CN103808917B - 一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法 - Google Patents

一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法 Download PDF

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Abstract

一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：包括以下步骤：1）溶液的配制，2）细胞接种，3）电子烟烟液体染毒及BrdU掺入，4）BrdU掺入量的测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察电子烟烟液对肺部不同细胞系的细胞毒性。（3）通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。（4）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。

Description

一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法
技术领域
本发明涉及电子烟烟液体外细胞增殖毒性的测定，具体说是基于BrdU掺入原理分析电子烟烟液染毒后细胞增殖毒性的定量测定方法。
背景技术
随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟是一种外表类似于卷烟的新型烟碱摄入方式。几年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。但是，目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用MTT法对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价。
检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如可通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性（例如MTT法）、检测细胞膜的完整性以及监测细胞增殖等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。
细胞增殖周期包括G1、S、G2、M四个时期，其中S期是DNA合成期。溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）是 DNA 合成前体胸腺嘧啶核苷的类似物（其化学结构特点是胸腺嘧啶的碱基嘧啶环上与5位C原子连接的甲基被溴代替），当细胞处于DNA合成期时，BrdU可通过与胸腺嘧啶竞争，掺入新合成的DNA中。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU抗体的特异性识别进行检测。BrdU对细胞无明显毒性，可应用于细胞DNA合成和细胞增殖的跟踪检测。因此，通过检测细胞样本中的BrdU掺入量可考察化合物对细胞增殖的影响，定量评价不同化合物的细胞增殖毒性。
目前，电子烟烟液染毒对细胞增殖毒性的影响还未见文献报道，亟需建立基于BrdU掺入的电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，考察市售电子烟产品的细胞增殖毒性。
发明内容
本发明的目的是建立的一种基于BrdU掺入的电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，为电子烟产品的毒性评价提供方法学支持。通过检测不同浓度电子烟烟液染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，定量评价电子烟烟液的细胞增殖毒性。本方法具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度电子烟烟液染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，定量评价电子烟烟液的细胞增殖毒性，具体步骤如下：
1）  溶液的制备：
（1）不同浓度电子烟烟液染毒溶液：
利用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液（100mg/ml），其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；
（2）磷酸盐缓冲液PBS：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制（pH=6.7）；
（3）封闭液：有PBS缓冲液配制1% BSA（质量百分比）作为封闭液；
（4）HRP酶标记的BrdU抗体： -20 ℃保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制；
（5）细胞固定液：4% 多聚甲醛或70%乙醇；
（6）2M的盐酸HCl溶液：使用去离子水配制2M的HCl溶液；
（7）细胞膜通透液：曲拉通100（Triton-100），使用PBS溶液稀释配制；
（8）0.1M四硼酸钠（Na2B4O7）：用PBS溶液配制；
（9）HRP酶显色底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液；
（10）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；
2）细胞样本的处理
（1）细胞接种：选用贴壁细胞，向96孔板（除最外周36个孔）中分别接种含有最佳接种密度细胞个数的100ul细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；
（2）电子烟烟液染毒及BrdU掺入：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组和电子烟烟液染毒组，空白对照组中每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组中每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，96 孔板的最外周36 个孔中加入细胞培养基，于37 ℃、5% CO2 条件下培养22 h；每孔加入10ul的BrdU染料，继续孵育；
（3）BrdU掺入量的测定：
a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100ul 的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20-30分钟；
b、吸除溶液后，每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
c、每孔加入100ul 2MHCl，室温下放置15分钟；
d、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
e、每孔加入100ul 0.1M四硼酸钠（Na2B4O7），室温下放置15分钟；
f、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
g、每孔加入100ul的0.1%Triton 100溶液进行细胞膜通透，反应1-2min；
h、为减少抗体的非特异性吸附，每孔加入100ul的1%BSA中封闭1h，
i、每孔加入100ul的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜；
j、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值；
（4）数据处理
吸光值A ：A = A450 nm
A空白对照组=6个平行孔的吸光度平均值
A染毒组=6个平行孔的吸光度平均值
细胞增殖抑制率（%）= 1-A染毒组/ A空白对照组。
本发明中，所适用贴壁细胞为中国仓鼠卵巢细胞CHO、人肺癌细胞A549或人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞。由于不同细胞系的增殖速率不同，对不同种类细胞系的细胞接种密度进行了优化。CHO细胞和A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。在开展细胞毒性评价前，需对所用细胞株的适用性进行评价，向96孔板中分别接种最佳接种密度的100ul细胞悬液，将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。然后按照BrdU掺入量的测定步骤进行实验，最后使用酶标仪检测每孔在450 nm波长处的吸光值，当吸光度值小于等于0.2时，证明细胞对BrdU抗体的非特异性吸附较小，可以进行基于BrdU掺入的细胞增殖毒性评价实验。若吸光度值高于0.2时，证明细胞本身非特异性吸附BrdU抗体，会引起较高的检测背景，不适用于基于BrdU掺入的细胞增殖毒性评价实验。
本发明中，需要使用BrdU抗体对细胞中掺入BrdU进行特异性识别，由于抗体大分子难以穿透细胞膜，因此需要使用细胞膜通透液提高细胞膜通透程度，对细胞膜通透液的浓度进行了优化。采用50mg/ml电子烟烟液对CHO细胞染毒22h，BrdU掺入时间2h，然后在BrdU掺入量测定步骤中选择不同浓度的Triton 100进行细胞膜通透。如图2所知，当通透液浓度低于0.5%时，细胞膜通透程度差，影响抗体大分子进入细胞与目标物结合，检测信号较低。当Triton 100的浓度高于0.5%时，影响了细胞形态，导致检测信号的降低。因此，本发明中选择细胞膜通透液Triton 100的浓度为0.5%。
对BrdU掺入时间进行优化，如图3可知，当BrdU掺入时间为1h时，细胞中BrdU掺入量较少，响应信号较低。当BrdU掺入时间为2h时，不同染毒浓度下细胞中BrdU的掺入量有明显的剂量效应关系。而当BrdU掺入时间为4h以上时，由于细胞增殖时间较长，不同染毒浓度下细胞中BrdU掺入量增加，响应信号均有所提高，但不同染毒浓度间剂量效应关系变差。因此，本专利中选择BrdU掺入时间为2h。
此外，由图3可知，当BrdU掺入时间为2h，电子烟染毒浓度为10mg/ml-100mg/ml时，染毒浓度与BrdU掺入量检测信号之间有很好的剂量效应关系。因此，本专利中电子烟烟液染毒浓度应覆盖10mg/ml-100mg/ml的范围。
本发明根据电子烟烟液的特性，建立了一种基于BrdU掺入的电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，根据细胞DNA合成的BrdU掺入量，准确定量评价电子烟烟液的细胞增殖毒性。为电子烟产品的毒性评价提供方法学支持。本发明具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过细胞适用性验证步骤，本发明可能适用于多种贴壁培养细胞，可用于考察电子烟烟液对肺部不同细胞系的细胞毒性。（3）通过BrdU掺入时间和细胞膜通透液浓度的优化提高检测灵敏度。（4）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
附图说明
图1. 本发明分析方法流程图。
图2. 细胞膜通透液Triton 100的浓度优化。
图3.不同BrdU掺入时间下电子烟烟液细胞毒性的剂量-效应关系曲线。
图4. 电子烟样品2烟液对A549细胞增殖毒性的剂量-效应关系曲线。
具体实施方式
本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
为考察电子烟样品2烟液染毒对A549细胞的细胞增殖毒性，开展以下实验步骤：
一、溶液的制备：
（1）电子烟烟液染毒溶液：
使用精度为万分之一的分析天平对电子烟产品2的烟液进行准确称量，秤取210mg，然后加入2.1ml的细胞培养基溶液，配制最高浓度染毒溶液，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到。
（2）磷酸盐缓冲液PBS：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制（pH=7.4）。
（3）封闭液：有PBS缓冲液配制1% BSA（质量百分比）作为封闭液。
（4）HRP酶标记的BrdU抗体： -20 ℃保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制，可按照抗体说明书的推荐浓度使用。
（5）细胞固定液：4% 多聚甲醛或70%乙醇。
（6）2M的盐酸HCl溶液：使用去离子水配制2M的HCl溶液。
（7）细胞膜通透液：0.5%曲拉通100（Triton-100）。使用PBS溶液稀释配制。
（8）0.1M四硼酸钠（Na2B4O7）：用PBS溶液配制。
（9）HRP酶显色底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液。
（10）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml。
二、细胞样本的处理
首先向细胞培养板中接种A549细胞，接种密度为10000个/孔，设置6平行。将细胞培养板放入细胞培养箱中孵育24小时，不进行电子烟烟液染毒步骤，直接开展BrdU掺入量的测定，检测得到A450nm吸光度值为0.09，证明该细胞系不会对BrdU抗体产生非特异性吸附，适合用于评价电子烟烟液的细胞增殖毒性。
经扩增培养的A549细胞进行消化以后，制备细胞悬液（1×105个/ml）。96孔板的每孔（除最外周36个孔）加入100 μl细胞悬液，接种密度为10000个/孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。细胞培养24 h 后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为空白对照组、8个不同剂量（10，20，30，40，50，60，70，80，100mg/ml）的电子烟烟液染毒组，空白对照组每孔分别加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液。最外周36个孔中，选择6孔加入100 μl细胞培养基作为培养基对照。于37 ℃、5% CO2 条件下培养22h。然后每孔加入10μl的BrdU染液，继续于37 ℃、5% CO2 条件下培养2h后，进行BrdU掺入量的测量。根据450nm处的吸光度值，计算电子烟烟液染毒对A549细胞的增殖抑制率。
图4所示为电子烟烟液染毒浓度与细胞增殖抑制率之间的剂量效应关系。如图4可知，电子烟烟液染毒浓度与A549细胞增殖抑制率有很好的剂量效应关系，可通过公式计算IC50值。

Claims (3)

1.一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：该方法是基于BrdU掺入原理，通过检测不同浓度电子烟烟液染毒下，细胞DNA合成的BrdU掺入量，定量评价电子烟烟液的细胞增殖毒性，具体步骤如下：
1）  溶液的制备：
（1）不同浓度电子烟烟液染毒溶液：
利用分析天平对电子烟烟液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液配制最高浓度染毒溶液100mg/ml，其余染毒溶液通过使用细胞培养基溶液对最高浓度染毒溶液进行稀释得到；
（2）pH为6.7的磷酸盐缓冲液PBS：用磷酸二氢钾和磷酸氢二钠配制；
（3）封闭液：由PBS缓冲液配制质量百分比为1%的 BSA溶液作为封闭液；
（4）HRP酶标记的BrdU抗体： -20 ℃保存，使用封闭液对抗体进行稀释配制；
（5）细胞固定液：4% 多聚甲醛或70%乙醇；
（6）2M的盐酸HCl溶液：使用去离子水配制2M的HCl溶液；
（7）细胞膜通透液：曲拉通100（Triton-100），使用PBS溶液稀释配制；
（8）0.1M四硼酸钠（Na2B4O7）：用PBS溶液配制 ；
（9）HRP酶显色底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液；
（10）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100μg/ml；
2）细胞样本的处理
（1）细胞接种：向96孔板除最外周36个孔外分别接种100ul细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h；所使用细胞系为贴壁细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞CHO、人肺癌细胞A549或人肺正常上皮细胞BEAS-2B细胞，CHO细胞和A549细胞的接种密度为10000个/孔，BEAS-2B细胞的接种密度为20000个/孔；开展细胞毒性评价前，需对所用细胞株的适用性进行评价，细胞非特异性吸附的吸光度值应小于等于0.2；
（2）电子烟烟液染毒及BrdU掺入：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板除最外周36孔外每列6孔为一组分别设置为空白对照组和电子烟烟液染毒组，空白对照组中每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组中每孔加入100μl电子烟烟液染毒溶液，电子烟烟液染毒浓度覆盖10mg/ml-100mg/ml的范围，设置不少于7个非零染毒浓度；96 孔板的最外周36 个孔中加入细胞培养基，于37 ℃、5% CO2 条件下培养22 h ，每孔加入10ul的BrdU染料，继续孵育；
（3）BrdU掺入量的测定：
a、吸除培养板中的溶液，每孔加入100ul 的4%多聚甲醛或70%乙醇，于室温下固定20-30分钟;
b、吸除溶液后，每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
c、每孔加入100ul 2MHCl，室温下放置15分钟；
d、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
e、每孔加入100ul 0.1M四硼酸钠（Na2B4O7），室温下放置15分钟；
f、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
g、每孔加入100ul的0.1%Triton 100溶液进行细胞膜通透，反应1-2min；
h、为减少抗体的非特异性吸附，每孔加入100ul的1%BSA中封闭1h，
i、每孔加入100ul的HRP酶标记的BrdU抗体，4度过夜；
j、每孔使用200ul的PBS溶液洗涤3次，每次不少于10分钟；
k、加入HRP酶常用TMB显色底物进行显色反应，并在450nm处检测相应吸光度值；
（4）数据处理
吸光值A ：A = A450 nm
A空白对照组=6个平行孔的吸光度平均值
A染毒组=6个平行孔的吸光度平均值
细胞增殖抑制率（%）= 1-A染毒组/ A空白对照组。
2.根据权利要求1所述的电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：细胞膜通透液Triton 100的浓度为0.5%。
3.根据权利要求1所述的电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法，其特征在于：其特征在于： BrdU掺入时间为2h。
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LINA S. WONG et al..Firsthand cigarette smoke alters fibroblast migration and survival: implications for impaired healing.《Wound Repair and Regeneration》.2004,第12卷(第4期),471-484. *

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CN103808917A (zh) 2014-05-21

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