JP7148206B2 - 線虫抵抗性 - Google Patents
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Description
以下の説明及び実施例では、いくつかの用語が使用される。そうした用語に与えられる範囲を含め、本明細書及び特許請求の範囲について明確で一貫した理解を得るために、以下の定義を提供する。本明細書において別段定義しない限り、使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
本発明者らは、ネコブセンチュウ属の線虫種(たとえば、ネコブ又はシスト線虫)による感染後に、巨大細胞において有意に抑制又は下向き調節されるが、巨大細胞より大きい感染根組織(たとえば、こぶ又は感染した根セグメント)では変化しない、WRKYスーパーファミリーに属する植物遺伝子、より詳細にはWRKY32遺伝子を特定した。驚いたことに、この遺伝子(WRKY32遺伝子)の発現を遺伝子発現抑制によってin casuで変更又は低減させた結果として、機能WRKY32タンパク質の発現が低減されると、前記植物において、ネコブ又はシスト線虫によって引き起こされる疾病症状の軽減が観察されたことがわかった。たとえば、驚いたことに、作物植物(トマト植物)におけるWRKY32遺伝子(たとえば、トマト相同配列(Solyc07g005650)の発現を、RNAiを主体とする形質転換を使用してノックダウンさせると、前記作物植物において、感染の数が減少した、及び/又はネコブ若しくはシスト線虫によって通常引き起こされる感染の重症度が軽減されたことがわかった。
別の態様では、本発明はまた、上記方法のいずれか1つによって取得可能な植物、植物部分、植物細胞、種子、及び/又は根茎に関する。
別の態様では、本発明は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、又は8と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドの発現が低減されているトマト植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞に関する。好ましい一実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、配列番号1、8と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
別の態様では、本発明は、植物細胞、植物部分、又は植物において線虫抵抗性を向上又は増大させるための、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、又は15のアミノ酸配列と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用に関する。
ソラヌム・リコペルシクムにおける線虫病検定
トマト(S.リコペルシクム)植物における線虫抵抗性を試験するために、本発明者らは、Solyc07g005650遺伝子によってコードされるWRKY32タンパク質の発現の低減又は変更の結果として、ネコブ線虫感染による疾病症状が軽減するかどうかを調査した。
線虫であるサツマイモネコブセンチュウのトマト(S.リコペルシクム)植物への外寄生能に対する、Solyc07g005650遺伝子の発現低下の効果を試験するために、S.リコペルシクム根に、Solyc07g005650遺伝子を発現抑制するように設計された、配列CTGACATGCCAGTACCCAAAAAACGTCATGGTCCACCGAGTGCACCTCTTATTGCTGCTACTGCCCCTGCTTCCGTAACCACTATGCATGCTAACAAACCCGAACCCCTACAACATCAAAAATCGACCACACAATGGTCCGTGGACAAAGAAGGTGAGTTGACTGGTGAGAAATTGGATGTTGGAGGAGAAAAAGCAATGGを有するRNAiベクター構築物を形質移入した実験を行った。リゾビウム・リゾゲネスを媒介としたトマト根への形質移入には、同じプラスミドにおける(蛍光マーカーとして使用した)DSレッドの存在を視覚的に役立てた。
対照群は、ベクター構築物で形質転換されているが、Solyc07g005650遺伝子を発現抑制するように設計されたRNAiを含んでいないトマト(S.リコペルシクム)植物からなるものとした。
シロイヌナズナにおけるネコブ線虫病検定
シロイヌナズナ属(シロイヌナズナ)植物における線虫抵抗性を試験するために、本発明者らは、At4g30935遺伝子によってコードされるWRKY32タンパク質の発現の低減又は変更の結果として、ネコブ線虫(サツマイモネコブセンチュウ)感染による疾病症状が軽減するかどうかを調査した。
線虫であるサツマイモネコブセンチュウのシロイヌナズナ植物への外寄生能に対する、At4g30935遺伝子(配列番号13がゲノム配列に相当し、配列番号14がコード配列に相当し、配列番号15がタンパク質に相当する)の発現低減の効果を評価するために、6ウェル細胞培養プレートにおいて滅菌MS20/Gelrite培地で成長させた、At4g30935遺伝子にT-DNA挿入を含んでいるシロイヌナズナ突然変異体系統(SALK_091352;Alonsoら、2003、Science)の10日齢植物に、植物1株あたり200匹の無菌サツマイモネコブセンチュウ感染性幼若体(J2)を負荷した実験を行った。
対照群は、公的に入手可能な、挿入突然変異体のゲノム規模コレクションを創出するのにバックグラウンドとして使用された生態型であるシロイヌナズナCol-0野生型植物からなるものとした(Alonsoら、2003、Science)。6ウェル細胞培養プレートにおいて滅菌MS20/Gelrite培地で成長させた10日齢植物に、植物1株あたり200匹の無菌サツマイモネコブセンチュウ感染性幼若体(J2)を負荷した。
シロイヌナズナにおけるテンサイシスト線虫病検定
シロイヌナズナ属(シロイヌナズナ)植物における線虫抵抗性を試験するために、本発明者らは、At4g30935遺伝子によってコードされるWRKY32タンパク質の発現の低減又は変更の結果として、テンサイシスト線虫(テンサイシストセンチュウ)感染による疾病症状が軽減するかどうかを調査した。
線虫であるテンサイシストセンチュウのシロイヌナズナ植物への外寄生能に対する、At4g30935遺伝子の発現低減の効果を評価するために、6ウェル細胞培養プレートにおいて滅菌KNOP/Daichin寒天培地で成長させた、At4g30935遺伝子にT-DNA挿入を含んでいるシロイヌナズナ突然変異体系統(SALK_091352;Alonsoら、2003、Science)の10日齢植物に、植物1株あたり150匹の無菌テンサイシストセンチュウ感染性幼若体(J2)を負荷した実験を行った。
対照群は、公的に入手可能な、挿入突然変異体のゲノム規模コレクションを創出するのにバックグラウンドとして使用された生態型であるシロイヌナズナCol-0野生型植物からなるものとした(Alonsoら、2003、Science)。6ウェル細胞培養プレートにおいて滅菌KNOP/Daichin寒天培地で成長させた10日齢植物に、植物1株あたり150匹の無菌テンサイシストセンチュウ(IRS)感染性幼若体(J2)を負荷した。
配列番号1 ナス科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号2 アブラナ科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号3 ウリ科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号4 マメ科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号5 バラ科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号6 イネ科コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号7 ナス属コンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号8 ソラヌム・リコペルシクムコンセンサスWRKY32タンパク質配列
配列番号9 ナス属コンセンサスWRKY32コード核酸配列
配列番号10 ソラヌム・リコペルシクムWRKY32ゲノム核酸配列
配列番号11 ソラヌム・リコペルシクムWRKY32コード核酸配列
配列番号12 ソラヌム・リコペルシクムWRKY32 RNAi配列
配列番号13 シロイヌナズナWRKY32ゲノム核酸配列
配列番号14 シロイヌナズナコード核酸配列
配列番号15 シロイヌナズナタンパク質配列
Claims (13)
- 対照植物に比べて向上した線虫抵抗性を有する植物を生産する方法であって、前記植物において、
i)WRKY32ポリペプチドの発現及び/又は活性、並びに
ii)前記WRKY32ポリペプチドをコードするWRKY32ポリヌクレオチドの発現
の少なくとも一方を低減するステップを含み、
前記発現及び/又は活性は、
WRKY32ポリヌクレオチド及び/又はWRKY32ポリペプチドの改変、並びに
RNA干渉(RNAi)又はウイルス誘導性遺伝子発現抑制(VIGS)を用いたWRKY32遺伝子発現抑制
の少なくとも一方によって低減され、
前記WRKY32ポリペプチドは、2つのWRKYドメインを含み、少なくとも1つのW-boxポリヌクレオチドコンセンサス配列に結合しうる、WRKY32ファミリーに属する転写因子タンパク質であり、
前記生産された植物が、シロイヌナズナ植物でない、方法。 - 前記WRKY32ポリペプチドが内因性ポリペプチドである、及び/又は前記WRKY32ポリヌクレオチドが内因性ポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記WRKY32ポリペプチドが、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、及び15のいずれか1つのアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、及び/又は前記WRKY32ポリヌクレオチドが、配列番号9、10、11、13、及び14のいずれか1つのヌクレオチド配列と少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記植物を再生させるステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドの発現が、少なくとも、前記植物の根において低減される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- i)WRKY32ポリペプチドの発現及び/又は活性、並びにii)WRKY32ポリヌクレオチドの発現の少なくとも一方が、WRKY32ポリヌクレオチドを改変することにより低減され、前記改変は、前記ポリヌクレオチドにおける少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- WRKY32ポリペプチドの発現及び/若しくは活性、並びに/又はWRKY32ポリヌクレオチドの発現が、WRKY32遺伝子ノックアウトを使用して低減される、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~3のいずれか一項に記載のWRKY32ポリペプチドの発現及び/若しくは活性、並びに/又は請求項1~3のいずれか一項に記載のWRKY32ポリヌクレオチドの発現が低減されている、植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞であって、
前記発現及び/又は活性は、
WRKY32ポリヌクレオチド及び/又はWRKY32ポリペプチドの改変、並びに
RNAi又はVIGSを用いたWRKY32遺伝子発現抑制
の少なくとも一方によって低減され、
シロイヌナズナ植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞でない、植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞。 - 改変されたWRKY32ポリヌクレオチドを含む、請求項8に記載の植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞。
- 前記改変は、前記ポリヌクレオチドにおける少なくとも1つのヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む、請求項8又は9に記載の、植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞。
- WRKY32ポリペプチドの発現及び/若しくは活性、並びに/又はWRKY32ポリヌクレオチドの発現が、WRKY32遺伝子ノックアウトによって低減されている、請求項8に記載の植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞。
- 請求項8~11のいずれか一項に記載の植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞の子孫である、植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞であって、前記子孫は、請求項1~3のいずれか一項に記載のWRKY32ポリペプチドの発現及び/若しくは活性、並びに/又は請求項1~3のいずれか一項に記載のWRKY32ポリヌクレオチドの発現が低減されており、
前記発現及び/又は活性は、
WRKY32ポリヌクレオチド及び/又はWRKY32ポリペプチドの改変、並びに
RNAi又はVIGSを用いたWRKY32遺伝子発現抑制
の少なくとも一方によって低減される、植物、植物部分、根茎、種子、又は細胞。 - 請求項1~7のいずれか一項に記載の方法によって取得された植物。
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