CN104357570B - 一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物及其应用，属于生物检测技术领域。其以fstC基因为目标基因，通过设计3对DNA引物，与待检测的DNA模板放入扩增缓冲液中，在63℃恒温环境中扩增，再以80℃恒温环境终止反应，并对扩增产物进行检测。本发明的LAMP检测引物具有特异性强、灵敏度高、耗时短、操作简便的优点。该引物可以应用于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测中，在水生动物的病原种类鉴定、监测、疾病检疫方面具有一定的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物及其应用，具体涉及一种用于检测杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的LAMP检测引物及其应用，属于生物检测技术领域。
背景技术
杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.salmonicida)亦称为灭鲑气单胞菌，是最早被描述的鱼类病原菌之一，主要引起鲑科鱼类的感染发生疥疮病。该病在1894年由Emmerich和Weibel最早报道在德国的养鱼场发生，并从孵化场发病的褐鳟中分离到该菌，在当时称其为鳟疫杆菌。在1957年出版的《伯杰氏鉴定细菌学手册》第7版中，该菌被正式列入气单胞菌属，在第9版《伯杰氏鉴定细菌学手册》中杀鲑气单胞菌被归于弧菌科气单胞菌属的嗜冷无动力气单胞菌类。
杀鲑气单胞菌具有广泛的世界范围的地理分布，宿主范围很广。在我国在内的很多国家均有该菌的分布，如奥地利、比利时、丹麦、挪威、法国、英国、爱尔兰、芬兰、瑞士、西班牙、德国、加拿大及澳大利亚等国家均有该菌的检出报道，在经济上对这些国家的养殖鱼类造成了不小的损失，尤其是经济价值较高的鲑科鱼类。但是近年来，发现其宿主范围明显在扩大，除了鲑科鱼类外还包括鮨科、鲤科和裸盖科均有报道，其中包括米诺鱼、金鱼、鲤、河鲈、欧鳊、六线鱼、鲇、狗鱼、大西洋鳕、鲽等。杀鲑气单胞菌杀鲑亚种及通常所指杀鲑气单胞菌，该菌为革兰氏阴性小杆菌，无动力，在4-5℃温度范围内该菌生长不定，37℃不生长，最适生长温度22-25℃。
目前杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测方法主要有分离培养、生化鉴定，普通PCR和实时荧光定量PCR等分子生物学方法。常规的分离培养方法操作繁琐，检测周期长，一般需要3-5天完成，不能满足快速检测的需求；虽然近几年，PCR和实时荧光PCR分子生物学检测方法在病原菌检测中的应用越来越广，但这些方法的检测成本高，需要精密昂贵的热循环仪器，且对实验环境和操作者的技术也有严格的要求，因此限制了该技术的普遍适用性，不利于在基层的推广和应用。通过对现有资料文献检索发现，尚未有与本发明的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异性LAMP检测方法及核酸引物相关的报道。LAMP技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已广发应用于各领域病原生物的快速检测。本发明根据杀鲑气单胞菌杀鲑亚种检测靶点设计特异性引物，建立特异性强、灵敏度高、耗时短的检测方法。该方法在杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的病原种类鉴定、监测、疾病检疫方面具有一定的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异性LAMP检测引物；该引物可用于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的LAMP检测，具有检测结果特异性强、灵敏度高，实用性强。
按照本发明提供的技术方案，一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物，包括3对扩增引物，具体如下：
引物F3：5’-ACATAGGCGATGCCCTCA-3’；
引物B3：5’-GCCATGGGGATGGAGCT-3’；
引物FIP：
5’-GCGGATCTTGATCTCGCTGCG-AGCATGTGCCGGGTGTC-3’；
引物BIP：
5’-GCGACTACACACTGCTGCTGAT-TCGAAGTCATTGCCAAAGGA-3’；
引物LF:5’-GGGGTTGGTGCCTATGATGT-3’；
环引物LB:5’-CAACGGCAAACGGGTCAAC-3’。
所述杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物的应用，应用于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的快速检测，步骤为：以杀鲑气单胞菌杀鲑亚种大肠杆菌素受体colicinreceptor(fstC)为靶基因，通过环介导等温扩增技术LAMP方法，以待检样品DNA为模板，以所述3对扩增引物的核苷酸序列扩增靶基因，检测是否存在扩增产物，颜色变绿表明检测结果为阳性。
具体步骤如下：
(1)杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的DNA提取：采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的DNA，溶解在50μL、pH7.5的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；
(2)LAMP反应：1-3μL DNA,1-2μL、40pmol引物FIP和引物BIP，1-2μL、5pmol引物F3和引物B3，1-2μL、20μmol引物LF和引物LB，12.5-15μL RM混合液；灭菌蒸馏水补齐至25μL；
LAMP检测反应程序为：60-65℃扩增10-60min；80℃恒温环境终止反应2-5min，最后目视检测；
浊度检测：LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸镁沉淀，根据反应体系中是否形成白色沉淀定性判断LAMP反应是否发生，并根据浊度值对结果进行定量分析；
染色法检测：向扩增产物中添加1-2μL SYBR Green I核酸染料，有阳性扩增者显示为绿色，无阳性扩增者则显示红色；
(3)电泳检测：取5-10μL LAMP检测产物，以1.5％琼脂糖进行凝胶电泳检测，电压80-120V，TAE电泳缓冲液中含Tris碱0.04mol/L，EDTA 2mM/L，进行电泳检测。
RM混合液组成如下：20 mM pH 8.8的Tris-HCl缓冲液；10mM(NH4)2SO4；质量浓度0.1％的Tween 20；0.8 M甜菜碱；8mM MgSO4；1.4 mM dNTP和8UBst DNA聚合酶。
本发明的有益效果：本发明能快速、灵敏、准确的检测出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的感染，对药物的预防以及苗种检疫有重要的意义；LAMP检测技术具有特异性好和灵敏度高等特点，使得杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的快速检测成为可能。
附图说明
图1杀鲑气单胞菌杀鲑亚种LAMP引物的特异性检测。
图2杀鲑气单胞菌杀鲑亚种LAMP引物检测方法灵敏度试验。
图3杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异引物的电泳检测。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明检测系统中的特异性引物均通过核酸合成设备制备。核酸合成设备可委托相关基因公司合成。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异LAMP引物获得
根据NCBI网站上已收录的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种fscT序列(GenBank登录号AY505565)运用在线软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/e/)设计出一组特异性LAMP引物。所述引物的核苷酸序列如下所示：
F3：5’-ACATAGGCGATGCCCTCA-3’；
R3：5’-GCCATGGGGATGGAGCT-3’；
FIP：5’-GCGGATCTTGATCTCGCTGCG-AGCATGTGCCGGGTGTC-3’；
BIP：
5’-GCGACTACACACTGCTGCTGAT-TCGAAGTCATTGCCAAAGGA-3’；
LF:5’-GGGGTTGGTGCCTATGATGT-3’；
LB:5’-CAACGGCAAACGGGTCAAC-3’。
实施例2杀鲑气单胞菌杀鲑亚种LAMP引物的特异性检测
1、副溶血弧菌、鮰鱼爱德华氏菌、维氏气单胞菌、灿烂弧菌、鳗利斯顿氏菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌、无乳链球菌的基因组DNA提取：
细菌菌株DNA提取参照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)的手册指南进行(公众可从上海生工获取详细资料)，具体如表1所示，溶解在50μL TE缓冲液(pH7.8)，置-20℃保存备用。
表1
| 菌株名称 | 菌株号 |
| 副溶血弧菌 | ATCC17802 |
| 鮰鱼爱德华氏菌 | ATCC33202 |
| 维氏气单胞菌 | ATCC9071 |
| 灿烂弧菌 | ATCC25914 |
| 鳗利斯顿氏菌 | ATCC14181 |
| 表皮葡萄球菌 | ATCC14990 |
| 普通变形杆菌 | ATCC6380 |
| 无乳链球菌 | ATCC13813 |
| 杀鲑气单胞菌杀鲑亚种 | NCBI:JX164202 |
2、LAMP反应体系和程序：
LAMP检测体系为25μL的总量，具体包含：
最后用灭菌双蒸水补至25μL。
每个管中分别加入杀鲑气单胞菌杀鲑亚种、副溶血弧菌、鮰鱼爱德华氏菌、维氏气单胞菌、灿烂弧菌、鳗利斯顿氏菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌、无乳链球菌的基因组DNA模板1μL，最后用灭菌双蒸水补至25μL。
LAMP检测反应程序为：63℃扩增15min；80℃恒温环境终止反应2-5min，最后目视检测；
3、取1μL SYBR Green I添加入每个单独的扩增反应管中，目视检测检测。结果图1所示，副溶血弧菌、鮰鱼爱德华氏菌、维氏气单胞菌、灿烂弧菌、鳗利斯顿氏菌、表皮葡萄球菌、普通变形杆菌、无乳链球菌均无颜色变化，仅第一管添加了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的反应管显示为绿色，证明该引物特异性很好。
实施例3杀鲑气单胞菌杀鲑亚种特异引物LAMP检测方法灵敏度试验
通过杀鲑气单胞菌杀鲑亚种fstC基因克隆并构建质粒计数和梯度稀释制备108，107，106，105，104，103，102，101，100(copies/μL)的质粒。按实施例1中加入除DNA模板外的其他LAMP反应试剂进行，扩增产物目视检测，如图2所示。该引物可检测10(含)拷贝及以上的质粒模板，证明引物的灵敏度很好。图3所示电泳结果。
实施例4杀鲑气单胞菌杀鲑亚种LAMP临床检测及应用
根据事例1所述方法，随机抽取不同养殖塘口内养殖发病鲫、鲢等养殖动物的疥疮病灶处组织少许进行研磨，按照动物组织DNA提取试剂盒进行DNA提取，并作为检测模板进行LAMP反应，经证实在抽取的患病银鲫溃疡组织处可检测出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。检测得到测试图中，泳道2代表检测出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种，其余抽检组织未检测出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种，样本检测的同时现场进行了细菌学的分离培养及后续的PCR扩增、测序验证，证实患病银鲫溃疡处分离到的细菌为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种，此结果与LAMP反应鉴定结果一致，然而LAMP检测包括样本的制备至反应结束仅仅耗时1个小时，比常规的鉴定快捷、简便，非常适用于现场的应用。
Claims (2)
1. 一种杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物，其特征是：包括3对扩增引物，具体如下：
引物F3：5’-ACATAGGCGATGCCCTCA-3’；
引物B3：5’-GCCATGGGGATGGAGCT-3’ ；
引物FIP：
5’-GCGGATCTTGATCTCGCTGCG-AGCATGTGCCGGGTGTC-3’；
引物BIP：
5’-GCGACTACACACTGCTGCTGAT-TCGAAGTCATTGCCAAAGGA-3’；
引物LF: 5’-GGGGTTGGTGCCTATGATGT-3’；
环引物LB: 5’- CAACGGCAAACGGGTCAAC-3’。
2.权利要求1所述杀鲑气单胞菌杀鲑亚种快速检测引物的非诊断目的的应用，其特征是：应用于杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的快速检测具体步骤如下：
（1）杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的DNA提取：采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的DNA，溶解在50 µL、pH7.5的TE缓冲液中，置于-20℃保存备用；
（2）LAMP反应：1-3μL DNA, 1-2μL 、40pmol引物FIP 和 引物BIP，1-2μL 、5 pmol 引物F3和引物B3，1-2μL 、20μmol 引物LF 和 引物LB，12.5-15μL RM 混合液；灭菌蒸馏水补齐至25μL；
LAMP检测反应程序为：60-65℃ 扩增10-60min；80℃恒温环境终止反应2-5min，最后目视检测；
浊度检测：LAMP在合成DNA的同时还产生大量的焦磷酸镁沉淀，根据反应体系中是否形成白色沉淀定性判断LAMP反应是否发生，并根据浊度值对结果进行定量分析；
染色法检测：向扩增产物中添加1-2μL SYBR Green I核酸染料，有阳性扩增者显示为绿色，无阳性扩增者则显示红色；
（3）电泳检测：取5-10μL LAMP检测产物，以1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测，电压80-120V，TAE电泳缓冲液中含Tris碱0.04mol/L，EDTA 2mM/L，进行电泳检测；
所述RM 混合液组成如下：20 mM
pH 8.8的Tris-HCl缓冲液；10mM (NH4)2SO4；质量浓度0.1% 的Tween 20；0.8 M甜菜碱；8mM
MgSO4；1.4 mM dNTP和8U Bst DNA聚合酶。
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