CN114854753B - 靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的植物表达载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因的植物表达载体及其应用。本发明涉及的植物表达载体可以转录形成具有反向互补结构的双链RNA，由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核酸序列分别正、反向插入载体构成。本发明还公开了这些表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。表达本发明涉及的载体的植物对辣椒疫霉的抗病性明显增强，侵染这些植物的辣椒疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因表达受到了显著抑制，由于氧化固醇结合蛋白1基因对于辣椒疫霉的发育和致病是必需的，因此本专利涉及的植物表达载体可有效抑制辣椒疫霉对植物的侵染，为防治辣椒疫霉引起的相关病害提供了一种有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及两种具有茎环结构转录本抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的植物表达载体，以及这些植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。
背景技术
辣椒疫霉(Phytophthora capsici)是一种重要植物病原卵菌，在世界各地均有分布，可侵染茄科、豆科及大多数葫芦科的70多种植物，引起猝倒、萎蔫和根、茎、果实腐烂，从苗期至果期均能发病，造成严重的经济损失。辣椒疫霉引起的辣椒疫病是一种毁灭性病害，可经雨水、土壤和气流等途径传播，造成叶片枯萎、果实腐烂，甚至全株枯死等症状，对作物产量、品质影响极大，严重时可导致减产50％以上。
对辣椒疫霉的防治主要依赖于化学防治，但由于杀卵菌剂的种类较少，长期单一使用化学农药已导致辣椒疫霉对多种化学农药产生抗药性，且不断增大剂量施用化学农药对于环境造成严重污染。此外，对辣椒疫霉具有抗性的植物品种资源匮乏，亟需开发新型手段防治辣椒疫霉引起的植物病害。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA诱发的基因沉默现象，其可以通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。RNAi在生物体内普遍存在，DNA转录形成的双链或发卡结构的RNA序列可以被加工为20-30bp之间的小RNA，这些小RNA通过介导基因沉默复合体特异识别与之互补配对的靶基因DNA或mRNA序列，造成mRNA的切割、翻译抑制或DNA甲基化，最终抑制基因的正常表达(Fire,A.等.1998.Nature.391(6669):806)。寄主诱导的基因沉默技术(Host-induced gene silencing,HIGS)是基于RNAi的原理，在寄主植物中表达靶向病原物关键基因的沉默载体即HIGS介体，当病原物入侵寄主植物时，由HIGS介体剪切加工生成的小RNA在转录后水平沉默病原菌重要基因，从而保护植物免受侵染，提高植物对病原物的抗性。HIGS因其不依赖抗性品种资源而成为理想的植物病害防治策略(Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12:821-831)，已在部分植物-病原菌的互作系统中被成功应用。过去几年相关研究表明HIGS可以抑制植物病原菌的生长和致病，如应用于大麦上布氏白粉菌的防治(Nowara,D.等.2010.The plant cel.22(9):3130-3141)、小麦上条锈菌和镰刀菌的防治(Panwar,V.等.2013.Plant molecular biology.81(6):595-608；Koch,A.等.2014.Plant biotechnology journal.12:821-831)、水稻上稻瘟菌的防治(Zhang,D.等.2015.Plant science.237:24-32)以及棉花上大丽轮枝菌的防治(Duan C.G.等.2012.Silence.3(1):5)。Jahan等人针对致病疫霉4个与致病或细胞结构相关基因分别进行了转基因沉默植物的构建，发现表达靶向PiGPB1基因的发卡结构的植物抗病性明显增强，在该转基因植物叶片内鉴定到24-25nt的小RNA分子可以靶向PiGPB1基因，推测可引起转录后水平对靶基因的沉默(Jahan,S.N.等.2015,Journal of experimentalbotany.66(9):2785-2794)。以上研究说明基于HIGS的跨界基因沉默可有效用于植物病害防治。
氧化固醇结合蛋白1(ORP1)是超高效杀菌剂氟噻唑吡乙酮的作用靶标，辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1(PcORP1)的氨基酸突变可以导致辣椒疫霉对药剂产生高水平抗药性，且ORP1在疫霉中较为保守。经检索，目前未发现基于RNA沉默技术防治辣椒疫霉引起的植物病害的相关文献。
发明内容
本发明目的在于提供靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的DNA片段，以及可以转录形成具有内含子的发卡结构的可抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达的植物表达载体。
本发明的第二个目的在于提供上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因表达上的用途。
本发明的第三个目的在于提供上述植物表达载体在防治辣椒疫霉导致的植物病害上的用途。
本发明的第四个目的在于提供利用表达上述载体的转基因植物防治辣椒疫霉导致的植物病害的方法。
实现本发明的技术方案如下：
本发明的靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的序列为序列表中序列1或者序列表中序列2。
两种可以转录形成具有茎环结构RNA分子的植物表达载体，由SEQ ID No.1或SEQID No.2所示的核酸序列分别正、反向插入到对应的植物表达载体构成。
优选的，所述植物表达载体是将如式(I)所示编码基因克隆到出发载体，构成可表达靶向辣椒疫霉纤维素合酶3基因并使其沉默的具有反向互补二级结构的RNA分子的重组表达载体；SEQ正向-X-SEQ反向(I)；式(I)中，所述SEQ正向的序列为序列表中序列1或者序列表中序列2；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
所述出发载体为pEarlyGate100，式(I)中，X为UBC基因内含子或植物丙酮酸磷酸激酶基因内含子，所述UBC基因内含子序列如序列表中序列3的自5’端第3308-3379位核苷酸序列所示。
在本发明的一个实施方式中，SEQ正向-X-SEQ反向(I)的序列为序列表中序列3的自5’端第2751-3935位核苷酸序列。
在本发明的另一个实施方式中，SEQ正向-X-SEQ反向(I)的序列为序列表中序列4的自5’端第2753-3821位核苷酸序列。
在本发明的一个实施方式中，所述植物表达载体的构建方法为将序列1或2所述的片段先正向插入pENTR1a质粒得到重组质粒pENTR1a-5’ORP，再将序列反向插入pENTR1a-5’ORP载体的UBC基因内含子的3’端，将得到的重组质粒再利用LR反应，将序列1所示片段正向、UBC基因内含子和序列1所示片段反向依次串联的片段或者序列2所示片段正向、UBC基因内含子和序列2所示片段反向依次串联的片段转入植物表达载体pEarlyGate100中，得到靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的植物表达载体。
将序列表中序列1或者序列表中序列2所述的片段先正向插入pENTR1a质粒的酶切位点Cla I和EcoR I之间，经PCR、测序、酶切、电泳验证后再将序列表中序列1或者序列表中序列2所述片段利用酶切位点Sac II和Spe I反向插入pENTR1a-5’ORP载体的UBC基因内含子的3’端，质粒经验证后保存，再利用LR反应将质粒转入植物表达载体pEarlyGate100两个attR位点之间(如图1所示)上，获得正反向插入序列表中序列1的片段的重组载体pEG::ORP3hp和正反向插入序列2的片段的重组载体pEG::ORP4hp,即获得转入抗辣椒疫病的转基因烟草表达载体。pEG::ORP3hp载体结构如图2所示，其序列如序列表中序列3所示；pEG::ORP4hp载体结构如图3所示，其序列如序列表中序列4所示。
上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合1基因表达上的应用。
上述植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。
上述植物表达载体在抑制辣椒疫霉氧化固醇结合1基因表达上的应用。
上述植物表达载体在防治辣椒疫霉引起的植物病害上的应用。`
利用上述植物表达载体防治辣椒疫霉引起的植物病害的方法，包括将含有上述植物表达载体的溶液或试剂直接喷洒、施用或转化植物的各种组织如原生质体等。
本发明涉及的植物表达载体可以通过构建转基因植物进行使用。
本发明涉及的植物表达载体的使用方法：通过PCR克隆辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因的序列1或序列2所示的片段，借助质粒和片段的连接整合入通用的植物表达载体，随后可以通过根癌农杆菌介导的转化、原生质体转化等方式进行转基因植物的构建。
本发明具有的优点或有益效果：(1)表达本发明所涉及植物表达载体的转基因植物对辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的表达表现明显抑制效果，且能表现对辣椒疫霉的显著抗性，本发明可为辣椒疫霉导致的植物病害的防治提供新的有效途径。(2)本发明涉及的植物表达载体对疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因的特异性强，理论上能够特异性抑制包括辣椒疫霉在内的多种植物病原疫霉，且不存在抗药性问题。(3)本发明涉及的转基因植物不表达任何完整的蛋白，对人或动物安全，同时可有效降低化学农药的使用量。(4)本发明涉及的基因靶标同时也是氟噻唑吡乙酮或类似超高效药剂的作用靶标，可用于因为氨基酸突变而对该类药剂产生抗药性的疫霉群体进行抗药性治理，或者与杀菌剂复配使用延缓该类高抗药性风险药剂的抗药性产生。(5)本发明不存在环境污染问题，有利于环保。
附图说明
图1.为本发明涉及的植物表达载体pEarlyGate100的结构示意图。
图2.为本发明涉及的植物表达载体1(pEG::ORP3hp)的结构示意图。
图3.为本发明涉及的植物表达载体2(pEG::ORP4hp)的结构示意图。
图4.为稳定表达本发明涉及的植物表达载体1(pEG::ORP3hp)的转基因烟草的植株对辣椒疫霉的抗性水平测定照片。
图注：WT表示野生型本生烟，pEG-1/4表示转入空载体pEarlyGate100的转基因烟草，pEG::ORP3hp-3/4/5表示转入pEG::ORP3hp介体的转基因烟草(3个植株株系)。
图5.为稳定表达本发明涉及的植物表达载体2的转基因烟草的植株对辣椒疫霉的抗性水平测定照片
图注：WT表示野生型本生烟，pEG-1/4表示转入空载体pEarlyGate100的转基因烟草，pEG::ORP4hp-1/4/6/8/10/11表示转入pEG::ORP4hp介体的转基因烟草(6个植株株系)。
图6.为表达本发明涉及的植物表达载体1的转基因烟草对辣椒疫霉的抗性水平柱形图。
图注：WT表示野生型本生烟，pEG-1/4表示转入空载体pEarlyGate100的转基因烟草(2个植株株系)；pEG::ORP3hp-3/4/5表示转入pEG::ORP3hp介体的转基因烟草(3个植株株系)。图A表示烟草植株发病率；图B表示烟草植株病基部辣椒疫霉生物量。
图7.为表达本发明涉及的植物表达载体2的转基因烟草对辣椒疫霉的抗性水平柱形图。
图注：WT表示野生型本生烟，pEG-1/2/4表示转入空载体pEarlyGate100的转基因烟草(3个植株株系)，pEG::ORP4hp-1/4/6/8/10/11表示转入pEG::ORP4hp介体的转基因烟草(6个植株株系)。图A表示烟草植株发病率；图B表示烟草植株病基部辣椒疫霉生物量。
图8.为侵染了表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达烟草植株上辣椒疫霉的氧化固醇结合蛋白1基因的表达量变化情况。
图注：pEG表示瞬时表达空载体pEarlyGate100的烟草叶片阴性对照样品，pEG::ORP3hp表示瞬时表达pEG::ORP3hp的烟草叶片样品，pEG::ORP4hp表示瞬时表达pEG::ORP4hp的烟草叶片样品。
图9.为表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达烟草中产生的靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的小RNA检测情况。
图注：Buffer表示注射缓冲液的烟草叶片空白对照样品；pEG表示瞬时表达空载体pEarlyGate100的烟草叶片阴性对照样品，pEG::ORP3hp-1/2/3表示瞬时表达pEG::ORP3hp的烟草叶片样品(三个重复)，pEG::ORP4hp-1/2表示瞬时表达pEG::ORP4hp的烟草叶片样品(两个重复)，Reference U6表示烟草内参小RNA。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如果未特别指明，实施例中所用的试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
实施例1本发明的抑制辣椒疫霉氧化固醇蛋白1基因表达的序列来源
本发明的两种植物表达载体中的序列来源于PcORP1的cDNA序列的不同区间，序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，可以引起不同程度的PcCes3的基因沉默，因此均可作为增强植物对辣椒疫霉抗病性的植物表达载体。PcORP1的cDNA序列来源于辣椒疫霉的数据库(JGI)中编号为PHYCAscaffold_14:545241-548188的基因。
选择PcORP1的cDNA序列第924-1479共556个碱基序列序列(序列表中序列1)作为第一个发卡结构的植物表达载体表达序列，第1346-1843共499个碱基序列(序列表中序列2)作为第二个发卡结构的植物表达载体表达序列。所需的扩增引物见表1。以辣椒疫霉cDNA为模板，以PcORP1-3-F和PcORP1-3-R为引物扩增得到序列表中序列1所示的片段，以PcORP1-4-F和PcORP1-4R为引物扩增得到序列表中序列2所示的片段。
表1目的序列扩增引物序列
| 引物primer | 序列Sequence(5’-3’) |
| PcORP1-3-F | TCGTCTTCACTCCGCAAT |
| PcORP1-3-R | TCTCCAGGATAAGCACCACT |
| PcORP1-4-F | TAGCACTTTGACCGCACCT |
| PcORP1-4R | GCAGAAGATTCGCCGTCTA |
将上述序列1和序列2分别与烟草、番茄、辣椒等辣椒疫霉常见寄主的基因组序列(NCBI)进行比对，检测其对植物基因非特异性沉默的可能性。比对结果显示本发明所涉及的序列1和序列2与植物基因组序列最大连续匹配均不足10个碱基，且通过序列潜在产生的siRNA预测显示上述序列产生的siRNAs均不能达到基因沉默的有效长度，排除了沉默寄主植物基因的可能性。
实施例2本发明植物表达载体的构建
扩增本发明涉及序列的引物委托擎科生物合成，序列采用Q5 High Fidelity DNAPolymerases(NEB)进行扩增获得，分别凝胶电泳回收后进行载体构建。
对于发卡结构载体，将序列表中序列1或者序列表中序列2所述的片段先正向插入pENTR1a质粒的酶切位点Cla I和EcoR I之间，经PCR、测序、酶切、电泳验证后再将序列表中序列1或者序列表中序列2所述片段利用酶切位点Sac II和Spe I反向插入pENTR1a-5’ORP载体的UBC基因内含子的3’端，质粒经验证后保存，再利用LR反应将质粒转入植物表达载体pEarlyGate100两个attR位点之间(如图1所示)上，获得正反向插入序列表中序列1的片段的重组载体pEG::ORP3hp和正反向插入序列2的片段的重组载体pEG::ORP4hp,即获得转入抗辣椒疫病的转基因烟草表达载体。pEG::ORP3hp载体结构如图2所示，其序列如序列表中序列3所示；pEG::ORP4hp载体结构如图3所示，其序列如序列表中序列4所示。
将上述植物表达载体转化入根癌农杆菌菌株GV3101感受态细胞中。
实施例3利用本发明涉及的植物表达载体进行转基因植物构建
供试植株及菌液：无菌培养的烟草苗，含有本发明涉及的植物表达载体的根癌土壤杆菌菌株GV3101。
供试培养基：
(1)1/2MS固体培养基：MS(Murashige&Skoog medium)2.2g，蔗糖30g，搅拌溶解后用NaOH调PH至5.6-5.8，加入8g琼脂定容至1L，高温高压灭菌。
(2)MS固体(液体)预培养基：MS 4.44g，MES 2.1235g,蔗糖30g,搅拌溶解后用NaOH调pH至5.8，加入2.4g植物凝胶(Phytogel)，1mL 6-BA(1mg/mL)高温高压灭菌后加入1mL乙酰丁香酮(AS,100μM)，1mL萘乙酸(NAA,1mg/mL)，液体培养基不加入植物凝胶。
(3)筛选培养基(生芽)：MS 4.44g，蔗糖30g，搅拌溶解后用NaOH调pH至5.8，加入2.4g植物凝胶(Phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入1mL玉米素(ZT,2mg/mL)，100μL吲哚-3-乙酸(IAA,1mg/mL)，1mL特美丁(Tim,300mg/mL)，筛选标记1mL草甘膦(5mg/mL)，2mL羧苄青霉素(Carbenicillin,Cb 50mg/mL)。
(4)茎伸长培养基：MS 4.44g，蔗糖30g,搅拌溶解后用NaOH调pH至5.8，加入2.4g植物凝胶(Phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入500μL玉米素(ZT,2mg/mL)，100μL吲哚-3-乙酸(IAA,1mg/mL)，1mL赤霉素(GA,1mg/mL)，1mL特美丁(Tim,300mg/mL),筛选标记1mL草甘膦(5mg/mL)，2mL羧苄青霉素(Carbenicillin,Cb 50mg/mL)
(5)生根培养基：MS 4.44g，蔗糖30g,搅拌溶解后用NaOH后调pH至5.8，加入2.4g植物凝胶(Phytogel)，高温高压灭菌，灭菌后加入1mL吲哚丁酸(IBA，0.5mg/mL)，1mL特美丁(Tim,300mg/mL),筛选标记1mL草甘膦(5mg/mL)，2mL羧苄青霉素(Carbenicillin,Cb 50mg/mL)。
转基因植物构建方法：
(1)取一定数量的本生烟种子，用2％的次氯酸钠浸泡15秒，消毒后用无菌水洗涤5-6次，每次需充分洗涤，彻底去除残留的消毒剂，种子洗涤干净后，将种子播在1/2MS平板培养基上。待长出两片子叶后，将发芽种子转入倒有1/2MS培养基的组培瓶中，培养至6-8叶期(一个半月左右)，即获得无菌幼苗可用于组织培养。
(2)预培养阶段：将大小适宜的无菌苗取出，取中上部叶位的叶片作为组织培养材料，用剪刀剪成1×1cm的方块。将处理好的外植体置于预培养培养基上，培养基上提前铺好灭过菌滤纸，至于黑暗中放置2～3天。
(3)准备浸润用农杆菌菌液
a.将含有HIGS介体的根癌土壤杆菌菌株GV3101活化后，取单菌落于2mL LB液体培养基(Rifampicin 50μg/mL,Getamycin 50μg/mL,Kanamycin 50μg/mL，下文将不再赘述)中，28℃200rpm震荡培养24h。
b.以1％的接种量接种摇培菌液到100mL LB液体培养基，震荡培养至对数生长中期，OD600＝0.6-0.8。
c.4000rpm离心10min，菌沉用50mL MS液体培养基洗涤一遍，4000rpm离心10min再次收集菌沉。
d.用50mL MS液体培养基悬浮菌体即可用于转化。
(4)共培养阶段：将预培养两天后的外植体浸泡于农杆菌侵染液中，浸泡期间需不断震荡，使细菌与叶片组织伤口部位充分接触；共培养10分钟后倒掉侵染液，无菌滤纸吸干外植体表面菌液，置于预培养培养基上(叶背朝下)，黑暗条件25℃共培养2天。
(5)芽诱导阶段：将外植体取出置于芽诱导培养基，在光照培养组培间中培养15天左右，每隔一周左右继代培养一次，再转入新的芽诱导培养基中继续进行继代培养，直至外植体发芽完全。
(6)芽伸长阶段：经过芽诱导后待外植体发芽，芽长约为1-2cm时转入芽伸长培养基中培养2～3周。
(7)生根阶段：当芽伸长至3-5cm时，用无菌的手术剪刀剪掉愈伤组织后将芽插入转移到生根培养基中培养3-4周。
(8)土培期：将PCR验证为阳性，且生根旺盛，生长到一定高度的小苗及时转入土盆里。培养至其开花结种，即获得F1代。
(9)转基因植物的验证：由于转化载体携带草甘膦抗性基因，可采用含草甘膦的MS培养基培养转基因植物种子以评估转基因植物对草甘膦的抗性，同时结合草甘膦抗性基因和本发明涉及序列的扩增进行转基因验证。
结果表明，按照上述方法获得了稳定表达pEG::ORP3hp的转pEG::ORP3hp烟草株系pEG::ORP3hp-3、pEG::ORP3hp-4、pEG::ORP3hp-5，稳定表达pEG::ORP4hp的转pEG::ORP4hp烟草株系pEG::ORP4hp-1、pEG::ORP4hp-4、pEG::HNBCesA3hp-6、pEG::HNBCesA3hp-8、pEG::HNBCesA3hp-10和pEG::HNBCesA3hp-11。
实施例4转化本发明涉及的植物表达载体的转基因植物的抗病性评价
本试验采用辣椒疫霉游动孢子悬浮液灌根接种进行转基因植物的抗病性评价。用移液器向烟草植株茎基部注射3mL 8×103个/mL孢子悬浮液进行灌根接种，接种7d后，将植株连根从土壤中拔出，观察植株根茎基部发病情况，如果茎基部出现变褐坏死，剪开茎基部后植株维管束变褐变黑，则断定烟草发病。灌根接种试验对每类转基因烟草至少有8次生物学重复，7d后统计每类转基因植株发病数和平均病情指数，计算平均发病率。
统计结果见图4-图7，与野生型和转化空载体的烟草相比，表达本发明涉及的植物表达载体的转基因植物上辣椒疫霉的扩展明显受到抑制，平均病情指数及发病率均显著降低。说明本发明涉及的植物表达载体能有效增强植物对辣椒疫霉的抗病性。同时，pEG::ORP3hp和pEG::ORP4hp转基因植物在发病率上无显著差异，说明pEG::ORP3hp和pEG::ORP4hp表达载体可以同等水平地诱导植物产生对辣椒疫霉的抗病性。
实施例5、转化本发明涉及的植物表达载体的植物上靶向PcORP1的小RNA检测及侵染该植物时PcORP1基因表达量检测
采用PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒(Roche)，通过PCR方式合成特异性DIG-dUTP的高敏感核酸探针。试验方法如下：利用DNAMAN软件设计合成靶向PcORP1基因特异性探针所需的引物(见表2)。
表2 Northern blot探针引物序列
探针合成具体试验步骤如下：PCR DIG Probe Synthesis Kit试剂盒内试剂置于冰上融化，轻轻涡旋后离心，按一下步骤配置50μl的反应体系，并进行PCR反应。PCR反应体系为Template DNA 10-100pg，plasmid DNA，PCR buffer with MgCl2 5μL，PCR DIG Probesynthesis Mix 5μL，上游PCR引物10×5μL，下游PCR引物10×5μL，Enzyme Mix 0.75μL，Water Add up to 50μL。PCR条件：95℃2min起始反应95℃30s，60℃30s，72℃40s反应30个循环72℃7min，结束反应。
采用TRIzol法(Invitrogen,USA)提取pEG::ORP3hp或pEG::ORP4hp转基因烟草的总RNA并与已经合成的特异性探针进行杂交，本试验以稳定表达的烟草内源小RNA U6为阴性对照，通过Northern-blot杂交试验检测在瞬时表达样品中HIGS介体是否被剪切加工生成特异性的小RNA分子。
结果如图9所示，在表达本发明涉及的植物表达载体的瞬时表达植物体内均能检测到大量靶向转基因序列的小RNA分子，说明本发明涉及的植物表达载体可在植物体内高效产生潜在能诱发靶基因沉默的小RNA。
收集接种后发病叶片，利用Trizol法提取样品总RNA，反转录获得cDNA，再通过qPCR测定靶基因PcORP1表达量变化。值得注意的是不同植物表达载体中含有靶基因的不同片段正义链和反义链，因而测定瞬时表达后接种发病样品中靶基因表达量时，应避免扩增表达载体中靶基因片段。所以本试验针对不同植物表达载体设计并筛选了测定靶基因表达量所需的引物(见表3)。qPCR引物设计筛选有三个条件：首先是引物扩增序列避开瞬时表达HIGS介体的靶基因序列，第二是是熔解曲线为单峰，第三是引物扩增效率在90％-110％之间，相关系数R2>0.98。
表3测定PcORP1基因表达量所需的引物
如图8所示，与对照植物相比，在表达本发明涉及载体pEG::ORP3hp或pEG::ORP4hp的瞬时表达植物上生长的辣椒疫霉的ORP1基因均表现明显下调，说明本发明涉及的植物表达载体pEG::ORP3hp和pEG::ORP4hp可以通过寄主诱导的基因沉默有效介导辣椒疫霉的靶标基因沉默。同时，pEG::ORP3hp和pEG::ORP4hp转基因植物在靶标基因沉默效率和靶基因相关小RNA产量两方面无显著差异，说明pEG::ORP3hp和pEG::ORP4hp表达载体具有同等的基因沉默效率，二者均可以作为靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因进行干扰的高效植物表达载体。
以上结果说明构建的转基因植物可以通过小RNA介导的基因沉默显著增强对辣椒疫霉引起的植物病害的抗性。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 靶向沉默辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1的植物表达载体及其应用
<130> WHOI210028
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 556
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcgtcttcac tccgcaatca cgtcgtgttt cggcctattg gcgcggtgaa tggtgtttta 60
cgcagcattg ggacagattc gagctctggg aagcagtacg cacgggctag tgtggtgctc 120
ccggtgtcgt cagaagtagc ggcgattcta ctggctgacc atgcgcgcag agctgaatgg 180
gacgtgcatt ttcctcaatc ggcacatgtt gctacattcg atgacgcgac ggatctcgtg 240
catttgtcaa gtggaagctt tgcccagatc caacagacca agccaattgt ggctcctcat 300
gtggctgctg ctgcgtgtgc cttgtgtgca gcactcttct ctggtgcttc atcttgggag 360
gcgctgctga ttgcgatgat ctacgctgca gccgtaggtg gcatcgtgag tagcatcgac 420
tatagcactt tgaccgcacc tcgcgacctc gtagttcttc gtcatgtgcg tgagtctgct 480
acgcctgatt cacaggattc aagcgacgac aagtcagcgg acgagatggg ccagtcagtg 540
gtgcttatcc tggaga 556
<210> 2
<211> 499
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
atagcacttt gaccgcacct cgcgacctcg tagttcttcg tcatgtgcgt gagtctgcta 60
cgcctgattc acaggattca agcgacgaca agtcagcgga cgagatgggc cagtcagtgg 120
tgcttatcct ggagaagtcc gtcgttaacg agctcaaacc tgttgtctcc ggtattgtgc 180
gcgctcacgt cggactgagt ggctggttgc tcgagccggt tgattcaggt cacgctacgc 240
tggccaccta cattaccgac ctggacatga aggggtggct agcgcctacc acgcgccaga 300
gtttcttgct ctcccgtttg gactgtgttt cagttctaag cgagtacgtg aaccaggcac 360
acttgtgtgg atcggagcta ggatttggtg gtggtcttga cgaggacgga gaaggagagt 420
tcgaaactcg tagcgtcggg tacgacgaca ctagcgaagc aagcggtcta ggagacgttg 480
tagacggcga atcttctgc 499
<210> 3
<211> 11390
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcga gctcggatct gataatttat 120
ttgaaaattc ataagaaaag caaacgttac atgaattgat gaaacaatac aaagacagat 180
aaagccacgc acatttagga tattggccga gattactgaa tattgagtaa gatcacggaa 240
tttctgacag gagcatgtct tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac tcaaaccgcc 300
ccatatgcag gagcggatca ttcattgttt gtttggttgc ctttgccaac atgggagtcc 360
aagattctgc agtcaaatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct 420
gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 480
cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 540
cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 600
ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 660
ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 720
gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 780
gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 840
gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 900
ggccgggcgt cgttctgggc tcatcgattc gatttggtgt atcgagattg gttatgaaat 960
tcagatgcta gtgtaatgta ttggtaattt gggaagatat aataggaagc aaggctattt 1020
atccatttct gaaaaggcga aatggcgtca ccgcgagcgt cacgcgcatt ccgttcttgc 1080
tgtaaagcgt tgtttggtac acttttgact agcgaggctt ggcgtgtcag cgtatctatt 1140
caaaagtcgt taatggctgc ggatcaagaa aaagttggaa tagaaacaga atacccgcga 1200
aattcaggcc cggttgccat gtcctacacg ccgaaataaa cgaccaaatt agtagaaaaa 1260
taaaaactga ctcggatact tacgtcacgt cttgcgcact gatttgaaaa atctcagaat 1320
tccaatccca caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg 1380
tattcaacac cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata 1440
cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa 1500
atttgccact attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac 1560
agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa 1620
ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc 1680
cagcagtgat ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt 1740
cctctatctt tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac 1800
cactgataat gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt 1860
tagagaggcc tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga 1920
gatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat 1980
caagaacaca gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 2040
tcaaggcttg cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 2100
tcctactgaa tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac 2160
tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 2220
aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata 2280
cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc 2340
tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag 2400
gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg 2460
ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 2520
ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg 2580
acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 2640
tggagaggac acgctcgaga tcagggccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 2700
ctgttcgttg caacaaattg ataagcaatg cttttttata atgccaactt ttcgtcttca 2760
ctccgcaatc acgtcgtgtt tcggcctatt ggcgcggtga atggtgtttt acgcagcatt 2820
gggacagatt cgagctctgg gaagcagtac gcacgggcta gtgtggtgct cccggtgtcg 2880
tcagaagtag cggcgattct actggctgac catgcgcgca gagctgaatg ggacgtgcat 2940
tttcctcaat cggcacatgt tgctacattc gatgacgcga cggatctcgt gcatttgtca 3000
agtggaagct ttgcccagat ccaacagacc aagccaattg tggctcctca tgtggctgct 3060
gctgcgtgtg ccttgtgtgc agcactcttc tctggtgctt catcttggga ggcgctgctg 3120
attgcgatga tctacgctgc agccgtaggt ggcatcgtga gtagcatcga ctatagcact 3180
ttgaccgcac ctcgcgacct cgtagttctt cgtcatgtgc gtgagtctgc tacgcctgat 3240
tcacaggatt caagcgacga caagtcagcg gacgagatgg gccagtcagt ggtgcttatc 3300
ctggagagta ggcagtagtt tccattcgat gttgatttga ttgactctga ttgtgtacat 3360
ttgttgctat atctattagt cgtcttcact ccgcaatcac gtcgtgtttc ggcctattgg 3420
cgcggtgaat ggtgttttac gcagcattgg gacagattcg agctctggga agcagtacgc 3480
acgggctagt gtggtgctcc cggtgtcgtc agaagtagcg gcgattctac tggctgacca 3540
tgcgcgcaga gctgaatggg acgtgcattt tcctcaatcg gcacatgttg ctacattcga 3600
tgacgcgacg gatctcgtgc atttgtcaag tggaagcttt gcccagatcc aacagaccaa 3660
gccaattgtg gctcctcatg tggctgctgc tgcgtgtgcc ttgtgtgcag cactcttctc 3720
tggtgcttca tcttgggagg cgctgctgat tgcgatgatc tacgctgcag ccgtaggtgg 3780
catcgtgagt agcatcgact atagcacttt gaccgcacct cgcgacctcg tagttcttcg 3840
tcatgtgcgt gagtctgcta cgcctgattc acaggattca agcgacgaca agtcagcgga 3900
cgagatgggc cagtcagtgg tgcttatcct ggagatgcct aggtgagtct agagagttaa 3960
ttaagacccg ggactagtcc ctagagtcct gctttaatga gatatgcgag acgcctatga 4020
tcgcatgata tttgctttca attctgttgt gcacgttgta aaaaacctga gcatgtgtag 4080
ctcagatcct taccgccggt ttcggttcat tctaatgaat atatcacccg ttactatcgt 4140
atttttatga ataatattct ccgttcaatt tactgattgt accctactac ttatatgtac 4200
aatattaaaa tgaaaacaat atattgtgct gaataggttt atagcgacat ctatgataga 4260
gcgccacaat aacaaacaat tgcgttttat tattacaaat ccaattttaa aaaaagcggc 4320
agaaccggtc aaacctaaaa gactgattac ataaatctta ttcaaatttc aaaagtgccc 4380
caggggctag tatctacgac acaccgagcg gcgaactaat aacgctcact gaagggaact 4440
ccggttcccc gccggcgcgc atgggtgaga ttccttgaag ttgagtattg gccgtccgct 4500
ctaccgaaag ttacgggcac cattcaaccc ggtccagcac ggcggccggg taaccgactt 4560
gctgccccga gaattatgca gcattttttt ggtgtatgtg ggccccaaat gaagtgcagg 4620
tcaaaccttg acagtgacga caaatcgttg ggcgggtcca gggcgaattt tgcgacaaca 4680
tgtcgaggct cagcaggacc tgcaggcatg caagcttggc actggccgtc gttttacaac 4740
gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 4800
tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 4860
gcctgaatgg cgaatgctag agcagcttga gcttggatca gattgtcgtt tcccgccttc 4920
agtttaaact atcagtgttt gacaggatat attggcgggt aaacctaaga gaaaagagcg 4980
tttattagaa taacggatat ttaaaagggc gtgaaaaggt ttatccgttc gtccatttgt 5040
atgtgcatgc caaccacagg gttcccctcg ggatcaaagt actttgatcc aacccctccg 5100
ctgctatagt gcagtcggct tctgacgttc agtgcagccg tcttctgaaa acgacatgtc 5160
gcacaagtcc taagttacgc gacaggctgc cgccctgccc ttttcctggc gttttcttgt 5220
cgcgtgtttt agtcgcataa agtagaatac ttgcgactag aaccggagac attacgccat 5280
gaacaagagc gccgccgctg gcctgctggg ctatgcccgc gtcagcaccg acgaccagga 5340
cttgaccaac caacgggccg aactgcacgc ggccggctgc accaagctgt tttccgagaa 5400
gatcaccggc accaggcgcg accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc 5460
tggcgacgtt gtgacagtga ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact 5520
ggacattgcc gagcgcatcc aggaggccgg cgcgggcctg cgtagcctgg cagagccgtg 5580
ggccgacacc accacgccgg ccggccgcat ggtgttgacc gtgttcgccg gcattgccga 5640
gttcgagcgt tccctaatca tcgaccgcac ccggagcggg cgcgaggccg ccaaggcccg 5700
aggcgtgaag tttggccccc gccctaccct caccccggca cagatcgcgc acgcccgcga 5760
gctgatcgac caggaaggcc gcaccgtgaa agaggcggct gcactgcttg gcgtgcatcg 5820
ctcgaccctg taccgcgcac ttgagcgcag cgaggaagtg acgcccaccg aggccaggcg 5880
gcgcggtgcc ttccgtgagg acgcattgac cgaggccgac gccctggcgg ccgccgagaa 5940
tgaacgccaa gaggaacaag catgaaaccg caccaggacg gccaggacga accgtttttc 6000
attaccgaag agatcgaggc ggagatgatc gcggccgggt acgtgttcga gccgcccgcg 6060
cacgtctcaa ccgtgcggct gcatgaaatc ctggccggtt tgtctgatgc caagctggcg 6120
gcctggccgg ccagcttggc cgctgaagaa accgagcgcc gccgtctaaa aaggtgatgt 6180
gtatttgagt aaaacagctt gcgtcatgcg gtcgctgcgt atatgatgcg atgagtaaat 6240
aaacaaatac gcaaggggaa cgcatgaagg ttatcgctgt acttaaccag aaaggcgggt 6300
caggcaagac gaccatcgca acccatctag cccgcgccct gcaactcgcc ggggccgatg 6360
ttctgttagt cgattccgat ccccagggca gtgcccgcga ttgggcggcc gtgcgggaag 6420
atcaaccgct aaccgttgtc ggcatcgacc gcccgacgat tgaccgcgac gtgaaggcca 6480
tcggccggcg cgacttcgta gtgatcgacg gagcgcccca ggcggcggac ttggctgtgt 6540
ccgcgatcaa ggcagccgac ttcgtgctga ttccggtgca gccaagccct tacgacatat 6600
gggccaccgc cgacctggtg gagctggtta agcagcgcat tgaggtcacg gatggaaggc 6660
tacaagcggc ctttgtcgtg tcgcgggcga tcaaaggcac gcgcatcggc ggtgaggttg 6720
ccgaggcgct ggccgggtac gagctgccca ttcttgagtc ccgtatcacg cagcgcgtga 6780
gctacccagg cactgccgcc gccggcacaa ccgttcttga atcagaaccc gagggcgacg 6840
ctgcccgcga ggtccaggcg ctggccgctg aaattaaatc aaaactcatt tgagttaatg 6900
aggtaaagag aaaatgagca aaagcacaaa cacgctaagt gccggccgtc cgagcgcacg 6960
cagcagcaag gctgcaacgt tggccagcct ggcagacacg ccagccatga agcgggtcaa 7020
ctttcagttg ccggcggagg atcacaccaa gctgaagatg tacgcggtac gccaaggcaa 7080
gaccattacc gagctgctat ctgaatacat cgcgcagcta ccagagtaaa tgagcaaatg 7140
aataaatgag tagatgaatt ttagcggcta aaggaggcgg catggaaaat caagaacaac 7200
caggcaccga cgccgtggaa tgccccatgt gtggaggaac gggcggttgg ccaggcgtaa 7260
gcggctgggt tgtctgccgg ccctgcaatg gcactggaac ccccaagccc gaggaatcgg 7320
cgtgagcggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct 7380
ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg 7440
ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc 7500
ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt 7560
cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt 7620
tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga 7680
cgggcacgta gaggtttccg cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct 7740
ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg 7800
agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg 7860
agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac 7920
gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga 7980
gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta 8040
catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga 8100
cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta 8160
ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta 8220
cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat 8280
cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat 8340
cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac 8400
ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc 8460
tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat 8520
tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga 8580
gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg 8640
cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac 8700
ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg 8760
ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc 8820
gtcgccactc gaccgccggc gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg 8880
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 8940
atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg 9000
cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc 9060
agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 9120
gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 9180
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 9240
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 9300
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 9360
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 9420
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 9480
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 9540
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 9600
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 9660
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 9720
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 9780
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 9840
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 9900
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 9960
aaactcacgt taagggattt tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa 10020
aatataatat tttattttct cccaatcagg cttgatcccc agtaagtcaa aaaatagctc 10080
gacatactgt tcttccccga tatcctccct gatcgaccgg acgcagaagg caatgtcata 10140
ccacttgtcc gccctgccgc ttctcccaag atcaataaag ccacttactt tgccatcttt 10200
cacaaagatg ttgctgtctc ccaggtcgcc gtgggaaaag acaagttcct cttcgggctt 10260
ttccgtcttt aaaaaatcat acagctcgcg cggatcttta aatggagtgt cttcttccca 10320
gttttcgcaa tccacatcgg ccagatcgtt attcagtaag taatccaatt cggctaagcg 10380
gctgtctaag ctattcgtat agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa agagcctgat 10440
gcactccgca tacagctcga taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga 10500
gcaaaggacg ccatcggcct cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa 10560
gtgcaggacc tttggaacag gcagctttcc ttccagccat agcatcatgt ccttttcccg 10620
ttccacatca taggtggtcc ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc 10680
attttctccc accagcttat ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca 10740
gcggtatttt tcgatcagtt ttttcaattc cggtgatatt ctcattttag ccatttatta 10800
tttccttcct cttttctaca gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg 10860
aactccaatt cactgttcct tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca 10920
aagttgtttt caaagttggc gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg 10980
tgatcacagg cagcaacgct ctgtcatcgt tacaatcaac atgctaccct ccgcgagatc 11040
atccgtgttt caaacccggc agcttagttg ccgttcttcc gaatagcatc ggtaacatga 11100
gcaaagtctg ccgccttaca acggctctcc cgctgacgcc gtcccggact gatgggctgc 11160
ctgtatcgag tggtgatttt gtgccgagct gccggtcggg gagctgttgg ctggctgggt 11220
ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca tcggtaacat gagcaaagtc 11280
tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga ctgatgggct gcctgtatcg 11340
agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg 11390
<210> 4
<211> 11276
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcga gctcggatct gataatttat 120
ttgaaaattc ataagaaaag caaacgttac atgaattgat gaaacaatac aaagacagat 180
aaagccacgc acatttagga tattggccga gattactgaa tattgagtaa gatcacggaa 240
tttctgacag gagcatgtct tcaattcagc ccaaatggca gttgaaatac tcaaaccgcc 300
ccatatgcag gagcggatca ttcattgttt gtttggttgc ctttgccaac atgggagtcc 360
aagattctgc agtcaaatct cggtgacggg caggaccgga cggggcggta ccggcaggct 420
gaagtccagc tgccagaaac ccacgtcatg ccagttcccg tgcttgaagc cggccgcccg 480
cagcatgccg cggggggcat atccgagcgc ctcgtgcatg cgcacgctcg ggtcgttggg 540
cagcccgatg acagcgacca cgctcttgaa gccctgtgcc tccagggact tcagcaggtg 600
ggtgtagagc gtggagccca gtcccgtccg ctggtggcgg ggggagacgt acacggtcga 660
ctcggccgtc cagtcgtagg cgttgcgtgc cttccagggg cccgcgtagg cgatgccggc 720
gacctcgccg tccacctcgg cgacgagcca gggatagcgc tcccgcagac ggacgaggtc 780
gtccgtccac tcctgcggtt cctgcggctc ggtacggaag ttgaccgtgc ttgtctcgat 840
gtagtggttg acgatggtgc agaccgccgg catgtccgcc tcggtggcac ggcggatgtc 900
ggccgggcgt cgttctgggc tcatcgattc gatttggtgt atcgagattg gttatgaaat 960
tcagatgcta gtgtaatgta ttggtaattt gggaagatat aataggaagc aaggctattt 1020
atccatttct gaaaaggcga aatggcgtca ccgcgagcgt cacgcgcatt ccgttcttgc 1080
tgtaaagcgt tgtttggtac acttttgact agcgaggctt ggcgtgtcag cgtatctatt 1140
caaaagtcgt taatggctgc ggatcaagaa aaagttggaa tagaaacaga atacccgcga 1200
aattcaggcc cggttgccat gtcctacacg ccgaaataaa cgaccaaatt agtagaaaaa 1260
taaaaactga ctcggatact tacgtcacgt cttgcgcact gatttgaaaa atctcagaat 1320
tccaatccca caaaaatctg agcttaacag cacagttgct cctctcagag cagaatcggg 1380
tattcaacac cctcatatca actactacgt tgtgtataac ggtccacatg ccggtatata 1440
cgatgactgg ggttgtacaa aggcggcaac aaacggcgtt cccggagttg cacacaagaa 1500
atttgccact attacagagg caagagcagc agctgacgcg tacacaacaa gtcagcaaac 1560
agacaggttg aacttcatcc ccaaaggaga agctcaactc aagcccaaga gctttgctaa 1620
ggccctaaca agcccaccaa agcaaaaagc ccactggctc acgctaggaa ccaaaaggcc 1680
cagcagtgat ccagccccaa aagagatctc ctttgccccg gagattacaa tggacgattt 1740
cctctatctt tacgatctag gaaggaagtt cgaaggtgaa ggtgacgaca ctatgttcac 1800
cactgataat gagaaggtta gcctcttcaa tttcagaaag aatgctgacc cacagatggt 1860
tagagaggcc tacgcagcag gtctcatcaa gacgatctac ccgagtaaca atctccagga 1920
gatcaaatac cttcccaaga aggttaaaga tgcagtcaaa agattcagga ctaattgcat 1980
caagaacaca gagaaagaca tatttctcaa gatcagaagt actattccag tatggacgat 2040
tcaaggcttg cttcataaac caaggcaagt aatagagatt ggagtctcta aaaaggtagt 2100
tcctactgaa tctaaggcca tgcatggagt ctaagattca aatcgaggat ctaacagaac 2160
tcgccgtgaa gactggcgaa cagttcatac agagtctttt acgactcaat gacaagaaga 2220
aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca ctctggtcta ctccaaaaat gtcaaagata 2280
cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga cttttcaaca aaggataatt tcgggaaacc 2340
tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag 2400
gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcattcaa gatctctctg 2460
ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 2520
ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgacat ctccactgac gtaagggatg 2580
acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 2640
tggagaggac acgctcgaga tcagggccca aataatgatt ttattttgac tgatagtgac 2700
ctgttcgttg caacaaattg ataagcaatg cttttttata atgccaactt tatagcactt 2760
tgaccgcacc tcgcgacctc gtagttcttc gtcatgtgcg tgagtctgct acgcctgatt 2820
cacaggattc aagcgacgac aagtcagcgg acgagatggg ccagtcagtg gtgcttatcc 2880
tggagaagtc cgtcgttaac gagctcaaac ctgttgtctc cggtattgtg cgcgctcacg 2940
tcggactgag tggctggttg ctcgagccgg ttgattcagg tcacgctacg ctggccacct 3000
acattaccga cctggacatg aaggggtggc tagcgcctac cacgcgccag agtttcttgc 3060
tctcccgttt ggactgtgtt tcagttctaa gcgagtacgt gaaccaggca cacttgtgtg 3120
gatcggagct aggatttggt ggtggtcttg acgaggacgg agaaggagag ttcgaaactc 3180
gtagcgtcgg gtacgacgac actagcgaag caagcggtct aggagacgtt gtagacggcg 3240
aatcttctgc gtaggcagta gtttccattc gatgttgatt tgattgactc tgattgtgta 3300
catttgttgc tatatctatt agatagcact ttgaccgcac ctcgcgacct cgtagttctt 3360
cgtcatgtgc gtgagtctgc tacgcctgat tcacaggatt caagcgacga caagtcagcg 3420
gacgagatgg gccagtcagt ggtgcttatc ctggagaagt ccgtcgttaa cgagctcaaa 3480
cctgttgtct ccggtattgt gcgcgctcac gtcggactga gtggctggtt gctcgagccg 3540
gttgattcag gtcacgctac gctggccacc tacattaccg acctggacat gaaggggtgg 3600
ctagcgccta ccacgcgcca gagtttcttg ctctcccgtt tggactgtgt ttcagttcta 3660
agcgagtacg tgaaccaggc acacttgtgt ggatcggagc taggatttgg tggtggtctt 3720
gacgaggacg gagaaggaga gttcgaaact cgtagcgtcg ggtacgacga cactagcgaa 3780
gcaagcggtc taggagacgt tgtagacggc gaatcttctg ctgcctaggt gagtctagag 3840
agttaattaa gacccgggac tagtccctag agtcctgctt taatgagata tgcgagacgc 3900
ctatgatcgc atgatatttg ctttcaattc tgttgtgcac gttgtaaaaa acctgagcat 3960
gtgtagctca gatccttacc gccggtttcg gttcattcta atgaatatat cacccgttac 4020
tatcgtattt ttatgaataa tattctccgt tcaatttact gattgtaccc tactacttat 4080
atgtacaata ttaaaatgaa aacaatatat tgtgctgaat aggtttatag cgacatctat 4140
gatagagcgc cacaataaca aacaattgcg ttttattatt acaaatccaa ttttaaaaaa 4200
agcggcagaa ccggtcaaac ctaaaagact gattacataa atcttattca aatttcaaaa 4260
gtgccccagg ggctagtatc tacgacacac cgagcggcga actaataacg ctcactgaag 4320
ggaactccgg ttccccgccg gcgcgcatgg gtgagattcc ttgaagttga gtattggccg 4380
tccgctctac cgaaagttac gggcaccatt caacccggtc cagcacggcg gccgggtaac 4440
cgacttgctg ccccgagaat tatgcagcat ttttttggtg tatgtgggcc ccaaatgaag 4500
tgcaggtcaa accttgacag tgacgacaaa tcgttgggcg ggtccagggc gaattttgcg 4560
acaacatgtc gaggctcagc aggacctgca ggcatgcaag cttggcactg gccgtcgttt 4620
tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc 4680
cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt 4740
tgcgcagcct gaatggcgaa tgctagagca gcttgagctt ggatcagatt gtcgtttccc 4800
gccttcagtt taaactatca gtgtttgaca ggatatattg gcgggtaaac ctaagagaaa 4860
agagcgttta ttagaataac ggatatttaa aagggcgtga aaaggtttat ccgttcgtcc 4920
atttgtatgt gcatgccaac cacagggttc ccctcgggat caaagtactt tgatccaacc 4980
cctccgctgc tatagtgcag tcggcttctg acgttcagtg cagccgtctt ctgaaaacga 5040
catgtcgcac aagtcctaag ttacgcgaca ggctgccgcc ctgccctttt cctggcgttt 5100
tcttgtcgcg tgttttagtc gcataaagta gaatacttgc gactagaacc ggagacatta 5160
cgccatgaac aagagcgccg ccgctggcct gctgggctat gcccgcgtca gcaccgacga 5220
ccaggacttg accaaccaac gggccgaact gcacgcggcc ggctgcacca agctgttttc 5280
cgagaagatc accggcacca ggcgcgaccg cccggagctg gccaggatgc ttgaccacct 5340
acgccctggc gacgttgtga cagtgaccag gctagaccgc ctggcccgca gcacccgcga 5400
cctactggac attgccgagc gcatccagga ggccggcgcg ggcctgcgta gcctggcaga 5460
gccgtgggcc gacaccacca cgccggccgg ccgcatggtg ttgaccgtgt tcgccggcat 5520
tgccgagttc gagcgttccc taatcatcga ccgcacccgg agcgggcgcg aggccgccaa 5580
ggcccgaggc gtgaagtttg gcccccgccc taccctcacc ccggcacaga tcgcgcacgc 5640
ccgcgagctg atcgaccagg aaggccgcac cgtgaaagag gcggctgcac tgcttggcgt 5700
gcatcgctcg accctgtacc gcgcacttga gcgcagcgag gaagtgacgc ccaccgaggc 5760
caggcggcgc ggtgccttcc gtgaggacgc attgaccgag gccgacgccc tggcggccgc 5820
cgagaatgaa cgccaagagg aacaagcatg aaaccgcacc aggacggcca ggacgaaccg 5880
tttttcatta ccgaagagat cgaggcggag atgatcgcgg ccgggtacgt gttcgagccg 5940
cccgcgcacg tctcaaccgt gcggctgcat gaaatcctgg ccggtttgtc tgatgccaag 6000
ctggcggcct ggccggccag cttggccgct gaagaaaccg agcgccgccg tctaaaaagg 6060
tgatgtgtat ttgagtaaaa cagcttgcgt catgcggtcg ctgcgtatat gatgcgatga 6120
gtaaataaac aaatacgcaa ggggaacgca tgaaggttat cgctgtactt aaccagaaag 6180
gcgggtcagg caagacgacc atcgcaaccc atctagcccg cgccctgcaa ctcgccgggg 6240
ccgatgttct gttagtcgat tccgatcccc agggcagtgc ccgcgattgg gcggccgtgc 6300
gggaagatca accgctaacc gttgtcggca tcgaccgccc gacgattgac cgcgacgtga 6360
aggccatcgg ccggcgcgac ttcgtagtga tcgacggagc gccccaggcg gcggacttgg 6420
ctgtgtccgc gatcaaggca gccgacttcg tgctgattcc ggtgcagcca agcccttacg 6480
acatatgggc caccgccgac ctggtggagc tggttaagca gcgcattgag gtcacggatg 6540
gaaggctaca agcggccttt gtcgtgtcgc gggcgatcaa aggcacgcgc atcggcggtg 6600
aggttgccga ggcgctggcc gggtacgagc tgcccattct tgagtcccgt atcacgcagc 6660
gcgtgagcta cccaggcact gccgccgccg gcacaaccgt tcttgaatca gaacccgagg 6720
gcgacgctgc ccgcgaggtc caggcgctgg ccgctgaaat taaatcaaaa ctcatttgag 6780
ttaatgaggt aaagagaaaa tgagcaaaag cacaaacacg ctaagtgccg gccgtccgag 6840
cgcacgcagc agcaaggctg caacgttggc cagcctggca gacacgccag ccatgaagcg 6900
ggtcaacttt cagttgccgg cggaggatca caccaagctg aagatgtacg cggtacgcca 6960
aggcaagacc attaccgagc tgctatctga atacatcgcg cagctaccag agtaaatgag 7020
caaatgaata aatgagtaga tgaattttag cggctaaagg aggcggcatg gaaaatcaag 7080
aacaaccagg caccgacgcc gtggaatgcc ccatgtgtgg aggaacgggc ggttggccag 7140
gcgtaagcgg ctgggttgtc tgccggccct gcaatggcac tggaaccccc aagcccgagg 7200
aatcggcgtg agcggtcgca aaccatccgg cccggtacaa atcggcgcgg cgctgggtga 7260
tgacctggtg gagaagttga aggccgcgca ggccgcccag cggcaacgca tcgaggcaga 7320
agcacgcccc ggtgaatcgt ggcaagcggc cgctgatcga atccgcaaag aatcccggca 7380
accgccggca gccggtgcgc cgtcgattag gaagccgccc aagggcgacg agcaaccaga 7440
ttttttcgtt ccgatgctct atgacgtggg cacccgcgat agtcgcagca tcatggacgt 7500
ggccgttttc cgtctgtcga agcgtgaccg acgagctggc gaggtgatcc gctacgagct 7560
tccagacggg cacgtagagg tttccgcagg gccggccggc atggccagtg tgtgggatta 7620
cgacctggta ctgatggcgg tttcccatct aaccgaatcc atgaaccgat accgggaagg 7680
gaagggagac aagcccggcc gcgtgttccg tccacacgtt gcggacgtac tcaagttctg 7740
ccggcgagcc gatggcggaa agcagaaaga cgacctggta gaaacctgca ttcggttaaa 7800
caccacgcac gttgccatgc agcgtacgaa gaaggccaag aacggccgcc tggtgacggt 7860
atccgagggt gaagccttga ttagccgcta caagatcgta aagagcgaaa ccgggcggcc 7920
ggagtacatc gagatcgagc tagctgattg gatgtaccgc gagatcacag aaggcaagaa 7980
cccggacgtg ctgacggttc accccgatta ctttttgatc gatcccggca tcggccgttt 8040
tctctaccgc ctggcacgcc gcgccgcagg caaggcagaa gccagatggt tgttcaagac 8100
gatctacgaa cgcagtggca gcgccggaga gttcaagaag ttctgtttca ccgtgcgcaa 8160
gctgatcggg tcaaatgacc tgccggagta cgatttgaag gaggaggcgg ggcaggctgg 8220
cccgatccta gtcatgcgct accgcaacct gatcgagggc gaagcatccg ccggttccta 8280
atgtacggag cagatgctag ggcaaattgc cctagcaggg gaaaaaggtc gaaaaggtct 8340
ctttcctgtg gatagcacgt acattgggaa cccaaagccg tacattggga accggaaccc 8400
gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggtca cacatgtaag tgactgatat 8460
aaaagagaaa aaaggcgatt tttccgccta aaactcttta aaacttatta aaactcttaa 8520
aacccgcctg gcctgtgcat aactgtctgg ccagcgcaca gccgaagagc tgcaaaaagc 8580
gcctaccctt cggtcgctgc gctccctacg ccccgccgct tcgcgtcggc ctatcgcggc 8640
cgctggccgc tcaaaaatgg ctggcctacg gccaggcaat ctaccagggc gcggacaagc 8700
cgcgccgtcg ccactcgacc gccggcgccc acatcaaggc accctgcctc gcgcgtttcg 8760
gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 8820
aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 8880
ggggcgcagc catgacccag tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc 8940
ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 9000
cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 9060
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 9120
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 9180
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 9240
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 9300
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 9360
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 9420
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 9480
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 9540
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 9600
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 9660
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 9720
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 9780
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 9840
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgcattct aggtactaaa acaattcatc 9900
cagtaaaata taatatttta ttttctccca atcaggcttg atccccagta agtcaaaaaa 9960
tagctcgaca tactgttctt ccccgatatc ctccctgatc gaccggacgc agaaggcaat 10020
gtcataccac ttgtccgccc tgccgcttct cccaagatca ataaagccac ttactttgcc 10080
atctttcaca aagatgttgc tgtctcccag gtcgccgtgg gaaaagacaa gttcctcttc 10140
gggcttttcc gtctttaaaa aatcatacag ctcgcgcgga tctttaaatg gagtgtcttc 10200
ttcccagttt tcgcaatcca catcggccag atcgttattc agtaagtaat ccaattcggc 10260
taagcggctg tctaagctat tcgtataggg acaatccgat atgtcgatgg agtgaaagag 10320
cctgatgcac tccgcataca gctcgataat cttttcaggg ctttgttcat cttcatactc 10380
ttccgagcaa aggacgccat cggcctcact catgagcaga ttgctccagc catcatgccg 10440
ttcaaagtgc aggacctttg gaacaggcag ctttccttcc agccatagca tcatgtcctt 10500
ttcccgttcc acatcatagg tggtcccttt ataccggctg tccgtcattt ttaaatatag 10560
gttttcattt tctcccacca gcttatatac cttagcagga gacattcctt ccgtatcttt 10620
tacgcagcgg tatttttcga tcagtttttt caattccggt gatattctca ttttagccat 10680
ttattatttc cttcctcttt tctacagtat ttaaagatac cccaagaagc taattataac 10740
aagacgaact ccaattcact gttccttgca ttctaaaacc ttaaatacca gaaaacagct 10800
ttttcaaagt tgttttcaaa gttggcgtat aacatagtat cgacggagcc gattttgaaa 10860
ccgcggtgat cacaggcagc aacgctctgt catcgttaca atcaacatgc taccctccgc 10920
gagatcatcc gtgtttcaaa cccggcagct tagttgccgt tcttccgaat agcatcggta 10980
acatgagcaa agtctgccgc cttacaacgg ctctcccgct gacgccgtcc cggactgatg 11040
ggctgcctgt atcgagtggt gattttgtgc cgagctgccg gtcggggagc tgttggctgg 11100
ctgggtttca aacccggcag cttagttgcc gttcttccga atagcatcgg taacatgagc 11160
aaagtctgcc gccttacaac ggctctcccg ctgacgccgt cccggactga tgggctgcct 11220
gtatcgagtg gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctgg 11276
Claims (4)
1.一种靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的植物表达载体在防治辣椒疫霉所引起植物病害上的应用；其特征在于，所述植物表达载体是由SEQ ID No. 1或SEQID No. 2所示的核酸序列分别以正、反向两次插入到对应的植物表达载体构成；所述植物表达载体是将如式(I)所示编码基因克隆到出发载体，构成表达靶向辣椒疫霉纤维素合酶3基因并使其沉默的具有反向互补二级结构的RNA分子的重组表达载体； SEQ正向-X-SEQ反向 (I)；式(I)中，所述SEQ正向的序列为序列表中序列1或者序列表中序列2；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述出发载体为pEarlyGate100，式(I)中，X为UBC基因内含子或植物丙酮酸磷酸激酶基因内含子，所述UBC基因内含子序列如序列表中序列3的自5’端第3308-3379位核苷酸序列所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体的构建方法为将序列1或2所述的片段先正向插入pENTR1a质粒得到重组质粒pENTR1a-5’ORP，再将序列反向插入pENTR1a-5’ORP载体的UBC基因内含子的3’端，将得到的重组质粒再利用LR反应，将序列1所示片段正向、UBC基因内含子和序列1所示片段反向依次串联的片段或者序列2所示片段正向、UBC基因内含子和序列2所示片段反向依次串联的片段转入植物表达载体pEarlyGate100中，得到靶向辣椒疫霉氧化固醇结合蛋白1基因并使其沉默的植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体的序列为序列表中序列3或序列表中序列4。
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