CN106978496B - 一种黄颡四锚虫的pcr检测引物及荧光定量pcr检测试剂盒 - Google Patents

一种黄颡四锚虫的pcr检测引物及荧光定量pcr检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。提供了一对黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测的专用引物，包含该引物的试剂盒及其检测方法。所述引物包括上游引物18s‑Ⅱ‑F和下游引物18s‑Ⅱ‑R，18s‑Ⅱ‑F的序列为：5’‑CTGGTCATGGCTCTGCTGAC‑3’，18s‑Ⅱ‑R的序列为：5’‑CGTTAAAGGAGCATCAGCTG‑3’。本发明首次提供了黄颡四锚虫18s基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR对待测样本中18s可变区基因检测成为可能。

Description

一种黄颡四锚虫的PCR检测引物及荧光定量PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及鱼类寄生虫检测领域，具体涉及一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。
背景技术
寄生于黄颡鱼鳃上的黄颡四锚虫(Bychowskyella pseudobagri Achmerov)分布很广，东北、山东、浙江、湖北、广东、江苏、福建、云南、四川等均有记录，而且宿主亦广泛，它可寄生于多种黄颡属鱼类及鳠属(Hemibagrus)鱼类鳃上。小型虫体，体长0.210-0.588mm，体宽0.060-0.168mm。属于一种单殖吸虫，寄生于鱼类鳃部时表现出明显的“群居”现象，少量寄生黄颡四锚虫时，养殖鱼类并没有明显症状，多表现为吃食量下降或暗浮头现象。大量寄生时，病鱼呼吸困难，游动缓慢，鳃部明显浮肿，鳃盖张开，鳃上粘液增多，鳃丝肿胀或粘连，严重时发生变性或坏死，鳃因贫血而呈现苍白色或花鳃状。黄颡四锚虫流行与春末夏初，对鱼苗和鱼种的危害较大，大量寄生虫常引起苗种的大批死亡。寄生于大规格鱼种或成鱼时常引起养殖鱼类继发细菌寄生而产生大量死亡。
黄颡四锚虫由于体型小，小量寄生时无症状，因此传统的检测方法，并不适合该寄生虫。而在检测和诊断技术中，荧光定量聚合酶链反应(Real-time FluorescentQuantitative Polymerase Chain Reaction,RtFQ-PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在该研究领域得到广泛应用。目前对于黄颡四锚虫的检测国内尚没有荧光定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼鳃内或环境水体中是否存在寄生虫的技术。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一对黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测的专用引物，包含该引物的试剂盒及其检测方法。
本发明的技术方案是：
一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，所述引物包括上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R，
18s-Ⅱ-F的序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
18s-Ⅱ-R的序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
所述上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1：1。
一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组分：
Figure GDA0002423429210000011
Figure GDA0002423429210000021
其中，
上游引物为18s-Ⅱ-F，序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
下游引物为18s-Ⅱ-R，序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括7.5×107拷贝/μL的强阳性对照和469拷贝/μL的临界阳性对照质粒；所述阴性对照为无菌水。
所述阳性对照的核苷酸序列是：
CTGGTCATGGCTCTGCTGACTTGTCAGTGGGGAAATGGCTAGCTGGTATATTCACTCATAGCTTCGCAGCTGTGTCCATGTGTCCTCGGACGTATGGATGGCGTTGGGTGTCAGCTGATGCTCCTTTAACG。
所述阳性对照质粒的构建方法包括如下步骤：
1)、制备黄颡四锚虫的DNA模板：
将形态鉴定好的黄颡四锚虫置于1.5mL的EP管中，加入180μL组织裂解液TL，20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于55℃水浴3h或者直到消化完全；
加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心30-60s；
加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s；
加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，并重复该步骤一次；
取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，加入100μL无菌水，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，并将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到黄颡四锚虫DNA模板，在-20℃保藏备用；
2)、PCR体系扩增：
PCR体系为：
黄颡四锚虫DNA模板5μL
10pmol/μL的上游引物18s-Ⅱ-F 2.0μL，
10pmol/μL的下游引物18s-Ⅱ-R 2.0μL，
5U Taq DNA聚合酶0.6μL，
2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL，
DEPC水 补充至25μL；
PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环；
3)、将步骤2)得到的黄颡四锚虫的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离得到靶标条带，用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收靶标DNA；
4)、将回收的DNA在16℃下加入到连接体系中，并于16℃下放置10h；
5)、将步骤4)得到的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落；
6)、挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体通用引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子；
7)、将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中，37℃下200rpm摇菌培养10h，并取1mL用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，从而得到阳性对照质粒，测定提取的阳性对照质粒DNA的浓度，稀释后作为阳性对照用于PCR检测。
一种黄颡四锚虫的检测方法，使用上述的试剂盒进行检测，包括如下步骤：
1)、制备DNA模板：取样品一小块鳃组织块，加入200μL Millipore H2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12000rpm离心1min，弃上清，加入200μL Millipore H2O重悬，充分混匀后取50μL加入到200μL 6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12000rpm离心3min，取上清作为PCR的模板；
2)、实时荧光定量PCR扩增：
配置PCR反应体系，每25μL的PCR反应体系具体包括：
Figure GDA0002423429210000031
其中，12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液包括2.5μL的10×buffer、2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水。
PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环；
3)、结果判断：观察实时荧光定量PCR扩增曲线，若获得的荧光扩增曲线Ct值低于临界对照Ct值，则样品患有黄颡四锚虫病。
本发明的有益效果是：1)首次提供了黄颡四锚虫18s基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR对待测样本中18s可变区基因检测成为可能；2)本检测方法与黄颡四锚虫其他常规检测方法，如显微镜观察法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，具有操作程序简单易用的特点，本试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用，检测效率得到了很大的提高；3)本检测方法不仅能够评价鱼体的黄颡四锚虫寄生情况，同时也可用于水体中黄颡四锚虫的检测。
本发明能为快速、准确地检测出黄颡四锚虫提供保证，为预防疾病，科学用药和保障鱼类健康提供了保障。依据本发明专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼类鳃及水体中黄颡四锚虫18s可变区基因的核苷酸检测。
附图说明
图1是采用三对引物分别对于黄颡四锚虫的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图2是采用三对引物对六种非靶标鱼类寄生虫的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图3是利用第二对引物18s-Ⅱ-F/R进行的阳性对照标准品实时荧光定量PCR扩增曲线图；
图4是利用第二对引物18s-Ⅱ-F/R对鱼DNA样本进行的实时荧光定量PCR扩增曲线图。
具体实施方式
本发明的一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，包括上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R，
18s-Ⅱ-F的序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
18s-Ⅱ-R的序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
所述上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1：1。
一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组分：
Figure GDA0002423429210000041
其中
上游引物为18s-Ⅱ-F，序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
下游引物为18s-Ⅱ-R，序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括7.5×107拷贝/μL的强阳性对照和469拷贝/μL的临界阳性对照质粒；所述阴性对照为无菌水。
所述阳性对照的核苷酸序列是：
CTGGTCATGGCTCTGCTGACTTGTCAGTGGGGAAATGGCTAGCTGGTATATTCACTCATAGCTTCGCAGCTGTGTCCATGTGTCCTCGGACGTATGGATGGCGTTGGGTGTCAGCTGATGCTCCTTTAACG。
所述阳性对照质粒的构建方法包括如下步骤：
1)、制备黄颡四锚虫的DNA模板：
将形态鉴定好的黄颡四锚虫置于1.5mL的EP管中，加入180μL组织裂解液TL，20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于55℃水浴3h或者直到消化完全；
加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心30-60s；
加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s；
加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，并重复该步骤一次；
取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，加入100μL无菌水，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，并将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到黄颡四锚虫DNA模板，在-20℃保藏备用；
2)、PCR体系扩增：
PCR体系为：
黄颡四锚虫DNA模板5μL
10pmol/μL的上游引物18s-Ⅱ-F 2.0μL，
10pmol/μL的下游引物18s-Ⅱ-R 2.0μL，
5U Taq DNA聚合酶0.6μL，
2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL，
DEPC水 补充至25μL；
PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环；
3)、将步骤2)得到的黄颡四锚虫的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离得到靶标条带，用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收靶标DNA；
4)、将回收的DNA在16℃下加入到连接体系中，并于16℃下放置10h；
5)、将步骤4)得到的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落；
6)、挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体通用引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子；
7)、将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中，37℃下200rpm摇菌培养10h，并取1mL用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，从而得到阳性对照质粒，测定提取的阳性对照质粒DNA的浓度，稀释后作为阳性对照用于PCR检测。
一种使用上述试剂盒检测黄颡四锚虫的检测方法，包括如下步骤：
1)、制备DNA模板：取样品一小块鳃组织块，加入200μL Millipore H2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12000rpm离心1min，弃上清，加入200μL Millipore H2O重悬，充分混匀后取50μL加入到200μL 6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12000rpm离心3min，取上清作为PCR的模板；
2)、实时荧光定量PCR扩增：
配置PCR反应体系，每25μL的PCR反应体系具体包括：
Figure GDA0002423429210000061
其中，12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液包括2.5μL的10×buffer、2μL的10mMdNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水。
PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环；
3)、结果判断：观察实时荧光定量PCR扩增曲线，若获得的荧光扩增曲线Ct值低于临界对照Ct值，则样品患有黄颡四锚虫病。
下面结合实施例对本发明作具体说明。
本发明的实验方法均参照《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯等主编，科学出版社2005年出版)所建议的实验条件。
实施例1用于对黄颡四锚虫18s可变区基因进行荧光定量PCR检测的引物设计及筛选
1、生物信息学方法设计引物及进行引物筛选
根据文献信息，对中科院水生生物研究所筛选并获得的黄颡四锚虫18s(GenBank登录号：KY680236)可变区进行分析，同时下载12种近源寄生虫18s基因序列作为参考序列，请见下表。
参考序列物种名称(拉丁名) GenBank
Mizelleus indicus KR296800
Bychowskyella tchangi KT852455
Bychowskyella fossilisi KT852454
Mizelleus longicirrus KR296801
Hamatopeduncularia elongata KT252896
Thysanotohaptor rex KT252903
Neocalceostomoides spinivaginalis KT252904
Hamatopeduncularia thalassini KT252900
Chauhanellus chauhani KT252897
Euzetrema knoepffleri AJ564212
Pseudomurraytrema ardens AJ228793
Lamellodiscus donatellae FN296214
通过Clustal X进行比对后，选择合适区域设计引物，该区域在黄颡四锚虫18s基因可变区，是分辨黄颡四锚虫的特异性序列，但相对于参考序列至少存在10％-30％的差异，选定区域后采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物。将所提取的备选引物按以下要求进行筛选：
1)引物在可变区内设计并具有特异性；
2)产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)；
3)引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大；
4)G+C含量在40％～60％之间；
5)碱基要随机分布，尽量均匀；
6)引物自身不能有连续超过4个碱基的互补；
7)引物之间不能有连续超过4个碱基的互补；
8)引物5’端可以修饰；
9)3’端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域(2-3个)；
10)引物整体设计自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9KJ/mol；
11)引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区；
12)引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源；
13)查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似；
14)Tm值在55-65℃之间。
所用PCR引物由上海生工公司合成，引物要求PAGE纯化，到货时为引物干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，引物至100pmol/μL贮存液后备用。
针对黄颡四锚虫18s可变区基因，共设计了3组上下游引物，序列如下：
18s-Ⅰ(154bp)
上游引物18s-Ⅰ-F：5’-CAAATCAAACGCTTCGGCGTG-3’；
下游引物18s-Ⅰ-R：5’-TCCCCGTTACCCGTCATAATC-3’；
18s-Ⅱ(131bp)
上游引物18s-Ⅱ-F：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’；
下游引物18s-Ⅱ-R：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’；
18s-Ⅲ(181bp)
上游引物18s-Ⅲ-F：5’-ACCTCCATGTCGTTACCTTG-3’；
下游引物18s-Ⅲ-R：5’-ACCAGGCAAATCATGCTCAC-3’。
2、分子生物学实验进行引物检测
2.1实验材料及试剂
材料：鱼类常见致病黄颡四锚虫，6个阴性对照，即黄颡华指环虫(Sinidactylogyrus pseudobagrus)，黄颡伪锚盘虫(Pseudoancylodiscoides gigi)，月斧伪锚盘虫(Pseudoancylodiscoides strelkowi)，河鲈锚首虫(Ancyrocephalusmogurndae)，东方车轮虫(Trichodina orientalis)和鲤斜管虫(Chilodonella cyprini)。七个寄生虫均来自中科院武汉水生生物研究所。用动物DNA提取试剂盒(Tiangen)提取寄生虫基因组DNA。同时分别提取患病鱼的鳃、及混合有黄颡四锚虫的水体中微生物的基因组DNA，用于评价PCR体系的特异性和灵敏度。
试剂：5U/μL Taq DNA polymerase(Promega，含10×reaction buffer和25mM Mg2 +)、10mM dNTPs(Promega)、DNA marker I(Tiangen)；Millipore H2O(Millipore公司生产的超纯水)高压灭菌后分装，于-20℃保存备用。
2.2引物、寄生虫测试
用常规PCR测试所设计的引物及供试寄生虫，PCR反应体系(10pmol/μL的上游引物18s-Ⅱ-F 2.0μL，10pmol/μL的下游引物18s-Ⅱ-R 2.0μL，样品DNA 5μL，5U Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水的混合物；PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环)根据各组分的浓度配制，扩增程序根据引物的Tm值及产物的大小编写。常规PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物，结果如图1所示。
2.3黄颡四锚虫常规PCR方法检测三对引物结果
2.3.1常规PCR测试寄生虫及设计的引物
设计的三对引物序列如下：
18s-Ⅰ
上游引物18s-Ⅰ-F：5’-CAAATCAAACGCTTCGGCGTG-3'；
下游引物18s-Ⅰ-R：5’-TCCCCGTTACCCGTCATAATC-3'；
18s-Ⅱ
上游引物18s-Ⅱ-F：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3'；
下游引物18s-Ⅱ-R：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3'；
18s-Ⅲ
上游引物18s-Ⅲ-F：5’-ACCTCCATGTCGTTACCTTG-3'；
下游引物18s-Ⅲ-R：5’-ACCAGGCAAATCATGCTCAC-3'.
从图1可以看出，对于黄颡四锚虫，病鱼鳃部组织以及混有黄颡四锚虫的水体，所设计的三对引物均可扩增出靶标条带，表明黄颡四锚虫、自行设计的引物以及使用的PCR扩增体系均可用于后续的实验。
2.3.2常规PCR检测体系的特异性
对于常见的六种非靶标鱼类寄生虫，使用建立的常规PCR检测体系(如2.2中所述)均为检测阴性，对黄颡四锚虫为检测阳性，这表明所建立的常规PCR检测体系具有极好的特异性，可以用于黄颡四锚虫的快速检测(如图2所示)。
3、实时荧光定量检测引物扩增效率
3.1阳性对照质粒及标准模板的制备
用建立的常规PCR体系扩增黄颡四锚虫的目的片段，2％琼脂糖凝胶电泳分离得到特定的靶标条带。用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶标DNA。将回收的部分DNA16℃下加入到连接体系中(10μL，含线性克隆载体、连接酶和连接酶buffer)，并在16℃下放置10h后将全部的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落。挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子。将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中培养过夜，并取1mL提取质粒DNA(普通质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，从而得到阳性对照物。测定提取的质粒DNA的浓度，稀释到一定倍数作为阳性对照用于PCR检测。
3.2引物PCR扩增效率检测
引物的筛选原则为：在目的可变区中选择PCR扩增效率较高(90～110％的扩增效率比较合适)的引物作为候选引物。
3.2.1梯度模板准备
将阳性对照物DNA(上述3.1所得)，用无菌水以20倍梯度稀释，作为荧光定量PCR反应体系优化用模板。取20×、400×、8000×、160000×、3200000×稀释度，编号依次对应为L1、L2、L3、L4、L5。分装后于-80℃保存备用。
3.2.2荧光定量PCR缓冲液及PCR程序
PCR反应体系为：10pmol/μL的上游引物2.0μL，10pmol/μL的下游引物2.0μL，样品DNA 5μL，5U Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水的混合物；
所述PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环。结果如表1所示。
3.2.3结果
表1不同引物扩增效率
引物 L1 L2 L3 L4 L5 扩增效率
18s-I 18.23 21.40 24.58 27.75 30.92 157.23％
18s-II 14.94 19.15 22.71 27.13 31.78 101.72％
18s-III 13.95 19.25 24.55 29.85 35.15 76.02％
注：表格中注明值为Ct值。
根据扩增效率来看，选择II号引物对18s-II-F/R继续后续实验(因为90～110％的扩增效率比较合适)。
实施例2：荧光定量PCR引物用量的优化
1、荧光定量PCR引物用量的第一次优化
用稀释好的L1(20×)和L2(400×)阳性对照质粒作为引物量优化的模板，分别对引物的上下游的用量进行梯度优化，引物工作液浓度10pmol/μL，PCR反应体系为：上下游引物量见表2，样品(模板)DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBRgreen I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环。结果如表2所示，从结果可以分析出，PCR引物在以下梯度组合可以正常工作，其中引物组合(2.0μL×10pmol/μL、2.0μL×10pmol/μL)、(1.5μL×10pmol/μL、1.5μL×10pmol/μL)扩增效率高于引物组合(2.5μL×10pmol/μL、2.5μL×10pmol/μL)的扩增效率，这三组引物组合的扩增效率又明显高于其他几组的扩增效率，因此将上游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL、下游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL作为引物用量进行第二次筛选。
表2实时荧光定量PCR引物用量的第一次优化结果
Figure GDA0002423429210000111
注：表格中注明值为Ct值，“1.0,1.5,2.0,2.5”为25μL PCR体系中引物(浓度为10pmol/μL)的用量(μL)。
2、荧光定量PCR引物用量的第二次优化
为测试不同引物用量组合对于试剂灵敏度的影响，选用浓度更低的DNA模板进行测试。使用阳性对照提取的DNA(实施例l中扩增得到)进行梯度稀释取L3(8000×)、L4(160000×)，L5(3200000×)作为第二次引物量优化的模板，对各组引物在第一次优化基础上进一步进行优化。PCR反应体系为：上下游引物量见表3，样品(模板)DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环。结果如表3所示，本次优化上游引物在2.0μL，下游引物在2.0μL时PCR扩增效率最高，选择此体积为本发明实时荧光定量PCR引物的使用体积。
表3实时荧光定量PCR引物用量的第二次优化结果
Figure GDA0002423429210000121
注：表格中注明值为Ct值，“1.5,2.0”为25μL PCR体系中引物(浓度为10pmol/μL)的用量(μL)。
基于以上优化结果，本发明黄颡四锚虫实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量基本如表4所示。
表4黄颡四锚虫实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量
组份 规格 用量
实时荧光定量PCR反应缓冲液 2× 12.5μL
DNA模板 5μL
引物用量 10pmol/μL 上游2.0μL，下游2.0μL
Taq DNA聚合酶 5U 0.6μL
无菌水 补充至25μL
实施例3标准曲线的建立
1、阳性对照质粒荧光定量PCR检测
将阳性对照质粒DNA作为模板进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行20倍系列稀释成1：3.0×1010拷贝/μL；2：1.5×109拷贝/μL；3：7.5×107拷贝/μL；4：3.75×106拷贝/μL；5：1.88×105拷贝/μL；6：9.38x103拷贝/μL。每个稀释度重复平行试验3次。标准品检测PCR反应体系为：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，质粒DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreen I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示(图3，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值，1：3.0×1010拷贝/μL；2：1.5×109拷贝/μL；3：7.5×107拷贝/μL；4：3.75×106拷贝/μL；5：1.88×105拷贝/μL；6：9.38x103拷贝/μL)
2、标准曲线的绘制
根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线，实时荧光定量PCR检测阳性对照的线性范围是3×1010～1×104拷贝/μL反应体系，标准曲线的相关系数R平方值为0.9989(y＝-3.2813x+44.668)，荧光定量PCR反应的扩增效率为101.72％。标准曲线显示：本发明建立的黄颡四锚虫18s可变区基因实时荧光定量PCR检测方法有至少6个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
实施例4黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测试剂盒
黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测试剂盒包括各自独立包装的反应液1mL/管和Taq聚合酶(5U，每个反应0.6μL)30μL/管，两试剂管再共同组装在一外包装盒中。其中，反应液为2×buffer(每12.5μL用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)。实施例2确定的组合2.0μL上游引物、2.0μL下游引物和2.9μL的无菌水按比例混合，配制时将每一组分乘以一个系数(如10000，根据生产量定)，混匀后，分装，每支1mL为方便检测。试剂盒还包括另外各自独立包装的强阳性对照7.5×107拷贝/μL(400×稀释度的阳性对照L2)、临界阳性对照469拷贝/μL(64000000×稀释度的阳性对照品L6)、DNA提取液((用于提取待测鱼鳃或水体内的DNA)(配方为：chelex-100)及阴性对照品(无菌水)，并与反应液和Taq聚合酶试剂管共同组装在外包装盒中。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环。
分别取5μL阳性对照L2、L6于PCR反应体系中反应，反应体系包括：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，阳性对照5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环。结果(如表5所示)表明，经过5次重复测定结果比较稳定，确定为本发明试剂盒的阳性对照。
表5阳性对照的测试结果
重复 1 2 3 4 5
L2 18.8 18.5 18.7 18.5 18.9
L6 36.1 36.5 36.4 36.8 36.3
实施例5黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测试剂盒的性能评估
为对本发明试剂盒的性能进行评估，按照产品优化后的工艺多次配制出产品小样对试剂盒的灵敏度、特异性、精确度以及稳定性，用试生产的产品进行临床试验，以考查产品的性能。
1、试剂盒检测的线性范围和灵敏度测试
将黄颡四锚虫18s可变区基因人工构建质粒pBlue-18s-II用DEPC水稀释液进行20倍系列梯度稀释至1280000000×，即灵敏度质控品(取L1(20×稀释度)、L2(400×稀释度)、L3(8000×稀释度)、L4(160000×稀释度)、L5(3200000×稀释度)、L6(64000000×稀释度)、L7(1280000000×稀释度)作为评价试剂盒灵敏度的质控品，编号L1-L7，分装后于-80℃保存备用。使用本发明试剂盒进行检测。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，阳性对照质粒DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环。结果(如表6所示)显示，在L6(64000000×稀释度)时试剂盒多数情况下可检出，对不同批次的产品小样进行灵敏度及线性分析，结果显示引物均可稳定测出L6(64000000×稀释度)的阳性对照质粒DNA样品，对于L7(1280000000×稀释度)样品，本发明试剂盒不能检出，所以本发明试剂盒最低可检出含L6(64000000×稀释度)的人工构建质粒，具有较高的灵敏度。故设L6(64000000×稀释度)为最低检出值。
表6本发明试剂盒线性范围的测试结果
稀释梯度 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7
Ct值 14.83 19.15 22.69 27.14 31.72 36.03 No Ct
2、试剂盒检测的特异性分析
采用不同批次的产品小样对六种主要鱼类寄生虫(N1：黄颡华指环虫，N2：黄颡伪锚盘虫，N3：月斧伪锚盘虫，N4：河鲈锚首虫，N5：东方车轮虫，N6：鲤斜管虫)进行检测。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，寄生虫样品DNA 5μL，5UTaq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer，2μL的10mM dNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μL DEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环。结果(表7)N1-N6均未检出Ct值，证明本发明的试剂盒具有良好的特异性。
表7本发明试剂盒特异性的测试结果
样品 N1 N2 N3 N4 N5 N6
Ct值 No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct
3、试剂盒批内检测的精密性
使用精密性质控品(将人工构建的pBlue-18s-II质粒稀释至8000×作为精密性质控品用于对阳性对照质粒DNA检测试剂盒的质量控制。对反应体系分别进行10次重复检测，PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，阳性对照质粒DNA5μL，Taq DNA聚合酶(5U)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μLDEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环。10个精密度质控品Ct值的CV％<10％(如表8所示，CV表示变异系数)，证明本发明的试剂盒具有良好的精密性。
表8本发明试剂盒的精密度测试结果
样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CV％
Ct值 22.7 22.7 22.6 22.7 22.7 22.6 22.7 22.6 22.8 22.7 0.27
4、试剂盒的准确性测定
采用测序方法进行确认本发明试剂盒的准确性。对扩增产物进行测序，序列与预期结果完全一致，证明本发明试剂盒的检测结果是准确的。
5、试剂盒的稳定性测定
5.1试剂盒的稳定性
产品的稳定性取决于各个组成成份的稳定性。本发明中配制实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照质粒在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最长保存一周仍未见性能下降。
在为临床试验准备的产品运输中，全套产品(包括实时荧光定量PCR反应液、TaqDNA聚合酶、试剂盒对照品)，在先后经历为期3天的-20℃冷冻、4℃长途运输、-20℃冷冻、复融等一系列往返过程后，使用质控品检测，检测结果未见有显著差异。表明本发明试剂盒的各组份相当稳定。
5.2对照品的稳定性
对照品的稳定性对试验结果的分析判断有很大影响，本试剂盒的对照品主要是对反应体系进行质量控制。本试剂盒使用了一份强阳性对照(L2)、一份临界阳性(L6)和一份阴性对照(H2O)，对其进行冻融检测。实验结果如表9所示，结果表明本发明试剂盒中的对照品也具有良好的稳定性。
表9阳性对照品的冻融试验结果
Figure GDA0002423429210000161
实施例6黄颡四锚虫18s可变区基因荧光定量PCR检测
1、提取鱼取样组织的DNA
采集了3份患病及7份健康鱼样品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小块鳃组织块，加入200μL Millipore H2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12000rpm离心1min，弃上清，加入200μL Millipore H2O重悬。充分混匀后取50μL加入到200μL 6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12000rpm离心3min，取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。剩余的模板于-20℃保存以备复检。
2、用实施例1、2中建立的方法检测鱼DNA样本
检测PCR反应体系为：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，鱼DNA 5μL，5U Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer，2μL的10mM dNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μL DEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，55℃20s，72℃20s，75℃5s，读板共40个循环。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图4所示(图中横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值)，图中的横线为荧光阈值，当每个样品PCR反应管内荧光信号达到此阈值时，所经历的循环数为该样品的Ct值。各样本的CT值与该样本的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。强阳性对照的Ct值为19.15，说明实验操作正确。10份样本的荧光定量实验结果显示，只有3份患病鱼样本荧光信号达到阈值，Ct分别为14.9,15.1,15.1，低于临界对照(36.03)；而剩下7份健康鱼样本的荧光信号未达到阈值，因此无对应的Ct值(结果显示为NA)。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州宏盛水产科技有限公司
<120> 一种黄颡四锚虫的PCR检测引物、荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
<130> 2017
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctggtcatgg ctctgctgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgttaaagga gcatcagctg 20
<210> 3
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctggtcatgg ctctgctgac ttgtcagtgg ggaaatggct agctggtata ttcactcata 60
gcttcgcagc tgtgtccatg tgtcctcgga cgtatggatg gcgttgggtg tcagctgatg 120
ctcctttaac g 131
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaatcaaac gcttcggcgt g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccccgttac ccgtcataat c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acctccatgt cgttaccttg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accaggcaaa tcatgctcac 20

Claims (6)

1.一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，其特征在于，所述引物包括上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R，
18s-Ⅱ-F的序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
18s-Ⅱ-R的序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
2.根据权利要求1所述的一种黄颡四锚虫的PCR检测引物，其特征在于，所述上游引物18s-Ⅱ-F和下游引物18s-Ⅱ-R的摩尔浓度比是1：1。
3.一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
Figure FDA0002423429200000011
其中，
上游引物为18s-Ⅱ-F，序列为：5’-CTGGTCATGGCTCTGCTGAC-3’，
下游引物为18s-Ⅱ-R，序列为：5’-CGTTAAAGGAGCATCAGCTG-3’。
4.根据权利要求3所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括7.5×107拷贝/μL的强阳性对照和469拷贝/μL的临界阳性对照质粒；所述阴性对照为无菌水。
5.根据权利要求4所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照的核苷酸序列是：
CTGGTCATGGCTCTGCTGACTTGTCAGTGGGGAAATGGCTAGCTGGTATATTCACTCATAGCTTCGCAGCTGTGTCCATGTGTCCTCGGACGTATGGATGGCGTTGGGTGTCAGCTGATGCTCCTTTAACG。
6.根据权利要求4所述的一种黄颡四锚虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒的构建方法包括如下步骤：
1)、制备黄颡四锚虫的DNA模板：
将形态鉴定好的黄颡四锚虫置于1.5mL的EP管中，加入180μL组织裂解液TL，20mg/ml的蛋白酶K 20μL，于55℃水浴3h或者直到消化完全；
加入200μL结合液CB和100μL异丙醇，13000rpm离心5min，将上清加入一个吸附柱AC中，13000rpm离心30-60s；
加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s；
加入600μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，并重复该步骤一次；
取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，加入100μL无菌水，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，并将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到黄颡四锚虫DNA模板，在-20℃保藏备用；
2)、PCR体系扩增：
PCR体系为：
黄颡四锚虫DNA模板 5μL
10pmol/μL的上游引物18s-Ⅱ-F 2.0μL，
10pmol/μL的下游引物18s-Ⅱ-R 2.0μL，
5U Taq DNA聚合酶0.6μL，
2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL，
DEPC水补充至25μL；
PCR反应条件为：95℃3min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，75℃5s,读板共40个循环；
3)、将步骤2)得到的黄颡四锚虫的目的片段用2％琼脂糖凝胶电泳分离得到靶标条带，用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收靶标DNA；
4)、将回收的DNA在16℃下加入到连接体系中，并于16℃下放置10h；
5)、将步骤4)得到的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养至长出菌落；
6)、挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体通用引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子；
7)、将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中，37℃下200rpm摇菌培养10h，并取1mL用质粒小提试剂盒提取质粒DNA，从而得到阳性对照质粒，测定提取的阳性对照质粒DNA的浓度，稀释后作为阳性对照用于PCR检测。
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