CN101603091A

CN101603091A - 西瓜细菌性果斑病菌免疫pcr的检测试剂盒和试剂盒使用方法

Info

Publication number: CN101603091A
Application number: CNA2009101418930A
Authority: CN
Inventors: 刘箐
Original assignee: SUZHOU HUIMENG BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: SUZHOU HUIMENG BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2009-05-22
Filing date: 2009-05-22
Publication date: 2009-12-16

Abstract

本发明是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，Aac)的检测。一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有：8－10×PCR缓冲液；氯化镁20－25mmol/L；dNTP 8－10mmol/L；Taq酶1－5IU/μL；引物5’－GACCAGCCACACTGGGAC－3’8－10pmol/μL；引物5’－CTGCCGTACTCCAGCGAT－3’8－10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管。本发明的优点是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在10小时内就可以完成检测。

Description

西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR的检测试剂盒和试剂盒使用方法

技术领域

本发明是一种西瓜细菌性果斑病菌的基因检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，专一针对西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.citrulli，Aac)的检测。适用于西瓜细菌性果斑病菌的田间预防及进出口植物检疫中Aac快速检测。

背景技术

西瓜细菌性果斑病又称细菌斑点病、西瓜水浸病、果实腐斑病等，是西瓜、籽瓜风险最高的一种种子传播病害。苗期和成株均可发病。瓜苗染病沿中脉出现不规则褐色病变，有的扩展到叶缘，从叶背面看呈水渍状，有时被一个黄色组织带包围。种子带菌的瓜苗在发病后1-3周即死亡。西瓜果实染病，初期在果实上部表面现数个几毫米大小灰绿色至暗绿色水渍状斑点，后迅速扩展成大型不规则的水浸状斑，3～5天内便布满除接触地面部分的整个果面。早期形成的病斑老化后表皮龟裂，常溢出黏稠、透明的琥珀色菌脓，果实很快腐烂。该病多始于成瓜向阳面，与地面接触处未见发病，瓜蔓不萎蔫，西瓜细菌性果斑病的病原菌为燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenaesubsp.citrulli，A.a.c)。该菌属原核生物界(Procaryotae)、薄壁菌门(Gracilicutes)、暗细菌纲(Scotobacteria)、假单孢菌科(Pseudomonadaceae)、嗜酸菌属(Acidovorax)。

由于该病主要通过种子带菌进行远距离传播，且病瓜种子带菌率较高，所以对种子进行严格检测是防止该病害传播的最重要手段。目前国内对西瓜果斑病菌检测采用的方法主要有育苗检测、分离培养检测、免疫血清学和PCR检测等方法。育苗检测、分离检测所需检测时间较长，无法满足多批次种子进出口检测要求；免疫血清学如ELISA检测灵敏度相对较低，有时甚至出现假阴性现象。而只有少量种子携带病原这一实际情况，更使得以上检测方法的灵敏度和检出率受到限制，发展一种将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，是进出口种子西瓜细菌性果斑病菌检测急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒。以克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测灵敏度，同时大大提高了种子检测的效率。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有：8-10×PCR缓冲液；氯化镁20-25mmol/L；dNTP 8-10mmol/L；Taq酶1-5IU/μL；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管；

使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为360bp的特异性扩增产物。

其扩增条件是：PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR扩增条件：94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持。

一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，所述使用方法的步骤为：

(1)加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac；

(2)PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；

(3)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(4)对条带进行分析得出结论；

若有360bp扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。

进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，所述的PCR管包被Aac单克隆抗体的具体步骤为：

(a)用包被缓冲液按照1∶100-300稀释Aac单克隆抗体，抗体浓度为0.4-0.8mg/ml，将稀释好的抗体按照每管50μL加入PCR管室温4小时或4℃过夜包被抗体。

(b)包被缓冲液配方为：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，叠氮化钠0.2g，溶于1000ml PBST缓冲液中，调pH值到9.6。配制PBST：氯化钠8.0g，无水磷酸氢二钠1.15g，无水磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，吐温-200.5毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7.4。

进一步，所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，所述的加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac的具体步骤为：

a)样品制备方法为：按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分钟)离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增；

b)抽提缓冲液配方为：Na₂SO₃0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0.5ml/L，pH为7.4，抽提缓冲液使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1∶2-10。

c)加样品50μL，在室温或37℃的条件下在缓冲液中孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac；

一种西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法，步骤为：

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm(转/每分钟)离心1分钟，丢去上清夜，收集菌体。

B.加入400ul裂解液(40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸(Tris-醋酸)，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时。

C.然后加入200ul 5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm(转/每分钟)离心15分钟。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ul TE溶液中，置4℃保存备用。

西瓜细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli，Aac)免疫PCR检测试剂盒，属于农作物病害防治和植物检疫范畴，基因位于16SrDNA。使用本发明试剂盒对8个参试菌株进行检测，Acc得到360bp特异性目标条带，其余菌株无产物；对26个ELISA检测阳性样品进行验证，符合率为98％，且不符合样品均为ELISA未有效检测样品。该试剂盒集病原浓缩、特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒，尤其适用于植保部门和进出口检疫部门，对病原含量比较低的样品进行快速西瓜细菌性果斑病菌的鉴定。

本发明的有益效果是：本发明西瓜细菌性果斑病菌的检测试剂盒，涉及一种检测危险性植物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌的试剂盒，在10小时内就可以完成检测。

本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的植物病原菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原菌，并直接可从植物种子、组织中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为病害防治策略的制定提供了依据。

通过对西瓜细菌性果斑病菌的特异性检测，引物Aacp1和Aacp2和优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了一段长360bp的PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于8种类非目标菌，均无扩增产物。

通过灵敏度的检测，对西瓜细菌性果斑病菌纯菌液模拟带菌种子提取液的直接PCR和免疫PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为3600个细菌/ml，而免疫PCR的最低检出量是600个细菌/ml。

通过对西瓜种子检测，均可从带菌种子中准确稳定的检测到360bp的PCR产物，和ELISA检测符合率为98％，且有2％的ELISA未检测到的带菌种子，该试剂盒也可以检测到目标条带，说明该试剂盒比ELISA试剂盒更加灵敏。

附图说明

图1是试剂盒使用流程图；

图2是本试剂盒引物特异性的验证和PCR条件优化；

A.a.c菌株DNA的PCR扩增结果

M：100bp DNA ladder D：A.a.c菌株DNA

图3是模拟带菌种子提取液的直接PCR检测灵敏度结果；

其中：M：100bp DNA ladder；A：3600cells/ml；

B：360cells/ml；C：36cells/ml；D：3.6cells/ml

E：3.6×10-1cells/ml；F：3.6×10-2cells/ml；

G：3.6×10-3cells/ml

图4是模拟带菌种子提取液的免疫PCR检测灵敏度结果；

其中：M：100bp DNA ladder；A：≤60000cells/ml；B：≤6000cells/ml；C：≤600cells/ml；D：≤60cells/ml；E：≤6cells/ml；F：≤0.6cells/ml；G：≤0.06cells/ml

图5对八种非Aac菌株进行特异性验证结果；

其中：M：100bp DNA ladder P，1，3：Aac，2，4，5，6，7，8，9，10分别为丁香假单胞杆菌丁香致病型，番茄细菌性溃疡病，番茄细菌性叶斑病菌，番茄细菌性疮痂病，十字花科蔬菜黑腐致病变种，大豆细菌斑疹病，丁香假单胞杆菌丁香致病型，甜瓜细菌性叶斑病菌

图6A对出口10个黑瓜籽检测；

图6B对出口10个西瓜种子检测；

图6C对5个田间籽瓜样品检测。

其中：M：Marker，P：Aac对照

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有：10×PCR缓冲液；氯化镁25mmol/L；dNTP 10mmol/L；Taq酶5IU/μL；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’10pmol/μL；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管。

实施例2一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，包括有：8×PCR缓冲液；氯化镁20mmol/L；dNTP 8mmol/L；Taq酶1IU/μL；引物5，-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8pmol/μL；引物5，-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管。

实施例3：西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其步骤为：

(1)加样品50μL室温或37℃孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac；样品制备方法为：按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm(转/每分钟)离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增。抽提缓冲液配方为：Na₂SO₃0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，鸡蛋清蛋白与吐温-20(tween-20)各0.5ml/L，PH 7.4，抽提缓冲液使用量根据需要配置，一般种子和缓冲液的重量比约为1∶2-10。

(2)PCR扩增，PCR循环增加20分钟，94摄氏度高温裂解细菌，释放DNA作为扩增模板；PCR扩增条件：94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持。

(3)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(4)对条带进行分析得出结论，若有扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。

实施例4：见图2，试剂盒性能测定，用提取的Aac基因组DNA作为模板，按照94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持的PCR条件进行扩增，对PCR条件进行测试，结果发现，该PCR参数适合Aac的PCR扩增。

西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法如下：

B.加入400ul裂解液(40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸(EDTA)，1％十二烷基磺酸钠(SDS)，pH7.8)混匀，置于37℃水浴1小时。

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M，pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm(转/每分钟)离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。

实施例5：见图3，模拟种子带菌的直接PCR检测。各取A到G这7个不同浓度梯度纯菌液3μL，(A：60000cells/ml，B：6000cells/ml，C：600cells/ml，D：60cells/ml，E：6cells/ml，F：0.6cells/ml，G：0.06cells/ml)，与47μLPBS充分混合后，模拟50μL的种子抽提液，各取3μL作为模板直接进行PCR扩增，产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析，结果显示，只有A出现目标条带，其最低检出限为3600个细菌/ml。

PCR条件为94℃裂解20分钟，94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持。

实施例6：见图4，模拟种子带菌的免疫PCR检测。各取A到G这7个不同浓度梯度纯菌液3μL，(A：60000cells/ml，B：6000cells/ml，C：600cells/ml，D：60cells/ml，E：6cells/ml，F：0.6cells/ml，G：0.06cells/ml)，与47μLPBS充分混合后，模拟50μL的种子抽提液，然后加入已包被了A.a.c一抗的PCR管中进行孵育。然后用免疫PCR法扩增，产物经1-1.5％琼脂糖凝胶电泳及成像系统分析，结果发现检测灵敏度为600cells/ml。

实施例7：见图5，对8种类非Aac供试菌株的验证检测

供试菌株：丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pvSyringae)，番茄细菌性溃疡病(Corynebacterium michiganensepv.michiganense)，番茄细菌性叶斑病菌(Pseudomonas.syringae pvtomato)，番茄细菌性疮痂病(Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria)，十字花科蔬菜黑腐致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)，大豆细菌斑疹病(Xanthomonas campestris phaseoli)，丁香假单胞杆菌丁香致病型(Pseudomonas syringae pv Syringae)，甜瓜细菌性叶斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)。

PCR反应条件为：94℃预变性20分钟，94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持。扩增产物用1-1.5％琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析。

检测结果表明，以上八种供试菌，均未检出目标条带，说明试剂盒有比较好的专一性。

实施例8：见图6A，对出口的10批黑瓜籽进行验证检测

随机抽取经过ELISA检测的出口黑瓜子10批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃预变性20分钟，94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持，扩增产物用1-1.5％琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的3批黑瓜籽携带Aac，但ELISA检测结果只有两批。

实施例9：见图6B，对出口的10批西瓜种子进行验证检测

随机抽取经过ELI SA检测的进口西瓜籽10批各30克进行检测，PCR反应条件为：94℃预变性20分钟，94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持，扩增产物用1-1.5％琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的西瓜种子有5批携带Aac，但是ELISA检测结果只有4批携带。

实施例10：见图6C，对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品进行检测

对田间采集的籽瓜、黄瓜、西瓜样品5份进行Aac检测，PCR反应条件为：94℃预变性20分钟，94℃变性20秒，35℃退火20秒，72℃延伸35秒，35次循环完成后72℃延伸7分钟，最后4℃保持，扩增产物用1-1.5％琼脂糖凝胶电泳及UVP凝胶成像系统分析，结果表明，所检测的样品西瓜籽均携带Aac，和ELISA检测结果完全符合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>兰州慧盟生物科技有限公司

<120>西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR的检测试剂盒和试剂盒使用方法

<130>

<160>1

<170>Patent In version 3.5

<210>1

<211>360

<212>DNA

<213>密执安棒形杆菌密执安亚种

<400>1

gaccagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa 60

ttttggacaa tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgcaggatga aggccttcgg 120

gttgtaaact gcttttgtac ggaacgaaaa gccttcttct aataaagggg ggtcatgacg 180

gtaccgtaag aataagcacc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg 240

caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtgcgcag gcggtgatgt aagacagatg 300

tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atttgtgact gcatcgctgg agtacggcag 360

Claims

1.一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒，其特征是包括有：8-10×PCR缓冲液；氯化镁20-25mmol/L；dNTP 8-10mmol/L；Taq酶1-5IU/μL；引物5’-GACCAGCCACACTGGGAC-3’8-10pmol/μL；引物5’-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3’8-10pmol/μL；双蒸水99％～100％；包被了Aac单克隆抗体的检测PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阳性对照PCR管3个；包被了Aac单克隆抗体的阴性对照PCR管3个；阳性对照1管；阴性对照1管；

使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，西瓜细菌性果斑病菌产生分子量为360bp的特异性扩增产物；

2.一种西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述使用方法的步骤为：

(1)加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac病菌；

(3)1-1.5％琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；

(4)对条带进行分析得出结论；若有360bp扩增条带，则判断为西瓜细菌性果斑病菌。

3.如权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的PCR管包被Aac单克隆抗体的具体步骤为：

(b)包被缓冲液配方为：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，叠氮化钠0.2g，溶于1000ml PBST缓冲液中，调pH值到9.6；配制PBST：氯化钠8.0g，无水磷酸氢二钠1.15g，无水磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.2g，吐温-20 0.5毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7.4。

4.如权利要求2所述的西瓜细菌性果斑病菌免疫PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的加样品孵育2小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的Aac的具体步骤为：

a)样品制备方法为：按照每两克种子加入2ml提取缓冲液的比例，研磨种子至种皮破裂，静置1小时后，用纱布过滤取上清，5000rpm离心5分钟，用100μL重悬沉淀直接作模板进行PCR扩增；

b)抽提缓冲液配方为：Na₂SO₃0.13g/ml，聚乙烯吡咯烷酮2g/ml，叠氮化纳0.02g/ml，吐温-20各0.5ml/L，PH 7.4，种子和缓冲液的重量比为1∶2-10。

5.一种西瓜细菌性果斑病菌基因组DNA提取方法，其特征是，步骤为：

A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌离心管中，12000rpm离心1分钟，丢去上清夜，收集菌体；

B.加入400ul裂解液，40mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸，20mM醋酸钠，1mM乙二胺四乙酸，1％十二烷基磺酸钠，pH7.8，混匀，置于37℃水浴1小时；

C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15分钟；

D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；

E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾3M，pH8.0，-20度保存1小时后，13000rpm离心15分钟，弃上清液，沉淀用70％乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。