CN104651493A - 快速鉴定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸点突变及其对氟噻唑吡乙酮抗药性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白相关基因PcORP1核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂氟噻唑吡乙酮抗性监测中的应用，具体公开了两种鉴定辣椒疫霉PcORP1基因2379位核苷酸突变对氟噻唑吡乙酮产生抗药性的分子检测方法及其专用引物。所述突变位点指辣椒疫霉菌中PcORP1基因的自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。由此导致PcORP1蛋白的自N端起第769位氨基酸为甘氨酸与色氨酸杂合或纯合的色氨酸。本发明提供的分子检测方法，灵敏度高、稳定性好、检测周期短，可用于高通量地监测田间辣椒疫霉对杀菌剂氟噻唑吡乙酮的抗性基因频率以及抗性发生和发展情况，实现抗性病害的早期预警，指导及时调整辣椒疫霉防治策略，合理用药，延缓抗药性的发生和发展，并在病害的可持续管理系统中发挥重要的作用。

Description

快速鉴定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸点突变及其对氟噻唑吡乙酮抗药性的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴定辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白相关蛋白PcORP1基因核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂氟噻唑吡乙酮抗性检测中的应用，具体公开一种快速鉴定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸点突变及其对氟噻唑吡乙酮抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

辣椒疫霉(Phytophthora capsici Leonian)是一种重要的土传植物病原卵菌，寄主范围广泛，可侵染至少27科中的71种寄主植物。辣椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是一种世界性分布的毁灭性病害，在我国普遍发生，且有逐年加重趋势。在气候适宜的条件下，短期内就可爆发，蔓延速度极快，一般发病可引起30％产量损失，严重时可导致绝产。

目前，化学防治以其速效和高效的特点，在辣椒疫霉等植物病原卵菌病害的防治中依然发挥着不可替代的作用。但是随着一些内吸性杀菌剂的不合理频繁使用，许多植物病原卵菌已经对其产生了严重的抗药性。因此，国际上各大农化公司一直致力于开发具有全新作用机制且与市场上现有杀菌剂无交互抗药性的新型杀菌剂，用于辣椒疫霉等植物病原卵菌病害的防治和抗药性治理。

氟噻唑吡乙酮(oxathiapiprolin)即是美国杜邦公司2007年研发出的具有全新化学结构的新型植物病原卵菌抑制剂，其化学结构包括了吡唑环、噻唑环及异恶唑啉环(WO2008013925)，是迄今为止生物活性最高的一类卵菌抑制剂，也是21世纪最有代表性并有望形成系列产品的新型杀菌剂，目前国际上杀菌剂抗药性行动委员会(FRAC)将这类杀菌剂命名为哌啶基噻唑异恶唑啉类化合物(piperidinyl thiazoleisoxazoline，PTIs)。杜邦公司前期通过亲和色谱等研究，发现该药剂的作用靶标为人类氧化固醇结合蛋白同源相关蛋白(oxysterol binding protein-related protein，ORP)(WO2013009971)，这是一种全新的杀菌剂作用靶标。

目前，氟噻唑吡乙酮正在我国及全球不同地区申请登记用于防治辣椒疫霉菌，致病疫霉，黄瓜霜霉病菌及葡萄霜霉病菌等植物病原卵菌的防治，具有广阔的应用前景。但是，本研究室通过药剂驯化的方法得到了对氟噻唑吡乙酮产生高抗性水平的辣椒疫霉菌株，并且部分抗性菌株的生存适合度较高，表明具有较高的抗性风险。因此，在使用氟噻唑吡乙酮防治植物病原卵菌病害时需要关注并避免抗药性的产生，加强检测和早期预警病原菌对氟噻唑吡乙酮的抗性发生发展情况，这有助于指导氟噻唑吡乙酮的科学使用，延缓抗药性的发生和发展，延长药剂的使用年限。

杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法、菌丝干重测定法、孢子萌发测定法和琼脂展布法等。但是这些方法都需要先分离并纯化病原菌，然后接种于带药培养基上或接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果。采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率＞1％时，才能被检测到(如有95％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需大于300)，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点。

随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切PCR、等位特异PCR分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用。与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间、提高了工作效率，而且提高了检测的灵敏度，检测频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供两种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的方法及其专用引物。

本发明所提供的第一种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为494bp的片段，则所述待测辣椒疫霉菌中PcORP1基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指辣椒疫霉菌中PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。

所述PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸也就是SEQ ID NO：6中自5’末端起第2379位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为54.4℃。

本发明所提供的第二种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物进行PCR扩增，再用Pf1MI酶切所得部分PcORP1基因，若酶切产物中含有789bp和472bp片段，则所述待测辣椒疫霉菌中PcORP1基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点指辣椒疫霉菌中PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。

所述PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸也就是SEQ ID NO：6中自5’末端起第2379位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为60℃。

本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变的引物对，由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示DNA分子组成。

本发明的另一个目的是提供辣椒疫霉菌中PcORP1基因或蛋白的突变位点。

本发明所提供的辣椒疫霉菌中PcORP1基因的一个突变位点，为辣椒疫霉菌中PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。其中，所述PcORP1基因的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸也就是SEQ ID NO：6中自5’末端起第2379位核苷酸。

本发明所提供的辣椒疫霉菌中PcORP1蛋白的一个突变位点，为辣椒疫霉菌中PcORP1蛋白的自N端起第769位氨基酸为甘氨酸与色氨酸杂合或纯合的色氨酸。其中，所述的PcORP1蛋白的白N端起第769位氨基酸也就是SEQ ID NO：5中自N端起第769位氨基酸。

上述任一所述突变位点在鉴定辣椒疫霉菌抗药性中的应用也属于本发明的保护范围；所述抗药性为抗氟噻唑吡乙酮等PTIs杀菌剂。

上述应用中，存在所述突变位点的辣椒疫霉菌具有或候选具有抗药性。

本发明提供的检测辣椒疫霉菌对氟噻唑吡乙酮产生抗药性的点突变的方法，对抗性菌株进行高灵敏度、简单快速的分子检测，及时了解抗药性发生动态，对制定合理的病害管理方案、有效控制抗药性病害发展具有重要意义。

附图说明

图1为辣椒疫霉菌敏感和抗性菌株的序列对比。A：PcORP1基因的突变情况；B：PcORP1基因2379位的碱基杂合。HD11，LP3，YY7和JZ10为敏感菌株，R3-H，R3-F，R3-K，R3-M，R3-I，R3-P为抗性菌株。

图2为AS-PCR检测辣椒疫霉菌抗性突变体。A：四对AS-PCR引物在不同温度条件下的电泳结果。B：引物PcORP1F3/R在54.4℃下的扩增结果。S为敏感菌株，R为抗性杂合菌株。

图3为抗性菌株和敏感菌株的PF1MI酶切位点。

图4为CAPS方法酶切检测结果。1～4泳道为敏感菌株，5～10泳道为抗性菌株。S为敏感菌株，R为抗性杂合菌株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

文中“抗性菌株”均指对杀菌剂氟噻唑吡乙酮抗性的辣椒疫霉菌；“敏感菌株”均指对杀菌剂氟噻唑吡乙酮敏感的辣椒疫霉菌。

下述实施例中使用的辣椒疫霉菌株为：敏感菌株HD11、YY7和JZ10；敏感亲本菌株LP3；抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I和R3-P。

上述菌株LP3、R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I和R3-P采自中国江苏地区；HD11采自中国河北地区；JZ10采自中国河南地区；YY7采自中国湖南地区。经过现有的形态学和分子生物学方法鉴定所有菌株均为辣椒疫霉菌。

上述各个菌株均经过菌落生长测定法进行抗药性验证。

实施例1、辣椒疫霉菌对氟噻唑吡乙酮的敏感性测定

六株辣椒疫霉菌抗性突变体，菌株编号分别为R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I和R3-P；四株辣椒疫霉菌敏感菌株，菌株编号分别为HD11、LP3、YY7和JZ10。

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，琼脂粉15g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，121℃湿热灭菌20分钟。

1、实验步骤如下：

1)将氟噻唑吡乙酮用二甲基亚砜(DMSO)配成10⁴μg/ml的母液。对于辣椒疫霉菌敏感菌株的敏感性测定，将氟噻唑吡乙酮逐级稀释成0.001μg/mL，0.0008μg/mL，0.0006μg/mL，0.0004μg/mL，0.0002μg/mL的浓度梯度；对于辣椒疫霉菌抗性菌株的敏感性测定，将供试药剂氟噻唑吡乙酮逐级稀释成2μg/mL，1μg/mL，0.4μg/mL，0.2μg/mL，0.05μg/mL，的浓度梯度。

2)用移液枪吸取药液60μl加入已灭菌的冷却至45℃的60ml PDA培养基中，使溶剂含量为1‰，混匀，将带药的培养基倒入直径为9cm的培养皿中，设只加60μl DMSO的处理为空白对照，每个比例药剂设3次重复。

3)辣椒疫霉菌在PDA平板上培养5天后，沿菌落边缘用打孔器打取直径为0.5cm的菌饼，菌丝面向下接种于步骤2)中的带药和对照培养基中，置于28℃培养箱中黑暗培养，4d后测量菌落直径。

4)十字交叉法测量菌落直径，根据菌落平均直径值计算出各复配比例对供试菌株的菌丝生长的抑制率。然后将抑制率转化成机率值(Y)，药剂浓度转换成以10为底的对数值(X)，在Microsoft Excel中作回归直线，分别求出供试辣椒疫霉菌株的毒力回归曲线方程Y＝a+bX，以及相关系数r和有效抑制中浓度EC₅₀值，并计算抗性倍数。

抗性倍数＝抗性菌株的平均EC₅₀/敏感亲本菌株的平均EC₅₀

2、结果

表1 10株辣椒疫霉菌株对氟噻唑吡乙酮的敏感性

通过辣椒疫霉菌对氟噻唑吡乙酮敏感性检测，结果发现辣椒疫霉菌敏感菌株HD11、LP3、YY7和JZ10的平均EC₅₀为4.92×10^-4μg/mL，而抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I和R3-P的平均EC₅₀为0.39μg/mL，显著高于敏感菌株的EC₅₀，如表1。

实施例2、辣椒疫霉菌中PcORP1基因和PcORP1蛋白突变位点的发现

1、菌株：敏感菌株HD11、YY7、LP3和JZ10；抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I和R3-P。

2、方法：

1)菌株培养：使用PDA培养基(马铃薯去皮200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1L。121℃，20min，湿热灭菌后备用)于28℃培养辣椒疫霉菌。将预培养的辣椒疫霉菌敏感菌株接种在铺有玻璃纸的PDA培养基上，28℃黑暗培养3d后收集菌丝，液氮冰冻后于-80℃保存，用于提取基因组DNA。

2)分别提取辣椒疫霉菌敏感菌株和抗性菌株的基因组DNA：

取适量经液氮冰冻的菌丝，研钵研磨至粉末状，置于1.5mL离心管中；

加入150μL抽提缓冲液(0.35M山梨醇，0.1M Tris，0.005M EDTA[pH 7.5]，0.02M亚硫酸氢钠)，在振荡器上振荡30s；

加入150μL核裂解缓冲液(0.2M Tris，0.05M EDTA[pH 7.5]，2.0M NaCl和2％CTAB[pH 7.5])和60μL20％SDS，在振荡器上振荡后于65℃水浴30min；

加入等体积的氯仿∶异戊醇(v/v，24∶1)轻轻混匀，4℃，12000rpm离心20min；

取上清液于新管中，加入氯仿进行再次抽提；

离心后取上清液加入等体积的4℃异丙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(pH 8.0)，室温静置15min沉淀基因组；

4℃，12000rpm离心20min，沉淀用300μL70％预冷乙醇洗涤两遍；

真空干燥后，溶于50μL的无菌Milli-Q H₂O于-20℃保存备用。

3)辣椒疫霉菌敏感菌株氧化固醇结合蛋白相关蛋白PcORP1基因的PCR扩增

采用引物PcORP1F(5’-GCTCCACTTCGCCTCTTT-3’)和PcORP1R(5’-TTGCTCTTACCGCTGCTC-3’)扩增编码辣椒疫霉菌氧化固醇结合蛋白相关蛋白PcORP1基因的全长。

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

4)测序

将PCR产物进行测序。以基因组DNA为模板时，辣椒疫霉菌抗性菌株菌株的氧化固醇结合蛋白相关蛋白PcORP1基因全长共2948bp，序列如SEQ ID NO：6所示，其中包含74bp的内含子序列，cDNA编码957个氨基酸。序列如SEQ ID NO：5所示。

5)序列比对

分别将抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I、R3-P和敏感菌株HD11、YY7、LP3和JZ10的氧化固醇结合蛋白相关蛋白PcORP1基因全长进行测序。通过DANMAN软件分析比对序列，结果如下：

敏感菌株中，基因PcORP1的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸为G纯合，蛋白PcORP1自N端起第769位氨基酸为纯合的甘氨酸(Gly)；

抗性菌株中，基因PcORP1的基因组序列自5’末端起第2379位核苷酸为G和T的杂合，蛋白PcORP1自N端起第769位氨基酸为甘氨酸和色氨酸的杂合(图1A)；

结果表明，抗性菌株在2379位都发生突变并由纯合G突变为G和T的杂合，分析测序的峰线图，可以看到明显的套峰(图1B)，而这一碱基的改变也导致了749位纯合的甘氨酸突变为甘氨酸和色氨酸的杂合。因此，该位点的突变与辣椒疫霉菌对杀菌剂氟噻唑吡乙酮产生抗性相关。

实施例3、检测辣椒疫霉菌中突变位点的方法

一、AS-PCR检测方法

1、引物设计

引物如表2。

表2.AS-PCR检测辣椒疫霉菌对氟噻唑吡乙酮抗药性中使用的引物

Primer	Sequence(5’-3’)	SEQ ID
			PcORP1F1	TATGCTCAACACCAACAAGT
PcORP1F2	TATGCTCAACACCAACAACT
			PcORP1F3	TATGCTCAACACCAACAATT	SEQ ID NO：3
PcORP1F4	TATGCTCAACACCAACAAAT
			PcORP1R	CCTTCCACTCTTGCGATT	SEQ ID NO：4

本方法在上游引物的最后一个碱基与突变体一致，倒数第二个碱基同时也进行改变，并结合不同退火温度进行扩增，提高引物特异性。反应条件如下：

PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

结果(图2A)表明，引物对PcORP1F1在50.8-57.3℃均能从抗性菌株和敏感菌株中扩增得到条带，在59.6-61.1℃能够从抗性菌株中扩增到较暗的条带；PcORP1F2在抗性菌株和敏感菌株中扩增得到的均为非特异性条带；PcORP1F4在抗性菌株和敏感菌株均未扩增得到条带；PcORP1F3在54.4℃和57.3℃下，敏感菌株不能够扩增出条带，抗性菌株可以扩增出单一的目的条带，表明这对引物可以对抗性位点进行检测，而且在54.4℃下抗性菌株的条带更加明亮，因此选择引物PcORP1F3/R作为AS-PCR引物，54.4℃为退火温度。

引物PcORP1F3/R扩增产物为SEQ ID NO：6中第2360-2853位核苷酸。

2、检测突变位点

以待测的辣椒疫霉菌基因组DNA为模板，用引物对PcORP1F3和PcORP1R进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，若能够从菌株基因组DNA中扩增获得片段，判定所述菌株为抗性菌株，若不能扩增获得片段，则判定所检测的辣椒疫霉菌株为敏感菌株。

PCR扩增体系及反应条件与实验中一致，退火温度为54.4℃。

待测菌株为：抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I、R3-P，敏感菌株HD11、YY7、LP3和JZ10。

结果如图2B所示。结果表明，仅能从抗性菌株中扩增出目标片段，而不能虫敏感菌株中扩增出片段。因此采用引物PcORP1F3和PcORP1R，在退火温度为54.4℃时进行PCR扩增，可以有效检测辣椒疫霉菌对氟噻唑吡乙酮的抗药性菌株。

二、CAPS检测方法

辣椒疫霉菌抗性和敏感菌株PcORP1基因的核苷酸比对结果表明，由于2379位的碱基突变导致抗性菌株增加了1个Pf1MI酶切位点，即由敏感菌株的2个酶切位点突变为3个(图3)。Pf1MI酶切的识别位点为“CCANNNN/NTGG”。

以待测辣椒疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3(5’-CACCTACATTACCGACCTGG-3’)和SEQ ID NO：4(5’-CCACTCTTGCGATTCGTC-3’)所示引物进行PCR扩增，PCR反应体系如下：

50-μl的PCR体系：

PCR反应条件如下：

引物CAPSF/R扩增产物为SEQ ID NO：6中第1589-2849位核苷酸。

将PCR产物进行酶切。酶切体系为：PCR产物10μL，Milli-Q H₂O 18μL，10×BufferR 2μL，Pf1MI 1.5μL，轻轻混匀后37℃酶切10h。经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色10min后检测结果。酶切产物中只有1261bp片段的为敏感菌株，含有789bp和472bp片段的为抗性菌株。

待测菌株为：抗性菌株R3-H、R3-F、R3-K、R3-M、R3-I、R3-P，敏感菌株HD11、YY7、LP3和JZ10。结果如图4所示。结果表明，本发明鉴定方法能够准确鉴定出敏感菌株和抗性菌株。因此，可以将CAPS方法用于抗性菌株的检测。

Claims (8)

1.一种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若能扩增出494bp条带，则所述待测辣椒疫霉菌中PcORP1基因存在或候选存在突变位点；所述PCR扩增中，退火温度为54.4℃。

所述突变位点指辣椒疫霉菌中PcORP1基因的自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。由此导致PcORP1蛋白的自N端起第769位氨基酸为甘氨酸与色氨酸杂合或纯合的色氨酸。

2.一种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示DNA分子组成；

3.另一种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测辣椒疫霉菌的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示引物对进行PCR扩增，扩增得到PcORP1基因的1261bp片段，再用Pf1MI酶切所得的PcORP1基因片段，若酶切产物中含有含有789bp和472bp片段，则所述待测辣椒疫霉菌中PcORP1基因存在或候选存在突变位点；所述PCR扩增中，退火温度为60℃。

所述突变位点指辣椒疫霉菌中PcORP1基因的自5’末端起第2379位核苷酸为G和T杂合或T纯合。由此导致PcORP1蛋白的自N端起第769位氨基酸为甘氨酸与色氨酸杂合或纯合的色氨酸。

4.一种检测或辅助检测辣椒疫霉菌中PcORP1基因是否存在突变位点的引物对，由SEQ ID NO：3和和SEQ ID NO：4所示DNA分子组成；

5.权利要求1或3所述方法或者权利要求2或4所述的引物对在鉴定辣椒疫霉菌抗药性中的应用；所述抗药性为抗氟噻唑吡乙酮等PTIs杀菌剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：具有所述突变位点的辣椒疫霉菌具有或候选具有抗药性。

7.SEQ ID NO：5所示蛋白。

8.SEQ ID NO：6所示基因。