CN103014164B - 贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。本发明提供了检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有检测时间短、灵敏度高和特异性强的特点。

Description

贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

背景技术

包拉米虫（Bonamia）是严重危害贝类养殖业的主要疾病，包拉米虫病（Bonamiasis）为OIE规定的必报贝类传染病之一。该病虫体寄生在贝类的血淋巴细胞中，可引起相当高的流行率和死亡率。派琴虫(Perkinsus)派琴虫病能使贝壳不能闭合,套膜收缩,性腺发育抑制,生长缓慢,偶尔也会出现脓肿,死亡率可高达95%。这两种原虫是贝类最易感并且致死率也非常高的病，更为严重的是,人们食用了感染派琴虫的贝类还可能出现呕吐、腹泻等不适症状，因此迫切需要建立一种快速敏感的包拉米虫和派琴虫的检测方法，在感染早期就能检测出这些病原，从而为这些病的控制争取宝贵的时间。

目前，国内检测这两种原虫的方法有组织和细胞学检测法、电镜检测法、原位杂交法和RFTM检测法等，但这些检测存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等缺点，在实际应用中具有一定的局限性。

荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点。在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的方法来进行批量的快速检测。多重荧光PCR采用多对引物扩增检测多个模板，克服了单重荧光PCR的不足。但是建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道。

目前，还未见有应用多重荧光定量PCR技术对贝类包拉米虫和派琴虫进行检测和诊断的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的引物组。

本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。

本发明的另一个目的是提供检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂A。

本发明提供的试剂A由上述的引物组、探针A和探针B组成；

所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料C；

所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料D。

上述试剂中，所述报告荧光染料A为ROX，所述报告荧光染料B为FAM；所述淬灭荧光染料C为ECLIPSE1,所述淬灭荧光染料D为ECLIPSE2；

所述试剂中所述引物1、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为2:2:2:1:1:1。

本发明的第三个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR试剂B。

本发明提供的试剂B，由上述的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。

本发明提供的试剂B，所述引物1、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0.4μM；

所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为0.2μM。

本发明的第四个目的是提供一种检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B。

上述的引物组或上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有贝类包拉米虫和/或派琴虫产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有贝类包拉米虫和/或派琴虫为用上述的试剂A或上述的试剂B或上述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光RT-PCR反应。

若在610nm激发光下（ROX）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有包拉米虫；反之，则样品中不含有包拉米虫；

若在530nm激发光下（FAM）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有派琴虫；反之，则样品中不含有派琴虫；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均为S型曲线，则样品中含有包拉米虫和派琴虫；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有包拉米虫和派琴虫。

本发明的实验证明，本发明的引物和方法具有如下优点：

1）检测时间短

本研究通过Primer Express 3.0软件，设计了多套探针和引物，通过分析其引物之间的二聚体，筛选出了2套探针和引物。对筛选出的2套探针和引物进行不同浓度的配比，选出了其最佳引物和探针的浓度组合，建立了贝类包拉米虫和/或派琴虫的二重荧光定量PCR方法。该方法实现了一管二检的目的，仅需要约30分钟的时间，并且反应结果可以直接通过电脑观察，而常规的PCR方法起码需要3.5小时来完成扩增反应，然后需要花2小时进行凝胶电泳来观察结果；

2）检测敏感性高且特异性强

当贝类包拉米虫和派琴虫同时存在时，所建立的方法对其检测的CT值与单个原虫检测的CT值比较，结果基本一样，并未影响对贝类包拉米虫和派琴虫的检出及检出的敏感性。另外，建立的方法可以对样品中相应的病原含量进行定量，并且检测的敏感性非常高，均能检测到200个拷贝的贝类包拉米虫和派琴虫，比常规PCR方法敏感性高10倍，可用于贝类包拉米虫和派琴虫疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此该方法的建立对贝类包拉米虫和派琴虫的防治有重要意义。

附图说明

图1为普通PCR检测包拉米虫和派琴虫的敏感性

图2为检测包拉米虫的敏感性及标准曲线

图3为检测派琴虫的敏感性及标准曲线

图4为检测包拉米虫的特异性

图5为检测派琴虫的特异性

图6为批内重复性

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用一些材料和试剂如下：

Lightcycler2.0荧光定量PCR仪(Roche)。海洋动物组织基因组提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自广州东盛生物公司；pMD-18T试剂盒和Premix ExTaqTM购自大连宝生物公司；PCR试剂和质粒提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

包拉米虫记载在“中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究”，基因组学与应用生物学，2012，31（6）：1-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；

单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌记载在“3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立”，生物技术通讯，2012，23（5）：713-717，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物与Taqman探针的设计与合成

根据GenBank中包拉米虫和派琴虫的保守序列，采用Primer Express 3.0软件，设计两对特异性引物和两条Taqman探针（表1）。

表1为引物和TaqMan探针序列（5’-3’）

实施例2、荧光定量RT-PCR检测

一、荧光定量RT-PCR检测方法的确定

1、样本的制备

参照海洋动物组织基因组抽提试剂盒说明书，提取包拉米虫、单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫、副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的基因组DNA。

2、标准品的制备

以上述得到的包拉米虫的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含25μL PCR Mix、1μmol/L引物（Bonamia(760)-1和Bonamia(760)-2，见表2）、19μLddH₂O、4μLDNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，52℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min。得到760bpPCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到Bonamia760质粒；测序Bonamia760质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为760bp(OIE推荐检测包拉米虫引物http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online），说明为阳性质粒，含有包拉米虫保守序列；

以上述得到的派琴虫的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL(含25μL PCR Mix、1μmol/L引物（PerkITS-85(703)和PerkITS-750(703)，见表2）、19μLddH₂O、4μLDNA模板)，反应条件为：95℃预变性5min，94℃60s，52℃60s，72℃60s，35个循环，72℃延伸10min。得到703bp PCR产物，将该PCR产物克隆至pMD-18T载体，得到Perkinsus703质粒；测序Perkinsus703质粒，该质粒中含有的PCR产物大小为703bp(OIE推荐检测派琴虫引物http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online），说明为阳性质粒，含有派琴虫保守序列。

表2试验所使用引物序列

将Bonamia760质粒和Perkinsus703质粒作为阳性标准品，按照文献（Vaitomaa,J.,Rantala A.,Halinen K.,Rouhiainen L.,Tallberg P.,Mokelke L.& SivonenK.(2003)Quantitative Real-Time PCR for Determination of MicrocystinSynthetase E Copy Numbers for Microcystis and Anabaena in Lakes.Applied andEnvironmental Microbiology.69:7289-7297.）计算拷贝数，结果为拷贝数分别为2.1×10¹⁰拷贝/μl和1.9×10¹⁰拷贝/μl。

3、荧光定量RT-PCR的反应体系中引物和探针浓度的确立

用Bonamia760质粒和Perkinsus703质粒（二者的拷贝比为1:1）作为模板，将表1中的引物和探针在终浓度为0.2-0.8umol/L之间，进行不同浓度的配比进行荧光定量RT-PCR，选择引物和探针的最佳浓度。

扩增反应总体积为20uL，其中Premix ExTaq10uL（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR390S）；2uL模板，终浓度均为0.2-0.8umol/L的Bonamia（86）F、Bonamia（86）R和Bonamia（86）P；终浓度均为0.2-0.8umol/L的Perkinsus（118）F、Perkinsus（118）R和Perkinsus（118）P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合，置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行50个循环；最后于40℃结束反应。

结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，包拉米虫上、下游引物及探针终浓度分别为0.4umol/L，派琴虫上、下游引物及探针终浓度分别为0.2umol/L，对标准品的检测可获得较小的Ct值。

因此，优化的荧光定量RT-PCR的反应体系如下：扩增反应总体积为20uL，其中Premix ExTaq10uL（大连宝生物工程有限公司，产品目录号：DRR390S）；2uL模板，终浓度均为0.4umol/L的Bonamia（86）F、Bonamia（86）R和Bonamia（86）P；终浓度均为0.2umol/L的Perkinsus（118）F、Perkinsus（118）R和Perkinsus（118）P；余下用灭菌DEPC水补足，均匀混合。

将上述的反应体系置Lightcycler荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应，温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃10s；然后按95℃变性10s、60℃退火延伸30s进行50个循环；最后于40℃结束反应。

FAM在530nm激发光下发荧光，用来检测派琴虫；

ROX在610nm激发光下发荧光，用来检测包拉米虫；

二、普通PCR灵敏度检测

将贝类包拉米虫和派琴虫的基因组DNA按10倍倍比稀释，1×10¹⁰拷贝~1×10²拷贝为模板，按照上述一的2中PCR扩增反应体系和反应条件进行PCR反应。

结果如图1所示：

PCR电泳检测包拉米虫敏感性（图1的左图），M为100bp DNA ladder，1~9为1×10¹⁰拷贝~1×10²拷贝为模板，10为阴性对照（为水）；得到PCR预期扩增片段大小约为760bp(OIE推荐检测引物http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online），常规PCR方法最小检测限为1×10³拷贝。

PCR电泳检测派虫敏感性（图1的右图），M为100bp DNA ladder，1~9为1×10¹⁰～1×10²拷贝为模板，10为阴性对照（为水）；得到PCR预期扩增片段大小约为703bp(OIE推荐检测引物http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online），常规PCR方法最小检测限为1×10³拷贝。

三、荧光定量RT-PCR的敏感性试验

分别以10倍系列稀释的Bonamia760质粒（包拉米虫）和Perkinsus703质粒(派琴虫)，得到拷贝数均为1×10⁶～1×10²拷贝/uL的Bonamia760和Perkinsus703质粒，再将各种拷贝数的Bonamia760和Perkinsus703质粒混合（二者的拷贝比为1:1）作为模板进行二重荧光定量PCR扩增，扩增体系和条件如一中3的优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序。

在610nm激发光下的结果（ROX）如图2为，检测包拉米虫的敏感性(左图)及标准曲线（右图），1~5分别为1×10⁶～1×10²拷贝/μl（两个质粒各自的拷贝数），6空白对照（为DEPC水）；

在530nm激发光下的结果（FAM）如图3，检测派琴虫的敏感性(左图)及标准曲线（右图），1~5分别为1×10⁶～1×10²拷贝/μl（两个质粒各自的拷贝数），6空白对照（为DEPC水）；

从图中的荧光曲线可见，对包拉米虫和派琴虫的检测200拷贝仍有荧光曲线，表明该检测方法对包拉米虫和派琴虫的灵敏度均为200拷贝，比常规PCR方法敏感性高10倍，重复检测的结果一致。从标准曲线可见扩增成线性，说明所建立的方法具有很好的扩增效率。

三、荧光定量RT-PCR的特异性试验及干扰性试验

1、荧光定量RT-PCR的特异性试验

按照上述一的3中的优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板分别为包拉米虫基因组DNA、包拉米虫基因组DNA+派琴虫基因组DNA、单孢子虫基因组DNA、派琴虫基因组DNA、折光马尔太虫基因组DNA、副溶血弧菌基因组DNA、溶藻弧菌基因组DNA和河弧菌基因组DNA，以模板为ddH₂O作为阴性对照。

在610nm激发光下的结果（ROX）如图4所示，检测包拉米虫的特异性，其中1为包拉米虫、2为包拉米虫+派琴虫、3为派琴虫、4为单孢子虫、5为折光马尔太虫、6为副溶血弧菌、7为溶藻弧菌、8为河弧菌、9为ddH₂O；可以看出，1和2有PCR产物，得到相应的特异性荧光曲线，而3-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

在530nm激发光下的结果（FAM）如图5所示，检测派琴虫的特异性，其中1为包拉米虫、2为包拉米虫+派琴虫、3为派琴虫、4为单孢子虫、5为折光马尔太虫、6为副溶血弧菌、7为溶藻弧菌、8为河弧菌、9为ddH₂O；可以看出，2和3有PCR产物，得到相应病毒的特异性荧光曲线，而1、4-9均没有特异性荧光曲线，证实所设计的引物探针具有特异性，该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

应用建立的二重荧光定量PCR，进行检测以确定两种模板存在时是否对检测的Ct值产生影响，图4中包拉米虫DNA（1）、包拉米虫+派琴虫DNA混合样本（2）检测的CT值分别为18.72和20.51；图5中，派琴虫DNA（3）、包拉米虫+派琴虫DNA混合样本（2）检测的CT值分别为19.66和20.58。结果说明，样品中存在两种病原与存在单种病原，检测的CT值变异非常小，并未影响对贝类包拉米虫和派琴虫的检出及检出的敏感性。

因此，上述引物、探针和方法可应用于鉴定未知样本是否感染包拉米虫和派琴虫：

说明，二重荧光PCR反应结果的判断如下：

反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；

若在610nm激发光下（ROX）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有包拉米虫；反之，则样品中不含有包拉米虫；

若在530nm激发光下（FAM）的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有派琴虫；反之，则样品中不含有派琴虫；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均为S型曲线，则样品中含有包拉米虫和派琴虫；

若在610nm激发光下（ROX）和530nm激发光下（FAM）的反应结果均不为S型曲线，则样品中均不含有包拉米虫和派琴虫。

四、重复性试验

按照上述一的3中的优化的荧光定量RT-PCR的反应体系和反应程序进行荧光定量RT-PCR，不同的是模板为拷贝数均为1×10⁶拷贝/uL的包拉米虫基因组DNA和派琴虫基因组DNA混合的阳性样品。

分为3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差（S）和变异系数（CV）来验证荧光定量RT-PCR的批内重复性。三天后重复检测保存于-20℃的模板，来验证模板的稳定性及荧光定量RT-PCR的批间重复性。

检测结果见图6和表3所示，左图为在610nm激发光（ROX）下检测包拉米虫通道，右图为在530nm激发光（FAM）下检测派琴虫通道，1-3分别为第一天、第四天和第七天；4.空白对照；可以看出，变异系数均小于3%（表3）。结果说明此方法具有良好的准确性和重复性。

表3批间重复性

Claims (7)

1.检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂A，由如下的引物组、探针A和探针B组成；

所述引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成；

所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5；

所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE1；

所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料ECLIPSE2。

2.根据权利要求1所述的试剂A，其特征在于：

所述试剂A中所述引物1、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为2:2:2:1:1:1。

3.检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR试剂B，由权利要1所述的试剂A、PCR扩增缓冲液和水组成。

4.根据权利要求3所述的试剂B，其特征在于：

所述引物1、所述引物2和所述探针A在所述试剂B中的浓度均为0.4μM；

所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述试剂B中的浓度均为0.2μM。

5.检测贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光PCR的试剂盒，包括权利要求1或2所述的试剂A或权利要求3或4所述的试剂B。

6.权利要求1或2所述的试剂A或权利要求3或4所述的试剂B或权利要求5所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有包拉米虫和/或派琴虫产品中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于：所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有包拉米虫和/或派琴虫为用权利要求1或2所述的试剂A或权利要求3或4所述的试剂B或权利要求5所述试剂盒对所述待测样品进行二重荧光PCR反应。

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