BR122022011642B1 - Método de elaboração de produto - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, particularmente patógenos da ordem Pucciniales, preferencialmente da família Phacosporaceae, em plantas e/ou células vegetais. Isso é conseguido por meio de aumento da expressão de uma proteína CASAR ou seu fragmento em uma planta, parte de planta e/ou célula vegetal em comparação com plantas do tipo selvagem, partes de plantas do tipo selvagem e/ou células de plantas do tipo selvagem. Além disso, a presente invenção refere-se a plantas transgênicas, partes de plantas e/ou células vegetais que possuem maior resistência contra patógenos fúngicos, particularmente patógenos da ordem Pucciniales, preferencialmente da família Phacopsoraceae, e a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência que é idêntica ou homóloga a uma sequência que codifica uma proteína CASAR.

Description

DIVIDIDO DO BR 11 2015 007209-7, DEPOSITADO EM 07/11/2013

[001] O depositante reivindica prioridade de EP 12192316.3, depositado em 13 de novembro de 2012, que é integralmente incorporado ao presente como referência.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a um método de aumento da resistência a patógenos fúngicos, particularmente patógenos da ordem Pucciniales, tais como ferrugem da soja, em plantas, partes de plantas e/ou células vegetais. Isso é conseguido por meio de aumento da expressão e/ou atividade de uma proteína CASAR em uma planta, parte de planta e/ou célula vegetal em comparação com plantas do tipo selvagem, partes de plantas do tipo selvagem e/ou células de plantas do tipo selvagem.

[003] Além disso, a presente invenção refere-se a plantas transgênicas, partes de plantas e/ou células vegetais que possuem maior resistência a patógenos fúngicos, particularmente patógenos da ordem Pucciniales, tais como ferrugem da soja, e a vetores de expressão recombinantes que compreendem uma sequência que é idêntica ou homóloga a uma sequência que codifica uma proteína CASAR.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] O cultivo de plantas de safras agrícolas serve principalmente para a produção de alimentos para seres humanos e animais. Monoculturas em particular, que são a norma atualmente, são altamente susceptíveis à difusão de doenças similar a epidêmica. O resultado é rendimento notadamente reduzido. Até o momento, os organismos patogênicos vêm sendo principalmente controlados pelo uso de pesticidas. Atualmente, a possibilidade de modificação direta da disposição genética de uma planta ou patógeno também é aberta para o homem.

[005] A resistência geralmente descreve a capacidade de uma planta de evitar ou pelo menos combater a infestação e a colonização por patógenos daninhos. Podem ser discernidos diferentes mecanismos na resistência de ocorrência natural, com os quais as plantas resistem à colonização por organismos fitopatogênicos. Essas interações específicas entre o patógeno e o hospedeiro determinam o curso da infecção (Schopfer e Brennicke (1999), Pflanzenphysiologie, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, Alemanha).

[006] Com relação à resistência específica de raças, também denominada resistência de hospedeiros, realiza-se diferenciação entre interações compatíveis e incompatíveis. Na interação compatível, ocorre interação entre um patógeno virulento e uma planta susceptível. O patógeno sobrevive e pode acumular estruturas de reprodução, enquanto o hospedeiro principalmente morre. Ocorre interação incompatível, por outro lado, quando o patógeno infecta a planta, mas seu crescimento é inibido antes ou depois do desenvolvimento fraco de sintomas (principalmente pela presença de genes R da família de nucleotídeo-local de ligação-repetição rica em leucina (NBS- LRR), vide abaixo). Neste último caso, a planta é resistente ao patógeno correspondente (Schopfer e Brennicke, vide acima). Este tipo de resistência, entretanto, é específico para uma certa linhagem ou patógeno.

[007] Em interações compatíveis e incompatíveis, ocorre reação defensiva e específica do hospedeiro ao patógeno. Na natureza, entretanto, esta resistência frequentemente é superada devido ao rápido desenvolvimento evolutivo de novas raças virulentas dos patógenos (Neu et al (2003), American Cytopathol. Society, MPMI 16 n° 7: 626-633).

[008] A maior parte dos patógenos é específica de espécies vegetais. Isso significa que um patógeno pode induzir uma doença em uma certa espécie vegetal, mas não em outra espécie vegetal (Heath (2002), Can.J. Plant Pathol. 24: 259-264). A resistência contra um patógeno em certas espécies vegetais é denominada resistência não a hospedeiro. A resistência não a hospedeiro oferece proteção forte, ampla e permanente contra fitopatógenos. Genes que fornecem resistência não a hospedeiros fornecem a oportunidade de proteção forte, ampla e permanente contra certas doenças em plantas não hospedeiras. Particularmente, essa resistência funciona para diferentes linhagens do patógeno.

[009] Os fungos são distribuídos em todo o mundo. São conhecidas atualmente cerca de 100.000 espécies diferentes de fungos. Dentre eles, as ferrugens são de grande importância. Elas podem ter ciclo de desenvolvimento complicado, com até cinco estágios de esporos diferentes (espermácio, aecidiósporo, uredósporo, teleutósporo e basidiósporo).

[0010] Durante a infecção de plantas por fungos patogênicos, são comumente observadas fases diferentes. As primeiras fases da interação entre fungos fitopatogênicos e suas potenciais plantas hospedeiras são decisivas para a colonização da planta pelo fungo. Durante o primeiro estágio da infecção, os esporos são fixados à superfície das plantas, germinam e o fungo penetra na planta. Os fungos podem penetrar na planta por meio de portas existentes tais como estomas, lenticelas, hidatódios e feridas, ou penetram na epiderme da planta diretamente como resultado da força mecânica e com o auxílio de enzimas de digestão das paredes celulares. Estruturas de infecção específicas são desenvolvidas para penetração da planta.

[0011] Imediatamente após o reconhecimento de um patógeno potencial, a planta começa a realizar reações de defesa. A presença do patógeno é principalmente verificada por meio dos chamados receptores de PAMP, uma classe de quinases similares a receptores transmembranosos que reconhecem moléculas associadas a patógenos conservados (tais como flagelina ou chitina). Quinases similares a receptores (RLKs) são proteínas sinalizadoras que apresentam um domínio extracelular conectado por meio de um domínio transmembrana a uma quinase citoplasmática. Esta arquitetura indica que RLKs percebem sinais externos, realizando sua transdução para a célula. Em plantas, RLKs foram relacionadas em primeiro lugar à regulagem do desenvolvimento, reações de patógenos e eventos de reconhecimento (Santiago A. Morillo e Frans E. Tax (2006), Functional Analysis of ReceptorLike Kinases in Monocots and Dicots, Current Opinion in Plant Biology 9: 460469).

[0012] Abaixo no fluxo dos receptores de PAMP, os fito-hormônios ácido salicíclico (SA), jasmonato (JA) e etileno (ET) desempenham papel fundamental na regulagem das diferentes reações de defesa. Dependendo da razão dos diferentes fito-hormônios, diferentes reações de defesa são permitidas pela célula hospedeira. Geralmente, a defesa dependente de SA é ligada à resistência contra patógenos biotróficos, enquanto reações de defesa dependentes de JA/ET são ativas contra patógenos necrotróficos (e insetos).

[0013] Além das reações de defesa localizadas, plantas que foram atacadas localmente por um patógeno induzem reação de defesa sistêmica de longa duração de “toda a planta” denominada resistência adquirida sistêmica (SAR). SAR é associada à indução de ampla variedade de genes (os denominados genes “relativos à patogênese" ou PR), uma explosão da substância de oxigênio reativa (ROS), produção de etileno e ao acúmulo de ácido salicílico (SA).

[0014] Lee e Hwang (Planta 2005, Vol. 221: 790-800) demonstraram que um gene denominado SAR8.2 (também conhecido como CASAR, para “SAR de Capsicum annuum”) acumula-se em folhas de pimenta sistêmicas como resultado de infecções por patógenos fúngicos e bacterianos, elicitadores abióticos e por tensões ambientais, tais como seca, sal e baixas temperaturas. A expressão ectópica de CASAR em Arabidopsis gera expressão constitutiva dos genes FR, incluindo AtPR-1, AtPR-4 e AtPR5. Além disso, a sobre-expressão de CASAR em Arabidopsis aumentou a resistência contra infecções por Pseudomonas syringae pv. tomato, Fusarium oxysporum f. sp. matthiolae ou Botrytis cinerea (Lee e Hwang, Plant Molecular Biology (2006) 61: 95-109). Além disso, Lee e Hwang (Plant Molecular Biology (2006) 61: 95-109) demonstraram que proteína CASAR recombinante purificada e extratos de proteína bruta das plantas transgênicas exibiram atividade antifúngica contra alguns fungos fitopatogênicos.

[0015] Lee e Hwang (Plant Molecular Biology (2006) 61: 95-109) não demonstram resistência ou atividade antifúngica aprimorada contra fungos heminotrotróficos, particularmente contra patógenos fúngicos da ordem Pucciniales (ferrugem). Este grupo específico de patógenos fúngicos é caracterizado por um ciclo de vida exclusivo.

[0016] A ferrugem de soja Phakopsora pachyrhizi, por exemplo, penetra diretamente na epiderme da planta. Após o cruzamento da célula epidérmica, o fungo atinge o espaço intercelular do mesófilo, onde o fungo começa a espalhar-se através das folhas. Para obter nutrientes, o fungo penetra nas células de mesófilos e desenvolve haustórios no interior da célula de mesófilo. Durante o processo de penetração, a membrana de plasma da célula de mesófilo penetrada permanece intacta. O fungo de ferrugem de soja estabelece, portanto, interação biotrófica com soja.

[0017] Os fungos fitopatogênicos biotróficos, tais como ferrugem da soja e todos os outros fungos de ferrugem, dependem para sua nutrição do metabolismo de células vivas das plantas. Este tipo de fungo pertence ao grupo de fungos biotróficos, como outros fungos de ferrugens, fungos de míldeo do pó ou patógenos de oomicetes, tais como o gênero Phytophthora ou Peronospora. Os fungos fitopatogênicos necrotróficos dependem para sua nutrição de células mortas das plantas, tais como espécies do gênero Fusarium, Rhizoctonia ou Mycospaerella. A ferrugem da soja ocupou uma posição intermediária, pois ela penetra diretamente na epiderme, mediante o quê a célula penetrada torna-se necrótica. Após a penetração, o fungo muda para um estilo de vida biotrófico obrigatório. O subgrupo dos patógenos fúngicos biotróficos que segue essencialmente essa estratégia de infecção é heminocrotrófico. Ao contrário de um patógeno heminocrotófico, um patógeno hemibiotrófico vive por curto período de tempo de forma biotrófica e começa em seguida a matar a célula hospedeira e/ou o organismo hospedeiro, ou seja, muda pelo resto do seu ciclo de vida para um estilo de vida necrotrófico.

[0018] Ferrugem da soja vem se tornando cada vez mais importante nos últimos tempos. A doença pode ser causada pelas ferrugens biotróficas Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae. Elas pertencem à classe Basidiomycota, ordem Pucciniales (ferrugem), conhecida anteriormente como Uredinales, família Phakopsoraceae. As duas ferrugens infectam um amplo espectro de plantas hospedeiras leguminosas. P. pachyrhizi, também denominado ferrugem asiática, é o patógeno mais agressivo sobre soja (Glycine max) e, portanto, ao menos atualmente, é de grande importância para a agricultura. P. pachyrhizi pode ser encontrado em quase todas as regiões de cultivo de soja tropicais e subtropicais do mundo. P. pachiyrhizi é capaz de infectar 31 espécies de 17 famílias de leguminosas sob condições naturais e é capaz de crescer sobre mais sessenta espécies sob condições controladas (Sinclair et al (Eds.), Proceedings of the Rust Workshop (1995), National Soya Research Laboratory, Publicação n° 1 (1996); Rytter, J. L. et al, Plant Dis. 87, 818 (1984)). P.meibomiae foi encontrado na Bacia do Caribe e em Porto Rico, mas não causou danos substanciais até aqui.

[0019] P. pachyrhizi pode ser controlado atualmente no campo apenas por meio de fungicidas. Plantas de soja com resistência a todo o espectro dos isolados não são disponíveis. Ao pesquisar acessos de soja resistentes, seis genes R dominantes da família NBS-LRR, denominados Rpp1-5 e Rpp?(Hyuuga), que mediam a resistência de soja a P. pachyrhizi, foram descobertos por meio da seleção de milhares de variedades de soja. Como os genes R são derivados de hospedeiro (soja), a resistência foi perdida rapidamente, pois P. pachyrhizi desenvolve novas raças virulentas.

[0020] Nos últimos anos, doenças fúngicas, tais como ferrugem da soja, ganharam importância como pragas na produção agrícola. Houve, portanto, demanda no estado da técnica pelo desenvolvimento de métodos de controle de fungos e fornecimento de plantas resistentes a fungos.

[0021] Muita pesquisa vem sendo realizada no campo de míldeo do pó e felpudo que infecta a camada epidérmica das plantas. O problema de combater a ferrugem da soja que infecta o mesófilo, entretanto, permanece sem solução.

[0022] O objeto da presente invenção é, entre outros, o fornecimento de um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja.

[0023] Surpreendentemente, descobrimos que patógenos fúngicos, particularmente da ordem Pucciniales, particularmente da família Phakopsoraceae, tais como ferrugem da soja, podem ser controlados aumentando a expressão de um gene CASAR.

[0024] A presente invenção fornece, portanto, um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, em plantas transgênicas, partes de plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas por meio da sobre-expressão de um ou mais ácidos nucleicos CASAR.

[0025] Um objeto adicional é o fornecimento de plantas transgênicas resistentes contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, um método de produção dessas plantas e uma construção de vetor útil para os métodos acima.

[0026] A presente invenção também se refere, portanto, a uma construção de vetor recombinante e uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que compreende um ácido nucleico CASAR exógeno. Além disso, é reivindicado no presente um método de produção de planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica utilizando o ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Adicionalmente, é reivindicado no presente o uso de um ácido nucleico ou do vetor recombinante de acordo com a presente invenção para transformação de planta, parte de planta ou célula vegetal.

[0027] Os objetos da presente invenção, conforme descrito acima, são atingidos pelo objeto das reivindicações principais. Realizações preferidas da presente invenção são definidas pelo objeto das reivindicações dependentes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0028] O objeto da presente invenção é, entre outros, o fornecimento de um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja.

[0029] Surpreendentemente, descobrimos que a resistência contra patógenos fúngicos, particularmente da ordem Phakopsoraceae, tais como ferrugem da soja, pode ser amplificada aumentando a expressão de um gene CASAR.

[0030] A presente invenção fornece, portanto, um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, em plantas transgênicas, partes de plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas por meio da sobre- expressão de um ou mais ácidos nucleicos CASAR.

[0031] Um objeto adicional é o fornecimento de plantas transgênicas resistentes contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, um método de produção dessas plantas e uma construção de vetor útil para os métodos acima.

[0032] A presente invenção também se refere, portanto, a uma construção de vetor recombinante e uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que compreende um ácido nucleico CASAR exógeno. Além disso, é reivindicado no presente um método de produção de planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica utilizando o ácido nucleico de acordo com a presente invenção. Adicionalmente, é reivindicado no presente o uso de um ácido nucleico ou do vetor recombinante de acordo com a presente invenção para transformação de planta, parte de planta ou célula vegetal.

[0033] Os objetos da presente invenção, conforme descrito acima, são atingidos pelo objeto das reivindicações principais. Realizações preferidas da presente invenção são definidas pelo objeto das reivindicações dependentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0034] A Figura 1 exibe o sistema de avaliação utilizado para determinar o nível de área de folha doente do tipo selvagem e plantas de soja transgênicas contra o fungo da ferrugem P. pachyrhizi (conforme descrito em Godoy, C. V., Koga, L. J. e Canteri, M. G., Diagrammatic scale for assessment of soybean rust severity, Fitopatologia Brasileira, 31: 063-068, 2006).

[0035] A Figura 2 exibe a ilustração esquemática do vetor de transformação vegetal que abriga o cDNA de CASAR sob o controle do promotor ubiquitina de salsa.

[0036] A Figura 3 exibe a ilustração esquemática do vetor de transformação vegetal que abriga o cDNA de CASAR sob o controle do “promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem”, induzido por patógeno.

[0037] A Figura 4 exibe a sequência de cDNA com comprimento total de um gene CASAR de Capsicum annuum que possui SEQ ID NO: 1.

[0038] A Figura 5 exibe a sequência de cDNA com comprimento total de um gene CASAR que possui otimização de códons para expressão ideal em soja que possui SEQ ID NO: 2.

[0039] A Figura 6 exibe a sequência de proteína CASAR (SEQ ID N° 3).

[0040] A Figura 7 exibe a sequência do promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem que possui SEQ ID NO: 4.

[0041] A Figura 8 exibe o resultado da avaliação de 43 plantas de soja transgênicas (derivadas de cinco eventos independentes) que expressam a construção de vetor de sobre-expressão de CASAR. Plantas de soja T1 que expressam proteína CASAR foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. A avaliação da área de folha doente sobre todas as folhas foi realizada quatorze dias após a inoculação. O percentual médio da área de folha que exibe colônias fúngicas ou forte amarelamento/escurecimento sobre todas as folhas foi considerado área de folha doente. Todas as 43 plantas de soja T1 que expressam CASAR (expressão verificada por meio de PCR RT) foram avaliadas em paralelo com plantas controle não transgênicas. A média da área de folha doente é exibida na Figura 7. A sobre-expressão de CASAR reduz significativamente (***: p < 0,001) a área de folha doente em comparação com plantas controle não transgênicas em 44,5%.

[0042] A Figura 9 contém uma breve descrição das sequências da listagem de sequências.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0043] A presente invenção pode ser compreendida mais facilmente por meio de referência à descrição detalhada a seguir das realizações preferidas da presente invenção e aos exemplos incluídos no presente.

DEFINIÇÕES:

[0044] A menos que indicado em contrário, os termos utilizados no presente devem ser compreendidos de acordo com o uso convencional pelos técnicos comuns no assunto correspondente. Além das definições de termos fornecidas no presente, definições de termos comuns em biologia molecular podem também ser encontradas em Rieger et al, 1991, Glossary of Genetics: Classical and Molecular, quinta edição, Berlim: Springer-Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, Eds., Current Protocols, joint venture entre a Greene Publishing Associates, Inc. e a John Wiley & Sons, Inc. (Suplemento de 1998).

[0045] Deve-se compreender que, da forma utilizada no relatório descritivo e nas reivindicações, “um” ou “uma” pode indicar um(a) ou mais, dependendo do contexto em que é utilizado. Desta forma, por exemplo, pode- se utilizar referência a “uma célula” pode indicar que pelo menos uma célula. Deve-se compreender que a terminologia utilizada no presente destina-se somente a propósitos de descrição de realizações específicas e não se destina a ser limitadora.

[0046] Ao longo de todo o presente pedido, faz-se referência a diversas publicações. As revelações de todas essas publicações e das referências mencionadas nessas publicações são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência, a fim de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual pertence a presente invenção. Métodos padrão de clonagem, isolamento, amplificação e purificação de DNA para reações enzimáticas que envolvem ligase de DNA, polimerase de DNA, endonucleases de restrição e similares, bem como vários métodos de separação, são os conhecidos e comumente empregados pelos técnicos no assunto. Diversos métodos padrão são descritos em Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview NY; Maniatis et al, 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview NY; Wu (Ed.), 1993, Meth. Enzymol. 218, Parte I; Wu (Ed.), 1979, Meth. Enzymol. 68;Wu et al (Eds.), 1983, Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds.), 1980, Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.), 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Old e Primrose, 1981, Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif e Wensink, 1982, Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985, DNA Cloning, Vol. I e II, IRL Press, Oxford, Reino Unido; Hames e Higgins (Eds.), 1985, Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, Reino Unido; e Setlow e Hollaender, 1979, Genetic Engineering: Principles and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, Nova Iorque. Abreviações e nomenclatura, quando empregadas, são consideradas padrão no campo e comumente utilizadas em publicações profissionais tais como as mencionadas no presente.

[0047] “Homólogos” de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e/ou enzimas que possuem substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos com relação à proteína não modificada em questão e possuem atividade funcional similar à proteína não modificada da qual são derivados.

[0048] “Homólogos” de um ácido nucleico englobam nucleotídeos e/ou polinucleotídeos que possuem substituições, exclusões e/ou inserções de ácidos nucleicos com relação ao ácido nucleico não modificado em questão, em que a proteína codificada por esses ácidos nucleicos possui atividade funcional similar à proteína não modificada codificada pelo ácido nucleico não modificado do qual é derivada. Particularmente, homólogos de um ácido nucleico podem englobar substituições com base no código de aminoácido degenerativo.

[0049] Os termos “identidade”, “homologia” e “similaridade” são utilizados de forma intercambiável no presente. “Identidade”, “homologia” ou “similaridade” entre duas sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos designam, em cada caso, ao longo de todo o comprimento da sequência de ácidos nucleicos CASAR ou sequência de aminoácidos CASAR correspondente.

[0050] Preferencialmente, “percentual de identidade de sequências” é calculado por meio de comparação de duas sequências alinhadas idealmente sobre uma região específica, determinação da quantidade de posições nas quais o aminoácido ou base idêntica ocorre nas duas sequências, a fim de gerar a quantidade de posições coincidentes, divisão da quantidade dessas posições pelo número total de posições na região sendo comparada e multiplicação do resultado por 100.

[0051] Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica e esses métodos incluem GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch ((1970), J. Mol. Biol. 48: 443-453), para encontrar o alinhamento global (ou seja, que cobre as sequências completas) de duas sequências que maximiza o número de coincidências e minimiza o número de intervalos. O algoritmo BLAST (Altschul et al (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-10) calcula o percentual de identidade, similaridade ou homologia de sequências e realiza análise estatística da identidade, similaridade ou homologia entre as duas sequências. O software para realização de análises BLAST é disponível ao público por meio do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI). Homólogos podem ser facilmente identificados utilizando, por exemplo, o algoritmo de alinhamento de sequências múltiplas ClustalW (versão 1.83) com os parâmetros de alinhamento em pares padrão e um método de avaliação percentual. Percentuais globais de similaridade, homologia e identidade podem também ser determinados utilizando um dos métodos disponíveis no pacote de software MatGAT (Campanella et al, BMC Bioinformatics, dez de julho de 2003; 4: 29, MatGAT: an Application that Generates Similarity/Homology/Identity Matrices Using Protein or DNA Sequences). Podem ser realizadas pequenas edições manuais para otimizar o alinhamento entre motivos conservados, como seria evidente para os técnicos no assunto. Além disso, em vez de utilizar sequências de comprimento total para identificação de homólogos, podem também ser empregados domínios específicos. Os valores de identidade de sequências podem ser determinados ao longo de toda a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos ou de domínios selecionados ou motivo(s) conservado(s), utilizando os programas mencionados acima utilizando os parâmetros padrão. Para alinhamentos locais, o algoritmo de Smith-Waterman é particularmente útil (Smith, T. F., Waterman, M. S. (1981), J. Mol. Biol. 147 (1); 195-7).

[0052] A identidade de sequências pode também ser calculada, por exemplo, por meio do programa Vector NTI Suíte 7.1 da companhia Informax (Estados Unidos), empregando o Método Clustal (Higgins, D. G., Sharp, P. M., Fast and Sensitive Multiple Sequence Alignments on a Microcomputer, Comput. Appl. Biosci. abril de 1989; 5 (2): 151-1) com as configurações a seguir:

[0053] Alternativamente, a identidade pode ser determinada de acordo com Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez,Rodrigo, Gibson, Toby J., Higgins, Desmond G., Thompson, Julie D., Multiple Sequence Alignment with the Clustal Series of Programs (2003), Nucleic Acids Res. 31 (13): 3497-500, o site: http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html# e as configurações a seguir:

[0054] A identidade de sequências entre o ácido nucleico ou proteína útil de acordo com a presente invenção e os ácidos nucleicos CASAR ou proteínas CASAR pode ser otimizada por meio de algoritmos de alinhamento e comparação de sequências conhecidos na técnica (vide Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991, e referências ali mencionadas) e cálculo do percentual de diferença entre as sequências de proteínas ou nucleotídeos, por exemplo, por meio do algoritmo de Smith-Waterman conforme implementado no programa de software BESTFIT utilizando parâmetros padrão (por exemplo, Grupo de Computação Genética da Universidade de Wisconsin).

[0055] “Exclusão” designa remoção de um ou mais aminoácidos de uma proteína ou a remoção de um ou mais ácidos nucleicos de DNA, ssRNA e/ou dsRNA.

[0056] “Inserção” designa um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de ácidos nucleicos que são introduzidos em um local previamente determinado em uma proteína ou ácido nucleico.

[0057] “Substituição” designa a substituição de aminoácidos da proteína por outros aminoácidos que possuam propriedades similares (tais como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade, propensão à formação ou rompimento de estruturas α-helicoidais ou estruturas de folhas beta similares).

[0058] Sobre o nível de ácido nucleico, substituição designa a substituição de um ou mais nucleotídeos por outros nucleotídeos em um ácido nucleico, em que a proteína codificada pelo ácido nucleico modificado possui função similar. Particularmente, homólogos de um ácido nucleico englobam substituições com base no código de aminoácido degenerativo.

[0059] Substituições de aminoácidos são tipicamente de resíduos isolados, mas podem ser reunidas dependendo de restrições funcionais colocadas sobre a proteína e podem variar de um a dez aminoácidos; inserções ou exclusões serão normalmente da ordem de cerca de um a dez resíduos de aminoácidos. As substituições de aminoácidos são preferencialmente substituições de aminoácidos conservadoras. Tabelas de substituição conservadoras são bem conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Creighton (1984), Proteins, W. H. Freeman & Company (Eds.) e Tabela 1 abaixo; ou Taylor, W. R. (1986), The Classification of Amino Acid Conservation, J. Theor. Biol., 119: 205-18).TABELA 1

[0060] Exemplos de substituições de aminoácidos conservados:

[0061] Substituições, exclusões e/ou inserções de aminoácidos podem ser feitas facilmente utilizando métodos sintéticos de peptídeos bem conhecidos na técnica, tais como síntese de peptídeos em fase sólida e similares, ou por meio da manipulação de DNA recombinante.

[0062] Os métodos de manipulação de sequências de DNA para produzir variantes de substituição, inserção ou exclusão de uma proteína são bem conhecidos na técnica. Métodos de elaboração de mutações de substituição em locais previamente determinados em DNA são bem conhecidos dos técnicos no assunto, por exemplo, e incluem mutagênese de M13, mutagênese in vitro de Gene T7 (USB, Cleveland OH), mutagênese dirigida a local QuickChange (Stratagene, San Diego CA), mutagênese dirigida a local mediada por PCR ou outros protocolos de mutagênese dirigida a local.

[0063] Ortólogos e parálogos englobam conceitos evolucionários utilizados para descrever as relações ancestrais de genes. Os parálogos são genes dentro da mesma espécie que se originaram da duplicação de um gene ancestral; ortólogos são genes de diferentes organismos que se originaram por meio da formação de espécies e também são derivados de um gene ancestral comum.

[0064] O termo “codificar” ou “codificação” é utilizado para designar a capacidade de um ácido nucleico de conter as informações para a sequência de aminoácidos de uma proteína por meio do código genético, ou seja, a sucessão de códons, em que cada um é uma sequência de três nucleotídeos, que especificam qual aminoácido será adicionado a seguir durante a síntese de proteína. Os termos “codificar” ou “codificação” incluem, portanto, todos os quadros de leitura possíveis de um ácido nucleico. Além disso, os termos “codificar” ou “codificação" também se aplicam a ácidos nucleicos cujas sequências de codificação são interrompidas por sequências de ácidos nucleicos não codificadoras, que são removidas antes da tradução, tais como uma sequência de ácidos nucleicos que compreende introns.

[0065] O termo “domínio” designa um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas com evolução relacionada. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína.

[0066] Existem bancos de dados especializados para identificação de domínios, tais como SMART (Schultz et al (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 5857-5864; Letunic et al (2002), Nucleic Acids Res. 30, 242-244), InterPro (Mulder et al (2003), Nucl. Acids Res. 31, 315-318), Prosite (Bucher e Bairoch (1994), A Generalized Profile Syntax for Biomolecular Sequences Motifs and its Function in Automatic Sequence Interpretation, em ISMB-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, Altman, R., Brutlag, D., Karp, P., Lathrop, R., Searls, D., Eds., págs. 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al, Nucl. Acids Res. 32: D134-D137 (2004)) ou Pfam (Bateman et al, Nucleic Acids Research 30 (1): 276-280 (2002)). Um conjunto de ferramentas para análise in silico de sequências de proteínas é disponível no servidor proteômico ExPASy (Instituto Suíço de Bioinformática (Gasteiger et al, ExPASy: The Proteomics Server for In-Depth Protein Knowledge and Analysis, Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788(2003)). Domínios ou motivos podem também ser identificados utilizando métodos rotineiros, tais como alinhamento de sequências.

[0067] Da forma utilizada no presente, as expressões “resistência fúngica”, “resistência a fungos” e/ou “resistente a fungos” indicam a redução, prevenção ou retardamento de infecções por fungos. O temo “resistência” designa resistência fúngica. Resistência não indica que a planta possui necessariamente 100% de resistência a infecções. Em realizações preferidas, ampliação ou aumento da resistência fúngica indica que a resistência em uma planta resistente é de mais de 10%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90% ou mais de 95% em comparação com uma planta do tipo selvagem.

[0068] Da forma utilizada no presente, as expressões “resistência à ferrugem da soja”, “resistente a uma ferrugem da soja”, “resistente à ferrugem da soja”, “resistência à ferrugem”, “resistente a uma ferrugem” ou “resistente à ferrugem” indicam a redução, prevenção ou retardamento de infecções de plantas, partes de plantas ou células vegetais por Phakopsoracea, particularmente Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja ou ferrugem da soja asiática (ASR), em comparação com uma planta do tipo selvagem, parte de planta do tipo selvagem ou célula de planta do tipo selvagem. Resistência não indica que a planta possui necessariamente 100% de resistência a infecções. Em realizações preferidas, ampliação ou aumento da resistência à ferrugem indica que a resistência à ferrugem em uma planta resistente é de mais de 10%, mais de 20%, mais de 30%, mais de 40%, mais de 50%, mais de 60%, mais de 70%, mais de 80%, mais de 90% ou mais de 95% em comparação com uma planta do tipo selvagem que não é resistente à ferrugem da soja. Preferencialmente, a planta do tipo selvagem é uma planta de genótipo similar, de maior preferência idêntico, que possui maior resistência à ferrugem de soja, mas não compreende um ácido nucleico CASAR exógeno, seus fragmentos funcionais e/ou um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se com um ácido nucleico CASAR.

[0069] O nível de resistência a fungos de plantas pode ser determinado de diversas formas, tal como por meio de avaliação/medição da área de folha infectada com relação à área de folha geral. Outra possibilidade de determinar o nível de resistência é contar a quantidade de colônias de ferrugem de soja sobre a planta ou medir a quantidade de esporos produzidos por essas colônias. Outra forma de resolver o grau de infestação fúngica é medir especificamente a quantidade de DNA de ferrugem por meio de (q) PCR quantitativa. Sondas e sequências de primer específicas para a maior parte dos patógenos fúngicos são disponíveis na literatura (Frederick, R. D., Snyder, C. L., Peterson, G. L. et al, 2002, Polymerase Chain Reaction Assays for the Detection and Discrimination of the Rust Pathogens Phakopsora pachyrhizi and P. meibomiae, Phytopathology 92 (2) 217-227).

[0070] O termo “hibridização”, da forma utilizada no presente, inclui “qualquer processo por meio do qual uma fita de molécula de ácido nucleico liga-se a uma fita complementar por meio de emparelhamento de bases” (J. Coombs (1994), Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, Nova Iorque). Hibridização e a resistência de hibridização (ou seja, a resistência da associação entre as moléculas de ácidos nucleicos) sofrem impacto de fatores tais como o grau de complementaridade entre as moléculas de ácidos nucleicos, a estringência das condições envolvidas, a Tm do híbrido formado e a razão G:C dentro das moléculas de ácido nucleico.

[0071] Da forma utilizada no presente, o termo “Tm” é utilizado em referência à “temperatura de fusão”. A temperatura de fusão é a temperatura à qual uma população de moléculas de ácido nucleico de fita dupla dissocia-se pela metade em fitas simples. A equação para cálculo da Tm de moléculas de ácido nucleico é bem conhecida na técnica. Como indicado por meio de referências padrão, uma estimativa simples do valor da Tm pode ser calculada pela equação: Tm = 81,5 + 0,41 (% G+C), quando uma molécula de ácido nucleico estiver em solução aquosa a 1 M de NaCl (vide, por exemplo, Anderson e Young, Quantitative Filter Hybridization, em Nucleic Acid Hybridization (1985). Outras referências incluem computações mais sofisticadas, que levam em conta características estruturais e de sequências para o cálculo da Tm. Condições estringentes são conhecidas dos técnicos no assunto e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989), 6.3.1-6.3.6.

[0072] Particularmente, a expressão “condições estringentes” designa condições em que 100 nucleotídeos contíguos ou mais, 150 nucleotídeos contíguos ou mais, 200 nucleotídeos contíguos ou mais ou 250 nucleotídeos contíguos ou mais, que são um fragmento ou idênticas à molécula de ácido nucleico complementar (DNA, RNA, ssDNA ou ssRNA) hibridiza-se sob condições equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C com lavagem em 2 X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C ou 65 °C, preferencialmente a 65 °C, com uma molécula de ácido nucleico específica (DNA; RNA, ssDNA ou ssRNA). Preferencialmente, as condições de hibridização são equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C com lavagem em 1 X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C ou 65 °C, preferencialmente 65 °C e, de maior preferência, as condições de hibridização são equivalentes à hibridização em 7% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50 °C com lavagem em 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 50 °C ou 65 °C, preferencialmente 65 °C. Preferencialmente, os nucleotídeos complementares hibridizam-se com um fragmento ou os ácidos nucleicos CASAR inteiros. Alternativamente, condições de hibridização preferidas englobam hibridização a 65 °C em 1x SSC ou a 42 °C em 1x SSC e 50% de formamida, seguidas por lavagem a 65 °C em 0,3x SSC ou hibridização a 50 °C em 4x SSC ou a 40 °C em 6x SSC e 50% de formamida,seguida por lavagem a 50 °C em 2x SSC. Condições de hibridização preferidas adicionais são 0,1% de SDS, 0,1 SSD e 65 °C.

[0073] O termo “planta” destina-se a englobar plantas em qualquer estágio de amadurecimento ou desenvolvimento, bem como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de plantas) retirados ou derivados de qualquer planta, a menos que indicado claramente em contrário pelo contexto. Partes de planta incluem, mas sem limitações, células vegetais, hastes, raízes, flores, óvulos, estames, sementes, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de anteras, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastas, cultivos de raízes peludas e/ou similares. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, as sementes compreendem os ácidos nucleicos CASAR exógenos. Em uma realização, as sementes podem desenvolver-se em plantas com maior resistência a infecções por fungos em comparação com uma variedade do tipo selvagem da semente vegetal. Da forma utilizada no presente, “célula vegetal” inclui, mas sem limitações, um protoplasta, célula produtora de gametas e célula que se regenera em uma planta inteira. O cultivo de tecido de vários tecidos de plantas e a regeneração das plantas a partir deles são bem conhecidos na técnica e amplamente publicados.

[0074] Referência no presente a uma proteína e/ou ácido nucleico “endógeno” designa a proteína e/ou ácido nucleico em questão, conforme encontrado em uma planta na sua forma natural (ou seja, sem que haja nenhuma intervenção humana).

[0075] A expressão ácido nucleico “exógeno” designa um ácido nucleico que tenha sido introduzido em uma planta por meio de tecnologia genética. Um ácido nucleico “exógeno” pode não ocorrer em uma planta na sua forma natural, ser diferente do ácido nucleico em questão conforme encontrado em uma planta na sua forma natural ou pode ser idêntico a um ácido nucleico encontrado em uma planta na sua forma natural, mas não integrado dentro do seu ambiente genético natural. O significado correspondente de “exógeno” é aplicado no contexto da expressão de proteínas. Uma planta transgênica que contém um transgene, ou seja, um ácido nucleico exógeno, pode, por exemplo, em comparação com a expressão do gene endógeno, encontrar aumento substancial da expressão da proteína ou gene correspondente no total. Um planta transgênica de acordo com a presente invenção inclui um ácido nucleico CASAR exógeno integrado em qualquer local genético e, opcionalmente, a planta pode também incluir o gene endógeno dentro dos antecedentes genéticos naturais.

[0076] Para os propósitos da presente invenção, “recombinante” indica com relação, por exemplo, a uma sequência de ácidos nucleicos, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão ou construção de vetor que compreende qualquer um ou mais ácidos nucleicos CASAR, em que todas essas construções são realizadas pelo homem por meio de métodos de tecnologia genética e: a. as sequências de um ou mais ácidos nucleicos CASAR ou uma de suas partes; ou b. sequência(s) de controle genético que é(são) ligada(s) operativamente à sequência de ácidos nucleicos CASAR de acordo com a presente invenção, tal como um promotor; ou c. a e b; não estão localizadas no seu ambiente genético natural ou foram modificadas pelo homem por meio de métodos de tecnologia genética. A modificação pode assumir a forma, por exemplo, de substituição, adição, exclusão, inversão ou inserção de um ou mais resíduos de nucleotídeos. O ambiente genético natural é compreendido como indicando o local cromossômico ou genômico natural na planta original, a presença em uma biblioteca genômica ou a combinação com o promotor natural.

[0077] Um cassete de expressão de ocorrência natural (tal como a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos com a sequência de ácidos nucleicos correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos de acordo com a presente invenção, conforme definido acima), por exemplo, torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão é modificado pelo homem por meio de métodos sintéticos não naturais (“artificiais”), tais como tratamento mutagênico. Métodos apropriados são descritos, por exemplo, em US 5.565.350, WO 00/15815 ou US 200405323. Além disso, um cassete de expressão de ocorrência natural (tal como a combinação de ocorrência natural do promotor natural das sequências de ácidos nucleicos com a sequência de ácidos nucleicos correspondente que codifica uma proteína útil nos métodos de acordo com a presente invenção, conforme definido acima) torna-se um cassete de expressão recombinante quando esse cassete de expressão não é integrado ao ambiente genético natural, mas em um ambiente genético diferente.

[0078] A expressão “ácido nucleico isolado” ou “proteína isolada” designa uma proteína ou ácido nucleico que não está localizado no seu ambiente natural, particularmente seu ambiente celular natural. Desta forma, um ácido nucleico isolado ou proteína isolada é essencialmente separada de outros componentes do seu ambiente natural. Os técnicos no assunto sabem, entretanto, que preparações de um ácido nucleico isolado ou uma proteína isolada podem exibir um certo grau de impurezas, dependendo do procedimento de isolamento empregado. Métodos de purificação de ácidos nucleicos e proteínas são bem conhecidos na técnica. O gene isolado pode ser isolado a partir de um organismo e pode ser feito pelo homem, tal como por meio de síntese química. Neste particular, ácido nucleico recombinante pode também apresentar-se em forma isolada.

[0079] Da forma utilizada no presente, o termo "transgênico” indica um organismo, tal como uma planta, célula vegetal, calo, tecido vegetal ou parte de planta que contém de forma exógena o ácido nucleico, construção recombinante, vetor ou cassete de expressão descrito no presente ou uma de suas partes que é preferencialmente introduzido por meio de processos não essencialmente biológicos, preferencialmente por meio de transformação com Agrobacteria. A construção recombinante ou uma de suas partes é integrada de forma estável em um cromossomo, de forma que seja passada para gerações sucessivas por meio de propagação clonal, propagação vegetal ou propagação sexual. Gerações sucessivas preferidas também são transgênicas. Processos essencialmente biológicos podem ser o cruzamento de plantas e/ou recombinação natural.

[0080] Planta transgênica, célula ou tecido vegetal para os propósitos da presente invenção é compreendida, portanto, como indicando que um ácido nucleico CASAR exógeno, construção recombinante, vetor ou cassete de expressão que inclui um ou mais ácidos nucleicos CASAR é integrado ao genoma por meio de tecnologia genética.

[0081] Planta do “tipo selvagem”, parte de planta do “tipo selvagem” ou célula de planta do “tipo selvagem” indica que a mencionada planta, parte de planta ou célula vegetal não expressa ácido nucleico CASAR exógeno nem proteína CASAR exógena.

[0082] Local natural indica o local sobre um cromossomo específico, preferencialmente o local entre certos genes, de maior preferência os mesmos antecedentes de sequências da planta original que é transformada.

[0083] Preferencialmente, a planta transgênica, célula vegetal ou seu tecido expressa os ácidos nucleicos CASAR, construções de CASAR ou conjuntos de expressão de CASAR descritos no presente.

[0084] O termo “expressão” ou “expressão genética” indica a transcrição de um ou mais genes específicos ou construção de vetor genético específico. O termo “expressão” ou “expressão genética” indica particularmente a transcrição de um ou mais genes ou construção de vetor genético em RNA estrutural (rRNA, tRNA) ou mRNA com ou sem tradução subsequente deste último em uma proteína. O processo inclui a transcrição de DNA e o processamento do produto de mRNA resultante. O termo “expressão” ou “expressão genética” pode também incluir a tradução do mRNA e, com isso, a síntese da proteína codificada, ou seja, expressão de proteína.

[0085] A expressão “aumento da expressão”, “expressão aprimorada”, “sobre-expressão” ou “aumento de teor”, da forma utilizada no presente, indica qualquer forma de expressão que seja adicional ao nível de expressão do tipo selvagem original. Para os propósitos da presente invenção, o nível de expressão do tipo selvagem original poderá também ser zero (ausência de expressão).

[0086] Métodos de aumento da expressão de genes ou produtos genéticos são bem documentados na técnica e incluem, por exemplo, sobre- expressão dirigida por promotores apropriados, uso de amplificadores da transcrição ou amplificadores da tradução. Ácidos nucleicos isolados que servem de elementos promotores ou amplificadores podem ser introduzidos em uma posição apropriada (tipicamente acima no fluxo) de uma forma não heteróloga de polinucleotídeo, de forma a regular para cima a expressão de um ácido nucleico que codifica a proteína de interesse. Promotores endógenos, por exemplo, podem ser alterados in vivo por meio de mutação, exclusão e/ou substituição (vide Kmiec, US 5.565.350; Zarling et al, WO 9322443) ou promotores isolados podem ser introduzidos em uma célula vegetal na orientação e distância apropriadas de um gene de acordo com a presente invenção, de forma a controlar a expressão do gene.

[0087] A expressão “fragmento funcional” designa qualquer ácido nucleico ou proteína que compreende apenas uma parte do ácido nucleico com comprimento total ou proteína com comprimento total, respectivamente, mas ainda fornece a mesma função, tal como resistência a fungos, quando expresso ou reprimido em uma planta, respectivamente. Preferencialmente, o fragmento compreende pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% da sequência original. Preferencialmente, o fragmento funcional compreende ácidos nucleicos ou aminoácidos contíguos como no ácido nucleico original ou proteína original, respectivamente. Em uma realização, o fragmento de qualquer um dos ácidos nucleicos CASAR possui identidade conforme definido acima ao longo de um comprimento de pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 75% ou pelo menos 90% dos nucleotídeos do ácido nucleico CASAR correspondente.

[0088] A expressão “variante dividida”, da forma utilizada no presente, engloba variantes de uma sequência de ácidos nucleicos na qual introns e/ou exons selecionados foram extirpados, substituídos, deslocados ou adicionados ou nos quais introns foram reduzidos ou ampliados. Desta forma, uma variante dividida pode ter um ou mais, ou mesmo todos os introns removidos ou adicionados. Segundo esta definição, cDNA é considerado variante dividida da sequência genômica que contém introns correspondente e vice-versa. Essas variantes de divisão podem ser encontradas na natureza ou podem ser feitas pelo homem. Métodos de previsão e isolamento dessas variantes de divisão são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Foissac e Schiex (2005), BMC Bioinformatics 6: 25).

[0089] Em casos em que se deseja a sobre-expressão de ácido nucleico, a expressão “atividade funcional similar” ou “função similar” indica que qualquer homólogo e/ou fragmento fornece resistência a fungos quando expresso em uma planta. Preferencialmente, atividade funcional similar indica pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% ou mais de resistência a fungos em comparação com a atividade funcional fornecida pela expressão exógena da sequência de nucleotídeos CASAR conforme definido por SEQ ID NO: 1 ou 2 ou a sequência de proteínas CASAR conforme definido por SEQ ID NO: 3.

[0090] A expressão “aumento da atividade” ou “atividade aprimorada”, da forma utilizada no presente, indica qualquer proteína que possui atividade aprimorada e fornece resistência a fungos aprimorada em comparação com a planta do tipo selvagem que meramente expressa o ácido nucleico CASAR endógeno correspondente. Com relação à sobre-expressão, para os propósitos da presente invenção, o nível de expressão do tipo selvagem original poderá também ser zero (ausência de expressão).

[0091] Com relação a uma construção de vetor e/ou às moléculas de ácido nucleico recombinantes, a expressão “ligado operativamente” destina- se a indicar que o ácido nucleico a ser expresso é ligado à sequência reguladora, incluindo promotores, terminais, amplificadores e/ou outros elementos de controle da expressão (tais como sinais de poliadenilação), de forma que permita a expressão do ácido nucleico (por exemplo, em uma célula de planta hospedeira quando o vetor é introduzido na célula de planta hospedeira). Essas sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) e Gruber e Crosby, em: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Eds. Glick e Thompson, Capítulo 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Flórida, incluindo as referências ali contidas. Sequências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras e as que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Os técnicos no assunto apreciarão que o projeto do vetor pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de ácido nucleico desejado e similares.

[0092] O termo “introdução” ou “transformação”, da forma utilizada no presente, engloba a transferência de um polinucleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independentemente do método utilizado para transferência. Tecido vegetal capaz de propagação clonal subsequente, seja por meio de organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma construção de vetor de acordo com a presente invenção e uma planta inteira regenerada a partir dele. O tecido específico selecionado variará dependendo dos sistemas de propagação clonal disponíveis e mais apropriados para as espécies específicas sendo transformadas. Exemplos de alvos de tecido incluem discos de folhas, pólen, embriões, cotilédones, hipocotilédones, megagametófitos, tecido de calo, tecido meristemático existente (tal como meristema de ápice, botões axilares e meristemas de raízes) e tecido de meristema induzido (tal como meristema de cotilédone e meristema de hipocotilédone). O polinucleotídeo pode ser introduzido de forma transitória ou estável em uma célula hospedeira e pode ser mantido não integrado, por exemplo, na forma de plasmídeo. Alternativamente, ele pode ser integrado ao genoma hospedeiro. O genoma hospedeiro inclui o ácido nucleico contido no núcleo, bem como o ácido nucleico contido nos plastídeos, tais como cloroplastas e/ou mitocôndrias. A célula vegetal transformada resultante pode ser utilizada em seguida para regenerar uma planta transformada de forma conhecida dos técnicos comuns no assunto.

[0093] O termo “terminal” engloba uma sequência de controle que é uma sequência de DNA na extremidade de uma unidade de transcrição que sinaliza o processamento 3' e a poliadenilação de um transcrito primário e término de transcrição. O terminal pode ser derivado do gene natural, de uma série de outros genes vegetais ou de T-DNA. O terminal a ser adicionado pode ser derivado, por exemplo, dos genes nopalino sintase ou octopino sintase ou, alternativamente, de outro gene vegetal ou, de menor preferência, de qualquer outro gene eucariótico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO ÁCIDOS NUCLEICOS CASAR:

[0094] O ácido nucleico CASAR a ser sobre-expresso a fim de atingir maior resistência a patógenos fúngicos, por exemplo, da família Phakopsoraceae, tal como ferrugem da soja, é preferencialmente um ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR e é preferencialmente conforme definido por SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos, homólogos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão. Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais ou variantes de divisão. É de maior preferência identidade de pelo menos 90%, identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27.

[0095] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR a ser sobre- expresso a fim de atingir maior resistência a patógenos fúngicos, por exemplo, da família Phakopsoraceae, tal como ferrugem da soja, é preferencialmente um ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR e é preferencialmente conforme definido por SEQ ID NO: 1 ou um de seus fragmentos, homólogos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão. Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 1 ou é um de seus fragmentos funcionais ou variantes de divisão. É de maior preferência identidade de pelo menos 90%, identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 1.

[0096] De maior preferência, o ácido nucleico CASAR a ser sobre- expresso a fim de atingir maior resistência a patógenos fúngicos, por exemplo, da família Phakopsoraceae, tal como ferrugem da soja, é preferencialmente um ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR e é preferencialmente conforme definido por SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos, homólogos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão. Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2 ou é um de seus fragmentos funcionais ou variantes de divisão. É de maior preferência identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 2.

[0097] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende ou consiste de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste de: i. um ácido nucleico que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR e possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; (iii)uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma sequência complementar de qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos de (i) ou (ii) sob condições de hibridização sob alta estringência; que codificam preferencialmente uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína CASAR dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[0098] Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28. É de maior preferência identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[0099] Preferencialmente, o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3. É de maior preferência identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 3.

[00100] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR é uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende ou consiste de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste de: i. um ácido nucleico que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais, ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR e possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; (iii)uma molécula de ácido nucleico que se hibridiza com uma sequência complementar de qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos de (i) ou (ii) sob condições de hibridização sob alta estringência; que codificam preferencialmente uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína CASAR dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00101] Os percentuais de identidade de ácido nucleico são indicados com referência à região de nucleotídeo completa fornecida em uma sequência descrita especificamente no presente.

[00102] Preferencialmente, a parte do ácido nucleico CASAR contém cerca de 150-160, cerca de 160-170, cerca de 170-180, cerca de 180-190, cerca de 190-200, cerca de 200-210, cerca de 210-220, cerca de 220-230, cerca de 230-240, cerca de 240-250 ou cerca de 250-261 nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos consecutivos,preferencialmente contados a partir da extremidade 5' ou 3' do ácido nucleico, em comprimento, das sequências de ácidos nucleicos fornecidas em SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27.

[00103] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR compreende pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 170, pelo menos cerca de 180, pelo menos cerca de 190, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 210, pelo menos cerca de 220, pelo menos cerca de 230, pelo menos cerca de 240 ou pelo menos cerca de 250 nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos contínuos, preferencialmente contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico ou até o comprimento total da sequência de ácidos nucleicos descrita em SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27.

[00104] Preferencialmente, a parte do ácido nucleico CASAR contém cerca de 150-160, cerca de 160-170, cerca de 170-180, cerca de 180-190, cerca de 190-200, cerca de 200-210, cerca de 210-220, cerca de 220-230, cerca de 230-240, cerca de 240-250 ou cerca de 250-261 nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos consecutivos,preferencialmente contados a partir da extremidade 5' ou 3' do ácido nucleico, em comprimento, das sequências de ácidos nucleicos fornecidas em SEQ ID NO: 2 ou 1.

[00105] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR compreende pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 125, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 170, pelo menos cerca de 190, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 210, pelo menos cerca de 220, pelo menos cerca de 230, pelo menos cerca de 240 ou pelo menos cerca de 250 nucleotídeos, preferencialmente nucleotídeos contínuos, preferencialmente contados a partir da extremidade 5’ ou 3’ do ácido nucleico ou até o comprimento total da sequência de ácidos nucleicos descrita em SEQ ID NO: 2 ou 1.

[00106] Todas as sequências de ácidos nucleicos mencionadas no presente (sequências de DNA e RNA de fita simples e fita dupla, tais como cDNA e mRNA) podem ser produzidas de forma conhecida por meio de síntese química a partir dos blocos de construção de nucleotídeos, tal como por meio de condensação de fragmentos de blocos de construção de ácidos nucleicos complementares sobrepostos individuais da hélice dupla. A síntese química de oligonucleotídeos pode ser realizada de forma conhecida, por exemplo, por meio do método de fosfoamidita (Voet, Voet, segunda edição, Wiley Press, Nova Iorque, págs. 896-897). O acúmulo de oligonucleotídeos sintéticos e o preenchimento de intervalos por meio do fragmento Klenow de polimerase de DNA e reações de ligação, bem como métodos gerais de clonagem, são descritos em Sambrook et al (1989), vide abaixo.

[00107] Os ácidos nucleicos CASAR descritos no presente são úteis nas construções, métodos, plantas, plantas que podem ser colhidas e produtos de acordo com a presente invenção.

PROTEÍNAS CASAR:

[00108] A proteína CASAR é preferencialmente definida por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos, homólogos, derivados, ortólogos ou parálogos. Preferencialmente, a proteína CASAR de acordo com a presente invenção é codificada por um ácido nucleico que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28, ou um de seus fragmentos funcionais. De maior preferência, a proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de sequências de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos. É de maior preferência identidade de pelo menos 90%, identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[00109] A proteína CASAR é preferencialmente definida por SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos, homólogos, derivados, ortólogos ou parálogos. Preferencialmente, a proteína CASAR de acordo com a presente invenção é codificada por um ácido nucleico que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais. De maior preferência, a proteína CASAR de acordo com a presente invenção possui identidade de sequências de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos. É de maior preferência identidade de pelo menos 90%, identidade de pelo menos 95%, de maior preferência identidade de pelo menos 98% ou pelo menos 99% com SEQ ID NO: 3.

[00110] Preferencialmente, a proteína CASAR é uma proteína que compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: i. uma sequência de aminoácidos que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos, parálogos funcionais ou variantes de divisão; preferencialmente, a proteína CASAR confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle.

[00111] Preferencialmente, a proteína CASAR é uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: i. uma sequência de aminoácidos que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; ou (ii) uma sequência de aminoácidos codificada por um ácido nucleico que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2 ou 1, ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais, ou uma de suas variantes de divisão; preferencialmente, a proteína CASAR confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle.

[00112] Um derivado preferido de uma proteína CASAR é uma proteína CASAR que compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de: uma sequência de aminoácidos que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 60%, pelo menos 61%, pelo menos 62%, pelo menos 63%, pelo menos 64%, pelo menos 65%, pelo menos 66%, pelo menos 67%, pelo menos 68%, pelo menos 69%, pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28; em que os resíduos de aminoácidos não idênticos são substituições de aminoácidos conservadoras, preferencialmente conforme exibido na Tabela 1, do resíduo de aminoácido correspondente de SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou como proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle.

[00113] Preferencialmente, a proteína CASAR compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28 com uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras, preferencialmente conforme exibido na Tabela 1, dos resíduos de aminoácidos correspondentes de SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28. Preferencialmente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 1-10, 10-20, 20-30, 40-50, 5060, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120 ou 120-130 resíduos de aminoácidos de SEQ ID N° 3 são substituições de aminoácidos conservadoras, preferencialmente conforme exibido na Tabela 1, dos resíduos de aminoácidos correspondentes de SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[00114] De maior preferência, a proteína CASAR compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos com identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28, em que pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 28, pelo menos 29 ou pelo menos 30 dos resíduos de aminoácidos não idênticos ou em que 1-10, 10-20, 20-30, 4050, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 ou até todos os resíduos de aminoácidos não idênticos são substituições de aminoácidos conservadoras, preferencialmente conforme exibido na Tabela 1, do resíduo de aminoácido correspondente de SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[00115] Os percentuais de identidade de polipeptídeos ou proteínas são indicados com referência à sequência de aminoácidos completa descrita especificamente no presente.

[00116] Preferencialmente, a proteína CASAR compreende pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 55, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 65, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 80 ou pelo menos cerca de 85 resíduos de aminoácidos preferencialmente contínuos, preferencialmente contados a partir do terminal N ou do terminal C da sequência de aminoácidos ou até o comprimento total da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[00117] Preferencialmente, o polipeptídeo CASAR compreende cerca de 25-30, cerca de 30-35, cerca de 35-40, cerca de 40-45, cerca de 45- 50, cerca de 50-55, cerca de 55-60, cerca de 60-65, cerca de 65-70, cerca de 70-75, cerca de 75-80 ou cerca de 80-86 aminoácidos, preferencialmente aminoácidos consecutivos, preferencialmente contados a partir do terminal N ou terminal C da sequência de aminoácidos ou até o comprimento total de qualquer uma das sequência de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos definidas em SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28.

[00118] Preferencialmente, a proteína CASAR compreende pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 55, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 65, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 75, pelo menos cerca de 80 ou pelo menos cerca de 85 resíduos de aminoácidos preferencialmente contínuos, preferencialmente contados a partir do terminal N ou do terminal C da sequência de aminoácidos ou até o comprimento total da sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 3.

[00119] Preferencialmente, o polipeptídeo CASAR compreende cerca de 25-30, cerca de 30-35, cerca de 35-40, cerca de 40-45, cerca de 4550, cerca de 50-55, cerca de 55-60, cerca de 60-65, cerca de 65-70, cerca de 70-75, cerca de 75-80 ou cerca de 80-86 aminoácidos, preferencialmente aminoácidos consecutivos, preferencialmente contados a partir do terminal N ou terminal C da sequência de aminoácidos ou até o comprimento total de qualquer uma das sequência de aminoácidos codificadas pelas sequências de ácidos nucleicos definidas em SEQ ID NO: 3.

[00120] As proteínas CASAR, descritas no presente, são úteis nas construções, métodos, plantas, plantas que podem ser colhidas e produtos de acordo com a presente invenção.

MÉTODOS DE AUMENTO DA RESISTÊNCIA A FUNGOS E MÉTODOS DE MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO GENÉTICA

[00121] Uma realização da presente invenção é um método de aumento da resistência a fungos, preferencialmente resistência a Phakopsoraceae, tal como ferrugem da soja, em plantas, partes de plantas ou células vegetais por meio de aumento da expressão de uma proteína CASAR ou seu fragmento, ortólogo, parálogo ou homólogo funcional em comparação com plantas do tipo selvagem, partes de plantas do tipo selvagem ou células de plantas do tipo selvagem.

[00122] A presente invenção também fornece um método de aumento da resistência contra patógenos fúngicos, particularmente patógenos heminocrotróficos, particularmente contra patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, preferencialmente contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, em plantas ou células vegetais, nas quais, em comparação com plantas do tipo selvagem, partes de plantas do tipo selvagem ou células de plantas do tipo selvagem, uma proteína CASAR é sobre-expressa.

[00123] A presente invenção também fornece um método de aumento da resistência a patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja, em plantas ou células vegetais, por meio da sobre-expressão de uma proteína CASAR.

[00124] Em realizações preferidas, a quantidade de proteína e/ou a função da proteína CASAR na planta aumentam em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais em comparação com uma planta do tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico CASAR.

[00125] Em uma realização da presente invenção, a proteína CASAR é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, de maior preferência pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, de preferência ainda maior pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, de preferência superior 99% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou suas variantes de divisão; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, por exemplo pelo menos 75%, de maior preferência pelo menos 80%, por exemplo pelo menos 85%, de preferência ainda maior pelo menos 90%, por exemplo pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97% ou pelo menos 98%, de preferência superior 99% de homologia com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00126] Um método de aumento da resistência a fungos, preferencialmente resistência a Phakopsoracea, tal como ferrugem da soja, em plantas, partes de plantas ou células vegetais por meio de aumento da expressão de uma proteína CASAR ou um de seus fragmentos, ortólogos, parálogos ou homólogos funcionais, ou uma de suas variantes divididas, em que a proteína CASAR é codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou suas variantes de divisão; ou (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; é uma realização adicional da presente invenção.

[00127] Um método de aumento da resistência a fungos, preferencialmente resistência a Phakopsoracea, tal como ferrugem da soja, em plantas, partes de plantas ou células vegetais por meio de aumento da expressão de uma proteína CASAR ou um de seus fragmentos, ortólogos, parálogos ou homólogos funcionais, ou uma de suas variantes divididas, em que a proteína CASAR é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; é uma realização adicional da presente invenção.

[00128] Em um método adicional de acordo com a presente invenção, o método compreende as etapas de: a. transformação estável de uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende: menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; em ligação funcional com um promotor; b. regeneração da planta a partir da célula vegetal; e c. expressão do mencionado ácido nucleico, opcionalmente em que o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR é expresso em quantidade e por período suficiente para gerar ou aumentar a resistência à ferrugem da soja na mencionada planta.

[00129] Preferencialmente, o método compreende as etapas de: a. transformação estável de uma célula vegetal com um cassete de expressão recombinante que compreende: (i) um ácido nucleico que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; ou uma de duas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica o mesmo polipeptídeo CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; em ligação funcional com um promotor; b. regeneração da planta a partir da célula vegetal; e c. expressão do mencionado ácido nucleico, opcionalmente em que o ácido nucleico que codifica uma proteína CASAR é expresso em quantidade e por período suficiente para gerar ou aumentar a resistência à ferrugem da soja na mencionada planta.

[00130] Preferencialmente, o promotor é um promotor específico de mesófilos e/ou induzido por ferrugem; preferencialmente, o promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem, preferencialmente, conforme exibido em SEQ ID NO: 4.

[00131] Preferencialmente, o método de aumento da resistência a fungos, preferencialmente resistência a Phakopsoracea, tal como ferrugem da soja, em plantas, partes de plantas ou células vegetais compreende ainda a etapa de seleção de uma planta transgênica que expressa: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00132] Uma realização preferida é um método de aumento da resistência à ferrugem da soja em plantas de soja, partes de plantas de soja ou células de plantas de soja, aumentando a expressão de uma proteína CASAR, em que a proteína CASAR é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; em que o aumento da expressão da proteína CASAR é atingido por meio de transformação da planta de soja, parte de planta ou célula vegetal com um ácido nucleico que compreende o ácido nucleico definido no item (i), (ii), (iii) ou (iv).

[00133] Uma realização preferida é também um método de aumento da resistência à ferrugem da soja em plantas de soja, partes de plantas de soja ou células de plantas de soja, aumentando a expressão de uma proteína CASAR, em que a proteína CASAR é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; ou (iii)um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (ii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (ii) acima devido à degeneração do código genético; - em que o aumento da expressão da proteína CASAR é atingido por meio de transformação da planta de soja, parte de planta ou célula vegetal com um ácido nucleico que compreende o ácido nucleico definido no item (i), (ii) ou (iii).

[00134] Os patógenos fúngicos ou patógenos similares a fungos (tais como Chromista) podem pertencer ao grupo que compreende Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomycetes, Zygomycetes, Basidiomycota ou Deuteromycetes (Fungi imperfecti). Patógenos que podem ser mencionados como forma de exemplo, mas não como limitação, são os detalhados nas Tabelas 2 e 3 e as doenças a eles associadas.TABELA 2

[00135] Doenças causadas por fungos fitopatogênicos biotróficos e/ou heminocrotróficos:

TABELA 3

[00136] Doenças causadas por fungos necrotróficos e/ou hemibiotróficos e Oomycetes:

SÃO DE PREFERÊNCIA ESPECIAL OS SEGUINTES - Plasmodiophoromycota, tais como Plasmodiophora brassicae (raiz claviforme das crucíferas), Spongospora subterranea, Polymyxa graminis; - Oomycota, tais como Bremia lactucae (míldeo felpudo da alface), Peronospora (míldeo felpudo) em erva-bezerra (P. antirrhini), cebola (P. destructor), espinafre (P. effusa), soja (P. manchurica), tabaco (“bolor azul”; P. tabacina), alfafa e trevo (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (míldeo felpudo do lúpulo), Plasmopara (míldeo felpudo das uvas) (P. viticola) e girassol (P. halstedii), Sclerophthora macrospora (míldeo felpudo de cereais e gramas), Pythium (tal como apodrecimento de beterraba causado por P. debaryanum), Phytophthora infestans (míldeo da batata, tomate e similares), Albugo spec. - Ascomycota, tais como Microdochium nivale (bolor da neve de centeio e trigo), Fusarium, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (esterilidade parcial das espigas, principalmente em trigo), Fusarium oxysporum (murchar Fusarium do tomate), Blumeria graminis (míldeo do pó de cevada (f. sp. hordei) e trigo (f. sp. tritici)), Erysiphe pisi (míldeo do pó da ervilha), Nectria galligena (cancro Nectria das frutíferas), Uncinula necator (míldeo do pó das uvas), Pseudopeziza tracheiphila (doença do fogo vermelho das uvas), Claviceps purpurea (cravagem, por exemplo, sobre centeio e gramíneas), Gaeumannomyces graminis (take-all em trigo, centeio e outras gramíneas), Magnaporthe grisea, Pyrenophora graminea (fita esquerda de centeio), Pyrenophora teres (mancha líquida de cevada), Pyrenophora tritici- repentis (ferrugem das folhas de trigo), Venturia inaequalis (crosta da maçã), Sclerotinia sclerotium (quebra das hastes, apodrecimento do caule), Pseudopeziza medicaginis (mancha das folhas da alfafa, trevo vermelho e branco). - Basidiomycetes tais como Typhula incarnata (ferrugem Typhula em cevada, centeio e trigo), Ustilago maydis (fuligem de bolhas em milho), Ustilago nuda (fuligem solta em cevada), Ustilago tritici (fuligem solta em trigo, espelta), Ustilago avenae (fuligem solta em aveia), Rhizoctonia solani (apodrecimento da raiz Rhizoctonia de batata), Sphacelotheca spp (fuligem superior do sorgo), Melampsora lini (ferrugem do linho), Puccinia graminis (ferrugem do caule de trigo, cevada, centeio e aveia), Puccinia recondita (ferrugem das folhas em trigo), Puccinia dispersa (ferrugem marrom em centeio), Puccinia hordei (ferrugem das folhas de cevada), Puccinia coronata (ferrugem da coroa de aveia), Puccinia striiformis (ferrugem amarela de trigo, cevada, centeio e uma grande quantidade de gramíneas), Uromyces appendiculatus (ferrugem marrom do feijão) e Sclerotium rolfsii (apodrecimento das raízes e caule de muitas plantas). - Deuteromycetes (Fungi imperfecti) tais como Septoria (Stagonospora) nodorum (mancha das glumas) de trigo (Septoria tritici), Pseudocercosporella herpotrichoides (acama de trigo, cevada e centeio), Rynchosporium secalis (mancha das folhas de centeio e cevada), Alternaria solani (míldeo da batata e tomate), Phoma betae (carbúnculo da beterraba), Cercospora beticola (mancha das folhas da beterraba), Alternaria brassicae (mancha preta da canola, repolho e outras crucíferas), Verticillium dahliae (murchar de Verticillium), Colletotrichum, Colletotrichum lindemuthianum (antracnose do feijão), Phoma lingam (carbúnculo do repolho e da canola), Botrytis cinerea (bolor cinza da uva, morango, omate, lúpulo e similares).

[00137] São especialmente preferidos patógenos biotróficos, tais como Phakopsora pachyrhizi e/ou os patógenos que possuem essencialmente mecanismo de infecção similar, como Phakopsora pachyrhizi, conforme descrito no presente. São particularmente preferidos patógenos da subclasse Pucciniomycetes, preferencialmente da ordem Pucciniales (ferrugem), conhecida anteriormente como Uredinales, dentre os quais particularmente Melompsoraceae. São preferidos Phakopsoraceae, de maior preferência Phakopsora. São de preferência especial Phakopsora pachyrhizi e/ou Phakopsora meibomiae.

[00138] Fungos de ferrugem também preferidos são selecionados a partir do grupo de Puccinia, Gymnosporangium, Juniperus, Cronartium, Hemileia e Uromyces; preferencialmente Puccinia sorghi, Gymnosporangium juniperi-virginianae, Juniperus virginiana, Cronartium ribicola, Hemileia vastatrix, Puccinia graminis, Puccinia coronata, Uromyces phaseoli, Puccinia hemerocallidis, Puccinia persistens subsp. Triticina, Puccinia striiformis, causas de Puccinia graminis e/ou Uromyces appendeculatus.

CONSTRUÇÕES DE VETORES E CONSTRUÇÕES DE EXPRESSÃO DE CASAR

[00139] Um ácido nucleico recombinante, cassete de expressão ou construção de vetor compreende preferencialmente um gene natural e um promotor natural, um gene natural e um promotor não natural, um gene não natural e um promotor natural ou um gene não natural e um promotor não natural.

[00140] Caso se deseje a expressão de proteínas, geralmente é desejável incluir uma sequência de término de transcrição, tal como uma região de poliadenilação na extremidade 3’ de uma região de codificação de polinucleotídeos. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma série de outros genes vegetais ou de T-DNA. A sequência terminal 3’ a ser adicionada pode ser derivada, por exemplo, dos genes nopalino sintase ou octopino sintase ou, alternativamente, de um outro gene vegetal ou, de menor preferência, de qualquer outro gene eucariótico.

[00141] Construção De Vetor Recombinante Que Compreende: a. (i) um ácido nucleico que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou uma de suas variantes de divisão; (11) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ligado operativamente a b. um promotor; e c. uma sequência de término de transcrição é uma realização adicional da presente invenção.

[00142] Além disso, é fornecida uma construção de vetor recombinante que compreende: a. (i) um ácido nucleico que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27; (ii) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ou 28; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ligado operativamente a b. um promotor; e c. uma sequência de término de transcrição é uma realização adicional da presente invenção.

[00143] Além disso, é fornecida uma construção de vetor recombinante que compreende: a. (i) um ácido nucleico que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2; (11) um ácido nucleico que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ligado operativamente a b. um promotor; e c. uma sequência de término de transcrição é uma realização adicional da presente invenção.

[00144] No caso de uma biblioteca genômica, o ambiente genético natural da sequência de ácidos nucleicos é preferencialmente mantido, ao menos em parte. O ambiente preferencialmente ladeia a sequência de ácidos nucleicos pelo menos em um lado e possui comprimento de sequências de pelo menos 50 bp, preferencialmente pelo menos 500 bp, de preferência especial pelo menos 1000 bp e, de preferência superior, pelo menos 5000 bp.

[00145] Os promotores de acordo com a presente invenção podem ser constitutivos, indutíveis, particularmente indutíveis por patógenos, preferidos de estágio de desenvolvimento, preferidos de tipos celulares, preferidos de tecidos ou preferidos de órgãos. Preferencialmente, o promotor é um promotor não natural. Os promotores constitutivos são ativos sob a maior parte das condições. Exemplos não limitadores de promotores constitutivos incluem os promotores 19S e 35S de CaMV (Odell et al, 1985, Nature 313: 810-812), o promotor 35S de CaMV sX (Kay et al, 1987, Science 236: 1299-1302), o promotor Sep1, o promotor actina de arroz (McElroy et al, 1990, Plant Cell 2: 163-171), o promotor actina de Arabidopsis, o promotor ubiquitina (Christensen et al, 1989, Plant Molec. Biol. 18: 675-689); pEmu (Last et al, 1991, Theor. Appl. Genet. 81: 581-588), o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária, o promotor Smas (Velten et al, 1984, EMBO J. 3: 2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor desidrogenase de álcool cinamílico (Patente Norte-Americana n° 5.683.439), promotores do T-DNA de Agrobacterium, tais como manopino sintase, nopalino sintase e octopino sintase, o promotor de subunidade pequena de carboxilase bifosfato de ribulose (ssuRUBISCO) e/ou similares.

[00146] Preferencialmente, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende um promotor constitutivo, promotor específico de mesófilos, promotor específico da epiderme, promotor específico de raízes, promotor indutível por patógeno ou promotor indutível por fungos.

[00147] Um promotor é indutível se a sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzida sob o controle do promotor, for de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, de maior preferência pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300% mais alta no seu estado induzido que no seu estado não induzido. Um promotor é específico de célula, tecido ou órgão se a sua atividade, medida sobre a quantidade de RNA produzida sob o controle do promotor, for de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, de maior preferência pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 300% mais alta em um tipo de célula, tecido ou órgão específico que em outros tipos de célula ou tecidos da mesma planta; preferencialmente, os outros tipos de célula ou tecidos são tipos de célula ou tecidos do mesmo órgão da planta, tal como raiz. No caso de promotores específicos de órgãos, a atividade promotora necessita ser comparada com a atividade promotora em outros órgãos da planta, tais como folhas, hastes, flores ou sementes. Preferencialmente, o promotor é um promotor constitutivo, promotor específico de mesófilos ou promotor específico da epiderme.

[00148] Em realizações preferidas, o aumento da quantidade de proteína e/ou da atividade da proteína CASAR tem lugar de forma constitutiva ou específica de tecido. Em realizações especialmente preferidas, aumento essencialmente induzido por patógenos da quantidade de proteína e/ou da atividade de proteína tem lugar, por exemplo, por meio de expressão recombinante do ácido nucleico CASAR sob o controle de um promotor indutível por fungos. Particularmente, a expressão do ácido nucleico CASAR tem lugar sobre locais infectados por fungos, nos quais, entretanto, a expressão do ácido nucleico CASAR preferencialmente permanece essencialmente inalterada em tecidos não infectados por fungos.

[00149] Promotores preferidos por estágio de desenvolvimento são preferencialmente expressos em certos estágios de desenvolvimento. Promotores preferidos de órgãos e tecidos incluem aqueles que são preferencialmente expressos em certos tecidos ou órgãos, tais como folhas, raízes, sementes ou xilema. Exemplos de promotores preferidos de tecidos e preferidos de órgãos incluem, mas sem limitações, promotores preferidos de frutos, preferidos de óvulos, preferidos de tecidos machos, preferidos de sementes, preferidos de tegumentos, preferidos de tubérculos, preferidos de hastes, preferidos do pericarpo, preferidos de folhas, preferidos de estigmas, preferidos do pólen, preferidos das anteras, preferidos de pétalas, preferidos de sépalas, preferidos do pedicelo, preferidos de síliqua, preferidos do caule, preferidos das raízes e/ou similares. Promotores preferidos de sementes são preferencialmente expressos durante o desenvolvimento e/ou a germinação das sementes. Promotores preferidos de sementes podem ser, por exemplo, preferidos de embriões, preferidos do endosperma e preferidos de revestimento de sementes. Vide Thompson et al, 1989, BioEssays 10: 108. Exemplos de promotores preferidos de sementes incluem, mas sem limitações, sintase de celulose (celA), Cim1, gama-zeina, globulina 1, zeina de 19 kD de milho (cZ19B1) e/ou similares.

[00150] Outros promotores preferidos de tecidos ou preferidos de órgãos apropriados incluem, mas sem limitações, o promotor de gene napina de canola (Patente Norte-Americana n° 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al, 1991, Mol. Gen. Genet. 225 (3): 459-67), o promotor de oleosina de Arabidopsis (Pedido PCT n° WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente Norte-Americana n° 5.504.200), o promotor Bce-4 de Brassica (Pedido PCT n° WO 91/13980) ou o promotor B4 de leguminosas (LeB4; Baeumlein et al, 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9), bem como promotores que conferem expressão específica de sementes em plantas monocotiledôneas como milho, cevada, trigo, centeio, arroz etc. Promotores apropriados que merecem observação são o promotor de gene Ipt1 ou Ipt2 de cevada (Pedido PCT n° WO 95/15389 e o Pedido PCT n° WO 95/23230) ou os descritos no Pedido PCT n° WO 99/16890 (promotores do gene hordeína de cevada, gene glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina de arroz, gene gliadina de trigo, gene glutelina de trigo, gene glutelina de aveia, gene casirina de sorgo e/ou gene secalina de centeio).

[00151] Promotores úteis de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitações, o promotor de ligação de clorofila a/b principal, promotores de histona, promotor Ap3, promotor de β-conglicina, promotor de napina, promotor lecitina de soja, promotor zeina de 15 kD de milho, promotor zeina de 22 kD, promotor zeina de 27 kD, promotor g-zeina, os promotores ceroso, comprimido 1, comprimido 2, de bronze, o promotor Zm13 (Patente Norte-Americana n° 5.086.169), os promotores de poligalacturonase de milho (PG) (Patentes Norte-Americanas n° 5.412.085 e 5.545.546), o promotor SGB6 (Patente Norte-Americana n° 5.470.359) e outros promotores naturais e sintéticos.

[00152] Promotores específicos da epiderme podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de: - WIR5 (=GstA1); acc. X56012; Dudler & Schweizer; - GLP4, acc. AJ310534; Wei Y., Zhang Z., Andersen C. H., Schmelzer E., Gregersen P. L., Collinge D. B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998); - GLP2a, acc. AJ237942, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999); - Prx7, acc. AJ003141, Kristensen B. K., Ammitzboll H., Rasmussen S. K. e Nielsen K. A., Molecular Plant Pathology, 2 (6), 311 (2001); - GerA, acc. AF250933; Wu S., Druka A., Horvath H., Kleinhofs A., Kannangara G. e von Wettstein D., Plant Phys. Biochem. 38, 685 (2000); - OsROC1, acc. AP004656; - RTBV, acc. AAV62708, AAV62707; Kloti A., Henrich C., Bieri S., He X., Chen G., Burkhardt P. K., Wünn J., Lucca P., Hohn T., Potrykus I. e Fütterer J., PMB 40, 249 (1999); - Promotor ChtC2 de chitinase de batata (Ancillo et al, Planta, 217 (4), 566, (2003)); - Promotor AtProT3 (Grallath et al, Plant Physiology 137 (1), 117 (2005)); - Promotores SHN de Arabidopsis (fatores de transcrição AP2/EREBP envolvidos na produção de cera e cutina) (Aarón et al, Plant Cell 16 (9), 2463 (2004)); e/ou - GSTA1 de trigo (Dudler et al, WP 2005306368 e Altpeter et al, Plant Molecular Biology 57 (2), 271 (2005)).

[00153] Promotores específicos de mesófilos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de: - PPCZm1 (=PEPC); Kausch A. P., Owen T. P., Zachwieja S. J., Flynn A. R. e Sheen J., Plant Mol. Biol. 45, 1 (2001); - Osrbc S., Kyozuka et al, Plant Phys. 102, 991 (1993); Kyozuka J., McElroy D., Hayakawa T., Xie Y., Wu R. e Shimamoto K., Plant Phys. 102, 991 (1993); - OsPPDK, acc. AC099041; - TaGF-2.8, acc. M63223, Schweizer P., Christoffel A. e Dudler R., Plant J. 20, 541 (1999); - TaFBPase, acc. X53957; - TaWIS1, acc. AF467542; US 200220115849; - HvBIS1, acc. AF467539; US 200220115849; - ZmMIS1, acc. AF467514; US 200220115849; - HvPR1a, acc. X74939; Bryngelsson et al, Mol. Plant Microbe Interact. 7 (2), 267 (1994); - HvPR1b, acc. X74940; Bryngelsson et al, Mol. Plant Microbe Interact. 7(2), 267 (1994); - HvB1,3gluc; acc. AF479647; - HvPrx8, acc. AJ276227; Kristensen et al, Molecular Plant Pathology, 2 (6), 311 (2001); e/ou - HvPAL, acc. X97313; Wei Y., Zhang Z., Andersen C. H., Schmelzer E., Gregersen P. L., Collinge D. B., Smedegaard-Petersen V. e Thordal-Christensen H., Plant Molecular Biology 36, 101 (1998); e/ou - Promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem, conforme exibido em SEQ ID NO: 4.

[00154] Promotores constitutivos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste de: - promotor PcUbi de salsa (WO 03/102198); - promotor 35S de CaMV: promotor 35S de vírus mosaico da couve-flor (Benfey et al, 1989, EMBO J. 8 (8): 2195-2202), - promotor STPT: promotor de translocação de fosfato de triose curto de Arabidopsis thaliana (Acesso NM_123979); - promotor Act1: promotor do gene actina 1 de Oryza sativa (McElroy et al, 1990, Plant Cell 2 (2): 163-171 a); e/ou - promotor EF1A2: fator de alongamento de translação EF1 alfa de Glycine max (US 20090133159).

[00155] Em realizações preferidas, o aumento da quantidade de proteína e/ou função da proteína CASAR tem lugar e forma constitutiva ou específica de tecido. Em realizações especialmente preferidas, aumento essencialmente induzido por patógenos da quantidade de proteína ou da função de proteína tem lugar, por exemplo, por meio de expressão exógena do ácido nucleico CASAR sob o controle de um promotor indutível por fungos, preferencialmente um promotor indutível por ferrugem. Particularmente, a expressão do ácido nucleico CASAR tem lugar sobre locais infectados por fungos, nos quais, entretanto, a expressão da sequência de ácidos nucleicos CASAR, preferencialmente, permanece essencialmente inalterada em tecidos não infectados por fungos.

[00156] Preferencialmente, o ácido nucleico CASAR encontra-se sob o controle de um promotor específico de mesófilos induzido por ferrugem. De maior preferência, o promotor é o promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem; preferencialmente, conforme exibido em SEQ ID NO: 4. Preferencialmente, o promotor específico de mesófilos induzido por ferrugem compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de ácidos nucleicos exibida em SEQ ID NO: 4.

[00157] Um terminal preferido é o terminal do gene inibidor de catepsina D de Solanum tuberosum.

[00158] Combinações de promotor e terminal preferidas com o gene de interesse entre eles são promotor de salsa, preferencialmente o promotor ubiquitina de salsa, em combinação com o terminal do gene inibidor de catepsina D de Solanum tuberosum. Outra combinação de promotor e terminal preferida é o promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem em combinação com o terminal do gene inibidor de catepsina D de Solanum tuberosum.

[00159] Uma sequência de introns pode também ser adicionada à região não traduzida (UTR) 5’ e/ou à sequência de codificação da sequência de codificação parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. Demonstrou-se que a inclusão de um intron divisível na unidade de transcrição em construções de expressão animal e vegetal aumenta a expressão genética nos níveis de mRNA e de proteína em até mil vezes (Buchman e Berg (1988), Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405; Callis et al (1987), Genes Dev. 1: 1183-1200). Este aumento de introns da expressão genética é tipicamente maior quando colocado perto da extremidade 5’ da unidade de transcrição. O uso dos introns de milho Adh1-S intron 1, 2 e 6 e do intron Bronze-1 é conhecido na técnica. Para informações gerais, vide: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, Nova Iorque (1994).

[00160] Um tipo de construção de vetor é um “plasmídeo”, que designa um circuito de DNA de fita dupla circular ao qual podem ser ligados segmentos de DNA adicionais. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certas construções de vetor são capazes de reprodução autônoma em uma célula de planta hospedeira à qual são introduzidas. Outras construções de vetor são integradas ao genoma de uma célula de planta hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e, portanto, são reproduzidas junto com o genoma hospedeiro. Particularmente, a construção de vetor é capaz de dirigir a expressão do gene ao qual os vetores são ligados operativamente. A presente invenção destina-se, entretanto, a incluir essas outras formas de construção de vetor de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, vírus da batata X, vírus chocalho do tabaco e/ou vírus Gemini), que atendem a funções equivalentes.

[00161] Organismos transgênicos, plantas, partes de plantas e células vegetais transgênicas:

[00162] Uma realização preferida é uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que sobre-expressa uma proteína CASAR exógena. Preferencialmente, a proteína CASAR sobre- expressa na planta, parte de planta ou célula vegetal é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou suas variantes de divisão; ou ii. um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; iii. um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou iv. um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00163] De preferência superior, o ácido nucleico exógeno possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3.

[00164] Uma realização preferida é uma planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica que sobre-expressa uma proteína CASAR exógena. Preferencialmente, a proteína CASAR sobre- expressa na planta, parte de planta ou célula vegetal é codificada por: i. um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; ou uma de suas variantes de divisão; ou ii. um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; iii. um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou iv. um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00165] De preferência superior, o ácido nucleico exógeno possui identidade de sequências de pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2; ou compreende um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de sequências de pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3.

[00166] Em realizações preferidas, a quantidade de proteína de uma proteína CASAR na planta transgênica aumenta em pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mais em comparação com uma planta do tipo selvagem que não é transformada com o ácido nucleico CASAR.

[00167] De maior preferência, a planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica de acordo com a presente invenção foi obtida por meio de transformação com um vetor recombinante descrito no presente.

[00168] Métodos apropriados de transformação ou transfecção de células hospedeiras, incluindo células vegetais, são bem conhecidos na técnica de biotecnologia vegetal. Qualquer método pode ser utilizado para transformar o vetor de expressão recombinante em células vegetais para gerar as plantas transgênicas de acordo com a presente invenção. Métodos gerais de transformação de plantas dicotiledôneas são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas n° 4.940.838, 5.464.763 e similares. Métodos de transformação de plantas dicotiledôneas específicas, tais como algodão, são descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 5.004.863, 5.159.135 e 5.846.797. Métodos de transformação de soja descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 4.992.375, 5.416.011, 5.569.834, 5.824.877, 6.384.301 e em EP 0301749B1 podem ser utilizados. Os métodos de transformação podem incluir métodos de transformação diretos e indiretos. Métodos diretos apropriados incluem absorção de DNA induzida por polietileno glicol, transformação mediada por lipossomos (US 4.536.475), métodos biolísticos utilizando o disparador de genes (Fromm, M. E. et al, Bio/Technology, 8 (9): 833-9, 1990; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2: 603, 1990), eletroporação, incubação de embriões secos em solução que compreende DNA e microinjeção. No caso desses métodos de transformação direta, os plasmídeos utilizados não necessitam atender nenhuma exigência específica. Podem ser utilizados plasmídeos simples, tais como os da série pUC, pBR322, série M13mp, pACYC184 e similares. Caso plantas intactas devam ser regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável adicional é preferencialmente posicionado sobre o plasmídeo. Os métodos de transformação direta são igualmente apropriados para plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

[00169] A transformação pode também ser conduzida por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (tal como EP 0.116.718), infecção viral por meio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Métodos de transformação com base em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidos na técnica. A linhagem de Agrobacterium (tal como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento de T-DNA que é transferido para a planta após a infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado ao genoma da célula vegetal. O T-DNA pode ser localizado sobre o plasmídeo de Ri ou Ti ou é compreendido separadamente em um chamado vetor binário. Métodos de transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch, R. B. et al (1985), Science 225: 1229. A transformação mediada por Agrobacterium é mais apropriada para plantas dicotiledôneas, mas também foi adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita, por exemplo, em White, F. F., Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 1538; Jenes, B. et al, Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, editado por S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, págs. 128-143; Potrykus (1991), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205-225. A transformação pode resultar em expressão e transformação estável ou transitória. Embora uma sequência de nucleotídeos de acordo com a presente invenção possa ser inserida em qualquer planta e célula vegetal que se enquadre nessas classes amplas, ela é particularmente útil em células de plantas produtoras.

[00170] As células de plantas geneticamente modificadas podem ser regeneradas por meio de todos os métodos com os quais os técnicos no assunto são familiares. Métodos apropriados podem ser encontrados nas publicações mencionadas acima de S. D. Kung e R. Wu, Potrykus ou Hofgen e Willmitzer.

[00171] Após a transformação, células vegetais ou agrupamentos celulares podem ser selecionados para determinar a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes que podem ser expressos por plantas cotransferidos com o gene de interesse, após o quê o material transformado é regenerado em uma planta inteira. Para selecionar plantas transformadas, o material vegetal obtido na transformação é, via de regra, submetido a condições seletivas, de forma que plantas transformadas possam ser diferenciadas de plantas não transformadas. As sementes obtidas da forma descrita acima podem ser plantadas, por exemplo, e, após um período de crescimento inicial, submetidas a seleção apropriada por meio de pulverização. Uma possibilidade adicional consiste no cultivo das sementes, se apropriado após esterilização, sobre placas agar utilizando um agente de seleção apropriado, de tal forma que apenas as sementes transformadas possam crescer na forma de plantas. Alternativamente, as plantas transformadas são selecionadas para determinar a presença de um marcador selecionável tal como os descritos acima. As plantas transformadas podem também ser selecionadas diretamente por meio de seleção para determinar a presença do ácido nucleico CASAR

[00172] Após a transferência e a regeneração de DNA, plantas supostamente transformadas podem também ser avaliadas, utilizando, por exemplo, análise Southern, para determinar a presença do gene de interesse, número de cópias e/ou organização genômica. Alternativa ou adicionalmente, níveis de expressão do DNA recém introduzido podem ser monitorados utilizando análise Northern e/ou Western, em que os dois métodos são bem conhecidos dos técnicos comuns no assunto.

[00173] As plantas transformadas geradas podem ser propagadas por uma série de meios, tais como por meio de propagação clonal ou métodos clássicos de cultivo. Uma planta transformada de primeira geração (ou T1), por exemplo, pode ser isolada, transformadores de segunda geração (ou T2) homozigóticos são selecionados e as plantas T2 podem ser propagadas adicionalmente em seguida por meio de métodos clássicos de cultivo. Os organismos transformados gerados podem assumir uma série de formas. Eles podem ser, por exemplo, quimeras de células transformadas e células não transformadas; transformadores clonais (todas as células, por exemplo, transformadas para conter o cassete de expressão); enxertos de tecidos transformados e não transformados (em plantas, por exemplo, um estoque de raiz transformada enxertado em uma muda não transformada).

[00174] Preferencialmente, construções, vetores ou conjuntos de expressão não estão presentes no genoma da planta original ou estão presentes no genoma da planta transgênica, não no seu local natural do genoma da planta original.

[00175] Preferencialmente, a planta transgênica de acordo com a presente invenção ou a planta obtida por meio do método de acordo com a presente invenção possui aumento da resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos da ferrugem (ou seja, patógenos fúngicos da ordem Pucciniales), preferencialmente contra patógenos fúngicos da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja. Preferencialmente, aumenta a resistência contra Phakopsora pachyrhizi e/ou Phakopsora meibomiae.

[00176] Preferencialmente, a planta, parte de planta ou célula vegetal é uma planta ou derivada de uma planta selecionada a partir do grupo que consiste de feijão, soja, ervilha, trevo, kudzu, alfafa, lentilha, tremoços, ervilhaca, amendoim, arroz, trigo, cevada, Arabidopsis, lentilha, banana, canola, algodão, batata, milho, cana de açúcar, alfafa e beterraba.

[00177] Em uma realização da presente invenção, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste de feijão, soja, ervilha, trevo, kudzu, alfafa, lentilha, tremoços, ervilhaca e/ou amendoim. Preferencialmente, a planta é um legume, que compreende plantas do gênero Phaseolus (que compreende feijão francês, feijão anão, feijão comum (Phaseolus vulgaris), feijão fava (Phaseolus lunatus L.), feijão Tepary (Phaseolus acutifolius A. Gray), feijão da Espanha (Phaseolus coccineus)); o gênero Glycine (que compreende Glycine soja, soja (Glycine max (L.) Marill)); ervilha (Pisum) (que compreende ervilha de vagem (Pisum sativum L. convar. sativum), também denominada ervilha macia ou arredondada; ervilha marrowfat (Pisum sativum L. convar. medullare Alef emend. C. O. Lehm), ervilha torta (Pisum sativum L. convar. axiphium Alef emend. C. O. Lehm), também denominada ervilha forrageira ou ervilha em vagens comestíveis (Pisum granda sneida L. convar. sneidulo p. shneiderium)); amendoim (Arachis hypogaea), trevo (Trifolium spec.), luzerna (Medicago), kudzu (Pueraria lobata), alfafa comum, alfafa (M. sativa L.), grão de bico (Cicer), lentilha (Lens culinaris Medik.), tremoços (Lupinus), ervilhaca (Vicia), feijão de campo, fava silvestre (Vicia faba), araca (Lathyrus) (que compreende chícharo (Lathyrus sativus), ervilha tuberosa (Lathyrus tuberosus)); gênero Vigna (que compreende feijão traça (Vigna aconitifolia (Jacq.) Maréchal), fejão azuki (Vigna angularis (Willd.) Ohwi & H. Ohashi), feijão da Índia (Vigna mungo (L.) Hepper), feijão mungue (Vigna radiata (L.) R. Wilczek), amendoim bambara (Vigna subterrane (L.) Verdc.), feijão arroz (Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H. Ohashi), Vigna vexillata (L.) A. Rich., Vigna unguiculata (L.) Walp., nas três subespécies feijão aspargo, feijão fradinho, feijão Catjang)); guandu (Cajanus cajan (L.) Millsp.), o gênero Macrotyloma (que compreende amendoim geocarpa (Macrotyloma geocarpum (Hams) Maréchal & Baudet), feijão cavalo (Macrotyloma uniflorum (Lam.) Verdc,)); feijão de Goa (Psophocarpus tetragnolobus (L.) DC), feijão inhame africano (Sphenostylis stenocarpa (Hochst. ex A. Rich.) Harms), feijão preto egípcio, feijão dólico, feijão lablab (Lablab purpureus (L.) doce), feijão inhame (Pachyrhizus), feijão guar (Cyamopsis tetragonolobus (L.) Taub.); e/ou o gênero Canavalia (que compreende feijão sabre (Canavalia ensiformis (L.) DC) e feijão espada (Canavalia gladiata (Jacq.) DC).

[00178] É adicionalmente preferida uma planta selecionada a partir do grupo que consiste de feijão, soja, ervilha, trevo, kudzu, alfafa, lentilha, tremoços, ervilhaca e amendoim. De preferência superior, a planta, parte de planta ou célula vegetal ou é derivada de soja.

[00179] Preferencialmente, a planta transgênica de acordo com a presente invenção ou a planta obtida por meio do método de acordo com a presente invenção possui maior resistência contra patógenos fúngicos, preferencialmente patógenos fúngicos da ordem Pucciniales (ferrugem), preferencialmente da família Phakopsoraceae, de maior preferência contra patógenos fúngicos do gênero Phakopsora, de preferência superior contra Phakopsora pachyrhizi e Phakopsora meibomiae, também conhecidos como ferrugem da soja. Preferencialmente, aumenta a resistência contra Phakopsora pachyrhizi e/ou Phakopsora meibomiae.

[00180] Métodos de produção de plantas transgênicas:- Uma realização de acordo com a presente invenção fornece um método de produção de plantas transgênicas, partes de plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas resistentes a um patógeno fúngico, preferencialmente da família Phakosporaceae, tal como ferrugem da soja, em que o ácido nucleico recombinante utilizado para gerar uma planta transgênica compreende um promotor que é funcional na célula vegetal, ligado operativamente a um ácido nucleico CASAR, que é preferencialmente SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27; e uma sequência reguladora terminal.

[00181] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de plantas transgênicas, partes de plantas transgênicas ou células de plantas transgênicas que possuem resistência a fungos aprimorada, que compreende: a. introdução de uma construção de vetor recombinante de acordo com a presente invenção em uma planta, parte de planta ou célula vegetal; e b. geração de planta transgênica a partir da planta, parte de planta ou célula vegetal.

[00182] Preferencialmente, o método de produção da planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica compreende adicionalmente a etapa de: c. expressão da proteína CASAR, preferencialmente codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27, um de seus fragmentos funcionais, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00183] Preferencialmente, a mencionada introdução e expressão não compreende um processo essencialmente biológico.

[00184] De maior preferência, o método de produção da planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica compreende adicionalmente a etapa de: c. expressão da proteína CASAR, preferencialmente codificada por: (i) um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codificam uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00185] Preferencialmente, o método de produção da planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica compreende adicionalmente a etapa de seleção de uma planta transgênica que expressa: (i) um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos, ou uma de suas variantes de divisão; (ii) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60%, preferencialmente identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou até identidade de sequências de 100% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica o mesmo polipeptídeo CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas que difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético;

[00186] Preferencialmente, o método de produção da planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula vegetal transgênica compreende adicionalmente a etapa de colheita das sementes da planta transgênica, plantio das sementes e cultivo das sementes em plantas, em que a(s) planta(s) cultivada(s) compreende(m): i. o ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27, um de seus fragmentos funcionais, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; ii. o ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; iii. o ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou iv. o ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; preferencialmente, a etapa de colheita das sementes da planta transgênica, plantio das sementes e cultivo das sementes em plantas, em que a(s) planta(s) cultivada(s) compreende(m): i. o ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27, um de seus fragmentos funcionais, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; (ii) o ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)o ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codifica uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) o ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; é repetida mais de uma vez, preferencialmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 vezes.

[00187] As plantas transgênicas podem ser selecionadas por meio de métodos conhecidos conforme descrito acima (por exemplo, por meio de seleção para determinar a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes que podem ser expressos em plantas cotransferidos com o gene CASAR ou por meio de seleção direta em busca do ácido nucleico CASAR).

[00188] Além disso, é fornecido o uso do ácido nucleico CASAR exógeno ou da construção de vetor recombinante que compreende o ácido nucleico CASAR para transformação de uma planta, parte de planta ou célula vegetal para fornecer uma planta, parte de planta ou célula vegetal resistente a fungos.

[00189] Partes que podem ser colhidas e produtos: - Partes que podem ser colhidas da planta transgênica de acordo com a presente invenção são parte da presente invenção. Preferencialmente, as partes que podem ser colhidas compreendem o ácido nucleico CASAR ou a proteína CASAR. As partes que podem ser colhidas podem ser sementes, raízes, folhas e/ou flores que compreendem o ácido nucleico CASAR, a proteína CASAR ou suas partes. Partes preferidas de plantas de soja são grãos de soja que compreendem o ácido nucleico CASAR ou a proteína CASAR. - Produtos derivados de plantas transgênicas de acordo com a presente invenção, suas partes ou partes que podem ser colhidas são parte da presente invenção. Um produto preferido é massa ou óleo, preferencialmente massa de soja ou óleo de soja. Preferencialmente, a massa e/ou o óleo de soja compreende o ácido nucleico CASAR ou proteína CASAR.

[00190] Preferencialmente, as partes que podem ser colhidas da planta transgênica de acordo com a presente invenção ou os produtos derivados de uma planta transgênica compreendem uma molécula de ácido nucleico exógeno que compreende ou consiste de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste de: i. um ácido nucleico exógeno que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; ii. um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína CASAR que compreende uma sequência de aminoácidos que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada, preferencialmente ferrugem, com relação a plantas controle; iii. uma molécula de ácido nucleico exógena que se hibridiza com uma sequência complementar de qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos de (i) ou (ii) sob condições de hibridização sob alta estringência; que codificam preferencialmente uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada, preferencialmente ferrugem, com relação a plantas controle; e iv. um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ou em que a parte colhível da planta transgênica ou o produto derivado da planta transgênica compreende uma proteína CASAR codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iv).

[00191] Métodos de fabricação de produto: - As plantas, partes de plantas ou células vegetais de acordo com a presente invenção ou que podem ser obtidas por meio dos métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para fabricação de um produto ou parte colhível.

[00192] Em uma realização, o método de elaboração de produto compreende: a. cultivo das plantas de acordo com a presente invenção ou que podem ser obtidas por meio dos métodos de acordo com a presente invenção; e b. elaboração do mencionado produto a partir das plantas de acordo com a presente invenção e/ou partes, tais como sementes, dessas plantas ou por estas.

[00193] Em uma realização adicional, o método compreende as etapas de: a. cultivo das plantas de acordo com a presente invenção; b. remoção das partes que podem ser colhidas conforme definido acima das plantas; e c. elaboração do mencionado produto a partir das partes que podem ser colhidas de acordo com a presente invenção ou por estas.

[00194] Preferencialmente, os produtos obtidos por meio do mencionado método compreendem uma molécula de ácido nucleico exógena que compreende ou consiste de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste de: i. um ácido nucleico exógeno que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de ácidos nucleicos representada por SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; ii. um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína CASAR que compreende uma sequência de aminoácidos que possui, em ordem crescente de preferência, identidade de sequências de pelo menos 70%, pelo menos 71%, pelo menos 72%, pelo menos 73%, pelo menos 74%, pelo menos 75%, pelo menos 76%, pelo menos 77%, pelo menos 78%, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% com a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos, derivados, ortólogos ou parálogos funcionais; preferencialmente, a proteína CASAR possui essencialmente a mesma atividade biológica de uma proteína CASAR codificada por SEQ ID NO: 2 ou 1; preferencialmente, a proteína CASAR confere resistência a fungos aprimorada, preferencialmente ferrugem, com relação a plantas controle; iii. uma molécula de ácido nucleico exógena que se hibridiza com uma sequência complementar de qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos de (i) ou (ii) sob condições de hibridização sob alta estringência; que codificam preferencialmente uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada, preferencialmente ferrugem, com relação a plantas controle; e iv. um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético; ou em que o produto obtido pelo mencionado método compreende uma proteína CASAR codificada por qualquer um dos ácidos nucleicos CASAR de (i) a (iv).

[00195] O produto pode ser elaborado no local em que a planta foi cultivada, em que as plantas e/ou suas partes podem ser removidas do local em que as plantas foram cultivadas para gerar o produto. Tipicamente, a planta é cultivada, as partes que podem ser colhidas desejadas são removidas da planta, quando viável em ciclos repetidos, e o produto é elaborado com as partes da planta que podem ser colhidas. A etapa de cultivo da planta pode ser realizada apenas uma vez quando o método de acordo com a presente invenção é realizado, permitindo ao mesmo tempo, por várias vezes, as etapas de elaboração do produto, tal como por meio de remoção repetida de partes que podem ser colhidas das plantas de acordo com a presente invenção e, se necessário, processamento adicional dessas partes para chegar ao produto. Também é possível que a etapa de cultivo das plantas de acordo com a presente invenção seja repetida e as plantas ou partes que podem ser colhidas sejam armazenadas até realizar-se a elaboração do produto uma vez para as plantas ou partes de plantas acumuladas. Além disso, as etapas de cultivo das plantas e elaboração do produto podem ser realizadas com sobreposição no tempo, mesmo simultaneamente em grande parte ou sequencialmente. Geralmente, as plantas são cultivadas por algum tempo antes da elaboração do produto.

[00196] Em uma realização, os produtos elaborados pelos mencionados métodos de acordo com a presente invenção são produtos vegetais, tais como, mas sem limitações, alimentos, ração, suplemento alimentar, suplemento de ração, fibra, cosméticos e/ou produtos farmacêuticos. Os alimentos são considerados composições utilizadas para nutrição ou para suplementação da nutrição. Os alimentos animais e suplementos de ração animal são particularmente considerados alimentos.

[00197] Em outra realização, os métodos de produção de acordo com a presente invenção são utilizados para elaborar produtos agrícolas, tais como, mas sem limitações, extratos vegetais, proteínas, aminoácidos, carboidratos, gorduras, óleos, polímeros, vitaminas e similares.

[00198] É possível que um produto vegetal consista em grande parte de um ou mais produtos agrícolas.

[00199] Métodos de cultivo/métodos de aprimoramento vegetal/métodos de produção de variedades vegetais: - As plantas transgênicas de acordo com a presente invenção podem ser cruzadas com plantas transgênicas similares, com plantas transgênicas que não contêm os ácidos nucleicos de acordo com a presente invenção ou com plantas não transgênicas, utilizando métodos conhecidos de cultivo vegetal para a preparação de sementes. Além disso, as plantas ou células de plantas transgênicas de acordo com a presente invenção podem compreender e/ou ser cruzadas em outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos exógenos, de forma a criar uma “pilha” de transgenes na planta e/ou sua prole. A semente é plantada em seguida para obter uma planta transgênica fértil cruzada que compreende o ácido nucleico CASAR. A planta transgênica fértil cruzada pode possuir o cassete de expressão específico herdado por meio de uma mãe ou de um pai. A segunda planta pode ser uma planta congênita. O transgênico fértil cruzado pode ser híbrido. Também são incluídas na presente invenção sementes de quaisquer dessas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes de acordo com a presente invenção podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e utilizadas para cultivar gerações de prole de plantas transformadas de acordo com a presente invenção, incluindo linhagens de plantas híbridas que compreendem o ácido nucleico exógeno.

[00200] Desta forma, uma realização da presente invenção é um método de cultivo de planta resistente a fungos que compreende as etapas de: a. cruzamento de uma planta transgênica descrita no presente ou uma planta que pode ser obtida por meio de um método descrito no presente com uma segunda planta; b. obtenção de uma ou mais sementes resultantes da etapa de cruzamento descrita em (a); c. plantio da(s) mencionada(s) semente(s) e cultivo da(s) semente(s) em plantas; e d. seleção a partir das mencionadas plantas das plantas que expressam uma proteína CASAR, preferencialmente codificada por: i) um ácido nucleico exógeno que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 2, 1, 5-12, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 ou 27, um de seus fragmentos funcionais, ortólogos, parálogos ou variantes de divisão; ii) ) um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína que possui identidade de pelo menos 60% com SEQ ID NO: 3, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou um de seus fragmentos funcionais, ortólogos ou parálogos; preferencialmente, a proteína codificada confere maior resistência a fungos com relação a plantas controle; (iii)um ácido nucleico exógeno capaz de hibridizar-se sob condições estringentes com uma sequência complementar de qualquer um dos ácidos nucleicos de acordo com (i) ou (ii); preferencialmente, que codificam uma proteína CASAR; preferencialmente, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que possui propriedades essencialmente idênticas ao polipeptídeo descrito em SEQ ID NO: 3; preferencialmente, a proteína codificada confere resistência a fungos aprimorada com relação a plantas controle; e/ou (iv) um ácido nucleico exógeno que codifica a mesma proteína CASAR de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) a (iii) acima devido à degeneração do código genético.

[00201] Outra realização preferida é um método de aprimoramento de plantas que compreende: a. obtenção de planta transgênica por meio de qualquer um dos métodos de acordo com a presente invenção; b. combinação em uma célula vegetal do material genético de pelo menos uma célula vegetal da planta de (a) com o material genético de pelo menos uma célula diferente em um ou mais genes das células vegetais das plantas de (a) ou cruzamento da planta transgênica de (a) com uma segunda planta; c. obtenção de sementes de pelo menos uma planta gerada a partir da célula vegetal de (b) ou da planta do cruzamento da etapa (b); d. plantio das mencionadas sementes e cultivo das sementes em plantas; e e. seleção, dentre as mencionadas plantas, de plantas que expressam o ácido nucleico que codifica a proteína CASAR; e, opcionalmente, f. produção de material de propagação das plantas que expressam o ácido nucleico que codifica a proteína CASAR.

[00202] As plantas transgênicas podem ser selecionadas por meio de métodos conhecidos conforme descrito acima (por exemplo, por meio de seleção para determinar a presença de um ou mais marcadores que são codificados por genes que podem ser expressos em plantas cotransferidos com o gene CASAR ou por meio de seleção em busca do ácido nucleico CASAR).

[00203] Segundo a presente invenção, o ácido nucleico CASAR introduzido pode ser mantido na célula vegetal de forma estável caso seja incorporado em uma réplica autônoma não cromossômica ou integrado aos cromossomas da planta. Quando presente em uma construção de vetor de reprodução ou sem reprodução extracromossômico ou uma construção de vetor que é integrada a um cromossomo, o ácido nucleico CASAR exógeno reside preferencialmente em um cassete de expressão vegetal. Um cassete de expressão vegetal contém preferencialmente sequências reguladoras capazes de dirigir a expressão genética em células vegetais que são funcionais ligadas de tal forma que cada sequência possa desempenhar a sua função, tal como o término da transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são os originários de t-DNA de Agrobacterium tumefaciens tais como o gene 3 conhecido como octopino sintase do plasmídeo de Ti pTiACH5 (Gielen et al, 1984, EMBO J. 3: 835) ou seus equivalentes funcionais, mas todos os outros terminais funcionalmente ativos em plantas também são apropriados. Como a expressão de gene vegetal muito frequentemente não possui níveis de transcrição limitados, um cassete de expressão vegetal preferencialmente contém outras sequências ligadas funcionais como aprimoradores da tradução, tais como a sequência de sobredirecionamento que contém a sequência líder não traduzida 5’ de vírus mosaico do tabaco que aumenta a razão de polipeptídeo por RNA (Gallie et al, 1987, Nucl. Acids Research 15: 8693-8711). Exemplos de vetores de expressão vegetal incluem os detalhados em: Becker, D. et al, 1992, New Plant Binary Vectors with Selectable Markers Located Proximal to the Left Border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; Bevan, M. W., 1984, Binary Agrobacterium Vectors for Plant Transformation, Nucl. Acid Res. 12: 8711-8721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

EXEMPLOS

[00204] Os exemplos a seguir não se destinam a limitar o escopo das reivindicações da presente invenção, mas sim destinam-se a ser exemplos de certas realizações. Quaisquer variações dos métodos exemplificados que ocorrem para os técnicos no assunto destinam-se a enquadrar-se dentro do escopo da presente invenção.

EXEMPLO 1

[00205] Métodos gerais: - A síntese química de oligonucleotídeos pode ser afetada, por exemplo, de forma conhecida utilizando o método de fosfoamidita (Voet, Voet, segunda edição, Wiley Press, Nova Iorque, págs. 896-897). As etapas de clonagem conduzidas para os propósitos da presente invenção, tais como divisões por restrição, eletroforese de gel de agarose, purificação de fragmentos de DNA, transferência de ácidos nucleicos para membranas de nylon e nitrocelulose, ligação de fragmentos de DNA, transformação de células de E. coli, cultivos bacterianos, multiplicação de fagos e análise de sequências de DNA recombinante, são conduzidas conforme descrito por Sambrook et al, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ISBN 0-87969-309-6. O sequenciamento de moléculas de DNA recombinantes é conduzido com um sequenciador de DNA de fluorescência a laser MWG-Licor seguindo o método de Sanger (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463 (1977)).

EXEMPLO 2

[00206] Clonagem de construções de vetor de sobre-expressão: - O cDNA de CASAR (conforme exibido em SEQ ID NO: 1) foi sintetizado de forma que um local de restrição de BamHI seja posicionado em frente ao ATG de início e um local de restrição de PstI abaixo no fluxo do códon de parada. O cDNA sintetizado foi digerido utilizando a enzima de restrição PstI (NEB Biolabs) e a extremidade pegajosa do local PstI tornou-se obtusa utilizando Nuclease de Feijão Mungo de acordo com o manual do fabricante (NEB Biolabs). O fragmento com extremidades obtusas foi digerido utilizando a enzima de restrição BamHI e ligado em um vetor Gateway pENTRY-B digerido por HindIII (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos). A extremidade pegajosa do local HindIII tornou-se obtusa utilizando Nuclease de Feijão Mungo de acordo com o manual do fabricante (NEB Biolabs) e o vetor com extremidades obtusas foi digerido com BamHI antes da ligação.

[00207] Para obter o vetor de transformação vegetal binário, foi realizada uma reação LR tripla (sistema Gateway, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando um vetor pENTRY-A contendo um promotor ubiquitina de salsa, o vetor pENTRY-B descrito acima que contém o gene CASAR e um vetor pENTRY-C que contém o terminal do gene inibidor de catepsina D de Solanum tuberosum. Como alvo, utilizou-se um vetor pDEST binário que é composto de: (1) um conjunto de resistência a espectinomicina/estreptomicina para seleção bacteriana; (2) uma origem de pVS1 para reprodução em Agrobacterium; (3) uma origem de reprodução colE-1 para manutenção estável em E. coli; e (4) entre a fronteira direita e esquerda, seleção de AHAS sob controle de um promotor de pcUbi (Figura 2). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alfa), minipreparada e selecionada por meio de digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada construção de vetor foi sequenciado e submetido a transformação com soja.

[00208] O cDNA de CASAR otimizado pela expressão de soja (conforme exibido em SEQ ID NO: 2) foi sintetizado de tal forma que um local de restrição de Ncol esteja localizado em frente ao ATG de início e um local de restrição de AscI abaixo no fluxo do códon de parada. Os cDNAs sintetizados foram digeridos utilizando as enzimas de restrição NcoI e AscI (NEB Biolabs) e ligadas em um vetor Gateway pENTRY-B digerido por NcoI/AscI (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos) de forma que o fragmento com comprimento local esteja localizado em direção com sentido entre o “promotor 820 específico de mesófilos induzido por ferrugem” (promotor específico de mesófilos, expressão induzida por Phakopsora pachyrhizi, SEQ ID NO: 4) e o terminal do gene inibidor de catepsina D de Solanum tuberosum (t-StCATHD-pA).

[00209] Para obter o vetor de transformação vegetal binário, foi realizada uma reação LR tripla (sistema Gateway, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, Estados Unidos) de acordo com o protocolo do fabricante utilizando o vetor pENTRY-A vazio, o promotor::cDNA::terminal em um vetor pENTRY-B e um vetor pENTRY-C vazio. Como alvo, utilizou-se um vetor pDEST binário que é composto de: (1) um conjunto de resistência a espectinomicina/estreptomicina para seleção bacteriana; (2) uma origem de pVS1 para reprodução em Agrobacterium; (3) uma origem de reprodução colE- 1 para manutenção estável em E. coli; e (4) entre a fronteira direita e esquerda, seleção de AHAS sob controle de um promotor de pcUbi (Figura 3). A reação de recombinação foi transformada em E. coli (DH5alfa), minipreparada e selecionada por meio de digestões de restrição específicas. Um clone positivo de cada construção de vetor foi sequenciado e submetido a transformação de soja.

EXEMPLO 3 TRANSFORMAÇÃO DE SOJA

[00210] As construções de vetor de expressão (vide o Exemplo 2) foram transformadas em soja.

3.1 ESTERILIZAÇÃO E GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE SOJA

[00211] Virtualmente qualquer semente de qualquer variedade de soja pode ser empregada no método de acordo com a presente invenção. Uma variedade de cultivar de soja (incluindo Jack, Williams 82, Jake, Stoddard e Resnik) é apropriada para transformação de soja. Sementes de soja foram esterilizadas em uma câmara com gás cloro produzido por meio da adição de 3,5 ml de 12 N HCl em gotas em 100 ml de alvejante (5,25% de hipoclorito de sódio) em um dissecador com uma tampa com encaixe firme. Após 24 a 48 horas na câmara, as sementes foram removidas e cerca de 18 a 20 sementes foram colocadas em placas sobre meio GM sólido com ou sem 5 μM de 6- benzilaminopurina (BAP) em placas de Petri de 100 mm. Mudas sem BAP são mais alongadas e desenvolvem-se raízes, formando-se especialmente raízes laterais e secundárias. BAP fortalece a muda por meio da formação de uma muda mais curta e mais sólida.

[00212] Mudas com sete dias de idade cultivadas na luz (> 100 μEinstein/m2s) a 25 °C foram utilizadas para material de explante para os tipos de três explantes. Nesse momento, o revestimento de semente foi dividido e o epicotilédone com as folhas unifoliadas cresceram até, no mínimo, o comprimento dos cotilédones. O epicotilédone deverá ser de pelo menos 0,5 cm para evitar o tecido de nó de cotilédone (como os cultivares de soja e lotes de sementes podem variar de tempo de desenvolvimento, a descrição do estágio de germinação é mais precisa que um tempo de germinação específico).

[00213] Para inoculação de mudas inteiras, vide o Método A (Exemplo 3.3.1 e 3.3.2) ou explantes de folhas, vide o Método B (Exemplo 3.3.3).

[00214] Para o Método C (vide Exemplo 3.3.4), o hipocotilédone e um e meio ou parte dos dois cotilédones foram removidos de cada muda. As mudas foram colocadas em seguida sobre meios de propagação por duas a quatro semanas. As mudas produzem vários brotos ramificados para obter explantes deles. A maior parte dos explantes originou-se da plantícula que cresce a partir do botão apical. Esses explantes foram preferencialmente utilizados como tecido alvo.

3.2 CRESCIMENTO E PREPARAÇÃO DE CULTIVO DE AGROBACTERIUM

[00215] Cultivos de Agrobacterium foram preparados riscando-se Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens ou A. rhizogenes) que conduz o vetor binário desejado (por exemplo, H. Klee, R. Horsch e S. Rogers, 1987, Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its Further Applications to Plant Biology; Annual Review of Plant Physiology, Vol. 38: 467-486) sobre meio de crescimento de YEP sólido (meio YEP: 10 g de extrato de levedura, 10 g de Bacto Peptona, 5 g de NaCl. O pH é ajustado em 7,0 e o volume final é trazido para um litro com H2O (para placas Agar YEP adicionar 20 g de Agar, autoclave), seguido por incubação a 25 °C até o surgimento de colônias (cerca de dois dias). Dependendo dos genes marcadores selecionáveis presentes sobre o plasmídeo Ti ou Ri, o vetor binário e os cromossomos bacterianos, foram utilizados compostos de seleção diferentes para seleção de A. tumefaciens e A. rhizogenes nos meios sólidos e líquidos de YEP. Várias linhagens de Agrobacterium podem ser utilizadas para o método de transformação.

[00216] Após cerca de dois dias, uma única colônia (com um palito de dentes estéril) foi tomada e 50 ml de YEP líquido foram inoculados com antibióticos e agitados a 175 rpm (25 °C) até atingir-se OD600 de 0,8 a 1,0 (cerca de 2 d). Estoques de glicerol funcionais (15%) para transformação são preparados, 1 ml de estoque de Agrobacterium foi dividido em tubos Eppendorf de 1,5 ml e armazenado em seguida a -80 °C.

[00217] No dia anterior à inoculação de explantes, 200 ml de YEP foram inoculados com 5 μl a 3 ml de estoque de Agrobacterium funcional em um frasco Erlenmeyer de 500 ml. O frasco foi agitado por uma noite a 25 °C até que o OD600 fosse de 0,8 a 1,0. Antes da preparação dos explantes de soja, o Agrobacterium foi peletizado por meio de centrifugação por dez minutos a 5500xg a 20 °C. A pelota foi novamente suspensa em CCM líquido até a densidade desejada (OD600 0,5-0,8) e colocada à temperatura ambiente pelo menos trinta minutos antes do uso.

3.3 PREPARAÇÃO E COCULTIVO DE EXPLANTES (INOCULAÇÃO): 3.3.1 MÉTODO A: PREPARAÇÃO DE EXPLANTES NO DIA DA TRANSFORMAÇÃO

[00218] As mudas nesse momento possuíam epicotilédones alongados de pelo menos 0,5 cm, mas geralmente de 0,5 a 2 cm. Epicotilédones alongados com até 4 cm de comprimento foram empregados com sucesso. Explantes foram preparados em seguida: (i) com ou sem algumas raízes; (ii) com um cotilédone parcial, inteiro ou ambos, todas as folhas previamente formadas foram removidas, incluindo meristema apical, e o nó localizado no primeiro conjunto de folhas sofreu lesões com vários cortes utilizando um bisturi agudo.

[00219] Este corte no nó não incluiu apenas infecções por Agrobacterium, mas também distribuiu as células de meristema axilar e lesionou brotos pré-formados. Após a ferida e preparação, os explantes foram separados em uma placa de Petri e cocultivados em seguida com a mistura de CCM e Agrobacterium líquida por trinta minutos. Os explantes foram removidos em seguida do meio líquido e colocados em placas sobre um papel filtro estéril sobre quinze placas de Petri de 100 mm com meio de cocultivo sólido. Os tecidos alvo feridos foram colocados de tal forma que ficassem em contato direto com o meio.

3.3.2 MÉTODO MODIFICADO A: PREPARAÇÃO DE EXPLANTES DE EPICOTILÉDONES

[00220] Segmentos de epicotilédone de soja preparados a partir de mudas com quatro a oito dias de idade foram utilizados como explantes para regeneração e transformação. Sementes de soja cv. L00106CN, 93-41131 e Jack germinaram em sais 1/10 MS ou meio de composição similar com ou sem citoquininas por quatro a oito dias. Explantes de epicotilédones foram preparados por meio da remoção do nó do cotilédone e do nó da haste da seção de haste. O epicotilédone foi cortado em dois a cinco segmentos. São de preferência especial segmentos ligados ao nó primário ou superior que compreendem tecido meristemático axilar.

[00221] Os explantes foram utilizados para infecção por Agrobacterium. Agrobacterium AGL1 que abriga um plasmídeo com o gene de interesse (GOI) e o gene marcador selecionável AHAS, bar ou dsdA foi cultivado em meio LB com antibióticos apropriados por uma noite, colhido e novamente suspenso em um meio de inoculação com acetossiringona. Segmentos de epicotilédones recém-preparados foram embebidos na suspensão de Agrobacterium por trinta a sessenta minutos e, em seguida, os explantes foram manchados secos sobre papéis filtro estéreis. Os explantes inoculados foram cultivados em seguida sobre um meio de cocultivo com L- cisteína e TTD e outras substâncias tais como acetossiringona para aumentar o fornecimento de T-DNA em dois a quatro dias. Os explantes de epicotilédones infectados foram colocados em seguida sobre um meio de indução de brotos com agentes de seleção tais como imazapir (para gene AHAS), glufosinato (para gene bar) ou D-serina (para gene dsdA). Os brotos regenerados foram subcultivados sobre meio de alongamento com o agente seletivo.

[00222] Para regeneração de plantas transgênicas, os segmentos foram cultivados em seguida sobre um meio com citoquininas tais como BAP, TDZ e/ou Kinetin para indução de brotos. Após quatro a oito semanas, os tecidos cultivados foram transferidos para um meio com concentração mais baixa de citoquinina para alongamento de brotos. Brotos alongados foram transferidos para um meio com auxina para enraizamento e desenvolvimento de plantas. Diversos brotos foram regenerados.

[00223] Muitos setores transformados estáveis que exibem forte expressão de cDNA foram recuperados. Plantas de soja foram regeneradas de explantes de epicotilédones. Foram demonstrados setores transformados estáveis e fornecimento eficiente de T-DNA.

3.3.3 MÉTODO B: EXPLANTES DE FOLHAS

[00224] Para preparação do explante de folha, o cotilédone foi removido do hipocotilédone. Os cotilédones foram separados entre si e o epicotilédone é removido. As folhas primárias, que consistem das lâminas, petíolo e estípulos, foram removidas do epicotilédone por meio de corte cuidadoso na base dos estípulos, de tal forma que os meristemas axilares fossem incluídos sobre o explante. Para ferir o explante e estimular a formação de brotos a partir do zero, qualquer broto pré-formado foi removido e a área entre os estípulos foi cortada com um bisturi agudo três a cinco vezes.

[00225] Os explantes são completamente imersos ou a extremidade do petíolo ferido é mergulhada na suspensão de Agrobacterium imediatamente após a preparação de explante. Após a inoculação, os explantes são manchados sobre papel filtro estéril para remover o excesso de cultivo de Agrobacterium e colocar explantes com o lado ferido em contato com um papel Whatman de 7 cm redondo sobreposto ao meio de CCM sólido (vide acima). Este papel filtro evita o crescimento de A. tumefaciens sobre os explantes de soja. Embale cinco placas com Parfilm® "M" (American National Can, Chicago IL, Estados Unidos) e incube por três a cinco dias no escuro ou na luz a 25 °C.

3.3.4 MÉTODO C: MERISTEMA AXILAR PROPAGADO

[00226] Para preparação do explante de meristema axilar propagado, foram utilizadas plantículas com três ou quatro semanas de idade propagadas. Explantes de meristema axilar podem ser preparados do primeiro ao quarto nó. Em média, três a quatro explantes poderão ser obtidos de cada muda. Os explantes foram preparados a partir de plantículas por meio de corte de 0,5 a 1,0 cm abaixo do nó axilar sobre o internó e remoção do petíolo e da folha do explante. A extremidade na qual repousam os meristemas axilares foi cortada com bisturi para induzir o crescimento de brotos a partir do zero e permitir o acesso de células alvo a Agrobacterium. Portanto, um explante de 0,5 cm incluiu a haste e um botão.

[00227] Uma vez cortados, os explantes foram imediatamente colocados na suspensão de Agrobacterium por vinte a trinta minutos. Após a inoculação, os explantes foram manchados sobre papel filtro estéril para remover o excesso de cultivo de Agrobacterium e colocados em seguida quase completamente imersos em CCM sólido ou sobre um papel filtro de 7 cm redondo sobreposto ao CCM sólido, dependendo da linhagem de Agrobacterium. Este papel filtro evita o crescimento excessivo de Agrobacterium sobre os explantes de soja. Placas foram embaladas com Parafilm® "M" (American National Can, Chicago IL, Estados Unidos) e incubadas por dois a três dias no escuro a 25 °C.

3.4 INDUÇÃO DE BROTOS

[00228] Após três a cinco dias de cocultivo no escuro a 25 °C, os explantes foram enxaguados em meio SIM líquido (para SIM, vide Olhoft et al, A Novel Agrobacterium Rhizogenes-Mediated Transformation Method of Soy Using Primary-Node Explants from Seedlings, In Vitro Cell. Dev. Biol., Plant (2007) 43: 536-549) ou meio Modwash (1X sais principais B5, 1X sais menores B5, 1X ferro MSIII, 3% de sacarose, 1X vitaminas B5, 30 mM de MES, 350 mg/l de Timentin®, pH 5,6, WO 2005/121345) para remover o excesso de Agrobacterium e manchados secos sobre papel filtro estéril (para evitar danos especialmente sobre a lâmina) antes da colocação sobre o meio SIM sólido. Os cerca de cinco explantes (Método A) ou dez a vinte (Métodos B e C) explantes foram colocados de tal forma que o tecido alvo ficasse em contato direto com o meio. Durante as duas primeiras semanas, os explantes puderam ser cultivados com ou sem meio seletivo. Preferencialmente, explantes foram transferidos para SIM sem seleção por uma semana.

[00229] Para explantes de folhas (Método B), o explante deverá ser colocado no meio de forma que seja perpendicular à superfície do meio com o petíolo embutido no meio e a lâmina fora do meio.

[00230] Para meristema axilar propagado (Método C), o explante foi colocado no meio de forma que fosse paralelo à superfície do meio (basípeto) com o explante parcialmente embutido no meio.

[00231] Placas embaladas com fita de ventilação Scotch 394 (3M, St. Paul, MN, Estados Unidos) foram colocadas em uma câmara de cultivo por duas semanas com temperatura média de 25 °C sob ciclo de 18 h de luz/6 h de escuro a 70-100 μE/m2s. Os explantes permaneceram sobre o meio SIM com ou sem seleção até a ocorrência de crescimento de brotos a partir do zero na área alvo (tais como meristemas axilares no primeiro nó acima do epicotilédone). Transferências para meio novo podem ocorrer durante esse período. Explantes foram transferidos do SIM com ou sem seleção para SIM com seleção após cerca de uma semana. Nesse momento, houve considerável desenvolvimento de brotos a partir do zero na base do petíolo dos explantes de folhas em uma variedade de SIM (Método B), no nó primário para explantes de mudas (Método A) e nos nós axilares de explantes propagados (Método C).

[00232] Preferencialmente, todos os brotos formados antes da transformação foram removidos por até duas semanas após o cocultivo para estimular novo crescimento dos meristemas. Isso ajudou a reduzir o quimerismo no transformador primário e aumentar a amplificação de células meristemáticas transgênicas. Durante esse período, o explante pode ou não ser cortado em pedaços menores (ou seja, separando-se o nó do explante por meio de corte do epicotilédone).

3.5 ALONGAMENTO DE BROTOS

[00233] Após duas a quatro semanas (ou até a formação de uma massa de brotos) sobre meio SIM (preferencialmente com seleção), os explantes foram transferidos para meio SEM (meio de alongamento de brotos; vide Olhoft et al, 2007, A Novel Agrobacterium Rhizogenes-Mediated Transformation Method of Soy Using Primary-Node Explants from Seedlings, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant (2007) 43: 536-549) que estimula o alongamento de brotos dos primórdios do broto. Este meio pode ou não conter um composto de seleção.

[00234] A cada duas a três semanas, os explantes foram transferidos para meio SEM novo (preferencialmente contendo seleção) após remoção cuidadosa de tecido morto. Os explantes deverão ser mantidos juntos, não se fragmentar e manter-se um tanto saudáveis. Os explantes continuaram a ser transferidos até a morte do explante ou o alongamento dos brotos. Brotos alongados com mais de 3 cm foram removidos e colocados em meio RM por cerca de uma semana (Método A e B) ou cerca de duas a quatro semanas, dependendo do cultivar (Método C), quando começaram a formar-se as raízes. No caso de explantes com raízes, eles foram transferidos diretamente para o solo. Brotos enraizados foram transferidos para o solo e endurecidos em uma câmara de crescimento por duas a três semanas antes da transferência para a estufa. Plantas regeneradas obtidas utilizando este método foram férteis e produziram em média 500 sementes por planta.

[00235] Após cinco dias de cocultivo com Agrobacterium tumefaciens, a expressão transitória do gene de interesse (GOI) foi disseminada sobre os explantes de meristema axilar de mudas, especialmente nas regiões feridas durante a preparação de explantes (Método A). Explantes foram colocados em meio de indução de brotos sem seleção para observar como o nó primário reage à indução e regeneração de brotos. Desta forma, mais de 70% dos explantes formaram brotos novos nessa região. A expressão de GOI foi estável após quatorze dias sobre SIM, o que indica integração do T-DNA ao genoma de soja. Além disso, experimentos preliminares resultaram na formação de cDNA que expressa brotos em formação após três semanas sobre SIM.

[00236] Para o Método C, o tempo médio de regeneração de uma plantícula de soja utilizando o protocolo de meristema axilar propagado foi de quatorze dias a partir da inoculação do explante. Este método possui, portanto, baixo tempo de regeneração que gera plantas de soja férteis e saudáveis.

EXEMPLO 4 TESTE DE PATÓGENOS 4.1 CRESCIMENTO DE PLANTAS

[00237] Dez plantas T1 por evento foram colocadas em vasos e cultivadas por três a quatro semanas na fitocâmara (ritmo de 16 horas de dia e 8 horas de noite sob temperatura de 16 e 22 °C e umidade de 75%) até a expansão completa das duas primeiras folhas trifoliadas.

4.2 INOCULAÇÃO

[00238] As plantas foram inoculadas com P. pachyrhizi.

[00239] A fim de obter material de esporos apropriado para inoculação, folhas de soja que haviam sido infectadas com ferrugem 15-20 dias antes foram tomadas 2-3 dias antes da inoculação e transferidas para placas Agar (1% agar em H2O). As folhas foram colocadas com seu lado superior sobre o agar, o que permitiu o crescimento do fungo através do tecido para produzir esporos muito jovens. Para a solução de inoculação, os esporos foram retirados das folhas e adicionados a uma solução de Tween-H2O. A contagem de esporos foi realizada sob microscópio óptico por meio de uma câmara de contagem Thoma. Para inoculação das plantas, a suspensão de esporos foi adicionada a um frasco de pulverização operado por ar comprimido e aplicado uniformemente sobre as plantas ou as folhas até bom umedecimento da superfície de folha. Para testes macroscópicos, utilizamos densidade de esporos de 1-5 x 105 esporos/ml. Para microscopia, utiliza-se densidade de >5 x 105 esporos/ml. As plantas inoculadas foram colocadas por 24 horas em uma câmara de estufa com, em média, 22 °C e >90% de umidade do ar. O cultivo a seguir foi realizado em uma câmara com média de 25 °C e 70% de umidade do ar.

EXEMPLO 5 SELEÇÃO MICROSCÓPICA

[00240] Para avaliação do desenvolvimento de patógenos, as folhas inoculadas de plantas foram manchadas com anilina azul 48 horas após a infecção.

[00241] A mancha de azul de anilina serve para detecção de substâncias fluorescentes. Durante as reações de defesa em interações de hospedeiro e interações não de hospedeiro, substâncias tais como fenóis, calose ou lignina acumularam-se ou foram produzidas e incorporadas à parede celular localmente em papilas ou na célula inteira (reação hipersensível, HR). Foram formados complexos em associação com azul de anilina, que geram, por exemplo, no caso de calose, fluorescência amarela. O material de folha foi transferido para tubos ou placas Falcon contendo solução de retirada de manchas II (etanol/ácido acético 6/1) e incubado em um banho de água a 90 °C por 10-15 minutos. A solução de retirada de manchas II foi removida imediatamente em seguida e as folhas foram lavadas 2x com água. Para manchas, as folhas foram incubadas por 1,5-2 horas em solução de manchas II (0,05% azul de anilina = azul de metileno, 0,067 M de hidrogênio fosfato dipotássico) e analisadas por meio de microscopia imediatamente a seguir.

[00242] Os diferentes tipos de interação foram avaliados (contados) por meio de microscopia. São utilizados um microscópio Olympus UV BX61 (luz incidente) e um filtro UV Longpath (excitação: 375/15, divisor de feixe: 405 LP). Após manchas de azul de anilina, os esporos pareceram azuis sob luz UV. As papilas puderam ser reconhecidas abaixo do apressório fúngico por meio de uma mancha verde/amarela. A reação de hipersensibilidade (HR) foi caracterizada por fluorescência de células inteiras.

EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE À FERRUGEM DE SOJA

[00243] O progresso da doença de ferrugem da soja foi avaliado pela estimativa da área doente (área que foi coberta por uredinia esporulante) sobre o lado traseiro (lado abaxial) da folha. Além disso, o amarelamento da folha foi levado em conta (para o esquema, vide a Figura 1).

[00244] Ao todo, 43 plantas de soja T1 (cinco eventos independentes, 7-10 plantas transgênicas cada; expressão de transgene verificada por meio de PCR RT) que expressam a proteína CASAR foram inoculadas com esporos de Phakopsora pachyrhizi. Os sintomas de doença macroscópica causados por P. pachyrhizi sobre as plantas de soja inoculadas foram avaliados 14 dias após a inoculação.

[00245] O percentual médio da área de folha que exibe colônias fúngicas ou forte amarelamento/escurecimento sobre todas as folhas foi considerado área de folha doente. Ao todo, 43 plantas de soja T1 que expressam CASAR (expressão verificada por meio de PCR RT) foram avaliadas em paralelo com plantas controle não transgênicas da mesma variedade. Plantas de soja não transgênicas cultivadas paralelamente às plantas transgênicas foram empregadas como controle. A média da área de folha doente é exibida na Figura 7 para plantas que expressam CASAR de forma exógena em comparação com plantas do tipo selvagem. A sobre- expressão de CASAR reduz a área de folha doente em comparação com plantas controle não transgênicas em 44,5% em média ao longo de todos os cinco eventos independentes testados. Este dado indica claramente que a expressão in planta da construção de vetor de expressão CASAR gera avaliação de doença mais baixa de plantas transgênicas em comparação com controles não transgênicos. Portanto, a expressão de CASAR (conforme exibido em SEQ ID NO: 1) em soja aumenta significativamente (p < 0,001) a resistência de soja contra ferrugem da soja.

Claims (3)

1. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE PRODUTO, caracterizado por compreender: (A) cultivo de planta transgênica, ou que pode ser obtida por meio do método de produção de plantas transgênicas de soja, partes de plantas transgênicas de soja ou células de plantas transgênicas de soja, que possuem resistência a Phakopsora aprimorada, dito método compreendendo as etapas (I) a (III) a seguir: (I) introdução de uma construção de vetor recombinante em uma planta de soja, parte de planta de soja ou célula vegetal de soja, em que a construção de vetor recombinante compreende em uma ligação operável: (a) um ácido nucleico que consiste na SEQ ID NO: 1 ou 2, que codifica a proteína CASAR que consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, (b) um promotor induzido por ferrugem, e (c) uma sequência de término de transcrição; e (II) regeneração de planta transgênica, parte de planta transgênica ou célula de planta transgênica a partir da planta, parte de planta ou célula vegetal; e (III) expressão da proteína CASAR codificada por: (i) o ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 1 ou 2, que codifica uma proteína de SEQ ID NO: 3, e/ou (ii) o ácido nucleico exógeno de SEQ ID NO: 1 ou 2, que codifica a mesma proteína de qualquer um dos ácidos nucleicos de (i) acima, mas difere dos ácidos nucleicos de (i) acima devido à degeneração do código genético; e (B) elaboração do mencionado produto a partir das plantas e/ou partes da planta, em que o produto compreende a construção de vetor recombinante.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo dito produto ser produzido a partir das sementes das plantas.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo produto ser massa de soja ou óleo de soja.

Images