KR20190018642A - 선충 저항성 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 농업 분야, 특히 작물 보호 분야에서, 특히 식물에 선충 저항성을 제공하는 분야에 관한 것이다. 개선된 선충 저항성을 갖는 식물, 특히 뿌리혹 선충 및/또는 시스트 선충에 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법 및 이러한 방법으로 제조된 식물이 개시된다.
Description
본 발명은 농업 분야, 특히 작물 보호 분야, 보다 구체적으로는 선충 저항성을 식물에 제공하는 분야에 관한 것이다.
식물 기생충 선충은 전세계적으로 다수의 농작물에 감염된다(Baum et al. 2007, Genetic Engineering Vol. 28, Ed. J.K. Setlow, page 17; Jones et al. 2013, Molecular Plant Pathology Vol 14(9), page 946). 뿌리혹 선충(Meloidogyne spp.)와 시스트 선충(Heterodera 및 Globodera spp.)은 가장 경제적으로 관련된 식물-기생충 선충으로 연간 손실이 매우 크다(Rahman et al., Journal of Environmental Science and Health Part B Vol. 48, page 16; Hewezi and Baum 2013, MPMI Vol 26 (1), page 9). 뿌리를 통한 침투 및 이동 후에, 뿌리혹 선충은 숙주 세포가 그들의 생애주기 내내 섭취하고 발달하는 특유의 영양 공급 구조(거대 세포, 골(galls) 속에 묻혀있음)로 변형되는 것을 유도한다. 이 거대 세포는 식물에서 영양분을 배출한다(Grunder and Hofmann 2011, Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions, Ed. J. Jones, page 423). 뿌리 부전은 작물 생산에서 선충에 의해 야기되는 주된 문제이며 뿌리 량이 감소되고 비효율적인 물과 영양소 이용으로 이어진다.
작물 생산에서, 선충 감염은 작물 순환, 살선충제의 과도한 사용 및 유전 작물 저항성을 포함하는 많은 실행을 사용하여 싸운다. 살선충제의 사용은 다음 사항에 대한 우려로 전세계적으로 급격히 감소되었다: i. 인간의 건강, ii. 식품 작물의 잔류 화학 물질로 인한 식품 안전성, 및 iii. 비표적 유기체에 대한 영향과 생태계에 대한 부정적인 영향(Haydock et al. 2013, Plant Nematology, Ed. R. Perry and M. Moens, 2nd edition, page 459). 따라서 선충에 의한 피해로부터 작물을 보호하기 위한 대체 방안에 대한 요구가 높다. 많은 작물에서, 선충에 대한 저항성은 야생 종자에서 발견되며, 그러한 저항성은 교차 및 선별을 통해 엘리트 물질로 통합될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 토마토를 포함하는 대부분의 작물에서 선충에 대한 유전적 저항성의 작은 기초만 있다. 이러한 유전적 숙주 저항성의 보급은 선충 개체군에 선발 압력을 가하여 저항성-파괴 분리를 유발한다(Davies and Elling 2015, Nematology Vol 17, page 249).
토마토에서, 뿌리혹 선충은 에스. 페루비아넘(S. peruvianum)에서 유래된 Mi1.2라는 저항성 유전자를 사용하여 오랫동안 처리되어 왔지만, 최근에는 엠. 인코그니타(M. incognita)를 포함하는 여러 멜로이도긴(Meloidogyne) 종들이 토마토에서 Mi1.2-매개 저항성에 의해 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다. 따라서, 식물 병원체 선충에 대한 저항성을 보장하기 위해 다수의 작물 종에 새로운 유전적 솔루션이 절실히 필요하다.
완전 기생 영양 기생충인 뿌리혹 선충은 생명 주기를 완성하기 위한 영양소의 공급원으로서 먹이 구조의 세포에 의존한다(Kyndt et al. 2012, New Phytologist Vol 196, page 887). 따라서, 뿌리혹 선충은 세포 내로(세포를 통해) 이동하는 시스트 선충과 달리, 세포 사이로(세포들 간에) 이동하기 때문에 뿌리 세포에 거의 또는 전혀 괴사를 일으키지 않는다. 뿌리 혹 선충에서, 먹이 세포의 형성은 세포핵의 분열을 자극하고 세포 확장을 촉진하여 전구 세포를 거대 세포로 재프로그램하는 능력을 갖는 단일 2-단계 유형(juvenile)(J2) 선충에 의해 유도된다(Jones and Goto 2011, Genomics and Molecular Genetics of Plant-Nematode Interactions, Ed. J. Jones, page 83). 선충은 전형적으로 4-6개의 거대 세포의 형성을 유도함으로써 숙주의 먹이 구조가 될 세포를 특별히 선택한다. 거대 세포 형성의 첫 징후 중 하나는 자극된 세포 분열과 두 개의 딸 핵 사이에 세포 판을 형성하지 못해 생긴 이중 핵 세포의 출현이다. 먹이 구조가 형성된 후, 선충은 정주하여 감염 후 24시간에 볼 수 있는 골(gall)(세포 과형성에 의해 형성된 거대한 뿌리 구조)로 둘러싸여 있다. 세포 재-프로그래밍은 먹이 구조의 형성을 유도하는 데 필요하다. 이것은 선충에 의해 유도되는 숙주에서의 유전자 발현의 변화된 상태에서 비롯된다(Bellafiore and Biggs 2010, Current Opinion in Plant Biology Vol 13, page 442). 선충의 형성을 촉진시키거나 용이하게 하고 발달을 지원하는 숙주 유전자 산물의 일부는 숙주의 감수성 요인으로 작용한다.
감염시, 숙주의 전사체(transcriptomic) 변화는 궁극적으로 침략 선충의 성공적인 침략, 확립 및 발달을 이끈다. 호환가능한 상호작용 동안 유전자 발현의 이러한 변화는 선충이 정착하고 재생산되기에 적합한 환경으로 숙주를 준비하는 데 중요하다(Gheysen and Mitchum 2011, Current Opinion in Plant Biology Vol 14, pages 415-421). 그러나, 어떻게 유전자 발현의 유전자(들) 또는 변형(들)이 식물에서의 침입 선충(예, 뿌리 혹 및/또는 시스트 선충)의 성공적인 침입, 확립 및 발달을 유도하는지는 아직 파악하기 어렵다. 상기 식물에서의 침입 선충의 성공적인 침입, 확립 및 발달을 방지 또는 감소시키기 위해 어떻게 그리고 어떠한 유전자 발현의 유전자(들) 또는 변형(들)이 식물에서 표적화되거나 또는 변경되거나 역전될 수 있는지 또한 불분명하다.
따라서, 식물에서 칩입 선충(예, 뿌리 혹 및/또는 시스트 선충)의 성공적인 칩입, 확립 및 발달을 억제 또는 감소시키기 위해 식물에서 조작되거나 변경될 수 있는 새로운 분자 표적(들)(예, 유전자) 및 이들의 관련 단백질(들)을 밝혀내는 것이 당업계에 필요하다. 또한, 그러한 분자 표적(들)의 사용에 의존하는 식물에 대한 선충 저항성을 부여하기 위한 대안적 또는 개선된 방법이 필요하고, 이에 의해 선충에 저항적이거나 또는 예를 들어 와일드 타입 식물과 같은 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물의 효과적인 발생을 가능하게 하는 것이 요구된다.
본 발명은 식물에서 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 상기 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 상기 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 제공한다.
일 구현으로, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 13 중 어느 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
일 구현으로, 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8, 바람직하게 SEQ ID NO: 8 중 어느 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩타이드는 바람직하게 WRKY32 과에 속하는 전사 인자 단백질이고, 2개의 WRKY 도메인을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 포함 된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩될 수 있다. 폴리펩타이드는 토마토 WRKY32 폴리펩타이드일 수 있고, Solyc07g005650 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현은 적어도 상기 식물의 뿌리에서 손상된다.
일 구현으로, 식물의 표현형은 개선된 선충 저항성을 제외하고는 컨트롤 식물과 비교하여 변경되지 않는다.
상기 방법은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게, 이는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 단계를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 변형은 상기 폴리뉴클레오타이드에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 변형은 예를 들어 방사선 또는 에틸 메탄설포네이트를 이용한 처리를 사용하여 도입될 수 있다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 활성은 하나의 유전자 사일런싱을 이용하여 손상되거나 변형된다.
일 구현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
적절한 구현으로, 상기 식물은 토마토 식물, 바람직하게는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물이다.
선충은 뿌리혹 선충 및/또는 시스트 선충일 수 있으며, 예를 들어 멜로이도긴(Meloidogyne), 헤테로데라(Heterodera) 또는 글로보데라(Globodera), 바람직하게는 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 자바니카(Meloidogyne javanica), 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis), 헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii) 및 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)으로부터 선택될 수 있다.
상기 개시 내용은 또한 SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현이 손상된 토마토 식물, 종자 또는 세포를 교시한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드에 삽입, 결실 또는 치환되고, 바람직하게는 하나 이상의 점 돌연변이가 상기 폴리뉴클레오타이드에 도입된다.
본원은 추가로, SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성이 손상된 토마토 식물, 종자 또는 세포를 교시한다.
일 구현으로, 폴리펩타이드는 WRKY32 과의 전사 인자 단백질이고, 2개의 WRKY 도메인을 포함하고, 상기 도메인은 하나 이상의 폴리 뉴클레오타이드 상에 포함된 적어도 하나의 W- 박스에 바인딩한다.
토마토 식물, 종자 또는 세포는 바람직하게 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물, 종자 또는 세포이다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 활성은 뿌리에서 손상되지만 슈트(순)에서는 손상되지 않는다. 추가의 구현으로, 발현 및/또는 활성의 손상은 개선된 선충 저항성을 제외하고 컨트롤 식물과 비교하여 식물, 종자 또는 세포의 표현형을 변화시키지 않는다. 일 구현으로, 본원에 교시된 토마토 식물, 종자 또는 세포는 컨트롤 식물과 비교하여 개선된 선충 저항성, 바람직하게 개선된 뿌리 혹 선충 및/또는 시스트 선충 저항성을 나타낸다. 선충은 멜로이도긴(Meloidogyne), 헤테로데라(Heterodera) 또는 글로보데라(Globodera) 속으로부터 선택 될 수 있으며, 바람직하게는 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 자바니카(Meloidogyne javanica), 및 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis)로부터 선택될 수 있다.
본원에서 교시된 바와 같은 토마토 식물의 뿌리 줄기가 또한 제공되며, 이식물의 성장 및 발달을 개선시키기 위한 그러한 뿌리 줄기의 사용이 또한 제공된다.
본 발명은 추가로 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포, 식물 일부 또는 식물에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 사용하는 용도를 제공한다. 폴리펩타이드 바람직하게 WRKY32 과의 전사 인자 단백질이고, 2개의 WRKY 도메인을 포함할 수 있고, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 상에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 식물 또는 뿌리 줄기에서 WRKY32 단백질의 활성을 저해하는 하나 이상의 화합물로 식물 또는 뿌리 줄기를 처리하는 것을 포함하는, 컨트롤 식물 또는 뿌리 줄기에 비해 식물 또는 뿌리 줄기에서 선충 저항성을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 교시하며, 뿐만 아니라 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생시키는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법을 교시한다.
일 구현으로, 식물 또는 뿌리 줄기 자체 또는 본원에 교시된 어느 방법에 사용된 것은 트랜스제닉 식물 또는 뿌리 줄기가 아니며, 상기 방법 또는 사용은 트랜스제닉 수단을 포함하지 않는다.
도 1은 Solyc07g005650 유전자의 발현이 컨트롤 식물과 비교하여 사일런싱된 식물에서 M. 인코그니타(M. incognita) 감염에 의해 유발된 뿌리에서의 뿌리혹 선충(root knots)의 수를 나타낸다.
도 2는 wrky32 유전자가 컨트롤 식물에 비해 파괴된 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물에서 M. 인코그니타(M. incognita) 감염에 의해 유발된 뿌리에서의 뿌리혹 선충의 수를 나타낸다.
도 3은 wrky32 유전자가 컨트롤 식물과 비교하여 파괴된 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물에서 헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii) 감염에 의해 유발된 식물 당 발달된 암컷 수를 나타낸다.
도 2는 wrky32 유전자가 컨트롤 식물에 비해 파괴된 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물에서 M. 인코그니타(M. incognita) 감염에 의해 유발된 뿌리에서의 뿌리혹 선충의 수를 나타낸다.
도 3은 wrky32 유전자가 컨트롤 식물과 비교하여 파괴된 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물에서 헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii) 감염에 의해 유발된 식물 당 발달된 암컷 수를 나타낸다.
정의
하기의 설명 및 실시예에서, 다수의 용어들이 사용된다. 이러한 용어에 부여할 범위를 포함하여 명세서 및 청구범위에 대한 명확하고 일관된 이해를 제공하기 위해 다음과 같은 정의가 제공된다. 본원에서 달리 정의되지 않는 한, 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 방법에 사용된 통상적인 기술을 수행하는 방법은 당업자에게 자명할 것이다. 분자 생물학, 생화학, 전산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 생물정보학, 유전체학, 시퀀싱 및 관련 분야에서 통상적인 기술의 실행은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 하기 참고문헌에서 논의되어 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; and the series Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.
본 문헌과 청구범위에서, "포함하다(to comprise)"라는 동사와 그 활용형은 비한정적인 의미로 사용되며, 그 뒤에 나오는 항목은 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다. 이는 동사 "필수적으로 구성된(consisting essentially of)" 및 "구성된(consisting of)"을 포함한다.
본원에서 사용된 단수 형태 "하나의('a' 또는 'an')", 및 "상기(the)"는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, 상기에서 사용된 바와 같이 "하나의(a)" DNA 분자를 분리하는 방법은 복수의 분자(예를 들어, 10, 100, 1000, 1만, 10만, 100만 또는 그 이상의 분자)를 분리하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 "WRKY"("워키(worky)"로 발음됨)라는 용어는 생물적 및 비생물적 스트레스에 대한 반응, 면역, 식물 방어, 노화, 종자 휴면 및 종자 발아, 일부 발달 과정 등을 포함하여 식물의 많은 과정의 핵심 조절자인 식물 전사 인자의 상과(superfamily)를 지칭한다. WRKY 전사 인자 과(family)는 고등 식물의 10개의 가장 큰 전사 인자 과들 중 하나이며 그린 녹색 계통(녹조류 및 육상 식물)에서 발견된다. WRKY 전사 인자 과는 여러 멤버(즉, 상이한 WRKY 유전자 및 관련 단백질)를 포함한다. 예를 들어, 최고 100개의 상이한 WRKY 멤버(즉, WRKY 유전자 및 이에 상응하는 단백질)가 애기장대(Arabidopsis)에서 확인되었다(Eulgem et al (2000), Trends in Plant Science, Vol 5, pages 199-206).
WRKY 전사 인자는 "WRKY 도메인" (또는 WRKY 단백질 도메인)이라 불리는 적어도 하나의 DNA-바인딩 도메인의 존재를 특징으로 한다. WRKY 도메인은 모든 WRKY 단백질에 의해 공유되는 가장 주된 특징이며, 따라서 "WRKY 과(family)"라는 이름을 갖는다. WRKY 도메인은 N-말단에서 거의 변하지 않는 (즉, 과 멤버들 중에서 고 보존된) WRKY 아미노산 서열을 포함하고, 약 60 잔기의 길이를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, WRKY 도메인은 Cx4-5Cx22-23HxH("C2H2"라고도 함) 또는 Cx7Cx23HxC("C2HC"라고도 함)로 구성된 C-말단에 비정형 아연-핑거 구조를 포함한다. 대부분의 WRKY 전사 인자는 유전자 상의 프로모터 요소에 특이적으로 바인딩하는 능력이 있으며, 이 요소는 'W-박스 프로모터 요소'라고 한다. W-박스는 특정 DNA 바인딩에 필요한 최소한의 컨센서스 서열인 TTGACC/T 컨센서스 서열을 갖는다(Rushton et al(2010), Trends in Plant Science. Vol 15, pages 247-258).
다양한 WRKY 과 멤버는 이들의 아미노산 서열뿐만 아니라 WRKY 도메인의 수와 이들의 아연-핑거-유사 모티프의 특징 모두에 기초하여 분류된다. 이러한 기준에 근거하여, WRKY 전사 인자는 세 가지 주요 카테고리, 즉 그룹 I, 그룹 II 및 그룹 III 군으로 분류된다. 그룹 I WRKY 단백질(예, WRKT32)은 2개의 WRKY 단백질 도메인의 존재를 특징으로 하는 반면, 그룹 II 및 III은 모두 WRKY 단백질 도메인을 하나만 보유한다. 그룹 I 및 II는 C2H2 징크 핑거를 가지며, 그룹 III WRKY 단백질은 그룹 I 및 II 인자의 C2H2 모티프 대신 C2HC 징크 핑거를 갖는다. 세 그룹 모두 다양한 유전자의 다양한 W-박스 요소에 특이적으로 바인딩하는 것으로 나타났다(Eulgem et al (2000), Trends in Plant Science, Vol 5, pages 199-206)
본원에 사용된 "WRKY 단백질 또는 폴리펩타이드" 또는 "WRKY 전사 인자 단백질 또는 폴리펩타이드"라는 용어는 WRKY 전사 인자 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 단백질을 지칭하며, 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 상에 존재하는 W-박스에 특이적으로 바인딩할 수 있는 적어도 하나의 WRKY 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 '컨센서스 서열(consensus sequence)'이라는 용어는 서열 정렬에서 각 위치에서 발견되는 가장 빈번한 잔기, 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 계산된 순서를 나타낸다. 이는 관련 서열들(예, 동일한 과에 속하는 다른 식물 종들로부터 얻은 WRKY32 서열들)을 서로 비교하고, (예를 들어, 모티프 검색 프로그램(예, MEME)을 이용하여) 유사한 서열 모티프를 계산하는 다중 서열 정렬(예, WRKY32 서열)의 결과를 나타낸다. 숙련자는 '컨센서스 서열'의 개념뿐만 아니라 상이한 식물들(예, 농작물들)에 걸친 단백질의 컨센서스 서열을 확인하기에 적합한 방법론에 대해 잘 알고 있다.
본원에서 사용된 용어 "Solyc07g005650 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드"는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열을 갖는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 폴리뉴클레오타이드를 지칭하고, 이는 본원에 교시된 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 8)을 코딩한다. 이종상동성 유전자(orthologous genes)는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 및 다른 작물 종들에서 확인되었다.
"유전자의 발현(expression of a gene)"은 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이 생물학적으로 활성인 RNA로 전사되는, 즉 생물학적으로 활성 단백질 또는 펩타이드(또는 활성 펩타이드 프래그먼트)로 번역될 수 있는 프로세스를 의미한다. "단백질의 발현(expression of a protein)"은 본원에서 유전자의 발현이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 이는 적절한 조절 영역, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 영역이 mRNA로 전사되고, 이어서 단백질 또는 펩타이드(또는 활성 펩타이드 프래그먼트)로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기능이 적은 단백질이 생산될 때 유전자 또는 단백질의 발현이 손상된다. 이것은 RNA로의 전사가 감소된 경우 및/또는 전사된 RNA가 생물학적으로 비활성인 경우 및/또는 전사된 RNA가 감소된 수준으로 단백질로 번역될 경우에 발생할 수 있다.
용어 "유전자(gene)"는 적절한 조절 영역(예, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 세포 내의 RNA 분자(예, mRNA)로 전사되는 영역(전사 영역)을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 따라서, 유전자는 몇 개의 작동가능하게 연결된 서열, 예를 들어 프로모터, 예를 들어, 번역 개시에 연루되는 서열을 포함하는 5' 리더 서열, (단백질) 코딩 영역(cDNA 또는 게노믹 DNA) 및 예를 들어, 전사 종결 서열 사이트를 포함하는 3' 비-번역 서열과 같은 여러 작동가능하게 연결된 서열들을 포함할 수 있다.
"키메릭 유전자(chimeric gene)" (또는 재조합 유전자)는 일반적으로 종에서 자연적으로 발견되지 않는 임의의 유전자, 특히 핵산 서열의 하나 이상의 부분이 존재하며, 자연적으로 서로 관련되지 않는 유전자를 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 전사된 영역의 일부 또는 모두와 자연적으로 관련되지 않거나, 또는 또 다른 조절 영역과 관련되지 않는다. "키메릭 유전자"라는 용어는 프로모터 또는 전사 조절 서열이 하나 이상의 코딩 서열 또는 안티센스(센스 가닥의 역 컴플리먼트) 또는 역위 반복 서열(센스 및 안티센스, 이에 의해 RNA 전사체는 전사시 이중 가닥 RNA를 형성한다))에 작동가능하게 연결된 발현 구조물을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 용어는 기능적 관계로 폴리뉴클레오타이드 요소들의 연결을 지칭한다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 차라리 전사 조절 서열은, 코딩 서열의 전사에 영향을 주면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 것은 연결된 DNA 서열이 연속적임을 의미할 수 있다.
"전사 조절 서열(transcription regulatory sequence)"은 본원에서 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 (코딩) 서열의 전사 속도를 조절할 수 있는 핵산 서열로서 정의된다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 전사 조절 서열은 전사 개시(프로모터 요소) 및 전사를 유지 및 조절하기 위해 필요한 모든 서열 요소를 포함하며, 예를 들면, 어테뉴에이터 또는 인핸서를 포함한다. 대부분 코딩 서열의 상류(5') 전사 조절 서열이 언급되지만, 코딩 서열의 하류(3')에서 발견되는 조절 서열 또한 이 정의에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터(promoter)"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대해 상류에 위치하는 하나 이상의 유전자의 전사를 조절하는 기능을 하는 핵산 프래그먼트를 지칭하며, DNA-의존성 RNA 폴리머라아제, 전사 개시 사이트 및 이에 한정하는 것은 아니나 전사 인자 바인딩 사이트, 리프레서 및 활성제 단백질 바인딩 사이트, 및 프로모터로부터 전사의 양을 조절하기 위해 직접 또는 간접적으로 작용하는 당업자에게 알려진 어느 다른 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 어느 다른 DNA 서열에 대한 바인딩 사이트의 존재에 의해 구조적으로 확인된다. 선택적으로, 용어 "프로모터"는 본원에서 5' UTR 영역(5' 비번역 영역)을 포함한다(예를 들어, 본원에서 프로모터는 유전자의 번역 개시 코돈의 하나 이상의 부분 상류(5')를 포함할 수 있으며, 이 영역은 전사 및/또는 번역을 조절하는 역할을 가질 수 있다. "구성적인(constitutive)"프로모터는 대부분의 생리 및 발달 조건 하에서 대부분의 조직에서 활성적인 프로모터이다. "유도성(inducible)" 프로모터는 생리학적으로(예를 들어, 특정 화합물의 외부적 적용에 의해) 또는 발달적으로 조절되는 프로모터이다. "조직 특이성(tissue specific)" 프로모터는 특정 유형의 조직 또는 세포에서만 활성이 있다. "식물 또는 식물 세포에서 활성인 프로모터"는 식물 또는 식물 세포 내에서 전사를 유도하는 프로모터의 일반적인 능력을 의미한다. 이는 프로모터의 시공간적 활성에 아무런 영향을 미치지 않는다.
"3'UTR" 또는 "3' 비-번역 서열"(종종 3' 비번역 영역 또는 3' 단부라고도 함)은 유전자의 코딩 서열의 하류에서 발견되는 핵산 서열을 지칭하며, 예를 들어 전사 종결 사이트 및 (대부분은 있지만 모든 진핵 세포 mRNA는 아님) 폴리아데닐화 시그널(예, AAUAAA 또는 이의 변이체)을 포함한다. 전사 종결 후, mRNA 전사물은 폴리아데닐화 시그널의 하류에서 절단될 수 있고, 폴리(A) 꼬리가 부가될 수 있으며, mRNA의 세포질(번역이 일어나는 곳)로의 이동에 관여한다.
"cDNA"라는 용어는 상보적인 DNA를 의미한다. 상보적인 DNA는 RNA를 상보적인 DNA 서열로 역전사함으로써 만들어진다. 따라서 cDNA 서열은 유전자로부터 발현되는 RNA 서열에 상응한다. 게놈으로부터 발현될 때 mRNA 서열이 스플라이싱될 수 있기 때문에, 즉 인트론이 mRNA로부터 스플라이싱되고 엑손이 세포질에서 단백질로 번역되기 전에 합쳐져서, cDNA의 발현은 cDNA를 코딩하는 mRNA의 발현을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, cDNA 서열은 예를 들어, 단백질과 같이 결합된 엑손으로 구성된 완전한 오픈 리딩 프레임만을 코딩할 수 있는 반면, 게놈 DNA는 인트론 서열에 의해 산재되어 있는 엑손을 코딩하는 점에서 cDNA가 일치하는 게노믹 DNA 서열과 동일하지 않을 수 있다. 따라서, cDNA를 코딩하는 유전자를 유전공학적으로 변형시키는 것은 cDNA에 상응하는 서열을 변형시키는 것과 관련 될뿐만 아니라, 유전자 발현의 손상을 일으키는 한, 그 유전자의 게노믹 DNA 및/또는 다른 유전자 조절 서열의 돌연변이 인트론 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드는 피리미딘 및 퓨린 염기의 어느 폴리머 또는 올리고머, 바람직하게는 시토신, 티민 및 우라실, 및 아데닌 및 구아닌을 포함할 수 있다(Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry, at 793-800(Worth Pub. 1982) 참조, 이는 본원에 그 전체가 모든 목적상 참고문헌으로 편입됨). 본 발명은 어느 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 펩타이드 핵산 성분, 및 이들 염기의 메틸화된, 히드록시메틸화된 또는 글리코실화된 형태와 같이 이의 어느 화학적 변이체를 고려한다. 폴리머 또는 올리고머는 조성이 이종성 또는 동종성일 수 있으며, 자연적으로 발생되는 공급원으로부터 분리될 수 있거나 인위적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 또한, 핵산은 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 호모듀플렉스(homoduplex), 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 및 하이브리드 상태를 포함하여, 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 영구적으로 또는 과도적으로 존재할 수 있다.
표적화된 뉴클레오타이드 교환(TNE)은 염색체 또는 에피솜 유전자 내의 부위에 부분적으로 상보적인 합성 올리고 뉴클레오타이드가 특정 부위에서 단일 뉴클레오타이드의 역전을 지시하는 프로세스이다. TNE는 광범위하게 다양한 올리고뉴클레오타이드 및 표적을 사용하여 기술되었다. 보고된 올리고뉴클레오타이드의 일부는 RNA/DNA 키메라이며, 뉴클레아제 저항성을 부여하기 위한 말단 변형을 포함한다.
용어 "정렬('aligning' 및 'alignment')"은 동일하거나 유사한 뉴클레오타이드의 짧은 또는 긴 스트레치의 존재에 기초한 2개 이상의 뉴클레오타이드 서열의 비교를 의미한다. 뉴클레오타이드 서열의 정렬을 위한 몇 가지 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이하에서 더 설명될 것이다.
"서열 동일성(sequence identity)"은 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열의 동일성의 척도이다. 일반적으로, 서열은 가장 높은 서열 일치가 얻어지도록 정렬된다. "동일성(identity)" 그 자체는 당업계에 공지된 의미를 가지며, 공개된 기술을 이용하여 산출될 수 있다(참조 예, COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성을 측정하는 다수의 방법이 존재하지만, 용어 "동일성(identity)"은 숙련자에게 잘 알려져있다(Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073). 두 서열 간의 동일성 또는 유사성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 문헌 [GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073]에 개시된 방법을 포함한다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, GCS 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403)을 포함한다.
예시로서, 특정 서열의 폴리펩타이드를 코딩하는 레퍼런스 뉴클레오타이드 서열에 대해 적어도, 예를 들어 95% "동일성"을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 레퍼런스 폴리뉴클레오타이드 서열의 각 100 뉴클레오타이드 당 5개 까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고 레퍼런스 서열과 동일한 것을 의미한다. 따라서, 레퍼런스 핵산 서열에 대한 뉴클레오타이드 서열의 동일성의 백분율은 레퍼런스 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 즉, 레퍼런스 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 폴리 뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 레퍼런스 서열의 뉴클레오타이드의 최고 5%가 결실되고 그리고/또는 또 다른 뉴클레오타이드로 치환되고, 그리고/또는 레퍼런스 서열의 뉴클레오타이드의 총 뉴클레오타이드의 최고 5% 뉴클레오타이드의 수가 레퍼런스 서열에 삽입될 수 있다. 레퍼런스 서열의 이러한 돌연변이는 레퍼런스 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 레퍼런스 서열 내의 뉴클레오타이드 사이에 개별적으로 또는 레퍼런스 서열 내의 하나 이상의 인접한 그룹에서 산재된 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다.
유사하게, 레퍼런스 아미노산 서열과 적어도 예를 들어 95% "동일성"을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 레퍼런스 아미노산 서열의 각 100 아미노산 당 5개 까지의 변경을 포함할 수 있는 것을 제외하고 레퍼런스 서열과 동일한 것을 의미한다. 따라서, 레퍼런스 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열의 동일성의 백분율은 레퍼런스 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다. 즉, 레퍼런스 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 수득하기 위해, 레퍼런스 서열의 아미노산 잔기의 최고 5%가 결실되거나 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 레퍼런스 서열의 총 아미노산 잔기의 최고 5% 아미노산의 수가 레퍼런스 서열에 삽입될 수 있다. 레퍼런스 서열의 이러한 변경은 레퍼런스 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시-말단 위치에서 또는 레퍼런스 서열 내의 잔기 중에서 개별적으로 또는 레퍼런스 서열 내의 하나 이상의 연속적인 그룹에 산재된 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 발생할 수 있다.
용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 상호교환가능하게 사용되며 특정 작용 모드, 크기, 3차원 구조 또는 기원에 대한 레퍼런스와 관련없이 아미노산 사슬로 구성된 분자를 지칭한다. 따라서, 단백질의 "프래그먼트(fragment)" 또는 "부분(portion"은 여전히 "단백질"이라고 지칭될 수 있다. "분리된 단백질(isolated protein)"은 더 이상 자연 환경에 존재하지 않는 단백질, 예를 들어 시험관 내 또는 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포 내의 단백질을 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "트랜스제닉 식물(transgenic plant)"은 유전적 변형을 이용하여 유전자 물질이 변형된 식물, 식물 세포, 캘러스(callus), 식물 조직 또는 식물 일부를 지칭한다(예를 들어, 식물에 새로운 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한, 유전자 벡터 구조물을 이용한 트랜스펙션 또는 트랜스포매이션). 유전적 변형은 세포 또는 유기체 외부의 외인성 DNA 프래그먼트가 살아있는 세포의 게놈에 통합되는 프로세스이다. 이러한 통합은 안정적일 수 있다. 외인성 DNA 프래그먼트는, 예를 들어 20, 50, 100, 500, 1000, 5000 또는 10000 염기 쌍보다 클 수 있다. 유전적 변형에는 재조합 핵산(DNA 또는 RNA) 기술이 포함된다. 이는 종 경계를 넘어서 유전자 또는 유전자의 일부를 전달하고 트랜스제닉 세포와 유기체를 생성하는 것을 포함한다. 유전적 변형의 결과로서, 식물은 새로운 조합의 유전 물질, 예를 들어 관련이 없는 유기체로부터의 외래 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드가 식물 게놈에 첨가되거나, 또는 재조합 폴리뉴클레오타이드가 염색체 또는 안정한 엑스트라-염색체 요소에 통합되어 연속적인 세대로 전달된다.
본원에서 사용된 "비-트랜스제닉 식물(non-transgenic plant)"이란 용어는 관련이 없는 유기체로부터 유전 물질을 첨가하지 않고 유전자 구조가 변경되지 않았거나 변경된 식물을 지칭한다. 용어 "비-트랜스제닉 식물"은 또한 예를 들어 표적화된 뉴클레오타이드 교환(TNE) 기술을 사용하여 게놈 편집을 받은 식물을 포함한다.
"게놈 편집(genome editing)"은 돌연변이 유발 분자를 사용하여 하나 이상의 염기를 삽입, 치환 또는 제거함으로써 살아있는 세포의 게놈 DNA가 변경되는 프로세스이다. 삽입, 치환 또는 제거되는 염기의 수는, 예를 들어, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50 이상일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 유발 분자는 게놈의 미리 정의된 위치에서 특정 이중 가닥 브레이크(DSBs) 또는 단일 가닥 닉(niks)을 생성하기 위해 인위적으로 조작된 유전자 복구 올리고뉴클레오타이드 또는 엔도뉴클레아제일 수 있다. 브레이크 또는 닉은 미스매치 복구, 염기 절제 복구, 동종성 재조합 또는 비-동종성 말단 결합(NHEJ)의 자연적인 프로세스를 사용하여 세포 자체의 복구 기작에 의해 복구된다. 현재 다음과 같은 4 과의 가공된 뉴클레아제가 사용되고 있다: 징크 핑거 뉴클레아제(ZFNs), 전사 활성제-유사 효과 뉴클레아제(TALENs), CRISPR/Cas9 시스템, 및 가공된 호밍 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제. 게놈 편집은 또한 표적 뉴클레오타이드 교환(TNE)으로 지칭되는 올리고뉴클레오타이드(ODM)를 사용하는 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 유발에 의해 달성될 수 있다. 게놈 편집에는 부위-특이적 돌연변이 유발, 부위-특이적 유전자 추가 및 유전자 타겟팅이 포함된다. 게놈 편집은 외인성 DNA의 안정적인 도입을 포함하지 않는다.
단백질 또는 유전자(예, WRKY32)와 함께 본 발명의 내용에서 사용되는 "내인성(endogenous)"이라는 용어는 상기 단백질 또는 유전자(WRKY32)가 여전히 포함되어 있는 식물에서 기원한다는 것을 의미한다. 종종 내인성 유전자가 식물의 정상적인 유전적 컨텍스트에 존재할 것이다. 본 발명에서, 내인성 단백질 또는 유전자(예, WRKY32)는 표준 분자 생물학 방법, 예를 들어, 유전자 사일런싱, TNE 등을 사용하여 (식물 또는 식물 세포에서) 원 위치에서 변형될 수 있다.
"식물(plant)"이란 식물 전체 또는 식물로부터 획득가능한 세포, 조직 또는 기관과 같은 식물의 일부(예, 꽃가루, 종자, 생식세포(gamete), 뿌리, 잎, 꽃, 꽃 봉오리, 꽃밥, 과일 등)뿐만 아니라 자가 수정 또는 교잡(crossing)에 의해 이러한 식물로부터 유래된 이들 어느 것 및 자손의 유도체를 지칭한다. "식물 세포(들)(plant cell(s)"는 분리되거나 조직, 기관 또는 유기체 내에서 원형질체, 생식세포, 현탁 배양물, 미세포자, 꽃가루 알갱이 등을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "뿌리 줄기(rootstock)"는 새로운 지상 성장이 생성될 수 있는 식물의 일부분, 종종 지하 부분을 의미한다. 예를 들어, 이는 근경(rhizome) 또는 지하경(underground stem)을 칭할 수 있다. 접목시, 이는 이미 다른 식물의 절단 또는 새싹이 접목된, 확립되고 건강한 뿌리 시스템을 가지고 있는 식물, 때로는 단지 스텀프(stump)를 칭한다.
본원에서 언급된 "컨트롤 식물(control plant)"은 본원에서 교시된 방법에 적용된 식물과 동일한 종 및 바람직하게는 동일한 유전적 배경의 식물이며, 결과적으로 선충 저항성이 개선되거나 증가된다. 컨트롤 식물은 바람직하게 내인성, 기능성 WRKY32 유전자를 포함하고, 상기 유전자 및 상응하는 WRKY32 단백질을 발현하며, 바람직하게는 와일드 타입 식물이다. 컨트롤 식물은 선충 감염에 민감하거나, 선충 감염의 증상을 나타내거나, 또는 선충 감염에 대한 저항성이 낮다. 예를 들어, 선충(뿌리혹 또는 시스트 선충)이 성공적으로 침입하여, 스스로 확립하고 컨트롤 식물에서 발달할 수 있다.
"선충 저항성(nematode resistance)"은 중간 저항성 및 고 저항성 또는 하나 이상의 선충(예, 뿌리혹 또는 시스트 선충)에 대한 완전한 저항성을 포함하여, 다양한 수준의 선충 저항성 또는 식물 내성을 의미한다. 이는 동일한 질병 압력 하에서 성장할 때, 감수성 컨트롤 식물에서 나타나는 것들과 관하여, 질병을 일으키는 증상(예, 과민 반응(HR) 병변의 빈도 및/또는 크기 등)의 비교에 의해 측정되고 선택적으로 정량화될 수 있다. 이러한 질병 생물 검정은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 선충 저항성은 또한 질병 압력 하에서 성장할 때 감수성 식물에 비해 저항성 식물의 보다 높은 수율로서 간접적으로 측정될 수 있다.
"선충으로 인한 증상(nematode caused symptoms)"에는 피딩 사이트(feeding sites), 혹병(galls), 성장 둔화(retarded growth), 다른 병원균의 2차 감염의 플러스 기회, 영양소 회수 등과 같은 질병의 어느 증상을 포함한다.
"개선된 선충류 저항성(improved nematode resistance)"은 적절한 컨트롤 식물에 비해 식물 또는 식물 조직의 선충 저항성의 증가를 의미한다. 질적인 증가(예, 감수성에서 저항성으로)와 양적 증가 모두가 여기에 포함된다. 또한, 질병 발병률(식물이 감염되는 비율) 및/또는 질병 중증도의 감소가 포함된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 선충(예, 뿌리혹 및/또는 시스트 선충)에 대한 개선된 선충 저항성을 갖는 식물은, 질병 저항성을 평가하는 적절한 바이오어세이 및/또는 분야 분석을 이용하여, 컨트롤 식물보다 상기 선충에 대해 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 더 높은 수준의 저항성을 포함하는 식물이다. 예를 들어, 선충 감염에 반응하여 개발된 근류 선충병(root knots)의 수는 본원에서 교시된 식물 및 컨트롤 식물 모두에서 측정될 수 있으며, 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이 비교될 수 있다.
개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법
본 발명자들은 멜로이도긴(Meloidogyne) 선충 종들(예, 뿌리혹 또는 시스트 선충)에 의한 감염시 거대 세포에서 현저히 억제되거나 하향 조절되는 WRKY 상과, 보다 구체적으로는 WRKY32 유전자에 속하지만, 거대 세포보다 큰 감염된 뿌리 조직(예, 혹병(galls) 또는 감염된 뿌리 세그먼트)에서 변화가 없는 식물 유전자를 확인하였다. 놀랍게도, 이 유전자(WRKY32 유전자)의 발현이 유전자 사일런 싱(gene silencing)에 의해 기능적 WRKY32 단백질의 발현이 손상되는 경우에 변형되거나 손상되었을 때, 상기 식물에서 뿌리혹 또는 시스트 선충에 의해 야기된 질병 증상의 감소가 관찰된다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 예를 들어, RNAi-기반 트랜스포매이션을 사용하여 농작물(토마토 식물)에서 WRKY32 유전자(예, 토마토 상동성 서열(Solyc07g005650))의 발현을 녹 다운시키는 것은 감염의 수를 감소시키고, 그리고/또는 상기 농작물에서 뿌리혹 또는 시스트 선충에 의해 전형적으로 야기된 감염의 중증도를 감소시키는 것으로 놀랍게도 발견되었다.
제1견지로, 본 발명은 식물에서 내인성 WRKY32 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키거나 WRKY32 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계를 포함하는, 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
일 구현으로, 어느 WRKY32 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성 또는 어느 WRKY32 폴리뉴클레오타이드의 발현은 식물에 대한 개선된 또는 증가된 선충 저항성을 부여하도록 상기 WRKY32 폴리펩타이드 및/또는 WRKY32 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 어느 식물에서 손상될 수 있다.
본원에서 사용된 "WRKY32 폴리펩타이드 또는 단백질"이란 용어는 WRKY 폴리펩타이드 상과의 과 멤버인 폴리펩타이드를 지칭한다. WRKY32 단백질은 WRKY 폴리뉴클레오타이드 상과의 과 멤버인 WRKY32 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. WRKY32 폴리펩타이드는 그룹 I WRKY 폴리펩타이드 또는 단백질에 속한다. WRKY32 폴리펩타이드는 하나 이상의 유전자 상에 포함된 하나 이상의 W-박스(들)에 특이적으로 바인딩할 수 있는 2개의 WRKY 도메인을 포함하고, C2H2 모티프를 갖는 징크 핑거를 추가로 포함한다. WRKY32 단백질 또는 폴리펩타이드의 비-제한적 예로는 솔라나세아에(Solanaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함함), 브라시아세아에(Brassicaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 2), 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함함), 파바세아에(Fabaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함함), 로자세아에(Rosaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함함), 포아세아에(Poaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함함), 솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함함) 및 솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함함), 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) WRKY32 단백질(SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함함)을 포함한다.
본원에서 사용된 "솔라나세아에(Solanaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 솔라나세아에(Solanaceae) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 솔라나세아에(Solanaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 1) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 솔라나세아에(Solanaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "브라시아세아에(Brassicaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 브라시아세아에 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 브라시아세아에(Brassicaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(EQ ID NO: 2) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 브라시아세아에(Brassicaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 3) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "파바세아에(Fabaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 파바세아에(Fabaceae) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 파바세아에(Fabaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 4) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 파바세아에(Fabaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "로자세아에(Rosaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 로자세아에(Rosaceae) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 로자세아에(Rosaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 5) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 로자세아에(Rosaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "포아세아에(Poaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 포아세아에(Poaceae) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 포아세아에(Poaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 6) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 포아세아에(Poaceae) 과에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열"이란 용어는 모든 솔라넘(Solanum) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는 특정 WRKY32 단백질 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열(SEQ ID NO: 7) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 솔라넘(Solanum) 속(예, 솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum))에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현 및/또는 활성을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "솔라넘(Solanum) 컨센서스 코딩(cDNA) WRKY32 핵산 서열"이란 용어는 모든 솔라넘(Solanum) 종 중에서 고도로 보존되고 SEQ ID NO: 9의 핵산 서열을 가지며, 본원에 교시된 바와 같은 솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY 단백질 서열(SEQ ID NO: 7)을 갖는 특정 WRKY32 핵산 서열을 지칭한다. 일 구현으로, 솔라넘(Solanum) 컨센서스 코딩(cDNA) WRKY32 핵산 서열(SEQ ID NO: 9) 및 이의 변이체는 식물, 바람직하게는 솔라넘(Solanum) 속(예, 솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum))에 속하는 식물 종에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 (예를 들어, 식물에서 이의 발현을 변형시킴으로써) 사용될 수 있다.
다른 견지로, 본 발명은 컨트롤 식물에 비하여 개선되거나 증가된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함한다.
또 다른 견지에서, 본 발명은 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, 10, 11, 13 또는 14 중 어느 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 "폴리뉴클레오타이드 (유전자) 또는 폴리펩타이드 (단백질)의 발현을 손상시키는"이란 용어는 변형된 식물 또는 식물 세포에서 생산된 단백질(예, WRKY32) 또는 RNA(예, WRKY32 mRNA)의 수준이 적절한 컨트롤 식물 또는 식물 세포(예, 와일드 타입 식물 또는 식물 세포)에서 생산된 단백질 또는 유전자의 수준과 비교하여 감소된 상황을 지칭한다. 바람직하게, 유전자 또는 단백질(예, WRKY32)의 발현은 식물 또는 식물 세포에서 생산된 유전자 또는 단백질(예, WRKY32)의 수준이 컨트롤 식물에서 생산되는 유전자 또는 단백질(예, WRKY32 단백질)의 수준보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 더 낮은 경우에 손상된다. 대안적으로, 식물 또는 식물 세포에서 생산된 유전자 또는 단백질의 수준이 컨트롤 식물에서 생산되는 유전자 또는 단백질의 수준보다 통계적으로 유의하게 낮으면, 유전자 또는 단백질의 발현이 손상된다. 본 발명에 따른 "폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 손상"은 기능적 WRKY32 유전자(즉, mRNA) 또는 단백질 또는 이의 변이체의 부재 또는 감소된 존재를 나타낸다. 이는 예를 들어 WRKY32 단백질의 조절하에 있거나 WRKY32 단백질에 의해 조절되어 식물 생리학(예, 선충에 대한 저항성 증가)을 일으키는 하나 이상의 하류 유전자 및/또는 단백질의 발현을 억제 또는 방해할 수 있다. 당업자는 유전자 또는 단백질(예, WRKY32)의 발현이 손상되었는지 여부를 쉽게 확립할 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질의 활성을 손상시키는"(예, WRKY32 단백질)이란 용어는 예를 들어 프로모터 요소에 바인딩하여 리셉터에 바인딩하는 능력, 효소 반응을 촉매화하는 능력, 유전자 발현을 조절하는 능력 등과 같이, 단백질의 자연 활성이 컨트롤 식물에서 동일한 단백질의 활성과 비교하여 변경되거나 감소되거나 차단 또는 저해되는 상황을 칭한다. 바람직하게는, 식물 또는 식물 세포에서 생산된 단백질(예, WRKY32 단백질)의 활성이 컨트롤 식물에서 생산되는 동일한 단백질(예, WRKY 32 단백질)의 활성보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 또는 심지어 100% 더 낮은 경우에 손상되는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명에 따른 "단백질 또는 폴리펩타이드의 활성의 손상"은 기능적 WRKY32 단백질 및 이의 변이체의 부재 또는 감소된 활성을 나타내며, 예를 들어, WRKY32 단백질 또는 이의 변이체가 유전자 상의 W-박스에 바인딩할 수 없거나 또는 보다 적은 친화도 또는 효능으로 바인딩하거나, 또는 이의 컨트롤 또는 영향 하에서 상기 유전자(들)의 발현을 조절할 수 없거나 또는 보다 적은 정도로 조절하는 경우이다. 이는 예를 들어, WRKY32 단백질의 조절 하에 있거나 WRKY32 단백질에 의해 조절되어 식물 생리학(예, 선충에 대해 증가되거나 개선된 저항성)의 변화를 야기하는 하나 이상의 하류 유전자 및/또는 단백질의 발현을 억제 또는 방해할 수 있다. 당업자는 단백질(예를 들어, WRKY32)의 활성이 손상되었는지 여부를 용이하게 확립할 수 있다. 예를 들어, WRKY32 단백질 또는 이의 변이체가 W-박스에 바인딩하는 능력을 평가하거나 또는 WRKY32 단백질 또는 이의 변이체에 의해 조절되는 유전자의 발현 패턴에 손상된 WRKY32 단백질 활성의 하류 효과를 평가함으로써 확립될 수 있다. 본 발명에서, 손상된 또는 변형된 WRKY32 단백질은 그 활성이 이로부터 유도되는 내인성 WRKY32 단백질보다 현저히 낮은 경우에 내인성 WRKY32 단백질에 비해 손상된 활성을 나타내지만, 예를 들어, 상기 손상된 또는 변형된 WRKY32 단백질은 이로부터 유도되는 내인성 WRKY32 단백질의 특정 활성보다 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100% 더 낮은 경우에, 내인성 WRKY32 단백질, 바람직하게 이로부터 유도되는 내인성 WRKY32 단백질에 비해 손상된 활성을 나타낸다.
WRKY32 단백질 또는 상동 유전자(orthologues) 또는 돌연변이, 및 프래그먼트와 같은 이의 변이체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "기능 장애(dysfunctional)" 또는 "덜 기능적인(less functional)"은, 예를 들어, 선충(예, 뿌리혹 또는 시스트 선충) 감염에 민감한 식물에서 유전자(들)의 발현 수준을 손상(예, 사일런싱에 의해)시킴으로써 (양적 및/또는 질적) 선충 저항성을 증가시키거나 개선시키는 능력을 지칭한다. WRKY32 단백질 및 식물 종 X로부터 수득된 이의 변이체의 기능은 다양한 방법으로 시험할 수 있다. 바람직하게, 예를 들어 유전자 사일런싱 벡터를 이용하여, 식물 종 X에서 WRKY32 단백질을 코딩하는 유전자의 사일런싱(silencing) 또는 노크 아웃(knocking out)은 본원에 상세히 설명된 바와 같이 시험될 수 있는 개선된 선충 저항성을 유도할 것이다. 또한, 식물에서 기능적 WRKY32 단백질로 유전자의 녹아웃을 보완하면 선충 감염에 대한 민감성이 회복되거나 부여된다. 즉, 선충 감염에 대한 민감성이 상기 식물에서 회복될 것이다. 숙련자는 WRKY32 및 이의 변이체의 기능을 시험하는 데 어려움이 없을 것이다. 어느 기능적 또는 비-손상된 WRKY32 단백질의 부재 하에 식물에서 "기능 장애" 또는 "손상된" WRKY32 단백질의 발현은 상기 식물에 대한 개선된 선충 저항성을 부여할 것이며, 즉 식물은 선충 감염의 증상을 발달시키지 않거나 또는 내인성 WRKY32 단백질을 포함하는 컨트롤 식물과 비교하여 더 낮은 정도(예, 선충 감염의 경미한 징후)로 영향을 미칠 것이다.
본 발명은 추가로 컨트롤 식물에 비해 개선되거나 또는 증가된 선충 저항성을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, 예를 들어 WRKY32 유전자와 같이 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하여 변형된 폴리펩타이드를 코딩하는 변형된 폴리뉴클레오타이드를 수득하는 단계를 포함하며, 변형된 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드에 비해 손상된 활성을 나타낸다.
일 구현으로, 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열, 또는 EQ ID NO: 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 어느 아미노산 서열 또는 EQ ID NO: 8의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
일 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 폴리펩타이드는 WRKY32 과에 속하는 전사 인자 단백질이다. 따라서, 상기 폴리펩타이드는 본원에 교시된 그룹 I WRKY32 단백질의 특징, 즉 하나 이상의 유전자(들) 또는 폴리뉴클레오타이드 상에 포함된 하나 이상의 W-박스(들)에 특이적으로 바인딩할 수 있는 2개의 WRKY 도메인을 가지며, 그리고 C2H2 모티프를 갖는 징크 핑커를 추가로 포함한다.
따라서, 바람직한 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 WRKY32 폴리펩타이드는 2개의 WRKY 도메인을 포함하고 폴리뉴클레오타이드에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩할 수 있다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 폴리펩타이드는 토마토 WRKY32 폴리펩타이드이고, 바람직하게 상기 폴리펩타이드는 Solyc07g005650 폴리뉴클레오타이드 또는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열을 갖는 유전자에 의해 코딩된다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성 및/또는 본원에 교시된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드의 발현은 선충에 의해 전형적으로 감염되는 주요 영역을 나타내는 상기 식물의 뿌리에서 적어도 손상되며(예, 뿌리혹 또는 시스트 선충), 여기서 선충 감염의 증상(예, 골(galls) 또는 뿌리혹)은 일반적으로 가시적이거나 두드러진다.
일 구현으로, 본원에서 교시된 식물의 표현형은 컨트롤 식물과 비교하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물을 제외하고는 컨트롤 식물과 비교하여 변경되지 않는다. 예를 들어, 수율, 생식, 개화, 성장, 발달 등은 컨트롤 식물 또는 와일드 타입 식물, 바람직하게는 동일한 종의 컨트롤 식물 또는 와일드 타입 식물과 비교하여 본 발명에 따른 방법에 영향을 받지 않는다.
따라서, 일 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 방법은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 내인성 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 방법은 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일 구현으로, 이는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열 또는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 손상시키거나 변형시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에 교시된 바와 같은 방법에서, 내인성 WRKY32 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키거나 또는 식물에서 본원에 교시된 WRKY32 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 것은 어느 적합한 수단에 의해 달성될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 내인성 WRKY32 폴리뉴클레오타이드를 변형시켜 식물에서 내인성 WRKY32 폴리펩타이드와 비교하여 덜 기능적이거나 WRKY32 기능 또는 활성이 결여된 변형된 WRKY32 폴리펩타이드를 코딩함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 기능 또는 활성이 결여된 WRKY32 폴리펩타이드는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 상에 존재하는 W-박스에 바인딩하지 못하거나 또는 보다 적은 친화도 또는 효율성으로 바인딩하거나 또는 유전자 상에 포함된 W-박스에 바인딩하여, 이에 따라 선충에 의한 칩임을 전체적으로 방해(즉, 선충 저항성을 개선 또는 증가)함에도 불구하고, 상기 기능적으로 손상된 WRKY32 폴리펩타이드의 컨트롤 하류 또는 컨트롤 하에 상기 유전자(들)의 발현을 조절하거나 영향을 미치는데 실패하는 WRKY32 폴리펩타이드일 수 있다.
예를 들어, 일 구현으로, 교시된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 손상 또는 변형은 방사선 처리 또는 에틸 메탄설포네이트를 이용한 처리를 사용함으로써 수행될 수 있다. 다른 구현으로, 교시된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 손상시키거나 변형시키는 것은 식물 종자를 돌연변이화(예, EMS 돌연변이 유발), 식물 개체 또는 DNA의 풀링, 관심 부위의 PCR 증폭, 헤테로듀플렉스 형성 및 고-처리량 검출, 돌연변이 식물의 동정, 돌연변이 PCR 산물의 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 그러한 변형된 식물을 생성하기 위해 다른 돌연변이 유발 및 선별 방법이 동등하게 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 종자는 예를 들면 방사선 처리되거나 화학적으로 처리될 수 있으며, 식물은 개선된 선충 저항성 및/또는 HR 병변과 같은 변형된 표현형에 대해 스크리닝될 수 있다.
또 다른 구현으로, 상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현은 RNAi 및 VIGS를 포함하는 유전자 사일런싱 방법을 사용하여 손상될 수 있다.
일 구현으로, 교시된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 손상시키거나 변형시키는 것은 표적 돌연변이 유발 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 이러한 방법은 이에 한정하는 것은 아니나, 징크 핑거 뉴클레아제, Cas9-유사, Cas9/crRNA/tracrRNA 또는 Cas9/gRNA CRISPR 시스템을 사용하는 방법, 또는 WRKY32 유전자에 대한 서열 상보성을 갖는 돌연변이 유발을 향상시키기 위해 식물의 원형질체(예, KeyBase® 또는 TALENs)에 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 표적 돌연변이 유발 방법을 포함한다.
택일적으로 TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomics; McCallum et al., 2000, Nat Biotech 18:455, and McCallum et al. 2000, Plant Physiol. 123, 439-442, 모두 본원에 참고문헌으로 편입됨)과 같은 돌연변이 유발 시스템이, 상기 돌연변이 중 하나 이상을 갖는 및/또는 하나 이상의 선충에 대한 증가된 질병 저항성을 갖는 WRKY32 단백질을 코딩하는 WRKY32 유전자를 제공하는 식물 계통을 생성시키는데 사용될 수 있다. TILLING은 전통적인 화학적 돌연변이 유발(예, EMS 돌연변이 유발)에 이은 고처리량 돌연변이 스크리닝을 사용한다. 따라서, 하나 이상의 원하는 돌연변이를 갖는 WRKY32 유전자를 포함하는 식물, 종자 및 조직을 수득할 수 있다.
일 구현으로, 본원에 교시된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 손상시키거나 변형시키는 것은 상기 폴리뉴클레오타이드에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
본원에서 교시된 내인성 WRKY32 폴리펩타이드 또는 이의 변이체의 발현 및/또는 활성을 손상시키거나 또는 내인성 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변이체의 발현을 손상시키는 데 사용되는 임의의 수단은 기능적 돌연변이(예, 예를 들어 논센스 돌연변이를 도입하여 미성숙 정지 코돈을 생성하는 것과 같이, 단백질 또는 유전자 기능을 방해하거나 변경시키는 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 결실 또는 삽입 또는 치환 또는 점 돌연변이)를 일으키거나, 또는 기능의 손실(예를 들어, 유전자 사일런싱에 의한 자연 기능의 녹 아웃)을 일으킬 수 있는 것으로 이해된다. 숙련자는 핵산 서열 또는 아미노산 서열에서 기능적 돌연변이를 도입하여 생성된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 기능을 변경 또는 차단 또는 억제하는 방법을 잘 알고 있다.
일 구현으로, 본원에 교시된 식물은 어느 식물일 수 있다. 적합한 식물의 비제한적 예로는 솔라나세아에(Solanaceae) 과, 브라시아세아에(Brassicaceae) 과, 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 과, 파바세아에(Fabaceae) 과, 로자세아에(Rosaceae) 과, 포아세아에(Poaceae) 과, 또는 솔라넘(Solanum) 속에 속하는 어느 식물 종들을 포함한다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 식물은 솔라넘(Solanum) 속의 어느 식물 종일 수 있다. 추가의 바람직한 구현으로, 본원에 교시된 식물은 토마토 식물, 보다 바람직하게 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물일 수 있다. 놀랍게도 내인성 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 단백질(즉, SEQ ID NO: 8)의 발현 및/또는 활성 또는 내인성 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 유전자(EQ ID NO: 10 또는 11 또는 Solyc07g005650 유전자)의 발현을 손상시켜, 상기 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 토마토 식물에서 컨트롤 식물에 비해 선충(예, 뿌리혹 선충)에 대해 상기 식물에 현저히 보다 많은 저항성(선충 감염의 보다 적은 증상)을 생기게 하거나 부여하는 데 충분한 것으로 발견되었다.
일 구현으로, 본 발명의 방법은 하나 이상의 선충에 대한 개선된 저항성을 위해 자가 또는 교잡(crossing)에 의해 재생된 식물 또는 이로부터 유래된 식물을 스크리닝하는 단계 및 하나 이상의 상기 선충에 대해 개선되거나 증가된 저항성을 포함하는 식물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 견지로, 본 발명은 컨트롤 식물 또는 뿌리 줄기에 비하여 식물 또는 뿌리 줄기에서 선충 저항성을 개선시키는 방법에 관한 것으로, 상기 식물 또는 뿌리 줄기를, 상기 식물 또는 뿌리 줄기에서 WRKY32 단백질의 활성을 저해하는 하나 이상의 화합물로 식물 또는 뿌리 줄기를 처리하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법에 관한 것으로, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하거나, 또는 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함한다.
식물
또 다른 견지로, 본 발명은 또한 상기 방법 중 어느 하나에 의해 수득가능한 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기(rootstock)에 관한 것이다.
일 구현으로, 본 발명은 본원에 교시된 바와 같은 손상된 또는 변형된 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WRKY32 폴리펩타이드를 포함하는 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기에 관한 것이다.
일 구현으로, 본 발명은 또한 내인성 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 및/또는 내인성 WRKY32 폴리펩타이드의 발현이 본원에 교시된 바와 같이 변형된 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기에 관한 것이다.
상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 내인성 WRKY32 폴리뉴클레오타이드의 발현이 예를 들어, T-DNA 삽입에 의해 녹 아웃되는 어느 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기일 수 있으며, 또는 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 내인성 WRKY32 유전자의 발현이 예를 들어, RNAi를 이용하여 사일런싱되는 어느 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기일 수 있다.
일 구현으로, 상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 솔라나세아에(Solanaceae) 과, 브라시아세아에(Brassicaceae) 과, 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 과, 파바세아에(Fabaceae) 과, 로자세아에(Rosaceae) 과, 포아세아에(Poaceae) 과, 또는 솔라넘(Solanum) 속에 속하는 어느 식물 종들로부터 유래할 수 있다.
바람직하게는, 본원에 교시된 식물은 농작물 또는 재배된 식물, 즉 인간에 의해 경작되고 자란 식물 종이다. 농작물은 식량이나 사료용(예, 전작(field crops)), 또는 장식용(예, 절단용 꽃 생산, 잔디용 풀 등의 생산)으로 재배할 수 있다. 본원에 정의된 농작물은 또한 연료용 오일, 플라스틱 폴리머, 의약품, 코르크, 섬유(면과 같은) 등의 비-식품 제품이 수확되는 식물을 포함한다. 바람직하게, 본원에 교시된 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 농작물에서 유래한다.
일 구현으로, 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기일 수 있다. 예를 들어, 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 솔라넘(Solanum)(리코페시컴(lycopersicum) 포함), 니코티아나(Nicotiana), 캡시컴(Capsicum), 페튜니아(Petunia) 및 다른 속에 속할 수 있다. 다음 식물 종들을 적절하게 사용할 수 있다: 담배(니코티아나(Nicotiana) 종, 예, N. 벤타미아나(N. benthamiana), N. 플럼바기니폴리아(N. plumbaginifolia), N. 타바컴(N. tabacum) 등), 체리 토마토, 바르. 세라시포르메(var. cerasiforme) 또는 방울 토마토, 바르. 핌피넬리폴리움(var. pimpinellifolium) 또는 나무 토마토(S. 바타세움(S. betaceum), syn. 시포만드라 바타세아에(syn. Cyphomandra betaceae))와 같은 토마토(솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum)), 감자(솔라넘 터버로섬(Solanum tuberosum)), 가지(솔라넘 멜론게나(Solanum melongena)), 페피노(솔라넘 머리카텀(Solanum muricatum)), 코코나(cocona)(솔라넘 세실리플로럼(Solanum sessiliflorum)) 및 나랑히야(naranjilla)(솔라넘 퀴토엔세(Solanum quitoense)), 고추(peppers)(캡시컴 안눔(Capsicum annuum), 캡시컴 프루테센스(Capsicum frutescens), 캡시컴 바카텀(Capsicum baccatum))와 같은 채소 종, 장식용 종(ornamental species)(예, 페튜니아 히브리다(Petunia hybrida), 페튜니아 악실라리에스(Petunia axillaries), P. 인테그리폴리아(P. integrifolia)), 커피(코페아(Coffea)).
일 구현으로, 본원에 교시된 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 쿠쿠르비타세아에(Cucurbitaceae) 또는 그라미네아에(Gramineae)와 같은 어느 다른 과에 속할 수 있다. 적합한 숙주 식물은 예를 들어, 메이즈(maize)/옥수수(제아(Zea) 종), 밀(트리티컴(Triticum) 종), 보리(예, 호르데움 불가레(Hordeum vulgare), 귀리(예, 아베나 사티바(Avena sativa)), 수수(소르검 비컬러(Sorghum bicolor), 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale)), 대두(글리신(Glycine) 종 예, G. 맥스(G. max), 코튼(고시피움(Gossypium), 예, G. 히르서텀(G. hirsutum), G. 바르바덴세(G. barbadense)), 브라시카(Brassica) 종(예, B. 나퍼스(B. napus), B. 준세아(B. juncea), B. 올레라세아(B. oleracea), B. 라파(B. rapa) 등), 해바라기(헬리안터스 안너스(Helianthus annus)), 잇꽃, 얌, 카사바, 알팔파(메디카고 사티바(Medicago sativa), 쌀(오리자(Oryza) 종, 예, O. 사티바(O. sativa) 인디카 컬티바-그룹 또는 자포니카 컬티바-그룹), 벼과목초(forage grasses), 펄 밀렛(pearl millet)(페니세텀(Pennisetum) 종. 예, P. 글라우컴(P. glaucum), 수종(tree species)(피너스(Pinus), 포플러, 전나무, 질경이 등), 차, 커피, 야자 나무, 코코넛, 완두, 주키니(zucchini), 콩류(beans)(예, 파세올러스(Phaseolus) 종), 오이, 아티초크, 아스파라거스, 브로콜리, 마늘, 부추(leek), 양상추(lettuce), 양파, 무, 순무, 양배추(Brussels sprouts), 당근, 꽃양배추, 치커리, 샐러리, 시금치, 꽃상추, 회향, 근대(beet)와 같은 채소 종, 다육과 열매 식물(fleshy fruit bearing plants)(포도, 복숭아, 플럼스(plums), 딸기, 망고, 사과, 플럼(plum), 체리, 살구, 바나나, 블랙베리, 블루베리, 감귤류, 키위, 무화과, 레몬, 라임, 넥타린, 라즈베리, 수박, 오렌지, 자몽 등), 관상용 종(예, 장미(Rose), 페튜니아(Petunia), 크리산터멈(Chrysanthemum), 릴리(Lily), 거베라(Gerbera) 종), 허브(민트, 파슬리, 바질, 백리향 등), 우디 트리(예, 포풀러스(Populus), 살릭스(Salix), 퀘커스(Quercus), 유칼립투스(Eucalyptus)의 종), 섬유 종, 예, 아마(flax)(린넘 우시타티시멈(Linum usitatissimum) 및 대마(Cannabis sativa))를 포함한다.
일 구현으로, 상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 AT5G24910에서 T-DNA 삽입을 포함하는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기가 아니다. 또 다른 구현으로, 상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기가 아니다. 상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 변형된 내인성 WRKY32 유전자 또는 단백질에 대해 동형 접합성이거나 또는 이형 접합성일 수 있다.
바람직한 구현으로, 상기 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 솔라넘(Solanum) 속으로부터의 어느 식물 종일 수 있거나 이로부터 유래된 것일 수 있다. 추가의 바람직한 구현으로, 본원에서 교시된 바와 같은 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 및/또는 뿌리 줄기는 토마토 식물, 보다 바람직하게는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물일 수 있거나 또는 이로부터 유래된 것일 수 있다.
일 구현으로, 상기 식물은 본원에 교시된 바와 같은 손상되거나 변형된 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WRKY32 폴리펩타이드를 포함하는 뿌리 줄기를 포함하는 키메라(chimer) 식물이다. 바람직하게는 상기 키메라는 어느 다른 식물의 접순(scion), 바람직하게는 본원에 정의된 증가된 선충 저항성을 나타내지 않는 식물의 접순, 보다 바람직하게는 본원에 정의된 컨트롤 식물의 접순을 포함한다.
변형된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 토마토 식물
다른 견지로, 본 발명은 토마토 식물, 식물 부분, 뿌리 줄기, 종자 또는 세포에 관한 것으로, 여기서 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 내인성 폴리뉴클레오타이드의 발현이 손상된다. 바람직한 구현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 1, 8과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다.
일 구현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열 또는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일 구현으로, 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드에 삽입, 결실 또는 치환되고, 바람직하게는 하나 이상의 점 돌연변이가 상기 폴리뉴클레오타이드에 도입된다. 상기 폴리뉴클레오타이드에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드 또는 상기 점 돌연변이(들)의 상기 삽입, 결실 또는 치환은 기능적 효과를 가지거나 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 관련 폴리펩타이드(즉, WRKY32)의 기능 또는 생산의 상실을 변경 또는 차단 또는 저해하거나 유발할 수 있는 기능적 돌연변이인 것으로 이해된다.
본원에 교시된 바와 같은 토마토 식물, 식물 부분, 뿌리 줄기, 종자 또는 세포와 관련된 구현에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성이 손상된다. 바람직한 구현으로, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성 및/또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 뿌리에서 손상되지만, 새싹에 영향을 미치는 것을 피하기 위해 새싹에서는 손상되지 않는다.
본원에 교시된 바와 같은 토마토 식물, 식물 부분, 종자, 뿌리 줄기, 또는 세포와 관련된 구현에서, 폴리펩타이드는 WRKY32 과에 속하는 전사 인자 단백질이며, 2개의 WRKY 도메인을 포함하고, 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 상에 포함된 적어도 하나의 W-box에 특이적으로 바인딩할 수 있다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 토마토 식물, 식물 부분, 뿌리 줄기, 종자 또는 세포는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물, 식물 부분, 뿌리 줄기, 종자 또는 세포이다.
일 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성의 손상 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현의 손상은 개선된 선충 저항성을 제외하고 컨트롤 식물에 비해 상기 식물, 종자 또는 세포의 표현형을 변경시키지 않는다. 예를 들어, 성장, 발아 능력, 수확량, 발달, 물리적 속성 등은 변경되거나 변화되지 않는다.
일 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 토마토 식물, 또는 이의 종자 또는 세포로부터 유래된 식물은 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성, 바람직하게는 개선된 뿌리혹 선충 및/또는 시스트 선충 저항성을 나타낸다.
일 구현으로, 선충은 멜로이도긴(Meloidogyne) 헤테로데라(Heterodera) 또는 글로보데라(Globodera), 바람직하게는 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 자바니카(Meloidogyne javanica) 및 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis)로부터 선택될 수 있다.
다른 견지로, 본 발명은 본원에 교시된 바와 같은 토마토 식물의 뿌리 줄기 및 이식편(graft)의 성장 및 발달을 개선시키기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구현으로, 본원에 교시된 바와 같은 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 또는 뿌리 줄기는 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 또는 뿌리 줄기가 아니다. 즉, 어떠한 트랜스제닉 수단도 포함하지 않거나, 외래 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드가 식물, 식물 부분, 식물 세포, 종자 또는 뿌리 줄기의 게놈에 첨가되지 않는다.
일 구현으로, 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물은 본원에 교시된 바와 같은 손상되거나 변형된 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 및/또는 WRKY32 폴리펩타이드를 포함하는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 뿌리 줄기를 포함하는 키메라 식물이다. 바람직하게 상기 키메라는 어느 다른 식물의 접순(scion), 바람직하게는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물의 접순, 보다 바람직하게는 본원에 정의된 증가된 선충 저항성을 나타내지 않는 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물의 접순, 보다 바람직하게는 본원에 정의된 컨트롤 식물의 접순을 추가로 포함한다.
발명의 용도
다른 견지로, 본 발명은 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 15의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서 선충 저항성을 개선시키거나 증가시키기 위해 사용하는 용도에 관한 것이다.
바람직한 구현으로, 상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현으로, 상기 폴리펩타이드는 WRKY32 과의 전사 인자 단백질이며, 2개의 WRKY 도메인을 포함하며, 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드 상에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 특이적으로 바인딩할 수 있다.
일 구현으로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열 또는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
서열 목록
SEQ ID NO: 1
솔라나세아에(Solanaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 2
브라시아세아에(Brassicaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 3
쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 4
파바세아에(Fabaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 5
로자세아에(Rosaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 6
포아세아에(Poaceae) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 7
솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 8
솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 단백질 서열
SEQ ID NO: 9
솔라넘(Solanum) 컨센서스 WRKY32 코딩 핵산 서열
SEQ ID NO: 10
솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 게노믹 핵산 서열
SEQ ID NO: 11
솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 코딩 핵산 서열
SEQ ID NO: 12
솔라넘 리코페리시컴(Solanum lycopersicum) WRKY32 RNAi 서열
SEQ ID NO: 13
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) WRKY32 게노믹 핵산 서열
SEQ ID NO: 14
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 코딩 핵산 서열
SEQ ID NO: 15
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 단백질 서열
실시예
실시예 1
솔라넘 리코페리시컴(
Solanum lycopersicum
)에서 선충병 검사
토마토(S. 리코페리시컴(S. lycopersicum)) 식물에서 선충 저항성을 시험하기 위해, 우리는 Solyc07g005650 유전자에 의해 코딩된 WRKY32 단백질의 손상된 발현 또는 변형이 뿌리혹 선충 감염에 의한 질병 증상을 감소시키는지를 조사했다.
시험 그룹
Solyc07g005650 유전자의 감소된 발현이 선충 M. 인코그니타(M. incognita)가 토마토(S. 리코페리시컴(S. lycopersicum)) 식물을 감염시키는 능력에 미치는 효과를 시험하기 위해 실험을 수행하였으며, 여기서, S. 리코페리시컴(S. lycopersicum) 뿌리는 Solyc07g005650 유전자를 사일런싱하도록 고안된 RNAi 벡터 구조물로 트랜스펙션되었으며, 상기 RNAi는 서열을 갖는다.
CTGACATGCCAGTACCCAAAAAACGTCATGGTCCACCGAGTGCACCTCTTATTGCTGCTACTGCCCCTGCTTCCGTAACCACTATGCATGCTAACAAACCCGAACCCCTACAACATCAAAAATCGACCACACAATGGTCCGTGGACAAAGAAGGTGAGTTGACTGGTGAGAAATTGGATGTTGGAGGAGAAAAAGCAATGG
리조븀 리조제네스(Rhizobium rhizogenes)-매개 토마토 뿌리의 트랜스팩션은 동일한 플라스미드에서 DS-red(형광 마커로 사용됨)의 존재에 의해 시각적으로 도움을 받았다.
컨트롤 그룹
컨트롤 그룹은 벡터 구조물로 형질전환 되었으나 Solyc07g005650 유전자를 사일런싱하도록 고안된 RNAi가 없는 토마토(S. 리코페리시컴(S. lycopersicum)) 식물로 구성되었다.
상기 정의된 바와 같은 벡터 구조물을 이용한 성공적인 트랜스펙션 후, 두 실험 그룹(즉, 3주된 모래-재배 토마토 식물들)의 식물에 식물 당 500 J2s의 엠. 인코그니타(M. incognita)를 감염시켰다. 엠. 인코그니타(M. incognita)에 의한 토마토 뿌리의 감염이 감염 5주 후에 검출되었다.
엠. 인코그니타(M. incognita)에 의해 유발된 뿌리혹 선충의 수는 실험군(즉, 시험 그룹 및 컨트롤 그룹) 모두에서 검출되었다. 시험 그룹에서 성공적으로 트랜스펙션된 뿌리는 양안을 사용하여 뿌리에서 DS-적색 형광의 존재를 검출함으로써 확인되었다(도 1의 빗금친 막대 참조). 시험 그룹에서 성공적으로 트랜스펙션되지 않은 뿌리는 DS-적색 형광 신호를 나타내지 않았다(도 1의 검은 색 막대 참조). 이러한 뿌리는 시험 그룹 식물에서 '인터널 컨트롤(internal control)'로 제공되었다.
형성된 뿌리혹 선충의 수는 또한 컨트롤 식물, 즉 상기와 동일한 절차를 사용하여 컨트롤 벡터로 트랜스펙션된(즉, Solyc07g005650 유전자를 사일런싱하도록 고안된 RNAi가 결핍된) 식물에서 검출되었다. 각 실험 그룹에 대해 얻어진 결과를 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 시험 그룹(WRKY32 사일런싱됨)에서 성공적으로 트랜스펙션된 뿌리(즉, DS-적색 형광 신호를 나타냄)는 트랜스펙션되지 않은 뿌리(즉, DS-적색 형광 신호를 나타내지 않음)에 비해 약 90% 더 적은 질병 증상(뿌리혹 선충)을 나타내었다. 또한, 시험 그룹에서 트랜스펙션되지 않은 뿌리에서 형성된 뿌리혹 선충의 수는 컨트롤 그룹 식물들(즉, 트랜스펙션된 뿌리 및 트랜스펙션되지 않은 뿌리 모두)의 뿌리혹 선충의 수와 유사안 것으로 관찰되었다. 또한, 시험 그룹의 식물은 컨트롤 그룹의 식물보다 선충 저항성이 개선되거나 더 큰 것으로 나타났다(도 1의 빗금친 막대 참조).
컨트롤 그룹에서, 트랜스펙션된 뿌리와 트랜스펙션되지 않은 뿌리에서의 뿌리혹 선충의 수에 유의한 차이가 없었다.
전체적으로, 이들 결과는 토마토(S. 리코페리시컴(S. lycopersicum)) 식물에서 내인성 WRKY32 유전자(Solyc07g005650 유전자)의 발현을 손상(즉, 사일런싱시킴으로써)시키는 것은 컨트롤 식물에 비해 선충에 대한 증가되거나 개선된 저항성을 일으키는 것을 나타낸다.
실시예 2
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서의 뿌리혹 선충 질병 검사
아라비돕시스(Arabidopsis) A. 탈리아나(A. thaliana) 식물에서 선충 저항성을 시험하기 위해, 우리는 At4g30935 유전자에 의해 코딩된 WRKY32 단백질의 손상된 발현 또는 변형이 뿌리혹 선충(멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita)) 감염에 의한 질병 증상을 감소시키는지 조사하였다.
시험 그룹
선충 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita)의 A. 탈리아나(A. thaliana) 식물을 인페스트(infest)시키는 능력에 대해 At4g30935 유전자(SEQ ID NO: 13은 게노믹 서열을 나타내고; SEQ ID NO: 14는 그 코딩 서열을 나타내며; SEQ ID NO: 15는 그 단백질 서열을 나타낸다)의 손상된 발현의 영향을 평가하기 위해, 실험을 수행하였으며, 여기서 6-웰 세포 배양 플레이트에서 멸균 MS20/Gelrite 배지 상에 성장된 T-DNA 삽입을 함유하는 A. 탈리아나(A. thaliana) 돌연변이주(SALK_091352; Alonso et al, 2003, Science)의 10-일령 식물에 식물 당 200 멸균 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita) 감염성 주비나일(juveniles)(J2s)을 접종하였다.
컨트롤 그룹
컨트롤 그룹은 A. 탈리아나(A. thaliana) Col-0 와일드 타입 식물, 생태형으로 구성되어 있으며, 이는 공개적으로 이용가능한 삽입 돌연변이체 집합을 생성하기 위한 백그라운드로서 사용되었다(Alonso et al, 2003, Science). 6-웰 세포 배양 플레이트에서 멸균 MS20/Gelrite 배지에서 성장된 10-일령 식물에 식물 당 200 멸균 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita) 감염성 주비나일(juveniles)(J2s)을 접종하였다.
선충 접종 5주 후에, 실험 그룹(즉, 시험 그룹 및 컨트롤 그룹) 모두에서 식물 당 M. 인코그니타(M. incognita)에 의해 유발된 뿌리혹 선충의 총 수를 측정하였다. 도 2는 시험 그룹(WRKY32 유전자 파괴)에서 뿌리가 컨트롤 그룹(컨트롤)의 뿌리에 비해 평균 약 15% 적은 뿌리혹 선충을 나타냈다는 것을 보여준다. 또한 시험 그룹의 뿌리 시스템의 크기가 컨트롤 뿌리의 뿌리 시스템 크기와 유사하다는 것이 관찰되었다.
전반적으로, 이러한 결과는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 At4g30935 유전자의 발현을 녹아웃하면 컨트롤 식물에 비해서 뿌리혹 선충에 대한 저항성이 개선되었음을 나타낸다.
실시예 3
아라비돕시스 탈리아나(
Arabidopsis thaliana
)에서 비트-시스트 선충(
beet-cyst nematode) 질병 검사
아라비돕시스(Arabidopsis)(A. 탈리아나(A. thaliana)) 식물에서 선충 저항성을 시험하기 위해, 우리는 At4g30935 유전자에 의해 코딩된 WRKY32 단백질의 손상된 발현 또는 변형이 비트 시스트 선충(헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii)) 감염에 의한 질병 증상을 감소시키는지를 조사하였다.
시험 그룹
A. 탈리아나(A. thaliana) 식물을 감염시키는 선충 헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii)의 능력에 대한 At4g30935 유전자의 손상된 발현의 영향을 평가하기 위하여, 6-웰 세포 배양 플레이트에서 멸균 KNOP/Daichin 아가 배지에서 성장된, At4g30935 유전자에 T-DNA 삽입을 함유하는 A. 탈리아나(A. thaliana) 돌연변이주(SALK_091352; Alonso et al, 2003, Science)의 10-일령 식물에 식물 당 150 멸균 H. 스카츠티(H. schachtii) 감염성 주비나일(juveniles)(J2s)을 접종하였다.
컨트롤 그룹
컨트롤 그룹은 A. 탈리아나(A. thaliana) Col-0 와일드 타입 식물, 생태형으로 구성되어 있으며, 이는 공개적으로 이용가능한 삽입 돌연변이체 집합을 생성하기 위한 백그라운드로서 사용되었다(Alonso et al, 2003, Science). 6-웰 세포 배양 플레이트에서 멸균 KNOP/Daichin 배지에서 성장된 10-일령 식물에 식물 당 150 멸균 H. 스카츠티(H. schachtii)(IRS) 감염성 주비나일(juveniles)(J2s)을 접종하였다.
선충을 접종한 지 2주 후에, 실험 그룹(즉, 시험 그룹 및 컨트롤 그룹) 모두에서 각 식물 당 성장한 H. 스카츠티(H. schachtii) 암컷의 총 수가 검출되었다. 도 3은 시험 그룹(WRKY32 유전자 파괴)에서 뿌리가 컨트롤 그룹(컨트롤)의 뿌리에 비해 평균 약 51% 더 적은 암컷의 발생을 지지한다는 것을 보여준다. 또한 시험 그룹의 뿌리 시스템의 크기가 컨트롤 뿌리의 뿌리 시스템 크기와 유사하다는 것이 관찰되었다.
전반적으로, 이러한 결과는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 At4g30935 유전자의 발현을 녹아웃하면 컨트롤 식물에 비해서 비트 시스트 선충에 대한 저항성이 개선되었음을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING
<110> Keygene N.V.
<120> Nematode Resistance
<130> P6069727PCT
<150> NL2016980
<151> 2016-06-16
<150> US62/351,055
<151> 2016-06-16
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<170> PatentIn version 3.5
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Met Asp Asp Glu Asn Glu Ser Ser Lys Ser Ala Gly Leu Lys Asn Ser
1 5 10 15
Asn Leu Glu Glu Xaa Glu Asp Lys Ile Ser Asn Lys Ile Glu Asn Ser
20 25 30
Ser Val His Asn Asp Asp Asn Gly Asp Asp Arg Val Ile Asp Gly Ser
35 40 45
Ser Gly Ala Glu Ser Leu Arg Glu Ser Lys Thr Glu Ala Leu Ile Ser
50 55 60
Glu Thr Leu Ala His Pro Asn Ala Glu Ser Ser Val Gln Ile Glu Ile
65 70 75 80
Asp Gly Gln Ser Glu Phe Asp Ser Glu Phe Ser Pro Ser Tyr Gln Leu
85 90 95
Ser Glu Val Pro Val Glu Tyr Glu Leu Pro Ser Phe Gly Phe Ser Glu
100 105 110
Lys Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Thr Lys Pro Gly Thr Leu Asn Ala
115 120 125
Gln Ala Arg Thr Glu His Gln Arg Arg Val Pro Asp Ala Ala Ser Ser
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Leu Glu Leu Ser Ser Leu Ser Val Ala Gln Ser Ile Ser Ser Val Pro
145 150 155 160
Ser Ala Thr Leu Ala Glu Arg Arg Ser Ala Ala Ala Val Asn Cys Ser
165 170 175
Thr Gly Glu Val Val Lys Gln Ser Ser Asp Ala Gln Val Leu Xaa Leu
180 185 190
Val Pro Val Leu Lys Arg Pro Thr Arg Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys
195 200 205
Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Ser Pro Gln Gly Ser Arg Ser Tyr Tyr
210 215 220
Arg Cys Thr His Ser Glu Cys Cys Ala Lys Lys Ile Glu Cys Ser Asp
225 230 235 240
His Thr Asn Arg Val Met Glu Ile Ile Tyr Arg Thr Gln His Asn His
245 250 255
Asp Pro Pro Pro Arg Val Asn Cys Xaa Arg Glu Ser Lys Ser Ala Val
260 265 270
Leu Ser Ser Pro Thr Asn Gly Lys Ser Ile Ile Ala His Pro Xaa Arg
275 280 285
Asn Ser Ile Glu Thr Val Val Ser Ser Leu Lys Glu Asn Leu Gln Glu
290 295 300
Ser Leu Pro Ile Ala Glu Thr Ala Asn Gln Asp Ser Gly Gly Ser Asp
305 310 315 320
Thr Asp Thr Glu Ile Thr Ile Arg Glu Glu His Arg Asp Glu Xaa Gly
325 330 335
Gln Lys Lys Arg Ser Arg Lys Ser Asp Xaa Ser Cys Xaa Glu Ser Val
340 345 350
Ser Lys Pro Gly Lys Lys Pro Lys Leu Val Val His Ala Ala Cys Asp
355 360 365
Val Gly Ile Ser Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys
370 375 380
Met Val Lys Gly Asn Pro His Pro Arg Asn Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser
385 390 395 400
Ala Gly Cys Pro Val Arg Lys His Ile Glu Arg Val Val Asp Thr Thr
405 410 415
Ser Ala Leu Thr Ile Thr Tyr Lys Gly Val His Asp His Asp Met Pro
420 425 430
Val Pro Lys Lys Arg His Gly Pro Pro Ser Ala Pro Leu Ile Ala Ala
435 440 445
Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Asn Met His Ala Asn Lys Pro Glu Pro
450 455 460
Leu Gln His Gln Lys Ser Thr Thr Gln Trp Ser Val Asp Lys Glu Gly
465 470 475 480
Glu Leu Thr Gly Glu Lys Leu Asp Val Gly Gly Glu Lys Ala Met Glu
485 490 495
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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515 520 525
Gln Thr Leu Leu Ser Ile Lys Thr Asn Pro Asp Asp Met Lys Asn Ser
530 535 540
Leu Leu Lys Asp Thr Ser Ala Val Val Pro Val Gln Asn Asn
545 550 555
<210> 7
<211> 511
<212> PRT
<213> Solanum
<400> 7
Met Asp Asp Glu Asn Glu Ser Ser Lys Ser Thr Gly Leu Lys Asn Ser
1 5 10 15
Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asp Lys Ile Ser Asn Lys Ile Glu Asn Ser
20 25 30
Ser Val His Asn Asp Asp Asn Gly Asp Asp Arg Val Ile Asp Gly Ser
35 40 45
Ser Gly Ala Glu Ser Leu Arg Glu Ser Lys Thr Glu Ala Leu Ile Ser
50 55 60
Glu Thr Leu Ala His Pro Asn Ala Glu Ser Ser Val Gln Ile Glu Ile
65 70 75 80
Asp Gly Gln Ser Glu Phe Asp Ser Glu Phe Ser Pro Ser Tyr Gln Leu
85 90 95
Ser Glu Val Pro Val Glu Tyr Glu Leu Pro Ser Phe Gly Phe Ser Glu
100 105 110
Lys Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Thr Lys Pro Gly Thr Leu Asn Ala
115 120 125
Gln Ala Arg Thr Glu His Gln Arg Arg Val Pro Asp Ala Ala Ser Ser
130 135 140
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Ser Val Ala Gln Ser Ile Ser Ser Val Pro
145 150 155 160
Ser Ala Thr Leu Ala Glu Arg Arg Ser Ala Ala Ala Val Asn Cys Ser
165 170 175
Thr Gly Glu Val Val Lys Gln Ser Ser Asp Ala Gln Val Leu Ala Leu
180 185 190
Val Pro Val Leu Lys Arg Pro Thr Arg Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys
195 200 205
Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Ser Pro Gln Gly Ser Arg Ser Tyr Tyr
210 215 220
Arg Cys Thr His Ser Glu Cys Cys Ala Lys Lys Ile Glu Cys Ser Asp
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His Thr Asn Arg Val Met Glu Ile Ile Tyr Arg Thr Gln His Asn His
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Asp Pro Pro Pro Arg Val Asn Cys Pro Arg Glu Ser Lys Ser Ala Leu
260 265 270
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275 280 285
Asn Ser Ile Glu Thr Val Val Ser Ser Leu Lys Glu Asn Leu Gln Glu
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Ser Leu Pro Ile Ala Glu Thr Ala Asn Gln Asp Ser Gly Gly Ser Asp
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Thr Asp Thr Glu Ile Thr Ile Arg Glu Glu His Arg Asp Glu Ala Gly
325 330 335
Gln Lys Lys Arg Ser Arg Lys Ser Asp Thr Ser Cys Leu Glu Ser Val
340 345 350
Ser Lys Pro Gly Lys Lys Pro Lys Leu Val Val His Ala Ala Cys Asp
355 360 365
Val Gly Ile Ser Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys
370 375 380
Met Val Lys Gly Asn Pro His Pro Arg Asn Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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<212> PRT
<213> Solanum lycopersicum
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Cys
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<212> DNA
<213> Solanum
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gaagacaaaa tcagcaacaa aatcgaaaat tcctccgtac acaacgacga caacggtgac 120
gatagagtaa ttgacggtag cagtggagct gagagtttac gagaatcaaa gacggaagct 180
ttaatttcag aaaccctagc tcatcctaat gcagaatcat ccgtacaaat tgaaattgat 240
ggccaatccg aattcgattc agagttttct ccctcttatc aactttctga agtaccagtg 300
gaatatgaac tgccctcgtt tggtttctcg gaaaaaatca aggatagaat tagtgttacc 360
aaacctggaa ctttgaatgc tcaagcacga acagaacatc aacgacgtgt tcctgatgca 420
gcatcctcat tggagctgtc ctctttatct gttgcacagt ccatttcatc agtgccaagt 480
gcaactctag cagaaagacg atcagcagca gcagtaaatt gtagtacagg agaagtggtt 540
aagcagagtt ctgacgccca ggttctagct cttgtaccag ttctaaagag accaactcgc 600
gatgggtaca attggcggaa gtatggtcaa aagcaagtta aaagtcctca aggttctcga 660
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gtaaattgcc caagggaaag caagtctgca ttattgtctt cacctaccaa tggcaaaagt 840
ataatagctc atccaagtag aaattctatt gagaccgtag tatcctcctt aaaagaaaat 900
ttgcaagaaa gtttaccaat tgctgagaca gcaaatcagg attccggtgg gtctgacact 960
gacactgaaa tcactattag agaggagcac cgtgacgagg ctggacaaaa gaagaggtca 1020
aggaaaagtg acacaagttg tttggaatct gtttctaaac ctggaaagaa acccaagctt 1080
gtggtgcatg ctgcttgtga tgtaggaatc tcaagtgatg gctacagatg gcgaaagtat 1140
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ggatgtcctg ttcgaaagca cattgagagg gttgtagata ccacaagtgc tttaacaata 1260
acatacaagg gagtacacga tcatgacatg ccagtaccca aaaaacgtca tggtccaccg 1320
agtgcacctc ttattgctgc tactgcccct gcttccgtaa ccaatatgca tgctaacaaa 1380
cccgaaccgc tacaacatca aaaatcgacc acacaatggt ccgtggacaa agaaggtgag 1440
ttgactggtg agaaattgga tgttggagga gaaaaagcaa tggaatcggc tcgaactctg 1500
ttgagtattg gatttgaaat taagccttgc taa 1533
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<212> DNA
<213> Solanum lycopersicum
<400> 10
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ttcagaaacc ctagctcatc ctaatgcaga atcatccgta caaattgaaa ttgatggcca 300
atccgaattc gattcagagt tttctccctc ttatcaactt tctggtacta ttcaatgccg 360
tttaattcgt tcttatgctt tttttttgtg tgtgaaattg agtagttcat gtttcatttt 420
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aaggacacat ttttattatt tagtaacaac ttaatgttaa gatatatctt cacccttagt 660
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attttgtctc tgctgggaat tgaacgtgag attttacgat gcttaacatc ttcattgacg 780
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taaatagttg atgattgttc aaatagaaaa ggaaaacacc tcaactatca tttgtgagtc 1020
tcatggtcaa ggtgtgtttt atactaacgg acatacacgt gttataatat tatccaccga 1080
cttgacattt ataaaatatt agatcgataa tgaagattgt gccacgtgtc cctgtaagta 1140
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taataaatac ttggtggtag tttacgtaga aaaagtgaac accgaatagt tcatataggg 1260
aatttgcaaa aagatcttca ggtgcgtttg gccattatat ctaggaggca agtccttttg 1320
attttatatt tttgtgtaag agagattatg atcatgagtt ctccttatca aaaagaaata 1380
aattatgatc atgagtttta tgagttttta agtagaaaaa gggaataagt tatacttgag 1440
gtgtgttttg acaaatagtc gttaatagat cagataggaa aactgaacat ctaatagttc 1500
atataggaaa cttgcaaaaa tgtgatactt cacgtgtatt ttgaccatta tatctggaat 1560
gtaagtcctt ttgagttgta catgcatgct taattgtcta cgaaaattct gtaattattg 1620
tgttgaataa tctggcagaa gtaccagtgg aatatgaact gccctcgttt ggtttctcgg 1680
aaaaaatcaa ggtatgcagt tcctttcttt tgacttggta tttaattttg ttatgatagt 1740
ttatctattt cgagatgtgg gagatggttg agtggattcg atgtggtagc atattcttat 1800
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gttatgttgt tgtattttaa taagttagtt tttcaattat cttgttacta taatcatagg 1920
tgtcaatgta tctgaatagt acttactcaa aaaagaaaaa acaagtagtg tatttgaatg 1980
gtagcacaga gatactgagg taatttacga taggggtgga caacatgcgc aagtagaaaa 2040
ttcaaggtga ttgctctgtc actatttgga gttttggacc ggagagctcg ctgctttttt 2100
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ttaagtgtca gtataaatcg agccaaaaat ttctgcaata taaatcactg aggtttctgg 2220
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tataagggtc tgatttaaat gtagtaaccc catcatattt atgaagcctc taagaacagt 2640
gttttgggaa gcgagaagcg gaaaaaagcg atgagggttc gctttacaga aggcgatatt 2700
tagtataaaa ataaaattat ataaattaac tgaatagagg taatatattc ttagattata 2760
agaaaataga tagtcaataa tacttataag tcataacata taaagcaaaa aaatcaaaaa 2820
cataattaaa tcacaaagaa tcaaactcct actcttcaac aagatcctca aactctttaa 2880
aatgcagcaa taaaaatata aaaaaacacc cagcagtaac caaaaaaaaa aacaagtagc 2940
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cagcaaccaa ccaaaaagag tatgaagaag agaagaagaa gagaacttgc ataaaaaaaa 3060
gtctgaagaa gagaagaaga agagaacttg cataaaaaaa agtctgaaga agagaagaag 3120
aagagaactt gcataaaaaa aagtctgaag aagagaagca gtcgcagctg tgagtgaagt 3180
cgcgacagat ggaaagagta tgtgaagtcg catatctttc tgaaattaaa aaaaaaaact 3240
tacaattttt ttggaaaaaa aacataaggg gcgcttttta tgctttatcg cgctttcgtt 3300
tttctggcgc ttctcgcttc tacagtagaa gcgagcgcct tttcaatgtc accttgcctc 3360
aggagctaaa agcgcaagag catcgcctca ctttaagcgc gcttttcaca acactgtcta 3420
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cgaacttgtg acttaaccgg gggcgggtgg tggtggaaag gggactatat cattactata 3540
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gggtgcaaac cttggagaat accagtagag acaaaaaaac actaggtgtt ttcccatctg 3660
tctgagcctt agggttatag ttatccggta ctcatgttgg tggataatac tcaagtagca 3720
ggtaccgctt gaggaatcat catgatcctt tagttttgga taaattgaaa gcagatgcaa 3780
gaaaccttaa caattgtcat atggtgacca tcacatggcc actctaactc ataatatctc 3840
atattgcaac attatttttg acgtgatgct ataaataatt aatagtccaa ttatgtttgt 3900
aggttaatac attacatttt ccagagtatc tggtttcgac ttttctgttt ataataatgt 3960
tttacttttt actgaaaagt ttatacagaa ttgctggaac tggatatgta tatttgtggg 4020
atggaacaaa tgagtcattt catgttgtat gcaggataga attagtgtta ccaaacctgg 4080
aactttgaat gctcaagcac gaacagaaca tcaacgacgt gttcctgatg cagcatcctc 4140
attggagctg tcctctttat ctgttgcaca gtccatttca tcagtgccaa gtgcaactct 4200
agcagaaaga cgatcagcag cagcagtaaa ttgtagtaca ggagaagtgg ttaagcagag 4260
ttctgacgcc caggttctag ctcttgtacc agttctaaag agaccaactc gcgatgggta 4320
caattggcgg aagtatggtc aaaagcaagt taaaagtcct caaggttctc gaagttatta 4380
ccgatgcact cattctgagt gttgtgccaa gaagattgag tgctctgatc acactaatcg 4440
tgttatggag attatttata gaactcaaca caatcatgat ccacccccaa gagtaaattg 4500
cccaagggaa agcaagtctg cattattgtc ttcacctacc aatggcaaaa gtataatagc 4560
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aatcactatt agagaggagc accgtgacga ggctggacaa aagaagaggc aagttcactt 4740
ttgtattcaa ttttagttat tttatttttc tgcttttcct cttacaaatg ttcaaaacca 4800
tatgattgat caccattctc acctatgatt ttcaggtcaa ggaaaagtga cacaagttgt 4860
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tctgcctgcc ttacgctgaa attataagaa ctaggaggga gtgatgccac attaaacaca 5100
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gtattggatt tgaaattaag ccttgctaaa attgcttagc tgctctgatt ttattttttt 6000
ctgcatttat ttagttttcc tccatagggc tttcttgtag aagtttagaa gagtacacct 6060
ttttttttat agtcctccaa tatatagatg gtctatactc agttatgtac attattgtgg 6120
atcaaaataa gtaacataga acttagaata acatattgtg atgtttgtca atttgcatct 6180
gtttc 6185
<210> 11
<211> 1542
<212> DNA
<213> Solanum lycopersicum
<400> 11
atggatgacg aaaacgagag ctccaaatca gccggactca aaaattcaaa tctagaagaa 60
gaagaagaag ataaaatcag caacaaaatc gaaaattcct ccgtacacaa cgacgaaaac 120
ggtgacgacg atagagtaat tgacggtagc agtggagctg agagtttacg agaatcaaag 180
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agtgttacca aacctggaac tttgaatgct caagcacgaa cagaacatca acgacgtgtt 420
cctgatgcag catcctcatt ggagctgtcc tctttatctg ttgcacagtc catttcatca 480
gtgccaagtg caactctagc agaaagacga tcagcagcag cagtaaattg tagtacagga 540
gaagtggtta agcagagttc tgacgcccag gttctagctc ttgtaccagt tctaaagaga 600
ccaactcgcg atgggtacaa ttggcggaag tatggtcaaa agcaagttaa aagtcctcaa 660
ggttctcgaa gttattaccg atgcactcat tctgagtgtt gtgccaagaa gattgagtgc 720
tctgatcaca ctaatcgtgt tatggagatt atttatagaa ctcaacacaa tcatgatcca 780
cccccaagag taaattgccc aagggaaagc aagtctgcat tattgtcttc acctaccaat 840
ggcaaaagta taatagctca tccaaggaga aattctattg agaccgtagt atccccctta 900
aatgaaaatt tgcaagaaag tttaccaatt gctgagacag caaatcagga ttcaggtggg 960
tctgacactg acactgaaat cactattaga gaggagcacc gtgacgaggc tggacaaaag 1020
aagaggtcaa ggaaaagtga cacaagttgt ttggaatctg tttctaaacc tggaaagaaa 1080
cccaagcttg tggtgcatgc tgcttgtgat gtaggaatct caagtgatgg ctacagatgg 1140
cgaaagtatg gacaaaaaat agtgaaggga aatccccatc caaggaacta ctatcgctgt 1200
acatcagctg gatgtcccgt tcgaaagcac attgagaggg ttttagatac cacaagtgct 1260
ttaacaataa catacaaggg agtacacgat catgacatgc cagtacccaa aaaacgtcat 1320
ggtccaccga gtgcacctct tattgctgct actgcccctg cttccgtaac cactatgcat 1380
gctaacaaac ccgaacccct acaacatcaa aaatcgacca cacaatggtc cgtggacaaa 1440
gaaggtgagt tgactggtga gaaattggat gttggaggag aaaaagcaat ggaatcggct 1500
cgaactctat tgagtattgg atttgaaatt aagccttgct aa 1542
<210> 12
<211> 201
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> WRKY32 RNAi encoding sequence
<400> 12
ctgacatgcc agtacccaaa aaacgtcatg gtccaccgag tgcacctctt attgctgcta 60
ctgcccctgc ttccgtaacc actatgcatg ctaacaaacc cgaaccccta caacatcaaa 120
aatcgaccac acaatggtcc gtggacaaag aaggtgagtt gactggtgag aaattggatg 180
ttggaggaga aaaagcaatg g 201
<210> 13
<211> 2229
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 13
ttttcttccg gagatcagtc ggtcggaaag cggctacctt tttgtctgcc tagagaattt 60
gttcgtttct ttcttttact ctcttcagac aaaacccacg agatacagaa aaagaggaca 120
agagagaatc gtccatggaa gaagacactg gtatcgacga agctaagaca tacacggtgg 180
agaagagcga gaaagtggag ccggagaagg acggactgag tcaattcaga gacgaggaaa 240
aatcacttgg tgcggatatg gaagatttac atgatgagac tgtgcgagaa accctaggca 300
aggatcaggt tcaaggtaac ggtttattct gcgcaaaatt ctttattggt ttttatttat 360
ttattcgaga ctttattttt tgacgaaatg atgtttgagt ttaccaggtg ttcgagaaaa 420
ttcctctgtg gaaccaaatg ttgaagatgt attagaagtg aatgtgagtt tgcttcagac 480
tcttctgcta ttcataaact ttcttaacac ttacaacttt gattctctca ttaacattga 540
ttgtgctaga acttgtaaag tttaactcat ttcagtgtct tcgatgttac tcgttcagtg 600
attatacaat aacatgggaa taggattaat cgtaatggtt ttaacctttg gccaagttca 660
atctgtatct gtatcagttt gatctgttac attttagtgt gtctgatttc ttaggcaatt 720
ctgaggacaa gaatcactgt tatcaaggca tgacatttaa ctgctttttg tatcacattg 780
gcaggagact gatagcgtca aggaaactgt tgtaagtgcg attgtgccgg ttgatgaagt 840
ggaagagaat cgtcaggtag aaacatctcc ttctctggct gcatcgtcag actcattgac 900
agtgacgcca tgtctatctt tggatcctgc aactgcttca accgcacaag atttaccact 960
ggtttcagtt ccaactaaac aagagcaaag atcagattcg ccggtggtta acagattgtc 1020
ggttactcct gttcctagga caccggctcg tgatggttat aattggagaa aatatggaca 1080
gaagcaggtt aagagtccca agggctcacg gagttactac aggtgtacat acactgaatg 1140
ttgtgctaaa aaaattgaat gctccaatga ttcaggcaat gtggtagaga ttgttaacaa 1200
aggtttacat actcatgaac ctccccggaa gactagcttc tccccgagag agattagagt 1260
tacaacagct atccggcctg tttcagagga tgatacagta gtagaagagc tatcaattgt 1320
tcctagcggt tcagatccgt ctgcttctac taaagaatac atctgtgagt cgcaaacact 1380
cgttgaccgg aaaagacact gtgagaacga agctgtggag gaaccagagc caaaacgaag 1440
gcaagtttgt agaattttgc atttcggtgc ttactcttca ctttgaaaga tgaaattaat 1500
agactttctt ctctctattt ttcagactga aaaaagataa ctcacagagt tcagattctg 1560
tctccaaacc tggaaagaaa aacaaattcg tagtacacgc agctggtgat gttggtatct 1620
gtggtgatgg atacaggtgg cgtaaatacg ggcagaaaat ggtgaaagga aatcctcatc 1680
caaggtctag aaaactaaac gcatgaccca tctctttatc cacatatgac atcttctaat 1740
acgcatggtg attgatttgt tctgtttcaa acattcagga actactaccg atgcacttca 1800
gcgggatgtc cagttcgtaa acacattgag acagcagtcg agaacacaaa agcagtaata 1860
atcacataca aaggagtaca caaccacgac atgccggtgc ctaagaaacg ccatggtcct 1920
ccaagctcaa tgctcgtagc tgcagccgct ccaacatcaa tgagaaccag gacagacgat 1980
caggtgaaca ttccgacttc aagccagtgc tcggtggggc gagaaagtga gaagcagagt 2040
aaagaagcat tggacgttgg tggagagaaa gtgatggaat cagctaggac tttgttgagc 2100
attggattcg aaatcaagca atgctgatta tatgtagttt atgagtttta tagagttcat 2160
cgactcaatt ttcgcctcct tgttcttgtt atataataat aataaaaaac cccatgaaga 2220
ttaccaact 2229
<210> 14
<211> 1401
<212> DNA
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 14
atggaagaag acactggtat cgacgaagct aagacataca cggtggagaa gagcgagaaa 60
gtggagccgg agaaggacgg actgagtcaa ttcagagacg aggaaaaatc acttggtgcg 120
gatatggaag atttacatga tgagactgtg cgagaaaccc taggcaagga tcaggttcaa 180
ggtgttcgag aaaattcctc tgtggaacca aatgttgaag atgtattaga agtgaatgag 240
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ccatgtctat ctttggatcc tgcaactgct tcaaccgcac aagatttacc actggtttca 420
gttccaacta aacaagagca aagatcagat tcgccggtgg ttaacagatt gtcggttact 480
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gttaagagtc ccaagggctc acggagttac tacaggtgta catacactga atgttgtgct 600
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catactcatg aacctccccg gaagactagc ttctccccga gagagattag agttacaaca 720
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<210> 15
<211> 466
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 15
Met Glu Glu Asp Thr Gly Ile Asp Glu Ala Lys Thr Tyr Thr Val Glu
1 5 10 15
Lys Ser Glu Lys Val Glu Pro Glu Lys Asp Gly Leu Ser Gln Phe Arg
20 25 30
Asp Glu Glu Lys Ser Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Leu His Asp Glu
35 40 45
Thr Val Arg Glu Thr Leu Gly Lys Asp Gln Val Gln Gly Val Arg Glu
50 55 60
Asn Ser Ser Val Glu Pro Asn Val Glu Asp Val Leu Glu Val Asn Glu
65 70 75 80
Thr Asp Ser Val Lys Glu Thr Val Val Ser Ala Ile Val Pro Val Asp
85 90 95
Glu Val Glu Glu Asn Arg Gln Val Glu Thr Ser Pro Ser Leu Ala Ala
100 105 110
Ser Ser Asp Ser Leu Thr Val Thr Pro Cys Leu Ser Leu Asp Pro Ala
115 120 125
Thr Ala Ser Thr Ala Gln Asp Leu Pro Leu Val Ser Val Pro Thr Lys
130 135 140
Gln Glu Gln Arg Ser Asp Ser Pro Val Val Asn Arg Leu Ser Val Thr
145 150 155 160
Pro Val Pro Arg Thr Pro Ala Arg Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr
165 170 175
Gly Gln Lys Gln Val Lys Ser Pro Lys Gly Ser Arg Ser Tyr Tyr Arg
180 185 190
Cys Thr Tyr Thr Glu Cys Cys Ala Lys Lys Ile Glu Cys Ser Asn Asp
195 200 205
Ser Gly Asn Val Val Glu Ile Val Asn Lys Gly Leu His Thr His Glu
210 215 220
Pro Pro Arg Lys Thr Ser Phe Ser Pro Arg Glu Ile Arg Val Thr Thr
225 230 235 240
Ala Ile Arg Pro Val Ser Glu Asp Asp Thr Val Val Glu Glu Leu Ser
245 250 255
Ile Val Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ser Ala Ser Thr Lys Glu Tyr Ile
260 265 270
Cys Glu Ser Gln Thr Leu Val Asp Arg Lys Arg His Cys Glu Asn Glu
275 280 285
Ala Val Glu Glu Pro Glu Pro Lys Arg Arg Leu Lys Lys Asp Asn Ser
290 295 300
Gln Ser Ser Asp Ser Val Ser Lys Pro Gly Lys Lys Asn Lys Phe Val
305 310 315 320
Val His Ala Ala Gly Asp Val Gly Ile Cys Gly Asp Gly Tyr Arg Trp
325 330 335
Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Met Val Lys Gly Asn Pro His Pro Arg Asn
340 345 350
Tyr Tyr Arg Cys Thr Ser Ala Gly Cys Pro Val Arg Lys His Ile Glu
355 360 365
Thr Ala Val Glu Asn Thr Lys Ala Val Ile Ile Thr Tyr Lys Gly Val
370 375 380
His Asn His Asp Met Pro Val Pro Lys Lys Arg His Gly Pro Pro Ser
385 390 395 400
Ser Met Leu Val Ala Ala Ala Ala Pro Thr Ser Met Arg Thr Arg Thr
405 410 415
Asp Asp Gln Val Asn Ile Pro Thr Ser Ser Gln Cys Ser Val Gly Arg
420 425 430
Glu Ser Glu Lys Gln Ser Lys Glu Ala Leu Asp Val Gly Gly Glu Lys
435 440 445
Val Met Glu Ser Ala Arg Thr Leu Leu Ser Ile Gly Phe Glu Ile Lys
450 455 460
Gln Cys
465
Claims (43)
- 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법으로서, 상기 식물에서 WRKY32 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계를 포함하는, 식물 생산 방법.
- 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법으로서, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 식물 생산 방법.
- 컨트롤 식물에 비하여 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법으로서, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 중 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제2항 또는 제3항에 있어서,
폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 9, 10 또는 11 중 어느 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 중 어느 아미노산 서열, 바람직하게 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는 WRKY32 과(family)에 속하는 전사 인자 단백질인, 식물 생산 방법.
- 제6항에 있어서,
폴리펩타이드는 2개의 WRKY 도메인을 포함하며, 상기 도메인은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩할 수 있는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는 토마토 WRKY32 폴리펩타이드이며, 바람직하게 여기서 상기 폴리펩타이드는 Solyc07g005650 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현은 적어도 상기 식물의 뿌리에서 손상되는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
식물의 표현형은 개선된 선충 저항성을 제외하고는 컨트롤 식물에 비해 변경되지 않는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 것을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 변형시키는 것을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제11항 또는 제12항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드의 변형은 상기 폴리뉴클레오타이드에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
변형은 방사선 처리 또는 에틸 메탄설포네이트 처리를 이용하여 도입되는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 활성은 유전자 사일런싱을 사용하여 손상되거나 변형되는, 식물 생산 방법.
- 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
식물은 토마토 식물, 바람직하게 솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물인, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
선충은 뿌리혹 선충 및/또는 시스트 선충인, 식물 생산 방법.
- 제19항에 있어서,
선충은 멜로이도긴(Meloidogyne), 헤테로데라(Heterodera) 또는 글로보데라(Globodera) 속, 바람직하게는 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 자바니카(Meloidogyne javanica), 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis), 헤테로데라 스카츠티(Heterodera schachtii) 및 헤테로데라 글리시네스(Heterodera glycines)로부터 선택되는, 식물 생산 방법.
- SEQ ID NO: 8과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현이 손상되는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드에서 삽입, 결실 또는 치환되며, 바람직하게 하나 이상의 점 돌연변이가 상기 폴리뉴클레오타이드에 도입된, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 및/또는 활성이 손상되는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리펩타이드는 WRKY32 과(family)의 전사 인자 단백질인, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제26항에 있어서,
폴리펩타이드는 2개의 WRKY 도메인을 포함하며, 상기 도메인은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩하는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
솔라넘 리코페시컴(Solanum lycopersicum) 식물, 종자 또는 세포인, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및/또는 활성은 뿌리에서 손상되지만, 새싹에서는 손상되지 않는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
발현 및/또는 활성의 손상은 개선된 선충 저항성을 제외하고 컨트롤 식물에 비해 식물, 종자 또는 세포의 표현형을 변경시키지 않는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
컨트롤 식물에 비해, 개선된 선충 저항성, 바람직하게 개선된 뿌리혹 선충 및/또는 시스트 선충 저항성을 나타내는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제31항에 있어서,
선충은 멜로이도긴(Meloidogyne), 헤테로데라(Heterodera) 또는 글로보데라(Globodera) 속, 바람직하게는 멜로이도긴 인코그니타(Meloidogyne incognita), 멜로이도긴 자바니카(Meloidogyne javanica) 및 글로보데라 로스토치엔시스(Globodera rostochiensis)로부터 선택되는, 토마토 식물, 종자 또는 세포.
- 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 토마토 식물의 뿌리 줄기(rootstock).
- 제33항의 뿌리 줄기를 이식편(graft)의 성장 및 발달을 개선시키기 위해 사용하는 용도.
- SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서 선충 저항성을 개선시키기 위해 사용하는 용도.
- 제35항에 있어서,
폴리펩타이드는 WRKY32 과의 전사 인자 단백질인, 용도.
- 제35항 또는 제36항에 있어서,
폴리펩타이드는 2개의 WRKY 도메인을 포함하며, 상기 도메인은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드에 포함된 적어도 하나의 W-박스에 바인딩하는, 용도.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 10 또는 11의 핵산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 용도.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 Solyc07g005650 유전자의 핵산 서열을 포함하는, 용도.
- 컨트롤 식물 또는 뿌리 줄기에 비하여 식물 또는 뿌리 줄기에서 선충 저항성을 개선시키는 방법으로서, 상기 식물 또는 뿌리 줄기에서 WRKY32 단백질의 활성을 저해하는 하나 이상의 화합물로 식물 또는 뿌리 줄기를 처리하는 것을 포함하는, 선충 저항성을 개선시키는 방법.
- 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법으로서, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 식물 생산 방법.
- 컨트롤 식물에 비해 개선된 선충 저항성을 갖는 식물 생산 방법으로서, 식물 세포, 식물 부분 또는 식물에서, SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 SEQ ID NO: 6의 어느 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 발현을 손상시키는 단계, 및 선택적으로 상기 식물을 재생하는 단계를 포함하는, 식물 생산 방법.
- 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
식물 또는 뿌리 줄기는 트랜스제닉 식물 또는 뿌리 줄기가 아니며, 상기 방법 또는 용도는 트랜스제닉 수단을 포함하지 않는, 방법, 식물, 뿌리 줄기 또는 용도.
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