CN101724689A - 用于派琴虫检测的实时荧光pcr引物和探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物和探针，所述的引物对特异性针对派琴虫基因组DNA中ITS2序列的保守区域，所述探针特异性针对于该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5′端具有报告荧光染料标记，3′端具有淬灭荧光染料标记。本发明充分利用了荧光PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有派琴虫，本发明中PCR扩增所针对的基因组区域为派琴虫的ITS2保守区域，特异性较强，与包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应，也不受贝类组织DNA的干扰。

Description

用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物和探针

技术领域

本发明属于流行病学和食品卫生检测领域，具体而言，本发明涉及用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物对和探针，其为派琴虫的检测特别是对贝类产品中携带的派琴虫的检测提供了有效的技术手段。

背景技术

派琴虫病(Perkinsosis)是由海洋派琴虫(Perkinsus marinus)、奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)等在贝类宿主血细胞内寄生或者游离在结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。是影响世界贝类养殖业发展的主要病原，为OIE规定的必报水生动物疫病之一，迄今为止，已发现的派琴虫感染宿主包括牡蛎、鲍鱼、蛤子、扇贝、珍珠牡蛎、鸟蛤和贻贝等。

据认为，在贝类病害中，派琴虫病害所造成的经济损失可能是最为严重的。1946年，派琴虫最初在美洲牡蛎(Crassostrea virginica)体内发现，当时曾引起美国路易斯安那州的墨西哥海湾的大批牡蛎死亡。据报道，美国亚特兰大中部地区多次严重的爆发派琴虫病，死亡率高达95％。1995年，派琴虫病致使大西洋伊伯利亚海岸、地中海海岸的马尼拉蛤仔大量死亡。1998年，派琴虫病导致日本南部和北部海岸的马尼拉蛤仔、菲律宾蛤仔及韩国南北半岛人工养殖和野生的马尼拉蛤仔大量的死亡，造成严重的经济损失。

在我国分布较广、影响较大的为P.olseni(或P.atlanticus)。1997年，我国在栉孔扇贝、虾夷扇贝、皱纹盘鲍、菲律宾蛤仔体内检测到派琴虫。美国2005年也从中国广西北海进口牡蛎中检出派琴虫。梁玉波(2005)采用巯基醋酸盐培养基(fluid thioglycollate media，FTM)培养的方法，对黄海北部三个海域的菲律宾蛤仔的派琴虫感染状况进行周年调查的结果表明，除3月和6月份的感染率分别为95％和90％之外，其它月份感染率均为100％。由此可见，派琴虫已经成为影响我国贝类养殖业发展的主要病原之一。

目前，派琴虫感染的诊断通常依靠OIE推荐的组织切片法、FTM组织培养法及PCR方法(OIE，2006)。组织学方法可以通过显微镜下直接观察虫体或观察组织损伤来监测感染的分布情况。然而，这一技术耗时长、需要高水平的技术人员且检测的灵敏度低。Ray(1952)报道采用FTM培养派琴虫休眠孢子的方法是将派琴虫滋养体进行培养，待虫体体积增大后观察，是一种传统有效的定量检测派琴虫的方法，但是该培养法只能将派琴虫培养成休眠孢子阶段才能检测到，而且整个过程耗时长达一周，敏感性较低，只有当克组织内原虫数量高于1000个时方可检出。

随着现代科技的发展，利用核糖体DNA对寄生虫进行分类，近年来已经成为国际上的研究热点。Holmdahl(1997)等报道，原生动物rRNA基因上两个内部转录间隔区(Internal transcribed spacer，ITS)碱基序列具有很强的变异性，其特征是鉴定原生动物类别的可靠依据。

荧光PCR(FQ-PCR)技术是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着TaqMan探针的广泛使用，到目前为止该技术已经非常成熟，具有灵敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特异性强(在普通PCR一对引物的基础上，中间还设计有探针，只有引物和探针均完全配对，才可能得到扩增，可对少至2个核苷酸的序列差异进行鉴定，从而保证了反应的特异性)、操作安全方便(无须凝胶电泳，避免了EB染色对人体的危害)等优点，目前已被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。目前，荧光PCR技术在贝类寄生性原虫学领域的应用很少，无疑有着广阔的发展空间。

本发明在改进传统FTM培养派琴虫的基础上，选择在派琴虫ITS2高度保守区设计引物，建立了实时荧光PCR快速检测派琴虫的方法。BLAST分析表明可扩增出P.olseni、P.marinus等派琴虫的相关基因，说明设计的引物在派琴虫属内有一定程度的通用性，这在尚未明了我国海域中是否还存在其它种类派琴虫的情况下，有利于尽可能的检获派琴虫病原。这既是加强出入境检疫工作、打破相关技术贸易壁垒的需要，也是消除食品安全隐患、保障国民身体健康的需要。

发明内容

本发明目的在于提供用于派琴虫检测的荧光PCR引物对和探针序列。

本发明的目的通过下述技术方案实现：选择派琴虫核糖体DNA序列中比较保守的ITS-2(Genbank NO.AF140295)区域，用软件Beacon Designer 7.0设计引物对和探针。引物对经在线序列BLAST分析，确定为派琴虫属的特异性引物对。并在该引物对的扩增区域内设定一条特异性的荧光TaqMan探针，报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同DNA模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对派琴虫的检测。

优选地，本发明荧光PCR引物对扩增的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的特异性荧光探针针对该引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。更优选地，本发明所述的特异性地针对派琴虫检测的荧光PCR引物对的核苷酸序列为：派琴虫病特异性的正向引物序列为5’-GAAGAATGGCGTGATCAAGGAAC-3’，反向引物序列为5′-TGCAAGGCTATAATCTCGTATTGTAG-3′，以及该引物对的正向引物向5’端延伸10个碱基、下游引物向3’端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列，或者它们的互补序列；探针序列为，5‘FAM-CAACACAGTCGGACTTGCGAGCATCCAA FAMRA-3’，5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。以及该探针向5’端延伸10个碱基、向3’端延伸10个碱基区域内得到的探针序列及互补序列。

检测派琴虫特异性的PCR引物和探针设计完成后，采用在线BLAST分析其序列特异性，结果表明派琴虫特异性的引物和探针设计区域为派琴虫所特有，没有发现同源或序列一致性生物基因信息，可以保证扩增产物的特异性。

在本发明的一个优选实验方案中，引物扩增产物长度为126bp，探针设计于待扩增序列间的高GC含量区，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

派琴虫荧光PCR检测采用如下步骤进行：

1)提取贝类等派琴虫感染样品组织的基因组DNA；

2)向经过处理的基因组DNA中加入上述引物对和荧光素标记探针以及PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液、MgCl₂、ddH₂O及DNA聚合酶，制备PCR扩增反应液；

3)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数(Ct)；

5)根据各样本的反应Ct值，按照阳性判定标准判定待检样本中是否存在派琴虫。

在改进传统FTM培养派琴虫方法的基础上，本发明建立了实时荧光PCR快速检测派琴虫的方法，所用试剂及检测方法充分利用了荧光PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定待检组织病料中是否含有派琴虫。同时，本发明中PCR扩增所针对的基因组区域为派琴虫的ITS2保守区域，特异性较强，与包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应，也不受贝类组织DNA的干扰。

附图说明

图1a中箭头所指为未染色的派琴虫休眠孢子，图1b中箭头所指为为经卢格氏碘液染色后的派琴虫休眠孢子；

图2所示的为派琴虫荧光PCR检测方法的扩增曲线。图中曲线1-7分别对应当采用的质粒模板浓度为2.6×10⁷-2.6×10拷贝时的扩增情况，同时，设阴性对照；

图3所示的是贝类派琴虫荧光PCR检测方法的标准曲线；

图4所示的是贝类派琴虫PCR检测方法的特异性试验结果。图中除派琴虫阳性样品和阳性对照有明显扩增曲线外，包拉米原虫、隐孢子虫刺激隐核虫DNA、微孢子虫DNA、微小隐孢子虫DNA、牡蛎包拉米虫DNA、未感染牡蛎组织DNA都无扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。

实施例1派琴虫FTM培养方法

1.样品前处理

抽取达到一定统计意义的贝类样品，分别置于灭菌的研钵，分别量取长、宽、厚后，将壳弃掉，用天平称取组织净重后，将其置于灭菌的研钵，研磨至0.1mm³左右。

2.样品的培养

将样品分别置于含5mL FTM培养基的灭菌离心管中，加250μL2.5％的氯霉素摇匀，用1mL 1％制霉菌素覆盖在液面，盖好盖子，22-24℃暗室中培养5-7d。

3.样品的纯化

将培养后的样品4000r/min离心10min，弃上清液，加6mL 2mol/LNaOH，涡旋混匀后置于55℃烘箱内消化过夜。4000r/min离心10min，弃上清液，加2mL ddH₂O洗涤，4000r/min离心10min，弃上清液，重复上述步骤2-4次。

4.染色镜检

将纯化的样品置于2mL ddH₂O中摇匀，加入80μL卢戈氏碘液染色后，取40μL于载玻片上，盖上盖玻片后，在显微镜(10×10)下顺序观察并计数。

5.结果判断

显微镜下，派琴虫的休眠孢子呈圆形，蓝黑色，直径大多在30-80μm。

实施例2引物和探针的制备

1引物和探针的设计和合成

选择派琴虫核糖体DNA序列中比较保守的ITS-2区域，用软件Beacon Designer 7.0设计。引物对经在线序列BLAST分析，确定为派琴虫属的特异性引物对。并在该引物对的扩增区域内设定一条特异性的荧光TaqMan探针。

本例中使用的引物序列为：

上游引物：(正向)：5’-GAAGAATGGCGTGATCAAGGAAC-3’；

下游引物：(反向)：5’-TGCAAGGCTATAATCTCGTATTGTAG-3’，扩增产物长度为126bp；

所述探针的序列为：5‘FAM-CAACACAGTCGGACTTGCGAGCATCCAAFAMRA-3’，该探针的5’端标记有荧光报告基团6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，FAM)，3’端标有荧光淬灭基团6-羧基四甲基诺丹明(6-carboxy-N，N，N′，N′-tetramethylrhodamine，TAMRA)该探针的设计针对于所扩增序列间的高GC含量区。

2引物和探针的准备

引物和探针合成后，引物稀释为10μmol/L，探针稀释为10μmol/L，上、下游引物1∶1等体积混合后，-20℃保存备用。

实施例3派琴虫荧光PCR检测方法的建立

1病料组织基因组DNA提取

取经FTM培养表明感染派琴虫的菲律宾蛤仔的鳃组织25mg，按试剂盒(QIAGEN，69506)说明提取基因组DNA，-20℃保存备用。

2PCR扩增目的基因

利用引物以病料组织基因组DNA为模板，采用梁玉波(2005)发表的派琴虫特异性引物AF和AR对上述提取的DNA进行PCR扩增。引物序列为：AF：5′-CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3′；AR：5′-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3。PCR反应体系参照：引物AF(10μmol/L)0.5μL、引物AR(10μmol/L)、0.5μL、荧光探针(10μmol/L)0.5μL、10×buffer(含Mg²⁺)2.5μL、dNTP(2.5mmol/L)2μL、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL、灭菌ddH₂O补充至25μL。在PTC-200梯度PCR仪(MJ)上扩增，反应程序为：94℃解链1min。每个循环包括94℃解链30s；45℃退火30s，72℃延伸90s，扩增35个循环；72℃继续延伸10min。

3阳性质粒的构建

用Agarose Gel DNA Purification Kit(OMEGA，D2500-01)将上述PCR产物回收纯化，连接到pGEM-T easy载体(Promega，A3610)中并转入大肠杆菌E.coli JM 109感受态细胞(TaKaRa，D9052)，经过筛选、PCR鉴定获得含目的片段的重组质粒。通过北京诺赛基因组研究中心测序鉴定，证实目的基因已正确克隆到载体中，用核酸蛋白测定仪(NanoDrop，ND-100)测定质粒浓度，换算成拷贝数，-20℃保存备用，使用前进行10倍梯度稀释。

4荧光PCR反应条件与体系的建立与优化

以构建的含有靶基因的阳性质粒为DNA模板，建立贝类派琴虫病通用荧光PCR方法，并对PCR反应体系和反应条件进行优化，确定荧光PCR反应体系组成为：10倍系列稀释的质粒DNA2μL，10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL、等体积混合的上下游引物(10μmol/L)1.5μL、荧光探针(10μmol/L)0.5μL、MgCl₂(25mmol/L)5μL、dNTP(2.5mmol/L)2.5μL、rTaq DNA聚合酶0.2μL、ddH₂O补充至25μL。反应在iQ^TM5荧光PCR仪(Bio-Rad)上进行，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火30s，扩增40个循环，每个循环第二步反应结束时检测荧光。

5标准曲线的建立及敏感性测定

以10倍梯度稀释(2.6×10⁷-2.6×10拷贝)的质粒DNA为模板，在荧光PCR仪上检测，得到扩增动力学曲线与相应的标准曲线。同时根据测得的最低拷贝数评价其敏感性。

6特异性试验

提取派琴虫感染阳性病料组织DNA，分别以刺激隐核虫DNA、微孢子虫DNA、微小隐孢子虫DNA、牡蛎包拉米虫DNA、未感染牡蛎鳃组织DNA作对照，同时以ddH₂O作为阴性对照，以构建的派琴虫阳性质粒作为阳性对照，检测所建立的派琴虫荧光PCR检测方法的特异性。荧光PCR反应体系为：10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL、等体积混合的上下游引物(10μmol/L)1.5μL，荧光探针(10μMmol/L)0.5μL，MgCl₂(25mmol/L)5μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，上述DNA模板2μL、ddH₂O补充至25μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火30s，扩增40个循环；每个循环第二步反应结束时检测荧光。

7试验结果

以重组的质粒DNA为模板进行扩增，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示特异性条带大小为649bp，与引物的预设扩增片段大小相符。

使用质粒DNA制作标准曲线。以10倍梯度稀释的质粒为模板，对应浓度为2.6×10⁷-26拷贝，以获得的CT值为y轴，对应的质粒DNA拷贝数的对数为x轴，仪器自动生成标准曲线的扩增效率为为91.9％，斜率为-3.533，反应的相关系数为0.998。标准方程为y＝-3.533x+4.652。由扩增曲线可知，荧光PCR的检测灵敏度为26个拷贝。根据检测出的最低拷贝数我们设立检测结果的判定标准，在阴性无Ct值的前提下，待检样品Ct值在35以下为阳性，35-40为可疑，需加大模板量重新进行检测，无Ct值或者Ct＞40的样品为阴性。

将上述4中建立的亚欧型口蹄疫病毒荧光PCR检测方法进行特异性试验，结果如图4所示，与试验采用的刺激隐核虫、微孢子虫、微小隐孢子虫、牡蛎包拉米虫等原虫以及牡蛎鳃组织无交叉反应，也不受牡蛎鳃组织DNA的干扰。表明所设计的引物及Taqman探针能够满足派琴虫特异性检测的需要。

实施例4派琴虫荧光PCR检测方法的应用

1组织病料DNA的提取取贝类样品的鳃组织25mg，按试剂盒(QIAGEN，69506)说明提取基因组DNA，-20℃保存备用。

2样品检测步骤

贝类派琴虫检测的反应体系为：10×buffer(Mg⁺²free)2.5μL、等体积混合的上下游引物(10μmol/L)1.5μL、荧光探针(10μmol/L)0.5μL、MgCl₂(25mmol/L)5μL、dNTP(2.5mmol/L)2μL、rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL、灭菌ddH₂O补充至25μL。试验同时设立ddH₂O为模板作空白对照。将上述各PCR反应管放于荧光PCR仪上，选择FAM通道采集荧光信号。

反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火30s，扩增40个循环；每个循环结束采集荧光信号。

3结果判定

反应结束后，仪器将自动给出每个样品的Ct值。记录Ct值，分析检测结果。

3.1试验成立判定

只有阳性对照有扩增曲线，而且Ct≤35；同时阴性对照及空白对照无扩增曲线或者扩增曲线Ct＞40的，才可判定本次试验成立，否则本次试验无效。

3.2阳性判定

如果样品的PCR扩增曲线Ct≤35，则表明样品中携带派琴虫。

3.3阴性判定

如果样品无扩增曲线或者扩增曲线Ct≥40，则表明样品中不携带派琴虫。

3.4可疑判定

如果35＜Ct＜40，判为可疑，可以加大模板量5-10倍再重复扩增，如果重复试验的Ct＜40，则判定样品中携带派琴虫。

采用本研究所建立的方法，对分别来自辽宁、山东、福建等地的30份贝类样品进行荧光PCR检测，检测到3份阳性样品，分别为来自辽宁的菲律宾蛤仔、福建的菲律宾蛤仔以及来自福建的毛蛤，阳性检出率为10％，所有阳性样品的检测结果均采用OIE推荐的FTM培养方法进行了证实。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所

<120>用于派琴虫检测的实时荧光PCR引物和探针

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>126

<212>DNA

<213>Perkinsus marinus

<400>1

gaagaatcgc gtgatcaagg aacacgtgat atcaccacaa cacagtcgga cttgcgagca     60

tccaaagaca ctcacaggcg cggtcctcct ctcggagggg ctacaatacg agattatagc    120

cttgca                                                               126

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaagaatggc gtgatcaagg aac                                             23

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tgcaaggcta taatctcgta ttgtag                                          26

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

caacacagtc ggacttgcga gcatccaa                                        28

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ccgctttgtt tggmtccc                                18

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acatcaggcc ttctaatgat g                            21

Claims (10)

1.一种用于派琴虫实时荧光PCR检测的引物对，其特征在于，所述的引物对特异性扩增派琴虫基因组DNA中ITS2序列的保守区域。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，该引物对扩增的靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：正向引物：5’-GAAGAATGGCGTGATCAAGGAAC-3’，或该序列向5’端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列；

反向引物：5’-TGCAAGGCTATAATCTCGTATTGTAG-3’，或该序列向3’端延伸10个碱基所包括的DNA序列区域内得到的引物序列。

4.一种用于派琴虫实时荧光PCR检测的荧光素探针，所述探针特异性针对于权利要求1～3任一项所述引物对扩增区域中的GC高含量区，该探针的5’端具有报告荧光染料标记，3’端具有淬灭荧光染料标记。

5.如权利要求4所述的荧光素探针，其特征在于，该述针的核苷酸序列为：5’-CAACACAGTCGGACTTGCGAGCATCCAA-3’，或该序列向5’端延伸10个碱基、向3’端延伸10个碱基区域内得到的探针序列，该探针的5’端具有报告荧光染料FAM标记，3’端具有淬灭荧光染料TAMRA标记。

6.一种对派琴虫进行实时荧光PCR检测的方法，该方法包括下列步骤：

1)提取派琴虫感染样品组织的基因组DNA；

2)向经过处理的基因组DNA中加入权利要求1～3任一所述引物对和权利要求4或5所述荧光素探针以及PCR扩增用的dNTP、PCR缓冲液、MgCl₂、ddH₂O及DNA聚合酶，制备PCR扩增反应液；

3)将装有PCR扩增反应液的PCR管置于荧光PCR仪上；

4)根据探针标记的报告荧光类型，选择对应的荧光通道，进行荧光PCR扩增，记录各检测样本的PCR扩增循环数Ct；

5)根据各样本的反应Ct值，按照阳性判定标准判定待检样本中是否存在派琴虫。

7.如权利要求6所述的实时荧光PCR检测方法，其中荧光PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，57℃退火30s，扩增40个循环。

8.如权利要求6或7所述的实时荧光PCR检测方法，其中所述的派琴虫判定标准为：如果扩增曲线的Ct值＜35，判定待检样品中含有贝类派琴虫，否则该样本不含贝类派琴虫。

9.含有权利要求1～3任一所述引物对和权利要求4或5所述探针的检测试剂盒。

10.权利要求1～3任一所述引物对和权利要求4或5所述探针在制备用于检测及鉴定贝类派琴虫病的试剂中的用途。

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