CN104017890A

CN104017890A - Eb1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用

Info

Publication number: CN104017890A
Application number: CN201410279223.6A
Authority: CN
Inventors: 刘吉平; 晏育伟; 程伟
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-06-20
Filing date: 2014-06-20
Publication date: 2014-09-03
Anticipated expiration: 2034-06-20
Also published as: CN104017890B

Abstract

本发明属于分子生物技术领域，具体公开了EB1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用。本发明通过研究发现，EB1基因转录表达与家蚕微孢子虫细胞分裂以及寄主的发育有关。将EB1基因作为靶基因，设计特异性引物，通过PCR扩增来检测蚕卵中是否感染家蚕微孢子虫，检测结果证实，以EB1基因作为检测靶基因，蚕卵抽提物中的抑制物质对病原基因DNA的PCR有效扩增的干扰作用很小，检测结果更准确、灵敏，更重要的是能在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染家蚕微孢子虫。为蚕种生产中“有毒”蚕卵的检测及安全发种提供保证。

Description

EB1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，更具体地，涉及EB1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用。

背景技术

家蚕微粒子病是病原性的桑蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）经食下传染或胚卵（胎）传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病。也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展的重要疫病，每年各地蚕种生产因微粒子病危害而造成的经济损失惨重。同时，野外昆虫微孢子虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间以及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种贸易和蚕业可持续发展。各地区蚕业主管部门和相关生产单位投入大量人力、物力和财力，采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下蚕种的常规方法进行防治，但效果始终不佳。我国将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。

最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行的，这种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，拯救了世界的养蚕业。但是显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，很难区分不同种属的微孢子虫及其类似物。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病 PCR 检测的引物多是针对靶基因SSUrRNA的（Terry R S,Smith JE, Bouchon D, et al. Ultrastructural characterization and molecular taxonomy of Nosema granulosis sp. n., a transovarially transmitted, feminizing (TTF) microsporidium. J. Eukaryot. Microbiol. 1999, (46): 492-499； Huang Wei-Fone , Tsai Shu-Jen , Lo Chu-Fang , et al. The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis .Fungal Genetics and Biology, 2004.41(5): 473-481 ）但是刘吉平等（2004）（刘吉平，曹阳，Smith J. E.等. 模拟感染家蚕微粒子病的 PCR 分子诊断技术研究. 中国农业科学，2004，37(12)：1925－1931）研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原基因DNA的PCR有效扩增。

发明内容

本发明为了克服现有技术中检测蚕卵是否感染家蚕微孢子虫所存在的上述缺陷，提供EB1基因在检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的引物组。

本发明的另一个目的是提供一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现：

本发明提供EB1基因在检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫中的应用。

本发明人在家蚕微孢子虫N. bombycis（广东株）转录组学研究的基础上，首次鉴定了可能与N. bombycis侵染、繁殖相关的EB1基因，并对感染了家蚕微孢子虫N. bombycis的家蚕幼虫、卵等不同发育阶段的家蚕组织进行了EB1的表达差异分析。结果表明，EB1在感染家蚕的前2天基本无转录活性，从感染家蚕第3天到五龄熟蚕以及蚕卵发育前7天，均能检测到EB1的转录表达活性；且在感病蚕卵前滞育阶段，蚕卵胚胎中的EB1基因表达量呈逐渐下降的趋势，在蚕卵刚产下来1 h时，其表达量最大，为Nb的1.86倍，随后，随着蚕卵胚胎的进一步发育，EB1的表达量逐步下降，在第7天时表达量最低，为Nb的0.12倍。推测N. bombycis的EB1基因转录表达可能与家蚕微孢子虫细胞分裂以及寄主的发育有关。

基于上述研究结果，发明人试图将EB1基因作为检测家蚕微孢子虫的靶基因，试验结果取得了意想不到的效果，以EB1基因作为检测靶基因，蚕卵抽提物中的抑制物质对病原基因DNA的PCR有效扩增的干扰作用很小，检测结果更准确、灵敏，更重要的是能在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染家蚕微孢子虫。

优选地，所述应用为以EB1基因为靶基因设计特异性引物进行PCR扩增，根据扩增DNA片段的结果判定蚕卵是否感染家蚕微孢子虫。

一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的引物组，所述引物组含有上游引物EB 1F和下游引物EB1R；所述引物组的序列如SEQ ID NO：1～2所示。

一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的试剂盒，所述试剂盒含有上述引物组，引物组的序列如SEQ ID NO：1～2所示。

优选地，所述引物组中EB 1F和EB1R的浓度分别为10 μM，所述试剂盒还含有2×Taq Master Mix。

优选地，所述试剂盒的PCR反应体系为：10 μL 2×Taq Master Mix；10 μM EB 1F 0.5 μL、10 μM EB1R 0.5 μL；模板 DNA 2 μL；ddH₂O补至20 μL。

更优选地，所述2×Taq Master Mix为0.1U/μL Taq DNA polymerase，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH₄)₂SO₄，3.0 mM MgCl₂，400 μM dNTP。

优选地，所述试剂盒的PCR反应条件为：94℃变性5 min；然后94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，32个循环；最后72℃延伸10 min。

上述引物组或上述试剂盒在检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫中的应用也属于本发明的保护范围。

上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1. 提取蚕卵DNA；

S2. 利用上述试剂盒进行PCR反应；

S3. 将PCR后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后紫外灯下观察，进行结果判定，所述结果判定为：若出现496bp的DNA片段，则表明待测蚕卵中含有家蚕微孢子虫。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明研究发现EB1基因转录表达可能与家蚕微孢子虫细胞分裂以及寄主的发育有关。基于上述研究结果，发明人试图将EB1基因作为检测家蚕微孢子虫的靶基因，试验结果取得了意想不到的效果，以EB1基因作为检测靶基因，蚕卵抽提物中的抑制物质对病原基因DNA的PCR有效扩增的干扰作用很小，检测结果更准确、灵敏，更重要的是能在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染家蚕微孢子虫。

本发明根据家蚕微孢子虫（广东株）EB1基因序列优选了特异性引物，通过该引物可检测蚕卵中是否感染了家蚕微孢子虫；本发明可根据上述特异性引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用及工业化生产。上述引物组特异性强，灵敏度高，对于蚕卵中的干扰物质影响较小，可以很容易地检测到蚕卵中是否含有微孢子虫。应用上述引物组和试剂盒可快速检测待测样品是否感染家蚕微孢子虫，尤其是在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染了家蚕微孢子虫。可为蚕种生产中“有毒”蚕卵的检测及安全发种提供保证。

附图说明

图1. EB1基因在感染了家蚕微孢子虫的家蚕中肠组织中的表达水平；把Nb EB1基因的表达量定义为1，作为对照，检测感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠组织中EB1的相对表达量；其中正常家蚕中肠组织中EB1的表达量为0。

图2. EB1在感染了家蚕微孢子虫的家蚕蚕卵中的表达水平；把Nb EB1基因的表达量定义为1，作为对照，检测感染家蚕微孢子虫的家蚕蚕卵中EB1的相对表达量；其中正常家蚕蚕卵中EB1的表达量为0。

图3. EB F/1R引物的特异性检测结果；其中M为DL2000 DNA Marker；1为“有毒”蚕种DNA；2为N.b DNA；3为无毒蚕种DNA；4为ddH₂O。

图4. EB1F/1R引物的灵敏性验证结果；其中M为DL2000 DNA Marker；1～8为10倍梯度稀释的N.b DNA；浓度分别为：50 ng/μL，5ng/μL，5×10^-1ng/μL ，5×10^-2ng/μL，5×10^-3ng/μL，5×10^-4ng/μL，5×10^-5ng/μL，5×10^-6ng/μL；9为ddH₂O。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。

实施例1 EB1基因功能研究

发明人在家蚕微孢子虫N. bombycis（广东株）转录组学研究的基础上，首次鉴定了可能与N. bombycis侵染、繁殖相关的EB1基因（登录号KF421134），并对感染了家蚕微孢子虫N. bombycis的家蚕幼虫、卵等不同发育阶段的家蚕组织进行了EB1的表达差异分析。

试验方法为：4龄起蚕(家蚕品种：两广二号) 添食家蚕微孢子虫，早晚各一次，此后正常饲养。添毒后每天（从四龄第一天到五龄熟蚕）随机选取添毒饲养的家蚕，用无菌器皿、无菌水和新制蜡盘解剖家蚕，采集中肠，并迅速放入液氮中速冻，然后于﹣80℃保存。取经过显微镜检验有微粒子孢子的母蛾产下的蚕卵，分别收取1 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d等时间段的蚕卵，放入﹣80℃冰箱保存。提取上述感染家蚕微孢子虫的不同时期家蚕中肠组织和蚕卵RNA，并反转录成cDNA，以正常家蚕组织为阴性对照，以N. bombycis孢子为阳性对照，同时以家蚕微孢子虫β-tubulin（Accession：EF151928）作为内参基因，对septin1的表达水平进行实时荧光定量PCR（qPCR）检测。

利用Primer Premier 5.0软件设计qPCR分析的引物如下所示，

qEB1F：5’ GAAAACCTTCCAATGAATACGAG 3’

qEB1R：5’ TCTTCTGTTACTTTACTTTTCCCA 3’

qβ-tubulinF: 5’ TGCCATTAGACAAGGACCATAC 3’

qβ-tubulinR: 5’GAAATCCCTGAAGACAATCTGAAG 3’

以上述提取的家蚕中肠组织和蚕卵总cDNA为模板，用引物qEB1F/R和qβ-tubulinF/R进行qPCR扩增。实时荧光定量PCR的反应条件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s、40个循环。

结果如图1和图2：EB1在感染家蚕的前2天基本无转录活性，从感染家蚕第3天到五龄熟蚕以及蚕卵发育前7天，均能检测到EB1的转录表达活性；且在感病蚕卵前滞育阶段，蚕卵胚胎中的EB1基因表达量呈逐渐下降的趋势，在蚕卵刚产下来1 h时，其表达量最大，为Nb的1.86倍，随后，随着蚕卵胚胎的进一步发育，EB1的表达量逐步下降，在第7天时表达量最低，为Nb的0.12倍。推测N. bombycis的EB1基因转录表达可能与家蚕微孢子虫细胞分裂以及寄主的发育有关。因此，可以将EB1基因作为靶基因，设计特异性引物，通过PCR扩增来检测蚕卵中是否感染家蚕微孢子虫。

实施例2 EB1基因作为检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的靶基因的应用

1、蚕卵总DNA的提取

采用QIAGEN 公司生产的DNeasy Plant mini kit试剂盒抽提基因组DNA，步骤如下：

（1）取20粒蚕卵放入研钵中，液氮充分研磨，将研磨后的粉末收集至1.5mL的离心管中；

（2）加入400 μL AP1和4 μL Rnase，涡旋混匀（400 μL APL和4 μL Rnase勿在使用前混合）；混匀后的溶液，65℃，孵育10 min（期间上下颠倒试管2～3次）；

（3）加130 μL AP2，混合后冰浴5 min；然后14 000 rpm，离心5 min；

（4）吸取上清于QIA shredder spin column中的收集管，14 000rpm，离心2min；

（5）将离心管中上清液移至新管（勿搅动出现的残渣），加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；将650 μL 混合液移至DNeasy Mini spin column中，4200 rpm，离心1 min；剩下的液体重复此步骤；

（6）将spin colum放入新收集管中，加入500 μL buffer AW，4200 rpm，离心1 min；弃上清；

（7）再加入500 μL AW，14000 rpm，离心2 min；（保证收集管不接触到底部上清）；移收集管至1.5 mL或2 mL离心管中；

（8）加入40μL buffer AE洗脱，室温放置5 min；4200 rpm，1 min；重复上一步（即加入40uL buffer AE洗脱，室温放置5 min，4200 rpm，1 min）；

（9）将提取好的总DNA放于-20℃冰箱保存备用。

2、引物设计和合成

根据本课题组在Genbank公布的家蚕微孢子虫EB1基因序列（登录号KF421134），应用Primer premier 5.0软件设计特异引物，获得蚕卵家蚕微孢子虫分子检测特异引物。所述蚕卵家蚕微孢子虫分子检测引物的DNA序列为：

上游引物（EB1F）： 5’ CAAATCCACCATACTTTCCCTT 3’；

下游引物（EB1R）： 5’ AATTCCCCCATGATCGCCTTAA 3’；

3、PCR扩增方法的建立：

以上述提取的蚕卵总DNA为模板，用引物EB1F 和EB1R进行PCR扩增。所述PCR反应体系为20 μL：10 μL 2×Taq Master Mix（0.1U/μL Taq DNA polymerase，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH₄)₂SO₄，3.0 mM MgCl₂，400 μM dNTP）；10 μM上游引物EB 1F 0.5 μL、10 μM下游引物EB1R 0.5 μL；模板 DNA 2 μL； ddH₂O补至20 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 10 min。

PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增到496 bp的DNA片段判定蚕卵样品是否感染了家蚕微孢子虫。本检测方法能够准确地判断样品是否含有家蚕微孢子虫，尤其是检测蚕卵家蚕微孢子虫，为蚕种生产中“有毒”蚕种的检测及安全发种提供了保证。

实施例3 实施例2所述引物的特异性检测

分别取30粒“有毒”蚕卵和健康蚕卵以及纯化的家蚕微孢子虫，按实施例2方法分别提取总DNA，再进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳检测结果。检测结果如图1所示：“有毒”蚕卵和纯化的家蚕微孢子虫中检出496bp的DNA片段，而健康蚕卵中未检测出496bp的DNA片段，而且更关键的是PCR检测中除由EB1F/EB1R引物扩增出约496bp的N.b特异目的泳带外，没有其它大小与目的片段不等的杂带出现，因此，以EB1基因作为检测靶基因，蚕卵抽提物中的抑制物质不会对病原基因DNA的PCR有效扩增有干扰作用，检测结果更准确、灵敏，更重要的是能在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染家蚕微孢子虫。以上结果表明实施例2所述引物具有良好的特异性，可用于蚕卵的微孢子虫快速检测。

实施例4 实施例2所述引物的灵敏度检测

取纯化的10⁸/mL的家蚕微孢子虫，按实施例2方法提取总DNA，核酸定量仪测定提取到的DNA浓度为50 ng/μL，10倍梯度稀释至5.0×10^-6ng/μL再进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，可检测的最低DNA浓度为5.0×10^-3ng/μL。而且更关键的是PCR检测中除由EB1F/EB1R引物扩增出约496bp的N.b特异目的泳带外，没有其它大小与目的片段不等的杂带出现，因此，以EB1基因作为检测靶基因，蚕卵抽提物中的抑制物质不会对病原基因DNA的PCR有效扩增有干扰作用，检测结果更准确、灵敏，更重要的是能在感病蚕卵的早期就可以快速检测出是否感染家蚕微孢子虫。上述结果表明实施例2所述引物具有较高的灵敏度，可用于蚕卵的微孢子虫的快速检测。

实施例5 一种用于检测蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的PCR检测试剂盒

按下列组成配制家蚕微孢子虫PCR快速检测试剂盒：

含有2×Taq Master Mix（Taq DNA polymerase，Tris-HCl，(NH₄)₂SO₄，MgCl₂，dNTP）、上游引物、下游引物。

上游引物（EB1F）和下游引物（EB1R）的序列如下：

EB1F： 5’ CAAATCCACCATACTTTCCCTT 3’；

EB1R： 5’ AATTCCCCCATGATCGCCTTAA 3’；

本发明对上述条件进行了优化，最终确定该试剂盒的反应体系为：10 μL 2×Taq Master Mix（0.1U/μL Taq DNA polymerase，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH₄)₂SO₄，3.0 mM MgCl₂，400 μM dNTP）；10 μM上游引物EB 1F 0.5 μL、10 μM下游引物EB1R 0.5 μL；模板 DNA 2 μL； ddH₂O补至20 μL。

上述模板DNA的提取方法参照实施例2。

应用上述试剂盒进行PCR的反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，32个循环；72℃ 10 min。

所述试剂盒还包括一份使用说明书，所述试剂盒分装为20次反应/盒。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> EB1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> EB1F

<400> 1

caaatccacc atactttccc tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> EB1R

<400> 2

aattccccca tgatcgcctt aa 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> qEB1F

<400> 3

gaaaaccttc caatgaatac gag 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> qEB1R

<400> 4

tcttctgtta ctttactttt ccca 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> qβ-tubulinF

<400> 5

tgccattaga caaggaccat ac 22

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> qβ-tubulinR

<400> 6

gaaatccctg aagacaatct gaag 24

Claims

1.EB1基因在检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，以EB1基因为靶基因设计特异性引物进行PCR扩增，根据扩增DNA片段的结果判定是否感染家蚕微孢子虫。

3.一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的引物组，其特征在于，所述引物组含有上游引物EB1F和下游引物EB1R；所述引物组的序列如SEQ ID NO：1～2所示。

4.一种检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求3所述引物组。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述引物组中EB1F和EB1R的浓度分别为10 μM，所述试剂盒还含有2×Taq Master Mix。

6.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应体系为：10 μL 2×Taq Master Mix；10 μM EB 1F 0.5 μL；10 μM EB1R 0.5 μL；模板 DNA 2 μL；ddH₂O补至20 μL。

7.根据权利要求5或6所述试剂盒，其特征在于，所述2×Taq Master Mix为Taq DNA polymerase，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH₄)₂SO₄，3.0 mM MgCl₂，400 μM dNTP。

8.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR反应条件为：94℃变性5 min；然后94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，32个循环；最后72℃延伸10 min。

9.权利要求3所述引物组或权利要求4～8所述试剂盒在检测家蚕蚕卵是否感染家蚕微孢子虫中的应用。