CN107245492A - 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用。本发明首先克隆获得了一种家蚕微孢子虫DNA2基因，其全长序列如SEQ ID NO.1所示，ORF框序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。并以此为基础提供了一组特异性检测家蚕微孢子虫的特异性检测引物组，对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，在家蚕微孢子虫的特异性检测方面具有很好的应用前景。而且，家蚕微孢子虫DNA2基因作为一个新发现的蛋白基因，具有潜在的功能应用，本发明DNA2基因的发现对于治疗和检测的理论验证和生产实践均有一定的意义。

Description

家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种来源于家蚕微孢子虫的解旋酶和核酸酶DNA2基因(DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2-like)及其应用。

背景技术

家蚕微孢子虫病是病原家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病。家蚕微孢子虫是一类细胞内专性寄生的真核生物，之前一直属于原虫，近些年被划分到真菌类。因其具有垂直传播的特点使成为了家蚕病原微生物中最受人关注的一种，也因此成为家蚕病原微生物中唯一需要检疫的疫病。从19世纪发现到现在，家蚕微孢子虫病对各国的养蚕业造成巨大的损失。除此之外，其他不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。

最初人们对家蚕微粒子病的检测主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行，但是显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，很难区分不同种属的微孢子虫及其类似物。

随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。现有技术中常用的靶基因SSUrRNA，研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原基因DNA的PCR有效扩增。发明人团队也先后发现了多种适用于家蚕微粒子病PCR检测的靶基因，具有较好的检测效果，各有优势和缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种家蚕微孢子虫DNA2基因。

本发明另一目的是提供该基因在检测家蚕微孢子虫方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明首先获得了一个家蚕微孢子虫DNA2基因，其全长序列如SEQ ID NO.1所示。其ORF框序列如SEQ ID NO.2所示。

所述家蚕微孢子虫DNA2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

同时，本发明设计了用于检测的DNA2基因的引物，并对一些其他桑园昆虫进行了了DNA2基因的特异性检测，结果显示，检测引物F/R对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，因此，如下所述应用均应在本发明的保护范围之内。

家蚕微孢子虫DNA2基因在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。

家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用。

一种特异性检测家蚕微孢子虫的检测引物F/R，上下游引物序列分别如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。

一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以权利要求6所述的检测引物F/R进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。

其中，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系(20μL)为：SYBR Green Mix 10μL，Forwrd primer(10pmol/μL)0.5μL，Reverse primer(10pmol/μL)0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O 7μL。

所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。

另外，所述方法在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。蚕桑生产环境较为复杂，混杂有其他种类的微孢子虫。本发明DNA2基因的发现对于治疗和检测的理论验证和生产实践均有一定的意义。

本发明具有以下有益效果：

本发明克隆获得了一种家蚕微孢子虫DNA2基因，并以此为基础提供了一组特异性检测家蚕微孢子虫的特异性检测引物组，对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，在家蚕微孢子虫的特异性检测方面具有很好的应用前景。

而且，家蚕微孢子虫DNA2基因作为一个新发现的蛋白基因，具有潜在的功能应用，为家蚕微孢子虫的相关研究提供了一个新的素材和基础。

附图说明

图1为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白氨基酸系统发育树(N-J)。注：Bootstrap＝1000,图中有下划线的是本研究测定的家蚕微孢子虫DNA2蛋白氨基酸序列。

图2为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白多重比对；1.家蚕微孢子虫DNA2蛋白，2.蜜蜂微孢子虫BRL01蛋白，3.蜜蜂微孢子虫DNA解旋酶蛋白，4.兔脑炎原虫DNA复制解旋酶蛋白，5.兔脑炎原虫DNA解旋酶蛋白，6.兔脑炎原虫EcunIII-L蛋白，7.肠脑炎微孢子虫DNA解旋酶，8.线虫DNA复制解旋酶蛋白。

图3为家蚕微孢子虫DNA2基因的PCR引物设计简图。

图4中A、B、C分别为引物1F/R、2F/R、3F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。

图5为检测引物F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。

图6为检测引物F/R对家蚕微孢子虫的检测灵敏性；注：M:DL2000Marker；泳道：1.10^-1ng/ul DNA；2.10^-2ng/ul DNA；3.10^-3ng/ul DNA；4.10-4ng/ul DNA；4.10^-4ng/ul DNA；5.10^-5ng/ul DNA；6.无菌水。

图7为感病家蚕中肠中N.b DNA2基因的表达水平。

图8为感病家蚕蚕卵中N.b DNA2基因的表达水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 DNA2基因克隆

1、引物设计

同源性分析预测：通过与其他种微孢子虫基因组基因进行同源性分析等手段，设计了家蚕微孢子虫DNA2基因序列编码区的扩增引物ORF-F/ORF-R：

引物ORF-F(SEQ ID NO.4所示)：

5'ATTATCATATGAACAACAATAAGTC 3'；

引物ORF-R(SEQ ID NO.5所示)：

5'ATATGAAGCTTCATAAAATCTCTAAT 3'。

2、PCR扩增和克隆

利用家蚕微孢子虫基因组DNA为模板，以引物ORF-F/ORF-R进行PCR扩增目的基因，将克隆的片段连接到PET28A载体上，然后送去公司(上海生工)进行测序，对测序结果进行验证分析后，获得家蚕微孢子虫DNA2基因全长序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列如SEQID NO.2所示。

另外研究得出，家蚕微孢子虫DNA2基因所编码蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。

3、序列同源性分析

通过在微孢子虫数据库进行同源性比对，BLAST分析表明家蚕微孢子虫DNA2基因与库中蛋白的同源性不高(如图1和2所示)，而其对于微孢子虫又极为重要，因此该基因是一种新发现的蛋白基因，家蚕微孢子虫DNA2基因是家蚕微孢子虫的解旋酶和核酸酶基因，在DNA的复制、修复、重组、转录等多个生理过程中具有不可替代的作用。

实施例2利用DNA2基因检测微孢子虫

1、设计了如表1所示的检测引物组(如图3所示)：

表1家蚕微孢子虫(广东株)转录组的DNA2基因验证及检测的PCR引物

2、检测特异性

以几种不同的微孢子虫DNA模板，利用上述引物进行PCR检测，结果显示，表1中的引物组均对家蚕微孢子虫具有检测特异性。如图4和图5所示。

3、检测灵敏性

灵敏性检测结果显示，检测引物F/R的灵敏度最好(如图6所示)，家蚕微孢子虫DNA2基因作为检测桑园环境中家蚕微孢子虫特异性引物，能检测到浓度为10^-4ng/ul的DNA。

而且，检测引物F/R的扩增片段较短，更利于检测。

因此，检测引物F/R对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和检测灵敏性，在家蚕微孢子虫的检测方面具有很好的应用前景。

实施例3 DNA2基因表达水平

1、检测感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠和蚕卵中N.b DNA2基因的表达水平，结果分别如图7和图8所示。

图7：感病家蚕中肠中N.b DNA2基因在各时间段的相对表达量如下：

6h：1.55；12h：16.67；24h：118.96；48h：194.99:；72h：17.17；96h：5.49；120h：25.89；144h：4.33；168h：2.14；192h：1.32；216h：1.20；240h：1.03；对照组表达量：1。

图8：感病家蚕蚕卵中N.b DNA2基因在各时间段的相对表达量如下：

1h：1.06；12h：7.48；24h：55.83；48：13.66；72h：5.91；96h：3.39；120h：2.01；144h：1.52；168h：1.30；192h：1.23；对照组表达量：1。

结果显示，家蚕微孢子虫感染家蚕以后，可在早期就及时的从中肠何蚕卵中检测到家蚕微孢子虫，结合实时荧光定量PCR检测，可在

综上研究及结果，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，具体如下：

以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以检测引物F/R(序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。

其中，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系(20μL)为：SYBR Green Mix 10μL，Forwrd primer(10pmol/μL)0.5μL，Reverse primer(10pmol/μL)0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O 7μL。

所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 5582

<212> DNA

<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因全长

<400> 1

ctagagtaga aattcgaaat ttgaaaattt tgttgattta aattttaatc cctaagaatg 60

aacaacaata agtcgcctca ttctttcaat tcgctaagaa aaagtcctat acgaaagaaa 120

atgaaagtcg tgtatgaatc aaatatttcg ttctgggaca atgtaaaaga tacaaattgt 180

gaagaggacg cacactcaga aagtgacttt actgaactgt catttacatc gttcgaaatt 240

gaacaatcaa aaaaatcttt aaaaaacatc acttctgtca aatttattat tagagaaata 300

gaaagagaag aagattgtgt tcgtttaatc agtaatgatg ttgtgtgtac agtttatgga 360

gaatggagtg agttagatta tgagatagac acaaaaataa ccgtaactcc ttgtatttgt 420

tgtacaaatg aactggaaag agatttcata gattcaaaga tacacattaa agttgatgat 480

aacactaatt atctatttat tgaagacgat cttatgacta taactaattt atgttcctct 540

attcggtgtt acaataagcc aatggttaat agtaaagtag cagatataaa ctttgaattt 600

agagacaagt gtttggttaa tggaattata ttacacgatg ttatggaaga agtgctgata 660

aacaaaaatt acactcttgc gtttattaat gaagcagtaa gaaaagcaac agaaaacaat 720

gcactaaata tatacgcgtg taatacaacg gaaagaagtg ttaagaagga tatttttgcc 780

agcctaacca atataagtcg ttttaaaaga cataatcttg ttttcgaaca gtctgaaaag 840

cgaattgttt ctttgatttc taatttgaaa ggaaatatcg atgttgttgg agaaaatatt 900

gttttagaaa ttaagagtgg taaaactatg gatgtttctc ataaggcgca agtcatgatg 960

tacaatttgc ttatgaaaga aagatttctt aaggattttg attgttattt gtattacatt 1020

gcaaatgata atcttgttaa aatagacgtt aagcactcag aggttaaaag tctatttata 1080

cggcgaaata aattaacttt gaagaacgat attgaaattt gcaactgtca agcctttgaa 1140

ccttgccaaa ttataaacaa aattttgagt ctgccaaatg accacttttt aaaacaaact 1200

tgggacgcta ttgaaaagga agaaaattat agactaaagg aaacatggaa caatgttact 1260

tttaaaaaac agaatgacac aaatgttatt tttaaatttg attttgagcc ttcaattatt 1320

gatgatattt acattaatat ttacaaccaa gatttaataa aattgtgtaa aggtatcata 1380

acatcctttg aaaataatat tatgatggtt tctcttagtg aaagaatcaa tttagaaaat 1440

aattctcttt attttatatc ttttggctgt aatgatttat tttttaagta tttaagatac 1500

tcactaatta acattgcttt ctttcgttat gtcgataaca gtaatggcca cggttttaaa 1560

ttgccaggtg aggaatttca attaggaaac gaaagtgaca ttgaagattc tgatagttcc 1620

gcagaatctt tagattgtga tagtttagaa tctaatgaaa aatctaataa tgagatcaca 1680

aatcaattgg acgatgtttt tatgaaaacc attgatacga cccccataaa aaacaataat 1740

ataactttaa tcaggaatgt ttcaagtagt ttagatttga atactgctct tttaaaaaac 1800

tcaaattcta gtttagattc ttcttttcaa tattttacac caccaacacc accaaaagtg 1860

acttacaaat atcaaattcc tgaaatttac aaagagcaat tttttaattt gaacgaagag 1920

caaaaaaact cgttgttttt atcacttaat tgtgaaaatt acaaaataat tcatggcatg 1980

cctggcactg gtaaaagcac aatcatcgtt cttttgatta agatattaat ttctcttaat 2040

tttaaagttt tacttgtttg ttacaccaat ttagccatta caaatattct tgataaatta 2100

aaaacggtca gatattacag agcaagaaaa gaaaaaatag attttaaatc atcagaggaa 2160

gtcaaaaaat attatgccaa tatcgattta gtggctagta catgtttcgg attttcagat 2220

acaattttta ttgatagaaa atttgatttt tgtattatcg acgaaggttc acaacaacat 2280

cttcttttaa ctttaattcc tgtgtcatta agcaatagat ttgtggtttt tggcgatcat 2340

ctacaactta agcctcttgt caaatcgtgt aaatttttat caacgagttt gttcgaatac 2400

cttttagatg aagatcattc tgaattacac acacaatata gaatgggaaa aaatattatg 2460

aggttatcta atgaattatt ttatgaaaac aaacttattg cagcaaatga tttcaaagat 2520

aaggttgtat ttattgattc tacagatata aattattctg agttcattag caatgtcaag 2580

aattcaacaa ttctctgtta ttttaattct caggttaaac ttacaaaact gcatacaaag 2640

tgccaagttg agactatcga cagatttcaa ggtagtgaag atgaaaatgt gattattgta 2700

tttgatccag tcagttcgtg tgaggttatg gagagtcatg aaagacttaa tgttgcgtta 2760

acaagagctc gaaagagttt gactttagtt ggagataaag aaaaaatgat ggaaattggt 2820

attttaagga gattattaga gattttatga aaaagaaatt tgttcggttt aattaaaagt 2880

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atcaactcta caaaacacat ggctgcatct gagaacaaca gtaacaaatc cgaaaatggt 3060

aaagatgaga ataatagaga agagaaaaaa gatgaaaaca gcagagaaaa gaaggaagat 3120

gaaaacaaaa tagaatttcg taatgacaaa aaatttccag aagaaatcaa agaagagatt 3180

agaaaggcct tacttcctga attagataag ccttctccaa cgacaatcag taaaaatttg 3240

tctaaaatgc ttaataaaaa ttttggtgct ggttggaatg tcgtggcagg aggtcattat 3300

tcgggaagtt tcacgtatat cgatgggatg tacacggaga ttaaggcgaa agatttagtt 3360

atttcaattt ttaaaattta cataccacaa aaataaacga attattttta aaaaaaggca 3420

gtttaaataa tgttaaagtt tacttaacta actttgaact ttgaagtagt cacaaattaa 3480

gatttatgtc cactgttgtc cctttgttat caacattaag cgtcataacc agttgctttg 3540

taaacatttt ttagtcaaaa cttttattac ttaattcgct taatttcatt gttgtagtta 3600

gtaatagaaa aaatcttatt aggaggatac tcacctgtaa ctgtccttgt tccatctgcg 3660

tgtatattct caaaatattg atcatcttca gtcaaaatat tcaaagccac atcttttata 3720

cagttaattt caacaccact agtctcaaaa atagccacat tacatccatt cacacccact 3780

ggacatgtaa caacttcaac tggatctccg tacaagtctt ttatctcctt ttttatttgt 3840

ttttccggat tttttatcgt aattctcata tccacacgac aagaatggca agacatttca 3900

taattgcact tatagacgtc tttttcagat ttatgacttt cattggttaa gattacaatt 3960

ttatcgtgtt tcacattgca acaagtgcaa gtgacctccg ctgggaatgt aagttctgca 4020

ttcatacctt gtatgttgct aaaatcgcct gttatgttta aggaatactt gatcatttag 4080

ggctcaagaa atttgtaaac aaaataataa aaagaaataa aggaggcatt agtgtagaag 4140

taatgtaaac agttttcttg tagatagatt aaaaatctta ataagcttct ttaaaaaaaa 4200

tatccgtgta acccccttac caaaatatgc tccttaaaga aatcaaacca attcacttcg 4260

gattttacaa aaagaaagcg ccaaaaaccg atttaatcgt ggaattatat tcaaaagacg 4320

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accaatggaa ttactctgta aatttatatt tgtctcttga aaataattat aaagattatt 4620

ctgtagaaga agtgtttgat gaaccaagtc ggttattatg tgatgtttat tatgttaaaa 4680

atgacgaaat taaagacgac aagattaaag atggtgaggt taaggatgaa aatgttgata 4740

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aaggaaataa aatttactgc cacactaaac caatagaatc actcgaattt agtgattcaa 5160

aaacagtaac ttttttaatt aatcttatat ctaaattaag aaatggtcca gttgatttta 5220

ttgaaataga ttgtggtgcc ttgatttggt tggtacgaaa caacaaaggt cttttcttat 5280

tttcaaattt cgaagttgag gagaaagttt caaattttgt caaagatttt cacaatgttt 5340

tccaaaaaat aaaagagaat tgagtgaaag agtatattca ggatatggaa aatatggaat 5400

atataagata gaaaaataag ctttcttttt atctttataa ttacttactg tcataataca 5460

cttttcacct cactttttaa cacacttctc ttttattttt tggaaaacat tgtgaaaatc 5520

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gt 5582

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<211> 2793

<212> DNA

<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因ORF框序列

<400> 2

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tgtgaagagg acgcacactc agaaagtgac tttactgaac tgtcatttac atcgttcgaa 180

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atagaaagag aagaagattg tgttcgttta atcagtaatg atgttgtgtg tacagtttat 300

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catcttcttt taactttaat tcctgtgtca ttaagcaata gatttgtggt ttttggcgat 2280

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atgaggttat ctaatgaatt attttatgaa aacaaactta ttgcagcaaa tgatttcaaa 2460

gataaggttg tatttattga ttctacagat ataaattatt ctgagttcat tagcaatgtc 2520

aagaattcaa caattctctg ttattttaat tctcaggtta aacttacaaa actgcataca 2580

aagtgccaag ttgagactat cgacagattt caaggtagtg aagatgaaaa tgtgattatt 2640

gtatttgatc cagtcagttc gtgtgaggtt atggagagtc atgaaagact taatgttgcg 2700

ttaacaagag ctcgaaagag tttgacttta gttggagata aagaaaaaat gatggaaatt 2760

ggtattttaa ggagattatt agagatttta tga 2793

<210> 3

<211> 930

<212> PRT

<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因编码的蛋白序列

<400> 3

Met Asn Asn Asn Lys Ser Pro His Ser Phe Asn Ser Leu Arg Lys Ser

1 5 10 15

Pro Ile Arg Lys Lys Met Lys Val Val Tyr Glu Ser Asn Ile Ser Phe

20 25 30

Trp Asp Asn Val Lys Asp Thr Asn Cys Glu Glu Asp Ala His Ser Glu

35 40 45

Ser Asp Phe Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ser Phe Glu Ile Glu Gln Ser

50 55 60

Lys Lys Ser Leu Lys Asn Ile Thr Ser Val Lys Phe Ile Ile Arg Glu

65 70 75 80

Ile Glu Arg Glu Glu Asp Cys Val Arg Leu Ile Ser Asn Asp Val Val

85 90 95

Cys Thr Val Tyr Gly Glu Trp Ser Glu Leu Asp Tyr Glu Ile Asp Thr

100 105 110

Lys Ile Thr Val Thr Pro Cys Ile Cys Cys Thr Asn Glu Leu Glu Arg

115 120 125

Asp Phe Ile Asp Ser Lys Ile His Ile Lys Val Asp Asp Asn Thr Asn

130 135 140

Tyr Leu Phe Ile Glu Asp Asp Leu Met Thr Ile Thr Asn Leu Cys Ser

145 150 155 160

Ser Ile Arg Cys Tyr Asn Lys Pro Met Val Asn Ser Lys Val Ala Asp

165 170 175

Ile Asn Phe Glu Phe Arg Asp Lys Cys Leu Val Asn Gly Ile Ile Leu

180 185 190

His Asp Val Met Glu Glu Val Leu Ile Asn Lys Asn Tyr Thr Leu Ala

195 200 205

Phe Ile Asn Glu Ala Val Arg Lys Ala Thr Glu Asn Asn Ala Leu Asn

210 215 220

Ile Tyr Ala Cys Asn Thr Thr Glu Arg Ser Val Lys Lys Asp Ile Phe

225 230 235 240

Ala Ser Leu Thr Asn Ile Ser Arg Phe Lys Arg His Asn Leu Val Phe

245 250 255

Glu Gln Ser Glu Lys Arg Ile Val Ser Leu Ile Ser Asn Leu Lys Gly

260 265 270

Asn Ile Asp Val Val Gly Glu Asn Ile Val Leu Glu Ile Lys Ser Gly

275 280 285

Lys Thr Met Asp Val Ser His Lys Ala Gln Val Met Met Tyr Asn Leu

290 295 300

Leu Met Lys Glu Arg Phe Leu Lys Asp Phe Asp Cys Tyr Leu Tyr Tyr

305 310 315 320

Ile Ala Asn Asp Asn Leu Val Lys Ile Asp Val Lys His Ser Glu Val

325 330 335

Lys Ser Leu Phe Ile Arg Arg Asn Lys Leu Thr Leu Lys Asn Asp Ile

340 345 350

Glu Ile Cys Asn Cys Gln Ala Phe Glu Pro Cys Gln Ile Ile Asn Lys

355 360 365

Ile Leu Ser Leu Pro Asn Asp His Phe Leu Lys Gln Thr Trp Asp Ala

370 375 380

Ile Glu Lys Glu Glu Asn Tyr Arg Leu Lys Glu Thr Trp Asn Asn Val

385 390 395 400

Thr Phe Lys Lys Gln Asn Asp Thr Asn Val Ile Phe Lys Phe Asp Phe

405 410 415

Glu Pro Ser Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Gln Asp

420 425 430

Leu Ile Lys Leu Cys Lys Gly Ile Ile Thr Ser Phe Glu Asn Asn Ile

435 440 445

Met Met Val Ser Leu Ser Glu Arg Ile Asn Leu Glu Asn Asn Ser Leu

450 455 460

Tyr Phe Ile Ser Phe Gly Cys Asn Asp Leu Phe Phe Lys Tyr Leu Arg

465 470 475 480

Tyr Ser Leu Ile Asn Ile Ala Phe Phe Arg Tyr Val Asp Asn Ser Asn

485 490 495

Gly His Gly Phe Lys Leu Pro Gly Glu Glu Phe Gln Leu Gly Asn Glu

500 505 510

Ser Asp Ile Glu Asp Ser Asp Ser Ser Ala Glu Ser Leu Asp Cys Asp

515 520 525

Ser Leu Glu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Asn Glu Ile Thr Asn Gln Leu

530 535 540

Asp Asp Val Phe Met Lys Thr Ile Asp Thr Thr Pro Ile Lys Asn Asn

545 550 555 560

Asn Ile Thr Leu Ile Arg Asn Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Asn Thr

565 570 575

Ala Leu Leu Lys Asn Ser Asn Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe Gln Tyr

580 585 590

Phe Thr Pro Pro Thr Pro Pro Lys Val Thr Tyr Lys Tyr Gln Ile Pro

595 600 605

Glu Ile Tyr Lys Glu Gln Phe Phe Asn Leu Asn Glu Glu Gln Lys Asn

610 615 620

Ser Leu Phe Leu Ser Leu Asn Cys Glu Asn Tyr Lys Ile Ile His Gly

625 630 635 640

Met Pro Gly Thr Gly Lys Ser Thr Ile Ile Val Leu Leu Ile Lys Ile

645 650 655

Leu Ile Ser Leu Asn Phe Lys Val Leu Leu Val Cys Tyr Thr Asn Leu

660 665 670

Ala Ile Thr Asn Ile Leu Asp Lys Leu Lys Thr Val Arg Tyr Tyr Arg

675 680 685

Ala Arg Lys Glu Lys Ile Asp Phe Lys Ser Ser Glu Glu Val Lys Lys

690 695 700

Tyr Tyr Ala Asn Ile Asp Leu Val Ala Ser Thr Cys Phe Gly Phe Ser

705 710 715 720

Asp Thr Ile Phe Ile Asp Arg Lys Phe Asp Phe Cys Ile Ile Asp Glu

725 730 735

Gly Ser Gln Gln His Leu Leu Leu Thr Leu Ile Pro Val Ser Leu Ser

740 745 750

Asn Arg Phe Val Val Phe Gly Asp His Leu Gln Leu Lys Pro Leu Val

755 760 765

Lys Ser Cys Lys Phe Leu Ser Thr Ser Leu Phe Glu Tyr Leu Leu Asp

770 775 780

Glu Asp His Ser Glu Leu His Thr Gln Tyr Arg Met Gly Lys Asn Ile

785 790 795 800

Met Arg Leu Ser Asn Glu Leu Phe Tyr Glu Asn Lys Leu Ile Ala Ala

805 810 815

Asn Asp Phe Lys Asp Lys Val Val Phe Ile Asp Ser Thr Asp Ile Asn

820 825 830

Tyr Ser Glu Phe Ile Ser Asn Val Lys Asn Ser Thr Ile Leu Cys Tyr

835 840 845

Phe Asn Ser Gln Val Lys Leu Thr Lys Leu His Thr Lys Cys Gln Val

850 855 860

Glu Thr Ile Asp Arg Phe Gln Gly Ser Glu Asp Glu Asn Val Ile Ile

865 870 875 880

Val Phe Asp Pro Val Ser Ser Cys Glu Val Met Glu Ser His Glu Arg

885 890 895

Leu Asn Val Ala Leu Thr Arg Ala Arg Lys Ser Leu Thr Leu Val Gly

900 905 910

Asp Lys Glu Lys Met Met Glu Ile Gly Ile Leu Arg Arg Leu Leu Glu

915 920 925

Ile Leu

930

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物ORF-F

<400> 4

attatcatat gaacaacaat aagtc 25

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物ORF-R

<400> 5

atatgaagct tcataaaatc tctaat 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 检测引物F

<400> 6

gtgaagagga cgcacactca 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 检测引物R

<400> 7

accattggct tattgtaaca ccg 23

Claims (10)

1.家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其全长序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其ORF框序列如SEQ IDNO.2所示。

3.家蚕微孢子虫DNA2基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.家蚕微孢子虫DNA2基因在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。

5.家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用。

6.一种特异性检测家蚕微孢子虫的引物组，其特征在于，为检测引物F/R，上下游引物序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

7.一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以权利要求6所述的检测引物F/R进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系为：SYBR Green Mix 10μL，Forwrd primer（10 pmol/μL）0.5μL，Reverse primer（10 pmol/μL）0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O 7μL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。

10.权利要求7所述方法在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。