CN105008540A - 赋予玉蜀黍对玉米根虫Il的抗性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于增强植物对昆虫害虫诸如玉米根虫的抗性的方法和组合物。本发明提供了用于在宿主植物或植物细胞中过表达Crw2或其变体以增强植物诸如玉蜀黍对昆虫害虫的抗性的方法。本发明还提供了用于鉴定在经由转基因或传统育种方法掺入植物时会增强植物诸如玉蜀黍对昆虫害虫的抗性的Crw2变体的方法。本发明还提供了通过表达Crw1和Crw2来增强抗性的方法。

Description

赋予玉蜀黍对玉米根虫Il的抗性的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月20日提交的美国临时申请No.61/703,396、2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/781,057、2012年9月20日提交的美国临时申请No.61/703,414以及2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/781,124的权益，它们的整个内容以引用方式并入本文。

对序列表的引用

依据美国专利法施行细则(C.F.R.)第37篇第1.52条(e)项(5)款将2013年9月20日作为文本文件提交的序列表据此以引用方式并入，该文本文件名称为“BB2190PCT_Sequence_Listing”，创建日期为2013年9月20日，文件大小为151,366字节。

技术领域

本发明的领域涉及植物育种和遗传学，具体地讲，涉及可用于玉蜀黍植物以赋予对玉米根虫的抗性的重组DNA构建体。

背景技术

叶甲属(Diabrotica)甲虫的三个种-西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberi Smith和Diabrotica barberi Lawrence)和南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)的幼虫形态是美国中西部危害严重的玉米昆虫害虫的代表。大约有三千万英亩(120,000km²)的玉米(种植面积八千万英亩)受到玉米根虫感染，据美国农业部估计，玉米根虫的幼虫每年可能造成大约10亿美元的损失。

存在多种旨在防治玉米根虫的不同治理实践，包括选择玉米品种、提前播种、施用杀虫剂、轮作和使用转基因玉米品种；然而，这些实践凭其自身均未证实能有效地治理害虫。还存在另外的复杂情况，原因在于玉米根虫已  显示出能够进化出对数种防治措施(包括施用杀虫剂、改进栽培技术和向植物中引入抗性基因)的抗性的惊人能力。

因此，一直需要可结合到昆虫害虫综合治理策略中的使玉蜀黍产生玉米根虫抗性的新机理。

发明内容

本发明提供了其中使编码CRW2的多核苷酸在玉蜀黍植物中表达的增强玉蜀黍植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法。此外，本发明提供了其中使编码CRW1和CRW2的多核苷酸在玉蜀黍植物中表达的增强玉蜀黍植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法。

本发明还提供了鉴定赋予玉蜀黍植物对昆虫害虫植食性的增强抗性的ZmCrw2(或ZmCRW2)变体随后进一步将所述变体引入玉蜀黍植物中的方法。所述变体可以通过基因改组实验鉴定，或者可以是通过连锁绘图或全基因组关联分析鉴定的天然存在的等位基因变体。由基因改组得到的变体能够以转基因方式引入玉蜀黍植物从而赋予它们增强的抗性，而使用本文所示方法鉴定的等位基因变体可利用分子育种技术掺入玉蜀黍植物中。

在一些实施例中，昆虫害虫为鞘翅目(Coleopteran)昆虫。

在其他实施例中，鞘翅目昆虫害虫属于叶甲属。在另有其他实施例中，昆虫害虫为玉米根虫，包括但不限于西部玉米根虫、北部玉米根虫和/或南部玉米根虫。

在其他实施例中，鞘翅目昆虫害虫属于弧丽金龟属(Popillia)，并且昆虫害虫为日本金龟子。

在一些实施例中，昆虫害虫为鳞翅目(Lepidopteran)昆虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟(Ostrinia sp.)、美国白蛾(Hyphantria cunea)或cattail caterpillar(Simyra insularis)。

本发明还提供了隔离的多核苷酸或cDNA、含有所述多核苷酸的重组构建体，以及含有所述重组构建体的植物及植物细胞。

附图和序列表简述

由以下的“具体实施方式”及构成本申请一部分的附图和序列表可以更完全地理解本发明。

图1A-图1G示出ZmCrw2与crw2-Mutag突变等位基因之间的比对。

图2A-图2F示出ZmCrw2与crw2-EMS突变等位基因之间的比对。

图3示出玉蜀黍同聚半乳糖醛酸1(HGA1)基因(也称为糖基转移酶AER61或ZmCrw2)的结构。示出了两个增变基因插入和EMS等位基因的位置。

图4A-图4J示出ZmCrw2蛋白(SEQ ID NO：2)及其同源物(SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23)的比对。

图5示出图4A-图4J中显示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分比和趋异度值。

图6(A)示出crw2-Mutag突变等位基因在10天大的幼苗中的基因表达。从叶、茎和根组织采集了总RNA样品，随后使用基因特异性引物执行了RT-PCR分析。crw2-Mutag突变体在三种组织中显示差异表达，其转录物比野生型近亲中的转录物长145bp。图6(B)示出crw2-TUSC突变体与其野生型近亲相比的RT-PCR分析结果。在该图中，“-1”和“-2”是指测试了每个等位基因的两份独立的样品。

图7示出从Lynx数据库收集的ZmCrw2基因在不同植物组织中的表达。

图8示出在西部玉米根虫摄食后的各时间点Crw1突变体与其野生型中的Crw2转录物水平的对比。在西部玉米根虫摄食的45分钟内，野生型植物中的Crw2转录物水平快速上调(上图)。在西部玉米根虫摄食后未在Crw1突变体中观察到这种上调(下图)。用相同方案上样的18S rRNA对照的结果在B中示出。

图9示出ZmCrw1和ZmCrw2在对西部玉米根虫植食性易感的双单倍体株系中的表达(使用RT-PCR分析进行评估)。结果表明ZmCrw11在该双单倍体株系中表达，而ZmCrw2不表达(图9)。

图10A和图10B示出在成株期期间，与野生型(“WT”)相比，Crw2突变体(“MT”)具有(A)较低水平的细胞壁结合的对香豆酸(pCA)和阿魏酸(FA)，以及(B)较低水平的木质素(p＜0.05；非配对t检验)。

SEQ ID NO：1是野生型玉米(Zea mays)Crw2(ZmCrw2)cDNA的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是野生型玉米CRW2(ZmCRW2)蛋白的氨基酸序列，所述蛋白也称为糖基转移酶(UniProt登录号B6TY42)。

SEQ ID NO：3是突变crw2-Mutag等位基因的cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是由突变crw2-Mutag等位基因编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是突变crw2-EMS等位基因的cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是由突变crw2-EMS等位基因编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是玉米的推定非典型蛋白(UniProt登录号C0PDR7)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是玉米的推定非典型蛋白(UniProt登录号C4J6G0)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是水稻(Oryza sativa)的推定HGA1(标识符Os06g49320；UniProt登录号Q5Z8T7)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是水稻的推定HGA1(标识符Os02g0135500；UniProt登录号Q6Z0Z4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是高粱(Sorghum bicolor)的推定非典型蛋白Sb10g029380(UniProt登录号C5Z9B2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是高粱的推定非典型蛋白Sb04g002850(UniProt登录号C5XTX5)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是大豆(Glycme max)非典型蛋白(标识符Glyma05g34170；UniProt登录号I1K5F9)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是大豆非典型蛋白(标识符Glyma08G05490；UniProt登录号I1KQG2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是拟南芥(Arabidopsis thaliana)糖基转移酶家族61蛋白(TAIR标识符：At3g18170；NCBI Gl No.GI30684813)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是也称为糖基转移酶家族61蛋白的拟南芥At3g18180基因座(UniProt登录号Q9LV22)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是大麦(Hordeum vulgare)预测蛋白(UniProt登录号F2DBB4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是也称为BRADI1G34670的二穗短柄草(Brachypodium distachyon)非典型蛋白(UniProt登录号I1GVW1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是得自百喜草(Paspalum notatum)的ZmCrw2的同源物(在内部专有数据库中辨认出来，在本文中称为PnCrw2)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：20是由SEQ ID NO：19编码的多肽的氨基酸序列。该多肽在本文称作PnCRW2。

SEQ ID NO：21是得自画眉草(Eragrostis nindensis)的ZmCrw2的同源物(在内部专有数据库中辨认出来，在本文中称为En Crw2)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是由SEQ ID NO：21编码的多肽的氨基酸序列。该多肽在本文称作EnCRW2。

SEQ ID NO：23得自大豆的非典型糖基转移酶AG061样蛋白(NCBI Gl No.356511269)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是用于RT-PCR分析的正向基因特异性引物PHN151293的核苷酸序列。

SEQ ID NO：25是用于RT-PCR分析的反向基因特异性引物PHN151298的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26是野生型玉米CRW1(ZmCRW1)蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：27是得自水稻的次生壁NAC转录因子2(UniProt登录号G3M8D2)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：28是得自水稻的推定NAM蛋白(OsNAC7)(标识符0s06g04090.1；UniProt登录号Q9SNM6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：29是得自高粱的推定非典型蛋白(标识符Sb07g001550.1；UniProt登录号C5YM23)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30是得自高粱的推定NAM蛋白(标识符Sb10g002120.1；UniProt登录号Q5NKS7)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：31是得自大豆的非典型蛋白(标识符Glyma16g02200.1；UniProt登录号I1MKD6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：32是得自大豆的非典型蛋白(标识符Glyma07g05660.1；UniProt登录号I1KHQ4)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是得自拟南芥的含NAC结构域蛋白43(标识符At2g46770.1；UniProt登录号Q84WP6)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：34是得自拟南芥的含NAC结构域蛋白12(标识符At1g32770.1；UniProt登录号Q9LPI7)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：35是得自拟南芥的含NAC结构域蛋白66(标识符At3g61910.1；UniProt登录号Q9M274)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：36是得自玉米的次生壁NAC转录因子2(UniProt登录号B4FPS5)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：37是得自玉米的推定NAM蛋白(UniProt登录号Q5NKQ3)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38是得自二穗短柄草的CRW1同源物(NCBI Gl No.357139497，在本文中称为BdCRW1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：39是得自葡萄(Vitis vinifera)的推定非典型蛋白(UniProt登录号F6HU82)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：40是得自大豆的CRW1同源物(NCBI Gl No.356522480，在本文中称为GmCRW1)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41是得自陆地棉(Gossypium hirsutum)的含NAC结构域蛋白(UniProt登录号G4V2G0)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是得自苹果(Pyrus malus)的NAC结构域类转录因子(NAC12)(UniProt登录号D9ZJ90)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是得自大麦的预测蛋白(UniProt登录号F2DV83)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44是得自拟南芥的CRW1同源物(NCBI Gl No.3510262；UniProt登录号Q84WP6)的氨基酸序列。

本申请随附的序列说明和序列表符合美国专利法施行细则第37篇第1.821条和第1.825条中关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开内容的指导规则。

序列表含有对于核苷酸序列字符的单字母编码和对于氨基酸的三字母编码，所述编码如遵照在Nucleic Acids Res.13：30213030(1985)(《核酸研究》，第13卷，第3021-3030页，1985年)和Biochemical J.219(No.2)：345373(1984)(《生物化学杂志》，第219卷第2期，第345-373页，1984年)中记述的IUPAC IUBMB标准所定义，这两份文献以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵守美国专利法施行细则第37篇第1.822条中示出的规则。

具体实施方式

本文给出的每份参考文献的公开内容据此全文引入以供参考。

本文中和随附的权利要求书中所用名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“一株植物”包括多株此类植物，提及“一个细胞”包括一个或多个细胞以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

如本文所用： 

术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”在本文中可互换使用。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”在本文中可互换使用。

术语“完全互补序列”和“全长互补序列”在本文中可互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100％互补的。

“表达序列标签”(“EST”)是源自cDNA文库的DNA序列，因而是已转录的序列。EST通常通过对cDNA插入片段进行单向测序获得。整个cDNA插入片段的序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由可选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列可能源自FIS或重叠群。

“性状”是指植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学、或物理学特征。在某些情况下，这种特征是人眼可见的，例如种子或植物大小，或者可通过以下方式测量：应用生物化学技术，例如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、或油含量；观察代谢或生理过程，如通过测量缺水耐受性或者对特定盐或糖浓度的耐受性；观察一个或多个基因的表达水平；进行农学观察，例如观察渗透胁迫耐受性或产量。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(比如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖产生的那些。如本文所用的术语“转基因(的)”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质体)中的细胞器DNA。

提及“植物”包括提及整个植株、植物器官、植物组织、植物繁殖体、种子和植物细胞以及同一植株的子代。

植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合进基因组中。

遗传改良种质的商业开发也已进展到将多种性状引入农作物植物的阶段，常称为基因堆叠方法(gene stacking approach)。在该方法中，可以将赋予不同所关注特性的多个基因引入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及具有不同转基因的株系的杂交。

“转基因植物”还包括在其基因组内包含不止一种异源多核苷酸的植物。每种异源多核苷酸可赋予转基因植物不同的性状。

针对序列而言的“异源”意指源自外来物种的序列，或者如果源自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，并且是任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5’单磷酸盐形式存在)用它们的单字母名称指代如下：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，“N”表示任意核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白(质)”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋  白(质)”还可包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”是指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”是指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的，或者可以用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“编码区”是指编码蛋白质或多肽的信使RNA部分(或另一核酸分子诸如DNA分子的对应部分)。“非编码区”是指信使RNA或其他核酸分子并非编码区的所有部分，包括但不限于(例如)启动子区、5’非翻译区(“UTR”)、3′UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”在本文中可互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”在本文中可互换使用。

“成熟”蛋白是指经翻译后加工的多肽；即，已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白是指mRNA的翻译初级产物；即，具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。

“隔离的”是指物质，诸如核酸分子和/或蛋白，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质从所述组分移出。隔离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得隔离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”是指例如通过化学合成或通过用基因工程技术操纵隔离的核酸片段而实现的两个原本隔离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括提及已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，诸如没有蓄意的人为干预而发生的那些。

“重组DNA构建体”是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”在本文中可互换使用。

“调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”是指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

“在植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”是指其活性由发育事件決定的启动子。

“有效连接”是指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段有效地连接。

“表达”是指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(例如，生成mRNA或功能性RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白。

“过表达”是指基因产物在转基因生物体中的生产超过在来自相同实验的无效分离(null segregating)(或非转基因)生物体中的生产水平。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

在将核酸片段(例如，重组DNA构建体)插入细胞的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子、或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

“转化的细胞”是已将核酸片段(例如，重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段便稳定地整合进宿主生物体和任何后续世代的基因组中。

“瞬时转化”是指将核酸片段引入宿主生物体的细胞核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达但无基因稳定遗传。

术语“杂交的”或“杂交”意指经由授粉产生子代(例如细胞、种子或植物)的配子融合。该术语既涵盖有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)，也涵盖自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植物时)。术语“杂交”是指经由授粉产生子代的配子融合行为。

术语“基因座”一般是指携带一种基因，或可能两种或更多种基因的染色体的遗传限定区域，所述基因如此紧密连锁而使得它们在遗传上表现为负责表型的单个基因座。当在本文中结合ZmCrw2使用时，“ZmCrw2基因座”应指携带ZmCrw2基因的染色体的限定区域，包括其相关调控序列。相似地，当在本文中结合ZmCrw1使用时，“ZmCrw1基因座”应指携带ZmCrw1基因的染色体的限定区域，包括其相关调控序列。

“基因”应指基因座内的特定基因编码区，包括其相关调控序列。本领域的普通技术人员应当理解，相关调控序列将距Zmcrw2编码序列不到约4kb的距离，且启动子位于上游。

“等位基因”是基因的占据染色体上特定基因座的几种可选形式之一。当二倍体植物中的一对同源染色体上特定基因座处存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中的一对同源染色体上特定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果二倍体植物中的一对同源染色体之一上存在转基因，则该植物在该基因座处是半合子的。

“有利等位基因”是位于特定基因座、赋予或有助于所期望的表型的等位基因，或作为另一种选择，是允许鉴定不具有所期望表型的植物以使得可将所述植物从育种计划或种植中筛除的等位基因。标记的有利等位基因是与有利表型分离、或作为另一种选择与不利植物表型分离从而提供鉴定植物的有益效果的标记等位基因。

“种质”是指个体(例如，一株植物)、个体组(例如，一个植物株系、品种或科)或者源自一个株系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质或源  自它们的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或可以从生物体或细胞分离得到。通常，种质提供具有特异分子组成的遗传物质，该特异分子组成为生物体或细胞培养物的部分或全部的遗传特性提供物质基础。如本文所用，种质包括细胞、种子或组织(可以由它们长出新植株)或者可以培养出整个植株的植物部分，例如叶、茎、花粉或细胞。

序列比对和同一性百分数计算可以用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于生物信息学计算软件包(美国威斯康星州麦迪逊市DNASTAR有限公司(Inc.，Madison，Wl))的程序。除非另行指出，否则本文提供的序列的多重比对均使用Clustal W比对方法进行。

Clustal W比对方法(由Higgins and Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)(Higgins和Sharp，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷第151-153页，1989年)；Higgins，D.G.et al.，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992)(Higgins，D.G.等人，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷第189-191页，1992年)描述)可见于生物信息学计算软件包(美国威斯康星州麦迪逊市DNASTAR有限公司(Inc.，Madison，Wis.))的MegAlign^TMv6.1程序。用于多重比对的默认参数对应于空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.2、延迟发散序列＝30％、DNA转换权重＝0.5、蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列、DNA权重矩阵＝IUB。就双序列比对而言，默认参数为比对＝缓慢-准确(SIow-Accurate)、空位罚分＝10.0、空位长度＝0.10、蛋白质权重矩阵＝Gonnet250、DNA权重矩阵＝IUB。

在使用Clustal W程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分数”和“趋异度”值；除非另行指出，否则本文提供并受权利要求书保护的同一性百分数和趋异度以此方式计算。本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(Sambrook，J.、Fritsch，E.F.和Maniatis T.，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社：冷泉港，1989年)(下文称为“Sambrook”)。

本文提供了可用于增强植物对昆虫害虫的抗性的隔离的多核苷酸、cDNA、多肽和重组DNA构建体。还提供了包含这些重组DNA构建体的组合物(诸如植物或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。

CRW2

crw2-Mutag(对玉米根虫易感)和crw2-EMS是叶片被西部玉米根虫(WCR)疯狂啃食的玉蜀黍突变体。由Crw2编码的多肽为糖基转移酶。糖基转移酶是植物中的可将单种或多种活化糖转移到许多不同的小分子受体的一个大的超家族的成员。最近的研究已表明，植物中的糖基转移酶可能在植物生长、发育和对环境作出响应的许多过程中发挥作用(Wang，J.and Hou，B.(2009)Front.Biol.China 4：39-46(Wang，J.和Hou，B.，2009年，《中国生物学前沿》，第4卷第39-46页))。

ZmCrw2的突变等位基因(SEQ ID NO：1)以隐性方式遗传，该遗传受单个基因控制。ZmCRW2(SEQ ID NO：2)是得自玉米的糖基转移酶。CRW2可以指ZmCRW2(SEQ ID NO：2)或其任一种同源物(SEQ ID NO：7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23)。

CRW1

crw1(对玉米根虫易感)是叶片被西部玉米根虫(WCR)疯狂啃食的玉蜀黍突变体(Dhillon B，Moose SP；and Johal GS.(2007).crw1-A novel maize mutant exceptionally susceptible to Western Corn Rootworm.Maize Genetics Conference.March 22-25，St.Charles，Illinois.Abstract and Presentation available online(Dhillon B、Moose SP和Johal GS在2007年3月22日至25日于美国伊利诺伊州圣查尔斯举办的玉米遗传学大会上的演讲：“crw1-对西部玉米根虫格外易感的新型玉蜀黍突变体”，摘要和演讲稿可从网上获得))，这种突变体并不常见，因为西部玉米根虫通常以玉蜀黍的花粉和穗丝而不是叶片为食。因此，通常使玉蜀黍叶片不受西部玉米根虫欢迎的机理在这种突变体中似乎失去了意义。

ZmCrw1以隐性方式遗传并受单个基因控制。CRW1(SEQ ID NO：26)是得自玉米的NAC转录因子。CRW1可以指ZmCrw1(SEQ ID NO：26)或其任一种同源物(SEQ ID NO：27-44)。

隔离的多核苷酸、cDNA和多肽

本发明包括下列隔离的多核苷酸、cDNA和多肽：

一种隔离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23以及它们的组合相比(基于Clustal W比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中该完全互补序列和(i)的核酸序列由相同数量的核苷酸组成并且是100％互补的。前述隔离的多核苷酸中的任一种均可用于本发明的任一种重组DNA构建体。所述多肽优选地为CRW2多肽。

一种具有这样的氨基酸序列的隔离的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23以及它们的组合相比(基于Clustal W比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。所述多肽优选地为CRW2多肽。

一种隔离的多核苷酸或cDNA，其包含(i)与SEQ ID NO：1、19或21相比(基于Clustal W比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。前述隔离的多核苷酸中的任一种均可用于本发明的任一种重组DNA构建体。

一种包含核苷酸序列的隔离的多核苷酸或cDNA，其中该核苷酸序列可在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、19或21的完全互补序列的DNA分子杂交。

一种包含核苷酸序列的隔离的多核苷酸或cDNA，其中该核苷酸序列通过由选自缺失、置换、添加和插入的至少一种方法使一个或多个核苷酸改变而由SEQ ID NO：1、19或21得到。

一种包含核苷酸序列的隔离的多核苷酸或cDNA，其中该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：1、19或21的等位基因。

一种隔离的多核苷酸或cDNA，包含：(i)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：20或22相比(基于Clustal W比对方法)具有至少90％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

应当理解，本领域的技术人员将会知道，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸，或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子置换。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可以预期使多肽分子的N端和C端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。

本发明的蛋白质也可以是包含这样的氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列在SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所示的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入和/或添加。置换可以是保守的，这意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基替代。保守置换的非限制性例子包括含脂族基团的氨基酸残基例如Ile、Val、Leu或Ala之间的替代，以及极性残基之间的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。

来源于氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白的DNA受到(例如)熟知的定点诱变时制得(参见例如Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982(《核酸研究》，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年)，该文献全文据此以引用方式并入)。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在意指可通过定点诱变缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。

定点诱变可以例如如下使用与待突变的单链噬菌体DNA互补，不同的是具有特定错配(即，所需突变)的合成寡核苷酸引物实现。也就是说，上述合成寡核苷酸用作引起互补链通过噬菌体合成的引物，然后所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化细胞培养物置于琼脂上，从而允许噬菌斑从含噬菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50％的新菌落包含突变为单链的噬菌体，而其余50％具有原始序列。在允许与具有上述所需突变的DNA完全相同的DNA杂交，但不与具有原始链的DNA杂交的温度下，允许所得的噬菌斑与通过激酶处理标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的噬菌斑并培养以收集其DNA。

允许生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失、置换、插入和/或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，以及其他技术，例如用诱变剂处理基因的那些，以及其中基因选择性裂解以移除、置换、插入或添加所选的一个或多个核苷酸然后连接的那些。

本发明的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列在SEQ ID NO：1、19或21的核苷酸序列中含有一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入和/或添加。核苷酸缺失、置换、插入和/或添加可通过定点诱变或上述其他技术实现。

本发明的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列可在严格条件下与SEQ ID NO：1、19或21的核苷酸序列的互补链杂交。

术语“在严格条件下”意指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地讲，本领域的普通技术人员可以例如根据DNA的长度轻松地确定中等严格条件。基本条件在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，third edition，chapters 6 and 7，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，第三版，第6和第7章，冷泉港实验室出版社，2001年)中示出，包括使用硝化纤维过滤器的预洗涤溶液5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)，约50％甲酰胺、2×SSC至6×SSC、约40-50℃的杂交条件(或其他类似杂交溶液，例如Stark溶液，约50％甲酰胺、约42℃)以及例如约40-60℃、0.5-6×SSC、0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在约50℃和6×SSC下杂交(和洗涤)。本领域的技术人员也可以例如根据DNA的长度轻松地确定高度严格条件。

一般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高温度和/或较低盐浓度下杂交和/或洗涤(例如在约65℃，6×SSC至0.2×SSC，优选地6×SSC，更优选地2×SSC，最优选地0.2×SSC下杂交)。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68℃、0.2×SSC、0.1％SDS下洗涤。可用SSPE(I×SSPE为0.15MNaCI、10mM NaH2P04和1.25mM EDTA，pH 7.4)替代杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1×SSC为0.15M NaCI和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行15分钟的洗涤。

使用商购获得的杂交试剂盒也是可能的，其不使用放射性物质作为探针。具体例子包括用ECL直接标记和检测系统(安玛西亚公司(Amersham))进行杂交。严格条件包括(例如)使用包括在试剂盒中的杂交缓冲液在42℃下杂交4小时，该杂交缓冲液补充有5％(w/v)阻断试剂和0.5M NaCI，随后在0.4％SDS、0.5×SSC中55℃下洗涤20分钟两次，在2×SSC中室温下洗涤5分钟一次。

重组DNA构建体

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体。

在一个实施例中，重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23以及它们的组合相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

在另一个实施例中，重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)与SEQ IDNO：1、19或21以及它们的组合相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、  84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

在另一个实施例中，重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CRW2多肽。CRW2多肽可得自拟南芥、玉米、大豆、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)、水稻、二穗短柄草、葡萄、墨西哥棉(Gossypium mexicanum)、苹果、大麦、甘蓝型油菜(Brassica napus)、高粱、甘蔗(Saccharum officinarum)、小麦(Triticum aesttvum)、百喜草和画眉草。

本文提供了一种包含有效连接到至少一个调控元件的隔离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述隔离的多核苷酸含有：(i)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：20或22相比(基于Clustal W比对方法)具有至少90％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是本文所公开的任一种启动子，例如根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。

调控序列

本发明的重组DNA构建体可包含至少一个调控序列。

调控序列可以是启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体。启动子可基于所需的结果来选择，其可包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或在宿主生物体中表达的其他启动子。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell et al.，Nature 313：810-812(1985)(Odell等人，《自然》，第313卷，第810-812页，1985年))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.，Plant Cell 2：163-171(1990)(McElroy等人，《植物细胞》，第2卷，第163-171页，1990年))；泛素(Christensen et al.，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)(Christensen等人，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页，1989年)和Christensen et al.，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992)(Christensen等人，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页，1992年))；pEMU  (Last et al.，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991)(Last等人，《理论与应用遗传学》，第81卷，第581-588页，1991年))；MAS(Velten et al.，EMBOJ.3：2723-2730(1984)(Velten等人，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页，1984年))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；组成型合成核心启动子SCP1(国际公布No.03/033651)等等。其他组成型启动子包括(例如)以下美国专利中所讨论的那些：No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142和No.6,177,611。

可用于本发明的组织特异性启动子可包括根优选启动子，例如玉蜀黍NAS2启动子、玉蜀黍Cyclo启动子(US 2006/0156439，2006年7月13日公布)、玉蜀黍ROOTMET2启动子(WO05063998，2005年7月14日公布)、CR1BIO启动子(WO06055487，2006年5月26日公布)、CRWAQ81(WO05035770，2005年4月21日公布)和玉蜀黍ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；Gl No.1063664)。

启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成性DNA片段。

本发明的重组DNA构建体还可以包含其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施例中，本发明的重组DNA构建体还包含增强子或沉默子。

可将内含子序列添加到5′非翻译区、蛋白质编码区或3’非翻译区，以增加在胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接的内含子已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能将基因表达提升最高1000倍。Buchman and Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)(Buchman和Berg，《分子与细胞生物学》，第8卷，第4395-4405页，1988年)；Callis et al.，Genes Dev.1：1183-1200(1987)(Callis等人，《基因和发育》，第1卷，第1183-1200页，1987年)。

可选择任何植物来鉴定将用于本发明的重组DNA构建体和其他组合物(例如，转基因植物、种子和细胞)及方法中的调控序列和编码CRW2多肽的基因。用于分离基因和调控序列并用于本发明的组合物和方法中的合适植物的例子包括但不限于：苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、球芽甘蓝、  卷心菜、低芥酸油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑橘类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、越橘、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柳枝稷、橘子、荼、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物

本发明的组合物包括含有重组DNA构建体的转基因微生物、细胞、植物和种子。细胞可以是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，例如细菌细胞。

本发明的组合物是在其基因组中含有本发明的任一种重组DNA构建体的植物。组合物还包括植物的任何子代，以及得自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组内包含所述重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交得到的后续世代。子代也包括杂交和近交。在杂交种子繁殖的作物中，可使成熟的转基因植物自花传粉以产生纯合的近交植物。近交植物产生含有新引入的重组DNA构建体的种子。可使这些种子生长以长成将表现出对昆虫害虫植食性的抗性增强的植物，或可将这些种子用于育种计划以产生杂交种子，随后可使这些杂交种子生长以长成将表现出对昆虫害虫植食性的抗性增强的植物。所述种子可以是玉蜀黍种子。

所述植物可以是单子叶的或双子叶的植物，例如玉蜀黍或大豆植物，比如玉蜀黍杂交植物或玉蜀黍近交植物。所述植物也可以是向日葵、高粱、低芥酸油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。

所述重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。

具体实施例包括但不限于以下这些：

1.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如，玉蜀黍植物)，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列的  多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物与不含所述重组DNA构建体的对照植物相比表现出对昆虫害虫植食性增强的抗性。

2.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如，玉蜀黍植物)，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CRW2多肽，并且其中所述植物与不含所述重组DNA构建体的对照植物相比时表现出对昆虫害虫植食性的增强抗性。

3.一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如，玉蜀黍植物)，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、19或21的完全互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过由选自缺失、置换、添加和插入的至少一种方法使一个或多个核苷酸改变而由SEQ IDNO：1、19或21得到；并且其中所述植物与不含所述重组DNA构建体的对照植物相比表现出对昆虫害虫植食性的增强抗性。

4.一种在其基因组中包含(A)第一重组DNA构建体和(B)第二重组DNA构建体的植物(例如，玉蜀黍植物)，所述(A)第一重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：(i)编码具有SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(ii)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal W比对方法)具有至少  80％的序列同一性；和(iii)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；所述(B)第二重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：(iv)编码具有SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(v)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44相比(基于Clustal W比对方法)具有至少80％的序列同一性；和(vi)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；并且其中所述植物与不含所述重组DNA构建体的对照植物相比表现出对昆虫害虫植食性的增强抗性。

5.本文所述实施例中的植物的任何子代、本文所述实施例中的植物的任何种子、本文所述实施例中的植物的子代的任何种子，以及得自本文所述实施例中的任何以上植物及其子代的细胞。

一种包含重组DNA构建体的植物细胞，所述重组DNA构建体包括含有隔离的多核苷酸的重组DNA构建体，所述隔离的多核苷酸包含：(i)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的核酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO：20或22相比(基于Clustal W比对方法)具有至少90％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是本文所公开的任一种启动子，例如根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。本文还提供了包含这种植物细胞的植物。这种植物可展示出对昆虫害虫植食性的增强抗性。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。鞘翅目昆虫害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。植物可以是单子叶植物。植物可以是玉蜀黍。

本文提供了一种在其基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal W比对方法)具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物与不含所述重  组DNA构建体的对照植物相比表现出对昆虫害虫植食性增强的抗性。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是本文所公开的任一种启动子，例如根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。本文还提供了包含这种植物细胞的植物。这种植物可展示出对昆虫害虫植食性的增强抗性。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。鞘翅目昆虫害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。植物可以是单子叶植物。植物可以是玉蜀黍。

本文还提供了在其基因组中包含以下构建体的植物：(a)包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸的第一重组DNA构建体，其中所述多核苷酸选自：(i)编码具有SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(ii)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal W比对方法)具有至少80％的序列同一性；和(iii)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；以及(b)包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸的第二重组DNA构建体，其中所述多核苷酸选自：(iv)编码具有SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(v)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44相比(基于Clustal W比对方法)具有至少80％的序列同一性；和(vi)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；并且其中所述植物与不含所述重组DNA构建体的对照植物相比表现出对昆虫害虫植食性的增强抗性。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是本文所公开的任一种启动子，例如根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。本文还提供了包含这种植物细胞的植物。这种植物可展示出对昆虫害虫植食性的增强抗性。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。鞘翅目昆虫害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。植物可以是单子叶植物。植物可以是玉蜀黍。

在本文所述的任何实施例中，CRW1和/或CRW2多肽可得自拟南芥、玉米、大豆、烟豆、野大豆、短绒野大豆、水稻、二穗短柄草、葡萄、墨西哥棉、苹果、大麦、甘蓝型油菜、高粱、甘蔗或小麦。

在本文所述的任何实施例中，所述重组DNA构建体可包含至少一个在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在本文所述的任何实施例中，在相似的环境条件和害虫压力下，所述植物(例如，玉蜀黍植物)可表现出相对于对照植物较低的产量损失，例如，低至少25％、至少20％、至少15％、至少10％或至少5％的产量损失。

“昆虫害虫压力”是指昆虫的侵染水平。

“昆虫”和“昆虫害虫”在本文中可互换使用。

昆虫可以处于成虫期或幼虫期。成虫期尤其受人关注。

昆虫可以是鞘翅目昆虫，该鞘翅目昆虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的昆虫。

叶甲属是广泛分布的甲虫属，其包括若干个具有破坏性的农业害虫物种，包括(例如)玉米根虫。玉米根虫是美国最具经济破坏性的玉蜀黍昆虫之一。西部玉米根虫和北部玉米根虫是爱荷华州(玉米主产区)最具毁灭性的根虫物种。第三个种为南部玉米根虫，其在其他地区导致重大经济损失。

弧丽金龟属是金龟子科的一个属，最为人们熟悉的是日本金龟子(Popillia japonica)。日本金龟子是在世界范围内造成作物损失的重要昆虫害虫。

昆虫可以是鳞翅目昆虫，该鳞翅目昆虫可以是秆野螟属(Ostrinia)、白蛾属(Hyphantria)或刀夜蛾属(Simyra)昆虫。秆野螟属是蛾类的一个属，其中的一个成员是欧洲玉米螟(一种对玉蜀黍造成严重危害的害虫)。

本发明的方法中示出的昆虫害虫可以包括但不限于任何玉米根虫物种(诸如但不限于西部玉米根虫)、日本金龟子、欧洲玉米螟、美国白蛾或cattail caterpillar(Simyra insularis)。

如本文所用的“植食性”是指昆虫以活的植物组织为食。植物组织可以是来自任何植物部分(包括但不限于叶、茎、根、生殖部分等)的组织。植食生物的长期攻击可能对个体植物的大小、寿命或繁殖产出造成显著的累积效应。

“易感性”是指植物品种不能限制指定害虫的生长和发育。

“抗性”是指植物品种与易感性植物品种在相似的环境条件和害虫压力下进行比较时限制指定害虫的生长和发育和/或它们造成的损害的能力。

通常，当在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物相对于参照或对照植物表现出对昆虫害虫植食性的抗性增强时，所述参照或对照植物在其基因组中不含所述重组DNA构建体。

本领域的普通技术人员熟知用于评价昆虫对植物组织的响应(即，被其吸引或排斥该植物组织)和用于评价植物对昆虫害虫的抗性水平的方案。

此外，如本文所示，可以执行选择性摄食试验作为评估植物(例如，玉蜀黍植物)对昆虫害虫(诸如玉米根虫)的抗性水平的方式。在该测定法中，使用包括可拆卸封盖的PVC盒来盛装昆虫和植物宿主，将等重量的新鲜采摘的植物宿主成熟叶片以随机方式贴附到润湿的滤纸上。使昆虫禁食过夜，然后放入装有植物组织的盒中。可用0至5的标度对叶片摄食情况打分，0表示完好无损，5表示被完全毁损。

还可以利用田间试验通过测定植物在充分的害虫压力下维持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力来评价植物对昆虫害虫的抗性。

在评估或测量其中利用了对照植物的本发明任意实施例(例如，如本文所述的组合物或方法)中的转基因植物的表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化过的植物的子代，该转化过的植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该重组DNA构建体的植物：包含该重组DNA构建体的子代通常将相对于不包含该重组DNA构建体的子代进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。

2.重组DNA构建体基因渗入进近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系通常将相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或变种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，第一杂交系由两个亲本近交系产生，第二杂交系由同样的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即，第一杂交系为对照或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体的植物：该植物可相对于这样的对照植物进行评估或测量，该对照植物不包含所述重组DNA构建体，但具有与所述植物相当的遗传背景(例如，与包含所述重组DNA构建体的植物相比，细胞核遗传物质共享至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。有多种可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中包括同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特征性扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性 和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将很容易认识到，评估或测量转基因植物的表型时将用到的合适对照或参照植物将不包括先前已针对所需的表型经由诱变或转化选择的植物。

方法

方法包括但不限于用于增强植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法、用于评价植物对昆虫害虫的抗性的方法、鉴定赋予植物对昆虫害虫植食性的增强抗性的Crw2的变体和/或天然存在的等位基因的方法，以及用于产生种子的方法。所述植物可以是单子叶的或双子叶的植物，例如玉蜀黍或大豆植物。所述植物也可以是向日葵、高粱、低芥酸油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗或高粱。种子可以是玉蜀黍或大豆种子，例如玉蜀黍杂交种子或玉蜀黍近交种子。

方法包括但不限于以下这些：

用于转化细胞(或微生物)的方法，包括用本发明的任一种隔离的多核苷酸或重组DNA构建体转化细胞(或微生物)。还包括通过该方法转化的细胞(或微生物)。在特定实施例中，所述细胞是真核细胞，例如酵母、昆虫或植物细胞；或原核细胞，例如细菌细胞。所述微生物可以是农杆菌属  (Agrobacterium)微生物，例如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

用于产生转基因植物的方法，包括用本发明的任一种隔离的多核苷酸或重组DNA构建体转化植物细胞，随后从转化的植物细胞再生出转基因植物。本发明还涉及通过该方法产生的转基因植物，以及得自该转基因植物的转基因种子。通过该方法得到的转基因植物可用于本发明的其他方法。

用于从细胞或细胞培养基中分离出本发明的多肽的方法，其中该细胞包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列的本发明的多核苷酸，并且其中使转化的宿主细胞在适于表达该重组DNA构建体的条件下生长。

改变本发明的多肽在宿主细胞中的表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)使转化的宿主细胞在适于表达该重组DNA构建体的条件下生长，其中该重组DNA构建体的表达导致本发明的多肽在转化的宿主细胞中的水平发生改变。

增强植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法，包括：(a)向可再生植物细胞中引入重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)后从可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对植物害虫的抗性。该方法还可以包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对昆虫害虫植食性的抗性。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。昆虫  害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的鞘翅目害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。

增强植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法，包括：(A)向可再生植物细胞中引入：(i)第一重组DNA构建体，其包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：(a)编码具有SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal W比对方法)具有至少80％的序列同一性；和(c)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；以及(ii)第二重组DNA构建体，其包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自：(a)编码具有SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)编码具有这样的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，该氨基酸序列与SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44相比(基于Clustal W比对方法)具有至少80％的序列同一性；和(c)具有与(i)或(ii)的多核苷酸的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列的多核苷酸；以及(B)在步骤(A)后从可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对植物害虫的抗性。该方法还可以包括(C)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对昆虫害虫植食性的抗性。所述至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是本文所公开的任一种启动子，例如根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。本文还提供了包含这种植物细胞的植物。这种植物可展示出对昆虫害虫植食性的增强抗性。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。鞘翅目昆虫害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。植物可以是单子叶植物。植物可以是玉蜀黍。

增强植物对昆虫害虫植食性的抗性的方法，该方法包括：(a)向可再生植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少  一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ IDNO：1、19或21的完全互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过由选自缺失、置换、添加和插入的至少一种方法使一个或多个核苷酸改变而由SEQ ID NO：1、19或21得到；以及(b)在步骤(a)后从可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对昆虫害虫植食性的抗性。该方法还可以包括(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对昆虫害虫植食性的抗性。

评价植物对昆虫害虫的抗性的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的对昆虫害虫的抗性。

在另一个实施例中，提供了评价植物对昆虫害虫的抗性的方法，包括：(a)获得转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比(基于Clustal V比对方法)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、  80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)使(a)部分的转基因植物在让多核苷酸表达的条件下生长；以及(c)评价(b)部分的转基因植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比的对昆虫害虫的抗性。

评价植物对昆虫害虫的抗性的方法，该方法包括：(a)获得转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、19或21的完全互补序列的DNA分子杂交；或(b)通过由选自缺失、置换、添加和插入的至少一种方法使一个或多个核苷酸改变而由SEQ ID NO：1、19或21得到；(b)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价所述子代植物与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比是否具有对昆虫害虫植食性的增强抗性。

在本发明的任何前述方法或任何其他方法实施例中，在所述引入步骤中，所述可再生植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚性愈伤组织细胞、配子细胞、分生组织细胞、或幼胚细胞。可再生植物细胞可源于近交玉蜀黍植物。

在本发明的任何前述方法或任何其他方法实施例中，所述再生步骤可包括以下方面：(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞，直至观察到愈伤组织；(ii)将步骤(i)的所述转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基中；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在本发明的任何前述方法或任何其他方法实施例中，至少一个调控元件可以是启动子。例如，启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫害虫。昆虫害虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的鞘翅目害虫。昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫害虫。鳞翅目昆虫害虫可以是欧洲玉米螟。表型分析可采用选择性摄食试验建立。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。用于植物  转化和再生的技术已在国际专利公布WO 2009/006276中进行了描述，该专利公布的内容以引用方式并入本文。含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可使再生的植物自花授粉以产生纯合的转基因植物。另外，将从再生的植物获得的花粉与农学上重要的品系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要品系的植物的花粉对再生的植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

在另一个实施例中，提供了鉴定赋予植物对昆虫害虫植食性的增强抗性的Crw2变体的方法。这种方法包括：(a)通过基因改组将一个或多个核苷酸序列合并，所述一个或多个核苷酸序列编码SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23的一个或多个片段，或与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23具有至少70％同一性的蛋白质或其片段；(b)将来自步骤(a)的改组序列转化进可再生植物细胞的群体中；(c)从步骤(b)的转化的可再生植物细胞的群体再生出转化植物的群体；(d)从来自步骤(c)的转化植物的群体筛选对所述昆虫害虫增强的抗性；以及(e)从转化的植物中鉴定出表现增强的抗性的变体。该方法还可以包括：(f)向可再生植物细胞引入包含赋予植物对昆虫害虫植食性的增强抗性的Crw2变体的重组构建体；(g)在步骤(f)后从所述可再生植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(h)选择(g)的转基因植物，其中该转基因植物包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对所述昆虫害虫的抗性。

术语“基因改组”和“定向进化”在本文中可互换使用。“基因改组”方法包括反复进行DNA改组，继之以适当筛选和/或选择，以产生具有改良生物活性的Crw2核酸或其部分的变体(Castle et al.，(2004)Science 304(5674)：1151-4(Castle等人，2004年，《科学》，第304卷第5674期，第1151-1154页)；美国专利No.5,811,238和No.6,395,547)。

本发明还提供了通过传统连锁绘图鉴定出玉蜀黍中与对昆虫害虫植食性的增强抗性相关联的Crw2等位基因变体的方法。在一些实施例中，通过以下方式鉴定出所述等位基因变体：(a)将对所述昆虫害虫具有不同抗性水平的两种玉蜀黍植物杂交；(b)关于编码包含SEQ ID NO：2、20或22的蛋白质  的多核苷酸序列、或在调控编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区中评价子代植物中的等位基因变异；(c)对子代植物对所述昆虫害虫的抗性进行表型分析；(d)将等位基因变异与所述抗性相关联；以及(e)鉴定出与对所述昆虫害虫的抗性增强相关联的等位基因。本文提供了一种鉴定出玉蜀黍植物中与对昆虫害虫植食性的增强抗性相关联的Crw2等位基因变体的方法，其中该方法包括以下步骤：a)将对所述昆虫害虫具有不同抗性水平的两种玉蜀黍植物杂交；b)关于编码包含SEQ ID NO：2的蛋白质的多核苷酸序列、或在调控编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区中评价子代植物中的等位基因变异；c)对子代植物对所述昆虫害虫的抗性进行表型分析；d)将等位基因变异与所述抗性相关联；以及e)鉴定出与对所述昆虫害虫的抗性增强相关联的等位基因。表型分析步骤(c)可使用本领域已知的评估抗昆虫害虫性的任何方法执行，例如，由历史数据获得群体中每种植物的抗性，或可使用本文所示的选择性摄食试验执行。

在其他实施例中，通过全基因组关联分析鉴定等位基因变体，方式为：(a)获得玉蜀黍植物的群体，其中所述玉蜀黍植物表现出对所述昆虫害虫的不同抗性水平；(b)关于编码包含SEQ ID NO：2的蛋白质的多核苷酸序列、或在调控编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区中评价等位基因变异；(c)将等位基因变异与所述抗性相关联；以及(d)鉴定出与对所述昆虫害虫的抗性增强相关联的等位基因变体。抗性可以使用本领域的普通技术人员已知的任何方法或选择性摄食试验来评估。或者，也可以使用有关抗性的历史表型数据。

本发明还提供了鉴定表现出对昆虫害虫植食性的抗性增强的玉蜀黍植物的方法，该方法包括：(a)检测玉蜀黍植物的基因组中是否存在与对所述昆虫害虫的抗性增强相关联的至少一个Crw2等位基因变体(其中所述等位基因变体可使用上述方法鉴定)；以及(b)鉴定含有所述至少一个等位基因变体的玉蜀黍植物。该方法还可以包括：(c)将所述玉蜀黍植物与第二种玉蜀黍植物杂交；以及(d)鉴定并选择得自所述杂交的具有所述等位基因变体的子代植物。

在任何上述方法中，昆虫害虫可以是鞘翅目昆虫，该鞘翅目昆虫可以是叶甲属或弧丽金龟属的昆虫。

或者，昆虫害虫可以是鳞翅目昆虫，该鳞翅目昆虫可以是秆野螟属、白蛾属或刀夜蛾属昆虫。

昆虫害虫可以是玉米根虫的任何种、日本金龟子、欧洲玉米螟、美国白蛾或cattail caterpillar(Simyra insu laris)。

在任何上述方法中，对抗昆虫害虫性的评价可包括本领域普通技术人员已知的任何方案。也可以使用本文所示的选择性摄食试验。

在任何上述方法中，植物为单子叶植物，并且可以是玉蜀黍。

实例

以下实例进一步阐述本发明，其中除非另有规定，否则份数和百分比均按重量计，而度是指摄氏度。应当理解，这些实例虽然指出本发明的实施例，但仅以举例说明的方式给出。根据以上讨论和这些实例，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的实质和范围的情况下，可对本发明作出各种变化和修改以使其适合于各种应用和条件。因此，根据前文的描述，除了本文中显示和描述的修改外的本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将显而易见。这类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。

实例1

叶片选择性摄食试验

执行了选择性摄食试验以评估Crw2突变型植物和野生型植物对玉米根虫的抗性水平。使用包括可拆卸封盖的PVC盒，将等重量的从突变型植物和野生型植物两者新鲜采摘的成熟叶片以随机方式贴附到润湿的滤纸上。将已被禁食过夜的西部玉米根虫和南部玉米根虫放入盒中。先前的观察表明，昆虫通常首先会随机试探啃咬，之后才会确定其摄食偏好，且该摄食偏好的确定通常发生在前45分钟内；优先的摄食通常持续到昆虫选择的叶片被完全吞食为止。用0至5的标度对叶片摄食情况打分，0表示完好无损，5表示被完全毁损。

实例2

Crw2基因的克隆和验证

从EMS群体中分离出对西部玉米根虫成虫表现出增强的易感性的玉蜀黍突变体，命名为crw2-EMS。独立地，从源于Mu活性品系的F2群体中鉴定出另一种具有西部玉米根虫易感性的突变体，命名为crw2-Mutag。Crw2突变体显示出对西部玉米根虫成虫以及日本金龟子和欧洲玉米螟(在用田间  试验评估时，称为ECB)增强的易感性。将crw2-EMS和Crw2-Mutag两者以单基因隐性方式分离并绘制到5号染色体的同一区域中，它们在正反交中为彼此的等位基因。采用共分离分析从Crw2-Mutag突变体中分离出候选基因；据发现该基因(SEQ ID NO：1)能够编码推定的同聚半乳糖醛酸(HGA1)，HGA1也被标注为“糖基转移酶AER61”或“推定的非典型蛋白”。该候选基因包含两个外显子和一个内含子，编码445个氨基酸(aa)长且具有一个20aa的跨膜螺旋(TMH)(从肽的第13位氨基酸到第32位氨基酸)的产物(SEQ ID NO：2)。预期该跨膜螺旋可将所述蛋白定位于内质网/高尔基体中，此时该肽的前12个氨基酸面向细胞器内部，其余氨基酸(从第33位氨基酸到第455位氨基酸)进入细胞质中悬在细胞器外。Crw2-Mutag的克隆和序列(SEQ ID NO：3是cDNA的核苷酸序列，SEQ ID NO：4是所编码多肽的氨基酸序列)揭示Mu-元件添加了145bp长度(参见图1A-图1G的比对)。

为了验证该候选基因，使用一组巢式引物从crw2-EMS突变等位基因(SEQ IDNO：5是cDNA的核苷酸序列而SEQ IDNO：6是编码多肽的氨基酸序列)及其祖基因MQ20W(一种公共玉蜀黍近交系)扩增出全长基因。同MO20W HGA1基因相比，在crw2-EMS等位基因中检测到了单个氨基酸改变R292C(图2A-图2F)。该氨基酸改变位于HGA1的保守区，可能是crw2-EMS突变的肇因等位基因。分离出具有位于EMS等位基因与Mu标签等位基因的位置之间的增变基因插入的独立TUSC等位基因，使其接受表型分析和分子分析。据发现TUSC等位基因为crw2-Mutag等位基因的等位基因，其对西部玉米根虫成虫和日本金龟子显示出类似的增强易感性。图3示出玉蜀黍的Crw2基因结构和每种Crw2突变的位置的示意图。在对西部玉米根虫高度易感的双单倍体株系中对该基因的功能进行了额外的验证。利用RT-PCR分析在双单倍体株系中检查了ZmCrw1和Crw2ZmCrw2的表达。结果表明ZmCrw1在该双单倍体株系中表达，而ZmCrw2不表达(图9)。

实例3

鉴定玉蜀黍CRW2多肽的同源物

可使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法分析玉蜀黍CRW2多肽与“nr”数据库中包含的全部可公开获得的氨基酸序列的相似性，并分析玉蜀黍CRW2多肽与DUPONT^TM专有内部数据库的相似性。

使用玉蜀黍CRW2多肽的序列(SEQ ID NO：2)进行的BLAST搜索揭示玉蜀黍CRW2多肽与得自各种生物体的同聚半乳糖醛酸的相似性。表1(非专利文献)示出的是玉蜀黍CRW2的氨基酸序列的BLASTP结果。图1还示出了使用Clustal W比对方法、用默认参数得到的每对氨基酸序列的序列同一性百分比值：

表1：玉蜀黍CRW2多肽的BLASTP结果(非专利文献)

*指示该序列在内部专有数据库中发现

图4A-图4J展示SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23所示的多肽氨基酸序列的比对。图5展示图4A-图4J所示的每个序列对的序列同一性百分比和趋异度值。

序列比对和同一性百分数计算使用生物信息学计算软件包(美国威斯康星州麦迪逊市DNASTAR有限公司(Inc.，Madison，Wl))的程序进行。序列的多重比对使用Clustal W比对方法(Thompson et al.(1994)Nucleic Acids Research.22：4673-80(Thompson等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680页))、用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.20)进行。使用Clustal方法进行双序列比对的默认参数是：空位罚分＝10.00，空位长度＝0.10。所用的蛋白权重矩阵为 系列。

实例4

突变体和野生型近亲中ZmCrw2基因的RT-PCR分析

从c/w2-Mutag突变体及其野生型近亲的10天大幼苗的叶、茎和根组织采集了总RNA样品，使用基因特异性引物(SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；图6A)完成了RT-PCR分析。crw2-Mutag突变体在三种组织中显示差异表达(在茎样品中比在叶和根样品中更多)，其转录物比野生型近亲中的转录物长145bp。crw2-Mutag转录物的克隆和测序揭示Mu-元件干扰了内含子剪接。Mu-元件添加了141bp的MuTIR(末端反向重复)和4bp到9bp的同向重复，导致读框移位(与野生型相比最后73个氨基酸发生改变)。对crw2-TUSC突变体的RT-PCR分析显示与其野生型近亲相比，叶中完全不存在Crw2转录物(图6B)。

实例5

使用Lynx数据库研究ZmCrw2基因在不同组织中的表达

Lynx数据库显示ZmCrw2在例如伸长的节间、根、抽丝期的内苞叶、穗和维管束的不同组织中的表达相对较低，分别为：伸长的节间(370PPM)，根(367PPM)，抽丝期的内苞叶(324PPM)，穗(310PPM)，维管束(220PPM)(图7)。ZmCrw2基因在叶组织(具体地讲，V5期的叶组织)中的表达是最高的(300PPM)；然而，在V5期叶组织中的表达作为对欧洲玉米螟(ECB)感染的响应而显著下降。当V5期叶轮感染ECB幼虫时，感染后0h、3h、6h和24h的ZmC/w2表达分别为300RPM、200RPM、150RPM和137RPM。

实例6

Crw1和Crw2通路分析

crw2-EMS的TBO染色产生了与crw1-Ac相同的图案，表明这两种突变体在单个遗传通路或网络中均存在缺陷。

为了进一步研究该联系，将Crw1突变体与野生型植物的Crw2转录物水平在昆虫摄食后各时间点的差异进行了比较。将crw1-Ac突变体及其野生型近亲的七周大植株封闭在田间的棚中，然后用已禁食了16小时的成年甲虫感染。在感染后0分钟、45分钟、1小时、6小时、12小时、24小时、36小时和48小时采集RNA。然后将突变体和野生型近亲在不同时间点的RNA样品合并，突变体为池1，野生型近亲为池2。评价了两个池中的每一个在各时间点的Crw2转录物水平。很快(45分钟)观察到野生型近亲较之crw1-Ac突变植物出现了Crw2转录物水平的大幅上调(图8)。这些结果还在RNA测序实验中得到了证实，其中Crw2转录物水平是Crw1野生型近亲中该水平的2.8倍(在log2尺度上)。这些结果指示Crw2为昆虫诱导型突变体，其对昆虫摄食作出响应的能力取决于具有功能性Crw1产物。

这些结果还表明Crw1和Crw2属于同一个遗传或生化网络，并且Crw2可以在Crw1的下游起作用。

实例7

Crw2在植物中的过表达

可使用本领域普通技术人员已知的方法将玉蜀黍Crw2基因或其任一种同源物插入载体中，然后可进一步将该载体转化进植物(包括但不限于玉蜀黍)。可采用与前述实例中相似的方式或使用任何已知的评估方法执行表型分析，以确定植物对昆虫害虫(例如但不限于西部玉米根虫、日本金龟子和欧洲玉米螟)的抗性。

玉蜀黍转化载体通过构造Gateway感受态入门载体而构建，在该感受态入门载体中，将含有ZM-CRW2的DNA片段连接到含有玉蜀黍泛素启动子的载体，得到了其中ZM-Crw2的表达受到玉蜀黍泛素启动子驱动的表达盒。经由LR反应(按照英杰公司(Invitrogen)就Gateway LR反应描述的方法进行)将所得的入门载体与另一载体组合，产生适于对玉蜀黍进行农杆菌介导的转化的构建体。

使用骨架中具有SB-RCC3启动子的载体作为接受入门载体，以相似的方式构建了第二载体，得到了其中ZM-Crw2的表达受到SB-RCC3启动子(一种得自高粱的根特异性启动子(US20120210463))驱动的表达盒。经由LR反应将所得的入门载体与另一载体组合，产生适于进行农杆菌介导的转化的构建体。

产生了T0玉蜀黍植物，将该植物置于温室中以供表型分析。

实例8

Crw1和Crw2在植物中的过表达

可利用本领域普通技术人员已知的方法使Crw1和Crw2在植物中过表达。Crw1基因可得自玉蜀黍(例如SEQ ID NO：26)，或可以是ZmCrw1基因的同源物(SEQ ID NO：27-44)。相似地，Crw2基因可得自玉蜀黍(SEQ ID NO：i)，或可以是ZmCrw2基因的同源物。可如之前的实例中所述或使用本领域已知的任何方法执行表型分析，以确定植物对昆虫害虫(例如但不限于西部玉米根虫、日本金龟子和欧洲玉米螟)的抗性。

实例9

Crw2突变表型的进一步评估

在2012年和2013年的夏季，从五月初到六月末，将Crw2突变体和相应的野生型(WT)近亲以每两周一次的时间间隔种植在田间。在西部玉米根虫压力处于其最大值的七月中旬评估了西部玉米根虫造成的植物虫害。不考虑突变幼苗的可用性，在Crw2突变植物达到5周龄或更大之前均未观察到叶的易感性表型。从那时起，叶片损坏继续稳步恶化，最终导致突变植物在重度西部玉米根虫感染下完全脱叶。此外，Crw2突变体深受各种不同的植食性昆虫之害，包括日本金龟子、欧洲玉米螟、美国白蛾和cattail caterpillar。

实例10

玉蜀黍Crw2基因的生物化学特性

用甲苯胺蓝O(TBO)(其与细胞壁中的游离羟基基团反应)将Crw2突变体叶片染色，结果显示叶脉间细胞的染色减弱，这可能导致抗拉强度受损。为了测试这种染色减弱是否是细胞壁结合的对香豆酸(pCA)和阿魏酸(FA)的水平降低所致，用Crw2叶片和野生型叶片的幼年(V3期)上皮细胞壁和成年(V8期)上皮细胞壁进行了对这些羟基肉桂酸的定量。在Crw2突变体中  观察到pCA水平和FA水平较之野生型近亲显著降低，但这种显著降低只在成叶中观察到(图10A)。

为了确定这种羟基肉桂酸水平降低是否还导致了木质素水平降低，从成年(V8期)Crw2突变体叶片和野生型近亲叶片的分离细胞壁作为乙酰溴可溶性(ABS)部分提取出木质素，随后通过紫外光谱法进行了分析。果不其然，Crw2突变体的成叶中的ABS木质素水平较之野生型叶片中的ABS木质素水平明显低得多(p＜0.05；非配对t检验)(图10B)。

Claims (15)

1.一种增强植物对昆虫害植食性的抗性的方法，包括：

(a)向可再生植物细胞中引入重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含有效连接到至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal W比对方法与SEQ ID NO：2、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22和23相比具有至少80％的序列同一性；以及

(b)在步骤(a)后从所述可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对植物害虫的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对昆虫害虫植食性的抗性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目(Coleopteran)昆虫。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述昆虫害虫为鳞翅目(Lepidopteran)昆虫。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单子叶植物为玉蜀黍。

7.一种鉴定赋予植物对昆虫害虫植食性的增强抗性的Crw2变体的方法，所述方法包括以下步骤：

a.通过基因改组将一个或多个核苷酸序列合并，所述一个或多个核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的一个或多个片段，或与SEQ ID NO：2具有至少70％同一性的蛋白质或其片段；

b.将来自步骤(a)的所述改组序列转化进可再生植物细胞的群体；

c.从步骤(b)的转化的可再生植物细胞的群体再生出转化植物的群体；

d.从来自步骤(c)的转化植物的群体筛选对所述昆虫害虫增强的抗性；以及

e.从所述转化植物中鉴定出表现所述增强的抗性的变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

f.向可再生植物细胞引入重组构建体，所述重组构建体包含通过权利要求7所述的方法鉴定出的Crw2变体；

g.在步骤(f)后从所述可再生植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

h.选择(g)的转基因植物，其中所述转基因植物包含所述重组DNA构建体并表现出与不包含所述重组DNA构建体的对照植物相比增强的对所述昆虫害虫的抗性。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目(Coleopteran)昆虫。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述昆虫害虫为鳞翅目(Lepidopteran)昆虫。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述植物为单子叶植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述单子叶植物为玉蜀黍。

13.一种鉴定玉蜀黍植物中的Crw2等位基因变体的方法，其中所述等位基因变体与对昆虫害虫植食性的抗性增强相关，所述方法包括以下步骤：

a.获得玉蜀黍植物的群体，其中所述玉蜀黍植物表现出对所述昆虫害虫的不同抗性水平；

b.关于编码包含SEQ ID NO：2的蛋白质的多核苷酸序列、或在调控编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区中评价等位基因变异；

c.将等位基因变异与所述抗性相关联；以及

d.鉴定出与对所述昆虫害虫的抗性增强相关联的等位基因变体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目(Coleopteran)昆虫。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述昆虫害虫为鳞翅目(Lepidopteran)昆虫。