CN102827926A - 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 - Google Patents

基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102827926A
CN102827926A CN2012101278015A CN201210127801A CN102827926A CN 102827926 A CN102827926 A CN 102827926A CN 2012101278015 A CN2012101278015 A CN 2012101278015A CN 201210127801 A CN201210127801 A CN 201210127801A CN 102827926 A CN102827926 A CN 102827926A
Authority
CN
China
Prior art keywords
real
sybr green
dna
quantitative pcr
pcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2012101278015A
Other languages
English (en)
Inventor
张晓君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huaihai Institute of Techology
Original Assignee
Huaihai Institute of Techology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaihai Institute of Techology filed Critical Huaihai Institute of Techology
Priority to CN2012101278015A priority Critical patent/CN102827926A/zh
Publication of CN102827926A publication Critical patent/CN102827926A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明是一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBRGreenⅠ实时定量PCR检测方法，该方法包括特异性引物设计、标准质粒的构建、SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应体系、SYBRGreenⅠ实时定量PCR的反应程序、标准曲线的建立和样品检测，在对样品进行检测时,根据其Ct值和线性方程获得该样品DNA拷贝数；本发明采用SYBRGreenI荧光定量PCR技术，对发病水产动物及养殖用水的病原鳗利斯顿氏菌进行定量检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，且价格低廉。它解决了以往检测病原鳗利斯顿氏菌的方法繁琐，检测时间长，检测费用高的问题，并且可以即时、准确的提供数据用于生产和科学研究。

Description

基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种鱼类病原细菌的检测方法，特别是一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。
背景技术
鳗利斯顿氏菌是水产养殖动物中常见且重要的病原菌，该菌于1985年由MacDonell和Colwell等提议由弧菌属（Vibrio Pacini 1954）转入利斯顿氏菌属（Listonella MacDonell and Colwell 1986）。该菌呈世界范围分布，且宿主范围广泛，早在18～19世纪在意大利就造成了野生鳗鲡的毁灭性死亡，能引起虹鳟、大麻哈鱼、真鲷、香鳟、牙鲆、大菱鲆、半滑舌鳎、大西洋鲑、太平洋鲑、红点鲑、硬头鳟、香鱼、鰤鱼、鲽鱼、鳕鱼、鲐鱼等多种鱼类、虾蟹类及贝类等水产动物发生相应的“弧菌病”，严重制约了水产养殖业的发展。该菌传统的检验方法包括形态学检测、生理生化特征检测等，这些检测手段不仅工作量大，而且耗时长, 已远远不能满足水产养殖生产上的诊断要求。因此选择合适的分子靶标，研究开发灵敏度高、特异性强的病原鳗利斯顿氏菌简便、快速检测方法已十分重要，在水产养殖动物处于带菌状态或大规模爆发细菌性疾病之前能进行准确的检测，这是传统方法无法比拟的。
目前溶血素被认为是鳗利斯顿氏菌重要的毒力因子，同时异种之间的hly基因核苷酸序列相似性较低，具设计PCR引物的保守区域，是弧菌科种间鉴定的良好分子靶标，hly基因可在种的水平上检测鳗利斯顿氏菌。SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强，且其荧光强度的增加与双链DNA的数量成正比。在PCR 反应体系中，加入过量SYBR荧光染料, SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。本发明以hly基因为靶基因，建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测鳗利斯顿氏菌的方法，为鳗利斯顿氏菌引起的疾病的快速诊断、分子流行病学调查及水环境病原菌监测等奠定良好的基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种方法更为合理、可操作性强的基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法, 其特点是，其步骤如下：
（ 1 ）特异性引物设计：从GenBank上获得鳗利斯顿氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNA Star软件进行同源性分析, 确定在鳗利斯顿氏菌菌株内保守、其他弧菌间特异的片段, 利用生物软件Primer 5.0 对该保守片段设计鳗利斯顿氏菌的特异性检测引物为：
va-hly-F为5'-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3'；
va-hly-R为5'-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3'；
（ 2 ）标准质粒的构建：首先扩增病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）溶血素基因，PCR反应条件为：94℃预变性3min，接94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min、30个循环，然后72℃温育7min；在60μL反应体系中含有：双蒸水 13.4μL，10×PCR缓冲液2μL，25 mM MgCl2 1.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 2μL；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用柱式DNA胶回收试剂盒将阳性PCR产物进行胶回收、纯化，将回收纯化的溶血素基因的PCR产物，利用PMD18T载体进行连接，连接完毕后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选，随机挑取6个白色克隆进行菌液PCR鉴定，以确证为阳性克隆；取2个阳性克隆用柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒；用核酸蛋白分析仪测量质粒浓度，根据阿佛加德罗常数换算出每μL质粒中的DNA的拷贝数，作为标准阳性样本；
（ 3 ） SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 的反应体系：20μL反应体系包括：双蒸水8.6μL，SYBR GreenⅠHotstar Fluo-PCR mix 10μL，正反向引物各0.2μL，1μL标准阳性质粒或待测样本；
（ 4 ） SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 的反应程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s，进行45个循环；PCR完成后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值、熔解曲线、Tm值；
（ 5 ）标准曲线的建立：鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组质粒按10倍稀释法稀释成3.0×108～3.0×101，共8个浓度梯度，按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈值Ｃt采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；得出细菌拷贝数与Ct值的线性方程为:
Ct=−2.086Log concentration+25.306
在对样品进行检测时, 根据其Ct值和线性方程获得该样品DNA 拷贝数；
（ 6 ）样品检测：取被检鱼肝脏或肌肉组织，进行研磨后用水煮法提取模板DNA；按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组标准质粒的DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ｃt与标准曲线对照，得到DNA样本中的溶血素基因片段拷贝浓度，据此得到被检鱼肝脏或肌肉组织中鳗利斯顿氏菌的DNA拷贝浓度。
本发明所述的病原鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum BH1）已经在公开文献《半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究》中所公开（菌株BH1），上述公开文献发表于《海洋学报》，2009，31（5）：112-121。菌株BH1的DNA序列长度及Genebank登录号见下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
该菌株BH1为公知公用材料，现保存在淮海工学院海洋学院实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外发放。
本发明检测方法以编码病原鳗利斯顿氏菌溶血素的基因为靶基因设计并合成va-hly-F和va-hly-R 正反向引物，以SYBR Green I作为结合于双链DNA小沟中的结合染料。使用本检测方法进行病原鳗利斯顿氏菌的检测，能显著提高其准确性和特异性，且操作简单，耗时短，费用低廉，为鳗利斯顿氏菌引起的疾病的快速诊断、分子流行病学调查及养殖水环境污染监测等提供了有效方法。
附图说明
图1为采用本发明方法SYBR GreenⅠreal time PCR 样品检测曲线图。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：
（ 1 ）特异性引物设计：从GenBank上获得鳗利斯顿氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNA Star软件进行同源性分析, 确定在鳗利斯顿氏菌菌株内保守、其他弧菌间特异的片段， 利用生物软件Primer 5.0 对该保守片段设计鳗利斯顿氏菌的特异性检测引物为：
va-hly-F为5'-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3'；
va-hly-R为5'-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3'；
（ 2 ）标准质粒的构建：首先扩增病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）溶血素基因，PCR反应条件为：94℃预变性3min，接94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min、30个循环，然后72℃温育7min；在60μL反应体系中含有：双蒸水 13.4μL，10×PCR缓冲液2μL，MgCl2（25 mM）1.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA 2μL（模板DNA按上海赛百盛基因技术有限公司生产的小量细菌基因组DNA抽提试剂盒所述方法提取）；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用上海生工生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒将阳性PCR产物进行胶回收、纯化，将回收纯化的溶血素基因的PCR产物，利用宝生物公司生产的PMD18T载体进行连接，一般连接3h，连接完毕后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选，随机挑取6个白色克隆进行菌液PCR鉴定，以确证为阳性克隆。取2个阳性克隆用上海生工生产的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒。用核酸蛋白分析仪测量质粒浓度，根据阿佛加德罗常数换算出每μL质粒中的DNA的拷贝数，作为本研究的标准阳性样本。
（ 3 ） SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 的反应体系：20μL反应体系包括：双蒸水8.6μL，SYBR GreenⅠHotstar Fluo-PCR mix(上海生工生产) 10μL，正反向引物各0.2μL，1μL标准阳性质粒或待测样本；
（ 4 ） SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 的反应程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s，进行45个循环；PCR完成后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值、熔解曲线、Tm值；
（ 5 ）标准曲线的建立：鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组质粒按10倍稀释法稀释成3.0×108～3.0×101，共8个浓度梯度，按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈值Ｃt采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。得出细菌拷贝数与Ct值的线性方程为:Ct=−2.086Log concentration+25.306。在对样品进行检测时, 根据其Ct值和线性方程就可获得该样品DNA 拷贝数。
（ 6 ）样品检测：取被检鱼肝脏或肌肉组织，进行研磨后用水煮法提取模板DNA；按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组标准质粒的DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ｃt与标准曲线对照，得到DNA样本中的溶血素基因片段拷贝浓度，据此得到被检鱼肝脏或肌肉组织中鳗利斯顿氏菌的DNA拷贝浓度。
实施例2，参照图1，人工感染半滑舌鳎病鱼检测实验；其检验步骤如下：
（1）选用暂养1周后的健康半滑舌鳎，体长在10cm左右。将供试菌株（BH1）接种于普通营养肉汤，28℃过夜培养后作为供试菌液（调至3×108CFU/ml），经腹腔接种健康半滑舌鳎，每尾接种0.2ml；均隔离养殖于试验水族箱中，感染鱼出现病症后，选择病症明显的3尾鱼，分别取肝脏10g与90mL生理盐水制成匀浆作为被检样品，共3种样品，分别取1mL匀浆液用水煮法提取细菌基因组DNA；
（2）取步骤（1）中得到的DNA样本作为模板，按如下实时荧光定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。20μL PCR的反应体系为：双蒸水8.6μL，SYBR GreenⅠ Hotstar Fluo-PCR mix(上海生工生产) 10μL，正反向引物各0.2μL，1μL标准阳性质粒或待测样本；PCR的反应程序为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s，进行45个循环；
（3）反应结束后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software软件进行数据分析。结果显示样品1 Ct值在16.3，其DNA拷贝数为2.076×104，样品2 Ct值在14.33，其DNA拷贝数为1.827×105，样品3 Ct值在19.52，其DNA拷贝数为5.975×102，3个样品均成阳性反应，实验结果表明该荧光PCR 方法具有广泛而良好的适用性。

Claims (1)

1.一种基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法, 其特征在于，其步骤如下：
（1）特异性引物设计：从GenBank上获得鳗利斯顿氏菌及其他弧菌的溶血素基因的DNA序列，采用DNA Star软件进行同源性分析, 确定在鳗利斯顿氏菌菌株内保守、其他弧菌间特异的片段, 利用生物软件Primer 5.0 对该保守片段设计鳗利斯顿氏菌的特异性检测引物为：
va-hly-F为5'-TGC GCT ATA TTG TCG ATT TCA GTT-3'；
va-hly-R为5'-GCA CCC GTT GTA TCA TCA TCT AAG-3'；
（2）标准质粒的构建：首先扩增病原鳗利斯顿氏菌BH1（Listonella anguillarum BH1）溶血素基因，PCR反应条件为：94℃预变性3min，接94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min、30个循环，然后72℃温育7min；在60μL反应体系中含有：双蒸水 13.4μL，10×PCR缓冲液2μL，25 mM MgCl2 1.6μL，4×dNTP混合物0.4μL，引物各0.2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.2μL，模板DNA 2μL；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后用柱式DNA胶回收试剂盒将阳性PCR产物进行胶回收、纯化，将回收纯化的溶血素基因的PCR产物，利用PMD18T载体进行连接，连接完毕后将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选，随机挑取6个白色克隆进行菌液PCR鉴定，以确证为阳性克隆；取2个阳性克隆用柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒；用核酸蛋白分析仪测量质粒浓度，根据阿佛加德罗常数换算出每μL质粒中的DNA的拷贝数，作为标准阳性样本；
（3）SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系：20μL反应体系包括：双蒸水8.6μL，SYBR GreenⅠHotstar Fluo-PCR mix 10μL，正反向引物各0.2μL，1μL标准阳性质粒或待测样本；
（4）SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，60℃ 30s，72℃ 30s，进行45个循环；PCR完成后，利用Bio-Rad iQ5 Optical System Software软件进行数据分析，包括查看扩增曲线、Ct值、熔解曲线、Tm值；
（5）标准曲线的建立：鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组质粒按10倍稀释法稀释成3.0×108～3.0×101，共8个浓度梯度，按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后，根据得到的各个浓度梯度的循环阈值Ｃt采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线；得出细菌拷贝数与Ct值的线性方程为:
Ct=−2.086Log concentration+25.306
在对样品进行检测时, 根据其Ct值和线性方程获得该样品DNA 拷贝数；
（6）样品检测：取被检鱼肝脏或肌肉组织，进行研磨后用水煮法提取模板DNA；按上述SYBR GreenⅠ实时定量PCR的反应体系和反应程序在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用去离子水，阳性对照采用鳗利斯顿氏菌PMD18-溶血素基因重组标准质粒的DNA；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ｃt与标准曲线对照，得到DNA样本中的溶血素基因片段拷贝浓度，据此得到被检鱼肝脏或肌肉组织中鳗利斯顿氏菌的DNA拷贝浓度。
CN2012101278015A 2012-04-27 2012-04-27 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法 Pending CN102827926A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012101278015A CN102827926A (zh) 2012-04-27 2012-04-27 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2012101278015A CN102827926A (zh) 2012-04-27 2012-04-27 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102827926A true CN102827926A (zh) 2012-12-19

Family

ID=47331233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2012101278015A Pending CN102827926A (zh) 2012-04-27 2012-04-27 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102827926A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468806A (zh) * 2013-09-10 2013-12-25 中国科学院海洋研究所 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434992A (zh) * 2008-09-28 2009-05-20 中国计量学院 一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量pcr检测方法
CN101768641A (zh) * 2010-01-19 2010-07-07 宁波大学 鳗利斯顿氏菌的lamp-lfd检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434992A (zh) * 2008-09-28 2009-05-20 中国计量学院 一种单增李斯特菌与志贺氏菌的荧光定量pcr检测方法
CN101768641A (zh) * 2010-01-19 2010-07-07 宁波大学 鳗利斯顿氏菌的lamp-lfd检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张晓君等: "副溶血弧菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法建立", 《食品科学》 *
张晓君等: "半滑舌蹋病原馒利斯顿氏菌表型及分子特征研究", 《海洋学报》 *
张晓君等: "半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌双重PCR检测方法的研究", 《海洋学报》 *
林强等: "牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用", 《中国水产科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468806A (zh) * 2013-09-10 2013-12-25 中国科学院海洋研究所 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法
CN103468806B (zh) * 2013-09-10 2015-08-26 中国科学院海洋研究所 扇贝致病性灿烂弧菌Vibrio splendidus的快速检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fan et al. Microbiota comparison of Pacific white shrimp intestine and sediment at freshwater and marine cultured environment
CN102851403B (zh) 一种鲤疱疹病毒2型的巢式pcr检测试剂盒
CN112048572B (zh) 基于lamp技术的虾类健康体系可视化快速检测试剂盒
CN110616272A (zh) 检测对虾肝肠胞虫的引物组及含有该引物组的试剂盒
CN104419706A (zh) Snp标记及其应用
CN106591471B (zh) 通过检测hurp1基因表达分析对虾是否受缺氧胁迫的方法
CN102888458A (zh) 一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法
Bidault et al. Development of a Taqman real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Vibrio tapetis in extrapallial fluids of clams
CN103952472B (zh) 用于海豚链球菌lamp-lfd可视化检测的引物和探针及引物和探针的应用
Kang et al. A case report of secondary infection by Vibrio splendidus associated with gas bubble disease in syngnathid fishes (Syngnathus schlegeli and Hippocampus haema)
CN104630387A (zh) 猪流行性腹泻病毒的lamp检测试剂盒
CN104357570B (zh) 一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物及其应用
CN101381767A (zh) 旋毛虫通用型实时荧光pcr检测方法
CN102827926A (zh) 基于溶血素基因的病原鳗利斯顿氏菌的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法
CN104962660A (zh) 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用
Jing-Jing et al. SYBR Green I-based real-time PCR targeting the rpoX gene for sensitive and rapid detection of Vibrio alginolyticus
Feng et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Perkinsus spp. in mollusks
CN106939347B (zh) 三疣梭子蟹病原需钠弧菌双重pcr快速检测试剂盒与方法
Ding et al. Direct visualization of the novel pathogen, S piroplasma eriocheiris, in the freshwater crayfish P rocambarus clarkii (G irard) using fluorescence in situ hybridization
CN104651518A (zh) 一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106701994A (zh) 同步检测肺炎克雷伯氏菌和豚鼠气单胞菌的双重pcr引物及其检测方法
CN101805788B (zh) 基于scar分子标记快速检测副溶血弧菌的pcr特异扩增引物及检测试剂盒
CN105838788A (zh) 一种蓝鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN102839216B (zh) 用于哈氏弧菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒及方法
CN104450952B (zh) 柱状黄杆菌快速检测引物及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20121219