-
Gebiet der
Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Durchmusterungen auf
Alzheimer-Krankheit und insbesondere diagnostische Untersuchungen
auf Grundlage von Durchmusterungen auf das Vorliegen von zellulären Veränderungen,
die früh
in der Pathologie von Alzheimer-Krankheiten auftreten.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Mit
zunehmender Lebenserwartung wird Alzheimer-Krankheit (AD) zu einem
bedeutenden Gesundheitsproblem in der westlichen Welt. Umfangreiche
Forschungen, die auf das Auffinden einer verläßlichen Therapie oder präventiver
Maßnahmen
für die
Krankheit abzielen, sind bisher ohne Erfolg durchgeführt worden.
-
Eines
der größten Probleme
beim Entwerfen und Untersuchen eines beliebigen Wirkstoffes stellt
das Fehlen verläßlicher
klinischer Diagnosekriterien dar, die AD-Erkrankte rechtzeitig für eine beliebige
bedeutsame Intervention identifizieren können. Die gegenwärtig verfügbaren klinischen
Diagnosehilfsmittel ermöglichen jedoch
keine genaue und verläßliche Diagnose
von Alzheimer-Krankheit außer
bei schwer unter Demenz leidenden Patienten. Darüber hinaus ermöglichen
sie keine Identifizierung von Individuen mit präklinischer Alzheimer-Krankheit,
denen präventive
Intervention nützen
könnten.
-
Die
am meisten verwendeten klinischen Diagnosekriterien sind die NINCDS/ADRDA-Kriterien
(McKhann, G. et al., (1984) Neurology 34: 939-944), welche ursprünglich für Forschungszwecke
entworfen wurden. Diese Kriterien sind äußerst empfindlich, weisen jedoch
eine geringe Spezifität
auf. Dies liegt an der Tatsache, dass der positive Prognosewert
einer Diagnose einer Alzheimer-Krankheit als "unwahrscheinlich" oder "eventuell" sehr hoch ist, während der negative Prognosewert
sehr niedrig ist (13). Anders ausgedrückt, ist es äußerst wahrscheinlich,
dass ein Patient tatsächlich
Alzheimer-Krankheit hat, wenn er die Anforderungen der NINCDS/ADRDA-Kriterien
für Alzheimer-Krankheit erfüllt. Es
wurde jedoch bei einer post mortem-Untersuchung herausgefunden,
dass ein Anteil der Patienten, die diese Kriterien nicht erfüllen (z.B.
als Kontrollen angesehen), Alzheimer-Erkrankung haben (13).
-
Als
Folge ihrer geringen Spezifität
sind die NINCDS/ADRDA-Kriterien für klinische Diagnosezwecke nicht
optimal. Darüber
hinaus sind sie nicht als Diagnosekriterien für klinische Studien geeignet,
die auf präventive
oder heilende Therapien gerichtet sind, deren größte Heilungschancen dann bestehen,
wenn sie verwendet werden, bevor sich eine bedeutsame Demenz entwickelt
hat. Daher verbleibt ein Bedarf für einen verlässlichen
Diagnosetest für
Alzheimer-Krankheit, und insbesondere für einen Test, der zum frühen Nachweis von
Individuen mit präklinischer
Alzheimer-Krankheit verwendet werden kann, denen präventive
Intervention nützen
könnte.
-
In
den letzten Jahren wurde immer mehr anerkannt, dass die pathogene
Grundlage von Alzheimer-Krankheit der anormale Wiedereintritt verschiedener
neuronaler Populationen in den Zellteilungszyklus darstellt (14).
Bei gesunden älteren
Individuen kann sich ein schneller Stillstand des Zellzyklus und
Redifferenzierung an diesen Wiedereintritt in den Zellzyklus anschließen. Im
Gegensatz dazu scheinen die Regulationsmechanismen bei Individuen
mit Alzheimer-Krankheit zu versagen, und der Verlauf der Neuronen
in den späten
Stadien des Zellzyklus führt
zur Anreicherung von mit AD in Beziehung stehender Pathologie und/oder
mit AD in Beziehung stehendem Neuronentod (14).
-
Studien
der vorliegenden Erfinder und Anderer deuten darauf hin, dass der
Defekt der Regulation des Zellzyklus bei Alzheimer-Krankheit am
Kontrollpunkt des G1/S-Übergangs
auftritt (3). Vorherige Studien über Fibroblasten
und Lymphozyten von Patienten mit Alzheimer-Krankheit deuten darauf
hin, dass die Regulation des Zellteilungszyklus wahrscheinlich in
diesem Zustand in Zellen unterbrochen wird, die keine Neuronen sind (8,
9, 17). Es ist auch bekannt, dass Patienten mit Alzheimer-Krankheit
gefährdeter
für einige
Krebsformen sind (4), und dass Patienten mit Down-Syndrom, die AD
im frühen
Erwachsenenalter entwickeln, gefährdeter
für Leukämie sind
als die Allgemeinbevölkerung
(7, 10). Es ist daher einleuchtend, die Hypothese aufzustellen, dass
der regulatorische Defekt des Zellzyklus in Neuronen wahrscheinlich
sogar in frühen
(präklinischen)
Stadien von AD durch eine ähnliche
regulatorische Fehlfunktion des Zellzyklus in Lymphozyten widergespiegelt wird.
-
Die
vorliegenden Erfinder haben nun gezeigt, dass die in vitro-Ansprechbarkeit
von Lymphozyten auf G1-Inhibitor-Behandlung bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit wesentlich
weniger wirksam als bei Kontrollen ist. Darüber hinaus ist bei Individuen,
die klinische Anzeichen von beginnender Alzheimer-Krankheit zeigen, die
Lymphozyten-Reaktion ähnlich
derjenigen, die bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit beobachtet
wird. Diese Befunde stellen den direkten Beweis zur Unterstützung der
Hypothese dar, dass der Defekt der Kontrolle über den G1/S-Phasenübergang
bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit nicht auf Neuronen beschränkt ist, sondern
auch in peripheren Zellen, wie z.B. Lymphozyten auftritt.
-
Die
Beobachtung, dass der regulatorische Defekt beim G1/S-Übergang
auch in peripheren Zellen auftritt, stellt die Grundlage für neue klinische
Untersuchungen dar, die für
die Diagnose von Alzheimer-Krankheit geeignet sind und die auf die
Auslösung
der Aktivierung des Kontrollpunktes des G1/S-Übergangs
in nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Lymphozytenkulturen, beruhen.
-
Da
regulatorischer Defekt des Zellzyklus in Neuronen ein sehr frühes Ereignis
bei der Pathogenese von Alzheimer-Krankheit zu sein scheint, werden
solche Untersuchungen voraussichtlich zur Identifizierung von Individuen
in den präklinischen
Stadien von Alzheimer-Krankheit, die nicht die Anforderungen der
NINCDS/ADRDA-Kriterien für
Demenz erfüllen,
von Nutzen sein, würden
aber von früher
Intervention mit präventiven
Maßnahmen
für Alzheimer-Krankheit
profitieren.
-
Beschreibung
der Erfindung
-
Gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit bei
einem menschlichen Individuum bereitgestellt, wobei das Verfahren
das Durchmustern auf das Vorliegen eines regulatorischen Defektes
des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
in nicht-neuronalen Zellen des menschlichen Individuums umfasst.
-
Das
Verfahren der Erfindung wird am stärksten bevorzugt in vitro an
nicht-neuronalen
Zellen ausgeführt,
die aus dem zu untersuchenden menschlichen Individuum isoliert sind.
Die nicht-neuronalen Zellen können
ein beliebiger nicht-neuronaler Zelltyp sein, der denselben regulatorischen
Defekt des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang aufweist, wie er in
den Neuronen bei Alzheimer-Krankheit vorliegt. In der am stärksten bevorzugten
Ausführungsform
wird das Verfahren an Lymphozyten ausgeführt, die aus dem Individuum
isoliert und in vitro kultiviert werden. Die Möglichkeit, das Vorliegen des
regulatorischen Defektes des Zellzyklus in einem nicht-neuronalen
Zelltyp zu untersuchen, bringt offensichtliche praktische Vorteile
mit sich. Die Verwendung von Lymphozyten ist besonders geeignet,
da sie leicht aus einer Blutprobe isoliert werden und in vitro kultiviert
werden können.
Eine weitere bevorzugte Alternative ist die Verwendung von Fibroblasten,
insbesondere Hautfibroblasten, welche geeigneterweise aus einer
Hautbiopsie erhalten werden können.
-
Wenn
das Verfahren der Erfindung diagnostisch verwendet wird, deutet
das Vorliegen eines Defekts bei der Regulation des Zellzyklus beim
G1/S-Phasenübergang
in einem nicht-neuronalen Zelltyp darauf hin, dass das Individuum
Alzheimer-Krankheit hat. Üblicherweise
deutet eine Verminderung der Effektivität der Kontrolle über den
Kontrollpunkt beim G1/S-Übergang
darauf hin, dass das Individuum Alzheimer-Krankheit hat.
-
Die
Verfügbarkeit
eines verlässlichen
Tests für
einen Defekt, dem die Pathologie von Alzheimer-Krankheit zugrunde
liegt, verbessert die Fähigkeit
zur Diagnose des Zustandes wesentlich, und insbesondere ermöglicht es
Frühdiagnose.
Die gegenwärtig
verfügbaren
operationalen Diagnosekriterien für Alzheimer-Krankheit ermöglichen
erst sehr späte
Diagnose von eventueller oder wahrscheinlicher AD, wenn Demenz bereits vorliegt.
Eine eindeutige Diagnose von Alzheimer-Krankheit kann nur nach post
mortem-Untersuchung durchgeführt
werden. Aus der Arbeit der vorliegenden Erfinder ist ersichtlich,
dass ein Defekt in der Kontrolle des Zellzyklus in peripheren (nicht-neuronalen)
Zellen, wie z.B. Lymphozyten, weit vor Auftreten der klinischen
Anzeichen von vollständig
entwickelter Demenz nachweisbar ist. Daher stellt das Verfahren
der Erfindung ein Hilfsmittel zur Frühdiagnose von Alzheimer-Krankheit
dar, insbesondere zum Nachweis von Individuen, die sich in präklinischen
Stadien der Krankheit befinden, und zur Identifizierung von Individuen,
die noch keine Alzheimer-Krankheit als solche entwickelt haben,
jedoch aufgrund des Vorliegens des regulatorischen Defektes des
Zellzyklus dafür "gefährdet" sind. Dies eröffnet die
Möglichkeit
der frühen
Intervention mit präventiven Maßnahmen
einschließlich,
unter anderem, Änderungen
des Lebenswandels und Vitaminbehandlungsschematas sowie HRT für postmenopausale
Frauen.
-
Die
Verfügbarkeit
diagnostischer Hilfsmittel, die in der Lage sind, frühe Veränderungen
bei Individuen nachzuweisen, die noch keine Alzheimer-Krankheit als solche
entwickelt haben, ermöglicht
auch die Entwicklung und das Untersuchen von Therapien, die auf
die Beendigung des Fortschreitens der Krankheit in einem Zeitpunkt
vor der Entwicklung von signifikanter Hirnpathologie abzielen. Die
diagnostischen Untersuchungen können
auch zur Entwicklung von Tiermodellen von früher Alzheimer-Krankheit angewendet
werden, z.B. zur Identifizierung eines Mausmodells, welches bei
der Regulation des Zellzyklus einen Defekt aufweist, der zu demjenigen
der Alzheimer-Krankheit
analog ist.
-
Die
Fähigkeit
zur Identifizierung von Individuen mit einem regulatorischen Defekt
des Zellzyklus beim G1/S-Übergang
kann zur Selektion von Individuen, die in klinische Studien einzubeziehen
sind, angewendet werden. Klinische Studien erzeugen mit größerer Wahrscheinlichkeit
aussagekräftige
Ergebnisse, wenn die Individuen, die in die Studie einbezogen sind,
so ausgewählt
sind, dass sie mit der größten Wahrscheinlichkeit von
der Behandlung während
der Untersuchung profitieren.
-
Die
Identifizierung des G1/S-regulatorischen Defekts in Lymphozyten,
die einem Patienten entnommen wurden, der unter beginnender oder
ausgeprägter
Alzheimer-Krankheit leidet, kann auf das Vorliegen von Immunproblemen
des Patienten oder auf die Wahrscheinlichkeit, dass der Patient
Immunprobleme mit dem Fortschreiten der Krankheit entwickelt, hindeuten.
Die Verfügbarkeit
solcher Informationen unterstützt
den Kliniker bei der Entscheidung, ob er mit einer Therapie interveniert,
die auf Linderung/Prävention
von Immunproblemen abzielt, die die Alzheimer-Krankheit verkomplizieren.
-
Das
Verfahren der Erfindung ist zur Diagnose von sporadischer Alzheimer-Krankheit besonders
bevorzugt. Es ist jedoch auch zur Diagnose von Formen von familiärer Alzheimer-Krankheit
geeignet, welche einen äquivalenten
regulatorischen Defekt des Zellzyklus aufweisen. Im Allgemeinen
umfasst dies nicht familiäre Alzheimer-Krankheit,
die mit Presenilin-1- oder Presenilin-2-Mutationen assoziiert ist.
-
Es
gibt verschiedene Arten zur Durchmusterung auf das Vorliegen eines
regulatorischen Defektes des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
in nicht- neuronalen
Zellen gemäß der Erfindung.
In einer Ausführungsform
kann das Durchmustern auf das Vorliegen eines regulatorischen Defektes
des Zellzyklus durch anfängliches
Induzieren der Zellteilung und anschließendes Auslösen des Stillstands des Zellzyklus
durch Hinzufügen einer
Zellteilungs-Inhibitorsubstanz
und Untersuchen der Ansprechbarkeit der regulatorischen Mechanismen des
G1/S-Zellzyklus der Zellen auf das Hinzufügen der Zellteilungs-Inhibitorsubstanz
hin durchgeführt
werden.
-
Am
stärksten
bevorzugt ist die Zellteilungs-Inhibitorsubstanz ein spezifischer
G1-Inhibitor, z.B. Rapamycin. Zellteilung kann durch Hinzufügen eines
Mitoseauslösenden
Reizes, z.B. eines oder mehrerer Wachstumsfaktoren, induziert werden.
Wenn die Untersuchung unter Verwendung von Lymphozyten ausgeführt wird, kann
Phytohämaglutinin
zur Induktion von Zellteilung verwendet werden.
-
In
einer weiteren, damit in Bezug stehenden Ausführungsform kann Behandlung
mit der Zellteilungs-Inhibitorsubstanz durch Behandlung mit einem
Reiz ersetzt werden, der Stillstand des Zellzyklus bei G1 auslöst, z.B.
ein umgebungsbedingter Reiz. Durchmustern auf das Vorliegen des
G1/S-regulatorischen
Defektes wird daher durchgeführt
durch: Induzieren der Zellen zur Teilung, Unterwerfen der Zellen
einem Reiz, der den Stillstand des Zellzyklus bei G1 induziert und
Untersuchen der Ansprechbarkeit der regulatorischen Mechanismen
der Zellen des G1/S-Zellzyklus auf das Hinzufügen des Reizes, der den Stillstand
des Zellzyklus auslöst.
-
Geeignete
Reize des Stillstandes des Zellzyklus umfassen, unter anderem, ionisierende
Strahlung, Sauerstoffmangel, UV-Strahlung etc. In einer bevorzugten
Ausführungsform
kann Stillstand des Zellzyklus durch Behandlung der Zellen mit N2O2 zur Erzeugung
von oxidativem Stress induziert werden. Wie oben erwähnt, kann
Zellteilung durch das Hinzufügen
eines Mitoseauslösenden
Reizes, z.B. einer oder mehrerer Wachstumsfaktoren, induziert werden.
Phytohämaglutinin
kann zur Induktion von Zellteilung in kultivierten Lymphozyten verwendet
werden.
-
Das
Grundprinzip hinter diesen beiden Verfahren liegt in der anfänglichen
Stimulation der Zellen zur Teilung und dem anschließenden Versuch,
den Zellzyklus im G1-Stadium unter Verwendung entweder eines Zellteilungs-Inhibitors oder eines
anderen Reizes, der den Stillstand des Zellzyklus auslöst, anzuhalten,
und anschließender
Bewertung der Wirkung einer solchen Behandlung auf das regulatorische
System des Zellzyklus. Die Wirkung auf die Regulation des Zellzyklus
kann durch eine Vielfalt unterschiedlicher Mittel, wie im Folgenden
erörtert,
bewertet werden. Die Behandlung mit einem Zellteilungs-Inhibitor
oder einem anderen Reiz, der den Stillstand des Zellzyklus induziert,
kann hierin als "Zellzyklus-hemmende
Behandlung" oder "hemmende Behandlung" bezeichnet werden.
Liegt ein regulatorischer Defekt des Zellzyklus beim G1/S-Übergang
vor, beeinflußt
dies die Ansprechbarkeit der Zelle auf den Versuch, den Zellzyklus
zum Stillstand zu bringen. Im Allgemeinen führt das Vorliegen eines regulatorischen
Defektes des Zellzyklus bei G1/S zu einer verminderten Ansprechbarkeit
auf Behandlung mit einem Zellteilungs-Inhibitor oder einem anderen
Reiz, der Stillstand des Zellzyklus bei G1 auslöst, d.h. die hemmende Behandlung
ist beim Stillstand des Zellzyklus beim G1/S-Kontrollpunkt in Zellen mit einem solchen
Defekt weniger wirksam.
-
Verschiedene
Ansätze
können
vor und nach dem Hinzufügen
des Mitoseauslösenden
Reizes sowie vor und nach dem Versuch, den Zellzyklus zum Stillstand
zu bringen, durchgeführt
werden, um die Ansprechbarkeit der Zellen auf die Zellzyklus-hemmende
Behandlung zu untersuchen. Eine nicht-vollständige Liste von bevorzugten
Ansätzen,
die gemäß der Erfindung
verwendet werden können,
wird im Folgenden angegeben, andere geeignete Ansätze sind
jedoch dem Fachmann bekannt:
- (1) Ausführung eines
Proliferationsassay zur Bestimmung, ob und in welchem Ausmaß als Ergebnis
der hemmenden Behandlung Stillstand des Zellzyklus aufgetreten ist.
Der Proliferationsassay kann gemäß beliebigen,
im Fachbereich bekannten Standardprotokollen ausgeführt werden.
Ein besonders geeignetes Beispiel stellt der MTT-Überlebensassay
dar (kommerziell erhältlich
von Chemicon International Ltd, siehe Mosmann, T. In J. Immunol.
Methods, 1983, Bd: 65, 55-63).
Bei einer üblichen Durchmusterung werden
Proliferationsassays sowohl an Zellen, die mit einem Zellteilungsinhibitor
oder einem anderen Reiz behandelt wurden, der Stillstand des Zellzyklus
induziert, als auch an unbehandelten Kontrollzellen desselben Individuums
durchgeführt.
Da die hemmende Behandlung nur in Gegenwart eines intakten G1/S-regulatorischen
Systems wirksam ist, ist der Unterschied des Ausmaßes an Proliferation
zwischen behandelten und unbehandelten Zellen bei Patienten mit
Alzheimer-Krankheit wesentlich kleiner als bei Kontrollen mit entsprechenden
Alter. Im Allgemeinen deutet eine geringe oder keine Veränderung
der proliferativen Aktivität
der Zellen aus dem Individuum in Gegenwart einer hemmenden Behandlung
auf eine verminderte Ansprechbarkeit der Hemmung des Zellzyklus
in der G1-Phase,
und daher auf das Vorliegen eines regulatorischen Defekts beim G1/S-Übergang hin. Das Vorliegen
eines solchen regulatorischen Defekts deutet wiederum darauf hin,
dass das Individuum Alzheimer-Krankheit hat.
- (2) Berechnen der relativen Verlängerung der G1-Phase des Zellzyklus
in Zellen des Individuums als Folge des Behandelns mit einem Zellteilungsinhibitor
oder Reiz, der Stillstand des Zellzyklus induziert. Die relative Verlängerung
der G1-Phase als Folge des Behandelns mit dem Zellteilungsinhibitor
oder Reiz, der Stillstand des Zellzyklus induziert, wird unter Verwendung
der Formel RL = 100f – 100
(in Prozent ausgedrückt) berechnet. "f' stellt das Verhältnis zwischen der Zeit in
G1 für
Zellen (nicht-neuronale Zellen des zu untersuchenden Individuums),
die hemmender Behandlung mit dem Zellteilungsinhibitor oder Reiz
unterworfen wurden, der Stillstand des Zellzyklus (TG1tr)
induziert, und der Zeit in G1 für
unbehandelte Kontrollzellen (d.h. auch nicht-neuronale Zellen des
zu untersuchenden Subjektes), die keiner hemmenden Behandlung unterworfen
wurden (TG1c), dar. f kann gemäß der folgenden
Beziehung berechnet werden: = TG1tr/TG1c =
[1n2 – 1n
(2 – G1tr)][1n(2 –G1tr)][1n2 – 1n (2 – G1c)] (5)
Verschiedene
Methoden können
zum Erhalt der Werte von TG1tr und TG1c eingesetzt werden. In einer bevorzugten
Ausführungsform
können
TG1tr und TG1c durch
Bestimmen des Anteils der Zellen in den verschiedenen Phasen des
Zellzyklus für
sowohl behandelte Zellen (nicht-neuronale Zellen des Individuums, das
mit der Zellteilungs-Inhibitorsubstanz oder dem Reiz, der Stillstand
des Zellzyklus induziert, behandelt wurde) als auch unbehandelte
Kontrollzellen (nicht-neuronale Zellen desselben Individuums, das
nicht mit Zellteilungs-Inhibitorsubstanz oder dem Reiz, der Stillstand
des Zellzyklus induziert, behandelt wurde), erhalten werden. Der
Anteil der Zellen in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus kann
leicht durch Einbau eines markierten Nukleotidanalogons, bevorzugt
Bromdeoxyuridin (BrdU), und anschließend durch Fluorescence Activated
Cell Sorting (FACS)-Analyse oder ein Äquivalent davon, wie in den
beigefügten
Beispielen beschrieben, bestimmt werden.
Das Vorliegen eines
regulatorischen Defektes des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
wird durch eine verminderte relative Verlängerung der G1-Phase in Gegenwart
der Zellteilungs-Inhibitorsubstanz oder des Reizes in Zellen des
Testindividuums im Vergleich zu Kontrollzellen, die keinen regulatorischen
Defekt des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang aufweisen, angezeigt
(siehe unter (1) zur weiteren Definition geeigneter Kontrollzellen).
Die Kontrollzellen, die keinen regulatorischen Defekt des Zellzyklus
beim G1/S-Phasenübergang
aufweisen, sollten nicht mit den "unbehandelten Kontroll-"Zellen, die zur Berechnung
der RL verwendet werden, welches Zellen aus dem Testindividuum darstellen,
die keiner hemmende Behandlung unterworfen wurden, verwechselt werden.
- (3) Bestimmung des regulatorischen Proteins des Zellzyklus oder
der mRNA-Expression. Expression von regulatorischen Proteinen des
Zellzyklus können
unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten Standardmethoden,
wie z.B. Immunoblotting, Western Blotting, ELISA oder damit in Beziehung
stehenden Verfahren bestimmt werden. Bestimmung der Expression entsprechender
mRNAs, die für
regulatorische Proteine des Zellzyklus kodieren, können auch
mittels Standardverfahren durchgeführt werden wie z.B. Hybridisierungsmethoden, "DNA Chip"-Analyse oder damit
in Beziehung stehenden Verfahren oder Methoden auf Grundlage von
Amplifizierung wie z.B. RT-PCR oder Amplifizierung auf Grundlage
von Nukleinsäuresequenz
(Nucleic Acid Sequence-based Amplification (NASBA)). Geeignete Verfahren
zum Nachweis/zur Quantifizierung von mRNAs, welche gemäß der Erfindung
verwendet werden können,
sind dem Fachmann bekannt. Bestimmte dieser Verfahren, z.B. RT-PCR,
beruhen auf dem Nachweis/der Quantifizierung einer cDNA-Kopie der
entsprechenden mRNA.
-
Der
regulatorische Defekt des Zellzyklus, der bei Alzheimer-Krankheit
vorliegt, kann zu Veränderungen
des Expressionsmusters von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus
und deren entsprechenden mRNAs führen.
Durchmustern auf Veränderungen
der Expression von bestimmten regulatorischen Proteinen des Zellzyklus
und/oder der entsprechenden mRNAs kann daher zur diagnostischen
Identifizierung des Vorliegens eines regulatorischen Defekts des
Zellzyklus bei G1/S verwendet werden. Darüber hinaus kann Expression
von regulatorischen Proteinen des Zellzyklus als Marker für den Verlauf
des Zellzyklus verwendet werden. Daher kann die Ansprechbarkeit
der Zeilen auf hemmende Behandlung durch Beobachten der Expression
eines oder mehrerer regulatorischer Proteine des Zellzyklus zur
Bestimmung des Ausmaßes,
in welchem hemmende Behandlung in Zellen des Testsubjektes Stillstand
des Zellzyklus verursacht, bestimmt werden. Geeignete regulatorische
Proteine des Zellzyklus umfassen CDKN3, p15ink4B, p16ink4A, p19ink4D,
p27kip1, p21cip1, p57kip2 und TP53. Die Sequenzen dieser Proteine
und die Gene, die für
diese kodieren, sind öffentlich
verfügbar.
-
Eine
Liste der OMIM-Accession-Nummern für diese Proteine ist in den
begleitenden Beispielen bereitgestellt. Antikörper, die zum Nachweis jedes
dieser Proteine geeignet sind, sind kommerziell erhältlich.
- (4) Bestimmung der Zelllebensfähigkeit
und des Zelltodes durch beliebige im Fachbereich bekannte Verfahren.
Ein Stillstand einer Proliferationszelle beim G1/S-Übergang
kann zu einem oder zwei möglichen "stromabwärts gelegenen" Phänomenen
führen,
entweder zur Differenzierung oder zum programmierten Zelltod. Diese
stromabwärts
gelegenen Phänomene
können
als Hinweis auf das Vorliegen eines regulatorischen Defekts beim
G1/S-Übergang
in einer Zellpolulation verwendet werden, da die stromabwärts gelegenen
Wirkungen des Stillstands des Zellzyklus bei G1/S auch abnormal
sind, wenn die Regulation des G1/S-Übergangs defekt ist. Ein geringeres
Ausmaß an
Zelltod oder ein höheres
Ausmaß an
Zelllebensfähigkeit
in Reaktion auf hemmende Behandlung in Zellen des Testindividuums
im Vergleich zu Kontrollzellen deutet darauf hin, dass das Individuum
Alzheimer-Krankheit
hat.
- (5) Bestimmung von mit Zelltod in Beziehung stehendem (induzierendem
oder hemmendem) Protein oder mRNA-Expression unter Verwendung von
Standardmethoden. In dieser Ausführungsform
wird Expression von mit Zelltod in Beziehung stehenden Proteinen
oder der entsprechenden mRNAs als indirekte Bestimmung der stromabwärts gelegenen
Wirkungen der Behandlungen mit einem Zellteilungsinhibitor oder
einem anderen Reiz, der Stillstand des Zellzyklus beim G1/S-Übergang
induziert, verwendet. Geeignete mit Zelltod in Beziehung stehende
Proteine umfassen Mitglieder der bcl-2-Proteinfamilie, wovon viele
im Fachbereich bekannt sind.
- (6) Bestimmung der Expression von Response-Element-Proteinen
für DNA-Schädigung oder
entsprechenden mRNAs unter Verwendung von Standardmethoden. Dieser
Ansatz kann verwendet werden, wenn der zur Induktion des Stillstandes
des Zellzyklus bei G1/S verwendete Reiz DNA- Schädigung
ist, z.B. Behandlung mit einem chemischen Mittel, welches DNA-Schädigung verursacht
oder Unterwerfen gegenüber UV-Strahlung.
Unter normalen Umständen
induziert das Vorliegen von DNA-Schädigung den Stillstand einer
Zelle beim G1/S-Phasenübergang
und beim Versuch, die beschädigte
DNA über
Aktivierung der Response-Wege für
DNA-Schädigung
zu reparieren. Änderungen
des Expressionsmusters von Proteinen, die an der normalen Reaktion
auf DNA-Schädigung
beteiligt sind, oder der entsprechenden mRNAs, in Reaktion auf das
Vorliegen von beschädigter
DNA kann daher auf das Vorliegen eines regulatorischen Defektes des
Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
hindeuten. Geeignete Response-Elemente für DNA-Schädigung umfassen TP53, Gadd34,
Gadd45A (126335), Gadd45B (604948), Gadd45G (604949), Gadd153 (126337)
und PCNA (176740). Eine Liste der OMIM-Accessionnummern für diese
Response-Elemente für DNA-Schädigung ist
im Folgenden bereitgestellt.
- (7) Bestimmung des DNA-Gehaltes der nicht-neuronalen Zellen
mit oder ohne Zellzyklusanalyse. In dieser Ausführungsform stellt die Messung
des DNA-Gehalts von Zellen des Testindividuums, welches mit einem Zellteilungsinhibitor
oder einem anderen Reiz, der Stillstand des Zellzyklus induziert,
ein indirektes Anzeichen für
das Vorliegen eines regulatorischen Defektes beim G1/S-Übergang
in solchen Zellen bereit. Das Grundprinzip hinter diesen Verfahren
liegt in dem Unterschied des DNA-Gehaltes zwischen den Zellen in der
G1-Phase und Zellen in der G2-Phase, welche das DNA-Replikationsstadium
des Zellzyklus durchlaufen haben. Wenn eine Population von normalen
Zellen (d.h. ohne einen regulatorischen Defekt bei G1/S) zur Induktion
des Stillstandes des Zellzyklus bei G1 oder bei G1/S behandelt wird,
verbleibt die Mehrheit der Zellen in der G1-Phase. Wenn Zellen jedoch
einen regulatorischen Defekt bei G1/S aufweisen, tritt ein Anteil
der Zellen durch den G1/S-Kontrollpunkt und wird DNA-Replikation
unterzogen. Daher deutet ein erhöhter
DNA-Gehalt in Zellen eines Testindividuums im Vergleich zu Kontrollzellen,
die keinen regulatorischen Defekt bei G1/S aufweisen, im Anschluss
an eine Behandlung zur Induktion des Stillstandes des Zellzyklus
bei G1 auf das Vorliegen eines regulatorischen Defektes bei G1/S
hin. Das Vorliegen eines solchen regulatorischen Defektes deutet
wiederum darauf hin, dass das Individuum Alzheimer-Krankheit hat.
-
Es
ist beabsichtigt, die obige Liste an Methoden, die zur Verwendung
bei der Untersuchung der Ansprechbarkeit von nicht-neuronalen Zellen,
insbesondere kultivierten Lymphozyten, zur hemmende Behandlung mit
einem Zellteilungsinhibitor oder Reiz, der Stillstand des Zellzyklus
induziert, geeignet ist, vielmehr zur Veranschaulichung als zur
Einschränkung
der Erfindung dient.
-
Am
stärksten
bevorzugt umfasst das Verfahren der Erfindung Durchmustern auf das
Vorliegen von mindestens einer Mutation oder Allel-Variante in einem
regulatorischen Gen des Zellzyklus, welches ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus CDKN3, p15ink4B, p16ink4A, p19ink4D,
p27kip1, p21cip1, p57kip2 und TP53.
-
Das
Verfahren der Erfindung ist nicht auf das Durchmustern auf das Vorliegen
einer beliebigen spezifischen Mutation oder genetischen Variante
eingeschränkt,
obwohl das Durchmustern auf das Vorliegen spezifischer Mutationen/Varianten,
für welche
gezeigt wurde, dass sie mit Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang stehen, beabsichtigt
ist. Die Erfindung umfasst das Durchmustern des regulatorischen
Gens des Zellzyklus oder einer Subregion davon auf das Vorliegen
von Mutationen oder genetischen Varianten einschließlich bisher
unbekannter Mutationen/Varianten. Um Zweifel auszuschließen, umfasst
die Bezeichnung "Gen" die regulatorischen
Regionen, insbesondere die Promotorregion. Das Vorliegen einer oder
mehrerer Mutationen oder genetischer Varianten in einem regulatorischen
Gen des Zellzyklus, insbesondere Mutationen/Varianten, welche zu
einer Veränderung
in der Aminosäuresequenz
des Proteins führen,
das durch das Gen kodiert ist oder welche die Funktion des kodierten
Proteins ändern
oder welche Expressionsmenge des Proteins ändern, deutet darauf hin, dass
das Individuum Alzheimer-Krankheit hat, vorausgesetzt, dass das
Vorliegen einer solchen Mutation oder Variante auf einen regulatorischen
Defekt des Zellzyklus hindeutet.
-
Im
Fachbereich gibt es viele Methoden zum Nachweis genetischer Variation,
welche gemäß der Erfindung
zum Durchmustern eines regulatorischen Gens des Zellzyklus eines
bestimmten menschlichen Individuums auf das Vorliegen von Mutationen/Allelvarianten
verwendet werden kann. Geeignete Methoden umfassen z.B. Einzelstrangkonformationspolymorphismus-Analyse
(SSCP), PCR-SSCP, Heteroduplex-Analyse (HA), Denaturierende Gradientengelelektrophorese
(DGGE), DNA-Sequenzierung, RNAse-Spaltung, Chemische Mismatch-Spaltung
(CCM) etc. (siehe Review von Schafer und Hawkins, Nature Biotechnology,
Bd: 16, S. 33-39, 1998).
-
Das
begleitende Beispiel 2 beschreibt die Verwendung von PCR-SSCP zur
Durchmusterung auf polymorphe Varianten in den p21cip- und p57-Genen
und die Identifizierung einer polymorphen Variante in Exon 2 des
p21cip-Gens und zweier polymorpher Varianten in Exon 2 des p57-Gens.
Derselbe technische Ansatz kann zum Durchmustern nach polymorphen
Varianten in anderen Genen mit geeigneter Modifikation, d.h. der Auswahl
von PCR-Primern, die für
das Gen von Interesse spezifisch sind, eingesetzt werden.
-
Das
Durchmustern auf das Vorliegen von Mutationen/Allelvarianten wird
an einer genomischen DNA-Probe ausgeführt, die aus dem menschlichen
Individuum isoliert wurde. Genomische DNA kann zweckmäßigerweise
unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten Standardmethoden
geeigneterweise aus einer Vollblutprobe isoliert werden. Vorteilhafterweise
kann der Vorgang des Durchmusterns auf das Vorliegen von Mutation/Allelvarianten
an genomischer DNA ausgeführt
werden, die aus kultivierten Lymphozyten des Individuums hergestellt
wurde. Dieselbe Lymphozytenkultur kann auch "funktionell" auf das Vorliegen eines regulatorischen
Defektes des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang untersucht werden,
z.B. durch Untersuchung der Ansprechbarkeit auf hemmende Behandlung
unter Verwendung eines Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung.
-
Assoziationen
zwischen einer bestimmten polymorphen Variante und Empfänglichkeit
für Alzheimer-Krankheit
kann durch Ausführen
von genetischen Assoziationsstudien, z.B. familienbezogene oder Fall-Kontroll-Assoziationsstudien
bestätigt
werden. Die Assoziation bestimmter polymorpher Varianten mit der Krankheit
kann auch durch Bewertung der Beziehung zwischen Genotyp und Expression
von Markern des Verlaufes des Zellzyklus im Gehirn bestimmt werden.
In den begleitenden Beispielen wurde die Beziehung zwischen Genotyp
und Expression von Cyclin B (ein Marker für den Verlauf des Zellzyklus
bis zum G2-Stadium) in Neuronenzellkernen bewertet. Andere Marker
des Zellzyklusverlaufes hätten
mit äquivalenter
Wirkung verwendet werden können.
-
In
einer spezifischen Ausführungsform
kann das Verfahren Genotypisieren eines der polymorphen Varianten
in den p21- und p57-Genen, die in den begleitenden Beispielen beschrieben
sind, umfassen. Diese Varianten, die als p21E2-Allele A und B, p57E2A-Allele
A und B und P57E2B-Allele A und B bezeichnet sind, können auf
Grundlage von PCR-SSCP-Analyse unter Verwendung der folgenden Primersätzen unter
den in den begleitenden Beispielen spezifizierten Bedingungen genotypisiert
werden:
-
In
jedem Fall können
die A- und B-Allele auf Grundlage unterschiedlicher elektrophoretischer
Beweglichkeit der sich ergebenden PCR-Produkte unter den in Beispiel
2 definierten Bedingungen unter Bezugnahme auf 6 identifiziert
werden. Es ist jedoch nicht beabsichtigt, die Erfindung auf die
Verwendung von PCR-SCCP und anderen Verfahren zum Genotypisieren
derselben Varianten, die verwendet werden können, einzuschränken.
-
Das
p21E2 A-Allel und das p57E2A A-Allel sind beide mit gesteigertem
Verlauf durch den G1/S-Kontrollpunkt und daher mit verstärkter Empfänglichkeit
gegenüber
Alzheimer-Krankheit assoziiert.
-
Durchmusterungen
auf Grundlage von Nachweis des Vorliegens von Mutationen oder Allelvarianten in
Genen, die für
regulatorische Gene des Zellzyklus kodieren, kann Genotypisieren
nach zwei oder mehreren polymorphen Varianten mit sich bringen oder
es kann Durchmustern nach einem oder mehreren regulatorischen Genen
des Zellzyklus auf das Vorliegen von genetischer Variation mit sich
bringen. Beliebige genetische Variation, die eine nachteilige Wirkung
auf die Funktion eines regulatorischen Gens des Zellzyklus aufweist, kann
möglicherweise
zu einer Umgehung des Kontrollpunktes des G1/S-Übergangs und folglich zu AD-Pathologie
führen.
Häufung
von genetischer Variation innerhalb eines einzelnen regulatorischen
Gens oder über mehrere
Gene hinweg kann eine zusätzliche
Wirkung aufweisen.
-
Durchmusterungen
auf Grundlage von Nachweis des Vorliegens von Mutationen oder Allelvarianten in
Genen, die für
regulatorische Gene des Zellzyklus kodieren, kann bei der Diagnose
von Alzheimer-Krankheit, möglicherweise
in Verbindung mit anderen Diagnosetests wie z.B. Durchmustern auf
das Vorliegen eines regulatorischen Defektes des Zellzyklus, verwendet
werden. Sie können
auch aufgrund des Vorliegens der Mutation(en) oder Allelvariante(n)
in einem regulatorischen Gen des Zellzyklus zur Identifizierung
von Individuen mit Prädisposition
für Alzheimer-Krankheit
verwendet werden.
-
Der
Ansatz des Durchmusterns nach Mutationen oder Allelvarianten in
einem regulatorischen Gen des Zellzyklus kann auch zur Bestimmung
einer beliebigen genetischen Grundlage für Alzheimer-Krankheit in einem
Patienten, der zuvor mit Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wurde,
verwendet werden.
-
In
einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Verwendung
zur Diagnose von Alzheimer-Krankheit in einem menschlichen Individuum
bereit, welches Durchmustern auf das Vorliegen von mindestens einer
Mutation oder Allelvariante in einem Gen in dem Genom des Individuums
umfasst, welches für ein
DNA-Reparaturenzym kodiert, wobei das Vorliegen einer Mutation oder
Allelvariante in einem solchen Gen auf Alzheimer-Krankheit hindeutet.
-
Geeignete
Gene umfassen diejenigen, die für
die DNA-Reparaturenzyme Ku70, Ku80, Ku86, NDHII, BLM, RECQL, RECQL4
und RECQLS kodieren. Die Bezeichnung "Gen" umfasst
die regulatorischen Regionen, insbesondere die Promotorregion.
-
Wiederum
erfordert das Verfahren der Erfindung kein Durchmustern auf das
Vorliegen einer bestimmten Mutation oder genetischen Variante, obwohl
das Durchmustern auf das Vorliegen bestimmter Mutanten/Varianten,
die mit Alzheimer-Krankheit in Zusammenhang stehen, beabsichtigt
ist. Das Verfahren kann das Durchmustern des Gens, welches für ein DNA-Reparaturenzym
kodiert, oder einer Sub-Region eines solchen Gens, auf das Vorliegen
einer beliebigen Mutation oder genetischen Variante einschließlich bisher
unbekannter Mutationen/Varianten mit sich bringen.
-
Das
Vorliegen einer oder mehrerer Mutationen oder genetischer Varianten
in einem Gen, welches für ein
DNA-Reparaturenzym kodiert, deutet auf Alzheimer-Krankheit hin,
da die DNA-Reparaturenzyme über Wege
wirken, die mit Zellzyklusregulation in Beziehung stehen. Das Vorliegen
von Mutationen oder Allelvarianten in Genen, die für DNA-Reparaturenzyme
kodieren, deutet daher indirekt auf einen regulatorischen Defekt
des Zellzyklus hin.
-
Es
wird beobachtet, dass die Menge somatischer Mutationen im Gehirn
von AD-Patienten signifikant mit der Fehlregulation des Zellzyklus
und Schwere der AD-Pathologie assoziiert ist (siehe begleitende
Beispiele). Daher wird vorgeschlagen, dass DNA-Reparaturmangel zur
Fehlregulation des G1/S-Übergangspunktes führt, was
schließlich
zur Entwicklung von Alzheimer-Krankheit
führt.
-
Durchmusterungen
auf Grundlage von Nachweis des Vorliegens von Mutationen oder Allelvarianten in
Genen, die für
DNA-Reparaturenzyme kodieren, können
diagnostisch verwendet werden, insbesondere zur Identifizierung
von Individuen mit präklinischer
Alzheimer-Krankheit. Ähnliche
Durchmusterungen können auch
aufgrund des Vorliegens von Mutation(en)/Variante(n) in einem Gen
oder Genen, die für
DNA-Reparaturenzyme kodieren, zur Idenzifizierung von Individuen,
die eine Prädisposition
zur Entwicklung von Alzheimer-Krankheit aufweisen, und auch zur
Bestimmung einer beliebigen genetischen Grundlage für Alzheimer-Krankheit
in einem Patienten, der zuvor mit Alzheimer-Krankheit diagnostiziert
wurde, verwendet werden.
-
Der
eigentliche Vorgang des Durchmusterns auf das Vorliegen von Mutationen/Allelvarianten
kann unter Verwendung beliebiger im Fachbereich bekannter Methoden,
wie oben erörtert,
ausgeführt
werden.
-
In
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur
Identifizierung von Verbindungen mit potentieller pharmakologischer
Aktivität
zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit bereit, wobei das Verfahren
die Schritte umfasst:
Analysieren der Regulation des G1/S-Übergangs
in nicht-neuronalen Zellen, die einen regulatorischen Defekt des
Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
aufweisen, in Anwesenheit und Abwesenheit einer Testverbindung,
wobei eine Testverbindung, welche zur Berichtigung des regulatorischen
Defekts beim G1/S-Übergang in
den Zellen führt,
als Testverbindung mit potentieller pharmakologischer Aktivität zur Behandlung
von Alzheimer-Krankheit identifiziert wird.
-
Das
Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung von im Wesentlichen
beliebigen nicht-neuronalen Zellen durchgeführt werden, welche einen zu
demjenigen in den Neuronen bei Alzheimer-Krankheit beobachteten
analogen regulatorischen Defekt des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
aufweisen. Geeignete Zellen können
kultivierte Lymphozyten umfassen, die von einem Individuum oder
mehreren Individuen mit Alzheimer-Krankheit abstammen.
-
"Analyse" der Regulation des
G1/S-Übergangs
kann unter Verwendung beliebiger in Verbindung mit dem ersten Aspekt
der Erfindung beschriebener Verfahren durchgeführt werden, die für das Durchmustern
auf das Vorliegen eines regulatorischen Defektes des Zellzyklus
bei G1/S geeignet sind.
-
Vorteilhafterweise
kann das zur Analyse der Regulation des G1/S- Phasenübergangs verwendete Verfahren
in Mikrotiterplatten mit vielen Vertiefungen durchgeführt werden,
wodurch das Durchmustern von Verbindungen im Mittel- bis Hochdurchsatzformat
ausgeführt
werden kann. Das am stärksten
bevorzugte, zur Verwendung im Mittel- bis Hochdurchsatzformat geeignete
Verfahren ist der Zellproliferationsassay.
-
Zellen,
die einen regulatorischen Defekt beim G1/S-Übergang aufweisen, werden mit
Testverbindungen behandelt und die Wirkung der Testverbindung auf
die Regulation des G1/S-Übergangs
wird unter Bezugnahme auf geeignete Kontrollen bestimmt, z.B. Zellen,
die mit keiner Testverbindung behandelt wurden. In einer üblichen
Durchmusterung wird die Testverbindung in einem Bereich unterschiedlicher
Konzentrationen untersucht.
-
Es
besteht keine Einschränkung
im Hinblick auf die Arten der in den Durchmusterungsverfahren der Erfindung
zu untersuchenden Kandidatenverbindungen. Testverbindungen können Verbindungen
mit einer bekannten pharmakologischen oder biochemischen Aktivität, Verbindungen
ohne eine solche identifizierte Aktivität und vollständig neue
Moleküle
oder Bibliotheken von Molekülen
umfassen, wie z.B. solche, die durch kombinatorische Chemie erzeugt
werden können.
Verbindungen, welche DNA, RNA, PNA, Polypeptide oder Proteine sind,
sind nicht ausgenommen.
-
Die
grundlegende Durchmusterungsmethodik von Verbindungen kann auch
zur Verwendung bei der Bestimmung der Wirksamkeit einer Behandlungsform
von Alzheimer-Krankheit angepasst werden, z.B. zur Untersuchung
der Wirkung eines bestimmten pharmakologischen Mittels auf die Regulation
des Zellzyklus.
-
In
einer geeigneten Variation kann das Verfahren der Erfindung spezifisch
zur Bestimmung verwendet werden, ob ein pharmakologisches Mittel
voraussichtlich zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit in einem bestimmten
menschlichen Individuum von Nutzen ist. In diesem Fall wird der
Assay unter Verwendung von nicht-neuronalen Zellen des Individuums
durchgeführt,
die einen regulatorischen Defekt des Zellzyklus beim G1/S-Phasenübergang
aufweisen, am stärksten
bevorzugt von kultivierten Lymphozyten. Die Zellen werden auf das
Vorliegen des Defektes bei der Regulation beim G1/S-Phasenübergang,
in Anwesenheit und Abwesenheit des pharmakologischen Mittels untersucht.
Pharmakologische Mittel, welche zur "Berichtigung" des regulatorischen Defekts beim G1/S-Übergang
führen,
werden als pharmakologische Mittel identifiziert, welche voraussichtlich
zur Behandlung von Alzheimer-Krankheit in dem Individuum von Nutzen
sind. "Berichtigung" bedeutet ein wesentliches
Ausmaß an
Wiederherstellung der normalen Zellzyklusregulation. Dies kann unter Bezugnahme
auf Kontrollzellen, z.B. Zellen derselben Art, die einer Kontrolle
entsprechenden Alters entnommen wurden, die keine Alzheimer-Krankheit
oder kein beliebiges Anzeichen eines regulatorischen Defektes beim
G1/S-Übergang
oder eines genetischen Defektes/einer Allelvariation aufweist, aufgrund
welcher eine Prädisposition
für Alzheimer-Krankheit
zu erwarten wäre,
bestimmt werden.
-
Die
Erfindung wird weiterhin unter Bezugnahme auf die folgenden experimentellen
Beispiele zusammen mit den begleitenden Figuren verständlich,
wobei:
-
1 Flusszytometer-Ausdrucke
von kultivierten Lymphozyten einer Kontrolle, eines präAD-Individuums
und eines AD-Patienten veranschaulicht. Die Ergebnisse sind sowohl
für mit
Rapamycin-behandelte Zellen als auch für unbehandelte Kontrollzellen
gezeigt. G1 zeigt an, dass die Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus vorliegen.
-
2 relative
(linkes Schaubild) und im Hinblick auf das Alter berichtigte relative
(rechtes Schaubild) Verlängerung
der G1-Phase des Zellzyklus unter dem Einfluss von Rapamycin in
kultivierten Lymphozyten aus präAD-,
AD-, ADM,- possAD-, DNOS- und Kontrollen veranschaulicht.
-
3 die
Wirkungen einer 24-stündigen
Rapamycin-Behandlung auf das Überleben
von Zellen in kultivierten Lymphozyten aus präAD-, AD-, possADM-, DNOS- und
Kontrollen veranschaulicht. Absolute Werfe sind in dem linken Schaubild,
Alters-korrelierte Werte in dem rechten Schaubild gezeigt.
-
4 die
Wirkungen von Doxorubicin-Behandlung auf das Überleben von Zellen in kultivierten
Lymphozyten aus präAD-,
AD-, possADM-, DNOS- und Kontrollen veranschaulicht. Absolute Werte
sind in dem linken Schaubild, Alters-korrelierte Werte in dem rechten
Schaubild gezeigt.
-
5 die
Wirkungen von H2O2-Behandlung
auf das Überleben
von Zellen in kultivierten Lymphozyten aus präAD,- AD-, possADM-, DNOS- und
Kontrollen veranschaulicht. Absolute Werte sind in dem linken Schaubild,
Alters-korrelierte Werte in dem rechten Schaubild gezeigt.
-
6 das
Ergebnis des Durchmusterns auf Polymorphismen in Exon 2 von p21
und Exon 2 von p57 mittels PCR-SSCP veranschaulicht.
-
7 das
Verhältnis
zwischen p21-Varianten A und B und Cyclin B-Expression im Gehirn veranschaulicht.
Ein weißer
Balken zeigt den Prozentsatz von Patienten an, wobei Cyclin B nicht
in Neuronen exprimiert wurde. Schwarze Balken zeigen den Prozentsatz
von Patienten an, wobei Cyclin B in Neuronenzellkernen exprimiert
wurde.
-
8 das
Verhältnis
zwischen p57 Exon 2A-Varianten A und B und Cyclin-Expression im
Gehirn von Patienten mit normalem p21 veranschaulicht (Variante
B). Ein weißer
Balken zeigt den Prozentsatz von Patienten an, wobei Cyclin B nicht
in Neuronen exprimiert wurde. Schwarze Balken zeigen den Prozentsatz
von Patienten an, wobei Cyclin B in Neuronenzellkernen exprimiert
wurde.
-
9 das
Vorherrschen somatischer Mutationen im Verhältnis zum Verlauf von AD und
Zellzyklusproteinen im Gehirn veranschaulicht. X-Achse: Braak-Stadien
der Schwere von AD; Y-Achse: Prozentsatz Primer, die unterschiedliche
RAPD-Muster aus Blut im Vergleich zu Gehirn erzeugten.
-
Legende zu den Figuren:
-
- Kontrollen: Gesunde Individuen mit normalen kognitiven und
neuropsychologischen Untersuchungsergebnissen;
- PräAD:
Gesunde Individuen mit neuropsychologischen Untersuchungsergebnissen,
die auf beginnende AD hindeuten;
- PossAD: Eventuelle Alzheimer-Krankheit, gemäß NINCDS-Kriterien diagnostiziert;
- AD: Wahrscheinliche Alzheimer-Krankheit, gemäß NINCDS-Kriterien diagnostiziert;
- ADM: Eventuelle Alzheimer-Krankheit (NINCDS) und Anzeichen für andere
Demenzarten;
- DNOS: Patienten mit Demenz, die nicht die Anforderungen der
NINCDS-Kriterien
für wahrscheinliche
Alzheimer-Krankheit erfüllen.
-
Beispiel 1-Nachweis für das Auftreten
eines regulatorischen Defekts des Zellzyklus in Lymphozyten von
Patienten mit Alzheimer-Krankheit
-
Materialien
und Methoden
-
Die
Studie umfasste 102 Individuen, die am Oxford Project to Investigate
Memory and Ageing (OPTIMA) vollstandig teilnahmen. Die jährliche
OPTIMA-Routineuntersuchung
umfasst eine physische Untersuchung sowie kognitive und neuropsychologische
Versuche. Arzneimittel-Einnahme und jegliche zwischenzeitliche Infektionen
werden aufgezeichnet. Blut wurde in Lithium-Heparin- oder EDTA-Vacutainer-Gefäßen gesammelt.
Lymphozyten wurden gemäß einem
Standardprotokoll unter Verwendung von Ficall (Sigma) isoliert. Zur
Standardisierung der Kulturverfahren für alle Patienten wurden die
getrennten Lymphozyten gefroren und zur weiteren Analyse gelagert.
-
Wenn
Lymphozyten zur Kultur benötigt
wurden, wurden sie in einem Wasserbad von 37 °C aufgetaut und zweimal in RPMI
gewaschen (ein beliebiges Medium oder Puffer, welches (welcher)
das Überleben
von Lymphozyten unterstützt,
kann mit äquivalenter
Wirkung zum Waschen der Zellen verwendet werden). Überleben
der Zelle (Ausschluss mit Trypan Blue) betrug üblicherweise etwa 80–90 %.
-
Eine
erste Untersuchungsreihe wurde an 49 Individuen ausgeführt (Tabelle
1a), während
eine zweite Untersuchungsreihe an 55 Individuen ausgeführt wurde
(Tabelle 1b). In der ersten Untersuchungsreihe (49 Individuen) wurden
zwei parallele Lymphozytenkulturen aus jedem Individuum in RPMI-Medium,
welches mit 10 % FCS mit einer Konzentration von 1 × 106 Zellen pro 1 ml Kulturmedium ergänzt wurde,
angesetzt. Phytohämaglutinin
(PHA) wurde zur Aktivierung der Lymphozyten zu den Kulturen mit
einer Endkonzentration von 22 μg/ml
hinzugefügt.
Die Kulturen wurden für
48 Stunden bei 37 °C
in einer befeuchteten Atmosphäre,
die 5 % CO2 enthielt, inkubiert. Nach 48
Stunden Inkubation wurde eine Kultur mit 100 ng/ml Rapamycin behandelt, während die
andere unbehandelte Kultur als Kontrolle verwendet wurde. Nach einer
Inkubation von weiteren 23 Stunden wurde BrdU mit einer Konzentration
von 10 μg/ml
zu allen Kulturen hinzugefügt.
Nach einer weiteren Stunde wurden die Kulturen "gesammelt" und in 70 % eiskaltem Ethanol fixiert.
BrdU-Einbau wurde unter Verwendung von Immunhistochemie und anschließender FACS-Analyse
bestimmt. Der Anteil der Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus
wurde bestimmt und Datenübertragung
zum Erhalt der relativen Verlängerung
der G1-Phase wurde
durchgeführt
(1).
-
Die
Berechnungen (relative Verlängerung
der G1-Phase des Zellzyklus in behandelten Kulturen im Verhältnis zu
Kontrollkulturen) beruhten auf den Vermutungen, dass sich Zellen
in der exponentiellen Phase der Proliferation befanden und dass
der Anteil des Wachstums in den Kulturen (Verhältnis von sich teilenden Zellen
gegenüber
ruhenden Zellen) 1,0 betrug (5). Es wurde auch angenommen, dass
Rapamycin lediglich die Länge
der G1-Phase veränderte
(19). Auf Grundlage dieser Annahmen wurde die relative Verlängerung
der G1-Phase unter Verwendung der Formel: RL = 100f – 100 (in
Prozent ausgedrückt)
berechnet. Das Verhältnis der
G1-Zeit in behandelten Zellen gegenüber Kontrollkulturen betrug: f = TG1tr/TG1c = [1n2 – 1n(2 – G1tr)][1n
(2 – G1c)]/[1n(2 – G1tr[1n2 – 1n(2 – G1c)] (5)
-
In
der zweiten Untersuchungsreihe (53 Individuen) wurden nach einer
anfänglichen
Inkubation von 48 Stunden (wie oben) vier getrennte Kulturen angesetzt.
Kontrollkulturen wurden ohne beliebige Behandlung belassen, eine
Reihe von Kulturen wurde mit 100 ng/ml Rapamycin behandelt, die
dritte Reihe wurde mit 1 μM Doxorubicin
behandelt, während
die vierte Reihe mit 120 μM
H2O2 behandelt wurde.
Doxorubicin-induzierte DNA-Schädigung
führte
eher zum Stillstand bei G2/M als bei G1/S. H2O2-Behandlung erzeugt oxidativen Stress, was
zu einem reversiblen und vorübergehenden
Stillstand des Zellzyklus bei G1/S führt.
-
Nach
20 Stunden Inkubation wurde ein 4 Stunden langer MTT-Überlebensassay (Chemicon International
Ltd) angesetzt. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerätes (570
Filter 630 Referenzfilter) abgelesen. Das Verhältnis zwischen der Zellanzahl
in behandelten Kulturen gegenüber
Kontrollen wurde in Prozent ausgedrückt.
-
Alle
Untersuchungen wurden im Hinblick auf die klinische Diagnose der Patienten
blind ausgeführt.
-
Die
Ergebnisse wurden in Beziehung zur klinischen Diagnose, die von
den am OPTIMA-Projekt beteiligten Klinikern bereitgestellt wurde,
analysiert.
-
Statistische
Analyse wurde unter Verwendung des Statgraphics-Softwarepakets ausgeführt. ANOVA-Tests
wurden zur Untersuchung der Wirkung der klinischen Diagnose auf
die Zellkulturparameter durchgeführt.
Eine zweite Reihe von Analysen über
die Wirkung des Alters auf die Ergebnisse wurde auch an Kontrollen
ausgeführt.
Korrektur des Alters ermöglicht
jede beliebige altersbezogene Variation bei dem bestimmten zu untersuchenden
Parameter. Die Wirkung des Alters auf einen bestimmten Parameter
wird durch Beobachten der Wirkungen des Alters auf den Parameter
bei gesunden Individuen bestimmt.
-
Ergebnisse
-
Die
klinischen Diagnosen der in die zwei Untersuchungsreihen einbezogenen
Patienten sind in den Tabellen 1a und 1b zusammengefasst. Die relative
Verlängerung
der G1-Phase unter dem Einfluss des spezifischen G1-Inhibitors Rapamycin
war signifikant von der klinischen Diagnose unserer Patienten abhängig (ANOVA
p = 0,04, Kruskall-Wallis-Test p = 0,017) (2). Die
höchsten
Werte wurden bei Individuen nachgewiesen, die als Kontrollen, die
mit Demenz-Syndromen mit Ausnahme von AD und die als Patienten mit
eventueller Alzheimer-Krankheit diagnostiziert wurden, was auf eine
wirksamere G1-Hemmung durch Rapamycin hindeutet. Es wurde herausgefunden,
dass Patienten, die als unter AD leidend (wahrscheinliche AD gemäß NINCDS)
und als solche, die mit AD und gleichzeitig bestehender anderer
Pathologie (ADM) diagnostiziert wurden, einen wesentlich weniger
wirksamen G1-Block aufweisen als Kontrollen und Patienten, die als
unter DNOS oder possAD gemäß NINCDS-Kriterien
leidend diagnostiziert wurden (2). Die
Unterschiede zwischen klinischen Diagnosekategorien sind ähnlich,
sogar wenn die relative G1-Verzögerung
im Hinblick auf das Alter berichtigt wurde (2).
-
Bei
der zweiten Untersuchungsreihe zeigten die Zellanzahlen nach Rapamycin-Behandlung das erwartete
Muster von höheren
Zellanzahlen in AD- und possAD-Kulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen (
3).
Die Empfindlichkeit des MTT-Assaysystems ist jedoch relativ gering.
Doxorubicin-Behandlung führte zu
keinen wesentlichen Unterschieden zwischen den Patientengruppen
(
3). Im Gegensatz zur Doxorubicin-Behandlung war
die Verminderung der Zellanzahl durch H
2O
2-Behandlung von der klinischen Diagnose
abhängig.
Die Patienten, die unter AD, präAD
und possAD litten, wiesen als Folge der H
2O
2-Behandlung
wesentlich höhere
Zellanzahlen auf als Kontrollen. DNOS-Patienten zeigten breite Variationen
und unterschieden sich von keiner der anderen Patientengruppen (
4). Tabelle
1a-Patienten, die in diese Studie einbezogen wurden
-
-
Legende:
-
- Kontrollen: Gesunde Individuen mit normalen kognitiven neuropsychologischen
Untersuchungsergebnissen;
- PräAD:
Gesunde Individuen mit neuropsychologischen Untersuchungsergebnissen,
die auf beginnende AD hindeuten;
- PossAD: Eventuelle Alzheimer-Krankheit, gemäß NINCDS-Kriterien diagnostiziert;
- AD: wahrscheinliche Alzheimer-Krankheit, gemäß NINCDS-Kriterien diagnostiziert;
- ADM: Eventuelle Alzheimer-Krankheit (NINCDS) und Anzeichen für eine andere
Art von Demenz;
- DNOS: Patienten mit Demenz, die nicht die Anforderungen der
NINCDS-Kriterien
für wahrscheinliche
Alzheimer-Krankheit erfüllen.
-
Diskussion
-
In
dieser Studie wurden die Wirkungen eines spezifischen G1-Inhibitors
(Rapamycin) (16, 19) auf die Länge
der G1-Phase in Lymphozyten unter Verwendung des Assays mittels
Einbau von BrdU und unter Verwendung der FACS-Analyse analysiert.
Die Verminderung der Zellanzahl in den Kulturen in Anschluss an
Rapamycin-Behandlung wurde auch bestimmt. In einem zweiten Ansatz
wurde G1-Hemmung durch oxidativen Stress ausgelöst und die Verminderung der
Zellanzahl in dem Kultursystem gemessen.
-
Die
Ergebnisse der ersten Untersuchungsreihe deuten darauf hin, dass
G1-Inhibitor-induzierter
Stillstand des Zellzyklus, wie durch die Verlängerung der G1-Phase des Zellzyklus
angezeigt, wesentlich weniger wirksam bei Patienten ist, die unter
Alzheimer-Krankheit leiden als bei Kontrollen. Es ist auch offensichtlich, dass
diese Veränderungen
früh auftreten,
in dem Stadium, wenn die Patienten noch nicht klinisch unter Demenz
leiden, jedoch Anzeichen für
spezifischen schnellen Gedächtnisverlust
zeigen, was als das erste deutliche Anzeichen für Demenz bekannt ist.
-
Der
Rapamycin-induzierte G1-Block hängt
von der Expression und Aktivität
des p27kip1 CDKI ab, was die Aktivität des CyclinE/cdk2-Komplexes
hemmt (16, 19). Daher hängt
die relative Verlängerung
der G1-Phase unter dem Einfluss von Rapamycin von der Expression/Aktivität dieses
CDKI ab (19). Die Tatsache, dass diese relative Verlängerung
von G1 bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit wesentlich niedriger
als bei gesunden älteren
Individuen ist, unterstützt
unsere Hypothese, dass ein Defekt des G1/S-Kontrollpunktes in Neuronen
von ähnlicher
Schädigung
der Kontrolle des Zellzyklus in anderen Zellarten bei diesen Patienten
begleitet ist. Es ist auch offensichtlich, dass der Defekt der Kontrolle
des Zellzyklus weit vor dem Erscheinen der Anzeichen von vollständig entwickelter
Demenz in peripheren Zellen nachweisbar ist. Dies ermöglicht es,
dass ein Assay auf Grundlage von Mitose-auslösender Stimulation von peripheren
Lymphozyten und anschließender Versuch
des G1/S-Übergangsblocks
zum frühen
Nachweis von Patienten, die für
eine spätere
Entwicklung einer AD-artigen Hirnpathologie gefährdet sind, verwendet werden
konnten.
-
Die
Unterschiede der Zellanzahlen, die durch H2O2 induziert wurden, waren in unseren Patientengruppen
signifikant unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass Lymphozyten
aus Kontrollen eine ausgeprägtere Reaktion
auf oxidativen Stress aufweisen. Es ist gezeigt worden, dass Behandlung
mit 120 mM H2O2 einen reversiblen
und vorübergehenden
Stillstand des Zellzyklus beim G1/S-Übergangspunkt
(6) induziert, um Zeit für
Reparatur von DNA-Schädigung
zu ermöglichen.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieser Mechanismus bei
Patienten mit Alzheimer-Krankheit nicht vollständig wirksam ist. Diese unzureichende
Reaktion auf oxidativen Stress liegt auch bei Individuen vor, die
unter präklinischer
AD leiden. Die veränderte
Reaktion auf oxidativen Stress kann auch eine Widerspiegelung von
beträchtlicher
vorher vorhandener DNA-Schädigung bei
den AD-Patienten sein (11). Diese Möglichkeit ist jedoch durch
die Tatsache ausgeschlossen, dass Doxorubicin-induzierte DNA-Schädigung,
die eher einen G2/M-Stillstand als einen G1-Stillstand induziert,
in unseren Patientengruppen nicht unterschiedlich ist. Die Ergebnisse
dieser Studie werden daher dahingehend interpretiert, dass sie auf
einen spezifischen Defekt bei der Regulation des G1/S-Übergangspunktes
hindeuten.
-
Zusammenfassend
zeigen die Ergebnisse dieser Studie an, dass die Reaktion von aktivierten
Lymphozyten auf G1-Hemmung bei Patienten, die unter Alzheimer-Krankheit
leiden, signifikant verändert
ist. Darüber
hinaus treten dieses Veränderungen
frühzeitig
vor dem Entstehen eines vollständig
entwickelten Demenzsyndroms auf, wodurch Individuen identifiziert
werden können,
die wahrscheinlich später
Alzheimer-Krankheit entwickeln. Diese Ergebnisse deuten darauf hin,
dass ein Diagnosetest auf Grundlage des Nachweises der Unversehrtheit
des Kontrollpunktes des G1/S-Übergangs
die Identifizierung von Individuen ermöglichen kann, die gefährdet sind,
später
AD zu entwickeln. Der Vorteil dieses Diagnoseverfahrens liegt in dessen
Fähigkeit
zur Identifizierung dieser Gruppe, wodurch die Möglichkeit von präventiver
Intervention für diese
Menschen eröffnet
wird.
-
Die
unter Beispiel 1 zur Trennung und Kultur von Lymphozyten, Induktion
von Zeltteilung, Induktion von Stillstand des Zellzyklus entweder
durch Behandlung mit einem Zellteilungsinhibitor oder H2O2-induziertem Sauerstoffmangel, BrdU- Einbau/FACS-Analyse
und MTT-Überlebensassay
unter Beispiel 1 beschriebenen Protokolle oder geringere Abwandlungen
davon können
alle zur diagnostischen Untersuchung auf das Vorliegen eines regulatorischen
Defekts beim G1/S-Übergang
verwendet werden.
-
Beispiel 2-Identifizieruna
von Einzelnukleotidpolymorghismen in p21cip und
-
Verfahren
-
Das
Exon 2 von p21cip wurde aus genomischer DNA (extrahiert aus Gehirn
oder Blut) unter Verwendung von
-Primern
amplifiziert. PCR-Amplifizierung wurde in einem Endvolumen von 50 μl unter Verwendung
von 1,25 Einheiten von Taq DNA-Polymerase, 1,5 mM MgCl
2,
5 % Gelatine, 200 μM
von jedem dNTP in PCR-Puffer (75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM (NH
4)
2SO
4 und
0,01 % Tween) ausgeführt.
An den Heißstart
(95 °C für 5') schlossen sich
30 Zyklen von 95 °C
1 min, 65 °C
1 min, 72 °C
1 min an.
-
Der
erste Abschnitt von Exon 2 von p57 (Exon 2Ap57) wurde aus genomischer
DNA (extrahiert aus Gehirn oder Blut) unter Verwendung von
-Primern
amplifiziert. PCR-Amplifizierung wurde in einem Endvolumen von 50 μl unter Verwendung
von 1,25 Einheiten von Taq DNA-Polymerase, 1,5 mM MgCl
2,
10 % DMSO, 200 μM
von jedem dNTP in PCR-Puffer (75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM (NH
4)
2SO
4 und
0,01 % Tween) ausgeführt.
An den Heißstart
(95 °C für 5 min) schlossen
sich 30 Zyklen von 95 °C
30 sek., 52 °C
30 sek., 72 °C
30 sek. an.
-
Der
zweite Abschnitt von Exon 2 von p57 (Exon 2Bp57) wurde aus genomischer
DNA (extrahiert aus Gehirn oder Blut) unter Verwendung von
-Primern
amplifiziert. PCR-Amplifizierung wurde in einem Endvolumen von 50 μl unter Verwendung
von 1,25 Einheiten von Taq DNA-Polymerase, 1,5 mM MgCl
2,
200 μM von
jedem dNTP in PCR-PufFer (75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM (NH
4)
2SO
4 und
0,01 % Tween) ausgeführt.
An den Heißstart
(95 °C für 5 min)
schlossen sich 30 Zyklen von 95 °C
30 sek., 53 °C
30 sek., 72 °C
30 sek. an.
-
Zum
anfänglichen
Durchmustern wurde das 4 μl
PCR-Produkt zu 16 μl
Denaturierungslösung
(95 % entionisiertes Formamid, 10 mM NaOH, 0,01 % Bromphenolblau
und 0,01 % Xylolcyanol FF) hinzugefügt, was 20 μl zur Gelbeladung entspricht.
Das Gemisch wurde für
5 min bei 95 °C
inkubiert und auf ein Metaphor-Agarosegel (2 % für Exon2 p21 und 3 % für Exon 2A
p57 und Exon2B p57), welches 1:10000 Gelstar enthielt, aufgetragen.
Das Elektrophoresegerät
wurde in einem üblichen
Kühlschrank
bei einer konstanten Temperatur von 4 °C gehalten. Elektrophorese wurde
unter Verwendung von 1 × TBE
(45 mM Tris-Borat/1 mM EDTA) bei 5 V/cm für 2 Stunden ausgeführt. SSCP-Muster,
die auf dem Gel erschienen, wurden durch UV-Licht nachgewiesen.
-
Ergebnisse
-
Polymorphismen
wurden auf dem Exon 2 des p21 cip- und Exon 2 des p57 kip2-Gens
nachgewiesen (6). Der auf dem Exon 2 von p21cip
(Variante A) nachgewiesene Polymorphismus war signifikant mit der Fehlregulation
des Zellzyklus in Neuronen assoziiert (7), d.h.
der Verlauf des Zellzyklus über
den G1/S-Übergang
in die G2-Phase, wie durch Cyclin B-Positivität angezeigt. Bei Patienten
mit normalem p21cip (Variante B) ist der Polymorphismus auf p57
Exon 2A mit Cyclin B-Positivität
assoziiert (8), was auf den Verlauf des
Zellzyklus über
den G1/S-Übergang
in die G2-Phase hindeutet.
-
Beispiel 3-Durchmustern
von RAPD auf somatische Mutationen
-
Verfahren
-
Somatische
Mutationen in Neuronen wurden unter Verwendung von genetischen Fingerprint-Verfahren
durchmustert. DNA wurde aus dem Gehirn und dem Blut von allen Patienten
erhalten. PCR-Amplifizierung wurde an beiden Proben von jedem Patienten
ausgeführt.
10 kurze Primer wurden zur zufälligen
Amplifizierung polymorpher DNA-Sequenzen verwendet (in Tabelle 2a
aufgelistete Primer). PCR-Amplifizierung wurde in einem Endvolumen
von 50 μl
unter Verwendung von 1,25 Einheiten von Taq DNA-Polymerase, 1,5
mM MgCl2, 200 μM von jedem dNTP in PCR-Puffer
(75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM (NH4)2SO4 und 0,01 % Tween)
ausgeführt.
An den Heißstart
(95 °C für 5 min)
schlossen sich 40 Zyklen von 94 °C
30 sek., AnT 1 min, 72 °C
2 min an. Die Annealing-Temperatur (AnT) variierte in Abhängigkeit
von dem Primer zwischen 33 °C
und 39 °C. Das
PCR-Produkt wurde auf ein 2 %-Agarosegel aufgetragen, welches 1:10.000
Gelstar enthielt. Elektrophorese wurde unter Verwendung von 1 × TBE (45
mM Tris-Borat/1 mM EDTA) bei 6,5 V/cm für 2 Stunden ausgeführt. Die
RAPD-Sequenzmuster wurden durch UV-Licht nachgewiesen. Die Unterschiede
zwischen der RAPD-Sequenz aus Blut- und Gehirn-DNA wurden für jeden
Patienten verglichen und als %-Primer exprimiert, die zu unterschiedlichen
RAPD-Profilen führten,
ausgedrückt
(RAPD-Profile sind nicht gezeigt).
-
Ergebnisse
-
Es
wurde beobachtet, dass die Menge an somatischen Mutationen im Gehirn
von AD-Patienten signifikant mit der Fehlregulation des Zellzyklus
und der Schwere der AD-artigen Pathologie assoziiert ist (9). Daher
nimmt man an, dass die unzureichende DNA-Reperatur zur Fehlregulation
des G1/S-Übergangspunktes
führen
kann, was schließlich
zur Entwicklung von Alzheimer-Krankheit führt.
-
Die
Genotypisierungs-Befunde stehen in Übereinstimmung mit vorherigen
Befunden in Lymphozyten von AD-Patienten, die darauf hindeuten,
dass eine nachweisbare Fehlfunktion bei der Kontrolle über die G1/S-Regulation
vorliegt, die entweder durch CDKI-induzierte Inhibitoren oder durch
oxidative DNA-Schädigung ausgelöst wird.
-
Tabelle
2-zur RAPD-Analyse verwendete Primer
OMIM-Accessionnummern:
| Gen/Protein | Accessionnummer |
| COKN3 | 123832 |
| p15ink4B | 600431 |
| p16ink4A | 600160 |
| p19ink4D | 600927 |
| p27kip1 | 600778 |
| p21cip1 | 116899 |
| p57kip2 | 600856 |
| TP53 | 191170 |
| Gadd45A | 126335 |
| Gadd45B | 604948 |
| Gadd45G | 604949 |
| Gadd153 | 126337 |
| PCNA | 176740 |
| Ku70 | 152690 |
| KU80 | 194364 |
| Ku86 | 604511 |
| NDHII | 603115 |
| BLM | 604610 |
| RECQL | 600537 |
| RECQL4 | 603780 |
| RECQL5 | 603781 |
-
Zitierte Referenzen
-
- 1. Araga S, Kagimoto H, Funamoto K und Takahashi K (1990)
Jpn J Med 29: 572-5
- 2. Arendt T, Holzer M und Gartner U (1998) J Neural Transm 105:
949-60
- 3. Arendt T, Rodel L, Gartner U und Holzer M (1996) Neuroreport
7: 3047-9
- 4. Burke WJ, McLaughlin JR, Chung HD, Gillespie KN, Grossberg
GT, Luque FA und Zimmerman J (1994) Alzheimer Dis Assoc Disord 8:
22-8
- 5. Darzynkiewicz Z (1993) In Fantes P und Brooks R (Hrsg) The
cell cycle. Oxford University Press, Oxford, Seiten 43–68
- 6. Davies KJ (1999) IUBMB Life 48: 41-7
- 7. Drabkin HA und Erickson P (1995) Prog Clin Biol Res 393:
169-76
- 8. Eckert A, Hartmann H, Forstl H und Muller WE (1994) Life
Sci 55: 2019-29
- 9. Fischman HK, Reisberg B, Albu P, Ferris SH und Rainer JD
(1984) Biol Psychiatry 19: 319-27
- 10. Fong CT und Brodeur GM (1987) Cancer Genet Cytgenet 28:
55-76
- 11. Mecocci P, Polidori MC, Ingegni T, Cherubini A, Chionne
F, Cecchetti R und Senin U (1998) Neurology 51: 1014-1017
- 12. Melaragno MI, Smith MdA, Kormann Bortolotto MH und Toniolo
Neto JT (1991) Gerontology 37: 293-8
- 13. Nagy Z, Esiri MM, Hindley NJ, Joachim C, Morris JH, King
EM-F, McDonald B, Litchfield S, Barnetson L, Jobst KA und Smith
AD (1998) Dementia 9: 219-226
- 14. Nagy Z, Esiri MM und Smith AD (1998) Neuroscience 84: 731-739
- 15. Payao SL, Smith MD und Bertolucci PH (1998), Gerontology
44: 267-71
- 16. Sherr CJ (1994) Stem Cells 12: 47-55; Diskussion 55-7
- 17. Tatebayashi Y, Takeda M, Kashiwagi Y, Okochi M, Kurumadani
T, Sekiyama A, Kanayama G, Hariguchi S und Nishimura T (1995) Dementia
6: 9-16
- 18. Trieb K, Ransmayr G, Sgonc R, Lassmann H und Grubeck Loebenstein
B (1996) Neurobiol Aging 17: 541-7
- 19. Wagner EF, Hleb M, Hanna N und Sharma S (1998) J Immunol
161: 1123-31
