CN103468806B - 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法。以待检测的过滤海水样品中细菌基因组总DNA为模版，利用细菌16SrDNA保守区域和致病性灿烂弧菌金属蛋白酶基因的特异性的引物进行荧光定量PCR扩增和定量分析检测养殖环境中扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus；检测方法包括细菌基因组DNA提取、荧光定量PCR检测。其优点是快速、特异性强、细菌密度检测范围宽、定量结果能接近于真实情况。

Description

扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法。
背景技术
灿烂弧菌（Vibrio splendidus）广泛存在于海洋环境中，是引起水产动物感染致病的主要病原菌，能引起水产贝类动物的组织溃烂、发育异常和幼苗的大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，胞外金属蛋白酶（Metalloprotease）是灿烂弧菌危害水产动物的主要致病因子即感染致病的根源。该金属蛋白酶基因位于灿烂弧菌基因组的1号染色体上属于单拷贝基因，这一特点便于进行定量分析。
目前，针对灿烂弧菌的检测方法主要包括生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术和PCR检测技术等。但这些方法存在较多的缺点和不足：生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰；rRNA基因在物种中非常保守，使得技术特异性不强；普通PCR方法难以达到定量分析的要求。与以上技术相比，荧光定量PCR技术在检测灵敏度和定量分析手段上都有着传统方法无法比拟的优势。
发明内容
本发明目的在于提供一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法。
为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法，以待检测的过滤海水样品中细菌基因组总DNA为模版，利用细菌16SrDNA保守区域和致病性灿烂弧菌金属蛋白酶基因的特异性的引物进行荧光定量PCR扩增和定量分析检测养殖环境中扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus；其中所述的引物为：
16S rDNA：
上游引物16Srtf：5’-AGAACCTTACCTACTCTTGACATCC-3’，
下游引物16Srtr：5’-CCCAACATTTCACAACACGA-3’；
金属蛋白酶基因：
上游引物spf1：5’-ATGGCACAAGGGATCAGCGG-3’，
下游引物spf2：5’-GGATAAGAGGAAGCGATAAAGAA-3’。
所述荧光定量PCR快速检测反应体系为反应总体积为10微升，包括基因组DNA 1-4微升，SYBR Premix Ex Taq3.5微升,ROX Reference Dye 0.2 微升，引物各0.15微升（浓度10微摩尔/升），最后加灭菌去离子水至10微升。
所述PCR反应条件为95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火/延伸30秒，收集SYBR Green荧光，40个循环。
以待测养殖环境中的DNA样品作为模板，分别利用16SrDNA和金属蛋白酶的荧光定量PCR引物，在同一体系下进行扩增，扩增结果用2-T分别计算出16SrDNA和金属蛋白酶浓度的相对值C16S和Cspf；而后再利用根据所得结果得出金属蛋白酶基因在环境样品DNA中所占16SrDNA基因的比例V=Cspf/C16S；最后利用16SrDNA标准曲线计算出的16SrDNA基因的绝对拷贝数N16S，根据上述结果计算出金属蛋白酶的相对拷贝数Mspf=N16S×V。
所述16SrDNA标准曲线： 
1）利用引物16Srtf和16Srtr，通过PCR反应从待测养殖环境DNA样品中扩增细菌总的16S rDNA，根据PCR纯化产物的浓度计算16S rDNA的拷贝数；
2）根据上述计算得出的拷贝数，用无菌水将16S rDNA稀释成不同数量级的拷贝数；根据上述拷贝数梯度，利用16Srtf和16Srtr进行SYBR Green荧光染料法荧光定量PCR反应，根据荧光定量PCR的结果绘制16S rDNA的标准曲线。
本发明提供了扩增灿烂弧菌金属蛋白酶的特异性引物，从而提供了一种快速检测致病性灿烂弧菌的方法，同已有的检测技术相比具有如下优势：
快速性：没有后处理，不用电泳、拍照，实施缩短反应时间；
检测范围宽：因目标基因为单拷贝，所以检测上线可达到107CFU/mL，可完全满足野外调查的需要；
特异性强：目标基因的PCR基因产物同源性极低，且检测方法不存在非特异性扩增的可能，保证检测的准确可靠性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的16SrDNA拷贝数的标准曲线图。（荧光定量PCR反应中16SrDNA拷贝数的标准曲线。该标准曲线的斜率为-2.898，拟合度R2为0.9965。）
图2为本发明实施例提供的大连虾夷扇贝养殖环境中致病性灿烂弧菌所占比例。（大连虾夷扇贝养殖环境中致病性灿烂弧菌所占比例。）
图3本发明实施例提供的大连虾夷扇贝养殖环境DNA中16SrDNA和金属蛋白酶的拷贝数。（大连虾夷扇贝养殖环境DNA中16SrDNA和金属蛋白酶的拷贝数。其中，红色线为环境样品中细菌总16SrDNA的拷贝数；蓝色线为环境样品中灿烂弧菌金属蛋白酶的拷贝数。）
具体实施方式
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实验例1：灿烂弧菌定量检测引物的特异性分析：
通过使用灿烂弧菌金属蛋白酶定量检测引物能够特异性的检测灿烂弧菌中金属蛋白酶基因。
分别将灿烂弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌、溶藻胶弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌进行培养后提取全基因组DNA，作为PCR反应的模板。利用灿烂弧菌金属蛋白酶定量检测引物和上述模板进行普通PCR反应。反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。PCR反应结束后对产物进行琼脂糖凝胶检测。结果表明，只有灿烂弧菌为模板的样品中有特异性条带，其他样品中菌无反应条带。将灿烂弧菌样品中的特异性条带进行序列测定分析，确定为灿烂弧菌的金属蛋白酶基因。说明灿烂弧菌金属蛋白酶定量检测引物有较好的特异性。
实验例2：灿烂弧菌定量检测引物的灵敏度分析：
通过使用灿烂弧菌金属蛋白酶定量检测引物能够高灵敏性的检测灿烂弧菌。
将灿烂弧菌用2216E液体培养基于18℃振荡培养12小时，使用平板计数的方法确定菌液的浓度为4×109CFU/毫升，使用无菌的生理盐水将灿烂弧菌的菌液按照10的倍数进行梯度稀释，浓度分别为4×108CFU/毫升、4×107CFU/毫升、4×106CFU/毫升、4×105CFU/毫升、4×104CFU/毫升、4×103CFU/毫升、4×102CFU/毫升、4×101CFU/毫升、4CFU/毫升。利用以上各稀释度的菌液作为模板进行普通PCR反应，反应条件为95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃复性30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10分钟。
PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测后发现其灵敏度能够达到检测每毫升最低4CFU的菌体。该引物的灵敏度能够有效地对养殖环境和养殖动物个体中致病性灿烂弧菌进行定性和定量的检测。
实施例3：对大连扇贝养殖环境中灿烂弧菌所占总细菌比例的检测情况
分别取3、5、7、8、9、11月的大连虾夷扇贝养殖环境中采集水体样品，水样经过0.22μm滤膜富集环境中的微生物，将滤膜上的总DNA进行提取后，测定各月份环境样品DNA的浓度。
进行荧光定量PCR反应前将各月份环境样品DNA的浓度都稀释到1ng/μl，将稀释好的样品分别用16SrDNA和金属蛋白酶基因的引物进行荧光定量PCR，反应条件为95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火/延伸30秒，收集SYBR Green荧光，40个循环。分别根据PCR结果中16SrDNA和金属蛋白酶基因扩增指数Ct值，用2-T计算出16SrDNA和金属蛋白酶浓度的相对值C16S和Cspf；再利用公式V=Cspf/C16S得出金属蛋白酶基因在环境样品DNA中所占16SrDNA基因的比例。根据每个月份金属蛋白酶基因和 16SrDNA相对拷贝数的比值，能够代表环境中致病性灿烂弧菌占细菌总数的比例（附图2）。
根据16SrDNA拷贝数的标准曲线计算出每个月份环境中细菌总的16SrDNA基因的绝对拷贝数N16S，该数值能够真实反应环境中细菌总数的情况。根据金属蛋白酶基因和16SrDNA的比值，再利用公式Mspf=N16S×V计算出各月样品中金属蛋白酶的相对拷贝数，能够较为准确的鉴定出致病性灿烂弧菌的数量（附图3）。

Claims (5)

1.一种扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法，其特征在于：以待检测的过滤海水样品中细菌基因组总DNA为模板，利用细菌16SrDNA保守区域和致病性灿烂弧菌金属蛋白酶基因的特异性的引物进行荧光定量PCR扩增和定量分析检测养殖环境中扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus；其中所述的引物为：
16S rDNA：
上游引物16Srtf：5’-AGAACCTTACCTACTCTTGACATCC-3’，
下游引物16Srtr：5’-CCCAACATTTCACAACACGA-3’；
金属蛋白酶基因：
上游引物spf1：5’-ATGGCACAAGGGATCAGCGG-3’，
下游引物spf2：5’-GGATAAGAGGAAGCGATAAAGAA-3’。
2.按权利要求1所述的扇贝致病性灿烂弧菌的快速检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增反应体系为反应总体积为10微升，包括基因组DNA 1-4微升，SYBR Premix Ex Taq 3.5微升,ROX Reference Dye 0.2微升，引物各0.15微升浓度10微摩尔/升，最后加灭菌去离子水至10微升。
3.按权利要求1所述的扇贝致病性灿烂弧菌的快速检测方法，其特征在于：所述PCR反应条件为95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火/延伸30秒，收集SYBR Green荧光，40个循环。
4.按权利要求1所述的扇贝致病性灿烂弧菌的快速检测方法，其特征在于：以待测养殖环境中的DNA样品作为模板，分别利用16SrDNA和金属蛋白酶的荧光定量PCR引物，在同一体系下进行扩增，扩增结果用2-ΔΔT分别计算出16SrDNA和金属蛋白酶浓度的相对值C16S和Cspf；而后再根据所得结果得出金属蛋白酶基因在环境样品DNA中所占16SrDNA基因的比例V＝Cspf/C16S；最后利用16SrDNA标准曲线计算出的16SrDNA基因的绝对拷贝数N16S，根据上述结果计算出金属蛋白酶的相对拷贝数Mspf＝N16S×V。
5.按权利要求4所述的扇贝致病性灿烂弧菌的快速检测方法，其特征在于：所述16SrDNA标准曲线：
1)利用引物16Srtf和16Srtr，通过PCR反应从待测养殖环境DNA样品中扩增细菌总的16S rDNA，根据PCR纯化产物的浓度计算16S rDNA的拷贝数；
2)根据上述计算得出的拷贝数，用无菌水将16S rDNA稀释成不同数量级的拷贝数；根据上述拷贝数梯度，利用16Srtf和16Srtr进行SYBR Green荧光染料法荧光定量PCR反应，根据荧光定量PCR的结果绘制16S rDNA的标准曲线。
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