CN101605904A - 用靶向mthfr样基因的rna干扰控制线虫的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够在植物中抑制建立或维持线虫感染所必需基因的表达的双链RNA组合物和转基因植物，和其相关方法。具体而言，本发明涉及RNA干扰抑制为MTHFR样基因的靶植物基因表达的用途，还涉及产生具有对寄生线虫增加的抗性的植物。

Description

用靶向MTHFR样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法

对相关申请的交叉引用

[第1段]本申请要求于2007年2月9日提交的序列号为60/900,621的美国临时申请的优先权权益。

发明领域

[第2段]本发明涉及线虫的控制。此处公开了制备具有增强的线虫抗性的转基因植物的方法、包含使其具有线虫抗性的多核苷酸的表达载体及转基因植物和其产生的种子。

发明背景

[第3段]线虫是以超过2,000种行间作物、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶及茎为食，造成世界范围估计一千亿美元作物损失的微小线虫。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根结线虫(RKN)、形成胞囊及形成损伤的线虫。以造成采食部位处根瘿形成为特征的根结线虫具有相对广泛的宿主范围并且因此对种类繁多的作物物种是致病性的。形成胞囊和形成损伤的线虫物种具有更有限的宿主范围，不过依旧在易感作物中造成巨大损失。

[第4段]致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区及在沙土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大豆胞囊线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草的总计约50种宿主。

[第5段]线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受其他土源性植物病原体侵袭。

[第6段]线虫的生命周期具有三个主要阶段：卵、幼体和成体。该生命周期在线虫物种之间不同。例如，SCN的生命周期在最适条件下通常可以于24-30日内完成，而其他物种可能经过长达一年或更长时间以完成生命周期。当温度和湿度水平在春季变得适宜时，蠕虫形状的幼体在土壤中从卵孵化出来。仅幼体发育阶段的线虫能够感染大豆根。

[第7段]SCN的生命周期已经成为众多研究的主题，并且因此是理解线虫生命周期的有用实例。在穿透大豆根后，SCN幼体通过根移动直至它们接触维管组织，此时SCN幼体停止迁移并开始采食。借助口针，线虫注射了调节某些根细胞并将它们转化成特化采食部位的分泌物。这些根细胞在形态学上转化成巨大的多核合胞体(或在RKN情况中为巨大细胞)，这种合胞体被用作线虫的营养物来源。主动采食的线虫因此从植物窃取必要的营养物，导致产量损失。当雌性线虫采食时，它们膨胀并逐渐变得如此巨大，以至于它们的身体突破根组织并暴露在根的表面。

[第8段]在采食一段时间后，作为成体不膨胀的雄性SCN线虫从根迁移至土壤内并使膨大的雌性成体受精。雄性线虫随后死亡，而雌性线虫仍附着于根系统并继续采食。膨大雌性线虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊(a mass or egg sac)中并随后在线虫体腔内发育。雌性成体的整个体腔最终充满卵，并且雌线虫死亡。正是充满卵的死亡雌线虫体才称作胞囊。最后胞囊释放并游离存在于土壤中。胞囊的璧变得极坚韧，从而为胞囊内所含大约200-400粒卵提供良好的保护作用。SCN卵在胞囊内存活直至适宜的孵化条件出现。尽管众多的卵可以在第一年中孵化，然而很多卵也会在保护性胞囊内存活几年。

[第9段]线虫依赖其自身力量在土壤中每年只能穿行几英寸。然而，线虫侵染可以以多种方式传播相当远的距离。可以移动受侵染土壤的任何事物，包括农场机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人，都能够传播这种侵染。种子大小的土壤颗粒往往污染收获的种子。因此，当来自受侵染田地的污染种子在非侵染田地中播种时，可以传播线虫侵染。甚至还存在某些线虫种类可以通过鸟类传播的证据。仅可以预防这些起因中的某些起因。

[第10段]防治线虫侵染的常规方法包括：在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理完线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。

[第11段]已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予植物对寄生线虫增加的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在采食植物的部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子然后能够用于指导有害蛋白质或酶的特异性表达，或指导对靶基因或对一般细胞基因反义的RNA的表达。这些植物启动子也可以用于通过用含有与其产物被摄取后诱导线虫致死的基因连接的植物靶基因的启动子的构建体转化植物来在采食部位特异性赋予线虫抗性。

[第12段]最近，已提出用RNA干扰(RNAi)(也称作基因沉默)作为控制线虫的方法。当与靶基因或mRNA的序列基本上相关的双链RNA(dsRNA)引入细胞中时，靶基因的表达会被抑制(参见例如美国专利号6,506,559)。美国专利号6,506,559证明了RNAi抗秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中已知基因的有效性，但没有披露RNAi用于控制植物寄生的线虫的用途。

[第13段]已有提议采用靶向线虫主要基因的RNAi，例如PCT公开WO 01/96584、WO 01/17654、US 2004/0098761、US 2005/0091713、US2005/0188438、US 2006/0037101、US 2006/0080749、US 2007/0199100和US 2007/0250947。

[第14段]对于RNAi的作用已提出了许多的模型。在哺乳动物系统中，大于30个核苷酸的双链RNA以一种非序列特异性方式引发诱导合成干扰素以及蛋白质合成的总体停止。但是，美国6,506,559揭示在线虫中，对应于靶基因序列的双链RNA的长度可为至少25、50、100、200、300或400碱基，甚至更长的双链RNA也能有效诱导秀丽隐杆线虫中的RNAi。已知当用包含98～854个核苷酸的双链区的发夹RNA构建体转化许多植物品种时，能有效沉默靶植物基因。一般认为在包括线虫和植物的许多有机体中，大片的双链RNA在细胞内被裂解成大约19-24个核苷酸的片段(siRNA)，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。

[第15段]亚甲基四氢叶酸还原酶(脱氢酶)(MTHFR)是涉及一碳代谢、甘氨酸降解、丝氨酸代谢、叶酸生物合成、一氧化碳脱氢酶通路和甲酰四氢叶酸(formtetrahydrofolate)生物合成的酶。它催化下列反应：5，10-亚甲基四氢叶酸+NAD⁺＝5，10-次甲基四氢叶酸+NADH+H。

[第11段]在植物中，这种酶涉及叶酸介导的一碳代谢。已经表明该酶以大约66kDa亚基的二聚体存在。与哺乳动物的MTHFR不同，植物酶更倾向于NADH转化为NADPH，而且不会被S-腺苷甲硫氨酸抑制。在植物的胞质溶液中NADH依赖的MTHFR反应可以是可逆的。还证明了叶组织能够代谢[甲基-(14)C]甲基四氢叶酸为丝氨酸、糖和淀粉。(Roje S.等人，J Biol Chem，274：36089-96，1999)。在酵母菌中，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)蛋白质家族催化5，10-亚甲基四氢叶酸至5-甲基四氢叶酸，含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作为辅助因子。已知该酶在除酵母菌之外的真核生物中被S-腺苷甲硫氨酸变构调节(Kasap M.等人，Mol.Phylogenet Evol.，42：838-846，2007)。

[第12段]虽然已经进行了大量的努力来使用RNAi控制植物寄生线虫，但是至今还没有任何国家对转基因的线虫抗性植物解除管制。所以，仍然需要鉴定安全有效的组合物和方法以用RNAi控制植物寄生线虫，并生产对植物寄生的线虫具有增加的抗性的植物。

发明内容

[第13段]发明人发现大豆MTHFR样基因(记为SEQ ID NO：1)，在合胞体中过表达，而且受到SCN对大豆根的感染的诱导。发明人还发现当MTHFR样基因(SEQ ID NO：1)在大豆根模型系统中得到抑制时，线虫感染这类根的能力下降。

[第14段]所以，在第一实施方案中，本发明提供了双链RNA(dsRNA)分子，该分子包含：a)第一链，包含与MTHFR样基因的一部分基本上相同的序列；和b)第二链，包含与第一链基本上互补的序列。

[第15段]本发明进一步涉及双链RNA分子库，包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与MTHFR样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。

[第16段]在另一个实施方案中，本发明提供能够表达与MTHFR样基因的一部分基本上相同的双链RNA的转基因线虫抗性植物。

[第17段]在另一个实施方案中，本发明提供能够表达dsRNA分子库的转基因植物，其中每个dsRNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自与MTHFR样基因的一部分基本上相同的多核苷酸。

[第18段]在另一个实施方案中，本发明提供一种制备能够表达双链RNA分子库的转基因植物的方法，其中每个双链RNA分子与植物中的MTHFR样基因的一部分基本上相同，所述方法包括步骤：a)制备具有与MTHFR样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成MTHFR样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择表达所述转录物的子代。

[第19段]本发明进一步提供一种赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包括步骤：a)制备具有与MTHFR样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成MTHFR样基因一部分的双链转录物；b)用所述核酸转化受体植物；c)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和d)选择线虫抗性的子代。

[第20段]本发明进一步提供包含与MTHFR样基因的一部分基本上相同的序列的表达盒和表达载体。

[第21段]在另一个实施方案中，本发明提供一种控制寄生线虫感染植物的方法，包括用双链RNA分子转化植物的步骤，该双链RNA分子有效地连接到根优选的、线虫可诱导的或采食部位优选的启动子上，该双链RNA包含一条与靶核酸的一部分基本上相同的链，该靶核酸对于采食部位的形成、发展或支持，特别是合胞体或巨大细胞的形成、发展或支持是必需的，从而通过去除或功能性失活所述采食部位、合胞体或巨大细胞来控制线虫对植物的感染，其中所述靶核酸是MTHFR样基因。

附图说明

[第22段]图1列出了指定给MTHFR样基因、多种启动子和MTHFR样蛋白质的序列号的表格。

[第23段]图2a-2b展示了示例性MTHFR样蛋白质的氨基酸比对：大豆52226546(SEQ ID NO：2)、红车轴草AB236821(SEQ ID NO：10)、蒺藜苜蓿ABD28438(SEQ ID NO：8)、拟南芥AAC13627(SEQ ID NO：12)、稻EAY84251(SEQ ID NO：14)、火炬松TA8217_3352编码的蛋白质(SEQ IDNO：20)、番茄BT014045编码的蛋白质(SEQ ID NO：16)和陆地棉TA21605_3635编码的蛋白质(SEQ ID NO：18)。用EMBOSS-4.0.0的GETORF算法得到开放阅读框和蛋白质的翻译。在Vector NTI软件组进行上述比对(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.05，空位分隔罚分＝8)。

[第24段]图3展示了示例性MTHFR样基因的整体氨基酸同一性百分比：大豆52226546(SEQ ID NO：2)、红车轴草AB236821(SEQ IDNO：10)、蒺藜苜蓿ABD28438(SEQ ID NO：8)、拟南芥AAC13627(SEQ IDNO：12)、稻EAY84251(SEQ ID NO：14)、火炬松TA8217_3352编码的蛋白质(SEQ ID NO：20)、番茄BT014045编码的蛋白质(SEQ ID NO：16)和陆地棉TA21605_3635编码的蛋白质(SEQ ID NO：18)。用Vector NTI 10.3.0版的AlignX软件模块计算配对比对和同一性百分比(Invitrogen，Carlsbad，CA.)(空位开放罚分＝10，空位延伸罚分＝0.1)。

[第25段]图4展示了示例性MTHFR样基因的整体核苷酸同一性百分比：大豆cDNA克隆52226546(SEQ ID NO：1)、编码红车轴草AB236821的多核苷酸(SEQ ID NO：9)、编码蒺藜苜蓿ABD28438的多核苷酸(SEQ IDNO：7)、编码拟南芥AAC13627的多核苷酸(SEQ ID NO：11)、编码稻EAY84251的多核苷酸(SEQ ID NO：13)、火炬松TA8217_3352(SEQ IDNO：19)、番茄BT014045(SEQ ID NO：15)和陆地棉TA21605_3635(SEQ IDNO：17)。用Vector NTI 10.3.0版的AlignX软件模块计算配对比对和同一性百分比(Invitrogen，Carlsbad，CA.)(空位开放罚分＝15，空位延伸罚分＝6.66)。

[第26段]图5a-5i示出SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17、19的示例性MTHFR样基因或编码MTHFR样同源物的多核苷酸序列的多种可能的21mer的核苷酸位置。

优选实施方案的详述

[第27段]本发明可以通过参考以下详细描述的本发明优选实施方案及本文所包含实施例而更容易地理解。除非另外说明，本文中所用术语将根据相关领域普通技术人员的习惯用法加以理解。除了下文提供的术语定义外，分子生物学中常用术语的定义也可以在Rieger等，1991Glossary ofgenetics：classical和molecular，第五版，Berlin：Springer-Verlag；和在Current protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等编著，CurrentProtocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资企业(1998增刊)中找到。应当理解如本说明书及在权利要求书中所用，“一种(a)”或“一个(an)”可以意指一个或多个，这取决于该冠词所用的上下文。因此，例如对“单数细胞”的称谓可以意指可以使用至少一个细胞。还应当理解本文中使用的术语仅仅旨在描述具体实施方案而并非意味对其限制性。

[第28段]在本申请通篇范围内，参考了多种专利和文献出版物。全部这些出版物及这些出版物中引用的那些参考文献的公开内容完整地并入本申请作为参考，旨在更充分地描述本发明所涉及领域的现状。

[第29段]此处植物的“MTHFR样基因”定义为与具有SEQ ID NO：1(大豆MTHFR样基因)限定的序列的52226546cDNA有至少60％序列同一性的基因。根据本发明，MTHFR样基因包括具有诸如SEQ ID NOs：3、7、9、11、13、15、17和19中限定的那些序列的基因，其是SEQ ID NO：1的大豆MTHFR样基因的同源物。此处限定的MTHFR样基因编码与具有SEQ ID NO：2中所限定序列的大豆MTHFR样多肽有至少60％序列同一性的多肽。这样的多肽包括具有SEQ ID NOs：8、10、12、14、16、18和20中限定的序列的MTHFR样多肽。

[第30段]其它MTHFR样基因(MTHFR样基因同源物)可以用此处提供的信息和生物技术领域技术人员已知的技术从大豆之外的植物中分离。例如，在严紧条件下与SEQ ID NO：1的核酸杂交的植物核酸分子可以从植物组织cDNA文库中分离。或者，可以从植物细胞中分离mRNA(例如通过Chirgwin等人，1979，Biochemistry 18：5294-5299的胍盐-硫氰酸盐抽提方法)，cDNA可以用反转录酶制备(例如Moloney MLV反转录酶，可购自Gibco/BRL，Bethesda，MD；或AMV反转录酶，可购自SeikagakuAmerica，Inc.，St.Petersburg，FL)。可以基于SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物。可以基于具有SEQ ID NOs：7、9、11、13、15、17和19中限定的序列的MTHFR样基因序列设计其它寡核苷酸引物。对应于此处限定的MTHFR样靶基因的核酸分子可以根据标准PCR扩增技术用cDNA或备选的基因组DNA作为模板和适宜的寡核苷酸引物扩增。这样扩增的核酸分子可以克隆至合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。

[第31段]此处使用的“RNAi”或“RNA干扰”指的是双链RNA(dsRNA)介导的植物中序列特异性转录后基因沉默方法。此处使用的“dsRNA”指部分或完全双链的RNA。双链RNA还指小或短的干扰RNA(siRNA)、短干扰核酸(siNA)、短干扰RNA、微小-RNA(miRNA)等等。在RNAi方法中，将包含与靶基因(例如MTHFR样基因)的一部分基本上相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链RNA引入植物中。在引入植物以后，该靶基因特异性双链RNA被加工成相对小的片段(siRNA)，接着能够分布整个植物，导致具有表型的功能缺失突变，这种表型在一代的时间内可能会与靶基因的部分或完全缺失产生的表型非常接近。或者，靶基因特异性双链RNA与调节元件或启动子有效地结合，导致该双链RNA在组织中以空间性的、空间性的或可诱导的方式表达，可被含有RNAi加工结构的植物细胞进一步加工为相对小的片段，从而得到功能缺失表型。另外，该调节元件或启动子可指导对根或合胞体或巨大细胞优先的表达，其中所述双链RNA可以或者在这些组织中组成型表达或者被线虫或幼体线虫(例如J2线虫)的采食而诱导表达。

[第32段]如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧啶替换胸腺嘧啶，用于dsRNA的术语“基本上相同”意指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约80％-90％相同，更优选地、与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95％相同并且最优选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约95％、96％、97％、98％、99％相同或完全相同。20个或更多个核苷酸是指靶基因至少约20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500或2000个连续碱基的部分或至多靶基因的全长。

[第33段]如此处所用，“互补的”多核苷酸是那些能够根据标准沃森-克里克互补规则碱基配对的多核苷酸。具体而言，嘌呤会与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)、对于DNA是腺嘌呤与胸腺嘧啶(A:T)、或对于RNA是腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。可以理解即使不完全互补两种多核苷酸也可以互相杂交，只要各自具有与对方基本上互补的至少一个区域。如此处所用，“基本上互补”指两个核酸序列的核苷酸至少超过80％互补。优选这两个核酸序列至少超过85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或全部核苷酸互补。或者，“基本上互补”指两个核酸序列能够在高度严紧的条件下杂交。如此处所用，术语“基本上相同”或“对应于”指两个核酸序列具有至少80％的序列同一性。优选这两个核酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

[第34段]如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体。该术语还包括RNA/DNA杂合体。当合成制备双链RNA时，不常见的碱基(例如肌酐、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他)也可用于反义RNA、双链RNA和核酶配对。例如含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已表明能以高亲和力结合RNA并作为基因表达的有效的反义抑制剂。也可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯骨架的修饰或对RNA的核糖基团中的2’-羟基修饰。

[第35段]如此处所用的术语“控制”当用于感染的上下文中时指感染的降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性；但是，这种增加的抗性并不意味着植物必须100％地抗线虫感染。在优选实施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植物高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。优选所述野生型植物是具有与线虫抗性增加的植物相似或更优选相同的基因型，但是不包含针对靶基因的双链RNA的植物。植物对线虫感染的抗性可以是由于当线虫暴露于含有双链RNA的植物时，线虫的死亡、不育、停止发育或移动性受损造成的，所述双链RNA特异性针对对于功能性采食部位、合胞体或巨大细胞的发育或维持必须的基因。此处使用的术语“对线虫感染的抗性”或“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主动过程达到，例如通过产出对线虫有害的物质，或通过被动过程达到，例如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例如合胞体或巨大细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如，计数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫的比例，或对于胞囊线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生的胞囊数量或线虫卵的数量。

[第36段]如本文中所用，术语“植物”根据上下文可以理解为意指完整植株、植物细胞、植物器官、植物种子及其子代。词汇“植物”也指任意植物，尤其指种子植物，并且可以包括，但不限于农作物植物。植物部分包括，但不限于茎、根、嫩枝、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、微孢子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。植物的类别通常与适合转化技术的高等和低等植物的类别一样广泛，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼(horsetails)、裸蕨植物、苔藓植物和多细胞藻类。本发明还包括用本发明的植物制备的种子。在一个实施方式中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高的抗线虫感染的抗性。

[第37段]如此处使用的术语“转基因”指含有至少一个重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是稳定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本发明的目的，术语“重组多核苷酸”指的是已经由遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。其实例包括连接到或加入到异源序列的任何克隆多核苷酸。术语“重组”并非指天然发生事件所导致的多核苷酸的改变，例如自发突变，或通过选择性育种导致的非自发突变。

[第38段]如此处所用的术语“有效抑制表达的量”指的是足以降低植物中靶基因产生的mRNA或蛋白质的水平或稳定性的双链RNA的浓度或量。如此处所用的“抑制表达”指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物的水平的缺乏或可观察到的降低。靶基因表达的抑制可能对于寄生线虫是致死的，其可以直接或间接通过对采食部位、合胞体或巨大细胞的修饰或根除达成，或者，如果对全功能采食部位、合胞体或巨大细胞的进入与寄生线虫的生命周期的特定阶段相关的话，这样的抑制可以拖延或防止进入特殊的发育步骤(例如变态)。可以通过检测植物根部胞囊的减少或消除，或线虫或线虫侵染的其他性质来确认抑制的结果(见下文实施例3所述)。

[第39段]根据本发明，用核酸或双链RNA转化植物，该核酸或双链RNA特异性抑制靶基因在植物中表达，该基因对于采食部位、合胞体或巨大细胞的发育和维持是必需的，最后影响线虫的存活、变态或繁殖。在一个实施方案中，所述双链RNA由已经转化入所感染的植物的祖株中的载体编码。优选表达该双链RNA的核酸序列在根部特异性启动子或寄生线虫采食细胞特异性启动子或线虫可诱导的启动子的转录控制下。

[第40段]所以，本发明的双链RNA包含与植物基因组的MTHFR样靶基因的一部分基本上相同的第一链和与第一链基本上互补的第二链。在优选的实施方案中，靶基因选自由下列多核苷酸组成的组中：a)含有SEQID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；和c)与含有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；和d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸。该基本上相同的双链核苷酸序列的长度可以是MTHFR样基因的至少大约19、20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续碱基或至多MTHFR样基因的全长。在一个优选实施方案中，双链核苷酸序列的长度为从大约19至大约200-500个连续核苷酸的长度。在另一个优选的实施方案中，本发明的双链RNA与SEQ ID NO：3的碱基1～199基本上相同或相同。

[第41段]如上所述，长度大于约19-24个核苷酸的双链RNA片段由线虫和植物细胞内裂解成大约19-24个核苷酸长的siRNA，这些siRNA是RNAi现象的实际介质。图5a-5i中的表格列出了此处限定的MTHFR样基因的示例性21-mer。该表格也可用于通过从各21mer加上或减去适宜数量的核苷酸计算19、20、22、23或24-mer。所以，本发明的双链RNA长度范围在大约19个核苷酸至800个核苷酸，或至多MTHFR样基因的全长。优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至600个核苷酸的长度。更优选本发明的双链RNA具有大约21个核苷酸至500个核苷酸的长度，或约21个至400个核苷酸的长度。

[第42段]如此处所公开的，不需要RNA与靶基因100％序列同一性来实现本发明。当优选含有与MTHFR样基因的部分序列相同的核苷酸序列的双链RNA用于抑制时，本发明可以容忍因为基因操作或合成、基因突变、品系多态性或进化趋异导致的可预期的序列变化。所以本发明的双链RNA还涵盖与靶基因具有至少1、2或更多核苷酸错配的双链RNA。例如，本发明中可以预见图5a-5i中示例性示出的21mer双链RNA序列可包含1、2或更多核苷酸的添加、删除或取代，只要得到的序列仍然干扰MTHFR样基因的功能。

[第43段]可以用本领域已知的序列比较和比对算法(见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，Stockton Press，1991，和其中引用的参考文献)来优化本发明的双链RNA和MTHFR样靶基因之间的序列同一性，并通过例如BESTFIT软件程序(例如威斯康辛大学遗传计算组)中实施的Smith-Waterman算法以默认参数计算核苷酸序列间的差异百分比。优选在抑制性RNA和靶基因的部分之间的序列同一性大于80％、90％，甚至100％。或者，RNA的双链体区域可以功能性地限定为能够在严紧条件下与靶基因转录物的部分杂交的核苷酸序列(严紧条件例如为400mMNaCl，40mM PIPES pH 6.4，1mM EDTA，60℃杂交12-16小时，然后65℃下用0.1％SDS和0.1％SSC洗涤大约15-60分钟)。

[第44段]当本发明的双链RNA长度大于约21个核苷酸时，例如50～1000个核苷酸，其会在植物或寄生线虫细胞内被随机裂解成大约21个核苷酸的双链RNA，即siRNA。本发明的较长双链RNA的裂解会产生来自该较长双链RNA的大约21mer(大约19mer～大约24mer范围内)的双链RNA的库。该约21mer双链RNA库也包含在本发明的范围内，不管是在植物或线虫细胞内产生的还是用已知的寡核苷酸合成技术合成的。

[第45段]本发明的siRNA具有对应于植物中在整个MTHFR样基因完整序列中跨越19-24个连续核苷酸片段的序列。例如，衍生自如SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的MTHFR样基因的本发明siRNA库可以包括多种RNA分子，其选自含有与图5a-5i中所示SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19的21mer核苷酸基本上相同的一条链的寡核苷酸。衍生自SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19所述的MTHFR样基因的本发明siRNA库也可以包括含有衍生自图5a-5i中所述SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19的任意21个连续核苷酸序列的特定RNA分子的任意组合。并且，如上所述，植物中多个专门切酶产生通常在19-24个核苷酸大小的siRNA(见Henderson等人，2006.Nature Genetics 38：721-725)。本发明的siRNA范围可以在约19个连续核苷酸至约24个连续核苷酸之间。同样，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19的约19、20、21、22、23或24个连续核苷酸序列的任意一种。或者，本发明的siRNA库可包括多个RNA分子，其具有衍生自SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19的约19、20、21、22、23和/或24个连续核苷酸序列的任意组合。

[第46段]本发明的双链RNA可任选地包括在一端或两端的单链突出。该双链结构可以通过单链自身互补RNA链形成(即形成发夹环)或两个互补的RNA链形成。RNA双链体的形成可以在细胞内或细胞外起始。当本发明的双链RNA形成发夹环时，可任选地包括内含子(如US2003/0180945A1中所述)或核苷酸间割区，该间割区是在互补的RNA链间的序列片段以稳定细胞中的发夹转基因。制备各种双链RNA分子的方法记载于例如WO 99/53050和美国专利No.6,506,559中。RNA可以允许每个细胞输送至少一个拷贝的量引入。更高剂量的双链材料会得到更有效的抑制。

[第47段]在另一个实施方案中，本发明提供分离的重组表达载体，其包含编码如上所述双链RNA的核酸，其中与宿主植物细胞的野生型品种相比，该载体在宿主植物细胞中的表达导致对寄生线虫的抗性增加。如此处所用的术语“载体”指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环状双链DNA环，附加的DNA片段可以连接其中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们导入的宿主植物细胞中自主复制。其他载体在导入宿主细胞时整合入宿主植物细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导其有效连接的基因的表达。这样的载体在此称为“表达载体”，用于重组DNA技术的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明意欲包括具有相同功能的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如马铃薯病毒X，烟草rattle病毒和双粒病毒组)。

[第48段]本发明的重组表达载体包括以适宜在宿主植物细胞中表达核酸的形式的本发明核酸，意思是该重组表达载体包括一个或多个调节序列，该调节序列基于待用于表达的宿主植物细胞进行选择，被有效连接至待表达的核酸序列。至于重组表达载体，术语“有效连接”和“有效结合”可以互换，意为以允许核苷酸序列表达的方式(即，当载体被引入宿主植物细胞中时在宿主植物细胞中表达)将目的核苷酸序列连接到调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。例如这类调节序列记载于Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)已及Gruber和Crosby的：Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick和Thompson编著，第7章，89-108，CRC Press：BocaRaton，Florida中，包括其参考文献。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的那些和仅仅在某些宿主细胞中或在某些情况下指导核苷酸序列表达的那些。本领域技术人员了解表达载体的设计可取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、所需双链RNA的表达水平等因素。本发明的表达载体可引入植物宿主细胞中进而产生此处所述的核酸编码的本发明的双链RNA分子。

[第49段]根据本发明，重组表达载体包括有效连接到核苷酸序列的调节序列(例如启动子)，该核苷酸序列是本发明双链RNA的一条或两条链的模板。在一个实施方案中，所述核酸分子进一步包括在所述核酸分子任何一端侧翼的启动子，其中该启动子驱动各个DNA链的表达，从而产生杂交形成双链RNA的两个互补的RNA。在另一个实施方案中，核酸分子包含转录成在一个转录单元中有双链RNA的两条链的核苷酸序列，其中正义链从转录单元的5’端开始转录，反义链从3’端开始转录，其中这两条链被大约3～500个碱基对隔开，转录后，该RNA转录产物自身折叠形成发夹。根据本发明，发夹转录物中的间隔区可以是任何DNA片段。

[第50段]根据本发明，所引入的多核苷酸如果合并入非染色体自主复制子中或整合入植物染色体中，会在植物细胞中稳定保持。或者，所引入的多核苷酸可以存在于染色体外非复制载体上，并瞬时表达或瞬时有活性。不管存在于染色体外非复制载体中还是整合入染色体的载体中，该多核苷酸优选位于植物表达盒中。植物表达盒优选含有能够驱动在植物细胞中基因表达的调节序列，该调节序列得到有效地连接，从而使得每个序列都能够发挥其功能，例如通过多聚腺苷酸信号终止转录。优选的多聚腺苷酸信号是那些来自于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)t-DNA的信号，例如已知为Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合成酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBO J.3：835)或其功能等同物，还有植物中的所有其他有功能活性的终止子都适用。因为植物基因的表达通常不在转录水平限制，植物表达盒优选包含其他有效连接的序列，例如像翻译增强子的序列，例如来自烟草花叶病毒的含有5’-不翻译前导序列的增速驱动序列，可增加每个RNA产生的多肽比例(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。植物表达载体的实例包括详细描述于下列文献中的载体：Becker，D.等人，1992，New plant binary vectors with selectable markers located proximalto the left border，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；Bevan，M.W.，1984，Binary Agrobacterium vectors for plant transformation，Nucl.Acid.Res.12：8711-8721；和Transgenic Plants第1卷，Engineering and Utilization中的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，S.15-38。

[第51段]植物基因的表达应该有效地连接至适当启动子，该启动子以时间优先、空间优先、细胞类型优先和/或组织优先方式使该基因表达。用于本发明表达盒的启动子包括能够在存在于植物根部的植物细胞中起始转录的任何启动子。这类启动子包括但不限于，那些能够从植物、植物病毒和含有在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌和根瘤菌)中得到的启动子。优选本发明的表达盒包括根特异性启动子、病原体可诱导的启动子或线虫可诱导的启动子。更优选该线虫可诱导的启动子是寄生线虫采食部位特异性启动子。寄生线虫采食部位特异性启动子可以对合胞体细胞或巨大细胞具有特异性或对这两种细胞都具有特异性。如果一个启动子在其诱导状态下的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)比未诱导状态下的活性高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这个启动子是可诱导的启动子。如果一个启动子的活性(通过其控制下产生的RNA量来测定)在特定的细胞类型、组织或器官中比在同一个植物的其他细胞类型、组织中要高至少30％、40％、50％，优选至少60％、70％、80％、90％，更优选至少100％、200％、300％，那么这种启动子是细胞、组织或器官特异性启动子，优选所述其他的细胞类型或组织是相同植物器官(例如根)的细胞类型或组织。在器官特异性启动子的情况中，启动子活性应该与其他植物器官中的启动子活性比较，例如叶、茎、花或种子。

[第52段]启动子可以是组成型的、可诱导的、发育阶段优先的、细胞类型优先的、组织优先的或器官优先的。组成型启动子在大多数情况下都有活性。组成型启动子的非限制实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science 236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)、拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花斑病病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利5,683,439)、来自农杆菌属T-DNA的启动子，例如甘露碱合成酶、胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶、核酮糖磷酸氢盐羧化酶(ssuRUBISCO)启动子的小亚基等。优选在接触寄生线虫的细胞中表达双链RNA的启动子。或者，所述启动子可以驱动双链RNA在远离接触线虫的部位的植物组织中表达，然后该双链RNA可以由植物转运至接触寄生线虫的细胞中，在线虫采食部位的特定细胞中或接近线虫采食部位的细胞中，例如合胞体细胞或巨大细胞。

[第53段]可诱导的启动子在特定环境条件下是有活性的，例如存在或缺乏营养素或代谢产物、热或冷、光照、病原体攻击、缺氧条件等。例如，已经表明启动子TobRB7、AtRPE、AtPyk10、Gemini19和AtHMG1可以由线虫诱导(对于线虫可诱导的启动子的综述，请参见Ann.Rev.Phytopathol.(2002)40：191-219；还参见US 6,593,513)。分离可以由线虫诱导的其他启动子的方法在美国专利5,589,622和5,824,876中列出。其他可以诱导的启动子包括：芸苔属的hsp80启动子，其可由热休克诱导；PPDK启动子，其由光诱导；烟草、拟南芥和玉蜀黍的PR-1启动子，其可以由病原体感染诱导；和Adh1启动子，其由缺氧和冷胁迫诱导。植物基因表达也可由可诱导的启动子促进(关于综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。如果需要时间特异性基因表达，可化学诱导的启动子特别适用。这种启动子的非限制性实例是可水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)、可四环素诱导的启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和可乙醇诱导的启动子(WO 93/21334).

[第54段]发育阶段优先的启动子在发育的特定阶段优先表达。组织和器官优先的启动子包括那些在特定组织和器官优先表达的启动子，例如叶、根、种子或木质部。组织优先或器官优先启动子的实例包括但不限于果实优先、胚珠优先、雄性组织优先、种子优先、珠被优先、块茎优先、柄优先、果皮优先和叶子优先、柱头优先、花粉优先、花药优先、花瓣优先、萼片优先、花梗优先、长角果优先、根优先、茎优先等等。种子优先的启动子在种子发育和/或萌发时优先表达。例如，种子优先启动子可以是胚优先、胚乳优先和种皮优先的。见Thompson等人，1989，BioEssays10：108。种子优先的启动子包括但不限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

[第55段]其他适宜的组织优先或器官优先启动子包括但不限于，油菜的油菜籽蛋白基因启动子(美国专利号5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP-启动子(Baeumlein等人，1991，Mol Gen Genet.225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)菜豆素启动子(美国专利号5,504,200)、芸苔属Bce4-启动子(WO 91/13980)、或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，Plant Journal，2(2)：233-9)，以及在像玉蜀黍、大麦、小麦、黑麦、稻等单子叶植物中赋予种子特异性表达的启动子。要关注的适宜启动子是大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)，或在WO 99/16890中描述的那些启动子(大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶谷蛋白基因、小麦的麦胶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因)。

[第56段]用于本发明的表达盒的其他启动子包括但不限于，主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-conglycin启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、蜡质基因(waxy)启动子、超甜基因(shrunken)1启动子、超甜基因2启动子和bronze基因启动子、Zm13启动子(US5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利号5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(US 5,470,359)，以及合成的或其他天然启动子。

[第57段]根据本发明，所述表达盒包括与核苷酸序列有效连接的表达控制序列，该核苷酸序列是所述双链RNA的一条或两条链的模板。该双链RNA模板包括：(a)第一链，具有与MTHFR样基因的大约19～500个或至多全长的连续核苷酸基本上相同的序列；和(b)第二链，具有与第一链基本上互补的序列。在进一步的实施方案中，启动子位于所述模板核苷酸序列任一端的侧翼，其中所述启动子驱动各个单独的DNA链的表达，进而产生两条互补的RNA，这两条互补的RNA能够杂交并形成所述双链RNA。在备选的实施方案中，核苷酸序列被转录成在一个转录单元上的双链RNA的两条链，其中，正义链从转录单元的5’端转录，而反义链从3’端转录，其中这两条链隔开大约3～500个碱基对，并且转录之后，该RNA转录物自身折叠形成发夹结构。

[第58段]在另一个实施方案中，所述载体含有双向启动子，驱动两个核酸分子的表达，由此一个核酸分子编码与MTHFR样基因的一部分基本上相同的序列，而另一个核酸分子编码与第一链基本上互补的第二序列，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。双向启动子是能够在两个方向介导表达的启动子。

[第59段]在另一个实施方案中，所述载体含有两种启动子，一个介导与MTHFR样基因的一部分基本上相同的序列的转录，另一个启动子介导与第一链基本上互补的第二序列的转录，并且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。第二启动子可以是不同的启动子。

[第60段]不同启动子指就细胞或组织特异性来说具有不同活性，或对诸如病原体、非生物胁迫或化学品等不同的诱导物呈现表达的启动子。例如，一个启动子可以是组成型的或组织特异性的，而另一个则可能是组织特异性或可被病原体诱导的。在一个实施方案中，一个启动子介导与过表达MTHFR样基因相适应的核酸分子的转录，而另一个启动子介导互补核酸的组织或细胞特异性转录或病原体诱导的表达。

[第61段]本发明还涉及能表达本发明的双链RNA、进而抑制例如根部、采食部位、合胞体和/或巨大细胞中的MTHFR样基因的转基因植物。所述植物或转基因植物可以是诸如但不限于树、切花(cut flowers)、观赏植物、蔬菜或农作物植物的任何植物。上述植物可来自选自由苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、黑小麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属、百脉根属(Lotus)、苜蓿属、驴食草属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属、萱草属(Heterocallis)、水仙属(Nemesis)、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛莨属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、喇叭舌属(Salpiglossis)、蓝英花属(Browaalia)、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)组成的组中的属。所述植物可以来自选自下列属的属：拟南芥属、苜蓿属、番茄属、芸苔属、香瓜属、茄属、核桃属、棉属、苹果属、葡萄属、金鱼草属、Brachipodium、杨属、草莓属、拟南芥属、云杉属、辣椒属、藜属、菊属、牵牛属、松属、豌豆属、稻属、玉蜀黍属、小麦属、黑小麦属、黑麦属、黑麦草属、大麦属、大豆属、黄杉属、伽蓝菜属、甜菜属、向日葵属、烟草属、南瓜属、蔷薇属、草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴食草属、车轴草属、胡卢巴属、豇豆属、橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、萝卜属、白芥属、颠茄属、曼陀罗属、天仙子属、烟草属、碧冬茄属、毛地黄属、Majorana、菊苣属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、水仙属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、喇叭舌属、蓝英花属、菜豆属、燕麦属和葱属组成的组中的属。在一个实施方案中，所述植物是单子叶植物或双子叶植物。

[第62段]在另一个实施方案中，所述植物是农作物植物。农作物植物是用于农业的所有植物。根据一个实施方案，所述植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)植物，优选是禾本科植物。因此，在又一个实施方案中，所述植物是禾本科玉蜀黍属、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、穇属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodium)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属植物。当植物是玉蜀黍属时，优选物种是玉米(Zeamays)。当该植物是小麦属时，优选物种是普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticum speltae)或圆柱小麦(Triticum durum)。当所述植物是稻属时，优选物种是稻(O.sativa)。当所述植物是大麦属植物时，优选物种是大麦(Hordeum vulgare)。当所述植物是黑麦属植物时，优选物种是黑麦(Secale cereale)。当所述植物是燕麦属植物时，优选物种是燕麦(Avenasativa)。当所述植物是甘蔗属植物时，优选物种是甘蔗(Saccharumofficinarum)。当所述植物是高粱属植物时，优选物种是高粱(Sorghumvulgare)、高粱(Sorghum bicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。当所述植物是狼尾草属植物时，优选物种是御谷(Pennisetum glaucum)。当所述植物是狗尾草属植物时，优选物种是粱(Setaria italiea)。当所述植物是黍属植物时，优选物种是野生稷(Panieum miliaceum)或柳枝稷(Panieumvirgatum)。当所述植物是穇属(Eleusine)植物时，优选物种是穇子(Eleusinecoracana)。当所述植物是芒属植物时，优选物种是芒(Miscanthus sinensis)。当所述植物是羊茅属(Festuca)植物时，优选物种是Festuca arundinaria、紫羊茅(Festuca rubra)或草甸草(Festuca pratensis)。当所述植物是黑麦草属植物时，优选物种是黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Loliummultiflorum)。或者，所述植物是黑小麦(Triticosecale)。

[第63段]作为备选方案，在一个实施方案中，植物为双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑桔科(Citrus)植物。在一个实施方案中，所述植物是豆科、茄科或十字花科植物。所以，在一个实施方案中，所述植物是豆科植物，优选的属是大豆属、豌豆属、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、蚕豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Lens)。豆科的优选物种是蒺藜苜蓿(M.truncatula)、紫花苜蓿(M.sativa)、大豆、豌豆、落花生(A.hypogaea)、鹰嘴豆(C.arietinum)、蚕豆(V.faba)、菜豆(P.vulgaris)、白羽扇豆(Lupinusalbus)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、苜蓿(M.sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是大豆、落花生和紫花苜蓿。最优选的物种是大豆。当所述植物是茄科时，优选的属是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(S.tuberosum)、番茄(L.esculentum)、烟草(N.tabaccum)或黄灯笼辣椒(C.chinense)。更优选的是马铃薯。因此，在一个实施方案中，所述植物是十字花科，优选属是芸苔属或萝卜属。十字花科的优选物种是欧洲油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleracea)、芥(B.juncea)或芜青(B.rapa)。更优选的物种是欧洲油菜。当所述植物是藜科植物时，优选属是甜菜属植物。且优选物种是甜菜(B.vulgaris)。当所述植物是菊科植物时，优选属是向日葵属，优选物种是向日葵(H.annuus)。当所述植物是锦葵科植物时，优选属是棉属或秋葵属。当所述属是棉属时，优选物种是陆地棉(G.hirsutum)或海岛棉(G.barbadense)。最优选的是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(A.esculentus)。当所述植物是亚麻科时，优选属是亚麻属，优选物种是亚麻(L.usitatissimum)。当所述植物是大戟科植物时，优选的属木薯属、麻风树属(Jatropa)、或蓖麻属(Rhizinus)植物。优选物种是木薯(M.esculenta)、麻风树(J.curcas)或蓖麻(R.communis)。当所述植物是旋花科植物时，优选属是番薯属，优选物种是甘薯(L.batatas)。当所述植物是蔷薇科时，优选属是蔷薇属、苹果属、梨属、李属、悬钩子属(Rubus)、茶蔗子属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属植物。优选物种是杂交草莓(Fragaria×ananassa)。当所述植物是葫芦科植物时，优选是香瓜属、西瓜属(Citrullus)或南瓜属(Cucurbita)植物。优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)、西瓜(Citrullus lanatus)或西葫芦(Cucurbitapepo)。当所述植物是山茶科时，优选属是山茶属，优选物种是山茶(C.sinensis)。当所述植物是茜草科植物时，优选属是咖啡属，优选物种是小果咖啡(C.arabica)或中果咖啡(C.canephora)。当所述植物是梧桐科时，优选属是可可属(Theobroma)，优选物种是可可树(T.cacao)。当所述植物是柑桔属时，优选物种是甜橙(C.sinensis)、柠檬(C.limon)、桔(C.reticulata)、柚(C.maxima)，和柑桔属物种的杂交品种，等等。在本发明的优选实施方案中，所述植物是大豆、马铃薯或谷物植物。在一个实施方案中所述植物是豆科植物，靶基因是与SEQ ID NO：1、3、6或9基本上相似。在进一步的实施方案中，所述植物是十字花科植物，靶基因与SEQ IDNO：4或11基本上相同。在一个备选的实施方案中，所述植物是茄科植物，靶基因与SEQ ID NO：15基本上相同。在一个进一步的实施方案中，所述植物是禾本科植物，靶基因与SEQ ID NO：13基本上相同。

[第64段]转化或转染包括植物细胞的宿主细胞的适当方法在植物生物生物技术领域内已知。任何方法都可以用于将重组表达载体转化入植物细胞中以获得本发明的转基因植物。转化双子叶植物的一般方法公开于：例如美国专利号4,940,838和5,464,763等中。转化具体双子叶植物(例如棉花)的方法在美国专利号5,004,863、5,159,135和5,846,797中列出。大豆转化方法于美国专利号4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877和6,384,301中列出，也可以使用EP 0301749B1中的方法。

[第65段]转化方法可包括直接或间接转化法。适当的直接法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4,536,475)、用基因枪的生物发射技术(Fromm ME等人，Bio/Technology.8(9)：833-9，1990；Gordon-Kamm等人Plant Cell 2：603，1990)、电穿孔、在含DNA的溶液中孵育干胚的方法和微注入法。在直接转化法的情况下，所用质粒不需要满足任何特殊要求。可以使用简单的质粒，例如pUC系列的质粒、pBR322、M13mp系列和pACYC184等等。如果要从转化的细胞再生完整的植物，优选在质粒中有一个附加的选择性标记基因。直接转化技术对双子叶和单子叶植物都同等适用。

[第66段]还可以通过利用农杆菌(例如EP 0 116 718)的细菌感染、利用病毒载体(EP 0 067 553、US 4,407,956、WO 95/34668、WO 93/03161)的病毒感染来进行转化或借助花粉转化(EP 0 270 356；WO 85/01856；US4,684,611)。农杆菌类转化技术(尤其是对于双子叶植物)为本领域公知的技术。农杆菌菌株(例如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包括质粒(Ti或Ri质粒)和用农杆菌感染之后转移入植物的T-DNA元件。该T-DNA(转移DNA)被整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可定位在Ri-或Ti-质粒上，或者分开包括在所谓的双元载体中。农杆菌介导的转化方法记载于例如Horsch RB等人(1985)Science 225：1229中。农杆菌介导的转化最适用于双子叶植物，也已经适用于单子叶植物。用农杆菌的转化记载于下列文献中，例如：White FF，Vectors for Gene Transfer in HigherPlants，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页、Jenes B等人Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineeringand Utilization，S.D.Kung和R.Wu编著，Academic Press，1993，第128-143页和Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42：205-225中。

[第67段]转化可能会导致瞬时或稳定的转化和表达。虽然本发明的核苷酸序列可以插入到属于这些广泛类别的任何植物和植物细胞中，但是它特别适用于农作物植物细胞。

[第68段]多种组织适用于作为农杆菌介导的转换过程的起始材料(外植体)，这些组织包括但不限于愈伤组织(US 5,591,616；EP-A1 604662)、不成熟胚(EP-A1 672 752)、花粉(US 54,929,300)、苗端(US 5,164,310)或适用于植物转化(US 5,994,624)。实际上此处所描述的方法和材料可以与所有本领域已知的农杆菌介导的转化方法结合使用。

[第69段]利用植物育种中的已知方法，本发明的转基因植物可以与相似的转基因植物杂交，或与缺少本发明核酸的转基因植物杂交，或与非转基因植物杂交，来产生种子。此外，本发明的转基因植物可包括、和/或与另一种含有一种或多种核酸的转基因植物杂交，从而在该植物和/或其后代中形成转基因的“垛叠”。然后种植种子来得到杂交的能育的含有本发明核酸的转基因植物。该杂交能育的转基因植物可以具有特定的通过母本或通过父本遗传的表达盒。第二代植物可以是近交植物。杂交的能育转基因植物可以是杂交种。本发明还包括任何这些杂交能育转基因植物的种子。本发明种子可从能育转基因植物收获，并用于生长包括含有所述DNA构建体的杂交植物系的本发明转化植物的后代。

[第70段]“基因垛叠”也可以用植物转化通过将两个或多个基因转移入细胞核中来实现。在转化过程中多个基因可以引入细胞核中，无论是依次引入还是一次引入。利用针对多个连锁的部分目的序列的单次转基因，可以通过基因沉默机制特别是RNAi下调植物中或目的病原体物种中的多个基因。在单独启动子控制下的垛叠的多个基因也可以过表达，来得到所需的单个或多个表型。含有既包括过表达基因又包括沉默靶基因的基因垛叠的构建体也可以引入植物中，获得单个或多个农艺学重要表型。在某些实施方案中，本发明的核酸序列可以与任何目的多核苷酸序列的组合垛叠，以形成所需的表型。这些组合可以产生具有多种性状组合的植物，这些性状包括但不限于，疾病抗性、除草剂耐受、产量升高、耐冷和抗旱。这些垛叠组合可以通过包括但不限于常规方法或遗传转化方法杂交育种植物的任何方法形成。如果通过遗传转化法垛叠所述性状，目的多核苷酸可以以任何顺序依次组合或同时组合。例如，如果要引入两个基因，这两个序列可以包含在分别的转化盒中，或在同一个转化盒中。这些序列的表达可以被同一个启动子或不同启动子驱动。

[第71段]根据本实施方案，本发明的转基因植物用包括如下步骤的方法生产：提供MTHFR样基因；制备具有与选择的MTHFR样基因的一部分基本上相同的第一区和与第一区互补的第二区的表达盒；将该表达盒转化入植物中；选择表达本发明双链RNA构建体的经转化植物的子代。

[第72段]对线虫感染的增加的抗性是希望能够遗传至广泛的植物中的一般性状。本发明可用于减少任何植物寄生线虫造成的农作物破坏。优选所述寄生线虫属于诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫科。诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫发现于长针线虫科(Longidoridae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、根结线虫科(Meloidogynidae)、短体线虫科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)中。优选地，发现于异皮线虫科或根结线虫科中。

[第73段]所以，本发明所针对的寄生线虫属于选自下列组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属(Cactodera)、长形胞囊线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)。在优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组的一个或多个属：Naccobus、棘皮线虫属、长形胞囊线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属。在更加优选的实施方案中，寄生线虫属于选自下组中的一个或多个属：球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属。在进一步更优选的实施方案中，寄生线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属中的一个或两个属。在另一个实施方案中，寄生线虫属于根结线虫属。

[第74段]当寄生线虫属于球胞囊线虫属时，其物种优选选自蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(Globodera virginiae)。在另一个优选的实施方案中，寄生的球胞囊线虫属线虫包括物种马铃薯白线虫、烟草球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个。当所述寄生线虫属于胞囊线虫属时，所述物种优选选自由燕麦胞囊线虫(H.avenae)、胡萝卜胞囊线虫(H.carotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(H.ciceri)、十字花科胞囊线虫(H.cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(H.delvii)、褐藻胞囊线虫(H.elachista)、菲氏胞囊线虫(H.filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(H.gambiensis)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、豌豆胞囊线虫(H.goettingiana)、荞麦胞囊线虫(H.graduni)、啤酒花胞囊(H.humuli)、大麦胞囊线虫(H.hordecalis)、麦类胞囊线虫(H.latipons)、燕麦胞囊线虫(H.major)、苜蓿胞囊线虫(H.medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(H.pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(H.rosii)、甘蔗胞囊线虫(H.sacchari)、甜菜胞囊线虫(H.schachtii)、蜀黍胞囊线虫(H.sorghi)、三叶草胞囊线虫(H.trifolii)、荨麻胞囊线虫(H.urticae)、木豆胞囊线虫(H.vigni)和玉米胞囊线虫(H.zeae)组成的组中。在另一个实施方案中，寄生胞囊线虫属线虫包括物种大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫(H.cajani)、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个。在更优选的实施方案中，寄生线虫包括大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫的至少一个物种。在最优选的实施方案中，所述寄生线虫是大豆胞囊线虫。

[第75段]当所述寄生线虫是根结线虫属线虫时，所述寄生线虫可选自由高粱根结线虫(M.acronea)、小果咖啡线虫(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(M.indica)、海滨根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、林氏根结线虫(M.lini)、苹果根结线虫(M.mali)、小头根结线虫(M.microcephala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)组成的组中。在优选的实施方案中，所述寄生线虫包括以下物种至少之一：爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫。

[第76段]下列实施例并不意味着限制本发明要求保护的范围，而意在作为某些实施方案的示例性描述。本领域技术人员所想到的对这些示例性方法的任何改变都应落入本发明的范围内。

实施例

实施例1：从大豆中克隆MTHFR样基因

[第77段]大豆栽培种威廉姆斯82(Glycine max cv.Williams 82)萌发后一天，将每个幼苗与大豆胞囊线虫第3小种第二阶段幼体(J2)一起孵育。孵育后6天，将新生的根组织切成1cm长的段，固定，在cryomold中包埋，并用已知的方法切片。在PALM显微镜(P.A.L.M.MicrolaserTechnologies GmbH，Bernried，德国)下通过其特有形态鉴定合胞体细胞：增大的细胞大小、增厚的细胞壁和稠密的细胞质，并将其分离出来放入RNA抽提缓冲液中。用已知方法抽提总细胞RNA、扩增并荧光标记。从“非合胞体”和未处理的对照根分离总RNA作为对照，进行同样的RNA扩增过程。扩增后的RNA与专利大豆cDNA阵列杂交。

[第78段]如表1所示，在SCN感染的大豆根部合胞体中，大豆cDNA克隆52226546被鉴定为上调。在微阵列数据中其表达模式表明了在线虫诱导的采食部位例如合胞体或巨大细胞的发育和/或维持中的功能，和/或在线虫易感性中的功能。测得52226546cDNA序列(SEQ ID NO：1)含全长编码序列。用EMBOSS-4.0.0的GETORF算法预测对应编码区碱基的核苷酸68～1093。预测的终止密码子位于核苷酸1094～1096处。

表1

基因名	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根
					52226546§	240±42	489±67	未检测	62±53

实施例2.使用大豆植物检测系统检测对SCN感染的抗性

[第79段]此示例性方法使用了含有大豆52226546靶基因的双元载体。该载体由52226546靶基因的反义片段(SEQ ID NO：3)、间隔区、该靶基因的正义片段和载体骨架组成。对应于SEQ ID NO：1的核苷酸371～570的靶基因片段(SEQ ID NO：3)用来构建双元载体RCB567、RCB576和RCB585。在这些载体中，针对52226546靶基因的双链RNA在合胞体或根优选启动子控制下表达：RCB567中的TPP启动子(SEQ ID NO：4)、RCB576中的At5g12170样启动子(SEQ ID NO：5)或RCB585中的MTN3启动子(SEQ ID NO：6)。这些转化的选择性标记是来自拟南芥的突变AHAS基因(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)，赋予了对除草剂ARSENAL的抗性(咪唑烟酸，BASF Corporation，Mou nt Olive，NJ)。突变的AHAS的表达由荷兰芹的泛素启动子驱动(WO 03/102198)。

[第80段]用生根外植体检测来说明双链RNA表达和得到的线虫抗性。该检测方法可见共同未决的申请USSN 12/001,234，其内容合并于此作为参考。

[第81段]将来自大豆栽培种的干净大豆种子表面灭菌并使其萌发。接种前三天，开始卸甲的(disarmed)农杆菌培养物的过夜液体培养，例如，含有双元载体RCB567、RCB576或RCB585的卸甲的发根农杆菌株K599。第二天，将培养物涂敷到含有卡那霉素作为选择剂的LB琼脂板上。将这些琼脂板在28℃培养两天。每50个要接种的外植体一个板。含有与苗连接的近端的子叶用作转化的外植体。去除子叶之后，用解剖刀围绕切除部位刮擦表面。切下并刮过的子夜是农杆菌接种的目标物。将制得的外植体浸入如上制备的卸甲的浓发根农杆菌菌落中，以使该菌落能在该切过并刮过的表面上可见。然后将外植体放到培养皿的1％琼脂上，光下共培养6-8天。

[第82段]在转化和共培养后，将大豆外植体转入含有选择剂的生根诱导培养基中，例如用于突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因的S-B5-708(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)。在与共培养步骤中同样的条件下保持培养物。S-B5-708培养基包含：0.5×B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1×维生素B5、400μg/ml特美汀、0.8％诺布尔琼脂和1μM咪唑烟酸(用于AHAS基因的选择剂)(BASF Corporation，Florham Park，NJ)，pH为5.8。

[第83段]选择和根诱导后2到3周，在外植体的切开末端上形成转化的根。将外植体转移至相同的选择培养基(S-B5-708培养基)中进一步选择。在该培养基中，一周内转基因根良好增殖并适合进行继代培养。

[第84段]将强壮的白色大豆根从生根的外植体切离，并培养于六孔板中的补充有200mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)中。暗处室温保持培养物。S-MS-606培养基包括：0.2×MS盐和维生素B5，2％的蔗糖和200mg/l特美汀，pH为5.8。

[第85段]继代培养一至五天后，在多孔板中用表面消毒的线虫幼体接种上述根，用于目的基因构建体的检测。使用大豆栽培种威廉姆斯82对照载体和Jack对照载体根作为对照。占据至少半个孔的每株根培养物用表面净化的大豆胞囊线虫(SCN)第三小种的第二阶段幼体(J2)以500J2/孔的水平接种。然后密封这些板，并放回到25℃下黑暗中的培养箱中。从每个双元载体转化产生几个独立的根株，这些根株用来进行生物检定。接种线虫后四周，计数每个孔中的胞囊。对构建体RCB567、RCB576和RCB585的生物检定数据说明多个株中胞囊数量都降低，表明在许多测试株中呈现出降低胞囊数量的普遍趋势。

[第86段]本领域技术人员会知晓，或仅仅通过常规的实验就能够确定此处描述的本发明具体实施方案的许多等同物。所附权利要求书意在涵盖这些等同物。

序列表

<110>巴斯福植物科学有限公司

     A·威格

<120>用靶向MTHFR样基因的RNA干扰控制线虫的组合物和方法

<130>PF 58863

<160>20

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1283

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(67)

<220>

<221>CDS

<222>(68)..(1096)

<220>

<221>3’UTR

<222>(1097)..(1268)

<400>1

aagagaacaa caacaaagca caacgtatag cttgctgaat cgttgtttga ggaaccaccg    60

aatctca atg gct tct tcg gtg ttc ttc act cac tcc cat tgc tac tct      109

        Met Ala Ser Ser Val Phe Phe Thr His Ser His Cys Tyr Ser

        1               5                   10

tca aag ccc tct tct ctt gtt ttc cgc caa gtt ggt gtg ggt ccc acc      157

Ser Lys Pro Ser Ser Leu Val Phe Arg Gln Val Gly Val Gly Pro Thr

15                  20                  25                  30

tct ctc cga ttc tct tct tct cat gtt gcc tcc gtt gct gct atg gct      205

Ser Leu Arg Phe Ser Ser Ser His Val Ala Ser Val Ala Ala Met Ala

                35                  40                  45

atg gat tct tct gct aag gtg att gat gga aaa tcc gtt gcc aag caa    253

Met Asp Ser Ser Ala Lys Val Ile Asp Gly Lys Ser Val Ala Lys Gln

            50                  55                  60

atc aga gat gag ata acg gct gag gtt tcc agg atg aga gaa tcc att    301

Ile Arg Asp Glu Ile Thr Ala Glu Val Ser Arg Met Arg Glu Ser Ile

        65                  70                  75

ggt gtg att cct ggg ttg gct gta att ctt gtt ggg gat agg aaa gac    349

Gly Val Ile Pro Gly Leu Ala Val Ile Leu Val Gly Asp Arg Lys Asp

    80                  85                  90

tca gca act tat gtg cgt aac aag aag aag gct tgt gaa tct gtt gga    397

Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys Lys Ala Cys Glu Ser Val Gly

95                  100                 105                 110

atc aat tct ttg gaa gca aat ctg cca gag gat tcc aca gaa gaa gaa    445

Ile Asn Ser Leu Glu Ala Asn Leu Pro Glu Asp Ser Thr Glu Glu Glu

                115                 120                 125

gtt ttg aac tat att gca ggc tac aat gat gat cct tca gtt cat ggc    493

Val Leu Asn Tyr Ile Ala Gly Tyr Asn Asp Asp Pro Ser Val His Gly

            130                 135                 140

atc ctt gtt cag tta ccc tta cct tcg cat atg aat gag caa aac atc    541

Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser His Met Asn Glu Gln Asn Ile

        145                 150                 155

ttg aac gct gtt aga att gag aag gat gta gat ggt ttt cat ccg tta    589

Leu Asn Ala Val Arg Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu

    160                 165                 170

aat att ggt cgt ctt gct atg cgt gga aga gaa cca ctg ttt gtt cct    637

Asn Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Gly Arg Glu Pro Leu Phe Val Pro

175                 180                 185                 190

tgt aca cca aag gga tgc ata gag cta ctg cac aga tac aat gtt tct    685

Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu His Arg Tyr Asn Val Ser

                195                 200                 205

atc aaa gga aag agg gct gtt gtg att ggt cgg agc aat att gtt gga    733

Ile Lys Gly Lys Arg Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly

            210                 215                 220

atg cca gct gct ctc ttg ctg caa agg gaa gat gct act gtc agt att    781

Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg Glu Asp Ala Thr Val Ser Ile

        225                 230                 235

gtc cat tct aga acc agt aac ccc gaa gag atc ata aga cag gca gat    829

Val His Ser Arg Thr Ser Asn Pro Glu Glu Ile Ile Arg Gln Ala Asp

    240                 245                 250

att atc att gct gcc gtt ggg caa gca aac atg gtg agg gga agc tgg    877

Ile Ile Ile Ala Ala Val Gly Gln Ala Asn Met Val Arg Gly Ser Trp

255                 260                 265                 270

ata aag cct ggt gca gtc att att gac gtc gga atc aac cca gta gag    925

Ile Lys Pro Gly Ala Val Ile Ile Asp Val Gly Ile Asn Pro Val Glu

                275                 280                 285

gat cca aat agt ccc cga ggt tac aaa ctg gtg gga gat gtt tgt tat    973

Asp Pro Asn Ser Pro Arg Gly Tyr Lys Leu Val Gly Asp Val Cys Tyr

            290                 295                 300

gaa gaa gcc ata aga att gcc tct gct gtt aca cca gtt cct gga gga    1021

Glu Glu Ala Ile Arg Ile Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Pro Gly Gly

        305                 310                 315

gtt ggt cca atg acc ata gca atg ctt ctc caa aat aca ctc att tct    1069

Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met Leu Leu Gln Asn Thr Leu Ile Ser

    320                 325                 330

gca aag agg gtg cac cat ttt gaa taa cactgtgaaa ggatgtatac          1116

Ala Lys Arg Val His His Phe Glu

335                 340

tattatgagc catcaatttt tgttttgggg agtcttggat tttaaggtag cattttttca  1176

acattcgggg gagggggtgt ttgagtttct tcctcaagcc aaaataagaa gagaaaatgt  1236

tcctttggat gataatataa aacatcttcc acaaaaaaaa aaaaaaa                1283

<210>2

<211>342

<212>PRT

<213>大豆

<400>2

Met Ala Ser Ser Val Phe Phe Thr His Ser His Cys Tyr Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Pro Ser Ser Leu Val Phe Arg Gln Val Gly Val Gly Pro Thr Ser Leu

            20                  25                  30

Arg Phe Ser Ser Ser His Val Ala Ser Val Ala Ala Met Ala Met Asp

        35                  40                  45

Ser Ser Ala Lys Val Ile Asp Gly Lys Ser Val Ala Lys Gln Ile Arg

    50                  55                  60

Asp Glu Ile Thr Ala Glu Val Ser Arg Met Arg Glu Ser Ile Gly Val

65                  70                  75                  80

Ile Pro Gly Leu Ala Val Ile Leu Val Gly Asp Arg Lys Asp Ser Ala

                85                  90                  95

Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys Lys Ala Cys Glu Ser Val Gly Ile Asn

            100                 105                 110

Ser Leu Glu Ala Asn Leu Pro Glu Asp Ser Thr Glu Glu Glu Val Leu

        115                 120                 125

Asn Tyr Ile Ala Gly Tyr Asn Asp Asp Pro Ser Val His Gly Ile Leu

    130                 135                 140

Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser His Met Asn Glu Gln Asn Ile Leu Asn

145                 150                 155                 160

Ala Val Arg Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile

                165                 170                 175

Gly Arg Leu Ala Met Arg Gly Arg Glu Pro Leu Phe Val Pro Cys Thr

            180                 185                 190

Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ile Lys

        195                 200                 205

Gly Lys Arg Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly Met Pro

    210                 215                 220

Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg Glu Asp Ala Thr Val Ser Ile Val His

225                 230                 235                 240

Ser Arg Thr Ser Asn Pro Glu Glu Ile Ile Arg Gln Ala Asp Ile Ile

                245                 250                 255

Ile Ala Ala Val Gly Gln Ala Asn Met Val Arg Gly Ser Trp Ile Lys

            260                 265                 270

Pro Gly Ala Val Ile Ile Asp Val Gly Ile Asn Pro Val Glu Asp Pro

        275                 280                 285

Asn Ser Pro Arg Gly Tyr Lys Leu Val Gly Asp Val Cys Tyr Glu Glu

    290                 295                 300

Ala Ile Arg Ile Ala Ser Ala Val Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly

305                 310                 315                 320

Pro Met Thr Ile Ala Met Leu Leu Gln Asn Thr Leu Ile Ser Ala Lys

                325                 330                 335

Arg Val His His Phe Glu

            340

<210>3

<211>199

<212>DNA

<213>大豆

<400>3

aagaagaagg cttgtgaatc tgttggaatc aattctttgg aagcaaatct ccagaggatt    60

ccacagaaga agaagttttg aactatattg caggctacaa tgatgatcct tcagttcatg    120

gcatccttgt tcagttaccc ttaccttcgc atatgaatga gcaaaacatc ttgaacgctg    180

ttagaattga gaaggatgt                                                 199

<210>4

<211>1999

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>4

gtagtgccct tcatggatac caaaagagaa aatttgattt agtgcataca tataacaata    60

taacgccgca taataatact gtataaaaca gtcatgtaac gatatgacag cagtaataca    120

gttccaagag acgttataat cgtatgcaat catatgcttg cgtagatttt ccaacagttt    180

tgtttcgttg ataggaggaa ctcaacactc tagggtagtg attggtagac actattagca    240

caaaaaatat taattttact ctgatgttta ccaaaaaagt taccaatcaa atatttaaga    300

gatcgtactc ttccacggcg actctaaaaa ccaaagatat aggttagact cataactact    360

ttataaagaa aatgtttaac gataactacc gagatctaat aaataaacct tcattttcaa    420

gtatattata tttgcttctt ttgtttatat atcaaaccaa gttctggttt ataaaaatat    480

tagataaaac tcgtctaaat aggtaggtgt aaaataaaat tttaaatttt tatcgataat    540

atttaaaatt tgaaaagtta ataatgatcc acacattttt tctaatattt aatttagtaa    600

tttttgtatt aaataaaatt tcaatcatat acattcgatt tttctataca ttttaactat    660

ctatttctgc ataataaact gtattttcat tttatacgct tcatcttatg gatgatattt    720

aaattttaaa tagtaattca tacacttttt aatatttaat ttagtatttt cttaaatcca    780

aattttaatc ttacaattta aatatctact ttaacataat acaaatacaa tttaatttca    840

ttgtattaaa ttcaaatata atttgattat aataaaatac aatttaattc taaaaagtcc    900

atcttagatt ttaattttcc tttttagttt tgaaaattaa aaatttaaat ttattagata    960

tatatgttac tttttcagtt ttcctattta tttaagaaaa aaatattttt taacacatgt    1020

caacttgtaa acaatagact gaacacgtca ttttatatta tgtttagttt tgaaaattaa    1080

agttaattaa atatttatat ttcttttttt tagcttttct aattattttt aaaatagtaa    1140

atatttttaa tacaaatcaa tatctgaaca atagatttga tacataacat aatcctataa    1200

attattaact tggaaaacga tagtttatat aataaaatta ttttcttaag ttctctaacc    1260

ataacaatta aactatattt tagcgaagaa aagaagagaa taccgagaga acgcaacttg    1320

cactaaaagc taccactttg gcaaatcact catttatatt attatatact atcacctcaa    1380

ttcaatcgaa acctcaaaat aacactaata tatacacaaa gaaacaacag aataacaccg    1440

aagaatatag gtttaggaaa atccagaatt tgttgagact aaagagatca aattttcgat    1500

acaaggtttt gctcaatttg tattttcata ataaaattct ttatttcacc atagacttac    1560

atgattagtt tttcttttaa taaaaaaaaa cacgcgacat gaaaattata ttatctcagt    1620

gttgtcgaat ttgaatttga attttgagtt aaatactaca catttgttga caacttatta    1680

aactttacaa gtctgctaca aatattgtca aatatttact aattaatgga ccaaaatcct    1740

ctaacttgca aatttgtatc tacatcaact taaaaattag gaatatgcga cccaaaaaaa    1800

aaaaaactag gaataataat aaaaaaatgg aatgatgtgg aggaagctct ttactctttg    1860

agaggaagtt tataaattga ccacacattt agtctattat catcacatgt attaagactt    1920

gacaacttgt ctttctcaca ccaaacccct ctcctctgtt tcataacatc tgctctttct    1980

tttttttcct aagccccta                                                 1999

<210>5

<211>1476

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>5

gctcgcgtta gttccactca aggagtatcc tttcttcctt gcgcaactct ccaccttcgg    60

gtaaagtacc atctctagca tcttgagtct tgatcaactt ctgttttgct tactctcaaa    120

atgcattaat ttttttttat actagatcat agtattatat ctcttaatct acctattgaa    180

atctacttaa tgtttttact aaaacctacg tgtttctctt tagagaattt tgtgctatgc    240

atgaattaga ggttagtaat gtgtaatact tcataagtct agatttattt gttggttaac    300

acgtttagta attcacacac acacaccacc ttagatattt tactgtgaat tagaaaaaga    360

tacatagtta ggagtgtttt tttaaaaaaa ttcaatcatg agaaaattag aggtgtgatg    420

ttatacatta tgaaaatgca aagggcagat acgaataaat tagaaacttg tttaacgggt    480

cagagttggc ttctagtctc tttcgacttg gatacttctt cttctacaat tgggacatta    540

ttgtaggcgc attatatcat ttctctacat gcaatgaatg tacatacatt aattcacatt    600

tatttttgga ataatcatat gagtgatcga agtttgtatt tatatattca atcttcacaa    660

actactttta tttaaaaatc atttgcaaaa tgctatttta ttgacaaaaa gatatatgct    720

ataaaataaa ataaaattca caaactatag tcattaatac aaaaagaaat cattgaatat    780

ggtagagggg aaacaaaaaa aaaacacgac gatgtaagtt ggtggaacca cattatcaaa    840

ataaaagaag gtggtggaac caaattgaat aaagtccgtc catatcatta tccgtccctt    900

aggagcctct aattagtaat attcttatgg gtccactgtg gcttagagga cttgattaaa    960

accattctta tttagtgcta actttgtgag ggttggaata acgaaccaag ctgattcaaa    1020

ccattccaaa acaaagttgt cacatatttc aaaaccaaag tttaccggac agagaaatat  1080

ggtgtgtttt tctcaaacca agctaaatgg aatccattgt aaaccaaaat gttcacacct  1140

acctattctt ttggagtccc ttttccatgt gtttgctgtc tgctagtcaa gtttcattag  1200

ctgattgcct tgcatcatat tcttggatca actttttttt tttttttttt tggggtaatt  1260

aacaaaatgc ttaaatttct caagactata ggatcacatt acctgtgtgc ttaacataac  1320

ttttagatag gctagagaat tgatctatta caagataatc aataatttac agaagaaaac  1380

attctttttt ttgttctatt tccttcatgt aggtatgtag ctgtatatta tactatcttg  1440

tattttcgat atcgtgctgg aactgtcaca gatgca                            1476

<210>6

<211>609

<212>DNA

<213>大豆

<400>6

gaagccacgt catgaagagt atatcatttc agtaatgttt tgagacgcct ctataatgct    60

ttaccaacaa aacaaaacaa aaaaaagaac atttgaaacc atttgtatta aaaaaaaaaa    120

ggtatattag gccataatat tataggtaac atgaaatatc aaatgacacg caagagtttt    180

gtcaaaaatg aaaccatcac acatcagaga ttatggcaaa taatgttttg tgtgtctctt    240

gcttcaccca taacataagc ctctataact ggagagaaga aaaaaaaaag tggaggggct    300

agggtgggaa tttggaagaa tacagttata ttgagcattg agcaagttga tagaaagctt    360

ctcaatttgt acaaaatttg catccacatg attattaaag acgtagacag cacttcttcc    420

ttcttttttt ctataagttt cttatatatt gttcttcatg ttttaatatt attactttat    480

gtacgcgtct aacagtagtc ctcccaaact gctataaata gagcctcttc aacgcacctc    540

ttggcagtac aaaaattatt catctcttct aagttctaat tttctaagca ttcagtaaaa    600

gaactaacc                                                            609

<210>7

<211>1056

<212>DNA

<213>蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)

<400>7

atggcttctt ctttgactca ttgctattct tctccttctt ccaccactac tctcctcctc    60

cgccgccgcc atcccatcaa tgtgggtccc acctctctcc gcttcttcac cattcactct    120

tctccctctt catcccgtgt tctctccatt gctgctagtg ctaccgaggc ttcttctgcc    180

aaggtgattg atggaaaaac ggtggcaaag caaatcagag atgagatagc agttgaagtc    240

tccaggatga gagaagccgc aggtgtgatt ccagggttag ctgttatcct tgtcggagat    300

agaaaggact ctgctactta tgtgcgtaac aagaagaagg cttgtgaaac tgttggaata    360

aattcgttgg aagtaaattt gcccgaggat tccacagaag aagaagtttt gaaccatatt    420

gcaggttata atgatgatcc ttcggttcat ggcattcttg ttcagctacc tttaccatct    480

catatgaatg aacaaaatgt gttgaatgct gttagaatcg agaaggatgt agatggtttt    540

catccattga atattggtcg gcttgctatg cgagggagag aacccctgtt tgttccctgt    600

acaccaaagg gatgcataga actactccac agatatggcg tttctatcaa aggaaagagg    660

gctgttgtga ttggccgtag taatattgtt ggaatgccag ctgctctctt gttgcaaagg    720

gaagatgcta ctgtcagtat tgttcattcc agaactacta accctgaaga gatcattaga    780

caagcagata tcatcatcgc tgctgttggc caaccaaaca tggttaaggg aagctggata    840

aaacccggtg cagtcattat tgatgtcgga atcaacccgg tagatgatcc aagtagttct    900

cgaggttata aattggttgg agatgtttgt tatgaagaag ccgtaaaagt tgcctctgct    960

attacacctg ttcctggagg tgttggtcca atgactattg caatgcttct acaaaatacg    1020

ctcatctctg caaagagaat ccatagtttt gaataa                              1056

<210>8

<211>351

<212>PRT

<213>蒺藜苜蓿

<400>8

Met Ala Ser Ser Leu Thr His Cys Tyr Ser Ser Pro Ser Ser Thr Thr

1               5                   10                  15

Thr Leu Leu Leu Arg Arg Arg His Pro Ile Asn Val Gly Pro Thr Ser

            20                  25                  30

Leu Arg Phe Phe Thr Ile His Ser Ser Pro Ser Ser Ser Arg Val Leu

        35                  40                  45

Ser Ile Ala Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ser Ser Ala Lys Val Ile Asp

    50                  55                  60

Gly Lys Thr Val Ala Lys Gln Ile Arg Asp Glu Ile Ala Val Glu Val

65                  70                  75                  80

Ser Arg Met Arg Glu Ala Ala Gly Val Ile Pro Gly Leu Ala Val Ile

                85                  90                  95

Leu Val Gly Asp Arg Lys Asp Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys

            100                 105                 110

Lys Ala Cys Glu Thr Val Gly Ile Asn Ser Leu Glu Val Asn Leu Pro

        115                 120                 125

Glu Asp Ser Thr Glu Glu Glu Val Leu Asn His Ile Ala Gly Tyr Asn

    130                 135                 140

Asp Asp Pro Ser Val His Gly Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser

145                 150                 155                 160

His Met Asn Glu Gln Asn Val Leu Asn Ala Val Arg Ile Glu Lys Asp

                165                 170                 175

Val Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Gly

            180                 185                 190

Arg Glu Pro Leu Phe Val Pro Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu

        195                 200                 205

Leu His Arg Tyr Gly Val Ser Ile Lys Gly Lys Arg Ala Val Val Ile

    210                 215                 220

Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg

225                 230                 235                 240

Glu Asp Ala Thr Val Ser Ile Val His Ser Arg Thr Thr Asn Pro Glu

                245                 250                 255

Glu Ile Ile Arg Gln Ala Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val Gly Gln Pro

            260                 265                 270

Asn Met Val Lys Gly Ser Trp Ile Lys Pro Gly Ala Val Ile Ile Asp

        275                 280                 285

Val Gly Ile Asn Pro Val Asp Asp Pro Ser Ser Ser Arg Gly Tyr Lys

    290                 295                 300

Leu Val Gly Asp Val Cys Tyr Glu Glu Ala Val Lys Val Ala Ser Ala

305                 310                 315                 320

Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met Leu

                325                 330                 335

Leu Gln Asn Thr Leu Ile Ser Ala Lys Arg Ile His Ser Phe Glu

            340                 345                 350

<210>9

<211>1053

<212>DNA

<213>红车轴草(Trifolium pratense)

<400>9

atggcttctt cttctatttt caatcctcct tcttccacca ctgctctcct cctccgccgc    60

actcgccacc caatccatgt aggtcccacc tctctccgat tcttgaccag tcagtccgct    120

cctccttcat cccatcttgt ctccttcgct gctagtgcta ctgaggcttc tgtggctaag    180

gtgattgatg gaaaactagt ggcaaaacaa atcagagatg agatcgcagc tgaagtctct    240

aggatgaaag aagctgtagg tgtcattcca gggttagctg ttatacttgt tggagataga    300

aaagactctg caacttatgt gcgtaacaag aagaaggctt gtgaatccgt tggaatcaat    360

tctttggaag taaatttgcc tgcagatacc actgaagaac aagttttgaa ttatatttca    420

ggctacaatg atgatccttc tgttcatggc attcttgttc agctaccttt accgtcccat    480

atgaacgaac aaaatgtgtt gaatgctgtt agaattgaga aggatgtaga tggttttcat    540

ccattgaata ttggtcgact tgccatgcga ggaagagaac ctctgtttgt tccttgtaca    600

cccaagggat gcattgaact actccacaga tatggcattt ctatcaaagg aaagagggct    660

gttgtgattg gtcggagtaa tatcgtcgga atgccagctg ctctcctgct gcaaagggaa    720

gatgctactg tcagtgttgt ccattccagg actagtaacc ctgaagagat cacaagacag    780

gcagatatca tcatcgctgc tgttggacaa ccaaacatgg ttaggggaag ctggataaaa    840

cctgatgcag tcattatcga tgttggaatc aacccagtag atgatccaag tagctcccga    900

ggttataaat tggttggaga tgtttgttat gaagaagcca taaaagttgc ctctgctatt    960

acacctgttc ctggaggagt tggtccaatg accattgcaa tgcttctgca aaatacactc    1020

acttccgcaa agagaattaa cagttttcag tag                                 1053

<210>10

<211>350

<212>PRT

<213>红车轴草

<400>10

Met Ala Ser Ser Ser Ile Phe Asn Pro Pro Ser Ser Thr Thr Ala Leu

1               5                   10                  15

Leu Leu Arg Arg Thr Arg His Pro Ile His Val Gly Pro Thr Ser Leu

            20                  25                  30

Arg Phe Leu Thr Ser Gln Ser Ala Pro Pro Ser Ser His Leu Val Ser

        35                  40                  45

Phe Ala Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ser Val Ala Lys Val Ile Asp Gly

    50                  55                  60

Lys Leu Val Ala Lys Gln Ile Arg Asp Glu Ile Ala Ala Glu Val Ser

65                  70                  75                  80

Arg Met Lys Glu Ala Val Gly Val Ile Pro Gly Leu Ala Val Ile Leu

                85                  90                  95

Val Gly Asp Arg Lys Asp Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys Lys

            100                 105                 110

Ala Cys Glu Ser Val Gly Ile Asn Ser Leu Glu Val Asn Leu Pro Ala

        115                 120                 125

Asp Thr Thr Glu Glu Gln Val Leu Asn Tyr Ile Ser Gly Tyr Asn Asp

    130                 135                 140

Asp Pro Ser Val His Gly Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser His

145                 150                 155                 160

Met Asn Glu Gln Asn Val Leu Asn Ala Val Arg Ile Glu Lys Asp Val

                165                 170                 175

Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Gly Arg

            180                 185                 190

Glu Pro Leu Phe Val Pro Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu

        195                 200                 205

His Arg Tyr Gly Ile Ser Ile Lys Gly Lys Arg Ala Val Val Ile Gly

    210                 215                 220

Arg Ser Asn Ile Val Gly Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg Glu

225                 230                 235                 240

Asp Ala Thr Val Ser Val Val His Ser Arg Thr Ser Asn Pro Glu Glu

                245                 250                 255

Ile Thr Arg Gln Ala Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val Gly Gln Pro Asn

            260                 265                 270

Met Val Arg Gly Ser Trp Ile Lys Pro Asp Ala Val Ile Ile Asp Val

        275                 280                 285

Gly Ile Asn Pro Val Asp Asp Pro Ser Ser Ser Arg Gly Tyr Lys Leu

    290                 295                 300

Val Gly Asp Val Cys Tyr Glu Glu Ala Ile Lys Val Ala Ser Ala Ile

305                 310                 315                 320

Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met Leu Leu

                325                 330                 335

Gln Asn Thr Leu Thr Ser Ala Lys Arg Ile Asn Ser Phe Gln

            340                 345                 350

<210>11

<211>1083

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>11

atggcgtcga tgatgtttac cgattgctcc tccaccacga cgtcgcgtct catccatttg    60

aaccgaagca gcggtacttt cctcctccgt caatgcgtcg gccaactccg tttacagacc    120

actgcttctg gccgtggctg ctgcattcgc tcctcttctt ctcccatttc ttccatttcc    180

gctgatacaa aatcagaggg tggcgcaatt gtaatagatg gaaaggctgt ggcaaaaaag    240

attagagatg aaatcacaat tgaagtttca agaatgaagg aatcaattgg tgtgattcct    300

ggtttagcag taatccttgt tggtgacaga aaagattctg caacttatgt gaggaacaag    360

aagaaagctt gtgactccgt tggaatcaaa tcgttcgaag ttcgtctagc tgaagattca    420

tcagaagaag aggtgttgaa atctgtatca ggattcaatg atgatccttc tgtccatgga    480

atccttgttc agttgcctct gccatcgcat atggatgaac agaacatact gaatgcggtt    540

agtatagaga aagatgttga cggatttcat ccgctaaata ttggacggct tgccatgcgt    600

ggaagagaac ccttattcgt tccttgtact ccaaaaggat gcattgagtt gttgcataga    660

tacaacattg aaatcaaagg aaagagagcg gttgttatcg gaaggagtaa cattgtcggt    720

atgccagctg ctcttttact gcagagggag gatgcaaccg ttagcattat ccattcaaga    780

accaagaacc ctgaagaaat cacaagagaa gctgatatta taatctcagc tgttggacag    840

ccaaacatgg tcagaggaag ctggataaaa ccgggcgcag tcctcatcga tgttgggatt    900

aatcctgttg aggatccaag tgctgcgcgt ggatatcgat tggttggaga catttgctac    960

gaggaggcta gcaaagttgc atcagccatc acacctgttc ctggcggtgt aggaccaatg    1020

accatagcca tgcttctatc caacacttta acatcagcta agaggattca caacttccag    1080

tga                                                                  1083

<210>12

<211>360

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>12

Met Ala Ser Met Met Phe Thr Asp Cys Ser Ser Thr Thr Thr Ser Arg

1               5                   10                  15

Leu Ile His Leu Asn Arg Ser Ser Gly Thr Phe Leu Leu Arg Gln Cys

            20                  25                  30

Val Gly Gln Leu Arg Leu Gln Thr Thr Ala Ser Gly Arg Gly Cys Cys

        35                  40                  45

Ile Arg Ser Ser Ser Ser Pro Ile Ser Ser Ile Ser Ala Asp Thr Lys

    50                  55                  60

Ser Glu Gly Gly Ala Ile Val Ile Asp Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys

65                  70                  75                  80

Ile Arg Asp Glu Ile Thr Ile Glu Val Ser Arg Met Lys Glu Ser Ile

                85                  90                  95

Gly Val Ile Pro Gly Leu Ala Val Ile Leu Val Gly Asp Arg Lys Asp

            100                 105                 110

Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys Lys Ala Cys Asp Ser Val Gly

        115                 120                 125

Ile Lys Ser Phe Glu Val Arg Leu Ala Glu Asp Ser Ser Glu Glu Glu

    130                 135                 140

Val Leu Lys Ser Val Ser Gly Phe Asn Asp Asp Pro Ser Val His Gly

145                 150                 155                 160

Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser His Met Asp Glu Gln Asn Ile

                165                 170                 175

Leu Asn Ala Val Ser Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu

            180                 185                 190

Asn Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Gly Arg Glu Pro Leu Phe Val Pro

        195                 200                 205

Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu His Arg Tyr Asn Ile Glu

    210                 215                 220

Ile Lys Gly Lys Arg Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly

225                 230                 235                 240

Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg Glu Asp Ala Thr Val Ser Ile

                245                 250                 255

Ile His Ser Arg Thr Lys Asn Pro Glu Glu Ile Thr Arg Glu Ala Asp

            260                 265                 270

Ile Ile Ile Ser Ala Val Gly Gln Pro Asn Met Val Arg Gly Ser Trp

        275                 280                 285

Ile Lys Pro Gly Ala Val Leu Ile Asp Val Gly Ile Asn Pro Val Glu

    290                 295                 300

Asp Pro Ser Ala Ala Arg Gly Tyr Arg Leu Val Gly Asp Ile Cys Tyr

305                 310                 315                 320

Glu Glu Ala Ser Lys Val Ala Ser Ala Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly

                325                 330                 335

Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met Leu Leu Ser Asn Thr Leu Thr Ser

            340                 345                 350

Ala Lys Arg Ile His Asn Phe Gln

        355                 360

<210>13

<211>1116

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>13

atggcgtcct ccatactctc cgactgctcc tcctccgcca cctcccgcct cctccccctc    60

cgccgcgccc tcctcgcgcc gccgtgccgc ttccgcccgg ccaccgtcgc cgcgccgccg    120

cggaggcccc tcgccatcgc cgccccccag ctcccgcttc tcccgcgcgc gcgcggcatg    180

gcttcggcct cagccgccgc cgccgccgcc gcctcctcta ccgactcaga tgcttgtgcc    240

aagattattg atgggaagtt ggtggcaaag cagataagag aggaaatcgc tgttgagatc    300

gccaagatga aggatgcaat tggggttgtg cctgggctgg cagtcatcct agttgggtca    360

aggaaggatt ctcaaacgta tgtgcgcaac aagaagaagg catgcgaagc ggttggtatc    420

aagtcatatg aggttaattt gccggaagac agctctgagg atgaggttct caagcacatc    480

gcaacattta acagtgatcc gtcggtgcat ggcatcttgg ttcagttgcc cctacctcat    540

catatgaatg atgagaacat tttgaatgct gttagtattg agaaggatgt tgatggattt    600

catccactga acattggacg acttgcaatg caaggtcggg atccgttctt tgttccatgc    660

acccctaaag gatgcatgga attactacac agatatggag ttgaaatcaa agggaagaga    720

gctgttgtaa ttgggcggag caatattgtg gggatgcctg ctgcattatt actgcaaaaa    780

gccaacgcaa ctgttagcat tgtacattca aataccaaga agcctgagga aataacaaga    840

caagcagata ttgttatcgc agctgttgga gttgctaatc tggtcagagg gagttggata    900

aagcctggtg ctgctattat tgatgttggc atcaatccag ttgatgatcc agaaagccct    960

cgaggttatc ggctggttgg agatgtgtgc tacgaggagg cctccaagat tgcaggacta    1020

atcacgccag ttcctggtgg tgtcgggcca atgacaattg cgatgctttt gtcgaacaca    1080

cttgagtcag ctaaaaggat acacaaattc aaataa                              1116

<210>14

<211>371

<212>PRT

<213>稻

<400>14

Met Ala Ser Ser Ile Leu Ser Asp Cys Ser Ser Ser Ala Thr Ser Arg

1               5                   10                  15

Leu Leu Pro Leu Arg Arg Ala Leu Leu Ala Pro Pro Cys Arg Phe Arg

            20                  25                  30

Pro Ala Thr Val Ala Ala Pro Pro Arg Arg Pro Leu Ala Ile Ala Ala

        35                  40                  45

Pro Gln Leu Pro Leu Leu Pro Arg Ala Arg Gly Met Ala Ser Ala Ser

    50                  55                  60

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Thr Asp Ser Asp Ala Cys Ala

65                  70                  75                  80

Lys Ile Ile Asp Gly Lys Leu Val Ala Lys Gln Ile Arg Glu Glu Ile

                85                  90                  95

Ala Val Glu Ile Ala Lys Met Lys Asp Ala Ile Gly Val Val Pro Gly

            100                 105                 110

Leu Ala Val Ile Leu Val Gly Ser Arg Lys Asp Ser Gln Thr Tyr Val

        115                 120                 125

Arg Asn Lys Lys Lys Ala Cys Glu Ala Val Gly Ile Lys Ser Tyr Glu

    130                 135                 140

Val Asn Leu Pro Glu Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Leu Lys His Ile

145                 150                 155                 160

Ala Thr Phe Asn Ser Asp Pro Ser Val His Gly Ile Leu Val Gln Leu

                165                 170                 175

Pro Leu Pro His His Met Asn Asp Glu Asn Ile Leu Asn Ala Val Ser

            180                 185                 190

Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile Gly Arg Leu

        195                 200                 205

Ala Met Gln Gly Arg Asp Pro Phe Phe Val Pro Cys Thr Pro Lys Gly

    210                 215                 220

Cys Met Glu Leu Leu His Arg Tyr Gly Val Glu Ile Lys Gly Lys Arg

225                 230                 235                 240

Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly Met Pro Ala Ala Leu

                245                 250                 255

Leu Leu Gln Lys Ala Asn Ala Thr Val Ser Ile Val His Ser Asn Thr

            260                 265                 270

Lys Lys Pro Glu Glu Ile Thr Arg Gln Ala Asp Ile Val Ile Ala Ala

        275                 280                 285

Val Gly Val Ala Asn Leu Val Arg Gly Ser Trp Ile Lys Pro Gly Ala

    290                 295                 300

Ala Ile Ile Asp Val Gly Ile Asn Pro Val Asp Asp Pro Glu Ser Pro

305                 310                 315                 320

Arg Gly Tyr Arg Leu Val Gly Asp Val Cys Tyr Glu Glu Ala Ser Lys

                325                 330                 335

Ile Ala Gly Leu Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met Thr

            340                 345                 350

Ile Ala Met Leu Leu Ser Asn Thr Leu Glu Ser Ala Lys Arg Ile His

        355                 360                 365

Lys Phe Lys

    370

<210>15

<211>1107

<212>DNA

<213>番茄(Lycopersicon esculentum)

<400>15

atggcgtcat ctccgataac aatgatgaag atgaagttaa acaactgctc accgccgtca    60

accgccgcag ccgcagctcg gtttttacca cttcttgggc cccaccaaat tcgcttccgt    120

tcctctgtgg ctccccttta caacccatct ttccccagaa ccatcatcac tcgtccaacg    180

ttttcctcct cctccatcat caccgctgcg atggctaatg aggcattggt aaaagtgatt    240

gatgggaaaa aagttgcaaa agatgttaga gatgaaataa atgctgaaat aactaggatg    300

aaagattcga ttggtgttgt tcctggcctt gcagttatac ttgttgggga taggaaggat    360

tctgcaactt atgttcgcaa caagaaaaaa gcttgtgaaa ctgctgggat caaatcctat    420

gaagtgtgtt tgcctgagaa ctcaacagag gaagaagttc tcaagtatat ttcagacttc    480

aatgatgatc ctatggttca tggaattctt gttcagctac cattgccttc gcatatggat    540

gaggagaaaa tcctacatgc tgtttgcatt gagaaggatg tggatggatt ccacccacta    600

aatattggcc agcttgcgat gcgaggtaga gagcccttat ttatcccctg tacaccaaaa    660

ggatgcattg agcttcttca tcggtacaat gtggaaatta aggggaaaaa agcggttgtc    720

attggcagga gcaatatagt tggaatgcct gctgccctgc tgctgcagag ggaagatgcc    780

accgtcagca tagttcattc cagaaccact aacccagagg agatcacaag agaagcagat    840

atcataatcg ctgctgtagg gaaaccaaat atggttagag gtagctggat caagcctggg    900

gcagtaatta ttgatgtcgg gattaatcct gtggaggatg ctacaaatcc tcgaggctat    960

cgactagttg gagatgtttg ttatgaggag gccatcaagg ttgcttcagc tattactcct    1020

gttcctggag gagttgggcc catgactata gcaatgcttc tctccaatac tttgttatca    1080

gcaaaacgaa ttaataactt caagtga                                        1107

<210>16

<211>368

<212>PRT

<213>番茄

<400>16

Met Ala Ser Ser Pro Ile Thr Met Met Lys Met Lys Leu Asn Asn Cys

1               5                   10                  15

Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Arg Phe Leu Pro Leu Leu

            20                  25                  30

Gly Pro His Gln Ile Arg Phe Arg Ser Ser Val Ala Pro Leu Tyr Asn

        35                  40                  45

Pro Ser Phe Pro Arg Thr Ile Ile Thr Arg Pro Thr Phe Ser Ser Ser

    50                  55                  60

Ser Ile Ile Thr Ala Ala Met Ala Asn Glu Ala Leu Val Lys Val Ile

65                  70                  75                  80

Asp Gly Lys Lys Val Ala Lys Asp Val Arg Asp Glu Ile Asn Ala Glu

                85                  90                  95

Ile Thr Arg Met Lys Asp Ser Ile Gly Val Val Pro Gly Leu Ala Val

            100                 105                 110

Ile Leu Val Gly Asp Arg Lys Asp Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys

        115                 120                 125

Lys Lys Ala Cys Glu Thr Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Glu Val Cys Leu

    130                 135                 140

Pro Glu Asn Ser Thr Glu Glu Glu Val Leu Lys Tyr Ile Ser Asp Phe

145                 150                 155                 160

Asn Asp Asp Pro Met Val His Gly Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro

                165                 170                 175

Ser His Met Asp Glu Glu Lys Ile Leu His Ala Val Cys Ile Glu Lys

            180                 185                 190

Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile Gly Gln Leu Ala Met Arg

        195                 200                 205

Gly Arg Glu Pro Leu Phe Ile Pro Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu

    210                 215                 220

Leu Leu His Arg Tyr Asn Val Glu Ile Lys Gly Lys Lys Ala Val Val

225                 230                 235                 240

Ile Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln

                245                 250                 255

Arg Glu Asp Ala Thr Val Ser Ile Val His Ser Arg Thr Thr Asn Pro

            260                 265                 270

Glu Glu Ile Thr Arg Glu Ala Asp Ile Ile Ile Ala Ala Val Gly Lys

        275                 280                 285

Pro Asn Met Val Arg Gly Ser Trp Ile Lys Pro Gly Ala Val Ile Ile

    290                 295                 300

Asp Val Gly Ile Asn Pro Val Glu Asp Ala Thr Asn Pro Arg Gly Tyr

305                 310                 315                 320

Arg Leu Val Gly Asp Val Cys Tyr Glu Glu Ala Ile Lys Val Ala Ser

                325                 330                 335

Ala Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met

            340                 345                 350

Leu Leu Ser Asn Thr Leu Leu Ser Ala Lys Arg Ile Asn Asn Phe Lys

        355                 360                 365

<210>17

<211>1089

<212>DNA

<213>陆地棉(Gossypium hirsutum)

<400>17

atggtgtcca tgatattcaa tgatccttct tccgctgccg ccttccatcg cctctccttt    60

acccgtttca gtaatggtct cgtttccctt cgccggtttg tgggtccact tcatgttttc    120

tcaaataccc ctacccttcc tcgagccctc tctctccacg ctccacgttc ttctcgtttc    180

attactgctt caatggctgc tgagccatcc gctaaggtga tcgatgggaa atcagtggca    240

aagcaaataa gagaagaaat aagtgctgaa gtaacaaaac tgaaggaagc aattggagtt    300

gttcctggat tagccgttat tctagttggg gataggaagg actctgctac ttatgtgcgg    360

aacaagaaaa aagcttgtga atctgtaggg attaactcct ttgaagtaaa tttacctgat    420

gatgcttctg agcaagaagt tctcaagtat atctcggact tcaatggtga tccttcggtt    480

catggcatcc ttgttcaatt gcctctacct tctcatatga atgagcagaa cattttaaat    540

gctgttacga ttgagaaaga tgtggatggc ttccacccat tgaacattgg tcatcttgcc    600

atgcgaggta gcgaaccctt gttcgttcca tgtactccta aaggatgcat agagctattg    660

catagatatg gtgttgatat taaaggaaag agggctgttg tcattggtcg gagtaatatt    720

gttggaatgc ctgcagctct gttactgcaa agggaagatg ctactgtaac tattgtccat    780

tctagaacca agaatcctga ggaaattaca agacaggcag atatcataat atctgctgtg    840

gggcagccaa atatggtgag aggtagctgg ataaagccag gtgctgttat tattgatgtt  900

ggaataaatc cagttgagga tgcaactagt cctcgaggat atcggttagt tggagatgtt  960

tgttatgacg aggcctgcaa gattgctgca gccgttactc cagttccagg gggtgtcggt  1020

cctatgacaa ttgcaatgct tctctctaac acagtcagtt cagcaaagag agcatataac  1080

ttcaattga                                                          1089

<210>18

<211>362

<212>PRT

<213>陆地棉

<400>18

Met Val Ser Met Ile Phe Asn Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Phe His

1               5                   10                  15

Arg Leu Ser Phe Thr Arg Phe Ser Asn Gly Leu Val Ser Leu Arg Arg

            20                  25                  30

Phe Val Gly Pro Leu His Val Phe Ser Asn Thr Pro Thr Leu Pro Arg

        35                  40                  45

Ala Leu Ser Leu His Ala Pro Arg Ser Ser Arg Phe Ile Thr Ala Ser

    50                  55                  60

Met Ala Ala Glu Pro Ser Ala Lys Val Ile Asp Gly Lys Ser Val Ala

65                  70                  75                  80

Lys Gln Ile Arg Glu Glu Ile Ser Ala Glu Val Thr Lys Leu Lys Glu

                85                  90                  95

Ala Ile Gly Val Val Pro Gly Leu Ala Val Ile Leu Val Gly Asp Arg

            100                 105                 110

Lys Asp Ser Ala Thr Tyr Val Arg Asn Lys Lys Lys Ala Cys Glu Ser

        115                 120                 125

Val Gly Ile Asn Ser Phe Glu Val Asn Leu Pro Asp Asp Ala Ser Glu

    130                 135                 140

Gln Glu Val Leu Lys Tyr Ile Ser Asp Phe Asn Gly Asp Pro Ser Val

145                 150                 155                 160

His Gly Ile Leu Val Gln Leu Pro Leu Pro Ser His Met Asn Glu Gln

                165                 170                 175

Asn Ile Leu Asn Ala Val Thr Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His

            180                 185                 190

Pro Leu Asn Ile Gly His Leu Ala Met Arg Gly Ser Glu Pro Leu Phe

        195                 200                 205

Val Pro Cys Thr Pro Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu His Arg Tyr Gly

    210                 215                 220

Val Asp Ile Lys Gly Lys Arg Ala Val Val Ile Gly Arg Ser Asn Ile

225                 230                 235                 240

Val Gly Met Pro Ala Ala Leu Leu Leu Gln Arg Glu Asp Ala Thr Val

                245                 250                 255

Thr Ile Val His Ser Arg Thr Lys Asn Pro Glu Glu Ile Thr Arg Gln

            260                 265                 270

Ala Asp Ile Ile Ile Ser Ala Val Gly Gln Pro Asn Met Val Arg Gly

        275                 280                 285

Ser Trp Ile Lys Pro Gly Ala Val Ile Ile Asp Val Gly Ile Asn Pro

    290                 295                 300

Val Glu Asp Ala Thr Ser Pro Arg Gly Tyr Arg Leu Val Gly Asp Val

305                 310                 315                 320

Cys Tyr Asp Glu Ala Cys Lys Ile Ala Ala Ala Val Thr Pro Val Pro

                325                 330                 335

Gly Gly Val Gly Pro Met Thr Ile Ala Met Leu Leu Ser Asn Thr Val

            340                 345                 350

Ser Ser Ala Lys Arg Ala Tyr Asn Phe Asn

        355                 360

<210>19

<211>894

<212>DNA

<213>火炬松

<400>19

atggcgaaga tcatcgatgg gaaagcaatt gcccagtcta ttcacaacga gatcgcccaa    60

gatgtcactg atctctccaa gaaatatggc aaggtgcctg gtttggctgt tgtcattgtg    120

ggcgagagga aagattccca gacttatgta cgcatgaaga ggaaagcatg tgcagaggtt    180

ggcataaagt cctttaatgt agacttaccg ggagacgtta cggaagagaa tcttctggac    240

acagttcttg acctgaacgc tgatcctgaa gtacatggca tcttggtcca gcttccacta    300

ccacgacaca tcaatgaaga gaagatactg agtgcaataa gcatagaaaa ggatgtagat    360

gggtttcatc ctctcaacat tggcaaactt gcaatgaagg gaagggaacc tctatttgtt    420

ccatgtacgc caaaggggtg catagaactc ttacaaagga gtggggtctc catatcaaat    480

aaaagagcag ttgtggttgg aaggagtaac atagtaggat tgccagttgc attgctgcta    540

atcaaattag atgcaactgt gacaatggtg cattctaaaa ctccagatcc aaaaagtata    600

ataagtgagg cggatatcat catagctgct gcaggacaag caaacatgat caaagcagat    660

tggatcaagc caggtgctgc tgttattgat gtcgggacaa atgcagtcga tgatccgagc    720

agaaagtcag gctacagatt agtgggagat gttgcttttg gggaatgcaa ggatgttgct    780

ggatggatca ctccagtacc aggtggagtt ggaccaatga ctattgcaat gcttctcaga    840

aatacaacag atggtgcgaa gcgagcctgt gaagaagctt ccaaagttga ataa          894

<210>20

<211>296

<212>PRT

<213>火炬松

<400>20

Met Ala Lys Ile Ile Asp Gly Lys Ala Ile Ala Gln Ser Ile His Asn

1               5                   10                  15

Glu Ile Ala Gln Asp Val Thr Asp Leu Ser Lys Lys Tyr Gly Lys Val

            20                  25                  30

Pro Gly Leu Ala Val Val Ile Val Gly Glu Arg Lys Asp Ser Gln Thr

        35                  40                  45

Tyr Val Arg Met Lys Arg Lys Ala Cys Ala Glu Val Gly Ile Lys Ser

    50                  55                  60

Phe Asn Val Asp Leu Pro Gly Asp Val Thr Glu Glu Asn Leu Leu Asp

65                  70                  75                  80

Thr Val Leu Asp Leu Asn Ala Asp Pro Glu Val His Gly Ile Leu Val

                85                  90                  95

Gln Leu Pro Leu Pro Arg His Ile Asn Glu Glu Lys Ile Leu Ser Ala

            100                 105                 110

Ile Ser Ile Glu Lys Asp Val Asp Gly Phe His Pro Leu Asn Ile Gly

        115                 120                 125

Lys Leu Ala Met Lys Gly Arg Glu Pro Leu Phe Val Pro Cys Thr Pro

    130                 135                 140

Lys Gly Cys Ile Glu Leu Leu Gln Arg Ser Gly Val Ser Ile Ser Asn

145                 150                 155                 160

Lys Arg Ala Val Val Val Gly Arg Ser Asn Ile Val Gly Leu Pro Val

                165                 170                 175

Ala Leu Leu Leu Ile Lys Leu Asp Ala Thr Val Thr Met Val His Ser

            180                 185                 190

Lys Thr Pro Asp Pro Lys Ser Ile Ile Ser Glu Ala Asp Ile Ile Ile

        195                 200                 205

Ala Ala Ala Gly Gln Ala Asn Met Ile Lys Ala Asp Trp Ile Lys Pro

    210                 215                 220

Gly Ala Ala Val Ile Asp Val Gly Thr Asn Ala Val Asp Asp Pro Ser

225                 230                 235                 240

Arg Lys Ser Gly Tyr Arg Leu Val Gly Asp Val Ala Phe Gly Glu Cys

                245                 250                 255

Asp Val Ala Gly Trp Ile Thr Pro Val Pro Gly Gly Val Gly Pro Met

            260                 265                 270

Thr Ile Ala Met Leu Leu Arg Asn Thr Thr Asp Gly Ala Lys Arg Ala

        275                 280                 285

Cys Glu Glu Ala Ser Lys Val Glu

    290                 295

Claims (25)

1、一种双链RNA分子，包含：i)第一链，包含与MTHFR样基因的一部分基本上相同的序列；和ii)第二链，包含与第一链基本上互补的序列，其中所述MTHFR样基因的一部分来自选自下组的多核苷酸：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸片段的多核苷酸；

f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的生物活性部分；

g)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和

h)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸。

2、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19限定的序列。

3、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸与具有SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性。

4、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码具有SEQID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽。

5、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸编码与具有SEQID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽。

6、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸在严紧条件下与包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸杂交。

7、如权利要求1所述的双链RNA，其中所述多核苷酸包含编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽的生物活性部分的片段。

8、一种双链RNA分子库，包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述双链RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少90％序列同一性的多核苷酸；和

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。

9、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列。

10、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少90％序列同一性。

11、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽。

12、如权利要求8所述的双链RNA库，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽。

13、一种转基因植物，能够表达与MTHFR样基因的一部分基本上相同的双链RNA，其中所述MTHFR样基因的一部分来自选自下组的多核苷酸：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸片段的多核苷酸；

f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的生物活性部分；

g)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和

h)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸。

14、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述双链RNA包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸的一部分：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中所限定序列的多核苷酸有至少90％序列同一性的多核苷酸；和

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。

15、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、香蕉、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、嫩荚菜豆、利马豆、豌豆和烟草。

16、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是大豆。

17、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列。

18、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸与具有SEQID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％的序列同一性。

19、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽。

20、如权利要求13所述的转基因植物，其中所述多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽。

21、一种制备能够表达在植物中抑制MTHFR样基因表达的双链RNA的转基因植物的方法，所述方法包括下列步骤：i)制备具有与MTHFR样基因的一部分基本上相同的区域的核酸，其中所述核酸一旦在所述植物中表达，能够形成双链转录物；ii)用所述核酸转化受体植物；iii)生成所述受体植物的一个或多个转基因子代；和iv)选择表达所述转录物的子代，

其中所述MTHFR样基因的一部分是选自下组的多核苷酸：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少70％序列同一性的多核苷酸；

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少70％序列同一性的多肽的多核苷酸；

e)包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中所限定序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸片段的多核苷酸；

f)包含片段的多核苷酸，所述片段编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的生物活性部分；

g)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸；和

h)在严紧条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸包括编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽的多核苷酸的至少19个连续核苷酸、或至少50个连续核苷酸、或至少100个连续核苷酸、或至少200个连续核苷酸。

22、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA包括多种RNA分子，每种RNA分子包含长度为约19～24个核苷酸的双链区，其中所述RNA分子衍生自选自下组的多核苷酸：

a)包含SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸；

b)编码具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中限定的序列的多肽的多核苷酸；

c)与具有SEQ ID NO：1、3、7、9、11、13、15、17或19中限定的序列的多核苷酸有至少90％序列同一性的多核苷酸；和

d)编码与具有SEQ ID NO：2、8、10、12、14、16、18或20中所限定序列的多肽有至少90％序列同一性的多肽的多核苷酸。

23、如权利要求21所述的方法，其中所述植物选自大豆、马铃薯、番茄、花生、棉花、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑桔树、香蕉、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、嫩荚菜豆、利马豆、豌豆和烟草。

24、如权利要求21所述的方法，其中所述植物是大豆。

25、如权利要求21所述的方法，其中所述双链RNA在植物根部或合胞体中表达。

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