CN104583409A - 具有对疫霉的抗性的马铃薯转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有针对疫霉属的卵菌的抗性的马铃薯转基因植物、该植物的转基因部分、其生产方法以及其在植物中的外部应用方法。在马铃薯植物中的宿主植物诱导的基因沉默方法中，提供来自致病疫霉的SEQ？ID？NO：1-43的核苷酸序列，所述核苷酸序列还可作为用于处理植物的杀真菌剂而提供。

Description

具有对疫霉的抗性的马铃薯转基因植物

本发明涉及具有对疫霉属卵菌的抗性的马铃薯(Solanum tuberosum)转基因植物、此类植物的转基因部分、其生产方法以及外部应用于植物的方法。

即使在现在，由致病疫霉(Phytophthora infestans)导致的马铃薯晚疫病仍然是最普遍的且对经济影响巨大的马铃薯疫病。

纵观全球，该病原体带来产量损失超过20％，导致收益损失。这意味着必须使用一些昂贵的化学的植物保护措施，因为马铃薯用于对抗致病疫霉，或减慢并限制其繁殖的自然防御机制不是足够的或者长期的。

已知植物的自然防御机制，例如在侵染部位的过敏反应、细胞壁的木质化、发病机理相关蛋白质的产生以及植物抗毒素的合成等，确实有助于增加抗性，但是对于受影响的植物，也会伴随着能量的损失和收益的损失。

植物的自然防御机制还包括所谓的抗性基因(R基因)的表达，该基因的产物能够与微生物的非病原基因(Avr基因)相互作用(基因对基因假说)并由此诱导特异性防御反应。但是，如果病原体例如致病疫霉可以免除Avr基因的合成，可以阻碍这一抗性，宿主植物也不会出现病原体识别该以及随后的特异性防御反应。

Fire等(1998)的研究已证实双链RNA(dsRNA)可导致同源RNA的序列特异性降解。同时，从该结果出发，利用RNA干扰(RNAi)技术，通过宿主植物诱导的保守且必需的基因(例如来自线虫或鳞翅目和Coleroptera的基因)沉默开发了体内与体外均表现出了对这些害虫的抗性的转基因植物。

此外，宿主植物与致植物病真菌的相互作用构成了宿主诱导的基因沉默(HIGS)的概念的应用以诱导抗性(EP 1 716 238)。

Van West等(1999)首先在疫霉中应用基因沉默方法，以实施对这些卵菌特异性基因的功能分析。

在WO 2006/070227中，第一次描述了，基于双链RNA在真菌细胞外与真菌细胞接触，利用RNA干扰控制病原真菌。它提出了一种可以生产具有病原体抗性的植物的方法。通过这种方式，RNA干扰可以针对一种或者多种病原体的一个或者多个基因。致病疫霉是可能的病原真菌而马铃薯是可能宿主植物。

之前研究给出假说，宿主植物诱导的基因沉默并不能够对每一个基因起作用，因此选择目标基因对于功能性沉默是至关重要的。因此，例如，通过宿主植物诱导的基因沉默，无法充分降低致病疫霉中的细胞膜H+-ATPasePnMA1以赋予有效的针对病原体的保护(Zhang et al.2011)。因此，目标基因的选择对于植物有效的病原体防御是决定性的(Yin et al.2011)。

最近提出的筛选系统有望能够帮助选择合适的寄生基因用于沉默构建体，以产生具有病原体抗性的植物(US 2010/0257634)。作者也提出了鉴定适宜的测试构建体来诱导马铃薯中的植物抗性。就这点而言，目标基因是基于基因组序列的生物信息学分析或必需基因或者来自其他已知模式生物的毒力因子的序列同源性确定的。该文件并没有包含任何本发明公开的用于产生针对疫霉属卵菌的抗性的基因的提示。

在WO 2009/112270文中，描述了一种用于在转基因植物中产生针对多种真菌的广谱抗性的方法。在本发明的方法的一种实施方式中，所述广谱抗性针对葡萄钩丝壳菌(Uncinula necator)、葡萄生轴霜霉(Plasmoporaviticola)、单胞锈菌(Uromyces spec.)、豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、白粉菌(Erysiphe sp.)以及致病疫霉。

此外，在WO 2006/047495中公开了通过RNAi诱导沉默开发具有致病疫霉抗性的马铃薯。一方面，产生携带用于RNA干扰的来自致病疫霉的rRNA基因的基因序列的植物。WO 2006/047495中描述的针对致病疫霉的rRNA基因的沉默构建体包含检索号为AJ854293的碱基对1-600、18S rRNA编码区的32bp以及致枯病原体5.8S rRNA的全部编码区。当选择用于HIGS策略的目标基因时，考虑到适用性，至关重要的是尽可能短或者优选地，在延伸超过17个连续碱基对的长度与非目标生物没有同源性，因为在消费转基因植物或其收获产物的情况下，如果有同源性的话，可以破坏非目标生物的基因表达(“脱靶”效应)。但是，在WO 2006/047495中描述的序列包含了致病疫霉18S rRNA的32bp，其与人(Homo sapiens)，猪(Sus scrofa)以及牛(Bos taurus)的18S rRNA基因同源序列有百分之百的相同性。2005年亚洲人类消耗马铃薯量为26kg，北美为58kg，欧洲为96kg(FAOSTAT)。按照马铃薯的人和动物高消费量来看，考虑到安全因素，WO 2006/047495中描述的来自致病疫霉的rRNA序列作为HIGS目标基因对于消费者是不适合的。

另一方面，在WO 2006/047495中，产生了携带用于RNA干扰的来自桃蚜(Myzus persicae)的组织蛋白酶B基因和来自致病疫霉的激发素基因INF1的基因序列的植物，所述植物因此表现出对两种植物病原体的抗性。这里用到的目标基因INF1编码激发子。基于作为致病因子的激发子，的抗性是不利的，因为在致病疫霉侵染马铃薯时，该激发素基因INF1并不总是必需的(Kamoun et al.1998)。

因此，本发明的目的是要提供一种能对疫霉属卵菌具有病原体抗性的，尤其是适于消费的，马铃薯转基因植物。

根据本发明，要达到此目的，双链的第一与第二DNA稳定地整合入转基因植物中，其中所述第一DNA包含(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，(c)与(a)或者(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或(d)在严格条件下，与(a)、(b)或者(c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

意外地，发现这种类型的第一DNA对通过宿主诱导的基因沉默策略赋予马铃薯植物病原体抗性尤为适合。

第一和第二DNA以一种稳定地方式整合到马铃薯转基因植物的基因组中。优选地，所述DNA以稳定方式整合到植物的染色体中。但其也可以整合到染色体外元件。稳定整合的优点是所述DNA可以传给所述转基因植物的后代。

双链DNA由一条编码链和一条非编码链组成。

此外，第二DNA的编码链的核苷酸序列与第一DNA的编码链反向互补。对于5’-3’方向的核苷酸序列，术语“反向互补反向互补”是指3’-5’方向的核苷酸序列的碱基根据碱基配对规则与第一DNA的碱基对应，并且处于反向/镜像的顺序。例如，如果第一DNA编码链的核苷酸序列为atggttc，则反向互补的第二DNA编码链的核苷酸序列为gaaccat。这也称为核苷酸序列的正义与对应的反义(反向互补)方向反向互补。

特别指出的是，在序列全长范围，第二DNA编码链的核苷酸序列可以与第一DNA编码链的核苷酸序列反向互补的。但是，也可以部分反向互补，也就是在有限长度上反向互补。所述第二DNA的编码链的核苷酸序列也可以在其核苷酸序列的多于一个区域，例如二或三个区域，与第一DNA编码链的核苷酸序列反向互补。

从所述第一和第二DNA的编码链完全或部分反向互补的核苷酸序列开始，合成双链RNA。通过在互补核苷酸之间形成桥连氢键产生RNA双链结构。双链RNA区域可由自身部分互补的核酸单链形成，或者由两条不同且非连续的互补的核酸链形成。因此，桥连氢键可在分子内形成，也在分子间形成。

根据本发明，第一DNA包含根据SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，其中这些序列来自所选择的来自致病疫霉的目标基因。这些目标基因包括初级代谢与氨基酸合成(尤其是脂肪族氨基酸(缬氨酸，亮氨酸与异亮氨酸)的生物合成，以及谷氨酸盐生物合成)的必需基因、细胞调控和信号转导(如氧化还原调控、钙信号传导、G-蛋白信号传导、MAP-激酶信号传导以及转录因子)的基因，以及翻译组件基因、具有RNA加工功能的基因、编码发育和分化蛋白质(例如具有细胞壁形成功能的蛋白质)的基因，以及编码转运蛋白、通道蛋白和膜蛋白的基因。表1中汇总了这些用于设计宿主诱导的基因沉默的来自疫霉的目标基因。

表1

术语“基因沉默”或沉默描述关闭基因的方法。沉默可以是，例如，转录沉默或者转录后沉默。基因沉默还包括反义技术、RNA干扰以及dsRNA。

基因沉默选择性抑制了致病疫霉中的目标基因的核苷酸序列的表达。在该情况下，目标核苷酸序列也可以是未加工的RNA分子、mRNA或者核糖体RNA序列。

目标基因可通过以下方式鉴定：(i)关于卵菌分化或感染过程的微阵列数据的公开的表达研究，以及关于卵菌分化或感染期间的代谢过程的公开研究数据(Grenville-Briggs et al.2005,Judelson et al.2009a,Judelson et al.2009b)(A)，(ii)与传统分析结合的比较生物信息学研究(BioMaxBioinformaticFramework)(B)，(iii)代谢途径与传统分析结合的分析(C)，以及(iv)关于真核生物中同源基因特征的数据的评估(Roemer et al.1994,Inoue et al.1995,Mazur et al.1995,Lesage et al.2004,Avrova et al.2008,Wang et al.2009,Li etal.2010,Wang et al.2010)(D)。

当选择目标基因时，需要考虑到，这些基因的核苷酸序列是致病疫霉特有的，以避免植物和人类基因的不需要的沉默。为达到此目的，将所选择的目标基因的蛋白质(BlastX)与马铃薯及番茄(Solanum lycopersicum)的蛋白质组进行比较。同时，还将目标基因的核苷酸(BlastN)与马铃薯、番茄基因组以及一般性的BlastN进行比较(条件：BlastN；数据库：人类基因组+转录物；最优化：有点相似的序列(blastn))。当目标基因与马铃薯及番茄没有显示同源性或者与一般性BlastN在短序列段中(<17nt)没有或仅有部分同源性，从而抑制或不发生与内源性植物核苷酸序列的相互作用时，认为该目标基因则是高度合适的。

根据本发明，所使用的核苷酸序列有不同长度。因此，例如，SEQ ID NO:1-43之一的核苷酸序列长度为501-735个核苷酸。

所使用的核苷酸序列也可以是一个或多个SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的一个或多个片段。就此点而言，该片段包含一个或多个SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200或1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500个连续的核苷酸。特别合适的片段是SEQ ID NO:1核苷酸具有290个核苷酸的片段。

在本发明优选的实施方式中，使用相同核苷酸序列(如SEQ ID NO:1)或者不同的核苷酸序列(如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43)的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个片段的组合。优选的组合包含SEQ ID NO:4、23、27和28的核苷酸序列的片段，这些基因与信号转导有关。更优选的组合包含SEQ ID NO:3、16和17的核苷酸序列的片段，这些是来自致病疫霉谷氨酸盐生物合成基因。进一步有利的组合包含来自细胞壁形成基因(SEQ ID NO:25、36、37)、钙信号传导基因(SEQ ID NO:20、21、22)、初级代谢基因(SEQ ID NO:5、6、7)、氧化还原调控基因(SEQ ID NO:24、25、26)的核苷酸序列或核苷酸序列的片段，或者包含来自SEQ ID NO:39、40、41、42的转运蛋白基因的核苷酸序列或核苷酸序列的片段。进一步优选的组合包含不同目标基因组(例如，G-蛋白信号传导基因、MAP激酶信号传导基因、初级代谢基因和氧化还原调控基因(SEQ ID NO:27、28、4、23))的核苷酸序列或核苷酸序列的片段，。组合若干目标基因意味着避免了转基因植物的抗性被卵菌中的自然突变破坏的可能性。

本发明的引入马铃薯中的双链的第一DNA可以包含在严格条件下与以下核苷酸序列杂交的核苷酸序列：(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的片段或至少15个连续核苷酸，(c)与(a)或(b)或(c)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列。严格的条件举例如下：65℃下4×SSC中杂交，然后在65℃下0.1×SSC中洗涤若干次，大约共1小时。此处所用的术语”严格杂交条件也可以是指“68℃下，0.25M磷酸钠、pH为7.2的7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，然后在68℃下，以2×SSC和0.1％SDS中洗涤两次。

特别地，本发明也包括核苷酸序列的这样的片段，其有几个，例如1或2个核苷酸与来自致病疫霉的目标基因序列并不互补。出现在例如卵菌中序列的变异基于基因突变，例如致病疫霉菌株中的增加、缺失、替换或多态性，并且导致在1、2或多个核苷酸的区域的配对错误，只要转基因马铃薯植物形成的RNA仍然可以干扰卵菌形成的目标基因RNA，就可以耐受所述变异。

根据本发明，马铃薯转基因植物具有抵抗疫霉属卵菌的病原体抗性。为了本发明该抗性，比较了转基因马铃薯和对照植物，理想地，所述对照植物与转基因植物具有相同的基因型，并在相同条件下生长，但不含有引入转基因植物的DNA。抗性大小采用目视打分法确定，其中判定得分为0(不易感)到100(非常易感)。一个更好地检测抗性的方法为比较转基因植物相较于控制组而言表面感染减少的百分比，如百分之10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100(详见室外条件下转基因马铃薯抗性测量方法的条件)。

疫霉属包含了多个种，如赤杨衰退病原菌(alni)、恶疫霉(cactorum)、辣椒疫霉(capsici)、樟疫霉(cinnamomi)、柑桔褐腐疫霉(citrophthora)、clandestina、草莓疫霉(fragariae)、hedraiandra、idaei、致病疫霉、ipomoeae、iranica、kernoviae、mirabilis、megakarya、烟草疫霉(nicotianae)、棕榈疫霉(palmivora)、烟草黑胫病菌(parasitica)、phaseoli、栎树猝死病菌(ramorum)、pseuodotsugae、quercina、大豆疫霉(sojae)或tentaculata。

在本发明的优选的实施方式中，转基因马铃薯表现了对致病疫霉的抗性。

在针对实验室和田间条件下，来自致病疫霉的乙酰乳酸合酶的构建体抑制脂肪族缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的生物合成导致枯萎病感染大量减少，叶的抗性大大增强。通过在一个构建体中组合一些目标基因，例如G蛋白信号传导、MAP激酶信号传导、初级代谢、氨基酸生物合成和氧化还原调控的基因，抗性效果还可以进一步增强，因为通过使用信号传导途径和代谢途径的组合构建体的多作用抑制病原体。

令人意外的是，本发明的马铃薯对具有不同侵袭性的致病疫霉的防御力在某种程度上发生了变化，因此获得了能够高效且永久地保护植物抵御这种最重要病原体的侵染的抗性。

还意外地发现所述抗性没有马铃薯的农学性质的重大缺陷或者负面变化。近田间条件下的栽培实验没有任何对马铃薯品质有害的作用。仔细选择致病疫霉的目标基因，排除任何与来自非目标生物(马铃薯，人类，猪，奶牛)的基因延伸超过17个连续碱基对的同源，意味着对使用所述植物作为饲料和食物没有限制，并且对于播种、培养、收获以及加工农作物没有限制。所述植物可以直接用作农业、食物或饲料植物。

根据优选的实施方式，双链RNA是miRNA或者siRNA。MiRNA是指小的干扰RNA，包括自然产生的miRNA和合成的miRNA，所述合成的miRNA可以通过例如重组或化学合成或者加工初级miRNA产生。

SiRNA是指小的干扰RNA，包括自然产生的siRNA和合成的siRNA，所述合成的siRNA可以通过例如重组或化学合成或者加工dsRNA产生

转基因植物产生来自引入的双链DNA的dsRNA，所述DNA由内源性RNAi或者沉默机制加工来形成siRNA和miRNA。

为了获得dsRNA，可以使用正义方向的双链的第一DNA(其具有根据SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列或其片段)和反义方向的双链的第二DNA，所述第一和第二DNA由内含子分隔开，所述内含子与所考虑的目标基因没有相似性。例如，所述DNA可以是指SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其针对致病疫霉的乙酰乳酸合酶基因。根据在植物细胞中的表达，可形成RNA转录物，其因为同义和反义序列区域的同源性可以合并形成dsRNA。由于在内含子区域中碱基对不匹配，dsRNA形成发卡结构。具有发卡结构的dsRNA也可以通过一个具有正义方向的根据SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列和有不同长度的反义方向的第二序列的双链DNA的方式制备。在这方面，正义方向的核苷酸序列比反义方向的核苷酸长大约190个核苷酸，反之亦然。

通过PCR扩增目标基因所选择的核苷酸序列的限定的区域，并且以正义和反义方向克隆到适于合成发卡结构的载体中。就这点而言，一些具有不同目标基因的序列区域的片段可以克隆到载体中以构建组合发卡结构。载体可通过植物生物技术界熟知的转化方法转入到植物细胞中。本领域技术人员会意识到，例如，也可以将目标基因的所选择的核苷酸序列以正义方向克隆进入一个载体，将所述目标基因的所述核苷酸序列以反义方向克隆进入第二载体，然后通过例如共转化导入植物细胞中。

沉默机制由dsRNA引起，例如，发卡RNA结构或者基因双螺旋。所述dsRNA可通过dsRNA特异性核酸内切酶(Dicer)产生小的dsRNA，所述产生通过将较长的核苷酸序列加工成小的dsRNA，优选21-25个碱基对，该过程与“茎环”(初级miRNA)和长互补dsRNA前体类似的。作为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核心成分，Argonaut蛋白与siRNA和miRNA结合并使其解螺旋(unwind)，所述双螺旋的引导链通过碱基配对与mRNA特异性结合并使其降解。通过miRNA方式，RNA干扰也是一种类似的过程，不同在于所产生的miRNA还包含与目标基因不同的部分区域。

当宿主植物感染致病疫霉后，在宿主植物和卵菌之间可以出现在植物中形成的RNA交换，所述RNA针对一个或多个Phytophthora特异的目标序列。在卵菌中，这些RNA可以导致一个或多个目标基因的序列特异性基因沉默。蛋白质及蛋白复合物如dicer，RISC(RNA诱导的沉默复合物)以及RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)，可参与到该过程中。

已知当RdRP从降解的mRNA片段中合成新的siRNA时，植物中的siRNA作用会继续。该次级或过渡RNAi可以增强沉默并且也导致共享这些保守序列时的不同转录物的沉默。

在优选的实施方式中，所述第一DNA和第二DNA与至少一个启动子可操作连接。

启动子是非翻译的DNA序列，通常是在编码区的上游片段，含有RNA聚合酶的结合位点并且启动DNA的转录。启动子还含有能够调节基因表达的特殊元件(例如顺式调控元件)。“可操作连接”是指包含完整核苷酸序列的DNA与启动子连接，以允许该核苷酸序列表达。该完整的核苷酸序列也可与下游的终止子信号(作为进一步的元件)连接。

启动子可以来源于植物、动物或者微生物，或者是合成来源的，并且可以例如从选自以下启动子：组成型、诱导型、发育特异的、细胞类型特异的、组织特异的或者器官特异的。组成型启动子在多数情况下是有活性的，诱导性启动子在诱导信号的作用下表达，所述诱导信号可以是，例如，生物胁迫如病原体或者非生物胁迫低温、干燥或化学物质。

启动子的实例是组成型的CaMV 35S启动子(Benfey et al.,1990)和C1启动子，该启动子在绿色组织中是有活性的(Stahl et al.,2004)。

所述第一DNA和第二DNA也可以和双启动子(doppelten Promotor)，例如有双向活性的TR1’和TR2’启动子(Saito et al.,1991)，可操作连接。

此外，所述第一DNA和第二DNA也可分别与启动子可操作连接。

使用分别位于核酸分子的3’端与5’端侧面的两个启动子，能够分别表达DNA的两条链，其中形成两个互补的RNA，其杂交并形成dsRNA。此外，可以配置两个启动子，这样一个启动子作用于所选择的核苷酸序列的转录，第二个启动子作用于与第一核苷酸序列互补的核苷酸序列的转录。两条核苷酸序列都转录后，dsRNA就形成了。

进一步，可以配置双向启动子，其运行两个方向的两个核苷酸序列的表达，其中一条核苷酸序列从3’方向读取，第二个序列从5’方向读取。只要两条核苷酸序列彼此互补则形成dsRNA。

本发明还关注了马铃薯转基因植物的部分。

在该应用的背景下，转基因植物的“部分”特别是指本发明的植物的种子、根、叶、花和细胞。就这点而言，术语“细胞”应该被理解为例如具有细胞壁的分离的细胞或其聚集体或原生质体。转基因植物的“转基因部分”也包括那些可以收获的部分，如马铃薯块茎。

此外，本发明涉及生产展现针对疫霉属卵菌抗性的马铃薯转基因植物的方法。

在植物生物技术领域，合适植物细胞转化方法是已知的。每种方法都可以用于将核酸(优选在载体中的)插入植物细胞来获得本发明的转基因植物。转化方法可以包括直接和间接的转化方法并且可用于双子叶植物，并且也可以主要用于单子叶植物。合适的直接转化方法包括PEG诱导DNA摄取、脂质体诱导的转化、通过粒子轰击的基因枪方法、电穿孔或显微注射。间接方法的实例包括了农杆菌诱导的转化技术或通过病毒载体的病毒感染。

所采用的优选的方法为使用双元载体的农杆菌诱导的DNA转移。植物细胞转化后，在一个或多个标记物上选择所述细胞，所述标记物与本发明的DNA一起转化植物，并且包含，优选地，诱导抗生素抗性的基因，例如诱导卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因NPTII，或者诱导潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶II基因HPTII。

接着，转化细胞再生为完整植物体。在DNA转移和再生后，获得的植物可通过，例如，定量PCR检验本发明中的DNA的存在。随后在体外和温室进行抗致病疫霉的抗性测试。例行的进一步表型研究可由受过合适训练的人员在温室或者室外实施。这些研究下的转化的植物可直接栽培。

本发明的生产显示针对疫霉属卵菌抗性的马铃薯转基因植物的方法包括以下步骤：

(i)产生转化的第一亲本植物，其含有稳定整合到所述亲本植物基因组中的双链的第一DNA，所述第一DNA包含(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，或(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，或(c)与(a)或(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或(d)在严格条件下，与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列；

(ii)产生转化的第二亲本植物，其含有稳定整合到所述亲本植物基因组中的双链的第二DNA，其中，所述第一和第二DNA编码链的核苷酸序列彼此部分或完全反向互补；

(iii)将所述第一亲本植物与所述第二亲本植株杂交；

(iv)选择植物，其基因组中稳定整合有双链的第一DNA与双链的第二DNA，由此形成双链RNA，以赋予针对疫霉属卵菌的病原体抗性。

根据本发明，其是根据来自致病疫霉的SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列或核苷酸序列片段。

在本发明的优选的实施方式中，所述双链RNA可以是miRNA或siRNA。

本发明还涉及外部应用于植物的组合物。

该组合物是为植物的外部应用制备的。它含有双链RNA，其中此RNA的一条链对应双链DNA的转录物，所述双链DNA包含(a)根据SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，或(b)根据SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，或(c)与(a)或(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或(d)在严格条件下，与(a)、(b)或的c)的核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。

用于生产本发明的组合物的双链RNA可在体外使用本领域技术人员已知的方法产生。例如，双链RNA可通过在体外直接形成RNA来合成。双链RNA也可通过形成mRNA转录物，然后所述转录物形成例如发夹结构而从双链DNA合成。

本发明的组合物可以用作植物或其种子的杀真菌剂。就这点而言，所述组合物用来控制病原体的生长，从而控制病原体的传播或治疗感染的植物。例如，所述组合物可以用作喷雾式杀真菌剂来进行喷洒，或其它本领域技术人员熟悉的常规方法对植物组织进行外用或在植物发芽前后通过喷洒或与栽培基质混合。

在进一步的应用中，本发明的组合物是用来对种子进行预处理的。在这方面，所述组合物最初与运载体基质混合，以双链RNA和运载体基质组合的形式应用于种子，例如，从而所述运载体底物具有RNA-稳定作用。由此，可以通过，例如，化学修饰(如将核糖己糖交换)增强RNA稳定性并因此增强对所选择的致病疫霉的目标基因的作用。封装的RNA分子的脂质体也可以用作RNA稳定剂。

理想地，用所述组合物处理的植物是马铃薯。

上面的关于本发明的植物和方法的讨论也适用于所述组合物。

现在将参考附图和序列来描述本发明：

图1：质粒pRNAi作为可以用于形成针对目标基因的发夹结构的载体的示例性代表。这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

图2：质粒pRNAi_PITG_03410作为含有用于形成针对目标基因(这里指的是PITG_03410)的dsRNA的正义-内含子-反义片段的载体的示例性代表。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV35S终止子。

图3：质粒pRNAi_HIGS_CoA作为含有正义-内含子-抗转录片段中的各种限定的序列的载体的示例性代表，所述片段导致针对各种目标基因的dsRNA的形成。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

图4：质粒pGBTV/EcoRI_kan。双元的Ti质粒，可以用作克隆载体。

图5：质粒pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410。双元Ti质粒，可以用于农杆菌诱导的转化。

图6：质粒pAM。可以用作克隆载体。

图7：质粒pAM_HIGS_CoA。可用作克隆载体的质粒的实例。

图8：质粒p95P-Nos。双元Ti质粒，可用作克隆载体。

图9：质粒p95N_HIGS_CoA。双元Ti质粒，可以用于农杆菌诱导的转化。

图10：质粒p95N_HIGS_dPRNAi_PITG_03410，作为用于形成针对目标基因(这里指的是PITG_03410)的dsRNA的双元载体的示例性代表，所述形成使用各位于核酸分子3’和5’端的两个CaMV 35S启动子。

图11：转化后在再生阶段中，选择培养基上的转基因马铃薯芽。

图12：来以双元载体pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410转化后用于测试马铃薯(PR-H4)的转基因性的诊断PCR。检测正义片段(370bp)(引物S3345’-ATCCCACTATCCTTCGCAAG-3’×S12595’-TTGATATCGCGGAAGGCGAGAGACATCG-3’)和反义片段(450bp)(S3295’-CTAAGGGTTTCTTATATGCTCAAC-3’×S12595’-TTGATATCGCGGAAGGCGAGAGACATCG-3’)。混合：PCR-MasterMix、PCR监测。标记：TrackIt^TM 1Kb DNA Ladder。

图13：以双元载体pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410(A)和双元载体p95N_HIGS_PITG_00375(B)转化后，检测转基因马铃薯中的siRNAs。通过用放射性标记的探针dsRNA_PITG03410(A)或放射性标记的探针dsRNA_PITG00375(B)的Northern印迹杂交实施检测。A：各种来自PR-H4_T007和T011品系的样品的多个应用。B：来自PR-H2_T040、T045、T047和T049品系的样品的单一应用。

图14A：质粒pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_00375作为含有融合构建体的载体的示例性代表，所述融合构建体由荧光素酶报告基因和测试HIGS目标片段PITG_00375组成。另外，这个载体含有双CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自萤火虫(Photinus pyralis)的luc基因的编码序列(其编码荧光素酶，由来自马铃薯基因St-LS1的修饰的内含子PIV2分隔开(Eckes et al.1986,Vancanneyt et al.1990))、另一个多克隆位点以及来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Nopalin合酶基因的Nos终止子。

图14B：质粒pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_03410作为含有构建体的载体的示例性代表，所述融合构建体由荧光素酶报告基因和测试HIGS目标片段PITG_00375组成。

图15A：通过载体pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_03410进行基因枪转化后，基因型Baltica的转基因马铃薯品系中的相对荧光素酶活性，所述品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_03410的HIGS_RNAi构建体。B：Baltica(非转基因对照)，T003、T005转基因HIGS马铃薯品系。

图15B：转基因HIGS品系上的来自致病疫霉的相对孢子囊产生。为了形成针对致病疫霉基因PITG_03410的dsRNA，以RNAi构建体转化Baltica品种的马铃薯品系。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Baltica品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有4个生物学重复)。B：Baltica(非转基因对照)，T003、T005：转基因HIGS马铃薯品系。

图16A：通过载体pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_03410进行基因枪转化后，基因型Hermes的转基因马铃薯品系中的相对荧光素酶活性，所述品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_03410的HIGS_RNAi构建体。H：Hermes(非转基因对照)，T004、T011：转基因HIGS马铃薯品系。

图16B：来自转基因HIGS品系上的来自致病疫霉的相对孢子囊产生。为了形成针对致病疫霉基因PITG_03410的dsRNA，以RNAi构建体转化Hermes品种的马铃薯品系。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Hermes品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有4个生物学重复)。H:Hermes(非转基因对照)，T004、T011：转基因HIGS马铃薯品系。

图17A：通过载体pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_03410进行基因枪转化后，基因型Desirée的转基因马铃薯品系中的相对荧光素酶活性，所述品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_03410的HIGS_RNAi构建体。D：Desirée(非转基因对照)，T098：转基因HIGS马铃薯品系。

图17B：来自转基因HIGS品系上的来自致病疫霉的相对孢子囊产生。为了形成针对致病疫霉基因PITG_03410的dsRNA，以RNAi构建体转化Desirée品种的马铃薯品系。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Desirée品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有4个生物学重复)。D：Desirée(非转基因对照)，T098：转基因HIGS马铃薯品系。

图18A：通过载体pABM-70Sluci_dsRNA.PITG_00375进行基因枪转化后，基因型为Desirée的转基因马铃薯品系中的相对荧光素酶活性，所述品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_00375的HIGS_RNAi构建体。D：Desirée(非转基因对照)，T042、T044、T047、T049：转基因HIGS马铃薯品系。

图18B：来自转基因HIGS品系上的来自致病疫霉的相对孢子囊产生。为了形成针对致病疫霉基因PITG_00375的dsRNA，以RNAi构建体转化Desirée品种的马铃薯品系。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Desirée品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有4个生物学重复)。D:Desirée(非转基因对照)，T042、T044、T047、T049：转基因HIGS马铃薯品系。

图19A：在室外样条件下以致病疫霉感染植物后，，基因型为Hermes的转基因马铃薯品系中的感染水平，所述品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_03410的HIGS_RNAi构建体。有三角形的灰色线：Baltica、Desirée和Russet Burbank(非转基因对照)；有方框的黑色线：Hermes基因型的植物；实线：Hermes(非转基因对照)；虚线：PR-H-4-7，以及点线：PR-H-4-11，转基因HIGS马铃薯品系。

图19B：与非转基因对照Hermes相比，在室外样条件下以致病疫霉感染植物后，基因型为Hermes的转基因马铃薯品系PR-H-4-7和PR-H-4-11感染程度的图片文档，所述转基因马铃薯品系稳定整合针对来自致病疫霉的基因PITG_03410的HIGS_RNAi构建体。照片摄于感染后32天。

图20：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_03410的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Russet Burbank(非转基因对照)，H-4-T084、H-4-T096：转基因HIGS马铃薯品系。

图21：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Hermes品种的马铃薯品系以通过双启动子构建体HIGS_dPRNAi_PITG_03410形成针对致病疫霉基因PITG_03410的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Hermes品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Hermes(非转基因对照)；H-23-T0003、H-23-T026、H-23-T038、H-23-T062、H-23-T063、H-23-T066：转基因HIGS马铃薯品系。

图22：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体HIGS_CoA转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_00146、PITG_08393、PITG_10447和PITG_00708的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。RussetBurbank(非转基因对照)；H-13-T050、H-13-T053、H-13-T036、H-13-T032：转基因HIGS马铃薯品系。

图23：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_06748的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Russet Burbank(非转基因对照)，H-15-T008、H-15-T010：转基因HIGS马铃薯品系。

图24：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_09306的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Russet Burbank(非转基因对照)，H-10-T111：转基因HIGS马铃薯品系。

图25：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_09193的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Russet Burbank(非转基因对照)，H-12-T194、H-12-T195、H-12-T222、H-12-T239：转基因HIGS马铃薯品系。

图26：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Desirée品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_09193的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Desirée品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Desirée(非转基因对照)，H-12-T187、H-12-T216、H-12-T237、H-12-T245：转基因HIGS马铃薯品系。

图27：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Russet Burbank品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_19177的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Russet Burbank品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Russet Burbank(非转基因对照)，H-9-T271、H-9-T305、H-9-T308：转基因HIGS马铃薯品系。

图28：转基因HIGS品系上的致病疫霉的相对孢子囊产生。以RNAi构建体转化Desirée品种的马铃薯品系以形成针对致病疫霉基因PITG_19177的dsRNA。在分离叶分析中以致病疫霉感染后，与非转基因的Desirée品种相比，这些品系显示出孢子囊产生的降低(平均有3个生物学重复)。Desirée(非转基因对照)，H-9-T280：转基因HIGS马铃薯品系。

图29：质粒p95N_RNAi PITG_06748，作为含有正义-内含子-反义片段以形成针对目标基因(这里指的是PITG_06748)的dsDNA的载体的示例性代表。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码一种拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

图30：质粒p95N_RNAi_PITG_09306，作为含有正义-内含子-反义片段以形成针对目标基因(这里指的是PITG_09306)的dsDNA的载体的示例性代表。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码一种拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

图31：质粒p95N_RNAi_PITG_09193，作为含有正义-内含子-反义片段以形成针对目标基因(这里指的是PITG_09193)的dsDNA的载体的示例性代表。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码一种拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

图32：质粒p95N_RNAi_PITG_19177，作为含有正义-内含子-反义片段以形成针对目标基因(这里指的是PITG_19177)的dsDNA的载体的示例性代表。此外，这个载体含有CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码一种拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。

实施例

构建体制备

使用PCR扩增所选择的目标基因的明确序列区域，并以正义和反义方向克隆到pRNAi载体里，所述载体适合发夹结构的系统(图2)。通过这种方式，可以将一些具有来自各种目标基因的序列区域的片段克隆到载体中，以形成组合发夹构建体(图3)。

始于致病疫霉基因组DNA，使用PCR扩增来自基因PITG_03410编码区域的290bp的序列区域，经由限制性内切酶位点XhoI和SmaI(通过引物序列插入)切割，并将其克隆至pRNAi载体中(引物1：cgctcgaggctggatctcgcgctgaggt，引物2：ttgatatcgcggaaggcgagagacatcg)。这个载体含有CaMV 35s启动子、多克隆位点、来自基因AtAAP6(编码拟南芥中的氨基酸透性酶)的内含子、另一个多克隆位点以及CaMV 35S终止子。其以XhoI和Ecl136II切割，4.098kb载体部分使用琼脂糖凝胶电泳分离，然后分离出来。在大肠杆菌(E.coli)菌株XL1-blue(Stratagene LaJolla,CA)中转换连接溶液。同一PITG_03410片段按照相反的方向被克隆到质粒pRNAi_PITG_03410_sense。为此，使用PCR从来自致病疫霉的基因组DNA再次扩增所述片段，经由限制性内切酶位点XhoI和SmaI(通过引物序列插入)切割，然后连接到以SmaI-SalI切割并线性化的载体pRNAi_PITG_03410_sense中(图1)。从载体pRNAi切下正义-内含子-反义(RNAi-PITG_03410)基因片段，然后克隆到载体pGBTV/EcoRI_kan中(图4)。为此，pGBTV/EcoRI_kan和pRNAi_PITG_03410都以HindIII切割，然后连接，由此生成质粒pGBTV/EcoRI_kan_PITG_03410(图5)。或者，HIGS-RNAi构建体如HIGS-CoA最初被克隆到载体pAM(DNA Cloning Service e.K.,Hamburg)(图6)。为此，pAM和pRNAi_PITG_03410都以HindIII切割，然后连接，由此生成质粒pAM_HIGS_CoA(图7)。，通过SfiI消化和连接，将HIGS_CoA片段从载体pAM整合到载体p95P-Nos中(DNA Cloning Servicee.K.,Hamburg)(图8)，由此生成质粒p95N_HIGS_CoA(图9)，所述质粒用于马铃薯转化。

除如上所述的适用于合成发夹结构的载体外，可以通过添加两个相反(颠倒)方向的启动子在马铃薯植物中对目标基因编码区域的区段进行表达(图10)。此外，也可以设想通过使用Web microRNA Designer(WMD3)方案的人工微小RNA构建体(amiRNA)进行基因沉默。人工miRNA是21-mer的单链RNA，可以被合成用来特异性负调节植物内所需的基因。就像siRNA，通过mRNA切割进行调节。这些RNAi构建体然后被克隆到双元载体中，并通过马铃薯中的农杆菌诱导的转化而转化。

转化和再生

马铃薯的转化是按照修改的Pel et al(2009)的方案使用抗生素卡那霉素进行的。供体材料在80mLMS(D)(25℃；16h昼/8h夜；2000勒克斯)种植3-4周。为了转化(C1),将节间从供体材料切下，呈大约0.5厘米的外植体。这些外植体在含有10mL MS(D)的培养皿中培养(15-20外植体/皿)中在25℃黑暗中温育2天，所述MS(D)含有70微升在28℃培养过夜的根癌农杆菌，所述农杆菌更早地以HIGS-RNAi构建体作为双元载体(例如p95N)的部分转化。接下来，外植体在滤纸上干燥，并放置在培养皿中在有选择抗生素(400mg/L的特美丁+75mg/L的卡那霉素)的MSW-Medium上，其密封培养2周(25℃；16h昼/8h夜；2000勒克斯)(C2)。这个选择步骤是每2周重复一次直到芽再生(来自C3)。再生芽(图11)在有选择抗生素(250mg/L的特美丁+100mg/L的卡那霉素)的MS(30g/L蔗糖)上温育以引起生根，并通过PCR测试要转化的构建体的整合，从而测试本发明的核酸存在。使用引物Bo2299(5’-GTGGAGAGGCTATTCGGTA-3’)和Bo2300(5’-CCACCATGATATTCGGCAAG-3’)扩增来自细菌NPTII基因的553bp的DNA片段，所述基因编码新霉素磷酸转移酶。此外，使用PCR检测正义和反义片段，以确保构建体完整(图12)。在退火温度55℃，在MulticyclerPTC-200(MJ Research,Watertown,USA)中，使用10ng的基因组DNA，引物浓度0.2μM进行PCR。PCR测试为阳性的芽的可在MS+30g/L蔗糖+400mg/L氨苄青霉素上增殖。

加工的双链RNA和siRNA的检测

在转化的植物中，所表达的发夹或双链RNA通过天然植物RNAi机制以某种程度加工，这样这些RNA分子会被降解成小的单链RNA。这些siRNA沉积在卵菌中的相应的目标基因的mRNA上，从而影响这个基因的沉默。因此，植物处于针对攻击性病原体自我保护的位置。借助这一概念，可以产生具有对致病疫霉的增加的抗性的转基因马铃薯植物。

以用于表达发夹或双链RNA的构建体转化马铃薯植物会导致双链RNA加工成siRNA，这优先于天然植物RNAi机制。为了测量dsRNA的片段，使用trizol方法从转基因植物分离总RNA(Chomczynski和Sacchi，1987)。15μg总RNA/样品补充甲酰胺、变性并在具有10％甲醛的1％的琼脂糖凝胶中用1×MOPS缓冲液(DEPC dH₂O中的0.2M MOPS(钠盐)、0.05M NaOAc、0.01M EDTA。以氢氧化钠调节为pH7.0)进行电泳分离。在20×SSC缓冲液(盐水-柠檬酸钠缓冲液)中使用Northern印记方法，将分离的RNA从凝胶转移到尼龙膜(带正电)。所述RNA与放射性标记的探针杂交，所述探针与以正义或反义方向存在于转化到植物中的构建体中的的目标基因片段的序列互补。如此，与所述dsRNA片段互补的RNA片段被标记并通过磷光影像分析仪检测。

以用于表达发夹或双链RNA的构建体转化马铃薯植物会导致双链RNA加工成siRNA，这优先于天然植物RNAi机制。为了测量成为siRNA的dsRNA的片段，使用trizol方法从转基因植物分离总RNA(Chomczynski和Sacchi，1987)。15μg总RNA/样品补充甲酰胺、变性并在具有15％Tris/硼酸液/EDTA(TBE)和尿酸的聚丙烯酰胺凝胶中在0.5×TBE中进行电泳分离。在0.5×TBE中使用Tank印记方法，将分离的RNA从凝胶转移到尼龙膜(中性)。所述RNA与放射性标记的探针杂交，所述探针与以正义或反义方向存在于转化到植物中的构建体中的目标基因片段的序列互补。如此，与所述dsRNA片段互补的siRNA片段被标记并通过磷光影像分析仪检测。

在各种转基因马铃薯品系中，例如，PR-H4品系或PR-H2品系，可以被检测到这样的siRNA(图13A、B)。这表明植物中转化的构建体可以被植物RNAi机制识别和加工，这样可以形成针对来自致病疫霉的HIGS目标基因的siRNA，其可实现病原体中该基因的沉默。

分离叶分析中转基因马铃薯植物抗性的测量

为测试转基因马铃薯叶的抗性，转基因植物从试管苗开始在温室5L的盆中栽培。6-8周后，每株植物剪下2片羽片并放置在一个密封的塑料盒内在潮湿的Grodan垫上，这样叶茎在潮湿的Grodan材料中。这确保了高湿度。盒子于18℃温育，使用白天/黑夜程序(阳光，2月-9月)。羽片小叶被接种致病疫霉的游动孢子悬浮液滴(10μL；10⁴游动孢子/mL)。24小时后，稍微打开盒盖，以允许盒子内空气平缓循环。游动孢子的目测打分及定量在6天后进行。目测打分评估羽片叶被致病疫霉感染和破坏的程度。对孢子囊进行计数来定量植物中病原体的繁殖能力。在这方面，以前的感染的羽片叶在Falcon管中的5毫升水中，于摇床上温育2h，从而使孢子囊从叶上脱离。在显微镜下，借助Thoma计数室对孢子囊进行计数。

在通过转化各种马铃薯基因型而生产的各种HIGS马铃薯品系中，在以致病疫霉感染后，可以测定到降低的孢子囊数量(6dpi)(图15B-18B)。这表明转基因植物上的病原体的繁殖能力受到了限制。

使用如图5所示的载体，在马铃薯品种Baltica,Hermes、Desirée以及Russet Burbank的遗传背景下，基因PITG_03410作为HIGS的目标基因被测试。应用于这些Russet Burbank品种的转基因植物的分离叶分析表明，与非转基因对照植物相比，转基因植物中的病原体的繁殖能力受到了限制(图20)。

作为适用于发夹结构的合成的载体的替代物，如图10所示的具有目标基因PITG_03410的载体被引入到Hermes品种的马铃薯上，对转基因马铃薯品系进行了分离叶分析的研究(图21)。在这里再次表明，与非转基因对照植物相比，转基因植物上的致病疫霉的繁殖能力受到了限制。

通过分离叶分析检测，还测试了以图3的针对基因PITG_00146、PITG_00708、PITG_10447和PITG_08363的组合载体转化的Russet Burbank马铃薯品种。观察发现与非转基因对照植物相比，转基因植物上的致病疫霉的繁殖能力受到了限制(图22)。

相似地,分离叶分析表明，当通过以图29、图30、图31或图32的载体转化时，Russet Burbank品种的转基因马铃薯上致病疫霉的繁殖能力会受到限制，所述载体针对基因PITG_06748(图23)、PITG_09306(图24)、PITG_09193(图25)或PITG_19177(图27)。

即使在以图31或图32中所示的针对基因PITG_09193(图25)或PITG_19177(图27)的载体转化的Desirée品种的转基因植物上,分离叶分析也表明，与非转基因对照植物相比，转基因植物中的致病疫霉的繁殖能力受到了限制。

马铃薯叶中的RNAi载体瞬时测试系统

开发根据Birch et al.(2010)的瞬时测试系统以研究针对所选择的致病疫霉目标基因序列的RNAi载体的功能。通过基因枪共转化，靶向目标基因的RNAi载体连同包含荧光素酶报告基因和测试目标片段的融合构建体在马铃薯叶中瞬时表达。如果dsRNA构建体在RNAi载体中加工，然后确保形成dsRNA，并作为结果形成siRNA。这些siRNA不仅使目标基因片段转录物降解，还导致融合报告基因转录物降解，这样用功能性RNAi构建体，可以观察到荧光素酶活性的减少。质粒pABM-70Sluci包含双CaMV 35S启动子、多克隆位点、来自萤火虫的luc基因的编码序列(编码荧光素酶，由来自马铃薯基因St-LS1的修饰的内含子PIV2分开(Eckes et al.1986,Vancanneyt et al.1990))、另一个多克隆位点以及来自根癌农杆菌Nopalin合酶基因的Nos终止子。将所述编码序列区域的PCR-扩增片段，例如PITG_03410基因的PCR-扩增片段，克隆到质粒pABM-70Sluci中，其也克隆到pRNAi载体来产生dsRNA构建体(图14A)。

这种瞬时测试系统不仅可以用于RNAi构建体一般功能的验证，也可用来研究基因不同序列区域的沉默效果，最后可以选择基因最好的序列区域进行最佳的沉默。此外，以RNAi构建体基因枪稳定转化的转基因植物可以用来确定单个转基因HIGS的马铃薯品系的沉默效率，所述品系可以，例如，基本上依据构建体的整合位点区分。在通过转化各种基因型的马铃薯获得的并且在致病疫霉感染后显示孢子囊数量减少的各种转基因HIGS马铃薯品系中，也可以测量出荧光素酶活性的减少(图15A-18A)。这表明加工成siRNA的HIGS构建体的功能，所述功能与转基因植物中目标基因序列沉默有关。

当编码基因序列要和载体pRNAi_HIGS_CoA一起在马铃薯叶中瞬时表达时，所述编码基因序列会由组合构建体如pRNAi_HIGS-CoA沉默，例如，目标基因：PITG_08393、PITG_00146、PITG_10447、PITG_00708，各克隆到载体pABM_70Sluci中，在来自萤火虫的luc基因的编码序列之后(pABM_70Sluci_PITG_08393、pABM_70Sluci_PITG_00146、pABM_70Sluci_PITG_10447、pABM_70Sluci_PITG_00708)，组合可以对各种目标基因分析构建体的沉默效率。这也可能通过以RNAi组合构建体和单独的融合构建体基因枪稳定转化转基因植物，所述融合构建体包含荧光素酶报告基因和各种目标基因的测试编码序列。

荧光素酶活性测定借助DualReporter Assay(Promega,Mannheim)进行(Schmidt et al.2004)。

室外条件下转基因马铃薯植物中抗性的测量

为测试在室外条件下转基因马铃薯的抗性，转基因植物最初于年初(3月)从试管苗开始在温室中在多孔垫上栽培3周。接下来，这些植物被种植在温室天然土壤中，温室屋顶为铁丝网，这样植物可接触与田间条件相当的环境条件，例如温度、阳光、降水和湿度。植物被种植在3个地块中，每块6株植物。8周后，通过喷雾接种以致病疫霉接种来自一个地块的2株植物的每一株的一个羽片(750μL；10⁴游动孢子/mL)。放置塑料袋包于这些叶上，以确保高湿度和促进感染。两天之后，塑料袋被移除。对温室中致病疫霉的枯萎病扩散进行目测打分并每周进行照片记录。感染打分的标准最初只对受感染的羽片叶(0：不感染，1：轻微的感染(感染的羽片1/2数量的叶被感染)，2：羽片超过1/2的叶感染，3：感染所有的叶)，然后感染扩散到植物和整个地块(4：感染也延伸到植物其他的叶子，6：感染也延伸到其他植物，8:感染很大程度也扩展到其他植物，10：10％的植物受感染/破坏，20：20％的植物受感染/破坏，100：100％的植物受感染/破坏)。

与作为转基因植物的精确对照而栽培、种植和感染的用于转化的基因型(Transformationsgenotyp)Hermes的马铃薯植物相比，在通过转化Hermes基因型马铃薯获得的各种转基因HIGS马铃薯品系(PR-H-4-7PR-H-4-11)中，测定到这些植物的感染程度在以致病疫霉的感染期间大大降低。感染的减少程度最初通过在接种的羽片上的病原体的感染能力大大下降来得以反映的(感染21天后打分：PR-H-4-7：3.3；PR-H-4-11：3.2；Hermes：7.6)以及在稍后时间这些植物上的病原体传播能力大幅减少(感染32天后打分：PR-H-4-7：26；PR-H-4-11：15；Hermes：80)(图19A、B)。

通过以上描述的测试，不仅可以证明在转基因马铃薯中将HIGS构建体加工成siRNA，而且可以通过降低的宿主植物上病原体孢子囊产生来定量涉及这些转基因植物目标基因序列沉默的构建体的功能，以及这些植物对致病疫霉增加的抗性。因为在不认真测试其功能，不可能鉴定功能性HIGS目标基因，这些在这里详细描述的分析特别适用于明确在HIGS构建体中以及对生成抗性HIGS植物有效的基因。

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Claims (10)

1.马铃薯(Solanum tuberosum)转基因植物或其部分，其基因组中已经稳定整合有双链的第一DNA和双链的第二DNA，以赋予针对疫霉属卵菌的病原体抗性，其中，所述第一和第二DNA的编码链的核苷酸序列彼此完全或部分地反向互补，由此可以产生双链RNA，其特征在于，所述第一DNA包含

(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，或

(c)与(a)或(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或

(d)在严格条件下，与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

2.权利要求1的转基因植物，其特征在于所述植物显示对致病疫霉(Phytophthora infestans)的抗性。

3.权利要求1的转基因植物，其特征在于所述双链RNA是miRNA或siRNA。

4.权利要求1的转基因植物，其特征在于所述第一DNA和第二DNA与至少一个启动子可操作连接。

5.权利要求1的植物的部分，其特征在于其是种子或细胞。

6.生产显示对疫霉属卵菌的抗性的马铃薯转基因植物的方法，包括以下步骤：

(i)产生转化的第一亲本植物，其含有稳定整合到所述亲本植物基因组中的双链的第一DNA，所述第一DNA包含

(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，或

(c)与(a)或(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或

(d)在严格条件下，与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(ii)产生转化的第二亲本植物，其含有稳定整合到所述亲本植物基因组中的双链的第二DNA，其中，所述第一和第二DNA的编码链的核苷酸序列彼此完全或部分地反向互补；

(iii)将所述第一亲本植物与第二亲本植物进行杂交；

(iv)选择植物，其基因组中已经稳定整合有双链的第一DNA和双链的第二DNA，由此可以产生双链RNA，以赋予针对疫霉属卵菌的病原体抗性。

7.权利要求6的方法，其特征在于所述抗性是针对致病疫霉的抗性。

8.权利要求6的方法，其特征在于所述双链RNA是miRNA或siRNA。

9.用于外部应用于植物的含有双链RNA的组合物，其中所述RNA的链对应于双链DNA的转录物，所述DNA包含

(a)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列，或

(b)SEQ ID NO:1-43的核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的片段，或

(c)与(a)或(b)的核苷酸序列之一互补的核苷酸序列，或

(d)在严格条件下，与(a)、(b)或(c)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

10.权利要求9的组合物，用于赋予针对疫霉属卵菌的抗性，尤其是针对致病疫霉的抗性。