CN103789409B - 一种鉴定番茄灰霉病菌对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法 - Google Patents

一种鉴定番茄灰霉病菌对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及灰霉病菌(Botrytis cinerea)β-微管蛋白基因的克隆及其在苯酰菌胺(zoxamide)抗性监测中的应用，具体公开了一种快速鉴定灰霉病菌抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物技术领域。该特异性引物对SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)和SEQ ID NO:5所示的DNA分子组成。本发明提供的检测灰霉病菌对苯酰菌胺产生抗药性的点突变的方法，具有高灵敏度、简单快速、稳定性好的特点，可以快速、灵敏地检测田间灰霉病菌对苯酰菌胺的抗性发生发展动态，及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。

Description

一种鉴定番茄灰霉病菌对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法
技术领域
本发明涉及灰霉病菌(B.cinerea)β-微管蛋白基因的克隆在杀菌剂苯酰菌胺抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定灰霉病菌β-微管蛋白基因核苷酸点突变及其对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。
背景技术
番茄灰霉病是有B.cinerea Pers ex Fr(anamorph of Botryotinia fuckeliana(de Bary)Whetz)所引起的一种世界性病害。该病原菌不仅可以侵染番茄还可以侵染黄瓜、茄子、葡萄等蔬菜和水果，甚至玫瑰、大丁草花之类的花卉，寄主至少达235种之多。该病害一般可造成减产20％-30％，大面积流行时损失更为惨重，已成为蔬果栽培和储存生产中的限制性障碍。
目前关于灰霉病的防治措施主要有抗病品种的选育、农业防治、生物防治和化学防治等，其中化学药剂的使用以其高效、方便、经济等特点，得以成为生产中控制该病害的主要措施。防治番茄灰霉病的杀菌剂包括很多种，如保护性杀菌剂、苯并咪唑类、N-苯基氨基甲酸酯类、二甲酰亚胺类、苯胺嘧啶类、吡咯类、酰胺类和唑类杀菌剂等。但由于灰霉病菌的遗传变异性大、繁殖速度快和寄主范围广等特点，再加上药剂的大面积频繁使用，导致了多种药剂对灰霉病菌丧失了防效，例如多菌灵、乙霉威、腐霉利、戊唑醇、环酰菌胺以及啶酰菌胺的抗性问题在各个地区均很严重。
苯酰菌胺(zoxamide)是21世纪初开始市场推广的一种新型苯甲酰胺类杀菌剂。其除对卵菌有特效外，对B.cinerea、Venturia inaequalis、Monilinia fructicola、Mycosphaerella fijiensis和Cercospora beticola等病原真菌也具有较好的活性。该杀菌剂作用机制与苯并咪唑类杀菌剂类似，也是作用于靶标菌的β-微管蛋白。但是以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂在田间使用后，抗药性问题很快产生并日益严重，FRAC(Fungicide Resistance Action Committee)将其列为高等抗性风险的杀菌剂。而苯酰菌胺在欧美地区已有12年之久的使用历史，未有任何其单独使用产生抗药性的报道，推测该药剂与多菌灵具有不同的抗性机制，目前有关灰霉病菌对苯酰菌胺的抗性分子机制尚未明确。该药剂在我国也正处于登记推广的阶段，因此明确其具体的抗性基因，建立抗性分子检测方法，可以用于将来田间抗性的快速检测，以及了解其抗性发展的动态，以制定合理的病害管理方案和延缓抗药性的产生。
在植物病原菌抗药性检测或监测中主要包括传统生物学方法和分子生物学方法。传统生物学方法，即是通过测定药剂对病原菌的EC50以区分敏感和抗性菌株，需要多个药剂处理，多次重复，检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多；而且这种方法检测灵敏度低，要求抗药性菌株的突变频率在1％以上。而分子生物学方法，从提DNA到特异性PCR或酶切分析，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10-5-10-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。
发明内容
本发明旨在提供一种检测或辅助检测灰霉病菌中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。
本发明所提供的检测或辅助检测灰霉病菌中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：
以待测灰霉病菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:1或SEQID NO:3)和SEQ ID NO:5所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为365bp的片段，则所述待测灰霉病菌中β-微管蛋白基因存在或候选存在突变位点；
所述突变位点是指灰霉病菌中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸为A。
所述灰霉病菌中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸也就是SEQ ID NO:6中自5’末端起第876位核苷酸。
上述过程中，所述PCR扩增中，引物对SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:1或SEQID NO:3)和SEQ ID NO:5退火温度为50-56.7℃。
本发明所提供的检测或辅助检测灰霉病菌中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO:2(或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3)和SEQ ID NO:5所示DNA分子组成。
本发明所提供的灰霉病菌中β-微管蛋白基因的一个突变位点，为灰霉病菌中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸为A。所述灰霉病菌中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸也就是SEQ ID NO:6中自5’末端起第876位核苷酸。
本发明所提供的灰霉病菌中β-微管蛋白的一个突变位点，为灰霉病菌中β-微管蛋白自N端起第233位氨基酸为异亮氨酸(Ile)。所述β-微管蛋白自N端起第233位氨基酸也就是SEQ ID NO:7中自N端起的第233位氨基酸。
以上任一所述的检测灰霉病菌中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对在鉴定灰霉病菌抗药性中的应用属于本发明的保护范围；所述抗药性为对苯酰菌胺的抗药性。
上述应用中，存在所述突变位点的灰霉病菌具有或候选具有对苯酰菌胺的抗药性。
SEQ ID NO:6所示基因或SEQ ID NO:7所示蛋白也属于本发明的保护范围。
本发明提供的检测灰霉病菌对苯酰菌胺产生抗药性的点突变的方法，可以用于快速、灵敏地检测田间灰霉病菌对苯酰菌胺的抗性发生发展动态，为抗药性的治理提供技术支持，便于及时调整病害防治策略，以延缓和控制抗药性的进一步发展。
附图说明
图1，图2为对苯酰菌胺表现抗性和敏感的灰霉菌株β-微管蛋白基因全序列和蛋白序列比对结果，发现与抗性相关的一个突变位点。其中，NJ11、SF2-8、FJY1-34、SQ15、LY10和FJ1-10为田间敏感菌株，RZ-BC14和RZ-BC16为抗性菌株。
图3(A)为采用不同AS-PCR引物进行温度梯度PCR扩增电泳图，表明各个引物的特异性存在差异。R：抗性菌株；S：敏感菌株；由上至下正向引物依次为RZBC233C、RZBC233T、RZBC233A及RZBC233G，反向引物均为RZBCR。
图3(B)为采用特异性引物对RZBC233A/RZBCR扩增对苯酰菌胺表现敏感和抗性的灰霉菌株的PCR电泳图(退火温度53.5℃)。Marker：DNA Marker II；RZ-BC14和RZ-BC16为苯酰菌胺抗性菌株；NJ11、SQ15、FJY1-34为苯酰菌胺敏感菌株；Mock为阴性空白对照。采用特异性引物对RZBC233C/RZBCR或RZBC233G/RZBCR时，具有同样的鉴定效果。采用引物对RZBC233T/RZBCR时，提高退火温度至61℃，才能将抗性菌株与敏感菌株区分开。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
文中“抗性菌株”均指对苯酰菌胺抗性的灰霉病菌；“敏感菌株”均指对苯酰菌胺敏感的灰霉病菌；
下述实施例中使用的灰霉菌株为：抗性菌株RZ-BC14和RZ-BC16；敏感菌株NJ11、SF2-8、FJY1-34、SQ15、LY10和FJ1-10
上述菌株NJ11采自于中国江苏南京地区，SF2-8采自于中国上海金山地区，FJY1-34采自于中国福建建阳地区，SQ15采自于中国上海青浦地区，LY10采自于中国辽宁营口地区，FJ1-10采自于中国福建建瓯地区。抗性菌株RZ-BC14和RZ-BC16均通过药剂驯化的方法获得，亲本菌株均为NJ11。以上菌株均经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定为灰霉病菌。上述各个菌株均通过菌落生长速率法进行敏感性测定和抗药性验证。
实施例1、灰霉病菌对苯酰菌胺的敏感性测定
6株敏感菌株NJ11、SF2-8、FJY1-34、SQ15、LY10和FJ1-10；2株抗性菌株RZ-BC14和RZ-BC16。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖18g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。
1、实验步骤如下：
1)将苯酰菌胺用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMSO)配成105μg/mL的母液。将苯酰菌胺逐级稀释成4×102μg/mL、6×102μg/mL、8×102μg/mL、1×103μg/mL、2×103μg/mL、4×103μg/mL和5×103μg/mL的浓度梯度，1‰DMSO作为空白对照，以测定6株灰霉敏感菌株的敏感性。对于2株灰霉抗性菌株的敏感性测定，1‰DMSO作为空白对照，浓度梯度为3×103μg/mL、5×103μg/mL、1×104μg/mL、2.5×104μg/mL和5×104μg/mL
2)按由低到高的顺序，用移液枪吸取各个浓度梯度的药液60μL加入已灭菌的冷却至45℃的60mL PDA培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9㎝的培养皿中，以只加60μL DMSO的处理为空白对照。每个浓度重复3次。
3)取20℃下黑暗培养3天后的灰霉菌株，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照平板中，置于20℃培养箱中黑暗培养，3d后测量菌落直径。
4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各个浓度下对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出各个供试灰霉菌株对苯酰菌胺的毒力回归曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC50值，并计
2、结果
敏感性测定结果表明，6株敏感菌株对苯酰菌胺的EC50在0.49-1.84μg/mL之间，而2株抗性菌株的EC50均大于20μg/ml，极显著高于敏感菌株的EC50，抗性倍数(抗性菌株EC50/亲本菌株EC50)也均在12倍以上，属于中等水平的抗性菌株。
表1.6 株灰霉病菌敏感菌株和2株灰霉病菌抗性菌株对苯酰菌胺的敏感性
实施例2、灰霉病菌中β-微管蛋白基因及其对应蛋白突变位点的发现
1、菌株：抗性菌株RZ-BC14和RZ-BC16；敏感菌株NJ11、SF2-8、FJY1-34、SQ15、LY10和FJ1-10。
2、方法：
1)菌株培养：将预培养的灰霉病菌菌株接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，20℃黑暗培养3d后收集菌丝，液氮冰冻后于-80℃保存，用于提取基因组DNA。
2)分别提取抗性菌株和敏感菌株的基因组DNA。
3)β-微管蛋白基因全序列的PCR扩增，所用引物如表2所示。
表2 灰霉病菌β-微管蛋白基因全序列扩增所用引物
PCR反应体系：PCR反应采用北京全式金生物技术有限公司试剂，50μL反应体系中包括1μL模板DNA(30-50ng)，4μL 10mM dNTP，5μL 10×扩增缓冲液(含20mM Mg2+)，1μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，每条引物(10μM)1μL，37μL ddH2O。
PCR反应条件：预变性94℃4min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min 30s，35个循环；最后72℃下延伸10min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
4)测序
将PCR产物进行测序。根据3对引物所扩增序列的重叠区域进行序列拼接，所扩增抗性菌株和敏感菌株的β-微管蛋白基因序列均为3136bp，将内含子区域剔除后得到密码子序列1344bp。其中抗性菌株的基因组序列如SEQ ID NO:6所示，共编码447个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示
5)序列比对
分别将抗性菌株与敏感菌株的β-微管蛋白基因全序列进行比对。结果表明：与敏感菌株相比，抗性菌株中基因组β-微管蛋白基因自5’末端起在DNA序列的876位核苷酸由G突变为A(图1)。该位点碱基突变导致氨基酸序列在233位发生突变，由甲硫氨酸(Met，M)突变为异亮氨酸(Ile，I)(图2)。
PCR产物测序结果表明，抗性菌株在876位均发生了由G变为A的突变，分析测序的峰线图，可发现该位点峰线图清晰单一明确，表明该位点的突变为纯合突变。推测该位点的突变与灰霉病菌对苯酰菌胺产生抗性相关(图1)。
实施例3、检测灰霉病菌中突变位点的方法
一、引物设计
菌株为实施例1中所用菌株NJ11、SQ15、FJY1-34、RZ-BC14和RZ-BC16。
引物如表3，根据突变体β-微管蛋白基因的序列设计allele specific-PCR(AS-PCR)引物，正向引物RZBC233T的3’-端第二个碱基为突变后的碱基，为了增加引物的特异性，在正向引物3’-端第一个碱基处引入错配的碱基(引物RZBC233A、RZBC233C和RZBC233G，错配碱基以下划线表示)。反向引物为RZBCR。
表3 AS-PCR检测对苯酰菌胺表现抗性的灰霉病菌所使用的引物
具体反应体系与实施例2中相同。对引物进行不同退火温度的梯度PCR，确定特异性高的退火温度。反应程序为：预变性94℃ 4min；94℃ 30s，50-68℃ 30s，72℃30s，35个循环；最后72℃下延伸10min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳检测。
结果如图3(A)所示，引物随着退火温度的提高其特异性均有所提高。其中在3’-端第一个碱基引入错配碱基的引物对RZBC233A/RZBCR、RZBC233C/RZBCR和RZBC233G/RZBCR，在退火温度为50-56.7℃时，只能从抗性菌株中扩增出365bp的目的条带；而在3’-端没有引入错配碱基的引物对RZBC233T/RZBCR，只有当退火温度至61℃时才只能在抗性菌株中扩增出365bp的目的条带，而不能从敏感菌株中扩增出相应的片段。对比以上四对引物的特异性、灵敏性和稳定性，三个含有错配碱基的引物对均可以用于G876A抗性等位基因的检测，在同等反应体系下，以RZBC233A/RZBCR扩增的条带最亮，特异性和灵敏性表现最优。
将三对引物对抗性菌株的扩增产物进行测序，测序PCR产物序列为SEQ ID NO:6中自5’末端起第861至1225位核苷酸序列。
二、检测突变位点
以待测灰霉病菌的基因组DNA为模板，采用引物对RZBC233A/RZBCR或引物对RZBC233G/RZBCR或引物对RZBC233C/RZBCR进行PCR扩增，若得到365bp的片段，则判定所检测的灰霉病菌基因组中β-微管蛋白基因序列自5’末端起876位核苷酸为A(即SEQ ID NO:6中自5’末端起第876位核苷酸为A)，进一步判定所述菌株为抗性菌株；若未扩增出365bp的片段，则判定所检测的灰霉病菌基因组中β-微管蛋白基因序列自5’末端起第876位核苷酸为G(即SEQ ID NO:6中自5’末端起第876位核苷酸为G)，进一步判定所述菌株为敏感菌株。
PCR扩增体系及反应条件与实验一中一致，退火温度为53.5℃。
待测菌株：敏感菌株NJ11、SQ15、FJY1-34；抗性菌株RZ-BC14和RZ-BC16。
结果如图3(B)所示，结果表明，引物对RZBC233A/RZBCR仅能够从对苯酰菌胺表现抗性的灰霉病菌菌株(RZ-BC14和RZ-BC1)中扩增出特异性目标片段，而不能从敏感菌株(NJ11、SQ15、FJY1-34)中未扩增出任何条带，因此，采用引物对RZBC233A/RZBCR，在退火温度为53.5℃时进行PCR扩增，可以用于特异性检测灰霉病菌病菌是否对苯酰菌胺产生了抗药性。

Claims (4)

1.一种检测或辅助检测灰霉病菌(Botrytis cinerea)中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：
以待测灰霉病菌的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，或者SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，或者SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为365bp的片段，则所述待测灰霉病菌中β-微管蛋白基因存在或候选存在突变位点，该基因的碱基序列如SEQ ID NO：6所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述PCR扩增中，退火温度为50-56.7℃
所述突变位点指灰霉病菌中β-微管蛋白的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸为A。
2.一种检测或辅助检测灰霉病菌中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5，或者SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5，或者SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:5组成。
3.权利要求1所述的方法或者权利要求2所述的引物对在鉴定灰霉病菌抗药性中的应用；所述抗药性为抗苯酰菌胺(zoxamide)杀菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：对苯酰菌胺具有抗药性的灰霉病菌在β-微管蛋白的基因组序列自5’末端起第876位核苷酸发生突变。
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