse wurden 1572 Übergänge, die 215 Peptiden entsprechen, als endgültige Kandidaten für die Validierung einzelner Proben ausgewählt.
Beispiel 2-4: Auswahl eines endgültigen Biomarkers, der in der Kitentwicklung verwendet wird, und Validierung eines endgültigen Biomarkers in Patientenprobe
Um die Zuverlässigkeit der Validierung einzelner Proben zu erhöhen, wurde die Analyse durchgeführt, indem alle Proben in zwei unabhängige Kohorten aufgeteilt wurden, einen Trainingssatz und einen Testsatz. Basierend auf den Ergebnissen der Einzelprobenanalyse des Trainingssatzes wurden polynomiale Regressionsanalyse und C-Statistiken zum Analysieren der Alzheimer-Krankheit, der leichten kognitiven Beeinträchtigung und der gesunden Kontrollgruppen verwendet und die Ergebnisse als Grundlage für die Biomarkerauswahl herangezogen und die endgültigen Biomarker unter Berücksichtigung verschiedener anderer Faktoren ausgewählt, die im Folgenden spezifiziert sind.
Derzeit wurde infolge einer Analyse einiger einzelner Proben bestätigt, dass einige Kandidaten signifikante Expressionsunterschiede zwischen den jeweiligen Krankheitsgruppen und der gesunden Kontrollgruppe zeigten (8A und 8B).
8A ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Bestätigung und Validierung des Übergangsexpressionsunterschieds AD-spezifischer Proben durch AuDIT-Analyse veranschaulicht und 8B ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Bestätigung und Validierung des Übergangsexpressionsunterschieds MCI-spezifischer Proben durch AuDIT-Analyse veranschaulicht.
Die Biomarker-Kandidaten wurden durch Überprüfung des AUC-Wertes anhand der Receiver Operating Characteristic (ROC)-Kurve validiert und Biomarker-Kandidaten mit einem AUC-Wert von 0,7 oder mehr, der als der Evaluierungsmaßstab diente, wurden ausgewählt. Danach wurde der durch den Trainingssatz validierte Kandidat als Alzheimer-Krankheit-spezifischer Biomarker durch Analyse einzelner Proben im Testsatz revalidiert (9).
9 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Analyse einzelner Proben in dem Trainingssatz veranschaulicht.
Basierend auf den Ergebnissen der Analyse einzelner Proben wurde entschieden, dass der MCI-spezifische Biomarker-Kandidat 5 (APOA) als Biomarker im Diagnosekit verwendet werden sollte. Die MS/MS-Ergebnisse waren selbst für die zur gleichen Gruppe gehörenden APOA-Biomarker unterschiedlich und es wurde bestätigt, dass insbesondere APOA4 MCI-spezifisch war (10).
10 veranschaulicht ROC-Kurven von Biomarker-Kandidaten 1 und 5, die durch Analyse einzelner Proben erhalten wurden.
Im Fall eines AD-spezifischen Biomarker-Kandidaten 1 (ITGB3) war der ROC-Wert 0,71 und es wurde entschieden, dass der Biomarker-Kandidat 1 mit APOA4 im Diagnosekit verwendet wird. Der AD-spezifische Marker wurde als nützlich zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit ausgewählt, da sein Expressionswert allmählich zunahm, wenn sich die Krankheit von der gesunden Kontrollgruppe zu der MCI-Gruppe und AD-Gruppe verschlechterte.
Schließlich wurde auch der CRP-Biomarker in demselben Well gespottet. CRP erreichte den ROC-Wert nur knapp nicht, was ein internes Kriterium für die Auswahl von Biomarkern ist, aber es wurde ein Versuch unternommen, eine signifikante Korrelation zwischen Alzheimer-Krankheit und dem Biomarker zu finden, als später mehr Daten gesammelt wurden, unter der Berücksichtigung, dass der Biomarker eine Eigenschaft hat, an der entzündlichen Reaktion beteiligt zu sein, und ein Marker war, der in der Literatur mit Alzheimer-Krankheit verknüpft ist.
Beispiel 2-5: Ergebnisse einer Exosomproteomikanalyse
Die Exosome (16HC, 9MCI und 17AD), die aus dem Blut von Patienten in den Stadien einer gesunden Kontrolle, leichten kognitiven Beeinträchtigung (MCI) bzw. Alzheimer-Krankheit (AD) extrahiert wurde, als nach Alzheimer-Krankheit-Biomarkern gesucht wurde, wurden für dasselbe Krankheitsstadium gepoolt, um drei Poolproben für jedes Krankheitsstadium zuzubereiten, und Proteomikanalyse der drei Biomarker (ITGB3, APOA4 und CRP), die oben identifiziert wurden, wurde durchgeführt (11).
11 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Analyse der Expressionswerte von drei Biomarkern (ITGB3, APOA4 und CRP) den Krankheitsstadien von Alzheimer-Krankheit entsprechend veranschaulicht.
Wie in 11 veranschaulicht, da die Expressionswerte der drei Biomarker verschiedene Muster für jedes Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zeigten, wurde analysiert, dass das Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit durch die Expressionswertmuster der drei Biomarker diagnostiziert werden konnte.
Beispiel 3: Entwicklung von acht Antikörpern gegen validierte Biomarker und Auswahl von Antikörperpaaren durch Sandwich-ELISA
Um APOA4, einen ausgewählten MCI-spezifischen Biomarker zur Diagnose zu verwenden, wurde zuerst ein Antikörper konstruiert. Antikörper gegen ITGB3 und CRP, zwei Biomarker, anders als APOA4, wurden nicht konstruiert, sondern wurden unter Verwendung von gewerblich bezogenen Antikörpern entwickelt.
Beispiel 3-1: Entwicklung von acht Antikörpern gegen validierte Biomarker
APOA4-Antigen wurde in eine Maus injiziert, um eine Immunantwort auszulösen, aus welcher ein Hybridom konstruiert wurde, um insgesamt fünf geklonte Antikörper zu konstruieren, und drei geklonte Antikörper wurden auf dieselbe Weise mit Hilfe von Ziege konstruiert. Der Einfachheit halber wurden die acht geklonten Antikörper willkürlich als Antikörper 1 bis Antikörper 8 bezeichnet und dann mit dem APOA4-Antigen zur Reaktion gebracht, um einen Paartest durch ein ELISA-Verfahren durchzuführen.
Die acht zuvor konstruierten Antikörper wurden einem Paartest durch Sandwich-ELISA unterzogen und die konstruierten acht Antikörper wurden unter Verwendung von Einfang- bzw. Detektionsantikörpern getestet (12 und 13).
12 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Durchführung eines Paartests an den acht geklonten Antikörpern mittels Sandwich-ELISA veranschaulicht, und 13 ist eine Graphik, die die Ergebnisse einer Durchführung des Paartests veranschaulicht.
Wie in 12 und 13 veranschaulicht, wurden zwei Paare ausgewählt, die als geeignetes Paar angesehen wurden, um in dem Diagnosekit verwendet zu werden ((Einfangantikörper 1, Detektionsantikörper 6), (Einfangantikörper 3, Detektionsantikörper 6)).
Beispiel 3-2: Affinitätsmessung unter Verwendung von Sandwich-ELISA und Antikörperpaarauswahl
Die Affinität von Antikörper 1, Antikörper 3 und Antikörper 6, die in Folge des Paartests ausgewählt wurden, für das Antigen wurde gemessen (14A). Zu diesem Zeitpunkt war das Antigen, das zur Affinitätsmessung verwendet wurde, das Antigen, das bei der Konstruktion der Antikörper verwendet wurde. Antigen-Antikörper-Affinität wurde für jeden der drei Antikörper (Antikörper 1-Antikörper 6, Antikörper 3-Antikörper 6) gemessen. Als das grundlegende Messverfahren wurde das direkte ELISA-Verfahren verwendet. Affinität wurde durch einen Versuch gemessen, der kompetitive Bindung zwischen Antigenen und Antikörpern herbeiführte (kompetitiver Bindungstest). Die Menge an Detektionsantikörper, die während des kompetitiven Antigen-Antikörper-Bindungsversuchs verwendet wurde, wurde durch Erstellen einer Klotz-Plot-Grafik bestimmt.
Die bestimmte Menge an Detektionsantikörper und das reihenverdünnte Antigen wurden zur Reaktion gebracht, das resultierende Produkt wurde dann in Antigen-beschichtete Wells abgegeben und Fluoreszenz wurde bei 450 nm gemessen.
Der gemessene OD-Wert wurde mit Hilfe einer Sigma-Plot-Software eingetragen, um den Wert der Dissoziationskonstante K_d zu messen, der Antigen-Antikörper-Affinität darstellt.
14A ist eine schematische Darstellung, die den Prozess zum Messen von Antigen-Antikörper-Affinität veranschaulicht.
Beispiel 3-2-1: Messung von Affinität von Antikörper 1 zu Antigen
Der Affinitätstest von Antikörper 1 für das Antigen wurde durch Eigenbewertung durchgeführt (14B).
14B veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 1 für das Antigen.
Wie in 14B veranschaulicht, war der Wert der Dissoziationskonstante K_d, der mittels Sigma-Plot-Software erhalten wurde, 11,38 nM, der bestätigt wurde, etwa zehnmal niedriger als die Affinität von 1 nM oder mehr, das Evaluierungskriterium, zu sein, und es zeigte sich, dass Antikörper 1 zur Verwendung in der Kitentwicklung nicht geeignet war.
Beispiel 3-2-2: Messung der Affinität von Antikörper 3 zu Antigen
Der Affinitätstest von Antikörper 3 für das Antigen wurde durch Eigenbewertung durchgeführt (14C).
14C veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 3 für das Antigen.
Wie in 14C veranschaulicht, war der Wert der Dissoziationskonstante K_d, der mittels Sigma-Plot-Software erhalten wurde, 0,2035 nM, der bestätigt wurde, etwa fünfmal höher als die Affinität von 1 nM oder mehr, das Evaluierungskriterium, zu sein, und es zeigte sich, dass Antikörper 3 zur Verwendung in der Kitentwicklung geeignet war.
Beispiel 3-2-3: Messung der Affinität von Antikörper 6 zu Antigen
Der Affinitätstest von Antikörper 6 für das Antigen wurde durch Eigenbewertung durchgeführt (14D).
14D veranschaulicht die Ergebnisse vom Messen der Affinität von Antikörper 6 für das Antigen.
Wie in 14D veranschaulicht, war der Wert der Dissoziationskonstante K_d, der mittels Sigma-Plot-Software erhalten wurde, 0,2755 nM, der bestätigt wurde, etwa viermal höher als die Affinität von 1 nM oder mehr, das Evaluierungskriterium, zu sein, und es zeigte sich, dass Antikörper 3 zur Verwendung in der Kitentwicklung geeignet war.
Basierend auf den Ergebnissen der Affinitätsmessung wurde ein Diagnosekit unter Verwendung von Antikörper 3 und Antikörper 6 als Einfang- bzw. Detektionsantikörper entwickelt.
Beispiel 4: Entwicklung eines Alzheimer-Krankheit-Diagnosekits
Beispiel 4-1: Überblick über das Diagnosekit
Jeder Schritt von der Kitkonstruktion bis zum Leistungstest kann in drei Hauptschritte eingeteilt werden, nämlich den Antikörper-Spotting-Prozess, den Prozess der Stabilisierung des gespotteten Antikörpers und den Testreaktionsprozess. Da Bedingungen wie pH-Wert und Antikörperkonzentration in jedem Schritt die Leistung des Kits beeinflussen, kann behauptet werden, dass der Schlüssel zur Kitentwicklung in der Suche nach diesen Bedingungen und der Auswahl der optimalen Bedingungen liegt (15).
15 ist eine schematische Darstellung, die den Prozess zum Entwickeln eines Alzheimer-Krankheit-Diagnosekits und Testen der Leistung des Kits veranschaulicht.
Es wurde bestimmt, dass ein Diagnosekit, der zwei oder mehr Biomarker verwendet, in Hinblick auf Zuverlässigkeit und Exaktheit von Ergebnissen vorteilhafter war, als eine Konstruktion eines Alzheimer-Krankheit-Diagnosekits mit nur einem neuartigen Biomarker, indem der Vorteil der Technologie unserer Firma genutzt wurde, wo mehrere Diagnosen möglich sind.
Das Entwicklungsziel des endgültigen Diagnosekits wurde auf mehrere Diagnosen unter Verwendung von insgesamt drei verschiedenen Biomarkern festgelegt, und die Konfiguration der drei Biomarker war MCI-spezifischer APOA4, AD-spezifischer ITGB3 und CRP, von welchem erwartet wurde, in weiteren klinischen Versuchen signifikant zu sein (16).
16 ist eine schematische Darstellung, die die Biomarker-Kombination veranschaulicht, die im Alzheimer-Krankheit-Diagnosekit enthalten ist.
Beispiel 4-2: Spotting von Biomarkern
Spotting wurde mit Antikörper 3 durchgeführt, der bessere Affinität in Folge der Affinitätsanalyse zeigte, die in Beispiel 3-2 durch das Sol-Gel-Verfahren gemessen wurde, das die Kerntechnologie von PCL Inc. ist.
Für den Spotting-Prozess wurde der Einfang-Antikörper auf den Boden des Platten-Wells gespottet, dann wurden das Antigen und der Detektionsantikörper durch ein Sandwich-ELISA-Verfahren zur Reaktion gebracht und der Signalwert wurde durch Abtasten bei 532 nm gemessen (17).
17 ist eine schematische Darstellung, die den Prozess für das Spotting eines Biomarkers und dann Durchführen eines Tests veranschaulicht, wenn ein Kit, der mit einem Marker Tau vordefiniert ist, der mit Alzheimer-Krankheit verknüpft ist, als ein Beispiel hergestellt wird.
Vor Verwendung der tatsächlichen Probe wurde das Antigen, das in dem Test verwendet wurde, mit dem gekauften Antigen getestet, das zum Zeitpunkt der Antikörperkonstruktion verwendet wurde, und dies diente der exakteren Validierung tatsächlicher Patientenproben mit einer großen Anzahl von tatsächlichen Proben, als der Sol-Gel-Spotting-Prozess später etabliert wurde.
Zuerst wurde die Spotting-Zusammensetzung basierend auf dem APOA4-Marker gesucht, der ein MCI-spezifischer Biomarker war, und als die Zusammensetzung des APOA4-Markers etabliert wurde, wurde der APOA4-Marker dann mit ITGB3 gespottet und schließlich wurden alle drei Marker, enthaltend CRP, gemeinsam gespottet, um die Kitkonstruktion (18) abzuschließen.
18 ist eine schematische Darstellung, die die Spotting-Reihenfolge von drei Biomarkern veranschaulicht.
Insbesondere wurde im Fall von APOA4 der Antikörper, auf dem die Konstruktion basierte, in der Kitkonstruktion verwendet und keine neu konstruierten Antikörper, sondern gewerblich erworbene Antikörper wurden als Spotting- und reaktive Antikörper gegen ITGB3 und CRP verwendet, die die Marker anders als APOA4 sind. Antikörper zu diesen zwei Markern wurden auch gescreent, um geeignete Antikörper auszuwählen, und die ausgewählten Antikörper wurden verwendet.
Der Einfang-Antikörper wurde mit Sol-Gel gemischt und gemäß dem Protokoll gespottet, dass von den gegenwärtigen Antragstellern in Bezug auf die Zusammensetzung von Sol-Gel im Voraus erstellt wurde, und als Ergebnis wurde ein Phänomen beobachtet, dass der Spot schrumpfte. Es wurde empirisch abgeleitet, dass das Phänomen vorwiegend durch eine zu geringe Konzentration des Einfangantikörpers verursacht wurde, und es wurde eine Konzentration von 0,5 mg/mL, die Konzentration des bestehenden Einfangantikörpers, bis 1 mg/mL angewendet und Spotting wurde erneut bei derselben Sol-Gel Zusammensetzung durchgeführt, um Spot-Schrumpfen zu verbessern (19).
19 ist eine Fotografie, die den Prozess zum Etablieren der Bedingung für die Form eines Spots basierend auf einem Unterschied in Konzentration des aufzubringenden Antikörpers veranschaulicht.
Gemäß den Ergebnissen von 19 wurde die Konzentration des Einfangantikörpers auf 1 mg/mL eingestellt, um die Ergebnisse in folgenden Versuchen mit verschiedenen Zusammensetzungen des Antikörpers und Sol-Gel-Spotting widerzuspiegeln.
Während des Spotting-Versuchs des Einfangantikörpers und Sol-Gel bei verschiedenen Zusammensetzungen des APOA4-Markers zeigte sich, dass eine Zusammensetzung (CBS-3) einen geringfügig höheren Signalwert hatte (20A und 20B).
20A ist eine Fotografie, die die Ergebnisse eines Versuchs veranschaulicht, Spotting-Bedingungen für APOA4 zu finden, und 20B veranschaulicht die Ergebnisse einer Durchführung eines Tests an Niedertiter-, Mitteltiter- und Hochtiter-Proben unter Bedingungen, die als am geeignetsten unter den APOA4 Spotting-Zusammensetzungen erachtet wurden.
Beispiel 4-3: ITGB3-Spotting-Test
Im Fall des ITGB3-Markers wurde ein Screeningtest an 10 bis 12 Spotting-Zusammensetzungen gemäß dem Protokoll durchgeführt, das von unserer Firma erstellt wurde, und mit diesem wurde eine Zusammensetzung ausgewählt, die als signifikant erachte wurde. Infolgedessen war es möglich, einen signifikanten Signalwert von der CBS-Zusammensetzung abzuleiten, der nichts hinzugefügt wurde, und dieser wurde als die Spotting-Bedingung ausgewählt (21).
21 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung des ITGB3-Screeningtests veranschaulicht.
Beispiel 4-4: CRP-Spotting-Test
Im Fall des CRP-Markers wurde Spotting unter Verwendung der Spotting-Zusammensetzung durchgeführt, die von unserer Firma als ein Protokoll erstellt wurde, wie im Fall von Screening des ITGB3-Markers. Infolge des Screeningtests bei nur der Zusammensetzung wurden signifikante Signalwerte bei zwei Zusammensetzungen, R-1 Zusammensetzung und R-1-1, erhalten, in welchen das Verhältnis von Sol-Gel ziemlich niedrig war. Im Fall von R-1-1 jedoch war eine stark klebrige Substanz, als Sol3 bezeichnet, in den Rohmaterialien für die Zusammensetzung enthalten, wodurch angenommen wurde, dass es Schwierigkeiten beim Prozess oder bei der Qualitätskontrolle während einer Massenproduktion des Kits in der Zukunft geben könnte, und letztendlich wurde die R-1 Zusammensetzung ausgewählt (22).
22 ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Spotting-Tests an dem CRP-Marker veranschaulichen.
Die Spotting-Zusammensetzungen für APOA4, CRP und ITGB3 wurden somit festgelegt (23).
23 ist ein Diagramm, das spezifische Spotting-Zusammensetzungen für APOA4, CRP und ITGB3 veranschaulicht.
Danach wurden ein Alterungstest des gespotteten Antikörpers, ein Blockierungstest und ein Trocknungstest durchgeführt, die Prozesse zum Stabilisieren der gespotteten Antikörper sind.
Beispiel 4-4-1: Alterungstest des gespotteten Antikörpers
Nach dem Spotting von POA4, ITGB3 und CRP wurden die Bedingungen für den Alterungsschritt getestet, der ein Schritt ist, der ein stabiles Aufbringen der Spots unterstützt (24). Grob gesagt, der Alterungsbedingungstest wurde unter zwei Bedingungen eines Produktionsraums mit hoher Feuchtigkeit von etwa 60% und einem Exsikkator mit einer geringen Feuchtigkeit von etwa 9% und zwei Zeitbedingungen von 2 Stunden und über Nacht durchgeführt.
24 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse von Testbedingungen zum Stabilisieren gespotteter Antikörper nach Spotting von drei Markern veranschaulicht.
Wie in 24 veranschaulicht, wurde bestätigt, dass der Signalwert, wenn Alterung in dem Exsikkator durchgeführt wurde, hoch war und die Form des Spots unter der Bedingung von 2 Stunden stabiler war als unter der Bedingung über Nacht; infolgedessen war die Stabilität des Spots unter der Bedingung eines Exsikkators bei Raumtemperatur als den Alterungsort und 2 Stunden als die Alterungszeit verbessert, und diese Bedingung wurde als die Alterungsbedingung bestimmt.
Beispiel 4-4-2: Blockierungstest von gespottetem Antikörper
Nachdem die Alterungsbedingung bestimmt wurde, wurde ein Blockierungspuffertest, ein Prozess, mit dem Ziel einer Eliminierung nichtspezifischer Reaktionen, durchgeführt. Der Blockierungspuffertest wurde mit insgesamt drei Puffern durchgeführt, enthaltend den Puffer (BSA 1%, Ziegenserum 0,1%, Tween 20 1 g, Natriumazid 2 g), der in unserem bestehenden Protokoll verwendet wird, und StabilBlock-Stabilisatoren SG01 und ST01 (25).
25 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Blockierungstests an gespotteten Antikörpern nach Spotting von drei Markern veranschaulicht.
Wie in 25 veranschaulicht, wurde bestätigt, dass das günstigste Signal im Sinne von Signalwert und Spotstabilität erhalten wurde, wenn Blockieren mit ST01 durchgeführt wurde.
Beispiel 4-4-3:Trocknungsbedingungstest
Nach dem Blockierungsprozess wurde zum Zweck eines Trocknens des Wells ein Test unter zwei Feuchtigkeitsbedingungen und zwei Zeitbedingungen durchgeführt. Der Test wurde durch Einstellen von zwei Bedingungen eines Produktionsraums mit einer Feuchtigkeit von 60% und eines Exsikkators mit einer Feuchtigkeit von 9% und zwei Zeitbedingungen von 2 Stunden und über Nacht durchgeführt (26).
26 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Durchführung eines Trocknungstests an gespotteten Antikörpern nach Spotting von drei Markern veranschaulicht.
Wie in 26 veranschaulicht, war der Unterschied in Signalwerten zwischen Trocknungsbedingungen nicht groß, aber die Exsikkator-und-über-Nacht-Bedingung wurde als die endgültige Trocknungsbedingung angesichts der Tatsache bestimmt, dass die Wells unter anderen Bedingungen als der Exsikkator-und-über-Nacht-Bedingung nicht vollständig trockneten.
Beispiel 4-5: Standardisierungstest für abschließenden Diagnosekit-Test
Die Kriterien für den Testprozess des Diagnosekits wurden basierend auf dem Protokoll festgesetzt, das von unserer Firma festgelegt wurde, und basierend darauf wurden die optimalen Testbedingungen durch Modifizieren der Bedingungen wie das Probenverdünnungsmittel und das Konjugatverdünnungsmittel ausgewählt.
Beispiel 4-5-1: Probenverdünnungsmittel-Bedingungstest
Zum Zeitpunkt des Tests wurde ein Bedingungstest für das Verdünnungsmittel durchgeführt, das gemeinsam mit der Probe abzugeben ist (27).
27 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Testung der Bedingungen von Probenverdünnungsmitteln veranschaulicht.
Wie in 27 veranschaulicht, wurde die Reaktion durch Einstellen des Verhältnisses der Probe zu dem Probenverdünnungsmittel auf 1:4 und des gesamten abgegebenen Volumens auf 100 µL durchgeführt und infolgedessen wurden die am stärksten verbesserten Ergebnisse erhalten, wenn ein Probenverdünnungsmittel verwendet wurde, das Ziegenserum enthielt.
Beispiel 4-5-2: Konjugatverdünnungsmittel-Bedingungstest
Ein Bedingungstest wurde für das Konjugatverdünnungsmittel durchgeführt, das in der zweiten Reaktion, nach der Reaktion mit der Probe, abzugeben ist (28).
28 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Testung der Bedingungen von Konjugatverdünnungsmitteln veranschaulicht.
Wie in 28 veranschaulicht wurde als Ergebnis bestätigt, dass die Signalwerte für alle Marker steigen, wenn die Reaktion unter Verwendung eines Puffers durchgeführt wurde, dem BSA hinzugefügt worden war.
Beispiel 4-5-3: Endgültige Teststandardisierungsinformationen für Diagnosekit
Die endgültigen Teststandardisierungsinformationen des Diagnosekits, die letztendlich durch die Ergebnisse von Beispielen bestätigt wurden, sind wie folgt:

i. Alterungsinformationen
1. 1. Raumtemperatur Exsikkator 2 Std.
ii. Blockierungsinformationen
1. 1. Raumtemperatur 1 Std.
iii. Trocknungsinformationen
1. 1. Raumtemperatur Exsikkator über Nacht
iv. Antriebsinformationen
1. 1. Verwendetes Gerät: Schüttelapparat
2. 2. Testprotokoll

Schritt	Probenreaktion	Waschen	Konjugatreaktion	Waschen
Temperatur	37°C
Volumen	100 µL		100 µL
Endgültige Menge	Probe: 20 µL		5 µg/mL pro Marker
Drehzahl	400 U/min		400 U/min
Wiederholung	1	3	1	3
Zeit	60 min		30 min
Puffer	1X PBS, Ziegenserum	1X Waschpuffer	1X PBS, 1% BSA, 0.3% Triton X-100	1X Waschpuffer

v. Analyseninformationen
1. Filmaufnahmegerät: Sensovation-Gerät
Beispiel 4-6: Endgültige Kitkonstruktion und tatsächlicher Probentest
Drei Marker wurden in einem Well basierend auf den Spotting-Bedingungen gespottet und ein Kit-Leistungstest wurde unter Verwendung tatsächlicher Proben von HC, MCI und AD durchgeführt. Von den Proben, die 380 Patienten entnommen wurden, wurden drei bis vier Proben für jedes Krankheitsstadium gepoolt. Schließlich wurden insgesamt 69 Proben eingerichtet, 23 für jede der HC-, MCI- und AD-Gruppen.
Beispiel 4-6-1: Exosom Western-Blot-Analyseergebnisse
Zur Validierung der Biomarker APOA4, CRP und ITGB3 wurde eine große Anzahl von Exosomproben (23 für jedes Stadium, insgesamt 69) durch Western-Blot-Analyse getestet. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Reihenfolge der Proben beliebig festgelegt, ohne das Experiment durchzuführen, indem Patienten für jedes Krankheitsstadium unter Berücksichtigung des Unterschieds zwischen Gelen des Western Blot zusammengestellt wurden (29A, 29B und 29C).
29A ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse von Ergebnissen einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an ITGB3 veranschaulichen, 29B ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse von Ergebnissen einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an APOA4 veranschaulichen, und 29C ist eine Fotografie und ein Diagramm, die die Ergebnisse von Ergebnissen einer Durchführung einer Western-Blot-Analyse an CRP veranschaulichen.
Wie in 29A, 29B und 29C veranschaulicht, entsprechen die WB-Ergebnisse Proteomikergebnissen im Falle von ITGB3 und APOA4, aber es war schwer, CRP durch WB zu analysieren, sodass die Ergebnisse beigelegt wurden, aber aus der Korrelationsanalyse in der abschließenden Schlussfolgerung ausgeschlossen wurden.
Beispiel 4-6-2: Ergebnisse einer tatsächlichen Probenanalyse nach endgültiger Kitkonstruktion
Ergebnisse wurden erhalten, indem 69 Plasmaproben, die von denselben Patienten wie in dem Western-Blot-Analyse-Experiment erhalten wurden, mit dem konstruierten Kit (30) zur Reaktion gebracht wurden.
30 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer Analyse tatsächlicher Proben unter Verwendung des abschließend konstruierten Kits veranschaulicht.
Beispiel 4-6-3: Korrelation zwischen tatsächlichen Probe-Analyseergebnissen und WB-Analyseergebnissen
Die Korrelation zwischen den Daten, die in Beispiel 4-6-2 erhalten wurden, und Western Blot-Intensität wurde verglichen und analysiert (31 und 32).
Zuerst ist 31 eine Graphik, die die Ergebnisse einer Korrelationsanalyse für den ITGB3-Marker veranschaulicht.
Wie in 31 veranschaulicht, wurde im Fall des ITGB3-Markers in allen der Proteomik-Analyseergebnisse, Western-Blot-Analyseergebnisse und Analyseergebnisse durch das konstruierte Kit, bestätigt, dass der Proteinexpressionswert auch eine zunehmende Tendenz zeigte, wenn die Krankheit von HC zu MCI und AD fortschritt, und der Korrelationskoeffizient (R2) auch 80% oder höher war.
Anschließend ist 32 eine Graphik, die die Ergebnisse einer Korrelationsanalyse für den APOA4-Marker veranschaulicht.
Wie in 32 veranschaulicht, wurde bestätigt, dass der APOA4-Marker einen deutlich hohen Expressionswert im MCI-Stadium aufwies, aber im AD-Stadium wieder eine abnehmende Tendenz zeigte.
Es ist wichtig, die Krankheit im MCI-Stadium rasch zu diagnostizieren, da das Ziel des Diagnosekits eine Frühdiagnose von Alzheimer-Krankheit ist und es möglich ist, klar zu erkennen, dass ein Patient an der Alzheimer-Krankheit leidet, ohne ein Diagnosekit zu verwenden, wenn der Patient das AD-Stadium erreicht.
Es wurde bestätigt, dass der APOA4-Marker einen Korrelationskoeffizienten (R2) von etwa 88% zwischen den Analyseergebnissen mit dem konstruierten Diagnosekit und Western Blot in den Proben im MCI-Stadium zeigte.
Im Falle des CRP-Markers schließlich ist es schwierig, den quantitativen Wert in der Western-Blot-Analyse zu bestimmen, aber aus den Ergebnissen der Proteomik-Analyse und den Literaturinformationen geht hervor, dass der Expressionswert von CRP im MCI-Stadium abnimmt und dass es wünschenswert ist, den CRP-Marker als zusätzlichen Indikatormarker zu verwenden.
Ausgehend von der obigen Beschreibung wird der Fachmann verstehen, dass die vorliegende Offenbarung in einer anderen spezifischen Form umgesetzt werden kann, ohne das technische Wesen oder wesentliche Merkmale zu verändern. Daher ist die obige Ausführungsform nicht einschränkend, sondern in jeder Hinsicht veranschaulichend. Der Umfang der Offenbarung wird durch die beigefügten Ansprüche und nicht durch die vorangestellte Beschreibung definiert, und daher sollen alle Änderungen und Modifikationen, die in den Rahmen der Ansprüche oder Äquivalente dieser Rahmen fallen, von den Ansprüchen erfasst werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

KR 101274765 [0016]
KR 100784437 [0016]
KR 101547643 [0016]

Claims

Markerzusammensetzung zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit, umfassend ein Protein, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon, als einen Marker.
Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, die erforderlich sind, um einen Ausbruch von Alzheimer-Krankheit zu bestimmen, wobei das Verfahren umfasst: (a) quantitatives Analysieren eines Expressionswerts eines Markerproteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon, in einer Serumprobe eines Probanden, der kein Mensch ist, mit Verdacht auf Alzheimer-Krankheit; und (b) Verknüpften des quantitativ analysierten Werts des Markerproteins mit Bestimmung eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Verknüpfungsschritt durch Kombinieren von quantitativen Analyseergebnissen jedes Markerproteins durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kombination von quantitativen Analyseergebnissen unter Verwendung eines Analyseverfahrens durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem linearen oder nichtlinearen Regressionsanalyseverfahren; einem linearen oder nichtlinearen Klassifikationsanalyseverfahren; ANOVA; einem neuronalen Netzwerkanalyseverfahren; einem genetischen Analyseverfahren; einem Support-Vector-Machine-Analyseverfahren; einem hierarchischen Analyse- oder Clustering-Analyseverfahren; einem Analyseverfahren mit hierarchischem Algorithmus mit Entscheidungsbäumen oder Kernel-Hauptkomponenten; einem Markov Blanket-Analyseverfahren; einem rekursiven Merkmalseliminierungs- oder entropiebasierten rekursiven Merkmalseliminierungsanalyseverfahren; einem Forward-Floating-Search- oder Backward-Floating-Search-Analyseverfahren; und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kombination quantitativer Analyseergebnisse unter Verwendung eines Computeralgorithmus durchgeführt wird.
Zusammensetzung zum Bestimmen eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit, umfassend ein Mittel zum Messen eines Expressionswerts eines Markerproteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Mittel ein Antikörper, Primer oder eine Sonde ist, imstande, spezifisch an das Markerprotein oder mRNA des Markerproteins zu binden.
Kit zum Bestimmen eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit, umfassend eine Quantifizierungsvorrichtung zum Messen von Expressionswerten eines oder mehrerer Proteine, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon.
Verfahren zum Bereitstellen von Informationen, um ein Krankheitsstadium von Alzheimer-Krankheit zu bestätigen, wobei das Verfahren umfasst: (a) quantitatives Analysieren eines Expressionswerts eines Markerproteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus APOA4, ITGB3 und einer Kombination davon, in einer Serumprobe eines Probanden, der kein Mensch ist, mit Verdacht auf Alzheimer-Krankheit; und (b) Verknüpften des quantitativ analysierten Werts des Markerproteins mit Bestimmung eines Ausbruchs von Alzheimer-Krankheit.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Verknüpfungsschritt durch Kombinieren von quantitativen Analyseergebnissen jedes Markerproteins durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kombination von quantitativen Analyseergebnissen unter Verwendung eines Analyseverfahrens durchgeführt wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem linearen oder nichtlinearen Regressionsanalyseverfahren; einem linearen oder nichtlinearen Klassifikationsanalyseverfahren; ANOVA; einem neuronalen Netzwerkanalyseverfahren; einem genetischen Analyseverfahren; einem Support-Vector-Machine-Analyseverfahren; einem hierarchischen Analyse- oder Clustering-Analyseverfahren; einem Analyseverfahren mit hierarchischem Algorithmus mit Entscheidungsbäumen oder Kernel-Hauptkomponenten; einem Markov Blanket-Analyseverfahren; einem rekursiven Merkmalseliminierungs- oder entropiebasierten rekursiven Merkmalseliminierungsanalyseverfahren; einem Forward-Floating-Search- oder Backward-Floating-Search-Analyseverfahren; und einer Kombination davon.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kombination quantitativer Analyseergebnisse unter Verwendung eines Computeralgorithmus durchgeführt wird.