CN103808681B - 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法 - Google Patents

用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103808681B
CN103808681B CN201410094933.1A CN201410094933A CN103808681B CN 103808681 B CN103808681 B CN 103808681B CN 201410094933 A CN201410094933 A CN 201410094933A CN 103808681 B CN103808681 B CN 103808681B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tobacco juice
electronic smoke
hole
electronic cigarette
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410094933.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103808681A (zh
Inventor
刘彤
陈欢
韩书磊
吴帅宾
付立伟
张小涛
石龙凯
侯宏卫
胡清源
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Original Assignee
National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center filed Critical National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority to CN201410094933.1A priority Critical patent/CN103808681B/zh
Publication of CN103808681A publication Critical patent/CN103808681A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103808681B publication Critical patent/CN103808681B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：包括以下步骤：1）配制实验试剂，2）细胞接种，3）电子烟烟液体染毒，4）中性红染色，5）结果与分析。本发明针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。通过细胞接种密度的优化步骤，筛查了最佳接种密度下最适用于电子烟烟液毒性评价的细胞系BEAS‑2B细胞。并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。本测定方法还具有快速简便、灵敏性高的优点。

Description

用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法
技术领域
本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于中性红染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。
背景技术
随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。
检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性（例如MTT法）以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。
中性红吸收试验是广泛接受的用来评价药物、化妆品、工业化工原料及环境污染物对不同细胞的毒性的体外细胞毒性测试方法。在众多细胞毒性测试方法中，中性红试验是最为灵敏的评价卷烟烟气冷凝物细胞毒性的方法。然而，该方法是否可用于评价电子烟烟液细胞毒性还未见文献报道。
发明内容
本发明基于中性红细胞毒性试验的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点，通过筛选适用于电子烟烟液细胞毒性评价的细胞系，优化染毒浓度，建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法，该方法具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，包括以下步骤：
1） 溶液的制备：
（1）中性红染液：0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50 μg/ml；
（2）中性红萃取液：冰醋酸∶无水乙醇∶水＝1∶50∶49；
（3）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS）（200 μg/ml，100% 细胞致死率浓度）；
（4）电子烟烟液染毒溶液：由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制。
2） 细胞样本的处理：
（1）细胞接种：本方法适用的细胞种类为人肺正常上皮细胞BEAS-2B细胞。向96孔板的每孔中加入100 μL的BEAS-2B细胞悬液。
（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组。阴性对照组每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h。
（3）中性红染色：电子烟烟液染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μl中性红染液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μlPBS洗2次，加入100ul中性红提取液。室温下快速振荡15~20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值。
（4）结果与分析：计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率。相对吸光值C= A540/ A540 阴性对照；
注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A540 阳性对照应小于等于0.3。
由于电子烟烟液的细胞毒性较低，应选择对其染毒响应更灵敏的细胞系作为测试细胞系，本发明中对CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞进行筛选。图1所示为CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞最佳接种密度条件优化。如图可知，当CHO细胞，A549细胞的接种密度等于或大于20000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为10000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，因此，CHO细胞和A549细胞的最佳接种密度为10000个/孔。对于BEAS-2B细胞，接种密度等于或大于40000个/孔时，细胞生长达到平台期，这表明细胞接种密度过高，已出现抑制作用，细胞无法继续增殖和生长。当细胞接种密度为20000个/孔时，细胞处于指数增长期且响应信号最大，因此，BEAS-2B细胞的最佳接种密度为20000个/孔。
本发明采用最佳接种密度下的三种细胞系对电子烟产品1的烟液细胞毒性进行测定。图2所示为采用CHO细胞，A549细胞，BEAS-2B细胞三种细胞系进行电子烟烟液细胞毒性评价时，电子烟烟液染毒浓度与中性红吸收值的剂量效应关系，根据公式计算得到其半数抑制率IC50值分别为15.2mg/ml,31.4 mg/ml,46.7 mg/ml，由此可知，BEAS-2B细胞对电子烟烟液细胞毒性测定更灵敏，本发明中选择BEAS-2B细胞为电子烟烟液细胞毒性测定所用细胞株。
由图2可知，当选择BEAS-2B细胞为测试细胞株时，当染毒浓度为5mg/ml至60 mg/ml时，电子烟烟液对细胞的细胞毒性由小变大，有很好的剂量效应关系，因此考察电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间应包含5mg/ml至60 mg/ml范围。
本发明根据电子烟烟液的特性，建立了一种基于中性红试验分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法，本发明具有以下特点：（1）针对大多数电子烟烟液样本密度大的特点，确立了采用质量称重配制电子烟染毒溶液的方法。（2）通过不同细胞系的筛选，接种密度的优化步骤，选择更适用于电子烟烟液细胞毒性评价的BEAS-2B细胞。（3）并通过电子烟烟液染毒浓度的优化，确定了最佳染毒浓度，以获得最佳剂量效应曲线。此外，本测定方法还具有操作快速简便、灵敏性高、结果稳定的优点。
附图说明
图1. 细胞接种密度优化。
图2.不同细胞系检测电子烟样品1烟液细胞毒性的剂量-效应关系。
图3. BEAS-2B细胞检测电子烟样品2烟液细胞毒性的剂量-效应关系。
具体实施方式
本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
为考察电子烟样品2烟液染毒对BEAS-2B细胞的毒性影响。经扩增培养的BEAS-2B细胞进行胰酶消化以后，制备细胞悬液（2×105个/ml）。96孔板（除最外周36个孔）中每孔加入100 μl细胞悬液，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。细胞培养24 h 后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为阴性对照、8个不同剂量（5 mg/ml，10mg/ml，15 mg/ml，20mg/ml，30 mg/ml，40 mg/ml，50 mg/ml，60 mg/ml）的电子烟烟液染毒和阳性对照处理。96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为溶液背景对照，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h。电子烟烟液染毒染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μl中性红染液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200μlPBS洗2次，加入1 ml中性红提取液。室温下快速振荡15~20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值。图3所示为电子烟烟液染毒所得到的剂量效应曲线，如图3可知，电子烟烟液染毒浓度与中性红检测吸光度值有很好的剂量效应关系，可通过公式计算IC50值。

Claims (2)

1.一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）溶液的制备：
（1）中性红染液：0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50 μg/ml；
（2）中性红萃取液：冰醋酸∶无水乙醇∶水＝1∶50∶49；
（3）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS），200 μg/ml，100% 细胞致死率浓度；
（4）电子烟烟液染毒溶液：使用分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制；
2）细胞样本的处理：
（1）细胞接种：选用人正常肺上皮细胞BEAS-2B细胞，向96孔板的每孔中加入100 μL的BEAS-2B细胞悬液，接种密度为20000个/孔；
（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，除最外周36孔，96孔板每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组，阴性对照组每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
（3）中性红染色：电子烟烟液染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μl中性红染液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养3 h，3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μlPBS洗2次，加入100ul中性红萃取液，室温下快速振荡15-20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值；
（4）结果与分析：计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率，相对吸光值C= A540/ A540 阴性对照；
此外，所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A540 阳性对照小于等于0.3。
2.根据权利要求1所述的用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，其特征在于：电子烟烟液细胞毒性浓度的染毒区间包含5mg/ml至60 mg/ml范围。
CN201410094933.1A 2014-03-16 2014-03-16 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法 Active CN103808681B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410094933.1A CN103808681B (zh) 2014-03-16 2014-03-16 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410094933.1A CN103808681B (zh) 2014-03-16 2014-03-16 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103808681A CN103808681A (zh) 2014-05-21
CN103808681B true CN103808681B (zh) 2017-01-11

Family

ID=50705770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410094933.1A Active CN103808681B (zh) 2014-03-16 2014-03-16 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103808681B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107167356B (zh) * 2017-03-31 2020-02-04 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种尿液中细胞染色后快速显色的染色剂及其使用方法
CN108424949B (zh) * 2018-02-06 2021-05-25 云南中烟工业有限责任公司 一种基于变形链球菌快速筛选电子烟液的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101393190A (zh) * 2008-10-30 2009-03-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 卷烟主流烟气细胞毒性测定方法
CN101691598A (zh) * 2009-09-17 2010-04-07 中国烟草总公司郑州烟草研究院 卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法
CN101851660A (zh) * 2010-04-23 2010-10-06 云南烟草科学研究院 用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法
CN103399159A (zh) * 2013-08-06 2013-11-20 国家烟草质量监督检验中心 一种卷烟烟气致细胞dna损伤的定量评价方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7837663B2 (en) * 2003-10-16 2010-11-23 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Odor controlling article including a visual indicating device for monitoring odor absorption

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101393190A (zh) * 2008-10-30 2009-03-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 卷烟主流烟气细胞毒性测定方法
CN101691598A (zh) * 2009-09-17 2010-04-07 中国烟草总公司郑州烟草研究院 卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法
CN101851660A (zh) * 2010-04-23 2010-10-06 云南烟草科学研究院 用于卷烟烟气细胞毒性检测的中性红溶液的配制方法
CN103399159A (zh) * 2013-08-06 2013-11-20 国家烟草质量监督检验中心 一种卷烟烟气致细胞dna损伤的定量评价方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
烤烟和白肋烟的致突变作用和细胞毒性的对比研究;曹易懿等;《职业与健康》;20120830;第28卷(第16期);第1938-1939页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103808681A (zh) 2014-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Suárez et al. Sister chromatid exchanges and micronuclei analysis in lymphocytes of men exposed to simazine through drinking water
Su et al. Sensors and analytical technologies for air quality: particulate matters and bioaerosols
McDermott et al. Effects of Pseudomonas aeruginosa virulence factor pyocyanin on human urothelial cell function and viability
Kanaani et al. Performance of UVAPS with respect to detection of airborne fungi
CN103808681B (zh) 用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法
CN101691598B (zh) 卷烟主流烟气冷凝物的细胞毒性测定方法
Campbell et al. Characterization of glyphosate and AMPA concentrations in the urine of Australian and New Zealand populations
CN105823738B (zh) 一种测定纸制品中可迁移性荧光增白剂含量的方法
CN103808917B (zh) 一种电子烟烟液细胞增殖毒性评价方法
Zhang et al. Adenosine triphosphate (ATP) bioluminescence-based strategies for monitoring atmospheric bioaerosols
CN104017572B (zh) 一种极度酸性pH荧光探针及其制备方法和应用
Zahavy et al. Rapid antibiotic susceptibility determination for Yersinia pestis using flow cytometry spectral intensity ratio (SIR) fluorescence analysis
CN103834716B (zh) 一种电子烟烟液体外细胞毒性wst-1测试方法
CN107586822A (zh) 一种检测电子烟气溶胶水提物细胞毒性的方法
Fulford et al. Total viable counts, ATP, and endotoxin levels as potential markers of microbial contamination of dental unit water systems
CN102507447B (zh) 一种利用青海弧菌q67检测真菌毒素萎蔫酸的方法
CN102242181B (zh) 基于细胞电子传感器的烟气冷凝物细胞毒性测定方法
CN106596442A (zh) 一种快速定量检测甲拌磷残留的方法
Chen et al. Rapid detection of Aspergillus flavus contamination in peanut with novel delayed luminescence spectra
Zhao et al. Use of the smart tongue to monitor mold growth and discriminate between four mold species grown in liquid media
Đurović et al. Novel electrochemical procedure for the determination of metamitron
Cai et al. Assessment and comparison of viability assays for cellular products
CN103267752A (zh) 测定胰岛中a细胞与b细胞数目比例的方法
Wang et al. Determination of benchmark dose based on adduct and micronucleus formations in formaldehyde-exposed workers
Millipore Precise and accurate counts and viability measurements across multiple cell lines using the Muse™ cell count & viability assay

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant