CN105861655B - 一种快速鉴定大豆疫霉对烯酰吗啉抗药性的方法及专用引物对 - Google Patents

一种快速鉴定大豆疫霉对烯酰吗啉抗药性的方法及专用引物对 Download PDF

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Abstract

本发明涉及大豆疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在烯酰吗啉抗性检测及监测中的应用，具体公开了一种鉴定大豆疫霉对烯酰吗啉抗药性的分子检测方法及专用引物对。属于分子生物学技术领域。该引物对由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示DNA分子组成，其PCR退火温度为61℃。本发明提供的检测大豆疫霉对烯酰吗啉产生抗药性的点突变的方法，具有灵敏度高、简捷快速、稳定性好的特点，可以用于快速、灵敏地检测田间大豆疫霉对烯酰吗啉的抗性发生发展动态，对于病原菌抗性发生的早期预警具有重要意义，以达到指导并及时调整病害防治策略，有效控制病原菌抗药性发展以及延长杀菌剂市场寿命的目的。

Description

一种快速鉴定大豆疫霉对烯酰吗啉抗药性的方法及专用引 物对
技术领域
本发明涉及大豆疫霉纤维素合酶相关基因CesA3的克隆及其在烯酰吗啉抗性检测及监测中的应用，具体公开一种快速鉴定大豆疫霉CesA3基因的核苷酸点突变及其对烯酰吗啉抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。
背景技术
大豆疫病是由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)引起的一种具有危险性、毁灭性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可发病，其中感病品种一般减产25％～50％，高感品种可达90％以上，甚至绝收；并且籽粒蛋白含量明显下降，使用价值受到影响。该病害自1948年在美国印第安纳州东北部首次被发现后，迅速扩展到巴西、阿根廷等20多个国家；在我国则主要发生在黑龙江、安徽、福建等省，为重要的外检和内检病害。
大豆疫霉为同宗配合的卵菌，自然条件下即可发生有性生殖，加速了基因的重组与交换，使得田间大豆疫霉菌株的遗传多样性越来越丰富；而且大豆疫霉生理小种毒性变异明显，新小种层出不穷，许多大豆抗性基因已被新的小种所克服，抗病资源失去效用。而化学防治的快速有效，使之成为该病害防治中较为重要的措施。但目前国内外专门用于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，其中最具有代表性的是以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，是第一代专门用于防治卵菌病害的一大类重要的内吸性杀菌剂。然而，由于该类杀菌剂的作用位点较为单一，而且大面积广泛使用，致使病原菌对该类药剂的抗药性接踵而至，并且发展迅速。目前病原菌对甲霜灵的抗性问题已尤为严重，但抗性分子机制暂未有确切的报道。羧酸酰胺类杀菌剂(Carboxylic acid amide，CAAs)是一类目前用于卵菌病害防治的主要杀菌剂，其中主要代表有烯酰吗啉、氟吗啉、双炔酰菌胺以及异丙菌胺等。然而在使用该类杀菌剂若干年之后，已经在田间采集的葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)以及黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis)中检测到对CAA类杀菌剂产生抗性的群体。
植物病原菌抗药性检测或监测中常见的两种方法分为传统生物学方法和分子生物学方法。传统生物学方法，包括菌落生长测定法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法，还有琼脂展布法、抑菌圈测定法等。这些方法是通过测定药剂对病原菌的EC50以区分敏感和抗性菌株，通常需要多个药剂处理，多次重复，因此就导致了这种方法检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多；而且这种方法检测灵敏度低，要求抗药性菌株的突变频率在1％以上。随着分子生物学技术的快速发展与进步，分子技术已在病原菌抗药性检测以及监测中得到广泛的应用，例如AS-PCR(Allele-specific PCR)以及PCR-RFLP(RestrictionFragment Length Polymorphism)。而且，与传统的检测方法比较，分子生物学方法从提DNA到特异性PCR或酶切分析，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10-5～10-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。
发明内容
本发明旨在提供一种检测或辅助检测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3是否存在抗烯酰吗啉突变位点的方法及其专用引物对，以期能提供一种简单快速、高灵敏度的分子检测方法以用于烯酰吗啉抗性菌株的检测与监测，以便及时了解抗药性发生动态。这对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要的意义。
本发明所提供的检测或辅助检测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3是否存在突变位点的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示DNA分子组成。
本发明所提供的检测或辅助检测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3是否存在抗烯酰吗啉突变位点的方法如下：
以待测大豆疫霉的基因组DNA为模板，若用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，25μL扩增体系为：1μL模板DNA(30-50ng)，每条引物(10μM)1μL，12.5μL 2×Taq Mix(购自北京博迈德科技发展有限公司)，9.5μL ddH2O。反应程序为：预变性94℃4min；94℃30s，61℃30s，72℃30s，30个循环；最后72℃下延伸10min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。若PCR扩增产物为383bp的片段，则所述待测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3存在或候选存在突变位点；所述突变位点是指大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3的序列自5’末端起第3070位核苷酸为C，即是指SEQ ID NO:3中自5’末端起第3070位核苷酸。
本发明的另一个目的是提供大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3以及对应蛋白的突变位点。
本发明所提供的大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3的一个突变位点，为大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3基因组序列自5’末端起第3070位核苷酸为C，即SEQ IDNO:3中自5’末端起的第3070位核苷酸。
本发明所提供的大豆疫霉中纤维素合酶相关蛋白CesA3的一个突变位点，为大豆疫霉中纤维素合酶相关蛋白CesA3自N端起第1024位氨基酸为亮氨酸，即是指SEQ ID NO:4中自5’末端起的第1024位氨基酸。
以上任一所述突变位点在鉴定大豆疫霉抗药性中的应用也属于本发明的保护范围。所述抗药性为抗烯酰吗啉的抗药性。
上述应用中，存在所述突变位点的大豆疫霉具有或候选具有对烯酰吗啉的抗药性。
SEQ ID NO:3所示基因或SEQ ID NO:4所示蛋白也属于本发明的保护范围。
本发明提供的检测大豆疫霉对烯酰吗啉产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间大豆疫霉对烯酰吗啉的抗性发生发展动态，以便及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。
附图说明
图1为对烯酰吗啉表现抗性和敏感的大豆疫霉菌株纤维素合酶相关基因CesA3全序列比对结果，发现与抗性相关的一个碱基突变位点。其中，Ps6、Ps13和PsJMS2为敏感菌株，RX9-1及RX9-2为抗性菌株。
图2为对烯酰吗啉表现抗性和敏感的大豆疫霉菌株纤维素合酶相关蛋白CesA3全序列比对结果，发现与抗性相关的一个氨基酸突变位点。其中，Ps6、Ps13和PsJMS2为敏感菌株，RX9-1及RX9-2为抗性菌株。
图3为采用不同AS-PCR引物对进行温度梯度PCR扩增电泳图。S：敏感菌株；R：抗性菌株；由上至下正向引物依次为Ps3070A.R、Ps3070T.R、Ps3070G.R、Ps3070C.R，正向引物均为Ps3070F。
图4为采用特异性引物对Ps3070F-Ps3070T.R扩增对烯酰吗啉表现敏感和抗性的大豆疫霉菌株的AS-PCR电泳图。Marker：Trans2K Plus DNA Marker；RX9-1及RX9-2为抗性菌株；Ps6、Ps13和PsJMS2为敏感菌株；CK为阴性对照。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
文中“抗性菌株”均指对烯酰吗啉抗性的大豆疫霉菌株；“敏感菌株”均指对烯酰吗啉敏感的大豆疫霉菌株。
下述实施例中使用的大豆疫霉菌株：RX9-1及RX9-2为抗性菌株；Ps6、Ps13和PsJMS2为敏感菌株。
上述菌株Ps6和Ps13均采自于中国福建地区，由福建省农业科学院陈福如研究员馈赠；PsJMS2采自于中国黑龙江地区，由中国农业科学院朱振东研究员馈赠。抗性菌株RRX9-1及RX9-2均通过烯酰吗啉药剂驯化的方法获得，亲本菌株均为Ps6。以上各菌株均经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为大豆疫霉菌株。上述各菌株均经过菌落生长速率法进行敏感性测定和抗药性验证。
实施例1、大豆疫霉对烯酰吗啉的敏感性测定
3株敏感菌株Ps6、Ps13和PsJMS2；2株抗性菌株RX9-1及RX9-2。
胡萝卜培养基：胡萝卜200g，榨汁，4层纱布过滤，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20min。
1、实验步骤如下：
1)将烯酰吗啉用二甲基亚砜(DMSO)配成5×104μg/ml的母液。对于3株大豆疫霉敏感菌株的敏感性测定，将烯酰吗啉稀释成80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL、180μg/mL和200μg/mL的浓度梯度。对于2株大豆疫霉抗性菌株的敏感性测定，烯酰吗啉被逐级稀释成5×103μg/mL、1×104μg/mL、1.5×104μg/mL、2×104μg/mL和2.5×104μg/mL的浓度梯度。
2)按由低到高的顺序，用移液枪吸取各个浓度梯度的药液480μL加入已灭菌的冷却至45℃的480mL胡萝卜培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，以只加480μL DMSO的处理为空白对照。每个浓度重复3次。
3)取25℃下黑暗培养4天后的大豆疫霉菌株，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照平板中，置于25℃培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。
4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各个浓度下对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出各个供试大豆疫霉菌株对烯酰吗啉的毒力回归曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC50值。
2.结果
表1 3株大豆疫霉敏感菌株和4株大豆疫霉抗性菌株对4中烯酰吗啉的敏感性
敏感性测定结果表明，烯酰吗啉对敏感菌株Ps6、Ps13和PsJMS2的EC50均小于1μg/mL，而对抗性菌株RX9-1及RX9-2的EC50均大于10μg/mL，有的甚至大于25μg/mL，抗性倍数均在100倍以上。
实施例2、大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3及其对应蛋白突变位点的发现
1、菌株：抗性菌株RX9-1及RX9-2，敏感菌株Ps6、Ps13和PsJMS2。
2、方法：
1)模板：分别以抗性菌株和敏感菌株的基因组DNA及cDNA为模板。
2)纤维素合酶相关基因CesA3全序列的PCR扩增
引物(表2)：Ps CesA3F(5’-GTTCGTCGTTGCCTTCACC-3’)
Ps CesA3R(5’-TACTGCCTTCCCGTTTCCT-3’)
采用北京全式金生物技术有限公司试剂，50μL反应体系中包括1μL模板DNA(30-50ng)，4μL 10mM dNTP，5μL 10×扩增缓冲液(含20mM Mg2+)，1μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，每条引物(10μM)1μL，37μL ddH2O，反应体系根据后续试验需要进行成倍增减。反应程序为：预变性94℃4min；94℃30s，58℃30s，72℃3min 30s，35个循环；最后72℃下延伸10min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
3)测序
将PCR产物进行测序，测序引物见表2。以基因组DNA为模板时，抗性菌株的纤维素合酶相关基因CesA3全序列共3165bp，序列如SEQ ID NO:3所示，无内含子序列，共编码1054个氨基酸，序列如SEQ ID NO:4所示。
4)序列比对
分别将抗性菌株RX9-1及RX9-2，与敏感菌株Ps6、Ps13和PsJMS2的纤维素合酶相关基因CesA3全序列进行测序。通过DANMAN软件分析序列结果，发现存在如下突变位点：与敏感菌株相比，抗性菌株RX9-1和RX9-2的纤维素合酶相关基因CesA3自5’末端起在基因序列的第3070位核苷酸由G突变为C(图1)，该位点碱基突变导致氨基酸序列在第1024位发生突变，由缬氨酸(Val，V)突变为亮氨酸(Leu，L)(图2)。
实施例3、检测大豆疫霉中突变位点的方法
1、引物设计
菌株为实施例1中所用菌株Ps6、RX2-1和RX9-1。
根据突变体RX9-1纤维素合酶相关基因CesA3的序列设计AS-PCR引物。引物对Ps3070F-Ps3070A/T/C/G.R用于检测G3070C的突变位点。其中，反向引物Ps3070A.R的3’-端最后一个碱基为突变后的碱基，正向引物为Ps3070F(表2)。为了增加引物的特异性，在反向引物3’-端第二个碱基引入错配碱基(表2，引物Ps3070T/C/G.R)。
表2检测对烯酰吗啉表现抗性的大豆疫霉菌株所使用的PCR引物
具体反应体系与实施例2中相同，对引物进行不同退火温度的温度梯度PCR，确定特异性高的退火温度。反应程序为：预变性94℃4min；94℃30s，50-68℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃下延伸10min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
结果如图3所示，引物对Ps3070F-Ps3070A.R在50-61℃的退火温度下均能从敏感菌株和抗性菌株的基因组DNA中扩增出383bp的片段，不能很好地将之区分开。在64.4℃的退火温度下，虽然引物对Ps3070F-Ps3070A.R仅能从抗性菌株中扩增出目的片段，但条带亮度较弱，扩增效率不高。当退火温度为61℃时，引物对Ps3070F-Ps3070T/G/C.R能够从抗性菌株RX9-1的基因组DNA中扩增出383bp的片段，而不能从敏感菌株中扩增出相应的片段。其中Ps3070F-Ps3070T引物对的PCR条带亮度最强，特异性最强。因此选择Ps3070F-Ps3070T引物对作为AS-PCR引物用来检测G3070C的突变位点，退火温度为61℃。将引物对Ps3070F-Ps3070T.R对抗性菌株RX9-1的扩增产物进行测序，结果PCR产物序列为SEQ ID NO：3中自5’末端起第2711至3093位核苷酸序列。
2、检测突变位点
以待测大豆疫霉Ps6、Ps13、PsJMS2、RX9-1和RX9-2的基因组DNA为模板，采用引物对Ps3070F-Ps3070T.R进行PCR扩增，若得到383bp的片段，则判定所检测的大豆疫霉基因组中纤维素合酶相关基因CesA3自5’末端起第3070位核苷酸为C(即SEQ ID NO:3中自5’末端起第3070位核苷酸为C)，进一步判定所述菌株为烯酰吗啉抗性菌株。
PCR反应体系如下：
PCR反应程序：
结果如图4所示，引物对Ps3070F-Ps3070T.R能够从对烯酰吗啉表现抗性的大豆疫霉菌株RX9-1和RX9-2中扩增出特异性片段，而在敏感菌株Ps6、Ps13和PsJMS2中均未扩增出任何条带，表明该对引物可以用于特异性检测大豆疫霉是否对烯酰吗啉产生了抗性。

Claims (7)

1.一种检测或辅助检测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3或对应蛋白是否存在位点突变的方法，步骤如下：
以待测大豆疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增；若PCR扩增产物为383bp的片段，则所述待测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3存在或候选存在位点突变，且所述位点突变是指CesA3基因组序列中自5’末端起第3070位核苷酸突变为C，即SEQ ID NO:3中自5’末端起第3070位核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对的PCR扩增中，退火温度为61℃。
3.一种检测或辅助检测大豆疫霉中纤维素合酶相关基因CesA3是否存在位点突变的引物对，由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示DNA分子组成。
4.检测大豆疫霉的纤维素合酶相关基因CesA3或该基因编码的蛋白中的位点突变的试剂在鉴定大豆疫霉对烯酰吗啉的抗药性中的应用，所述位点突变是指以下的1)或2)：
1)CesA3基因组序列中自5’末端起第3070位核苷酸突变为C，即SEQ ID NO:3中自5’末端起第3070位核苷酸；
2)CesA3基因编码的蛋白序列中自N端起第1024位氨基酸突变为亮氨酸，即SEQ ID NO:4自N端起第1024位氨基酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：存在所述位点突变 的大豆疫霉具有或候选具有对烯酰吗啉的抗药性。
6.SEQ ID NO:3所示基因。
7.SEQ ID NO:4所示蛋白。
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Resistance to the Novel Fungicide Pyrimorph in Phytophthora capsici: Risk Assessment and Detection of Point Mutations in CesA3 That Confer Resistance;Zhi li Pang等;《PLOS ONE》;20130228;第8卷(第2期);e56513
Sexual reproduction increases the possibility that Phytophthora capsici will develop resistance to dimethomorph in China;Y. Bi等;《Plant Pathology》;20140327;第63卷;1365–1373

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