CN103267752A - 测定胰岛中a细胞与b细胞数目比例的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法。该方法包括：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和B细胞；分别统计、测量它们的细胞数目和总面积；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将A细胞置于其中培养；后检测A细胞荧光淬灭前的平均荧光值；再加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测A细胞荧光淬灭后的平均荧光值；再用同样的方法检测B细胞荧光淬灭前的平均荧光值和淬灭后的平均荧光值；再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本，用同样的方法检测其荧光淬灭前的荧光值和淬灭后的荧光值；根据下列公式得到结果。本发明的方法可以在活细胞中进行，从而实现无损检测的目的。

Description

测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法。

背景技术

胰岛中包含A细胞、B细胞、D细胞及PP细胞等多种细胞。其中，A细胞与B细胞的比例对人体糖代谢的调节起重要作用。

相关技术中，测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法通常是：先将胰岛细胞团用多聚甲醛（PFA）进行固定，包埋和切片，再加入胰岛素的第一抗体和胰高血糖素的第一抗体，最后加入分别匹配以上两种抗体的不同第二抗体（分别被不同的荧光物质标记），最终通过测量有荧光部分的面积计算得到A细胞与B细胞的比例。

但是，这种方法的缺点是对细胞造成了损坏：在进行免疫反应前要将胰岛细胞固定，改变了其细胞形态，使得细胞死亡而无法进行其它活细胞功能检测试验，例如探测细胞的分泌功能等等。

发明内容

本发明的目的在于提供测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，包括下列步骤：

步骤A：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；

步骤B：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B细胞的总面积S₂；

步骤C：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤D：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

步骤E：再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本置于该培养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤F：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\×\frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；

操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。

本发明上述实施例的方法的检测原理是：先后分别采用锌离子荧光染料和非荧光素锌离子络合剂与活细胞中的锌离子络合，锌离子荧光染料作为荧光激发剂，非荧光素锌离子络合剂作为荧光淬灭剂，使得细胞发生荧光淬灭现象，再根据细胞荧光淬灭前后的荧光值计算得到胰岛中A细胞与B细胞的比例；该荧光淬灭的原理是：

以A细胞为例，在用于培养胰岛细胞的胰岛培养基中加入一种能发射荧光的络合剂—锌离子荧光染料，该锌离子荧光染料选择性地与m个A细胞中的锌离子络合，从而使得m个A细胞发射荧光；接着向所述胰岛培养基中加入另一种络合剂—非荧光素锌离子络合剂，此时非荧光素锌离子络合剂与锌离子荧光染料竞争结合细胞中的锌离子，使得锌离子荧光染料与锌离子的络合产物部分解离，进而使得m个A细胞发射的荧光强度降低，产生荧光淬灭，同时在此过程中检测m个A细胞发生荧光淬灭前、淬灭后的平均荧光值；

所述n个B细胞与所述检测样本的检测过程同上；更重要地，由于锌离子荧光染料对A细胞和B细胞的荧光染色能力不同，因而使得两种细胞的荧光淬灭程度也不同，从而可建立方程组以用于检测胰岛中A细胞与B细胞数目的比例；

此外，通过统计和测量所述多个A细胞、所述多个B细胞的细胞数目和总面积，可得到单个A细胞的淬灭系数和单个B细胞的淬灭系数，即发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；再通过如下的公式和计算方法即可得到A细胞与B细胞的比例：

x为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中A细胞的总的荧光强度；

y为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中B细胞的总的荧光强度；

α为A细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；

β为B细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；

γ=A细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×A细胞的平均面积/(B细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×B细胞的平均面积)；

结合所述步骤A至E中的检测结果以及上述参数之间的关系，得到：

x+y=a；

αx+βy=b；

x/y=(待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细胞的数目)×γ;

α=b₁/a₁;

β=b₂/a₂;

γ={(a₁)*(S₁/m)}/{(a₂)*(S₂/n)}；

最终得到，待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细胞的数目

其中，α，β，γ三个参数通过所述步骤B至D即可计算得到，a和b通过所述步骤E即可得到，进而最终得到R，即胰岛中A细胞与B细胞的比例

由上文可知，本发明的测定方法是先分别检测A细胞与B细胞的单独荧光淬灭参数，再检测混合有A细胞和B细胞的检测样本的荧光淬灭参数，最终建立方程，得到A细胞与B细胞的比例，由于锌离子荧光染料具有膜渗透性，可进入活细胞，对锌离子进行检测，无需破坏细胞的组织结构，因而本发明的测定方法可以在活细胞中进行，从而实现无损检测的目的。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

实施例一

本发明的实施例一提供了一种测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，包括下列步骤：

步骤101：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；

步骤102：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B细胞的总面积S₂；

步骤103：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤104：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

步骤105：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本置于该培养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤106：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\×\frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；

操作所述步骤101至所述步骤105时的环境温度为16-37℃。

上述方法的检测原理是：先后分别采用锌离子荧光染料和非荧光素络合剂与活细胞中的锌离子络合，使得细胞发生荧光淬灭现象，再根据细胞荧光淬灭前后的荧光值计算得到胰岛中A细胞与B细胞的比例；该荧光淬灭的原理是：

以A细胞为例，在用于培养胰岛细胞的胰岛培养基中加入一种能发射荧光的络合剂—锌离子荧光染料，该锌离子荧光染料选择性地与m个A细胞中的锌离子络合，从而使得m个A细胞发射荧光；接着向所述胰岛培养基中加入另一种络合剂—非荧光素锌离子络合剂，此时非荧光素锌离子络合剂与锌离子荧光染料竞争结合细胞中的锌离子，使得锌离子荧光染料与锌离子的络合产物部分解离，进而使得m个A细胞发射的荧光强度降低，产生荧光淬灭，同时在此过程中检测m个A细胞发生荧光淬灭前、淬灭后的平均荧光值（平均面积的荧光值）；

所述n个B细胞与所述检测样本的检测过程同上；更重要地，由于锌离子荧光染料对A细胞和B细胞的荧光染色能力不同，因而使得两种细胞的荧光淬灭程度也不同，从而可建立方程组以用于检测胰岛中A细胞与B细胞数目的比例；

此外，通过统计和测量所述多个A细胞、所述多个B细胞的细胞数目和总面积，可得到单个A细胞的淬灭系数和单个B细胞的淬灭系数，即发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；再通过如下的公式和计算方法即可得到A细胞与B细胞的比例：

x为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中A细胞的总的荧光强度；

y为荧光淬灭前待测胰岛细胞团中B细胞的总的荧光强度；

α为A细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；

β为B细胞发生荧光淬灭后的平均荧光值与发生荧光淬灭前的平均荧光值的比值；

γ=A细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×A细胞的平均面积/(B细胞荧光淬灭前的平均荧光强度×B细胞的平均面积)；

结合所述步骤101至105中的检测结果以及上述参数之间的关系，得到：

x+y=a；

αx+βy=b；

x/y=(待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细胞的数目)×γ;

α=b₁/a₁;

β=b₂/a₂;

γ={(a₁)*(S₁/m)}/{(a₂)*(S₂/n)}；

最终得到，待测胰岛细胞团中A细胞的数目/待测胰岛细胞团中B细胞的数目

其中，α，β，γ三个参数通过所述步骤102至104即可计算得到，a和b通过所述步骤105即可得到，进而最终得到R，即胰岛中A细胞与B细胞的比例，即

由上文可知，本发明的测定方法是先分别检测A细胞与B细胞的单独荧光淬灭参数，再检测混合有A细胞和B细胞的检测样本的荧光淬灭参数，最终建立方程，得到A细胞与B细胞的比例，由于锌离子荧光染料具有膜渗透性，可进入活细胞，对锌离子进行检测，无需破坏细胞的组织结构，因而本发明的测定方法可以在活细胞中进行，从而实现无损检测的目的。

其中，所述步骤101中分离出A细胞和多个B细胞的方法可以采用多种，例如采用细胞分离机进行分离。所述培养的过程中发生荧光络合反应，所述静置的过程中发生荧光淬灭反应。

此外，所述锌离子荧光染料需采用现有的对所述A细胞和所述B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；例如研究发现的红色内酰胺锌离子染料（ZinRhodaLactam-1，ZRL-1）等。所述非荧光素锌离子络合剂是指可与锌离子发生络合反应，但不能发射荧光的络合剂，例如N,N-二(2-吡啶甲基)胺（DPA），N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺（TPEN）等。

实施例二

本发明的实施例二提供了一种优选的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，包括下列步骤：

第一步：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；

第二步：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述多个A细胞的总面积S₁和所述多个B细胞的总面积S₂；

第三步：向胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入TPEN0.8-1.2mmol/L，静置12-25min；后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

第四步：向胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入TPEN0.8-1.2mmol/L，静置12-25min；后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

第五步：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本；向胰岛培养基中加入ZRL-18-12μmol/L，再将所述检测样本置于该培养基中，培养0.8-1.2h；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入TPEN0.8-1.2mmol/L，静置12-25min，后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

第六步：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\×\frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。

由上文可知，本实施例提供了一种更为优选的锌离子荧光染料ZRL-1，其具有较好的膜渗透性和对锌离子高选择性的络合能力，用于荧光检测，灵敏度高，因而使得本发明的检测方法灵敏度高，其具体的性质参见参考文献《A Highly Selective Turn-OnColorimetric,Red Fluorescent Sensor for Detecting Mobile Zinc inLiving Cells》（Inorg.Chem.2010,49,10753-10755），该化合物的结构式为：

并且非荧光素锌离子络合剂选用TPEN，同样其也是一种高选择性的络合剂，因而用作荧光淬灭剂，使荧光淬灭前后的荧光值差别较大，因而得到的检测结果准确度更高。

实施例三

本发明的实施例三提供了另一种优选的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，包括下列步骤：

步骤201：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；

步骤202：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B细胞的总面积S₂；

步骤203：向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养1h；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L，静置20min；后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤204：向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养1h；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L，静置20min；后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂

步骤205：再从待测胰岛细胞团中取出一部分作为检测样本；向胰岛培养基中加入ZRL-110μmol/L，再将所述检测样本置于该培养基中，培养1h；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入TPEN1mmol/L，静置20min；后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤206：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\×\frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，操作所述步骤201至所述步骤205时的环境温度为25-37℃。

上述方法中的所述胰岛培养基为洛斯维·帕克纪念研究所RPMI培养基，且所述培养基添加了0.1g/mL血清，即RPMI1640培养基，这种培养基稳定性和营养物质更适于胰岛细胞生长。

此外，上述三个实施例中，所述m≥6，所述n≥6，用于计算细胞的平均荧光值更具有统计学意义，其中优选采用6，适当减轻了统计工作量。更优选地，操作所有步骤时的环境温度为25-37℃，例如25℃或37℃。检测荧光值的方法可以采用多种，例如采用目前技术已经较成熟的宽场显微镜检测或共聚焦显微镜检测。

为了进一步说明本发明改进点，以下还提供了具体的试验例。

试验例

试验对象：C57BL/6J小鼠胰岛1个。

试验方法：

采用实施例三的方法进行检测，其中，所述m和n均为6；操作所有步骤时的环境温度为25℃。并且采用宽场显微镜检测检测荧光值。

试验结果：

α=0.7875，β=0.1630，γ=1.1226

a=41750，b=9886

C57BL/6J小鼠胰岛中A细胞与B细胞的比例R=13.4%。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，包括下列步骤：

步骤A：从待测胰岛细胞团中取出一部分，从中分离出多个A细胞和多个B细胞；

步骤B：分别统计所述A细胞的细胞数目m和所述B细胞的细胞数目n；分别测量所述m个A细胞的总面积S₁和所述n个B细胞的总面积S₂；

步骤C：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述m个A细胞置于该培养基中，培养；后检测所述m个A细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₁；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述m个A细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₁;

步骤D：向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述n个B细胞置于该培养基中，培养；后检测所述n个B细胞荧光淬灭前的平均荧光值a₂；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述n个B细胞荧光淬灭后的平均荧光值b₂;

步骤E：再从待测胰岛细胞团中取出一部分胰岛细胞团作为检测样本；向胰岛培养基中加入锌离子荧光染料，再将所述检测样本置于该培养基中，培养；后检测所述检测样本荧光淬灭前的荧光值a；向所述胰岛培养基中加入非荧光素锌离子络合剂，静置后检测所述检测样本荧光淬灭后的荧光值b;

步骤F：根据下列公式得到待测胰岛细胞团中A细胞与B细胞的数目比例R：

$R=\frac{b_{2}a-{\mathrm{ba}}_2}{{\mathrm{ba}}_1-{\mathrm{ab}}_1}\×\frac{{\mathrm{mS}}_2}{{\mathrm{nS}}_1};$

其中，所述锌离子荧光染料为对所述A细胞和所述B细胞荧光染色能力不同，并且具有膜渗透性的锌离子荧光染料；

操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为16-37℃。如权利要求1所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述锌离子荧光染料为红色内酰胺锌离子染料。

如权利要求2所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述非荧光素锌离子络合剂为N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺。

如权利要求3所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，

所述步骤C至所述步骤E中加入的红色内酰胺锌离子染料的浓度为：8-12μmol/L；

所述步骤C至所述步骤E中加入的N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的浓度为：0.8-1.2mmol/L。

如权利要求4所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，

所述步骤C至所述步骤E中所述培养的时间为0.8-1.2h；

所述步骤C至所述步骤E中所述静置的时间为15-25min。如权利要求5所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，

所述步骤C至所述步骤E中加入的红色内酰胺锌离子染料的浓度为：10μmol/L；

所述步骤C至所述步骤E中加入的荧光素锌离子络合剂为N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺的浓度为：1mmol/L；

所述步骤C至所述步骤E中所述培养的时间为1h；

所述步骤C至所述步骤E中所述静置的时间为20min。

如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述胰岛培养基为洛斯维·帕克纪念研究所RPMI培养基，且所述培养基含有0.1g/mL小牛血清。

如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述步骤C至所述步骤E中检测荧光值的方法为：

采用宽场显微镜检测或共聚焦显微镜检测。

如权利要求1-6任一项所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，操作所述步骤A至所述步骤E时的环境温度为25-37℃。

如权利要求9所述的测定胰岛中A细胞与B细胞数目比例的方法，其特征在于，所述m≥6；所述n≥6。