DE102005056793A1

DE102005056793A1 - Verfahren zur Diagnose von Sepsis mit Actin Beta/Gamma

Info

Publication number: DE102005056793A1
Application number: DE200510056793
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr. Rußwurm; Konrad Prof. Reinhart
Original assignee: SIRS Lab GmbH
Current assignee: SIRS Lab GmbH
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2007-05-31

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, wobei man in einer Probe eines Patienten den Gehalt von Actin beta (ACTB) und/oder Actin gamma (ACTG) und/oder davon abgeleiteten Derivaten bestimmt und erfasst, ob der ACTB- und/oder ACTG-Wert, bezogen auf eine Kontrollgruppe, höher oder niedriger liegt, um auf das Vorliegen einer Sepsis, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen. Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro- Verfahren zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung von Actin beta (ACTB) und/oder Actin gamma (ACTG) als Biomarker gemäß Anspruch 1, die Verwendung von Actin beta und/oder Actin gamma für die Erzeugung von Antikörpern für diagnostische Zwecke gemäß Anspruch 12, einen Kit zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung von Komponenten, welche eine Bestimmung von Actin beta und/oder Actin gamma ermöglichen, gemäß Anspruch 13.
Die Erfindung betrifft Actin, insbesondere Actin beta und/oder Actin gamma und davon abgeleitete Derivative. Der aus Gründen der Lesbarkeit verwendete Begriff ACTB steht stellvertretend für Actin beta, der verwendete Begriff ACTG für Actin gamma sowie davon abgeleitete Derivate und Mutationen und stellt keine Einschränkung der Erfindung dar.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen unter Verwendung des Proteins gemäß SEQ-ID 1 und/oder SEQ-ID 2 als Biomarker.
Trotz Fortschritten im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS (systemic inflammatory response syndrome) und Sepsis, definiert entsprechend der ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 [1], bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [2-3]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20 % bei SIRS, ca. 40 % bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70-80 % an [4-6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Auf molekularer Ebene wird als Sepsis ein Krankheitsbild bezeichnet, welches durch pathogene Mikroorganismen verursacht wird. Auf dem Boden der Erschöpfung Infektionsort-naher, molekularer Kontroll- und Regulationsmöglichkeiten entwickelt sich eine generalisierte, den ganzen Organismus umfassende Entzündungsreaktion, die für die vom Arzt nachgewiesenen klinischen Symptome/Diagnosekriterien/SIRS-Kriterien nach [1] verantwortlich ist. Dieser generalisierte, inflammatorische Zustand (als Sepsis nach [1] definiert) geht mit Zeichen der Aktivierung verschiedener Zellsysteme (endotheliale Zellen, aber auch aller leukozytären Zellsysteme und vor allem des Monozyten/Makrophagensystems) einher. Schließlich schädigen molekulare Mechanismen, die eigentlich den Wirt gegen invasive Mikroorganismen schützen sollen, dessen eigene Organe/Gewebe und tragen so entscheidend zur Entwicklung der vom Kliniker gefürchteten Organdysfunktionen bei [8-11].
Der Sepsisbegriff hat im Laufe der Zeit einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [1]. Entsprechend dieser Kriterien [1] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „Sepsis", „severe Sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/l oder eine Leukopenie <4G/l bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) <4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen.
Sepsis ist das klinische Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrunde liegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [12]. Gleichfalls bestehen auf Grund der mangelnden Spezifität der heutigen Sepsis- und SIRS-Diagnose beim Kliniker große Unsicherheiten, ab welchem Zeitpunkt ein Patient einer spezialisierten Therapie, beispielsweise mit Antibiotika, die ihrerseits beträchtliche Nebenwirkungen haben können, zugeführt werden soll [12].
Bahnbrechende Entdeckungen in Molekularbiologie und Immunologie während der letzten zwei Jahrzehnte ließen ein vertieftes, mehr an den grundlegenden Mechanismen orientiertes Verständnis der Sepsis entstehen. Das dadurch entstandene Wissen um relevante Targets bildete wiederum die Basis für die Entwicklung gezielter und adjuvanter Therapiekonzepte, welche hauptsächlich auf der Neutralisierung wesentlicher Sepsismediatoren beruhen [13-16]. Eine Ursache für das Scheitern fast aller immunmodulatorischer Therapieansätze in klinischen Studien – trotz Effektivität im Tierexperiment- wird in der nur schlechten Korrelation zwischen den klinischen, eher symptomatisch orientierten Diagnosekriterien und den grundlegenden Mechanismen einer generalisierten Immunantwort gesehen [12, 17-18].
Rückblickend erstaunt dies nicht, da bereits gesunde Menschen bei alltäglichen Verrichtungen Veränderungen der Herz- bzw. Atemfrequenz aufweisen können, welche per Definitionem bereits die Diagnose eines SIRS zuließen. Bei Berücksichtigung unserer heutigen biomedizinischen Möglichkeiten muss es als Anachronismus erscheinen, dass jährlich 751.000 Patienten in den USA anhand o.g. ACCP/SCCM Kriterien diagnostiziert, klassifiziert und behandelt werden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach einem „magic bullet" der Sepsistherapie aufgewendet wurden [19]. Auch fordern kürzlich publizierte Expertenmeinungen, dass zu einem besseren pathophysiologischen Verständnis der Sepsis eine Modifizierung der Konsensuskriterien nach [1] erforderlich ist [20-21]. Außerdem besteht unter vielen Medizinern Einigung darüber, dass die Konsensuskriterien nach [1] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Aufgrund der oben genannten Probleme mit der Anwendung der Konsensuskriterien nach [1] werden unter Intensivmedizinern Vorschläge für eine sensitivere und spezifische Definitionen der verschiedenen Schweregrade der Sepsis diskutiert [2,23]. Neu ist dabei vor allem, dass molekulare Veränderungen direkt in die Beurteilung der Schwere einer Sepsis, aber auch den Einschluss in innovative Behandlungsverfahren der Sepsis (wie z.B. die Therapie mit aktiviertem rekombinanten Protein C) einbezogen werden sollen. Dieser Konsensusprozess [23], der gegenwärtig von fünf internationalen Fachgesellschaften getragen wird, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch längst nicht abgeschlossen. Ziel ist die Etablierung eines Systems zur Schweregradbeurteilung der Sepsis, das es ermöglicht, Patienten anhand ihrer individuellen Patientenreaktion auf der Basis ihrer prädisponierenden Bedingungen, der Art und des Ausmaßes der Infektion, der Art und der Schwere der Wirtsantwort sowie des Grads der begleitenden Organdysfunktionen zu klassifizieren. Das beschriebene System wird mit PIRO, abkürzt nach den englischen Begriffen für „Predisposition", „Insult Infection", „Response" und „Organ dysfunction", bezeichnet.
Zur Vereinheitlichung der Definitionen der häufigsten Infektionen auf Intensivstationen wurden kürzlich Ergebnisse der Consensus Confecence des Internationalen Sepsis Forums veröffentlicht [24]. Durch Anwendung dieser einheitlicher Definitionen wird es zukünftig möglich sein, die Auswahl der Patienten für klinische Studien anhand prospektiv definierte Infektionskategorien zu stratifizieren und somit die Variabilität zwischen den verschiedenen Patientengruppen zu reduzieren.
Verglichen mit den Konsensuskriterien nach [1] sollen in der Zukunft zusätzliche molekulare Parameter in die Diagnosestellung einbezogen werden [23], um so eine verbesserte Korrelation der molekularen inflammatorischen/immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis zu ermöglichen, aber auch Aussagen zur individuellen Prognose abzuleiten. Nach solchen molekularen Biomarkern wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen und kommerziellen Gruppen intensiv gesucht [25]. Bisherige Parameter wie z.B. die Bestimmung des C-reaktiven Proteins oder des Procalcitonin (PCT) werden nicht allen klinischen Anforderungen gerecht werden und sind beispielsweise nicht in der Lage den Ausbruch einer Sepsis nach Operationen oder Polytrauma frühzeitig anzuzeigen [26].
Aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensivität der Konsensuskriterien nach [1], der unzureichenden diagnostischen Eignung bisheriger Biomarker für die Beschreibung des Immun-/Entzündungsstatus von Sepsispatienten und des mangelhaften oder verspäteten Nachweises der Ursache der Infektion besteht daher ein dringender Bedarf für neue diagnostische Verfahren, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, den Krankheitsverlauf bei Sepsis frühzeitig vorherzusagen, im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
Actin ist ein in Eukaryoten sehr hoch konserviertes Protein [27]. Die Konzentration an Actin in den häufigsten eukaryotischen Zellen ist sehr hoch und beträgt etwa 10% der Gesamtzahl an Zellproteinen [27].
In der Literatur finden sich die meisten Studien über Actin alpha, einer der Hauptkomponenten der Mikrofilamente der Muskelzelle und des Zytoskeletts der Nicht-Mukskelzelle.
Aus Erba et al. sind zwei Formen des Actin im Zytoplasma, das Actin beta (auch bekannt als Actin cytoplasmic 1) und das Actin gamma (auch bekannt als Actin cytoplasmic 2) [28]. Die beiden zytoplasmatischen Actin-Proteine liegen stets ko-exprimiert vor und unterscheiden sich lediglich in 4 Aminosäuren [28]. Ein Alignment mittels der Software BioEdit ergab folgende unterschiedliche Aminosäuren: D2E, D3E, D4E, V10I. Eigene Studien belegen, dass die unterschiedlichen Aminosäuren keinen signifikanten Einfluss auf die Charakteristika der Peptide haben. So konnte beispielsweise kein unterschiedlicher isolelektrischer Punkt zwischen Actin beta und Actin gamma gefunden werden.
Weiterhin wird Actin beta sehr oft als Housekeeping-Gen im Normalisierungsprozess bei Genexpressionsanalysen, wie PCR oder Northern blot, verwendet [z.B. 30].

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass bei Sepsis Muskel-Proteolyse stattfindet [30]. Außerdem ist aus US 20050164238 bekannt, dass Actin alpha 2 als diagnostischer Marker für SIRS/Sepsis eingesetzt werden kann [31].

Aus dem Stand der Technik sind keine Hinweise nicht bekannt, die Actin beta und/oder Actin gamma als diagnostischen Marker für SIRS und/oder Sepsis beschreiben oder nahe legen.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, mit Hilfe der gewonnenen Erkenntnisse Verfahren für die in vitro Diagnose einer generalisierten akuten Entzündung oder Sepsis zur Verfügung zu stellen und somit die o.g. unzureichenden Diagnosemöglichkeiten bedeutend zu verbessern. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur in vitro Diagnose einer generalisierten akuten Entzündung oder Sepsis zur Verfügung zu stellen, welche die in vitro Bestimmung der Konzentration von ACTB und/oder ACTG in der biologischen Proben eines Patienten ermöglichen. Ebenso werden mit der Erfindung Verfahren ermöglicht, neue Detektionsmöglichkeiten basierend auf der Verwendung von ACTB und/oder ACTG zu entwickeln. Außerdem bildet die Erfindung die Grundlage für die Entwicklung neuer therapeutischer Wirkstoffe.

Verfahrenstechnisch wird diese Aufgabe durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Im Hinblick auf eine Verwendung, wird die Aufgabe durch die Merkmale des Anspruchs 12 gelöst.

Ein Kit gemäß Anspruch 13 löst die Aufgabe ebenfalls.

Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarte Erfindung ist die aufgrund einer Suche nach neuen geeigneten Biomarkern für die Diagnose von Sepsis gewonnene Erkenntnis, dass der Gehalt an Actin beta und/oder Actin gamma in Plasma von Patienten mit Sepsis signifikant erhöht ist, im Vergleich zu Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung (SIRS). Die Bestimmung der Konzentration an ACTB und/oder ACTG lassen es somit zu, auf das Vorliegen, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen. Diese Unterscheidung ist mit den bisher zur Diagnose verwendeten Proteinmarkern (z.B. Procalcitonin (PCT) oder C-Reaktives Protein (CRP)) klinischen Parametern nicht möglich, aber für die Einleitung einer spezialisierten intensivmedizinischen Therapie und damit für das Verbessern der individuellen Prognose für das Überleben sehr bedeutungsvoll.

Insbesondere beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer biologischen Probe eines Menschen den Gehalt von ACTB und/oder ACTG und davon abgeleitete Derivaten bestimmt und aufgrund des Ergebnisses auf das Vorliegen, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung, schließt.

In einem bevorzugten Verfahren kann auf eine Sepsiserkrankung geschlossen werden, falls der Gehalt an ACTB und/oder ACTG oder davon abgeleiteten Derivaten bei Patienten mit Sepsis signifikant erhöht ist gegenüber dem Gehalt von ACTB und/oder ACTG bei SIRS- Patienten.

In einem weiteren bevorzugten Verfahren hat das ACTB und/oder ACTG die Aminosäuresequenz gemäß Seq-ID #1 und/oder SEQ-ID #2.

Es ist dem Fachmann klar, dass unter dem Begriff Derivate jegliche Mutationen, Modifikationen des ACTB und/oder ACTG, oder Peptide oder Nukleinsäuren, welche vom ACTB und/oder ACTG abgeleitet werden können, verstanden werden. Solche Modikfikationen können beispielweise prä- oder posttranslationalen Charakters sein, z.B. Glykosylierung, Proteolytische Spaltung von Proteinen, Methylierung, Phosphorylierung, Sulfatierung, Prenylierung.

Der Gehalt des ACTB und/oder ACTG wird aus Vollblut, Blutbestandteilen oder der Leber bestimmt. Eine bevorzugtes Verfahren ist die Bestimmung des ACTB und/oder ACTG-Gehalts aus dem Plasma oder Serum der Patienten.

Für die meßtechnische Bestimmung des ACTB und/oder ACTG kommen verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren zum Einsatz. Bevorzugt werden dabei immundiagnostische Verfahren eingesetzt. Hierbei kommen üblicherweise Antiköper-Assays zum Einsatz, welche gegen das ACTB und/oder ACTG gerichtete Antikörper beinhalten. Beispiele solcher Messverfahren sind ELISA, Western Blot, Immunopräzipitation oder FACS-Analysen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Verfahren eingesetzt, die neben der Bestimmung von ACTB und/oder ACTG auch parallel die Bestimmung weiterer Biomarker zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von SIRS oder Sepsis ermöglichen. Solche weiteren Biomarker können beispielsweise Protein- und/oder Genaktivitätsmarker darstellen, welche mit Proteinchips oder immunchromatographischen Messvorrichtungen bestimmt werden.

Die erfindungsgemäßen Verfahren können mit dem Fachmann bekannten computer-gestützten Auswerteeinheiten ausgewertet werden. Hierbei können die Messwerte der ACTB und/oder ACTG-Konzentration direkt oder über ein umgewandeltes Signal als Input für die Auswerteeinheit dienen, darin verarbeitete werden und über eine graphische oder sonstiges Darstellung zur Auswertung dargestellt werden.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des ACTB und/oder ACTG für die Gewinnung von gegen ACTB und/oder ACTG gerichteten Antikörpern und/oder davon abgeleitete Derivate. Solche abgeleiteten Derivate sind beispielsweise (mono,bi,tri) Fab-Fragmente, Fv-Fragmente, SFv-(Single Chain Antikörper), Di-, Tri-, oder Tetrabodies sein. Die Antikörper können mono- oder polyklonale Antiköper sein. Solche Antikörper und/oder davon abgeleitete Derivate können über verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren, wie z.B. die Hybridom-Technologie oder rekombinante Verfahren wie die Phagen-Display-Technolgie, gewonnen werden. Die auf dieser Basis gewonnenen Antikörper können in diagnostischen Testsystemen verwendet werden.

Die Erfindung umfasst auch die Verwendung des ACTB und/oder ACTG oder davon abgeleiteten Derivaten für den therapeutischen Einsatz bei Entzündungserkrankungen. Ein solcher therapeutischer Einsatz kann z.B. durch direkte Zugabe von ACTB und/oder ACTG oder durch kontrollierte Gentherapie als TET-ON/TET-OFF System erfolgen.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung Kits zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen. Solche Kits können ACTB und/oder ACTG und/oder dessen Derivate und/oder Komponenten enthalten, welche ACTB und/oder ACTG und/oder dessen Derivate spezifisch erkennen. Solche Komponenten können beispielsweise Antikörper, Antikörperfragmente, Nukleinsäuren, Peptidonukleotide oder Aptamere sein. Weiterhin können solche Kits Reagenzien enthalten, welche zur Probenvorbereitung oder Detektion benötigt werden. Solche Reagenzien sind z.B. Farbstoffe, Enzyme, Primer, radioaktive Substanzen, Puffer oder Trägermaterialien sein.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Kit Bestandteil einer Vorrichtung, welche verschiedene Schritte der Bestimmung und/oder Auswertung der ACTB und/oder ACTG-Konzentration semi- oder vollautomatisch ausführt.

Weitere Vorteile und Merkmal der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung eines Ausführungsbeispiels sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
1 detaillierte Charakteristika der Patientengruppen.
Ausführungsbeispiel
Das Ausführungsbeispiel beschreibt ein Verfahren zur in vitro Bestimmung von Actin beta und/oder Actin gamma bei Sepsispatienten und die Eignung von Actin beta und/oder Actin gamma zur Unterscheidung zwischen Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung und einer Sepsis.
Für die Untersuchungen wurden die Plasmaproben von folgenden zwei Patientenkollektiven untersucht:
Kontrollgruppe: Diese Gruppe umfasste 31 Patienten, welche im Laufe ihrer intensivmedizinischen Behandlung niemals Zeichen einer Infektion aufwiesen und bei denen Procalcitonin (PCT)-Konzentrationen nur im Normbereich (≤ 0.3 ng/ml) gemessen wurden. Die Plasmaproben sämtlicher Patienten dieser Patientengruppe wurden vereinigt und ein 8 ml-Aliquot entnommen.
Sepsis-Patienten: Diese Gruppe umfasste 44 intensivmedizinisch behandelte Patienten mit unterschiedlichen Schweregraden an Sepsis und Organdysfunktionen und signifikant erhöhten PCT-Konzentration (≥ 0.3 ng/ml). Die Plasmaproben sämtlicher Patienten dieser Patientengruppe wurden ebenfalls vereinigt und ein 8 ml-Aliquot entnommen.
Detaillierte Charakteristika der Patientengruppen sind in 1 dargestellt. 1 zeigt eine Box-Plot Darstellung ausgewählter klinischer Parameter der untersuchten Patientengruppen. Für den statistischen Vergleich wurde ein geeigneter globaler Test angewandt (vgl. Legende unterhalb der x Achse). Für Vergleiche mit p < 0.05 wurde zusätzlich der multiple t-Test post hoc durchgeführt. Statistisch signifikante Unterschiede (p < 0.05) sind hervorgehoben Das Ausführungsbeispiel beschreibt ein Verfahren zur in vitro Bestimmung von ACTB und/oder ACTG bei Sepsispatienten und die Eignung von ACTB und/oder ACTG zur Unterscheidung zwischen Patienten mit einer akuten generalisierten Entzündung (SIRS) und einer Sepsis.
Probenvorbereitung
Ammoniumsulfat-Präzigitation: Jeweils 8 ml der vereinigten Plasma der Kontroll- und Sepsispatienten (ca. 560 mg Gesamtprotein) wurden bei 0°C mit Ammoniumsulfat (40% Endkonzentration) gefällt.
Die Pellets wurden mit 40 mM Na-Phosphatpuffer gelöst und anschließend gegen 3 × 4 l 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 dialysiert.
Entfernung der Immunglobuline: Eine ProteinG-Säule mit jeweils 5 ml Protein G-Sepharose (Kapazität >25 mg/ml) wurden für die Entfernung von Immunglobulinen (IgG) eingesetzt. Die Chromatographie der Plasmaproben wurde in Gegenwart von 20 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 durchgeführt.
Nach der Abreicherung von Albumin und Immunglobulinen waren noch ca. 100 mg Gesamtprotein in den beiden Probenansätzen vorhanden. Vor der Anionenaustausch Chromatographie wurden die beiden Ansätze gegen Tris-HCL, pH 8,0 dialysiert.
Fraktionierung der Proteine: Für die Fraktionierung der Proteine der Plasmaproben wurde eine Anionenaustausch-Chromatographie mittels ÄKTA-Purifier (Amersham Biosciences) durchgeführt. Es wurde eine Resource Q [Polystyrol/Divinylbenzol-Säulenmaterial mit quarternären Ammoniumgruppen] 6ml Anionenaustauscher-Säule verwendet. Die Ansätze wurden zuvor auf 1 mM DTT eingestellt und durch einen 0,2 μm Filter (Millipore) filtriert. Die Anionenaustausch-Chromatographie wurde mit folgenden Puffer betrieben:
Puffer A: Tris-HCL, pH 8,0; 0,5 mM DTT.
Puffer B : Tris-HCL, pH 8,0; 1 M NaCl; 0,5 mM DTT.
Die Bindung der Probe an die äquilibrierte Säule und das Auswaschen nicht-bindender Proteine erfolgte mit 100% Puffer A. Die Elution (Fraktionierung) wurde durch Verwendung eines programmierten Stufengradienten mit 5, 10, 15, 20, 30, 60, und 100 % Puffer B durchgeführt. Dabei sind jeweils 7 Fraktionen mit 50, 100, 150, 200, 300, 600 und 1000 mM NaCl entstanden. Die Fraktionen wurden lyophilisiert und das Lyophilisat mit ddH₂O gelöst.
Die gelösten Proteine wurden vor der Analyse zur Entsalzung gegen 20 mM Tris-HCl dialysiert.
Analyse der Proteinfraktionen
Für die Analyse wurden die Proteinfraktionen zunächst einer isoeletrischen Fokussierung mittels 2D-Polyacrylgelelektrophorese (2D-PAGE) unterzogen. Nach anschließender Anfärbung mit Silber wurden die Spotintensitäten der 2D-Gele kalkuliert und die Werte für die Kontrollpatienten mit denen der Sepsispatienten verglichen. Nach Auswahl der Spots, die signifikante Unterschiede der Spotintensitäten zwischen Kontroll- und Sepsispatienten aufwiesen, wurden diese Spots massenspektrometrisch mittels MALDI Peptide Mass Fingerprint (MALDI-PMF) identifiziert.
Detaillierte Beschreibung der Spotanalyse
Für die vergleichende Analyse wurden aus den entsprechenden Fraktionen jeweils 500 μg Protein entnommen und mit Methanol und Chloroform gefällt. Die Pellets wurden mit IEF-Lysis Puffer aufgenommen und resolubilisiert. Nach der Vervollständigung des IEF-Puffers wurden die Proben einer isoelektrischen Fokussierung in 17cm IEF-Strips (pH 5-8) unterzogen (Bio-Rad).
IEF Programm:
Temperatur 20°C
Aktive Rehydrierung (50 V; 16 h; Pause nach Rehydrierung)
Programmschritte:

S 01: 200 V; rapid slope; 2 h
S 02: 400 V; rapid slope; 2 h
S 03: 600 V; rapid slope; 2 h
S 04: 1000 V; rapid slope; 2 h
S 05: 2000 V; rapid slope; 2 h
S 06: 3500 V; 40.000-60.000 V/h; 11 bis 17 min
S 07: 250 V; 24 h

Die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid Elektrophorese (SDS-PAGE) erfolgte bei 15°C unter Kühlung. Für die Kühlung wird ein geschlossener Kühlkreislauf verwendet (Lauda WK 1400). Die Elektrophorese wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Programmschritte:

50 V; 1 h
80 V; 1 h
100 V; 1 h
300 V; 4,5 h

Die fertigen SDS-PAGE-Gele wurden entweder mit Coomassie Brilliant Blue G250 angefärbt, oder nach der Methode von Shevchenko mit Silber gefärbt [32].
Die Auswertung der Spotmuster erfolgte mit der 2D Gel-Auswertesoftware PD-Quest (BIO-RAD). Für die Normalisierung der entsprechenden Gele wurde eine globale Normalisierungsmethode über die Gesamtintensität aller validen Spots angewandt. Die Normalisierten Gele wurden in einem „Matchset" zusammengefasst und die übereinstimmenden Proteinspots einander zugeordnet. Die normalisierten Spotintensitäten wurden verglichen und Spots mit relativen Spotintensitäten >2 bzw. <0.5 wurden markiert. Die markierten Proteinspots, d.h. Spots, die auf eine differentielle Plasma-Konzentration einer spezifischen Proteinspezies hinweisen, wurden ausgeschnitten und mit Hilfe des MALDI-Peptide Mass Fingerprint (MALDI- PMF) Verfahrens bzw. mit MS/MS und dem Abgleich der Ergebnisse mit der Datenbank SwissProt-Datenbank (Swiss Institute of Bioinformtics, http://www.swissprot.com) identifiziert.
Ergebnisse
Die 2D-Gele zeigten bei einer Beladung von ca. 500μg eine ausreichende Trennung im Bereich unterhalb ca. 50 kDa. Die Auswertung der mit Silber angefärbten 2D -Gele wies 44 Spots mit signifikant unterschiedlicher Spotintensität nach. Durch die massenspektrometrische Analyse der Spots und dem anschließenden Abgleich dieser Ergebnisse mit der Sequenzdatenbank Swissprot wurde das Protein ACTB und/oder ACTG eindeutig identifiziert. Dabei wurde festegestellt, dass die Spotintensität bei Sepsispatienten (SI=217.4) gegenüber der Spotintensität bei den Kontrollpatienten (SI=521.6) um ca. 2,4-fach reduziert war.
Die Ergebnisse belegen damit eindeutig, dass ein reduzierter Gehalt von ACTB und/oder ACTG in Intensivpatienten auf das Vorliegen einer Sepsis schließen lässt. Damit ist das Verfahren für die Erfindung anwendbar.
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zur in vitro Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer Probe eines Patienten den Gehalt von Actin beta [ACTB] und/oder Actin gamma [ACTG] und/oder davon abgeleiteten Derivaten bestimmt und erfasst, ob der ACTB und/oder ACTG-Wert, bezogen auf eine Kontrollgruppe höher oder niedriger liegt, um auf das Vorliegen einer Sepsis, den Verlauf und/oder den Therapieerfolg bei einer Sepsis oder einer generalisierten akuten Entzündung zu schließen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Actin beta und/oder Actin gamma und/oder davon abgeleiteten Derivaten bei Patienten mit Sepsis signifikant reduziert ist gegenüber dem Gehalt an Actin beta und/oder Actin gamma in nicht an Sepsis erkrankten Patienten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Actin beta die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID #1 aufweist und Actin gamma die Aminosäuresequenz gemäß SEQ-ID #2 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate Mutationen, Modifikationen von Peptiden oder Nukleinsäuren sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus dem Vollblut, Blutbestandteilen oder der Leber stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Serum oder Plasma ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Actin beta und/oder Actin gamma mittels eines Immunoassays erfaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Immunoassay mittels eines gegen Actin beta und/oder Actin gamma gerichteten Antikörpern durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Actin beta und/oder Actin gamma parallel mit anderen Proteinen im Rahmen einer Multiparameterbestimmung zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Multiparameter-Bestimmung mittels eines Proteinchips oder einer immunchromatographischen Messvorrichtung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Messergebnisse computergestützt ausgewertet werden.
Verwendung von Actin beta und/oder Actin gamma zur Herstellung von Antikörpern zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
Kit zur Diagnose, Risikoabschätzung und/oder Verlaufskontrolle von Sepsis oder generalisierten akuten Entzündungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit Komponenten enthält, welche Actin beta und/oder Actin gamma oder dessen Derivative spezifisch erkennen.
Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten ausgewählt werden aus einer Gruppe von Antikörpern, Nukleinsäuren, Peptidonukleotiden,
Kit nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten in ein semi-automatiserten oder automatisierten Vorrichtung integriert sind.
Verwendung von Actin beta und/oder Actin gamma als therapeutisches Target bei Sepsis.